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DE MEXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA OBTENCIÓN DE TINTURAS MADRE PARA UN FITOFARMACO DIRECTOR: M. en F. IDALIA LETICIA FLORES GÓMEZ. MÉXICO, D.F. DICIEMBRE 2013 T E S I N A QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: QUÍMICO FARMACEÚTICO BIÓLOGO P R E S E N T A : MARTHA BEATRIZ LARA REYES UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 AGRADECIMIENTOS A ti mi Eterno Creador y Bendito Padre porque me das la vida y me enseñas que tu amor es la única esencia que nos une en todo momento: Gracias por hacer posible este logro y por amarme tanto. A mi familia: Por su amor, apoyo y comprensión durante todo este tiempo de lucha. A la Institución que me enseño que: “Por mi Raza hablará el Espíritu”. A mis maestros. En especial a la M. en F. Idalia Flores Gómez, por el apoyo incondicional que me ofreció para la realización del siguiente trabajo. A todas aquellas personas que en algún momento y por alguna razón contribuyeron en el logro de esta meta. 3 ÍNDICE RESUMEN .............................................................................................................. 6 INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 7 1. ANTECEDENTES TEÓRICOS ......................................................................... 8 1.1. Origen de los fitofármacos ........................................................................... 8 1.1.2. Actualidad de los fitofármacos ............................................................. 10 1.2. Fitofármaco ............................................................................................... 11 1.2.1. Definición General ................................................................................. 11 1.2.2. Concepto ............................................................................................... 11 1.2.3. Bases Científicas de los Fitofármacos .................................................. 12 1.2.4. Categorización de los Fitofármacos ...................................................... 12 1.2.5. Pasos que llevan a la elaboración de una tintura madre (TM) .............. 13 1.2.5.1. Controles de uniformidad para la adquisición de materia prima ………..verde (planta medicinal) para la elaboración de tinturas madre. ..... 13 1.2.5.2. Control de Calidad ........................................................................... 14 1.3. Regulación de fitofármacos ......................................................................... 14 1.3.1. Europa ................................................................................................... 14 1.3.2. México ................................................................................................... 15 1.3.3. Estados Unidos de Norteamérica ......................................................... 16 1.4. Tinturas Madre ............................................................................................ 16 1.4.1. Definición ............................................................................................... 16 1.4.2. Conceptos básicos sobre su obtención ................................................. 16 1.4.3. Estandarización.- Porcentajes de hierba según su actividad ................ 17 1.4.4. Usos ...................................................................................................... 17 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................... 18 3. OBJETIVOS ...................................................................................................... 19 3.1. Objetivo general .......................................................................................... 19 3.2. Objetivos específicos................................................................................... 19 4. MATERIAL Y MÉTODO .................................................................................... 19 4.1. Materiales, Equipos y Reactivos. ................................................................ 19 4.1.1. Material Biológico .................................................................................. 19 4.1.2. Materiales de Laboratorio ...................................................................... 20 4.1.3. Equipo ................................................................................................... 20 4 4.1.4. Reactivos ............................................................................................... 21 4.2. Diagrama de Flujo ...................................................................................... 22 4.3. Metodología ................................................................................................. 23 4.4. Pruebas de control de calidad de la especie vegetal ............................... 23 4.4.1. Determinación de humedad ............................................................... 23 4.4.2. Determinación de cenizas totales ....................................................... 23 4.4.3. Determinación de cenizas solubles en agua ...................................... 24 4.4.4. Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico ................. 25 4.4.5. Determinación de sustancias solubles ............................................... 25 4.4.6. Determinación de metales pesados ................................................... 26 4.4.7 Análisis espectrofotométrico del marcador químico: flavonoides ………..totales expresado como porcentaje de quercetina. ......................... 26 4.4.8. Cuantificación de flavonoides15. ......................................................... 27 4.5. Análisis Microbiológico ............................................................................ 28 4.5.1. Método de conteo de aerobios mesófilos totales en placa. .............. 