Expresion-de-niveles-de-fibulina-2-y-fibulina-5-en-lquido-subretiniano-en-desprendimiento-de-retina-regmatogeno

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE MEDICINA Y ESTUDIOS DE POSGRADO 
ASOCIACIÓN PARA EVITAR LA CEGUERA EN MÈXICO 
EXPRESIÓN DE NIVELES DE FIBULINA-2 Y FIBULINA-5 EN 
LÍQUIDO SUBRETINIANO EN DESPRENDIMIENTO DE 
RETINA REMATÓGENO. 
TESIS 
PARA OPTAR POR EL GRADO DE 
CIRUJANO OFTALMÓLOGO 
PRESENTA: 
DRA. NED MERARI DAVILA AVILA 
TUTOR DE TESIS 
DR. HUGO QUIROZ MERCADO 
CIUDAD DE MEXICO, AGOSTO DE 2019 
�1
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
ÌNDICE 
1. RESUMEN………………………………………………………………………………… 3 
2. MARCO TEÒRICO……………………………………………………………………….. 4 
3. ANTECEDENTES………………………………………………………………………… 6 
3.1 Justificación……………………………………………………………………………….. 6 
3.2 Planteamiento del problema …………………………………………………………… 6 
3.3 Objetivos: General y específicos ………………………………………………………. 7 
3.4 Hipótesis ……………………………………………………………………………..…… 7 
3.5 Pregunta de investigación …………………………………………………………….… 7 
4. METODOLOGIA …………………………………………………………………………. 8 
5. RESULTADOS……………………………………………………………………………. 11 
6. DISCUSIÒN……………………………………………………………………………… 14 
7. CONCLUSIÒN………………………………………………………………………….. 15 
8. REFERENCIAS…………………………………………………………………………. 15 
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1. RESUMEN 
El desprendimiento de retina es la separación física de la retina del EPR y puede 
ocurrir en el envejecimiento, trauma, degeneración macular relacionada con la edad, 
después de una cirugía de cataratas, retinopatía diabética y retinopatía del prematuro. 
La fibulina-2 (Fbln2) y la fibulina-5 (Fbln5) son glicoproteínas de la matriz extracelular 
secretadas que se han asociado con el desarrollo y la remodelación de los tejidos, ya 
que se expresa en los sitios de transición epitelial-mesenquimatosa y media la 
adhesión de las células endoteliales y las células de los andamios a las fibras 
elásticas . En el desprendimiento de retina, hay una alteración de la adhesión celular 
entre retina y RPE. 
Este estudio compara los niveles de expresión de los genes FBLN2 y FBLN5 y las 
proteínas Fbln2 y Fbln5 en muestras de líquido subretiniano en desprendimiento de 
retina rematógeno primario humano versus humor acuoso de los ojos que tuvieron 
cirugía de catarata senil como grupo de control. El fluido subretiniano de diez pacientes 
con desprendimiento de retina regmatógeno se procesó para obtener la fracción 
soluble en proteínas y la fracción celular para la extracción de ARN. Se realizaron 
ensayos de Western blot y qRT-PCR para evaluar los niveles de expresión de fibulinas 
respectivamente. Se usaron diez muestras de humor acuoso de pacientes normales 
como control y se procesaron de manera similar. El presente estudio recibió la 
aprobación del Comité de Ética Local y todos los pacientes dieron su consentimiento 
escrito completo para participar. Este informe muestra que los niveles de ARNm de 
FBLN2 y FBLN5 en la fracción celular y los niveles de proteína en el fluido subretiniano 
en el desprendimiento de retina fueron significativamente mayores en comparación con 
las muestras de humor acuoso (P <0.05). Sin embargo, existe una regulación al alza de 
Fbln2 y una regulación a la baja de Fbln5 en la fracción celular del líquido subretiniano 
de pacientes en desprendimiento retiniano primario de la retina. Los resultados 
sugieren un desequilibrio de Fbln2 y Fbln5 en el desprendimiento de retina. 
Comprender el papel de ambas fibulinas en el desprendimiento de retina podría 
ayudarnos a desarrollar nuevos tratamientos para esta afección. 
