Evaluacion-de-la-funcion-de-ligandina-de-la-glutation-s-transferasa-de-cisticercos-de-taenia-solium

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 MAESTRÍA EN CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN Y DE LA 
SALUD ANIMAL 
 
 
 
 
 
EVALUACIÓN DE LA FUNCIÓN DE LIGANDINA DE LA GLUTATIÓN S -
TRANSFERASA DE CISTICERCOS DE Taenia sol ium 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE 
MAESTRA EN CIENCIAS 
 
 
 
 
PRESENTA 
MARTHA ADRIANA HERNÁNDEZ BAUTISTA 
 
 
 
DIRECTOR DE TESIS: DR. AGUSTIN PLANCARTE CRESPO 
ASESORA INTERNA: DRA. ALINE S. DE ALUJA 
COMITÉ TUTOR: DR. HECTOR QUIROZ ROMERO 
 
 
 
 MÉXICO, D.F 2012 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
I 
 
ÍNDICE 
 
Resumen 
1. Introducción 
IX 
1 
1.1. Taenia solium 1 
1.1.1 Características morfológicas 1 
1.1.2 Ciclo biológico 3 
1.1.3 Teniasis-cisticercosis 4 
1.1.4 Aspectos clínicos de la NC 5 
1.2 Respuesta inflamatoria 5 
1.3 Moléculas pro-oxidantes 6 
1.3.1 Ácidos biliares 7 
1.3.2 Porfirinas 10 
1.3.2.1 El grupo Hemo 12 
1.3.2.2 Biosíntesis del hemo 12 
1.3.2.3 Regulación de la síntesis del hemo 15 
1.3.2.4 Catabolismo del hemo 15 
1.3.2.5 Toxicidad de las porfirinas 18 
1.4 Especies reactivas 19 
1.5 Sistema detoxificante 20 
1.6 Glutatión S-transferasas (GSTs) 22 
1.6.1 Estructura 22 
1.6.2 Clasificación y nomenclatura 23 
1.6.3 Mecanismo catalítico 25 
1.6.3.1 Activación del glutatión 25 
1.6.3.2 Especificidad por sustratos electrofílicos 27 
1.6.4 Localización celular de las GSTs 28 
1.6.5 Importancia biológica 29 
1.7 Estudios de fluorescencia 31 
1.8 Estudios cinéticos 39 
 
 
II 
 
1.8.1 Cinética enzimática 39 
1.8.2 Estudios de inhibición enzimática 41 
2. Justificación 43 
3. Hipótesis 44 
4. Objetivo general 44 
5. Objetivos particulares 44 
6 Materiales y Métodos 45 
6.1 Obtención de los parásitos de T. solium 45 
6.2 Purificación de la enzima GSTTs26.5 45 
6.2.1 Obtención del extracto crudo del metacestodo (ECM) 45 
6.2.2 Cromatografía en Sefarosa-GSH 46 
6.2.3 Detección de las fracciones cromatográficas con actividad 
para GST 
46 
6.2.4 Concentración de las fracciones de SG-GSTTs: 46 
6.2.5 Cromatoenfoque en PBE 46 
6.2.6 Cuantificación de proteína 47 
6.2.7 Análisis electroforético en geles de poliarcrilamida de las 
fracciones proteicas obtenidas en los diferentes pasos de 
purificación. 
47 
6.3 Ensayo enzimático 48 
6.4 Ensayo de fluorescencia del liquido vesicular de cisticercos T.s. 48 
6.5 Ensayo de fluorescencia de la GSTTs26.5 48 
6.6 Inhibición de la fluorescencia intrínseca de la GSTTs26.5. 49 
6.6.1 Solubilización de los ligandos 49 
6.6.2 Procedimiento de los ensayos de fluorescencia 49 
6.6.3 Análisis de las interacciones entre la GSTTs26.5 y los diversos 
ligandos 
50 
6.7 Obtención de la Constante de disociación (Kd) por 
procedimientos cinéticos 
51 
6.8 Determinación de los parámetros de inhibición (I50, tipo y 51 
 
 
III 
 
constantes inhibitorias) de diversos ligandos 
7 Resultados 53 
7.1 Obtención de la GSTTs26.5 53 
7.1.1 Cromatografía de afinidad y PBE 53 
7.2 Análisis electroforético. 55 
7.3 Estudios de inhibición de la fluorescencia. 56 
7.4 Obtención de la constante de disociación (kd) 61 
7.6 Estudios de inhibición (I50, Ki, tipo de inhibición) 61 
8 Discusión 65 
9 Conclusión 68 
10 Bibliografía 69 
 
 
 
 
IV 
 
 
JURADO ASIGNADO 
 
Presidente Dra. Evangelina Romero Callejas 
Secretaria Dra. Aline Shunemann de Aluja 
Vocal MVZ. Dra. Gabriela Nava Balderas 
Suplente Dra. Ada Nelly Martínez Villalobos 
Suplente M. C. Sergio Enríquez Flores 
 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLO EL TEMA: 
 
Laboratorio de Inmunobioquímica de Taenia solium. 
Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, 
UNAM 
 
 
V 
 
 
Dedico este trabajo 
 
a mi madre, mi gran inspiración 
 
Por darme tu amor 
 
Por estar siempre a mi lado 
 
cuando así lo he necesitado 
 
Por darme los mejores consejos 
 
Para ser mejor cada día 
 
Gracias por darme la vida 
 
Te quiero y te adoro mucho… 
 
 
VI 
 
Agradecimientos 
 
Al Dr. Agustín Plancarte Crespo por haber aceptado dirigir esta tesis, por su 
interés de que fuera llevada a cabo, y cuya asesoría me ha sido 
extraordinariamente útil a lo largo de todo el trabajo. 
 
Al Dr. Héctor Quiroz Romero por las clases, los consejos, las pláticas, pero 
sobre todo por ser el extraordinario humano que es. 
 
A la Dra. Aline Shunemann de Aluja por las sugerencias y aportaciones 
realizadas para el enriquecimiento de este trabajo. 
 
A la Dra. Gabriela Nava Balderas por su asesoría y sugerencias al presente 
trabajo. 
 
Al Dr. Horacio Reyes Vivas por sus sugerencias al proyecto de investigación 
y por permitir el uso de equipo e instalaciones en el Laboratorio de 
Bioquímica Genética del Instituto Nacional de Pediatría (INP). 
 
A la Dra. Ada Nelly Martínez Villalobos, por su asesoría y por la ayuda para 
la obtención de cisticercos de Taenia solium. 
 
A la Dra. Evangelina por sus críticas realizadas al presente trabajo. 
 
M. C. Sergio Enríquez Flores por sus acertados comentarios en la revisión de 
esta tesis 
 
 
 
VII 
 
Al M.V.Z. José Agustín Jiménez Rodríguez por sus observaciones, 
conocimientos y por brindarme su ayuda incondicional. 
 
Al M.V.Z. Víctor Manuel Salgado Alfaro por su asesoría técnica, su ayuda 
incondicional y amistad. 
 
Al Biólogo José Rodrigo Romero Díaz por la ayuda ofrecida de manera 
incondicional. 
 
A la Dra. Edith González Mondragón por su asesoría y ayuda incondicional. 
 
A la M.C Bettsy Mendoza Dueñas por las correcciones de redacción 
realizadas al trabajo, y por su amistad incondicional. 
 
A la MVZ Zazil-Ha Velasco Herrera por sus comentarios en el trabajo, y por 
su amistad. 
 
A la Universidad Nacional Autónoma de México. 
 
Al Posgrado en Ciencias de la Producción y de la Salud Animal, FMVZ-
UNAM 
 
A la Facultad de Medicina, UNAM, Depto. Microbiología y Parasitología, 
Laboratorio de Inmunobioquímica de Taenia solium 
 
Al consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) (Beca # 234410) 
 
 
 
VIII 
 
El presente trabajo se llevo a cabo con la ayuda del Programa de Apoyo a 
Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM, 
Proyecto IN200510 – 3. 
 
 
IX 
 
A mi familia:, gracias por estar allí cada vez que los eh necesitado: 
 
A mi hermano por toda la ayuda que me has brindado, sin ti creo que no 
hubiera llegado hasta donde estoy. 
 
A mis colegas y amigas de la facultad, Patricia, Pilar, Dianina, Mayra, Perla, 
Juanita y todas aquellas personas que han compartido sus conocimientos 
y han hecho de mi estancia en la facultad y de mi enseñanza algo muy 
agradable. 
 
A mis amigas del CCH-oriente Diana y Mónica por estar siempre en los 
momentos que más las eh necesitado y por mostrarme todos los momentos 
agradables de la vida. 
 
 
 
 
 
X 
 
RESUMEN 
 
Se evaluó la función de ―ligandina‖ de la GSTTs26.5 de cisticercos de Taenia 
solium. Para ello se purificó la enzima a homogeneidad, se dejó 
interaccionar con diversos ligandos y por espectrofotometría y cinética 
enzimática se caracterizaron estas interacciones. LaGSTTs26.5 se purificó 38 
veces por medio de una cromatografía de afinidad para glutatión (GSH) y 
un cromatoenfoque en PBE 94 obteniendo un rendimiento del 4.12 %. La 
GSTTs26.5 es una enzima dimérica constituida por 217 aminoácidos de los 
cuales 11.9 % son aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina y 
triptófano). La emisión de la fluorescencia de estos aminoácidos 
aromáticos de la GSTTs26.5 fue inhibida por el ácido cólico, litocólico y 
quenodesoxicólico en un 8.42 %, 10 % y 11 % respectivamente. También se 
vio inhibida ésta fluorescencia por la coproporfirina, protoporfirina, 
mesoporfirina y hematina en un 68.64 %, 41.29 %, 39.77 % y 43.21 % 
respectivamente. Las constantes de disociación (KD) obtenidas por los 
ácidos biliares fueron de 9.3 μM para el ácido cólico, 48.58 μM para el 
ácido litocólico y 3.86 μM para el ácido quenodesoxicólico y aquellas para 
la coproporfirina de 2.6 μM, para la mesoporfirina, 1.1 μM, para la 
protoporfirina de 3.1 μM y para la hematina de 0.7 μM. 
Para confirmar los resultados espectrofluorométricos así como comprender 
como interactuaron los ligandos con la enzima, se realizaron estudios de 
inhibición cinética. Obteniendo valores de I50 para la coproporfirina (I50 = 
3.03 μM ± 0.64), protoporfirina (I50 = 0.026mM ± 0.92), mesoporfirina (I50 = 
0.030mM ± 0.006) y hematina (I50 = 2.40 μM ± 0.15). Adicionalmente, se 
obtuvo la Ki de estos ligandos utilizando al 1-cloro-2,4-dinitrobenceno 
(CDNB) como sustrato variable. Los resultados fueron: coproporfirina 1.14 
μM, protoporfirina 4.41 μM, mesoporfirina 0.53 μM y para la hematina 0.33 
 
 
XI 
 
μM. El tipo de inhibición que se obtuvo para todos los ligandos fue del tipo 
no competitivo. 
Los resultados obtenidos sugieren que los ligandos empleados se unen a la 
GSTTs26.5 en sitios de su estructura diferentes al sitio activo y permiten 
plantear la posibilidad de extrapolar esta función de ligandina en el 
transporte citoplásmico y extracelular de moléculas relacionadas con la 
fisiología y el metabolismo de T. solium. 
 