28 4.5.2. Determinación de coliformes totales. .................................................. 28 4.5.3. Determinación de coliformes fecales. ................................................ 30 4.5.4. Investigación de salmonella .............................................................. 30 4.5.5. Método de conteo de mohos en placa. ............................................... 32 4.6. Preparación para la obtención de la tintura madre ................................... 33 4.7. Control de calidad de la Tintura madre..................................................... 33 4.7.1. Descripción organoléptica. ................................................................. 33 4.7.2. Determinación del pH......................................................................... 34 4.7.3. Determinación de la densidad relativa. ............................................... 34 4.7.4. Determinación del Índice de Refracción. ........................................... 35 4.7.5. Determinación de sólidos totales. ..................................................... 35 4.8. Tamizaje Fotoquímico. .......................................................................... 35 4.8.1. Ensayo de Dragendorff. ...................................................................... 36 4.8.2. Ensayo de Mayer. ............................................................................... 36 4.8.3. Ensayo de Wagner. ........................................................................... 36 4.8.4. Ensayo de Baljet. ............................................................................... 36 4.8.5. Ensayo de Borntrager. ....................................................................... 37 4.8.6. Ensayo de Lieberman-Buchard. ........................................................ 37 4.8.7. Ensayo de resinas. ............................................................................. 38 4.8.8. Ensayo de Fehling. ............................................................................ 38 5 4.8.9. Ensayo de Espuma. .......................................................................... 38 4.8.10. Ensayo del cloruro férrico. ............................................................... 38 4.8.11. Ensayo de Shinoda. ........................................................................ 39 4.8.12. Ensayo de Gelatina. ....................................................................... 39 4.8.13. Ensayo de principios amargos y astringentes. ................................. 39 5. OBTENCION DE RESULTADOS ...................................................................... 40 5.1. CONTROL DE CALIDAD DE LAS MATERIAS PRIMAS VEGETALES....... 40 5.1.1. Determinación del contenido de humedad ............................................ 40 5.1.2. Determinación de cenizas totales .......................................................... 40 5.1.3. Determinación de cenizas solubles en agua. ........................................ 40 5.1.4. Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico. ................... 41 5.1.5. Determinación de metales pesados (Plomo). ........................................ 41 5.1.6. Análisis Microbiológico. ......................................................................... 41 5.2. DETERMINACIÓN DE LOS PARAMETROS DE CALIDAD DE LA ……TINTURA MADRE (T.M.). ........................................................................... 42 5.2.1. Descripción Organoléptica. ................................................................... 42 5.2.2. Parámetros físicos. ................................................................................ 43 5.2.3. Determinación de flavonoides por cromatografía de capa fina. ............. 43 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ...................................................................... 46 7. SUGERENCIAS. ……………………………………………………………...…….. 45 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ...................................................................... 46 6 RESUMEN Hace poco más de medio siglo en nuestro país la prescripción de “fitofármacos” era algo común a nivel medico. Esta tendencia había llegado de Europa y era la forma más fácil de tener un “cuadro básico” de medicamentos, los cuales se surtían en las “boticas” a través de formulas galénicas o magistrales prescritas por los médicos. Actualmente en los países desarrollados el uso de plantas medicinales ha aumentado, principalmente por una cuestión de moda; sin embargo, la creciente demanda del uso de la medicina natural en los países en vías de desarrollo se da más por una necesidad económica y cultural. En consecuencia directa, se ha visto que existe un notable interés científico en los Fitofármacos y Farmacia Natural por parte de la Industria Farmacéutica. Por tal motivo se hace necesario capacitar profesionales de la salud, para que puedan utilizar y/o comprender los alcances de la Fitoterapia Moderna o Fitomedicina de modo que a través del uso de sus herramientas terapéuticas puedan contribuir a mejorar la atención de sus pacientes. Por tal motivo las autoridades sanitarias se ven obligadas a regular la fabricación y comercialización de estos productos. Igualmente la industria farmacéutica debe conocer y aplicar la forma científica de obtención de fitofármacos y por ende de los principios activos vegetales que muchas veces emanan de una tintura madre. 7 INTRODUCCIÓN La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que alrededor del 80% de la población mundial está utilizando la medicina tradicional, para atender las necesidades primarias de asistencia médica. A partir de 1978, define la integración de los remedios herbolarios de eficacia comprobada en las políticas farmacéuticas y la reglamentación sanitaria de los países.1 Y más recientemente, en 1992, promueve una serie de recomendaciones para la regularización de los productos terapéuticos preparados con plantas medicinales. 