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2. MARCO TEÓRICO 
El desprendimiento de retina regmatógeno (DRR) se define como la separación física 
entre la retina y el epitelio pigmentario de la retina (EPR). La incidencia se estima entre 
0.6 y 1.8 casos por 100,000 habitantes (Nemet, 2017). Algunos factores descritos que 
contribuyen a la unión de la retina y el RPE son una bomba de Na +, K + ATPasa y 
proteínas de adhesión (vítreas o del fotorreceptor) (Marmor 1994, Yao 1990). Se ha 
descrito heterogeneidad genética en DRR, sin embargo, recientemente se ha intentado 
identificar genes y proteínas involucradas en DRR. 
Las fibulinas son miembros de una familia de proteínas de matriz extracelular, que son 
un componente importante de las fibras elásticas y las membranas basales (Timpl 
2005, Kanan 2014, Sicot, 2008). Se sabe que las fibulinas contribuyen a la adhesión 
celular y la migración celular, así como a la interacción del receptor de la superficie 
celular funcionando como integrinas. (Yanagisawa, 2002). 
La fibulina-2 es prescindible para el desarrollo del ratón y la formación de fibra elástica. 
Se dividen en dos clases. Ambas clases se caracterizan por repeticiones de EGF que 
se unen al calcio y un módulo específico de fibulina C-terminal. La clase I incluye 
fibulinas 1, 2 y 6, que comparten la presencia de un dominio N-terminal adicional. Los 
miembros de clase II incluyen los miembros más cortos fibulinas 3, 4, 5 y 7 y se 
caracterizan por menos repeticiones de EGF que se unen al calcio (Yanagisawa, 2009, 
Kanan, 2014). 
La proteína de fibulina 2 contiene cuatro dominios principales; un dominio N-terminal; 
tres módulos de anafilatoxinas; 11 repeticiones de EGF que se unen al calcio; y un 
módulo de tipo C-terminal de fibulina. Su transcripción se ha identificado previamente 
en tejidos oculares de ratón (Farjo, 2008)). Sin embargo, se sabe poco sobre la función 
de esta proteína en el ojo y su participación en DRR. 
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De otra manera, Fibulin 5 es una glucoproteína que contiene seis motivos similares a 
EGF (cbEGF) que se unen al calcio que proporcionan estabilidad y facilitan la 
interacción de proteínas. La fibulina-5 también esta involucrada en la unión a un 
subconjunto de integrinas de la superficie celular. (Yanagisawa, 2009). Varias 
enfermedades se han asociado a cambios en las fallas de Fbln2 y Fbln5. Por ejemplo, 
Fbln2 está regulado negativamente en el cáncer (Kanan, 2014). La baja regulación de 
la fibulina 2 en estos cánceres se debe a la metilación de su promotor, la eliminación de 
genes o la baja regulación de los niveles de proteína (Dunwell, 2009, Hill, 2010). 
Aunque las mutaciones Fbln2 se estudiaron en los controles y Pacientes con DMRE, 
estas mutaciones no se asociaron significativamente con AMD (Stone, 2004). Por otro 
lado, en un modelo animal para DRR, se encontraron niveles elevados de fibulina 2 en 
el RPE después del desprendimiento de retina, lo que sugiere un papel directo de la 
fibulina. 2 en adhesión de la retina a la EPR (Kanan 2014). 
Para Fbln5, se han descrito varias mutaciones en Fbln5 que resultan en enfermedades 
humanas tales como; cutis laxa (Fbln 4 y 5). (Nakamura, 2002).) Recientemente, Fbln5 
se ha relacionado con su participación en diferentes enfermedades oculares, como la 
degeneración macular relacionada con la edad (DMRE), donde se han informado 
variaciones en Fbln5 (Stone et al; 2004). En este caso, series de stone, et al; 2004, 
algunos casos con un fenotipo típico de drusas pequeñas y desprendimientos del 
epitelio pigmentario tuvieron esta variación, esta observación sugiere que estas 
proteínas podrían participar en la adhesión entre el epitelio pigmentario y la membrana 
de Bruch. 