 
 
1 
 
EVALUACIÓN DE LA FUNCIÓN DE LIGANDINA DE LA GLUTATIÓN S-TRANSFERASA DE 
CISTICERCOS DE Taenia solium 
 
1. INTRODUCCIÓN. 
 
1.1 Taenia solium 
Taenia solium es un cestodo parásito hermafrodita del hombre y del cerdo, por lo 
que su ciclo biológico es indirecto, es decir requiere de un hospedero 
intermediario (cerdo) y un hospedero definitivo (hombre), presenta 3 estadios 
diferentes: adulto, huevo y larva (cisticerco) (1,2). 
 
1.1.1 Características morfológicas 
 
Forma o estadío del adulto 
 
El adulto de T. solium es un gusano plano en forma de cinta, de color 
blanquecino, habita en el intestino delgado del ser humano donde vive anclado 
a la pared intestinal mediante un escólex piriforme el cual presenta cuatro 
ventosas y un rostelo con una doble corona de ganchos, siendo su tamaño similar 
a la cabeza de un alfiler (figura 1). Al órgano de fijación le continúa el cuello, 
porción germinal que da origen a un conjunto de segmentos o proglótidos, que 
formaran el estróbilo. Los proglótidos cercanos al cuello son inmaduros e 
indiferenciados, a medida que estos se alejan del mismo, se observan 
progresivamente proglótidos con órganos masculinos y femeninos bien 
diferenciados (figura 1) (1,2). Cada proglótido es una unidad de reproducción 
autofecundante e independiente, que produce huevos que contienen embriones 
infectantes; los proglótidos mas distales, que son los grávidos, presentan ramas 
uterinas llenas de huevos que le dan aspecto arboriforme, cada uno contiene un 
promedio de 50,000 a 60,000 huevos y habitualmente se desprenden del estróbilo 
en cadenas cortas que son eliminadas con las heces (1,2). 
 
 
 
 
2 
 
 
Figura 1. Elementos morfológicos característicos de T. solium. (Modificado a partir de 
www.infovek.sk/predmety/biologia/metodicke/ploskavce/index.php). En el lado izquierdo se aprecia el escólex de una 
taenia adulta en donde se indica la posición de las ventosas (V), el rostelo (R) y la corona de ganchos (G) que caracteriza a 
la especie. En el lado derecho se observa un segmento translucido de un proglótido grávido en donde se exponen las 
ramas uterinas (RU), que en T. solium no exceden las catorce. 
 
Forma o estadío de huevo 
 
Los huevos son esféricos, miden de 30 a 45 micrómetros y presentan varias 
membranas, una de ellas es el vitelo que solo se presenta en huevos inmaduros y 
que permiten la obtención de nutrientes. Esta membrana cubre al embrióforo 
formando una cubierta con bloques embriofóricos, los cuales se encuentran 
unidos por la proteína cementante, dando al huevo una apariencia física radiada 
(figura 2). La membrana oncosferal recubre a la oncosfera o embrión hexacanto, 
llamado así por ser una esfera con tres pares de ganchos (1, 2,3). 
 
 
Figura 2. Huevo de T. solium observado en el microscopio de luz 
 
 
 
 
3 
 
Forma o estadío de metacestodo 
 
Los metacestodos, larvas o cisticercos son vesículas parasitarias de 0.5 a 2cm de 
diámetro (figura 3), se encuentran llenas de líquido que contienen en su interior un 
escólex invaginado (4). La pared de la vesícula es una estructura membranosa 
compuesta de tres capas: cuticular o externa, celular o media y reticular o 
interna. El escólex presenta una estructura similar a la del estadio adulto (T. 
solium), con un róstelo que muestra ventosas, ganchos y un rudimento del cuerpo, 
que incluye el canal espiral (5). 
 
Figura 3. Imagen de cisticercos 
1.1.2 Ciclo biológico 
 
Si partimos del estadío de huevo de este parásito éste se puede diseminar en el 
medio ambiente a través de las heces de individuos teniasicos, produciendo la 
teniasis que es la enfermedad causada por la presencia de la forma adulta del 
parásito en el intestino de un individuo, cada huevo o embrión hexacanto al ser 
ingerido por un cerdo es activado por los jugos gástricos, liberando de sus 
cubiertas al embrión hexacanto el cual atraviesa la pared intestinal y a través del 
sistema circulatorio y/o linfático puede alcanzar diferentes tejidos en donde se 
desarrollará en un cisticerco ocasionando la enfermedad denominada 
cisticercosis (6, 7). El ciclo biológico se continúa cuando el hombre consume 
carne de cerdo con cisticercos viables (figura 4) y de esta forma desarrollará la 
teniasis. 
 
 
4 
 
De manera accidental, una persona al consumir huevos de T. solium desarrollará 
la cisticercosis. Cuando los parásitos se alojan en el sistema nervioso central 
ocasionan la neurocisticercosis (NC) que es la forma más peligrosa en ésta 
parasitosis (8). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Ciclo biológico de Taenia solium (imagen adaptado de 
http://remediosalternativosnaturales.blogspot.com/2011/02/lombriz-solitaria-tenia.html) 
 
1.1.3 Teniasis-Cisticercosis 
 
La teniasis suele cursar de manera asintomática ya que se produce un daño 
mínimo a la mucosa intestinal. Aunque pueden observarse síntomas 
gastrointestinales, como malestar abdominal, flatulencia, o pérdida de peso, la 
mayoría de pacientes con teniasis en estudios de campo no refieren síntomas y 
menos de la mitad de ellos han notado proglótidos en las deposiciones (9). 
La infección con la forma larvaria (cisticerco) ocasiona diferentes síntomas, los 
cuales dependen de la localización del parásito, la carga parasitaria y la 
respuesta inflamatoria del hospedero. Las manifestaciones clínicas más comunes 
 
 
5 
 
que pueden presentarse son fiebre, mialgias y cefaleas después de una invasión y 
diseminación aguda de cisticercos. Si se enquista el cisticerco en el músculo 
esquelético el principal problema proviene en la pérdida de la función de la 
parte afectada. 
 
1.1.4 Aspectos clínicos de la NC. 
 
Cuando los cisticercos se alojan en el sistema nervioso central pueden originarse 
grandes complicaciones por el efecto de la respuesta inflamatoria,obstrucción 
de los orificios encefálicos y/o sistemas ventriculares, causando hidrocefalia, 
convulsiones, hipertensión craneal, epilepsia focal o generalizada y ataxia (8, 9, 
10). 
 
1.2 Respuesta inflamatoria 
 
En relación a la respuesta inflamatoria en la NC, es común que los parásitos 
tengan algún grado de degeneración e inclusive se encuentren totalmente 
destruidos y solo se observen cicatrices sugerentes de su presencia, 
principalmente en individuos de zonas endémicas para esta parasitosis (11). Es 
decir, a través de la historia natural de la NC se observa un proceso inflamatorio 
crónico (12). En ese proceso, la severidad de la inflamación depende de la 
localización de los cisticercos; por ejemplo, si los parásitos están situados dentro 
del espacio subaracnoideo se desarrolla una intensa respuesta inflamatoria en la 
mayoría de los pacientes en comparación con aquellos cuyos parásitos están 
situados en el parénquima (13). Un hecho importante de cualquier proceso 
inflamatorio mediado por antígenos, es la activación que originan éstos sobre las 
células inflamatorias, particularmente los polimorfonucleares (PMN). El estallido 
respiratorio es un evento inicial de esta activación que consiste en que los PMN 
consumen elevadas cantidades de oxígeno molecular (O2). Por reducciones 
químicas secuenciales sobre el O2 y sus derivados se originan especies reactivas 
de oxígeno (ERO), como el peróxido de hidrogeno (H2O2) capaces de peroxidar 
tanto lípidos solubles como los de las membranas celulares. Esta peroxidación 
 
 
6 
 
lipídica (PL) es capaz de dañar a los tejidos y a las moléculas que rodean al sitio 
de la inflamación (14, 15). Por ejemplo, la PL de las membranas celulares causa 
daño en su función, disminuye la fluidez, inactiva receptores y enzimas unidos a 
ellas así como aumenta la permeabilidad de los iónes y eventualmente conlleva 
a la ruptura membranal (16). 
 
La PL es un factor importante en la patofisiología de diversas enfermedades y en 
el envejecimiento (17, 18). Los elevados productos de la PL se han observado en 
el líquido cefalorraquídeo de diversas enfermedades incluyendo a la NC (19, 20, 
21). En los pacientes con NC se ha demostrado una correlación entre la cantidad 
de los productos de la PL en su líquido cefalorraquídeo y la intensidad de su 
respuesta inflamatoria, inclusive en aquellos con tratamiento anti-inflamatorio. 
Adicionalmente, esta correspondencia fue mayor con los pacientes que 
presentaron síntomas clínicos más severos. 
 