2 Razón por la cual se ha despertado un notable interés científico y comercial de la industria farmacéutica en lo referente a la elaboración de fitofármacos y al uso de la “Farmacia Natural”. En virtud de lo anteriormente escrito, tenemos que: La elaboración de tinturas madre elaboradas a partir de materia prima vegetal (plantas medicinales), debe tener solidas bases científicas, ya que al contener sustancias fotoquímicas bioactivas (fitofármacos); estas actúan de las misma forma que los fármacos convencionales de las medicinas sintéticas; por ende se deben conocer los procesos de obtención, pureza y estandarización de cada una de estas que serán empleadas en la elaboración de fitofármacos. Esto es tan importante como el saber las indicaciones farmacológicas, dosificación o posología, efectos secundarios, adversos y colaterales, interacciones farmacológicas (fármaco- fármaco o fármaco-nutriente), precauciones, contraindicaciones, etc. de cada fitofármaco que se va a prescribir. Es por ello que el presente trabajo tiene como objetivo principal exponer en forma científica a través del análisis de laboratorio los fundamentos y controles sobre los cuales se ha basado la obtención de una tintura madre para la elaboración de un fitofármaco con las características fundamentales que son: Eficacia. Seguridad. Calidad Factores que son determinantes para poder decir que un fitofármaco esta dentro de la regularización y normatividad correspondiente 8 1. ANTECEDENTES TEÓRICOS 1.1. Origen de los fitofármacos La fitoterapia (del griego fyton, 'planta', 'vegetal' y therapeia, 'terapia'), conocida también como herbolaria (del latín herba, 'hierba'), es la ciencia del uso extractivo de plantas medicinales. La utilización de plantas medicinales para sanar enfermedades es una costumbre milenaria en todo el mundo.3 En realidad nadie sabe exactamente donde se utilizaron las plantas medicinales por primera vez, seguramente la búsqueda de algún remedio fue algo que se dio en todas las culturas a la vez, fruto del deseo del hombre de sanar por cuestión mágica-religiosa o por la búsqueda de nuevos alimentos, otras veces fue simplemente el resultado de la casualidad.3 Se sabe que el primer texto escrito sobre el uso de plantas medicinales tiene unos 4000 años de antigüedad y aparece en una tablilla de arcilla en la cultura de los sumerios, un antiguo pueblo que vivía al sur de los ríos Éufrates y Tigris, lo que valdría al actual Iraq. En laIndia el uso de plantas medicinales, incluido dentro del Ayurveda, nos ha dejado referencias escritas del año 800 a.C. donde aparecen descritas una 800 especies: La medicina ayurvédica comparte sus métodos con la medicina oficial donde la filosofía o la ciencia en general proponen hábitos de vida saludables para conseguir una salud plena fortificada con preparados herbolarios. Los griegos y los romanos recogen la tradición de la Mesopotamia y Egipto. Hacen uso de las plantas para curar las enfermedades y mantener un buen estado de salud. Así por ejemplo el físico griego Hipócrates (Isla de Cos en Grecia 460 a 377 a.C.) considerado el padre de la medicina, otorga extrema importancia a la medicina preventiva y, dentro de esta, las plantas juegan un papel muy importante, hasta el punto que se considera el autor del siguiente aforismo: “Deja que la comida sea tu medicina y tu medicina tu comida”.4 El primer escrito de naturaleza científica en la época clásica es “Materia Médica” escrita por Dioscórides (40 a 90 d.C.). Es un trabajo en cinco volúmenes. Este médico griego, natural de Anazarbus en Cilicia (un país que equivaldría a la actual Turquía) trabajaba con los romanos como botánico, lo que le permitió viajar mucho. Durante sus viajes estudio las propiedades de más de 1000 plantas y de muchos principios químicos y su obra sirvió de referencia hasta el siglo XV. Se han hecho sobre ella muchas revisiones y traducciones. La revisión más importante en castellano es: “Plantas medicinales”, El Dioscórides renovado del http://es.wikipedia.org/wiki/Ciencia http://es.wikipedia.org/wiki/Planta_medicinal 9 farmacéutico leridano Dr. Pio Font Quer. En ella revisa 682 especies, mencionando las opinión es de Dioscórides y, sobre todo las revisiones que de este médico habían realizado Pietro Andrea Mattioli y Andrés de Laguna. 4 Durante la edad media restos de los conocimientos occidentales a cerca de la elaboración de medicamentos fueron preservados en los monasterios (siglos V a XII). Estos científicos se sabe que fueron instruidos en los claustros en el siglo VII. Manuscritos de muchas islas fueron traducidos o grabados para las bibliotecas de los monasterios. Los monjes reunieron hierbas en el campo, o las plantaron en sus propios jardines de hierba. Estos solían elaborar preparados de conformidad con “el arte de la farmacia” en beneficio de los enfermos y heridos.4 Finalmente los árabes son los primeros en empezar a elaborar y comercializar formas farmacéuticas. Estableciendo en Bagdad durante el siglo VIII las primeras farmacias de propiedad privada. Estas conservaban gran parte de la sabiduría grecorromana y desarrollan con la ayuda de sus recursos naturales fitofármacos como son: jarabes, elixires, colirios y polvos medicinales, también inician la comercialización de aguas destiladas.5 Cuando los musulmanes se extendieron a través de África, España y sur de Francia, llevaron con ellos un nuevo modelo de farmacia que Europa occidental pronto asimilo.5 Hacia el ciclo XIX, y hasta principios del siglo XX, se pudo vislumbrar en Europa un gran auge por el uso de los “fitofármacos” los cuales eran comúnmente prescritos a nivel medico, ya sea en formulas magistrales o formulas galénicas, estas se surtían en “boticas” y era la forma más fácil de contar