No hay informes en la literatura actual centrados en evaluar los cambios en los niveles 
de expresión de fibulinas 2y 5 en el líquido subretiniano en pacientes con DRR. En 
este informe, mostramos cambios en los niveles de expresión de ambas fibulinas en 
pacientes con RDD cuando se compararon con el grupo control. Por lo tanto, 
concluimos que la regulación al alza de la fibulina 2 y la regulación a la baja de la 
fibulina 5 durante el desprendimiento de retina sugiere un papel de ambos en la fuerte 
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asociación entre el EPR y la retina que implica un desequilibrio de sus propiedades 
adhesivas. 
3. ANTECEDENTES 
3.1 Justificación 
Determinar niveles de Fibulina 2 y Fibulina 5 en líquido subretiniano y humor acuoso 
en pacientes con desprendimiento de retina regmatógeno comparado con humor 
acuoso de pacientes control. Realizando esta comparación se pretende realizar una 
línea de investigación en la cuál se puedan determinar marcadores de riesgo para 
desprendimiento de retina regmatógeno. En la literatura actual no se cuenta con niveles 
de fibulinas 2 y 5 normales para la población general, sin embargo, se sugiere que 
estas proteínas de anclaje celular podrían estar involucradas en la fisiopatología del 
desprendimiento de retina regmatógeno. 
3.2 Planteamiento del problema 
Actualmente no se cuenta con un estudio que cuantifique los niveles de Fibulina 2 y 
Fibulina 5 en líquido subretiniano de pacientes con desprendimiento de retina 
regmatógeno comparado con pacientes control. Así mismo a partir de los resultados de 
este estudio se podrían comparar los valores de fibulinas en pacientes control vs 
pacientes con DRR para posteriormente desarrollar marcadores de riesgo. 
3.3 Objetivos: Generales y específicos 
Objetivo General: 
• Determinar niveles de Fibulina 2 y Fibulina 5 en liquido subretiniano y humor 
acuoso de pacientes con Desprendimiento de Retina Regmatógeno comprado 
con humor acuoso de un grupo control. 
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Objetivos Específicos: 
• Determinar y comparar los niveles de Fibulina 2 y fibulina 5 en liquido 
subretiniano y humor acuoso de pacientes con Desprendimiento de Retina 
Regmatógeno comprado con humor acuoso de un grupo control. 
• Correlacionar valores de Fibulina 2 y Fibulina 5 con la edad del paciente. 
3.4 Hipótesis 
Hipótesis General: 
• Los niveles de Fibulina 2 y Fibulina 5 son mayores por lo menos 10% en liquido 
subretiniano en pacientes con Desprendimiento de Retina Regmatógeno que en 
el humor acuoso del propio paciente y de los pacientes control 
Hipótesis específicas: 
• La expresividad de Fibulina 2 en liquido subretiniano es mayor 10% en pacientes 
con Desprendimiento de Retina Regmatógeno comprado con humor acuoso del 
propio paciente y de pacientes control 
• La expresividad de Fibulina 5 en liquido subretiniano es mayor por lo menos 10% 
en pacientes con Desprendimiento de Retina Regmatógeno comprado con humor 
acuoso del propio paciente y de pacientes control 
• Los valores de Fibulina 2 y Fibulina 5 disminuyen con la edad del paciente. 
3.5 Pregunta de investigación 
¿Cuál es el nivel de Fibulina 2 y Fibulina 5 en liquido subretiniano de pacientes con 
Desprendimiento de Retina Regmatógeno comprado con humor acuoso del propio 
paciente y humor acuoso de un grupo control? 
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4. METODOLOGIA 
Diseño del estudio 
Se realizó un estudio transversal comparativo. Seleccionamos casos con DRR primario 
tratados por drenaje transescleral en el servicio de retina de la Asociación para Evitar la 
Ceguera en México, entre enero y diciembre de 2018. 
En el grupo de control, incluimos candidatos a cirugía de cataratas. Todos los pacientes 
que se habían sometido previamente a cirugía DRR fueron excluidos del estudio. Se 
obtuvo la aprobación ética institucional local. El estudio se adhirió a la Declaración de 
Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes para la 
intervención quirúrgica. 
Técnica quirúrgica y muestras de donantes humanos. 