1.3 Moléculas pro-oxidantes. 
 
En los pacientes con NC no se sabe cuáles son los productos de la peroxidación 
lipídica, aunque es muy probable que el colesterol, por su abundancia, sea uno 
de los blancos más comunes de las EROs durante el estallido respiratorio. 
De esta forma el colesterol durante su degradación oxidativa está sujeto a 
oxidaciones por las EROs produciéndose derivados oxidados del mismo u 
oxyesteroles (22). Es decir el colesterol expuesto a peróxidos (O2-, HOO-, H2O2), 
radicales hidroxilos (OH●) origina oxyesteroles. Los oxyesteroles son descritos a su 
vez, como radicales libres porque presentan carbones centrales y pueden originar 
radicales peroxilos con funciones tóxicas (23). Las manifestaciones más claras 
sobre los efectos tóxicos de los oxyesteroles en múltiples organismos están 
relacionadas con la aterogénesis o angiotoxicidad, carcinogénesis, mutagénesis, 
efectos inhibitorios sobre enzimas específicas y modificaciones a las membranas 
celulares. La importancia del colesterol en la estabilidad y las funciones de las 
membranas celulares está bien establecida. Sin embargo la inclusión de 
 
 
7 
 
oxyesteroles a la membrana celular altera su morfología, sobrevida, crecimiento y 
funciones normales. 
Por otro lado, la presencia del colesterol en los helmintos se conoce desde hace 
algún tiempo (24). Sin embargo, hasta la fecha las evidencias han mostrado que 
los helmintos no son capaces de sintetizar este lípido no saponificable sino 
absorberlo de sus huéspedes (25, 26, 27). No obstante el valor total del colesterol 
libre en sus tejidos y/o fluídos es considerable, al menos en larvas de 
Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis y Taenia hydatigena, siendo 
de 2.8 mg/g de peso húmedo que representa el 26 % del total de lípidos presentes 
en estos cestodos. (28, 29). Probablemente este colesterol sea utilizado por los 
cestodos integrándolo a su metabolismo, y como parte del mismo eliminarlo, 
produciendo productos intermediarios tóxicos como ácidos y sales biliares. 
 
1.3.1 Ácidos y sales biliares 
 
Los ácidos biliares son compuestos de 24 átomos de carbono dihidroxilados o 
trihidroxilados, que se derivan del colesterol (componente esencial de las 
membranas celulares, precursor de las hormonas esteroideas, de los ácidos 
biliares y de la vitamina D) (30, 31). 
En los mamíferos la síntesis de los ácidos biliares a partir del colesterol ocurre en el 
hepatocito. Para ello el colesterol es sujeto a una serie de cambios, tanto en su 
núcleo esteroideo como en su cadena lateral, que convierten al colesterol 
altamente insoluble en un ácido biliar hidrosoluble. El paso inicial y además el más 
crítico en la formación de ácidos biliares es la hidroxilación del colesterol en la 
posición 7 del núcleo esteroideo mediante la enzima colesterol 7-α hidroxilasa. El 
grupo 3-hidroxi en el colesterol está en orientación ―beta‖, y es convertido a 
posición ―alfa‖ por un proceso conocido como epimerización. Luego de estas 
reacciones iniciales, el 7-α hidroxicolesterol es modificado por una C27 hidroxilasa, 
que acortan la cadena alquil lateral y agregan un ácido carboxílico para formar 
el ácido biliar quenodesoxicólico. En la vía alterna, la actividad de la C27 
hidroxilasa es precedida por la 12-α hidroxilasa, que agrega un tercer grupo 
hidroxilo al núcleo esteroide, dando lugar al ácido biliar cólico (tri-hidroxílico) (31). 
 
 
8 
 
Luego de la síntesis hepática, tanto el ácido quenodesoxicólico como el ácido 
cólico son modificados en el hepatocito mediante la conjugación con el grupo 
amino de la glicina ó taurina en un enlace amídico. 
Esto sucede por la acción de la colil CoA:amino ácido N-aciltransferasa (BAT) 
sobre el ácido cólico mas glicina originando la sal biliar glicocólico. 
Adicionalmente, la colil-CoA:taurina N-aciltransferasa en presencia de taurina 
producirá la sal biliar quenodeoxicólico 
Estas nuevas estructuras son llamadas sales biliares e incluyen aparte de las ya 
mencionadas, al acido glucocólico, glicoquenodesoxicólico, taurocólico y 
tauroquenodesoxicólico (figura 5) (30). 
Las sales biliares son excretadas junto con la bilis al intestino delgado; en el lumen 
intestinal experimentan una 7-deshidroxilación bacteriana y se transforman en 
ácidos biliares secundarios: ácido desoxicólico y ácido litocólico (31) 
 
 ácido cólico ácido desoxicólico 
 
 
ácido quenodesoxicólico 
 
 
9 
 
 
 ácido taurocólico ácido glucocólico 
 
Figura 5. Estructura química de los ácidos biliares 
 
Los ácidos biliares o sales biliares producidas, tienen la función de actuar como 
surfactantes y ayudar a la emulsión de los lípidos y su absorción intestinal. En la 
fisiología de los parásitos, los ácidos biliares son particularmente importantes para 
completar su ciclo biológico. Ya que la presencia de éstos en el sistema digestivo 
de los mamíferos permite desencadenar diversos mecanismos relacionados con 
la eclosión de los huevos de los helmintos, enquistamiento de protozoarios y la 
evaginación del escolex de los cisticercos de los cestodos (32). Sin embargo, 
existe el lado opuesto a la función positiva mencionada por parte de los ácidos y 
sales biliares. 
Los efectos tóxicos de los ácidos y salesbiliares han sido descritos por diversos 
investigadores (33, 34). Esta toxicidad consiste, por una parte, en su función de 
detergentes, capaces de romper las membranas plasmáticas (35) y por la otra, 
por su capacidad oxidativa. Se sabe que los ácidos biliares al igual que las 
especies reactivas de oxígeno (EROs) y las citocinas inflamatorias son reguladores 
esenciales de los procesos de la muerte celular programada o de necrosis en 
enfermedades hepáticas agudas y crónicas (36). También se conoce de las 
acciones oxidativas de los ácidos biliares siendo el ácido taurolitocólico uno de los 
más pro-oxidativos (37) y el ácido litocólico y quenodeoxicólico tienen 
propiedades genotóxicas y mutagénicas (38). 
 
 
 
 
 
10 
 
1.3.2 Porfirinas 
 
Por otra parte, los cisticercos de T. solium no solamente están expuestos a los 
productos de la PL mencionados. Larralde y colaboradores en 1986 demostraron 
la presencia de diversas porfirinas en el líquido vesicular tanto de cisticercos 
humanos como de cerdos. Hasta el momento no se sabe si estas porfirinas son 
producidas por el parásito o las adquiere del hospedero, sin embargo se ha 
reportado que tienen una gran capacidad de generar EROs como radicales 
hidroxilos, considerados éstos como los más reactivos en los procesos de 
oxidación de las moléculas biológicas (39). Cabe mencionar que las porfirinas son 
compuestos formados con anillos tetrapirrolicos y sustituyentes laterales en ellos 
que tienen una función pro-oxidante debido a su interferencia con los sistemas 
redox celulares y además les permiten funcionar tanto en presencia o no de la luz 
(40, 41). 
Las porfirinas son el grupo prostético de las cromoproteínas porfirínicas. Están 
compuestas por un anillo tetrapirrólico (es decir 4 anillos pirrólicos designados 
como A, B, C y D, unidos a través de cuatro puentes metenilos α, β, γ y δ ) con 
sustituyentes laterales y un átomo metálico en el centro, unido mediante cuatro 
enlaces de coordinación (figura 6). Se clasifican basándose en los sustituyentes 
laterales del anillo, de modo que se distinguen mesoporfirinas, uroporfirinas, 
etioporfirinas y protoporfirinas. Estas últimas son las más relevantes y presentan 
como sustituyentes 4 metilos, 2 vinilos y 2 grupos propiónicos. 
 
 
Figura 6. Núcleo de la porfirina 
 
http://es.wikipedia.org/wiki/Grupo_prost%C3%A9tico
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Cromoprote%C3%ADna&action=edit&redlink=1
http://es.wikipedia.org/wiki/Pirrol
http://es.wikipedia.org/wiki/Sustituyente
http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81tomo
http://es.wikipedia.org/wiki/Metal
http://es.wikipedia.org/wiki/Enlace_qu%C3%ADmico
http://es.wikipedia.org/wiki/Metil
http://es.wikipedia.org/wiki/Vinil
 
 
11 
 
Existen 15 isómeros de protoporfirinas, pero en la naturaleza solo aparece el IX, 
que se caracteriza por disponer de cuatro grupos metilo en posición 1,3,5 y 8, 
grupos vinilo en posición 2 y 4 y en posición 6 y 7 grupos propiónicos. A este grupo 
pertenecen la hemoglobina, la mioglobina y los citocromos, entre otros. 
Las porfirinas tienen un papel central en los seres vivos debido a sus propiedades 
físicas, químicas y biológicas, ya que intervienen en procesos de captura del 
oxígeno y utilización de energía que ocurren en la célula (42). Por ejemplo en las 
plantas verdes, la clorofila es el compuesto responsable de la conversión de la 
energía luminosa del sol en energía química, que es ―almacenada‖ en los enlaces 
de los carbohidratos. La característica estructural esencial de las clorofilas es un 
sistema de cuatro anillos de pirrol unidos por puentes que contienen un único 
átomo de carbono. 
Por otro lado, en los humanos la porfirina mas abundante es el grupo hemo y 
como más adelante se mencionará, esta molécula es importante en muchos 
procesos celulares. 
Las porfirinas presentes en los grupos hemo y las clorofilas presentan varios 
sustituyentes en los anillos pirrólicos y reciben el nombre general de porfirinas. La 
porfirina, con los cuatro átomos de nitrógeno de los anillos de pirrol dirigidos hacia 
el centro del macrociclo, une iones metálicos. En el grupo hemo (figura 7) el ión es 
hierro (II); en las clorofilas es el ión magnesio (43). 
 
 
Figura 7. Estructura química del grupo Hemo. 
 
 
http://es.wikipedia.org/wiki/Is%C3%B3mero
http://es.wikipedia.org/wiki/Metilo
http://es.wikipedia.org/wiki/Vinilo
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Propi%C3%B3nico&action=edit&redlink=1
http://es.wikipedia.org/wiki/Hemoglobina
http://es.wikipedia.org/wiki/Mioglobina
http://es.wikipedia.org/wiki/Citocromo
 
 
12 
 
1.3.2.1 El grupo Hemo 
 
El hemo es una molécula esencial para las células aerobias; en combinación con 
ciertos polipéptidos, juega un papel fundamental en importantes procesos 
fisiológicos. Es el grupo prostético en numerosas hemoproteínas (hemoglobina, 
mioglobina, citocromos, óxido nitroso sintetasa, etc.) y posee un importante papel 
en el control de la síntesis de ciertas proteínas (globina, enzimas involucradas en la 
biosíntesis del hemo, hemo-oxigenasa 1 y receptores de transferrina) y en la 
diferenciación celular (44, 45). 
Las hemoproteínas se encuentran involucradas en un amplio espectro de 
funciones biológicas cruciales, que incluyen la unión a oxígeno (hemoglobina y 
mioglobina), el metabolismo celular del oxígeno (oxidasas, peroxidasas, catalasas 
e hidroxilasas) y la transferencia de electrones (citocromos) (45). 
 