con un “cuadro básico” de medicamentos. Estos “fitofármacos” incluían: jarabes, elixires, colirios, polvos, tónicos y suspensiones. A mediados del siglo pasado la medicina herbolaria sufre un gran revés ya que durante y después de la dos Guerras Mundiales, y con el descubrimiento de la penicilina, las formas farmacéuticas se empezaron a elaboraban bajo el fundamento de principios activos aislados y/o sintetizados en laboratorios.4 Aun en este siglo XXI esa tendencia es la que sigue imperando en nuestro mundo. Sin embargo el actual aumento de enfermedades crónicas y el declive económico mundial, vuelven a llevar a las gentes que viven en países subdesarrollados a buscar nuevamente un apoyo medicinal en la herbolaria. Aun es países desarrollados esta tendencia se está viendo como una moda. 10 1.1.2. Actualidad de los fitofármacos Es muy difícil ordenar un sector como el de los medicamentos elaborados a partir de plantas medicinales, que nunca ha estado ordenado. Sin embargo, es necesario afirmar que cualquier iniciativa que legisle en este sentido deberá estar presidida por dos principios irrenunciables: El interés del consumidor y usuario desde una perspectiva de salud. El principio de intervención pública como garantía del derecho a la salud.1 En la actualidad la importancia de las plantas medicinales se hace más patente en los países en vías de desarrollo. Por ejemplo en Pakistán se estima que un 80% de las personas dependen de estas para curarse, un 40% en la China, etc.1 Según estadísticas de la Organización Mundial de la Salud (O.M.S.), se estima que el 80% de la población mundial satisface sus necesidades de salud usando la medicina tradicional (hierbas y plantas silvestres).1 Esto no es de extrañar, y es precisamente su origen ancestral el fundamento que sostiene a la fitofarmacología.1 Claro, por siglos se sabe que una infusión de alguna planta medicinal puede aliviar un dolor de estómago. Sin embargo, los medicamentos hechos de plantas medicinales son mucho más que una “agüita de hierba”, por eso a partir de 1978, la OMS define la integración de los remedios tradicionales de eficacia comprobada en las políticas farmacéuticas y la reglamentación sanitaria de los países. El Ministerio de Salud es el que se encarga de la aprobación o prohibición de las plantas medicinales, recursos naturales vegetales, productos naturales botánicos y afines.1 Las formas farmacéuticas fabricadas con plantas medicinales son cada vez más populares en Latinoamérica, debido a la eficacia que están demostrando y a la menor cantidad de efectos secundarios que estos presentan a la hora de ser consumidos.6 En la actualidad, la fabricación de remedios a partir de arbustos, árboles o semillas de frutos puede contar con la misma tecnología avanzada utilizada por los laboratorios farmacéuticos que hacen medicamentos alopáticos (con ingredientes sintéticos o que sólo extraen uno o dos compuestos del vegetal medicinal, los aíslan y los sintetizan).6 En Europa la fitoterapia avalada por controles estrictos sanitarios ya es algo común, y fue muy bien recibida también en Estados Unidos, aunque en este país se les considera dentro de lo que son fármacos. En Latinoamérica la fitofarmacia es un concepto relativamente nuevo, pero que de a poco ha ido tomando fuerza, teniéndose avances fuertes en la legislación y elaboración de formas farmacéuticas registradas y supervisadas por la instancia de salud correspondiente.6 http://saludisima.com/ 11 Prueba de esta fuerza que está tomando la fitofarmacia es que ya hay laboratorios farmacéuticos que elaboran medicamentos alopáticos, elaborando fitofármacos y comercializándolos con gran éxito en el mercado mundial. En el cuadro No. 1 se muestra a algunos de ellos que venden sus productos herbolarios y/o combinados (alopáticos-herbolarios) en nuestro país. 1.2. Fitofármaco 1.2.1. Definición General Esta definición se desprende de las dos raíces de la palabra “fitofármaco”: “fito” procede del griego y significa planta, “fármaco” es el medicamento. Por lo tanto, en términos generales los fitofármacos son medicamentos que contienen como principio activo exclusivamente plantas, partes de plantas, ingredientes vegetales o bien, preparaciones obtenidas a partir de ellas.2 1.2.2. Concepto Son medicamentos obtenidos mediante modernas tecnologías de producción industrial y que contienen un extracto estandarizado de una planta el cual constituye su componente biológicamente activo. 1 Segúnel criterio de expertos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) los medicamentos herbolarios o fitomedicamentos se definen como: “Productos medicinales acabados y etiquetados cuyos ingredientes activos están formados por partes aéreas o subterráneas de plantas u otro material vegetal, o Laboratorio Nombre del fitofarmaco Forma farmacéutica y formulación Sede Farmasa-Schwabe Prosgutt Cada tableta contiene: Serenda repens 160mg/Urtica diodica 120 mg Karlsruhe, Alemania. Boheringer Lngelheim Pharmaton Cada cápsula contiene: extracto estandarizado de ginseng G115 equivalentes a 4% de ginsenósidos 40 mg. Obtenidos de raices de Panax ginseng C.A. Meyer más vitaminas y minerales. Ingelheim Amrhein, Renania-Palatinado, Alemania. Novartis Theraflu Cada parche contiene: Mentol 51, 220 mg, aceite de eucalipto en globulos 590 mg. Barcelona, España. Schering Plough Biometrix Cada cápsula contiene: Extracto estandarizado de Gynkgo biloba (al 24% de glucósidos) 10 mg. Extracto estandarizado de Ginseng coreano (al 5.3% de ginsenósidos) más vitaminas y minerales. Kenworth. N.J., Estados Unidos de Norte América. Siegfried Rhein Panato-s Cada 100 mL. de jarabe contienen: Extracto de hiedra desecada (Hedera helix) 0.7 gr Zofingen, Zuiza. 12 combinaciones de éstos, en estado bruto o en forma de preparaciones vegetales”. 