La oftalmoscopia indirecta se realizó durante la cirugía para el examen de la retina con 
el fin de determinar la distancia y la localización del sitio de drenaje del líquido sub 
retinal en función del grado de elevación de la retina y la localización de cualquier 
desgarro y vascularización coroidea. El drenaje se realiza detrás del pandeo en 
relación con la elevación más alta de la retina. Utilizamos una aguja de calibre 30 para 
realizar una incisión escleral. Al final del proceso de drenaje, la incisión escleral se 
cerró con la sutura vicryl 6-0. 
Las muestras subretinianas se recogieron en microtubos estériles y se congelaron 
inmediatamente a -80 ° C hasta su posterior análisis, cuando las muestras se 
descongelaron justo antes de los ensayos. 
Anticuerpos l 
Los anticuerpos monoclonales para fibulinas se adquirieron de Santa Cruz 
Biotechnology (CA, EE. UU.). (Dilución 1: 100, Santa Cruz Biotechnology) y el 
anticuerpo secundario anti-ratón-HRP fue de Santa Cruz Biotechnology (catálogo no. 
A3854, dilución 1: 200). 
 
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Medida de fibulinas 
Para el análisis de inmunotransferencia y expresión, las muestras se centrifugaron 
durante 10 minutos a 10.000xg para separar y obtener fracciones solubles y celulares 
para Western blot (WB) y qRT-PCR para ambas fibulinas respectivamente. Las 
fracciones se congelaron a -80 ° C y se almacenaron hasta su uso. 
Inmunotransferencia 
Se prepararon extractos de proteínas de 7 RDD y 5 pacientes de control a partir de 
líquido subretiniano de muestras de RDD como se describió anteriormente. Se estimó 
la proteína, y 50 µg / ul se fraccionaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron 
electroforéticamente a membranas de PVDF y se inmunotransfirieron para ambas 
fibulinas. Se realizó el mismo procedimiento para muestras de humor acuoso de 
pacientes normales que se usaron como control. 
Análisis de qRT-PCR 
Para evaluar los cambios en la expresión de ambas fibulinas en RDD se realizaron 
ensayos qRT-PCR. A partir de fracciones celulares, se realizaron extracciones de ARN 
previamente preparadas. 1.o La extracción de ARN se preparó utilizando el kit de 
aislamiento Directzol RNA MiniPrep (ZYMO Research, EE. UU.). Luego se eliminó el 
ADN contaminante mediante una solución de DNasa I. Se usó un microgramo de ARN 
total para la transcripción inversa en el ADN complementario (ADNc), utilizando el kit de 
mezcla maestra Brilliant II qRT-PCR (Agilent Technologies, CA, EE. UU.). También se 
preparó una reacción que no contenía transcriptasa inversa para cada muestra de ARN 
como control (-RT). 
Después de la síntesis de ADNc, todas las reacciones se trataron con RNasa H 
(Invitrogen) para degradar la plantilla de ARN. La PCR se realizó en los productos de 
reacción de síntesis de ADNc de primera cadena, usando el kit de dos pasos 
SuperScript III Platinum CellsDirect qRT-PCR (Invitrogen) en consecuencia al protocolo 
del fabricante del kit con cebadores específicos de genes sintetizados por el Instituto 
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Nacional de Biotecnología, UNAM, México. Los cebadores fueron los siguientes: 
FBLN5 FWD 5´CCTCGCGCTCTTGGA- 3´, FBLN 5´.REVCAGCGCCGAGAACCCAC-3
´, FBLN2 FWD 5´- GCAGCTCTTCTCCTGCAAGT-3´ y FBLN2 REV 5´-
CAGACCCACACTCTGT y el primer par específico de GCCCCACACTCTT ′ -
GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCA; 5′-CTTCCCGTTCTCAGCCTTGAC) como gen de 
referencia para el ARNm. 