1.3.2.2 Biosíntesis del hemo 
 
La síntesis de porfirinas ocurre en prácticamente todas las células vivas. En los 
mamíferos; dicha síntesis, ocurre principalmente en tejido eritropoyético e hígado. 
La síntesis del grupo hemo (figura 8) involucra ocho enzimas, siendo la primera y 
las tres últimas mitocondriales y las cuatro restantes citoplasmáticas (44). 
 
 
13 
 
 
Figura 8. Esquema de la vía sintética del hemo (Adaptado de Richard 2005) 
 
El primer paso en la síntesis del hemo implica la condensación, catalizada por la 
enzima δ-aminolevúlico sintetasa (ALA-S), de glicina y succinil CoA para formar 
una molécula de ácido δ-aminolevúlico. Esta reacción es la etapa limitante de la 
velocidad de la síntesis de hemo. 
 
El ALA formado es transportado activamente al citoplasma (46). En el citosol, la 
enzima ácido δ- aminolevúlico deshidrogenasa (ALA-D), también llamada 
porfobilinógeno sintetasa (PBG-S), cataliza la condensación de dos moléculas de 
ALA en un monopirrol llamado porfobilinógeno (PBG) (44). 
 
 
14 
 
Posteriormente, cuatro moléculas de PBG se condensan para formar un tetrapirrol 
lineal inestable denominado hidroximetilbilano (HMB). Esta reacción es catalizada 
por la enzima porfobilinógeno deaminasa (PBG-D), que también recibe el nombre 
de hidroximetilbilano sintetasa (HMB-S). El HMB sirve como sustrato para la 
uroporfirinógeno III sintetasa (URO III–S) o isomerasa, que cataliza la conversión del 
tetrapirrol a uroporfirinógeno III (UROgen III) por inversión del anillo D de HMB, 
seguida por el cierre del macrociclo en forma asimétrica. (44) 
El esqueleto de la porfirina ya se encuentra formado y las reacciones siguientes 
alteraran las cadenas laterales y el grado de saturación del anillo de porfirina. 
El paso siguiente consiste en la decarboxilación secuencial de las cuatro cadenas 
laterales de ácido acético (-CH2—COOH) del UROgen III por acción de la enzima 
citosólica UROgen decarboxilasa (UROD). Esta decarboxilación en etapas, se 
realiza partiendo de un compuesto de ocho carboxilos (UROgen III), pasando por 
intermediarios de siete (firia o heptaporfirinógeno III), seis (hexaporfirinógeno III) y 
de cinco carboxilos (pentaporfirinógeno III), hasta llegar a un compuesto de 
cuatro carboxilos (coproporfirinógeno III o COPRO gen III). La URO-D posee la 
capacidad de actuar sobre el UROgen I produciendo el COPROgen I, sin 
embargo este compuesto no puede ser utilizado como sustrato por las demásenzimas de la vía metabólica, por lo cual en las condiciones patológica en las 
que se forma COPROgen I, este se acumula y finalmente, es excretado. 
El COPROgen III es transportado a la mitocondria, donde la enzima mitocondrial 
coproporfirinogenasa (CPGasa) es la encargada de catalizar la decarboxilación 
oxidativa de dos cadenas laterales de ácido propionico del COPROgen III para 
producir el protoporfirinógeno IX (PROTOgen IX). 
El PROTOgen IX se oxida a protoporfirina IX (PROTO IX) por la acción de la enzima 
mitocondrial protoporfirinógeno oxidasa (PPGox). La última etapa de este camino 
metabólico implica la inserción de un ión ferroso en el anillo porfirínico de la 
PROTO IX por acción de la enzima mitocondrial ferroquelatasa (Fe-Quel) para 
generar un grupo hemo. 
 
 
 
 
 
15 
 
1.3.2.3 Regulación de la síntesis de hemo 
 
La regulación en la síntesis del hemo se encuentra en la vía de elaboración del 
hemo, es decir el paso limitante en la síntesis del hemo se halla en la reacción 
inicial de glicina y succinil-CoA para formar acido aminolevulínico (ALA). El hemo 
inhibe la ALA sintetasa y provoca una disminución en la producción del hemo (un 
mecanismo de retroalimentación negativa). Otras enzimas inhibidas por el hemo 
son la ALA deshidrogenasa (porfobilinogeno sintetasa) y porfobilinogeno 
deaminasa (PBG-D) (47). 
La ferroquelatasa también cumple un papel regulador en la biosíntesis del hemo, 
por medio de un mecanismo de retroalimentación negativa de la protoporfirina IX 
al inhibir a la enzima (47). 
 
1.3.2.4 Catabolismo del hemo 
 
Los glóbulos rojos tienen una vida media de 120 días. Las células senescentes son 
reconocidas por cambios en la membrana y son fagocitadas y eliminadas por las 
células del sistema retículo endotelial (S.R.E) principalmente en las paredes 
vasculares de hígado y bazo, y en médula ósea. 
La destrucción de los glóbulos rojos senescentes y la ruptura de la molécula de 
hemoglobina y de otras hemoproteínas (citocromos, peroxidasas, catalasas y 
triptófano-pirrolasa) producen moléculas de hemo que se degradan junto con el 
hemo libre. La parte proteica es hidrolizada por proteasas pancreáticas, mientras 
que el grupo hemo sufrirá transformaciones secuenciales. 
El único mecanismo fisiológico de degradación del hemo es mediado por el 
complejo multienzimático llamado sistema microsomal hemo-oxigenasa (HO). En 
mamíferos, este complejo cataliza la oxidación del hemo a biliverdina, hierro libre 
y monóxido de carbono (45), que es normalmente reciclado quedando 
disponible para la síntesis de nueva hemoglobina. 
El complejo microsomal está constituido por las enzimas hemo-oxigenasa y 
NADPH- citocromo P450 reductasa y cataliza la conversión secuencial del 
complejo hierro-protoporfirina IX a biliverdina IXa (47) (figura 9). 
 
 
16 
 
La hemo-oxigenasa es altamente estereoespecífica, clivando exclusivamente en 
el puente α-meso a hemo para dar biliverdina IXα. Para esta reacción son 
consumidas tres moléculas de O2 y un grupo reductor NADPH. El α-meteno es 
eliminado como CO y la molécula de hierro es liberada (48). La biliverdina se 
convierte rápidamente en bilirrubina por la enzima citosólica NADPH-biliverdina 
reductasa, presente en el hígado, riñón, músculo, cerebro, con consumo de 
NADPH (49) (figura 9). 
 
 
 
Figura 9. Esquema de la degradación del Hemo (44) 
 
 
 
17 
 
El monóxido de carbono (producto de la reacción) se involucra en procesos de 
apoptosis, inflamatorios, aterosclerosis, contracción vascular y protección celular 
(50). 
El hierro ferroso liberado pasa a formar parte del hierro disponible para la síntesis 
de hemoglobina y otras hemoproteínas, ya que solo el 1-3% del hierro utilizado 
diariamente en la síntesis de células de la serie roja proviene de la dieta (51). 
La bilirrubina en el plasma se une no covalentemente a la albúmina quien la 
transporta hasta el hígado. Al disociarse la bilirrubina de la albúmina, la bilirrubina 
ingresa al hígado y en el citoplasma se une a las glutatión S-transferasas. En el 
citoplasma del hepatocito la bilirrubina se hace más soluble cuando se conjuga 
con dos moléculas de ácido glucorónico, por medio de la enzima bilirrubina 
glucoronil transferasa en presencia de acido glucorónico-UDP. Esto da lugar al di-
glucoronato de bilirrubina, la cual es transportada a la luz del canalículo biliar, 
para ingresar al conducto biliar. 
La bilirrubina diglucoronidada se elimina por bilis y pasa al intestino en donde es 
hidrolizada por la acción de bacterias intestinales, y se convierte en 
urobilinógeno, este ultimo al ser oxidado por bacterias se convierte en 
estercobilina, pigmento que confiere a las heces su color característico. Parte del 
urobilinógeno es reabsorbido en el intestino ingresando nuevamente al torrente 
sanguíneo hepático y de ahí al riñón donde es convertido en urobilina y 
excretado (figura 10). 
 
 
 
18 
 
 
Figura 10. Esquema del catabolismo del Hemo (Adaptado de 
http://www.google.com.mx/imgres?q=catabolismo+del+grupo+hemo&um.html). 
 
1.3.2.5 Toxicidad de las porfirinas 
 
Las porfirinas y el grupo hemo además de participar en funciones importantes en 
el metabolismo de los organismos aeróbicos, pueden producir una gran variedad 
de efectos tóxicos, si estas moléculas no son metabolizadas adecuadamente. 
El grupo hemo cuando se encuentra en forma libre es potencialmente citotóxico 
porque puede originar radicales libres de oxígeno. Ya que el hierro en estado 
ferroso (Fe 2+), que se encuentra en el grupo hemo y en presencia de H2O2 
catalizará este peróxido produciendo el radical hidroxilo (OH•) el cual es muy 
reactivo. Este OH• reacciona con las moléculas biológicas oxidandolas, al 
interaccionar con los lípidos de las membranas celulares ocasiona su 
peroxidación o formación de hidroperóxidos lipídicos. Las consecuencias de esta 
peroxidación producen la pérdida de diversas propiedades de las membranas 
como son su fluidez, selectividad para el paso de moléculas, adhesión intercelular. 
 