1 Así mismo los fitofármacos, en sentido estricto, son fármacos: Que contienen como principio activo preparaciones vegetales, sobre todo extractos estandarizados, a diferencia de los “fármacos químicos”. Que tienen formas farmacéuticas normales como son jarabes, suspensiones, gotas, comprimidos, grageas, cápsulas o cremas. Que se emplean en el campo de la medicina científica. Cuyos efectos farmacológicos se prueban mediante experimentos y cuya eficacia clínica se demuestra en estudios clínicos y en la práctica médica. 1.2.3. Bases Científicas de los Fitofármacos El uso de toda materia prima, insumo o productos naturales en salud; no debe basarse solamente en un empirismo, más bien debe tener solidas bases científicas, porque las plantas medicinales contienen sustancias fotoquímicas bioactivas (fitofármacos); estos fitofármacos actúan de las misma forma que los fármacos convencionales de las medicinas sintéticas; y presentan indicaciones farmacológicas, dosificación o posología, efectos secundarios, adversos y colaterales, interacciones farmacológicas (fármaco-fármaco o fármaco-nutriente), precauciones, contraindicaciones, etc.2 Es por ello que las plantas medicinales y productos derivados de ellas tienen que presentar estas 3 características fundamentales: Eficacia. Seguridad. Calidad La Veracidad, también es un aspecto importante, es decir que la publicidad del producto natural sea realmente la correcta y comprobada científicamente, este es uno de los aspectos más problemáticos, porque muchos productos naturales propagandizan mensajes falsos al consumidor.2 La OMS a partir de la década de los 90 ha estado elaborando monografías científicas de plantas medicinales (una especie de fitofarmacopea) e incluye información botánica, química, farmacológica, toxicológica y clínica. 1 1.2.4. Categorización de los Fitofármacos Para que un fitofármaco sea considerado como tal, debe cumplir con las siguientes exigencias de uniformidad para sus materias primas vegetales, las cuales se volverán el principio activo de cada formula farmacéutica. 13 Certificación de la especie botánica utilizada: Un especialista clasifica la planta por género y especie. Partes empleadas: La variabilidad de las sustancias químicas presentes en las plantas, confiere diferentes características farmacológicas a cada una de sus partes; por esta razón, es importante definir la porción de la planta que se utiliza en la fabricación del extracto. Factores ambientales: El clima, la fertilidad del suelo, la altura y el uso de pesticidas, pueden alterar la calidad de la planta. Condiciones de la cosecha: Es importante determinar el tiempo adecuado para cosechar cada planta, ya que el ciclo de crecimiento modifica la composición química del extracto. Herbarios libres de contaminación: Es de suma importancia asegurar la calidad de las plantas que serán utilizadas para la preparación de fitofármacos, deben estar libres de hongos, bacterias, insectos, entre otros. Manufactura: Debe existir un procedimiento de control de calidad de los procesos de cosecha que aseguren el producto final, su estabilidad y tiempo de duración en los estantes de venta. Estandarización de los extractos: Es necesario conocer los constituyentes activos de la planta medicinal que se utiliza como la base del extracto que compone el fitofármaco; los cuales deben cumplir con un estándar de cuantificación para garantizar la calidad y seguridad del medicamento. Bases de comparación de los fitofármacos: Serán determinantes en el tipo de extracto los solventes empleados, los materiales secos utilizados y las condiciones de extracción.20 1.2.5. Pasos que llevan a la elaboración de una tintura madre (TM) 1.2.5.1. Controles de uniformidad para la adquisición de materia prima verde ………..(planta medicinal) para la elaboración de tinturas madre. Autentificación de las especies empleadas Parte de la planta que son usadas: Raíz, corteza, hojas, flores. Factores ambientales: Clima, altura, fertilidad del suelo y tipo de suelo. Condiciones de cosecha: Época del año, horario, humedad. Certificado de cumplimiento de los controles de calidad establecidos por las Normas Oficiales Mexicanas. 14 1.2.5.2. Control de Calidad Aspectos químicos y microbiológicos de materias primas. Control de material de envase y empaque. Controles de proceso.Controles químicos, microbiológicos y organolépticos de producto terminado. Calidad basada en Farmacopeas. Seguridad y eficacia (literatura científica). Ensayos clínicos Contaminación de ingredientes herbarios: Insectos, hongos, excretas, Pb, Mn, Hg.Buenas prácticas de manufactura: Control de calidad. Estandarización de los extractos. 7,8 1.3. Regulación de fitofármacos 1.3.1. Europa En la mayoría de los estados de la Unión Europea, los fitofármacos se incluyen en la Ley de Salud de cada nación. Por ejemplo, en España los fitofármacos se incluyen en la Ley 25/90 del Medicamento, en la categoría de medicamentos.8 En dicha información no se manejan aquellos matices que, en última instancia, no tengan importancia para la práctica terapéutica, sino que está enfocada hacia el concepto de fitofármacos en sentido estricto, como se emplea hoy día en la mayoría de los casos. Los fitofármacos en sentido estricto se definen mediante los siguientes dos criterios11: 1. Son fármacos que contienen, como sustancias activas, preparaciones de partes vegetales en una forma galénica específica. La preparación a partir de partes vegetales puede ser: a) Partes vegetales cortadas o pulverizadas. b) Jugos de partes de plantas. c) Tinturas, maceraciones en aceites, destilados. d) Extractos de partes de plantas, obtenidos mediante solventes dentro del marco de varios procedimientos. Como formas galénicas se encuentran especialmente: a) Polvos, gránulos. b) Gotas, jugos, soluciones. c) Cápsulas, comprimidos, grageas. d) Ampolletas, infusiones. e) Pastas, ungüentos, geles y cremas. 