Se prepararon reacciones de PCR duplicadas usando 5 µl de ADNc con q-PCR 
(Brilliant II SYBR® Green QRT-PCR Master Mix con ROX, 1-Paso) y 0.2 µM de cebador 
específico de gen en un volumen total de 20 µl. La reacción de RT-PCR se realizó en 
un RotorGen (Qiagen, sistema de PCR rápido en tiempo real; Warrington, Cheshire, 
Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las señales de 
fluorescencia producidas por la unión de SYBR Green a nuevos amplicones 
bicatenarios se recogieron después de cada ciclo de PCR. Se siguieron las condiciones 
de ciclo térmico predeterminadas del fabricante (40 ciclos de 1 s a 95 ° C y 20 s a 60 ° 
C). Los datos se analizaron mediante el análisis de softwareRotor gen (Applied 
Biosystems) y los datos de fluorescencia sin procesar se exportaron a la hoja de 
cálculo DART-PCR para calcular la expresión genética relativa normalizada a la media 
geométrica de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). La especificidad 
de todos los cebadores se evaluó mediante electroforesis en gel de productos 
amplificados y examen de la curva de disociación. Los niveles de expresión relativos de 
FBLN2 y FBLN5 de fracciones celulares de control y muestras humanas RDD se 
evaluaron utilizando el software SigmaStat 3.5 (Systat Software, Inc., Chicago, IL). Los 
resultados se expresaron como n veces en relación con el control endógeno calculado 
utilizando el método ΔΔCT. 
Análisis estadístico 
Los datos cuantitativos se calcularon y expresaron en términos de medias y 
desviaciones estándar. Los datos cualitativos se calcularon y expresaron en términos 
de frecuencias. Utilizamos un software Image J ® para medir el área de Fibulina 2 y 5 
en el análisis de transferencia Western. Para todas las demás pruebas, un nivel de p 
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<0.05 se consideró significativo. Para el análisis de expresión de qRT-PCR, se 
realizaron pruebas t de Student de dos colas para comparar la significación estadística 
de la expresión génica en DRR y muestras de control por separado y cuando se 
compararon con el gen de referencia (GAPDH). La prueba de Kolmogorov-Smirnov se 
usó para la prueba de normalidad. Los análisis estadísticos se realizaron con PRISM8 
(Chicago Illinois). 
5. RESULTADOS 
Se incluyeron un total de 10 pacientes (7 casos de DRD y 5 controles). Se realizaron 
ensayos de Western blot para Fbln2 y Fbln5 con el fin de evaluar los niveles de 
proteína en el fluido subretiniano de pacientes con RDD y controles. Las fracciones 
solubles (como se describió anteriormente) se sometieron a electroforesis en SDS-
PAGE. El análisis de inmunotransferencia muestra que el Fbln2 de 131 kDa se 
sobreexpresa en el fluido subretiniano de DRR cuando se comparó con el grupo de 
control (Fig. 1A). Para Fbln5, hay una banda más fuerte en WB (60kDa) de los 
controles en comparación con las muestras DRR (Fig. 1B). Estos resultados sugieren 
que hay una sobreproducción de Fbln2 y una reducción de la producción de Fbln5 en 
DRR. 
Niveles de expresión de ARNm de fibulinas 2 y 5 en DRR 
Para abordar cuantitativamente posibles cambios en la expresión génica de fibulinas, 
se usó qRT-PCR. La RT-PCR del ARNm del ojo humano mostró una expresión 
diferencial de FBLN2 y FBLN5 en pacientes con DRR, así como en el grupo de control. 
En el grupo DRR (Fig. 2A), hay una mayor expresión de FBLN2. Cuando se 
compararon los niveles de expresión de ambas Fibulinas, el análisis mostró que existen 
diferencias significativas entre la expresión de FBLN2 vs FBLN5 (p = 0.0318) y FBLN2 
vs GAPDH (p = 0.0127), para FBLN5 vs GAPDH no hubo diferencias significativas (p = 
0.1404). 
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En el grupo de control (Fig. 2B) hay una mayor expresión de FBLN5, sin embargo, 
cuando se compararon FBLN2 y FBLN5 no hay una diferencia significativa (p = 
0.1399). Cuando se compararon FBLN2 vs GAPDH y FBLN5 vs GAPDH hubo 
diferencias significativas (p = 0.0296 y p = 0.0281) respectivamente. Todos juntos, 
estos resultados sugieren un papel para FBLN2 en DRR. 