 
19 
 
También las porfirinas pueden activar la vía clásica y alterna del complemento y 
desencadenar diversos procesos patológicos como la inflamación y la lesión 
tisular (52) 
Un ejemplo de un proceso inflamatorio que desencadenan las porfirinas, se 
puede notar en la enfermedad porfiria cutánea, en el cual la acumulación de 
porfirinas en la dermis ocasiona que estas moléculas absorban radiaciones 
electromagnéticas, que elevando el potencial de energía de sus electrones 
haciéndolos saltar a orbítales mas energéticos. Este exceso de energía se 
transfiere al oxígeno, para producir oxígeno monoatómico y especies reactivas 
de oxígeno. Por tanto la membrana lipídica de las células se vería afectada por 
la fotooxidación ocasionada por estas especies reactivas, destruyendo a las 
células epiteliales (53). 
Existe evidencia que sugiere otra forma de daño producido por las porfirinas al 
sistema inmunológico, al activar al complemento. Lo anterior se mostró 
experimentalmente cuando una uroporfirina humana irradiada a 405 nm fue 
capaz de originar la hidrólisis de las moléculas del complemento C3 y C5 y en 
consecuencia producir la actividad quimiocinética de leucocitos 
polimorfonucleares humanos in vitro. (52). 
Cabe mencionar que las porfirinas, al menos in vitro, son capaces de originar 
especies reactivas de oxígeno (ERO) en la oscuridad (54). Además, se ha 
postulado que el daño tóxico de las porfirinas se debe a su interferencia con el 
ciclo celular redox (39). 
 
1.3 Especies Reactivas. 
 
Las especies reactivas (ER) son moléculas que pueden tomar uno o más 
electrones o protones, produciendo intermediarios parcialmente reducidos. Estas 
moléculas al ser más reactivas van a provocar un daño parcial o total en las 
células. Las ER pueden además amplificar las lesiones mediante reacciones en 
cadena que generan nuevasER. El oxígeno y el nitrógeno están involucrados en 
la formación de estos compuestos. Si bien para los organismos aeróbicos la 
molécula de oxígeno cobra elevada importancia al actuar como aceptor final 
 
 
20 
 
de electrones en la producción de ATP durante la respiración, ésta molécula se 
puede volver tóxica al aceptar un electrón creando el ión radical libre o anión 
superóxido (O2-) y adicionalmente en presencia de un protón la forma protonada 
del superóxido el perhidroxilo. Si el anión superóxido se vuelve a reducir se 
originará, el peróxido de hidrógeno (H2O2) y éste al reducirse el hidroxilo (OH●), los 
cuales son capaces de generar más compuestos electrófilos que favorecen el 
daño celular (55, 56). 
Las ER lesionan a las células debido a que interaccionan con polisacáridos, 
lípidos, proteínas e inclusive ADN y en consecuencia potencialmente cambian la 
estructura y funcionalidad de estas moléculas, generando moléculas oxidadas y 
oxidantes, así como radicales que terminan por desajustar el sistema redox, 
dando paso al fenómeno conocido como estrés oxidativo (55, 56). 
En el caso de los helmintos los ambientes de oxígeno son limitados, no obstante se 
encuentran expuestos a estrés oxidativo por los diversos mecanismos de defensa 
del hospedero, por ejemplo, la liberación de ER por parte de algunas células del 
sistema inmune (macrófagos, neutrófilos y eosinófilos, etc) y el ataque de otros 
xenobióticos. Con el propósito de mantener el balance redox, los organismos 
incluidos los helmintos, han desarrollado defensas antioxidantes capaces de 
detectar las ER, eliminarlas catalíticamente, disminuir su formación y contenerlas 
―físicamente‖ por acarreo o por inmolación. Este conjunto de moléculas 
enzimáticas y no enzimáticas se agrupa en el sistema detoxificante (55, 57, 58, 59). 
 
1.5 Sistema detoxificante 
 
El sistema detoxificante es un conjunto de procesos metabólicos de defensa para 
la biotransformación química de diversas sustancias tóxicas (xenobióticos o 
endobióticos) favoreciendo su eliminación. 
Los helmintos, como T. solium, al igual que otros organismos han desarrollado 
defensas contra las ER (de oxígeno o nitrógeno) y contra diversos xenobióticos 
(como los fármacos antihelmínticos), en las que pueden identificarse moléculas 
de tipo enzimático y no enzimático. Dentro del tipo no enzimático se encuentran 
los compuestos de bajo peso molecular como la vitamina E, el ácido ascórbico, el 
 
 
21 
 
piruvato, el urato, la bilirrubina, el glutatión (GSH), la tiorredoxina, el NADH y el 
NADPH, que actúan directamente sobre las ER y se oxidan rápidamente con el fin 
de preservar las biomoléculas de este organismo. Muchos de estos antioxidantes 
también actúan como cofactores de los sistemas enzimáticos desintoxicantes. 
En el caso del sistema enzimático, las ER y los xenobióticos se metabolizan 
mediante mecanismos distinguibles como el metabolismo antioxidante y el 
metabolismo xenobiótico. El sistema detoxificante se divide en las fases I, II y III, 
que integran una vía secuencial en la inactivación y eliminación de cualquier 
tóxico (55, 56). 
En la fase I se realiza una biotransformación de los grupos funcionales susceptibles 
en las moléculas tóxicas mediante oxidación, reducción ó hidrólisis haciendo más 
polares a estos compuestos. De las tres clases de reacciones antes mencionadas, 
las de oxidación son las más comunes y aunque en otros organismos la familia de 
los citocromos P450 lleva a cabo esta catálisis, en T. solium como en otros 
parásitos, no se ha registrado actividad de tal variedad de mono-oxigenasas. No 
obstante, el parásito cuenta con otras enzimas que llevan a cabo la oxidación de 
los xenobióticos y de las ER como son la superóxido dismutasa, la xantina oxidasa, 
la glutaredoxina, la peroxiredoxina y la monoamino oxidasa, por mencionar 
algunas, cabe señalar que T. solium carece también de actividad de catalasa. 
En la fase II se cataliza la adición de pequeñas moléculas a los xenobióticos 
generando nuevos enlaces covalentes, por lo que las reacciones se denominan 
como ―reacciones de conjugación‖, siendo el GSH, el ácido uridin-5-difosfo-α-D-
glucorónico (UDPG), los acetiles, la S-adenosilmetionina (SAM) y el 3-
fosfoadenosin-5-fosfosulfato (PAPS) los cosustratos más comunes. Las enzimas que 
catalizan tales conjugaciones son las glutatión S-transferasas (GSTs), la uridin-5-
difosfato-glucoronil-transferasa ó UDP-glucoroniltransferasa, la N-acetil transferasa, 
la metil-transferasa y la sulfo-transferasa, respectivamente. Para T. solium las 
reacciones de conjugación con glutatión son las de mayor importancia, no sólo 
por la abundancia del cosustrato y de este tipo de enzimas, sino también por la 
versatilidad que ofrecen y porque se han postulado como el principal mecanismo 
desintoxicante en helmintos ante la carencia de otros sistemas. 
 
 
22 
 
En la fase III se encuentran el conjunto de proteínas que permiten la 
transportación, compartamentalización y/o excreción de los conjugados o 
aniones orgánicos a eliminar y que constituyen la fase III, como las proteínas de 
resistencia a múltiples drogas ó MRPs (multidrug-resistance protein) y los 
transportadores de aniones orgánicos Oats (organic anion transporters). Sin 
embargo en T. solium aún no han sido reportados este tipo de transportadores (55, 
59, 60). 
Como se mencionó anteriormente los cisticercos de T. solium en el interior de sus 
huéspedes estén expuestos a las moléculas tóxicas descritas con anterioridad, de 
tal forma que para enfrentar con éxito su interacción con las mismas ha de ser 
necesario que utilicen un sistema detoxificante efectivo. Las glutatión S-
transferasas son enzimas detoxificantes de la fase II de detoxificación. En T. solium 
existen tres isoformas de GSTs citosólicas y una microsomal (61, 62). 
 
1.6 Glutatión S-transferasas (GSTs) 
 
Son enzimas detoxificantes con amplias especificidades hacia los sustratos 
hidrofóbicos electrofílicos (63, 64). Esta característica les permite detoxificar tanto 
a compuestos xenobiótcos, incluyendo antihelmínticos, (65) como endobióticos, 
éstos últimos originados durante el metabolismo oxidativo. 
 
1.6.1 Estructura 
 
La estructura general de las GSTs consiste en dos dominios, N y C-terminal. El 
dominio N-terminal constituye alrededor de una tercera parte de la proteína y 
consiste en una estructura β−α−β−α−β−β−α. El centro del dominio está compuesto 
de tres láminas beta situadas entre hélices alfa (α/β/α). El dominio C-terminal 
compone los otros dos tercios de la proteína y está constituido por varias hélices 
alfa. El centro del dominio consiste en la agrupación de cuatro de estas hélices 
(66). 
 
 
23 
 
La estructura cristalográfica de algunas GSTs citoplásmicas ha sido determinada 
por el método de cristalografía de rayos X. Estas estructuras se pueden apreciar 
en la figura 11 
 
Figura 12. Estructuras tridimensionales de subunidades (monómeros) de GST. Los dominios N-terminal y C-terminal 
están representados en rojo y azul. Los residuos esenciales para la actividad catalítica (tirosina, y cisteina) están 
representados en color amarillo. Las estructuras corresponden a a) GST del camarón, b) GST del hombre, c) GST de 
Proteus mirabilis y d) GST de Fasciola hepática. (67). 
 
Las GST suelen formar dímeros con subunidades de 24.4 a 26.5 kDa. (62, 68) y las 
principales interacciones entre las subunidades suceden entre el dominio N-
terminal de una subunidad con la C-terminal de la otra. No se ha descrito 
actividad catalítica de los monómeros de GST de mamíferos y estudios de 
desnaturalización proteica sugieren que la estructura catalíticamente activa es 
dimérica (69, 70). 
 
1.6.2 Clasificación y nomenclatura 
 
La gran variedad de proteínas con actividad GST y su presencia a lo largo de 
toda la escala evolutiva hace que su clasificación resulte compleja e inclusoconfusa. 
El nombre sistemático que refiere a las glutatión S-transferasas fue acordado por 
la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular y su clave numérica es: 
EC 2.5.1.18. 
 