15 2. Son fármacos que forman parte de una terapia medicamentosa racional en el sentido de la medicina científica y se emplean para el tratamiento de enfermedades o padecimientos definidos. Los fitofármacos modernos se someten a la comprobación de eficacia y tolerancia según los métodos de determinación de la medicina académica. La comprobación del efecto se realiza, esencialmente, mediante experimentos farmacológicos y la de eficacia mediante estudios clínicos o a través dela experiencia médica.11 Presentado en forma sencilla, un fitofármaco en sentido estricto se diferencia de un “fármaco químico” en que contiene como principio activo una preparación vegetal en lugar de una sustancia química sintetizada. Por esta razón, predominan los “extractos” de preparación de plantas. Es evidente que los productos mencionados a continuación no corresponden a la definición relevante para la práctica de los fitofármacos en sentido estricto con base en los dos criterios anteriores: a) Fármacos homeopáticos b) Fármacos antroposóficos c) “Remedios naturales”, (en el sentido tradicional de la expresión, “remedios …caseros”, entre otros).11 Si un fitofármaco contiene, como principio activo, un solo extracto vegetal se conoce como monopreparado. Si contiene dos o más extractos como principios activos se conoce como preparado de combinación. Bajo el concepto “extracto” se entienden formas diferentes, por ejemplo extractos líquidos, densos, o bien secos. Los medicamentos basados en principios activos vegetales aislados únicos (por ejemplo, digoxina) no se consideran como fitofármacos en sentido estricto, porque no tienen los principios secundarios naturales de un extracto. La unidad de los principios activos, secundarios y excipientes importantes para la eficacia que caracteriza un fitofármaco no se encuentra en estos medicamentos. 11 1.3.2. México De acuerdo con el articulo 224 Sección B de la reciente reforma a la Ley General de Salud publicada en el Diario Oficial el 30 de Diciembre de 2009, los medicamentos se clasifican por su naturaleza en alopáticos, homeopáticos y herbolarios.10 Definiéndose a los medicamentos herbolarios como: Aquellos productos elaborados con material vegetal o algún derivado de éste, cuyo ingrediente principal es la parte aérea o subterránea de una planta en extractos o tinturas, así 16 como jugos, resinas, aceites grasos y esenciales, presentados en forma farmacéutica, cuya eficacia terapéutica y seguridad ha sido confirmada científicamente en la literatura nacional o internacional.10 Es en la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (FHEUM, Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, 2001), que siendo la primera en su tipo de toda América, tiene como objetivo establecer los métodos de análisis y especificaciones técnicas que deben cumplir las plantas y sus derivados, que se utilicen en la elaboración de medicamentos y remedios herbolarios, para contribuir al mejoramiento de la calidad de estos productos y a su uso racional.16 Una característica importante por resaltar sobre la información contenida en las monografías de la FHEUM, es que la mayoría de estas se conformaron con base en información recabada de fuentes internacionales (publicaciones arbitradas o monografías de otras farmacopeas de su tipo), por lo que casi todas las especies referidas son especies europeas que fueron introducidas a América durante la Conquista.16 1.3.3. Estados Unidos de Norteamérica En los Estados Unidos de Norteamérica no existe la figura de fitofármaco, ni siquiera como medicamento herbolario. Aquellos productos derivados de plantas que cumplen en forma completa con las condiciones necesarias para ser considerados medicamentos, se registran como tales, pero sin la connotación de herbolarios. Así los productos herbolarios que no cumplen con estas condiciones, pueden incluirse como suplementos dietéticos9, llevando una leyenda que reza: Este producto no ha sido evaluado por la FDA. Por lo tanto este producto no intenta diagnosticar, tratar, curar o prevenir alguna enfermedad.12 1.4. Tinturas Madre 1.4.1. Definición Las Tinturas Madre son preparaciones líquidas que resultan de la extracción por medio del alcohol de principios activos de origen vegetal. Vienen señaladas con la abreviación T.M. o el símbolo O. La farmacopea XVI de los EEUU a definido las tinturas como “soluciones alcohólicas o hidroalcohólicas preparadas con drogas vegetales o con sustancias químicas”. Las tinturas se diferencian de los espíritus en que usualmente se preparan con cuerpos no volátiles.13 1.4.2. Conceptos básicos sobre su obtención 17 La preparación de las Tinturas Madre (TM) se efectúa en recipientes de materiales inertes (acero inoxidable o vidrio). Para elaborar una tintura madre se puede usar la percolación o la maceración en alcohol de título apropiado. Este título o grado alcohólico difiere en cada planta, así habrá plantas que sus principios activos sean más solubles en alcohol y habrá otras donde sus principios activos sean más solubles en agua. 14 El peso de la TM obtenido debe ser igual a 10 veces el peso, nos referimos al peso en seco de la planta tratada. Se macera por lo menos 3 semanas, se comprime el residuo con una presión de 10 pascal, e deja reposar y se filtra. Esto es muy importante para conservar el principio activo de cada planta y su acción medicamentosa.14 1.4.3. Estandarización.- Porcentajes de hierba según su actividad La Farmacopea Europea señala el proceso a seguir con la droga. En términos generales, el porcentaje de la hierba seca es de 20% en peso para drogas activas (1 gr. de droga por 5 gr. de tintura) y al 10% en peso para drogas muy activas (1 gr. de droga por 5 gr. de tintura). 