FIGURA 1 
$ 
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FIGURA 2A 
$ 
FIGURA 2B 
$ 
Figura 2A. Niveles de expresión relativos de ARNm de fibulinas usando qRT-PCR de muestras de RDD, representado con una escala de cambio de 
pliegue calculada por 2- 2-CT. En las muestras RDD, hay una sobreexpresión de FBLN2 en comparación con el control GAPDH y FBLN5. En la 
Figura 2B, niveles de expresión relativa de ARNm de fibulinas usando qRT-PCR de muestras de control, representadas con una escala de cambio de 
pliegue calculada por 2- ∆∆CT. En las muestras de control, existe una expresión principal de FBLN5 en comparación con el control GAPDH y FBLN2. 
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6. DISCUSIÓN 
Aunque en este estudio encontramos fibulina 2 y fibulina 5 en el líquido subretiniano, en 
los casos hay una regulación excesiva de la fibulina 2 en comparación con el grupo 
control n. Con respecto a la fibulina 5, los niveles de proteína y la expresión de ARNm 
fue menor en los casos que en los controles. 
Se sabe que las fibulinas interactúan con los receptores de la superficie celular como 
integrinas (Yanagisawa, 2009). Algunos mecanismos regulan la expresión de fibulinas. 
Los esteroides regulan la expresión de fibulinas 1, 2 y 3. El estradiol aumenta la 
expresión de fibulina 1C en células tumorales de ovario y la expresión de fibulina 3 en 
células de cáncer de mama (Clinton et al., 1996; Hayashido et al., 1998, Hayashi et al. , 
2003), la dexametasona mejora la expresión de fibulina 1C en las células de malla 
trabecular del ojo humano. Se ha demostrado que la progesterona estimula la 
expresión de fibulinas 1 y 2 en las células del estroma endometrial humano (Okada et 
al., 2003). 
Recientemente, las fibulinas están relacionadas con diferentes enfermedades oculares, 
por ejemplo, en la degeneración macular relacionada con la edad (DMRE), Stone, et al. 
es 2004 describió variaciones en aminoácidos en un estudio de casos y controles, 
encontrando mayores variaciones genéticas en fibulina 5 en casos de DMRE y un 
fenotipo típico con uniformes de drusas pequeñas. Gass y col. En 1997, observó este 
fenotipo y describió desprendimientos a largo plazo del epitelio pigmentario (stone 
2004). Por otro lado, Kanan et al., En 2014, desarrollaron un modelo animal para DRR, 
encontraron un aumento en los niveles de fibrina 2 en el EPR después del 
desprendimiento de retina, como en nuestro estudio. Estos hallazgos sugieren un rol 
importante de fibulina 2 en el desprendimiento de retina. 
No hay estudios que informaron niveles de fibulina 2 y 5 en ojos normales, lo que 
dificulta la comparación de nuestros resultados. Sin embargo, los niveles de fibulina 2 y 
5 podrían elevarse antes o después de la DRR. 
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Los niveles de proteína de Fbln2 aumentaron dramáticamente en el líquido subretiniano 
después del desprendimiento de retina, lo que sugiere un papel directo para la fibulina 
2 en la reinserción de la retina al epitelio pigmentario de la retina y un efecto 
contradictorio de Fbln5. 
Por lo tanto, sugerimos que la regulación al alza de Fbln2 y la regulación a la baja de 
Fbln5 in vivo durante el desprendimiento de retina podrían ayudar a restaurar la 
asociación entre el RPE y la retina, inhibiendo la migración de las células EPR y 
mejorando la unión a la retina. Se ha demostrado que Fbln2 es capaz de reducir el 
crecimiento celular y la migración y que los niveles de Fbln2 aumentaron en RPE 
después del desprendimiento de retina (Kanan Y 2012, Kanan Y, 2014, Law, E, 2012), 
de acuerdo con nuestros resultados 
7. CONCLUSIONES 
En este informe mostramos la presencia y la regulación al alza de Fbln 2 y Fbln5 en la 
fracción celular de líquido subretiniano de pacientes en desprendimiento retiniano 
primario de la retina y estos resultados sugieren un desequilibrio en la regulación de 
Fbln2 y Fbln5 presentes en el desprendimiento de retina 
8. REFERENCIAS 1
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