 
24 
 
Un criterio que se tomó anteriormente para clasificarlas, es su especificidad por el 
sustrato. Sin embargo, una vez purificadas diferentes isoenzimas, se vió que su 
especificidad por el sustrato se compartía entre ellas. Por ello su clasificación 
actual considera además de su afinidad por el sustrato otros parámetros como: 
secuencia de aminoácidos, propiedades inmunológicas y papel fisiolológico (71). 
Las enzimas de una misma clase comparten al menos un 60% de identidad, 
habiendo entre clases al menos un 30% de identidad. Para la clasificación se 
hace énfasis en la estructura primaria del extremo N-terminal ya que, entre clases, 
esta región tiende a estar relativamente conservada al ser parte del sitio activo. 
Esta región contiene un residuo esencial, que puede ser una tirosina, serina o 
cisteína, que interacciona con el grupo tiol del GSH. 
Las GSTs de mamíferos están divididas en clases designadas como Alfa, Mu, Pi, 
Sigma, Theta, Zeta y Omega (figura 12). Con base en ellas se ha hecho la 
clasificación de GST de otros organismos y además se han descrito clases nuevas 
como es el caso de las Lambda, Tau y DHAR (de ―active glutathione-dependent 
dehidroascorbate reductases‖) que actualmente son exclusivas de plantas. 
Además, existen otras clases caracterizadas en helmintos (GSTTs 26.5), insectos, 
hongos y bacterias. (72). 
Las GST humanas se han nombrado respecto de la clase en la que pueden estar 
contenidas (A, M, P, T y O para Alfa, Mu, Pi, Theta y Omega respectivamente), 
acompañado de la cantidad de subunidades que la componen o el tipo de 
isoenzima, el cual se designa con números arábigos. Por ejemplo, un homodímero 
de tipo Mu se denomina M1-1 y los heterodímeros de tipo Alfa se denominan A1-2. 
Además, la nomenclatura puede ir acompañada de la especificación de las 
variaciones alélicas: M1a-1b. Cuando es necesario distinguir GSTs de diferentes 
especies biológicas, se agregan prefijos. Por ejemplo mGST A1-1 y rGST A1-1 se 
refieren a enzimas de la clase Alfa de ratón (mouse GST) y de rata (rat GST) 
respectivamente. 
 
 
 
25 
 
 
Figura 12. Se observa solo una cadena de diversas GSTs de mamíferos (alfa, mu, pi, sigma). Las GSTs que comparten 
cierta similitud con las GSTs de plantas y GSTs de mamíferos son de la clase theta. 
 
1.6.3 Mecanismo catalítico 
 
Las GST se pueden encontrar como monómeros, homodímeros o heterodímeros y 
las unidades que componen estas últimas siempre pertenecen a la misma clase. 
Hasta ahora no se ha descrito actividad catalítica de monómeros en mamíferos, 
pero en plantas se han descrito GST activas como monoméros en las clases 
Lambda y DHAR (73). 
Respecto al funcionamiento de estas enzimas se deben abordar dos cuestiones 
importantes: el mecanismo que le permite a la enzima reconocer y activar al GSH 
para el ataque nucleofílico y la manera en que las GST reconocen 
específicamente los sustratos electrofílicos, como el 1,4, diclorodinitrobenceno 
(CDNB). 
 
1.6.3.1 Activación del GSH 
 
Uno de los aspectos fundamentales del mecanismos catalítico de las GST es la 
manera en que estas enzimas usan las interacciones con el GSH para activar el 
 
 
26 
 
átomo de azufre de ésta molécula y así iniciar el ataque nucleofílico. El tripéptido 
GSH está unido en una conformación extendida, donde el residuo γ-glutamil está 
dirigido hacia la interfase del dímero GST, mientras que el azufre del residuo 
cisteína apunta hacia la subunidad a la cual está unido y se localiza cerca de la 
superficie de la proteína (figura 13). 
 
Figura 13. Disposición del GSH en el sitio activo de las GST. El GSH y los residuos que interactúan con el GSH a través 
de puentes de hidrógeno están indicados mediante un esquema de barras. El diagrama corresponde a una GST bacteriana 
(74). 
 
La región más conservada estructuralmente en todas las enzimas GST citosólicas 
es el motivo ββα del centro activo, el cual se encarga de reconocer la porción γ-
glutamil del GSH. Este elemento estructural de las GSTs empieza con un residuo 
cisprolil que está justo antes de la lámina β3 y que continúa con la hélice α3. La 
función de este residuo es permitir que se mantenga el plegamiento total del 
dominio. Existen dos residuos localizados entre la lámina β4 y la hélice α3 que 
están directamente relacionados con este reconocimiento: un residuo glutamato 
o glutamina seguido de un residuo serina, treonina o cisteína. 
Las enzimas de la clase Alfa, Mu, Pi Theta y Sigma, utilizan el grupo hidroxilo del 
residuo serina o tirosina localizado cerca del dominio N-terminal del polipéptido 
para activar el átomo de azufre del GSH. El aminoácido hidroxilado actúa como 
donador de hidrógeno para el azufre, se forma el complejo E· GSH, esto genera la 
ionización del complejo. 
La especie reactiva de los complejos binarios formados entre las GST de cualquier 
clase y el GSH es el ion tiolato (GS-), el cual forma un puente de hidrógeno con el 
 
 
27 
 
hidroxilo de la serina o de la tirosina de las GST. Este puente de hidrógeno 
disminuye la afinidad por protones del grupo hidroxilo y aumenta la estabilidad 
del puente de hidrógeno con el azufre del GSH (75). 
La presencia de sustratos electrofílicos tóxicos activa a las GST, ya que estas 
enzimas permanecen inactivas en ausencia de este tipo de compuestos. 
La formación del conjugado de GSH con sustratos electrofílicos como el CDNB 
puede ser medido espectrofotométricamente. Este es el método más común 
para evaluar la actividad de las GSTs (71). 
 
1.6.3.2 Especificidad sobre sustratos electrofílicos 
 
El dominio C-terminal de las GSTs, es el encargado de alojar el sustrato electrofílico 
y está formado básicamente por hélices α. El número de las hélices varía entre 
clases de GST y las hélices 4α y 5α proporcionan un ambiente hidrofóbico para la 
estabilidad del sustrato dentro del dominio. Respecto a la posición del sustrato 
electrofílico dentro de la subunidad, éste se coloca sobre la estructura formada 
por la lámina β1 y la hélice α1 del dominio C-terminal. Estas dos estructuras dan 
forma a la base de la cavidad del dominio y los laterales o paredes están 
formados por hélices α y por la extensión final del dominio C-terminal. La forma de 
esta cavidad varía de una clase a otra, lo cual determina la variabilidad de 
sustratos que pueden ser transformados por estas enzimas. 
En muchas clases de GST la presencia de hélices o de asas en el dominio C-
terminal contribuye a que el dominio tenga una plasticidad estructural variada. 
Por ejemplo, la hélice α9, que es característica de la clase Alfa, forma una base-
soporte para el sustrato electrofílico en el dominio C-terminal. La clase Sigma tiene 
esta región más corta y eso trae como consecuencia que su sitio activo sea más 
abierto y las enzimas de tipo Mu tienen el asa característica de esta clase (75). 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
1.6.4. Localización celular de las GSTs 
 
La localización celular de las GST puede variar a pesar de que un gran número de 
ellas son solubles. La mayoría se han descrito en el citoplasma aunque algunas 
están presentes en el núcleo (76), los peroxisomas (77) y la mitocondria (78), 
donde pueden tener funciones peculiares para la integridad de estos organelos. 
Por ejemplo, GSTP1-1 en el núcleo puede estar asociada con la protección del 
ADN frente al daño inducido por la doxorubicina, causando la adquisición de 
resistencia a medicamentos usados en el tratamiento contra células tumorales 
(79). Se sabe también que las GST presentes en la mitocondria (GSTA1-1, GSTA4-4 
y GSTM1-1) pueden tener un papel importante en la defensa frente al estrés 
químico y oxidativo (78). En el caso de la GST peroxisomal,hGSTK1-1, se ha 
clasificado dentro de la clase mitocondrial ya que comparte similitud de 
secuencia con este grupo de GST (69% con mGSTK1-1 y 71% con rGSTK1-1) así 
como por su localización exclusivamente peroxisomal y mitocondrial (77). Es 
importante mencionar que algunas proteínas localizadas en retículo 
endoplásmico y en mitocondria también se han detectado abundantemente en 
los peroxisomas de los fibroblastos de ratón (80). Esta observación resulta 
importante, ya que estaría indicando una relación física entre estos tres organelos 
y una relación funcional entre las proteínas allí localizadas (80). 
La ausencia de isoenzimas particulares en las células puede predisponer a los 
tejidos a diferentes tóxicos químicos (antihelmínticos). Por ejemplo la ausencia de 
la clase Mu en la cual tiene gran actividad con epóxidos, el tejido es más 
susceptible a los efectos tóxicos por esta clase de compuestos (68). 
 
 
29 
 
1.6.5 Importancia biológica de las GSTs 
 
Una de las características más importantes de la superfamilia de las GSTs es la 
diversidad en la función enzimática, lo que les permite participar en diversos 
procesos metabólicos y enzimáticos, como se indicó anteriormente. Esta 
diversidad en la función enzimática las hace especialmente interesantes desde el 
punto de vista terapéutico y farmacológico, ya que algunas de sus actividades 
pueden relacionarse con aspectos puntuales del tratamiento de algunas 
enfermedades. Aunque el papel farmacológico de las GSTs en el metabolismo y 
detoxificación de xenobióticos está ampliamente descrito, el significado de la 
conjugación catalizada por las GSTs de compuestos endógenos no se ha 
explicado por completo. Algunos de los compuestos endógenos, particularmente 
aquellos que se han formado durante los procesos de degradación oxidativa de 
componentes celulares, son objeto de especial atención por su capacidad de 
atacar moléculas nucleofílicas, que pueden convertirse posteriormente en 
compuestos tóxicos (81). Las GSTs pueden catalizar la conjugación con GSH de 
compuestos endógenos alquenil α, β-insaturados como 4-hidroxinonenal (4-HNE), 
malonaldialdehído, acroleína, y bases propenales como citosina propenal, timina 
propenal y uracil propenal. Este proceso de conjugación con GSH protege contra 
la actividad de estos tóxicos potenciales (82, 83). Dada su naturaleza electrofílica, 
estos compuestos pueden reaccionar espontáneamente con el GSH pero la 
reacción es de 500 a 600 veces más rápida en presencia de las GST (81). 
También se considera la relación existente entre la patogénesis de algunas 
enfermedades y la actividad de las GST en el metabolismo de los productos de la 
peroxidación lipídica. Una de las hipótesis sobre la patogénesis de la enfermedad 
de Alzheimer (AD) es la relación que existe entre los niveles elevados de 
marcadores para estrés oxidativo y la degeneración neuronal (84). Este nivel 
elevado de estrés oxidativo en el cerebro de los pacientes con AD se caracteriza 
por un aumento en la peroxidación lipídica, proteínas oxidadas y ADN oxidado. 
Además, se ha detectado una reducción en la cantidad de ácidos grasos poli-
insaturados en los cerebros de pacientes con AD (22, 85, 86, 87). Teniendo en 
cuenta todos estos datos, posiblemente el 4-HNE tiene un papel importante en la 
 