15 La necesidad de estandarizar exige en la actualidad una valoración de las tinturas, indicando los contenidos máximos y mínimos en principios activos. Dependiendo que en la elaboración de la tintura se emplee una o varias drogas, se denominan respectivamente simples o compuestas (por ejemplo la tintura azafranada de opio de la Farmacopea Europea.15 1.4.4. Usos De acuerdo al tipo de solvente las tinturas son de uso interno, como ocurre en general con las hidroalcohólicas, o para uso externo, como sucede con las tinturas etéreas, clorofórmicas y acetónicas. Las tinturas hidroalcohólicas son las más empleadas hasta ahora, ya que la mayoría de las plantas usadas para la obtención de estas tienen principios activos solubles en alcohol y/o agua.15 18 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Considerando la dificultad que se presenta para regular el sector de los medicamentos herbolarios, el cual a través de los siglos nunca ha estado ordenado. Y tomando en cuenta, la necesidad de afirmar que cualquier iniciativa que legisle en este sentido deberá estar presidida por dos principios irrenunciables como son: El interés del consumidor y usuario desde una perspectiva de salud. El principio de intervención pública como garantía del derecho a la salud. Se hace indispensable que en México la industria farmacéutica fundamente en bases científicas (Farmacopea Herbolaria) su control sanitario en la elaboración de los fitofármacos con marcos regulatorios sobre: definiciones, manufactura, registros, etiquetas, publicidad, declaraciones de propiedades y comercialización de los mismos; para respaldar la elaboración de estos con principios activos vegetales de alta calidad. Así también esta regulación científica y sanitaria debe incluir la obtención de tinturas madre que se usan en la elaboración de varios fitofármacos y que son el principio activo vegetal de estos. Por tanto, con base en la información previamente establecida se realizó la obtención de tinturas madre para un fitofármaco. Todo ello para lograr una mejora en la obtención, uso y manejo de principios activos vegetales para la elaboración de un fitofármaco a través de la industria farmacéutica. 19 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo general Obtener una tintura madre con base a la información científica basada en la regulación sanitaria para la obtención de estas. 3.2. Objetivos específicos Enumerar los pasos a seguir para llevarun control de calidad en la obtención y almacenamiento de materia prima verde (plantas medicinales). Definir las características que deben guardar las plantas medicinales para respaldar su viabilidad en el uso de elaboración de tinturas madre. Describir los pasos a seguir para la obtención y estandarización de una tintura madre. Proponer la forma de conservación de una tintura madre. 4. MATERIAL Y MÉTODO 4.1. Materiales, Equipos y Reactivos. 4.1.1. Material Biológico 200 gramos de plantas secas de: Gynkgo Biloba (Lote: GKO 00363346) Ajenjo (Artemisa absinthium) (Lote: AJJ 002670041) Manzanilla (Matricaria chamomilla) (Lote: MNA 002080915) (Proveedor: Rosa Elena Dueñas, S.A. de C.V. Empresa exportadora e.importadora de plantas medicinales). 20 4.1.2. Materiales de Laboratorio Vasos de precipitado 500 mL. (Marca Pyrex) Pipetas de 2,5,10 mL. (Marca Labbox) Cápsulas de porcelana (Marca Pyrex) Espátula (Marca Carving) Probetas (Marca Pyrex) Equipo de reflujo (Marca Jkedal) Matraces bola de 25, 100 mL. (Marca Jkedal) Cajas petri de vidrio (Marca Jkedal) Asa de platino (Marca Veravitrum) Matraces Erlenmeyer (Marca Labbox) Tubos de ensayo (Marca Pyrex) Embudo (Marca Pyrex) Lámpara de alcohol (Marca Veravitrum) Parrilla eléctrica (Marca Labomex) Trípode (Marca Veravitrum) Papel filtro (Marca Labbox) Rollo de algodón (Marca Labbox) Rollo de papel aluminio (Marca Labbox) 4.1.3. Equipo Extensómetro (mod. EZ- Test marca Shimadzu) Equipo de percolación (mod. SX marca Kinetics) Rotavapor (mod. Stuar RE/MS marca BAUSH LOMB) Auto clave (MARKET FORGE SLERILMATIC) Balanza de precision (mod. 4100 marca GRAN NX) Balanza análítica (MOD. AV-50 marca DENVER USA) Agitador eléctrico de 220 voltios (mod. 102 marca LABEQUIM) Estufa (mod. E28 marca CIENYTEC) Estufa bacteriológica ( mod: E 33 marca RIOSSA) Mufla ( mod: FB1415M marca THERMO SCIENTIFIC) Refrigeradora (mod. LG V232 marca LG) Parrilla con agitadoción magnética (mod.A-50022D marca SCORPIONS CIENTIFIC) Potenciómetro (METROHN) Desecador (mod. 2.4 marca CORNING PYREX) Refractómetro (mod. ABBE NAR-1T marca RYE) Lector UV (mod. CLS200X marca LEICA) Espectrofotómetro (mod. HELIOS EPSIOLON marca SPECTRONICS) Ultrasonido (mod. XL marca SONICATOR) 21 4.1.4. Reactivos Cuadro No. 2 (Adquisición: Lab. GuillMar) Reactivo Proveedor/Marca Lote Agua destilada Ecopura de Querétaro 142AQ/013 Clorhidrato de hidroxilamina (solución) RYE/BAKER GM-219501 Tartrato de sodio RYE/BAKER GM-106664 Tartrato de potasio RYE/BAKER GM-106673 Ditizona (Solución) RYE/BAKER GM-104532 Metanol Ecopura/Kelsia EN8410-366 Ácido clorhídrico 20% RYE/MERCK 18-319100 Ácido clorhídrico 10% RYE/MERCK 18-319200 Hidróxido de sodio RYE/BAKER GM-106452 Peróxido de hidrógeno al 30% RYE/BAKER GM-218601 Etanol 96% Ecopura de Querétaro 191TQ/04 Etanol 50% Ecopura de Querétaro 200AQ/45 Ácido sulfúrico concentrado RYE/MERCK SH-71410 22 4.2. Diagrama de Flujo 23 4.3. Metodología 4.4. Pruebas de control de calidad de la especie vegetal El control de calidad de la materia prima vegetal (planta herbolaria) se realiza considerando la metodología de la OMS, y demás organismos encargados de asegurar la calidad de los productos fitofarmacéuticos.2 Para el control de calidad de las plantas medicinales crudas se realizaron las siguientes pruebas: 4.3.1.1 Determinación de la humedad 4.3.1.2. Cenizas totales 4.3.1.3. Cenizas solubles en agua 4.3.1.4. Determinación de metales pesados (Plomo) 4.3.1.5. Determinación de microorganismos 4.4.1. Determinación de humedad Se pulveriza una muestra de la materia prima verde y se pesan 2 gr con desviación permisible de 0.5 mg y se transfieren a una cápsula de porcelana previamente tarada y desecada a 105°C. Durante 3 horas. La cápsula se coloca en la desecadora donde se deja enfriar a temperatura ambiente y se pesa, colocándose nuevamente en la estufa durante 1 hora, volviéndose a pesar, hasta obtener una masa constante15. Expresión de los resultados. 