 
30 
 
patogénesis de AD como producto de la peroxidación lipídica, ya que los niveles 
de este compuesto están también elevados en el cerebro de pacientes con AD 
(88). Las GST pueden estar cumpliendo un papel protector frente al 4-HNE, ya que 
el pretratamiento de cultivos primarios de células de hipocampo de ratón con 
GST y la posterior exposición a concentraciones tóxicas de 4-HNE aumenta la 
superviviencia celular comparado con células no pretratadas (88). La actividad 
peroxidasa de las GST de clase Alfa también está relacionada con la protección 
frente a estrés oxidativo, actuando sobre los hidroperóxidos de fosfolípidos. Se ha 
demostrado que la sobreexpresión de hGSTA1-1 en la línea celular K562 atenúa la 
peroxidación lipídica en condiciones normales y bajo estrés oxidativo generado 
por exposición a peróxido de hidrógeno (89). La GST no solo esta relacionada con 
la protección al estrés oxidativo si no también participa en la transferencia del 
grupo hemo (protoporfirina IX incluyendo Fe3+) de la mitocondria al apocitocromo 
P450 en el retículo endoplásmico (90). 
Por otra parte cabe destacar que las GSTs fueron originalmente denominadas 
ligandinas al descubrir por azar entre 1967 y 1969 que tenían la capacidad de 
unirse a los ácidos biliares (91). Por lo tanto, fueron originalmente descritas no por 
su actividad catalítica sino por su afinidad a aniones orgánicos como la 
bilirrubina, bromosulfoftaleina, indocianina verde, etc. Estudios subsecuentes 
incluyeron otros ligandos como hidrocarbonos aromáticos policíclicos, el grupo 
hemo y sus derivados además de ácidos grasos, esteroides, gastrina y hormonas 
tiroideas (91, 92). Es decir las GSTs unen estos ligandos de manera no covalente 
(en un sitio diferente del sitio activo) y previamente a su biotransformación o 
excreción en la bilis. Es tan grande el número y la variedad de ligandos que 
pueden unir las GSTs que se ha sugerido que tienen una función similar al de la 
albúmina pero en el citoplasma. Adicionalmente, algunos autores (93, 94, 95) 
consideran que es más importante la función de unir ligandos por parte de las 
GSTs que la catalítica. 
Debido a la alta capacidad que tienen las GSTs de mamíferos de unir diferentes 
moléculas, una posibilidad para identificar la función de unir ligandos en zonas 
diferentes a la región catalítica, es el empleo de técnicas espectroscópicas. Estas 
técnicas ofrecen la posibilidad de medir indirectamente la unión entre una 
 
 
31 
 
proteína y su ligando, a través de la emisión de fluorescencia de sus fluoroforos 
(por ejemplo triptófanos, tirosinas y fenilalaninas). 
 
1.7 Estudios de fluorescencia 
 
La espectroscopia de fluorescencia permite estudiar procesos físicos 
fundamentales de las moléculas, como es la relación estructura-función e 
interacciones de proteínas y ácidos nucleicos con ligandos (96). 
El fenómeno de la fluorescencia es un proceso originado por la absorción de la 
luz, por tanto para comprender este mecanismo debemos entender como se 
lleva a cabo la absorción de luz. 
Absorción de la luz 
La luz es una forma de radiación electromagnética, una mezcla de ondas con 
diferentes longitudes de las mismas. La longitud de onda (λ) es definida como la 
distancia entre dos crestas de una onda. Las unidades empleadas son 
nanómetros. Dependiendo de la longitud de onda, nuestros ojos perciben un 
color diferente, si es que esta se encuentra en el rango visible, o no la perciben si 
pertenece a un espectro diferente, como la luz ultravioleta o el infrarrojo. (96). 
La luz de cierta longitud de onda puede ser absorbida selectivamente por una 
sustancia de acuerdo a su estructura molecular. La absorción de la energía de la 
luz ocurre cuando un fotón incidente promueve la transición de un electrón de un 
estado de menor a mayor energía. Las moléculas con electrones en compuestos 
aromáticos usualmente absorben luz en las longitudes de onda del UV cercano 
(150-400nm) o en la región del espectro de luz denominado visible (400-750 nm). 
La radiación emitida por una molécula, o un átomo, después de que ha 
absorbido energía para colocarse en un estado excitado es definida como 
luminiscencia. (96). Ésta se divide en dos categorías, fluorescencia y 
fosforescencia, dependiendo de la naturaleza del estado excitado. 
La fluorescencia y la fosforescencia difieren entre sí en el mecanismo a través del 
cual son producidos, además del tiempo de duración desigual en cada uno de 
estos fenómenos. La fluorescencia cesa casi inmediatamente después de que la 
 
 
32 
 
muestra se le suspende la radiación(<10-6 seg), mientras que la fosforescencia 
puede durar varios segundos o minutos en iguales circunstancias (96). 
En el diagrama de Jablonski (figura 14) se muestran los estados electrónicos de 
una molécula y los procesos de relajación implicados en la emisión de la 
fluorescencia. S0 y S1 son estados electrónicos de singulete, mientras que T1 es un 
estado energético menor para una molécula, conocido como triplete. Los 
estados de triplete y singulete se diferencian por la orientación de los spines de los 
electrones (singlete con spines antiparalelos y tripletes con spines paralelos) (96). 
 
 
Figura 14. Diagrama de Jablonski. Se muestran los diferentes niveles de energía presentes de una molécula 
fotoluminiscente. La línea horizontal So representa la energía del estado basal de la molécula, la cual normalmente es un 
estado singlete, en este nivel electrónico al igual que en los otros estados excitados se encuentran asociados varios niveles 
vibracionales de la molécula. A temperatura ambiente la energía electrónica de prácticamente todas las moléculas es So. 
Las dos líneas de la izquierda representan a S1 y S2 respectivamente, primero y segundo estado singlete excitado. El de la 
derecha T1corresponde al primer estado triplete excitado. Hay que señalar que el estado triplete es menos energético que 
el correspondiente estado excitado singlete. La excitación de esta molécula puede tener lugar por absorción de dos bandas 
de radiación, una centrada alrededor de la longitud de onda 1 (S0 S1) y la segunda alrededor de la longitud de onda 
más corta 2 (S0S2). 
 
Dentro de la fluorescencia se llevan a cabo dos procesos: 
a) Excitación: proceso en el cual a un sistema en estado fundamental, se le aplica 
una magnitud suficiente de energía, ésta puede ser absorbida por el sistema, 
pasando a un estado mayor de energía. 
 
 
33 
 
b) Emisión: Los estados excitados son inestables y el átomo tiende a volver a su 
estado fundamental, para lo cual se producen saltos de electrones desde los 
niveles más externos hacia los más internos, para ocupar los huecos producidos. 
En este proceso se produce desprendimiento de energía en forma de radiación 
(97). 
 
Factores que influyen en el mecanismo de fluorescencia 
Los procesos mencionados anteriormente pueden estar influenciados por varios 
factores que son: 
 
Rendimiento cuántico 
 
El rendimiento cuántico o la eficacia cuántica de la fluorescencia es simplemente 
la relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia respecto al 
número total de moléculas excitadas: 
 
 
Las moléculas altamente fluorescentes, por ejemplo, la fluoresceína, tienen 
eficiencias cuánticas que, en ciertas condiciones, se aproximan a la unidad. Las 
especies no fluorescentes tienen eficiencias que son prácticamente cero (97). 
 
Estructura 
 
La fluorescencia más intensa y la más útil es la que presentan los compuestos que 
contienen grupos funcionales aromáticos. La eficacia cuántica aumenta con el 
número de anillos y con su grado de conjugación. La sustitución en un anillo 
aromático causa desplazamientos en la longitud de onda de absorción máxima y 
los cambios correspondientes en los picos de fluorescencia. (97). 
Temperatura 
La eficacia de la fluorescencia disminuye en muchas moléculas con el aumento 
de la temperatura, ya que el aumento de la frecuencia de las colisiones a 
 
 
34 
 
temperatura elevada hace aumentar la probabilidad de desactivación no 
radiante (conversión externa) (97). 
 
Efecto del pH 
 
La fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes ácidos o básicos 
en el anillo depende normalmente del pH. Tanto la longitud de onda como la 
intensidad de emisión son diferentes para la forma ionizada y no ionizada del 
compuesto (97). 
 
Efectos del solvente 
 
La polaridad del solvente y el ambiente local tienen profundos efectos en el 
espectro de emisión de los fluoróforos. Esto se debe a que un fluoróforo tiene un 
dipolo, el cual cambia cuando se encuentra en estado excitado, entonces el 
solvente se reacomoda de acuerdo a este cambio y esto le resta energía al 
estado excitado, lo que se refleja en una emisión a longitud de onda menor (97). 
Los espectros de emisión son medidos fácilmente, hay numerosas publicaciones 
de efectos de emisión de fluorescencia en diferentes solventes, este efecto 
explica cambios estructurales cuando una molécula fluorescente está unida a 
proteínas, membranas o ácidos nucleicos. Un uso común de los efectos del 
solvente es determinar la polaridad de la sonda en el sitio de unión en la 
macromolécula o poder inferir los cambios en la polaridad del sitio en particular 
en la macromolécula. Esto se realiza comparando los espectros de emisión y/o la 
eficiencia cuántica del fluoróforo cuando está unido a la macromolécula y 
cuando está disuelto en solventes de diferente polaridad. Por ejemplo, podemos 
encontrar que en el espectro de emisión hay un corrimiento a longitudes de onda 
menores (cambio hacia el azul) cuando la polaridad del solvente va 
disminuyendo. Por el contrario, un incremento en la polaridad del solvente 
generalmente resulta en un cambio hacia el rojo (figura 15), es decir, longitudes 
de onda mayores y en algunas ocasiones, este cambio hacia el rojo va 
acompañado en una reducción de la eficiencia cuántica del fluoróforo. (96, 97). 
 
 
35 
 
 
Figura 15. Emisión de la intensidad de fluorescencia de triptófanos en distintos 
ambientes polares. Los números indican nivel ascendente de polaridad, desde un 
ambiente completamente no polar (1) hasta un ambiente muy polar (4), donde el 
pico de emisión se desplaza a longitudes de onda mayores. 
 
Apagamiento colisional (quenching). 
 
La intensidad de la fluorescencia puede ser disminuida por una gran variedad de 
procesos. Tales procesos de disminución de la intensidad son llamados 
apagamientos (quenching). Este apagamiento de la fluorescencia puede ocurrir 
por diferentes mecanismos. El apagamiento colisional es un proceso bimolecular 
dependiente del contacto entre la molécula excitada y el apagador (quencher), 
ocurre cuando un fluoróforo en estado excitado es interrumpido ante el contacto 
con alguna otra molécula en solución, la cual es llamada apagador. Es un 
proceso de difusión controlada en el cual el fluoróforo regresa a su estado basal 
sin la emisión de fotón, el proceso requiere que el tiempo de vida del estado 
excitado sea mayor de 10-9 s (96). 
Básicamente hay dos mecanismos por los cuales la pérdida colisional de la 
energía de excitación puede ocurrir: intensificación del cruzamiento intersistemas 
por el apagador o la transferencia de electrones. Una gran variedad de 
moléculas pueden actuar como apagadores, como el oxígeno, halógenos, 
 
 
36 
 
aminas y moléculas deficientes de electrones como arcrilamida. El mecanismo de 
apagamiento varía con el par fluoróforo-apagador (97). 
Además del apagamiento colisional, el apagamiento de la fluorescencia puede 
ocurrir por una variedad de procesos, los fluoróforos pueden formar complejos no 
fluorescentes con el apagador, tal es el caso del apagamiento estático y ocurre 
en el estado basal y no depende en la difusión o colisión molecular. El 
apagamiento también puede ocurrir por mecanismos no moleculares, como la 
atenuación de la luz incidente por el mismo fluoróforo u otras especies 
absorbentes (97). 
 
Fluoróforos 
 
Los fluoróforos son moléculas fluorescentes que tienen un espectro de absorción y 
emisión bien definidos, existe una diferencia entre los picos de absorción y emisión 
de un fluoróforo; la intensidad de su fluorescencia emitida varía con la longitud de 
excitación. Entre los fluoróforos más utilizados se pueden encontrar moléculas 
orgánicas simples y proteínas fluorescentes. (96). 
Los fluoróforos se pueden dividir en dos grandes clases: intrínsecos y extrínsecos. 
Los fluoróforos intrínsecosse hallan de manera natural e incluyen los aminoácidos 
aromáticos (tirosina, fenilalanina y triptófano) (Cuadro 1), NADH, flavinas y 
derivados del piridoxal y clorofila. El NADH es altamente fluorescente, con un 
máximo de emisión y absorción a 340 y 460 nm, respectivamente. El cofactor 
piridoxal fosfato también es fluorescente. Sus espectros de emisión y absorción son 
dependientes de su estructura química en la proteína. La riboflavina, flavin 
mononucleotido (FMN) y el flavin adenin nucleótido (FAD) absorben luz en el 
rango visible (450 nm) y emiten alrededor de 535 nm (96). 
 
 
 
 
 
 
 
 
37 
 
Cuadro 1. 
 
Aminoácido Excitación (ex) nm Emisión (em) nm 
Fenilalanina 260 282 
Tirosina 275 304 
Triptófano 295 353 
 
Por otro lado, los fluoróforos extrínsecos se agregan a la muestra para proveer 
fluorescencia cuando no existe de manera natural o para cambiar las 
propiedades del espectro de la muestra. Éstos incluyen; por ejemplo, a la 
fluoresceína, cloruro de dansilo (DNS-Cl) y la rodamina, entre otras numerosas 
moléculas. 
El cloruro de dansilo (DNS-Cl,) es usado ampliamente para marcar proteínas, 
especialmente donde se anticipan mediciones de polarización. Los grupos dansilo 
se pueden excitar a 350 nm, donde las proteínas no absorben, sin embargo, 
debido a que absorben cerca de los 350 nm, pueden servir como aceptores de la 
fluorescencia de proteínas. El espectro de emisión del grupo dansilo es altamente 
sensible a la polaridad del solvente y las emisiones máximas son típicamente 
próximas a 520 nm. 
 
Fluorescencia de proteínas 
 
Una de las áreas de investigación que se han visto muy beneficiadas con el uso 
de la fluorescencia es el estudio de la función y estructura de proteínas. Este 
énfasis es el resultado de la presencia de fluoróforos naturales en casi todas las 
proteínas. Los aminoácidos aromáticos, la tirosina, la fenilalanina y el triptofano 
absorben radiación electromagnética en el rango de espectro UV a longitudes 
de onda específicas, a 260 nm la fenilalanina (Phe), a 275 nm la tirosina (Tyr) y a 
295 nm el triptófano (Trp) y posteriormente emiten fluorescencia (Cuadro 1 y figura 
16). 
Debido a que las proteínas contienen grupos aromáticos como residuos de Tyr, Trp 
y Phe, generalmente se aprovecha esta propiedad para medir su concentración, 
 
 
38 
 
siendo excitadas a 280 nm. La absorción se debe principalmente a los dos 
primeros, sin embargo la Phe es escasamente excitada a esta longitud de onda. 
Asimismo, la eficiencia cuántica de la Phe en las proteínas es muy pequeña por 
tanto la emisión de este residuo es raramente observada. 
 
 
Figura 16. Espectros de emisión de los aminoácidos aromáticos a pH 7.0 en solución. 
 
En general, la fluorescencia de la mayoría de las proteínas es dominada por los 
residuos Trp, debido a la presencia de un grupo indólico, un fluoróforo sensible a 
la polaridad del solvente. Como resultado, el espectro de emisión de los residuos 
Trp puede reflejar la polaridad del ambiente que los rodea. La emisión del grupo 
indol puede ser corrida hacia longitudes de onda menores si el grupo esta oculto 
dentro de una proteína nativa (ambiente mayoritariamente hidrofóbico), por el 
contrario, su emisión puede desplazarse hacia longitudes de onda mayores 
(corrimiento hacia el rojo) cuando la proteína es desnaturalizada y el fluoróforo se 
expone a un ambiente hidrofilico (96, 97). 
La fluorescencia del Trp puede ser apagada por algunas sustancias apagadoras 
(quencheadores); tales como yoduros, oxígeno, acrilamida, succinimida, entre 
otras. Esta sensibilidad se atribuye a la facilidad con que el anillo indólico dona 
electrones cuando se encuentra en su estado excitado. Es esta propiedad lo que 
permite sugerir la exposición o accesibilidad al solvente de los residuos de Trp en 
una proteína ya sea soluble o insertada en membrana. (96, 97). 
Otra manera diferente de los métodos fluorescentes para evaluar la capacidad 
de unión entre macromoléculas y ligandos es por medio de reacciones 
 
 
39 
 
enzimáticas. Estas reacciones demuestran de forma cualitativa y cuantitativa la 
unión entre enzimas y sustratos. Estas uniones pueden ser modificadas, 
reflejándose ésto en un aumento o inhibición de la actividad catalítica, debido al 
efecto adicional de la unión de algún ligando, no necesariamente sustrato, a un 
sitio de la enzima diferente del sitio activo. De esta forma, se puede cuantificar la 
unión del ligando a la enzima. 
 
1.7 Estudios cinéticos 
 
1.7.1 Cinética enzimática. 
 
La cinética enzimática permite conocer diversas características catalíticas de una 
enzima. Esta información es fundamental para conocer su mecanismo de 
reacción, incluyendo sus diversas etapas y secuencias de las mismas (98), así 
como la especificidad por el sustrato o sustratos, entre otras cosas. También 
informan sobre la influencia que tienen sobre la enzima diversas condiciones 
experimentales. Así, es factible apreciar la estabilidad de las enzimas frente a 
cambios de temperatura, pH y fuerza iónica. También se pueden tener 
características de regulación enzimática al emplear sustancias inhibitorias sobre 
ellas, además de adquirir información sobre sus estructuras moleculares. La 
cinética enzimática nos permite determinar los parámetros catalíticos de una 
enzima, como la constante de Michaelis (Km), velocidad máxima de reacción 
(Vmax), constante de inhibición (Ki), que son datos numéricos que facilitan las 
comparaciones entre enzimas (99). 
La teoría de Michaelis–Menten describe la velocidad de reacción de diversas 
reacciones enzimáticas. Es un modelo que es aceptado solo cuando la 
concentración de sustrato es mayor que la de la enzima y para condiciones de 
estado estacionario, en otras palabras la concentración del complejo enzima-
sustrato [ES] es constante. La enzima [E] se combina con el sustrato [S], formando 
el complejo ES, el cual se disocia dando lugar a enzima libre y producto [P], 
siendo todos estos pasos reversibles (figura 17). 
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Estado_estacionario_(qu%C3%ADmica)&action=edit&redlink=1
http://es.wikipedia.org/wiki/Concentraci%C3%B3n
 
 
40 
 
 
Figura.17. Reacciones llevadas a cabo por la enzima de acuerdo a Michaelis-Menten (100). 
 
Muchas enzimas catalizan reacciones con dos sustratos que se influyen 
mutuamente, el análisis cinético de estas reacciones se simboliza por la ecuación 
 A +B E EA + EB 
Donde pueden existir varios complejos enzima -sustrato (EA, EB). La determinación 
de Km y Vmax es semejante al sistema utilizado en las reacciones con un solo 
sustrato, manteniendo uno de los sustratos a concentración constante y saturante 
(B), mientras que el otro (A) se emplea a concentraciones variables. Esto permite 
determinar el efecto del sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción y 
obtener así la constante de Michaelis-Menten para el sustrato (A). 
La constante de Michaelis es una magnitud cuantificable experimentalmente y 
definida operativamente, siendo la concentración del sustrato a la cual la 
velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima. Para una enzima 
particular, constituye una característica útil en la determinación cuantitativa de la 
actividad enzimática en los tejidos. Siendo la actividad de una enzima como la 
cantidad de producto generado (en micromoles) en un minuto por miligramo de 
proteína (30). 
Existen factores físicos y químicos que afectan a la actividad máxima de las 
enzimas, entre ellos el pH y la temperatura. La mayoría de las enzimas presentan 
un pH característico al cual su actividad es máxima. Esta relación depende del 
comportamiento ácido–base de la enzima y del sustrato. El pH óptimo de catálisis 
de una enzima no es necesariamente idéntico al pH de su entorno intracelular, 
sugiriendo que la relación pH–actividad de una enzima puede constituir