1). %𝐻 = 𝑀2−𝑀1 𝑀2−𝑀 ∗ 100 ……….ec. 1 %H = pérdida de peso por desecación (%) M2 = masa de la cápsula con la muestra de ensayo (gr) M1 = masa de la cápsula con la muestra de ensayo desecada (gr) M = masa de la cápsula vacía 100 = constante de porcentaje.22 4.4.2. Determinación de cenizas totales Se determinó la masa de 2.0 gr de la muestra de ensayo con una variación permisible de 0.5 mg en un crisol de porcelana previamente tarado. Se calienta suavemente la porción de ensayo aumentando la temperatura hasta carbonizar y luego incinerar en un horno mufla a temperatura de 700°C durante 2 hrs. 24 Se enfría el crisol en una desecadora y se pesa, repitiéndose el proceso hasta que dos pesadas sucesivas no difieran en 0.5 mg por gr. (masa constante).16, 22 Para obtener masa constante los intervalos entre calentamiento y pesada son de 30 min. Si el residuo presenta trazas de carbón, se le añade unas gotas de solución de H2O2 concentrado, ácido nítrico o solución de nitrato de amonio al 10% y se calienta hasta evaporar los solventes. Al enfriar el crisol el residuo es de color blanco. Expresión de los resultados: 2). %CT = M2−M M1−M ∗ 100 ……….ec. 2 %CT = porcentaje de cenizas totales en base hidratada. M = masa del crisol vacío (gr) M1 = masa del crisol con la proporción de ensayo (gr) M2 = masa del crisol con la ceniza (gr) 100 = factor matemático para los cálculos. 17,22 4.4.3. Determinación de cenizas solubles en agua A las cenizas totales obtenidas según el apartado anterior, se le añaden de 10 a 20 ml. De agua. El crisol de tapa y se hierve suavemente a la llama del mechero durante 5 min. La solución se filtra a través del papel de filtro libre de cenizas. El filtro con el residuo se transfiere al crisol inicial, se carboniza en un mechero y luego se incinera en un horno mufla a temperatura de 700 a 750°C., durante 2 h. Posteriormente se coloca en una desecadora y cuando alcance la temperatura ambiente se pesa. Se repite el procedimiento hasta alcanzar peso constante. Expresión de los resultados: 3). %𝐶AV = 𝑀2−𝑀𝑎 𝑀1−𝑀 ∗ 100 .……ec. 3 %CAV = porcentaje de cenizas solubles en agua en base hidratada M2 = masa del crisol con la cenizas totales (gr) Ma = masa del crisol con las cenizas insolubles en agua (gr) 25 M1 = masa del crisol con la muestra de ensayo (gr) M = masa del crisol vacío 100 = factor matemático para los cálculos.22 4.4.4. Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico A las cenizas obtenidas según la técnica se le añaden 2 a 3 ml de ácido clorhídrico al 10%. El crisol se tapa con un vidrio reloj y se calienta sobre un baño de agua hirviente durante 10 min. Se lava el vidrio reloj con 5 ml de agua caliente y se une al contenido del crisol. La solución se filtra a través de un papel de filtro libre de cenizas, se lava el residuo con agua caliente hasta que el filtro acidulado con ácido nítrico al cual se le añade una o dos gotas de solución de nitrato de plata 0.1M. No muestre presencia de cloruros. El filtrado con el residuo se deseca de 100 a 105°C, se transfiere al crisol inicial y se incinera en un horno mufla a temperatura de 700 a 750°C., durante 2h (si no se señala otra temperatura en la norma específica).Posteriormente se coloca en una desecadora y cuando alcance la temperatura ambiente se pesa. Se repite el procedimiento hasta obtener una masa constante16. Expresión de los resultados: 4). %𝐶I = 𝑀2−𝑀 𝑀1−𝑀 ∗ 100 ……. ec. 4 %CI = porcentaje de cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base hidratada. M = masa del crisol vacío (gr) M1 = masa del crisol con la proporción de ensayo (gr) M2 = masa del crisol con la ceniza (gr) 100 = factor matemático para los cálculos. 18 4.4.5. Determinación de sustancias solubles De la muestra de ensayo previamente pulverizada y tamizada se pesan 5 gr y se transfiere a un vaso cónico con tapa con capacidad de 250 ml. Se añaden 100 ml de agua y se agita constantemente durante 6 horas. Dejar en reposo 24 horas, luego agitar 30 min, y filtrar por papel. Se toma una alícuota de 20 ml, se transfiere a una cápsula de porcelana previamente tarada, evaporar sobre baño de agua, se 26 deseca en estufa a 105°C, durante 3 horas, se enfría en un desecador y se pesa. El ensayo se realiza por triplicado16. Expresión de los resultados: 5). %𝑆𝑠 = 𝑅∗500 𝑀∗(100−𝐻) ∗ 100 ….. ec. 5 %Ss = porcentaje de sustancias solubles en base hidratada. H = Humedad de la muestra en % R = Residuo de la muestra (gr) M = masa de la muestra de ensayo (gr) 100 y 500 = factor matemático para los cálculos.17,22 4.4.6. Determinación de metales pesados Se preparo un extracto etanolico y se tomó 20 ml. de esta solución, regulando su pH en un rango de 7-8 con solución de amoníaco. A continuación se añadió 2 ml de solución de cianuro de potasio, 1 ml de solución de clorhidrato de hidroxilamina y 2ml de solución de tartrato de sodio y potasio. Después se agitó la mezcla fuertemente durante medio minuto con 5 ml de solución de ditizona. La fase orgánica separada se midió a 520 nm., en cubetas de 1 cm tomando como solución de referencia tetracloruro de carbono. La lectura se realiza en absorbancia y se obtiene el resultado por interpolación en la curva de calibración elaborada con los estándares respectivos16. 4.4.7 Análisis espectrofotométrico del marcador químico: flavonoides ………..totales expresado como porcentaje de quercetina15. 1. Mezclar un gramo de droga en polvo con 10 ml de metanol por 5 min en un baño de agua (60°C). 2. Tomar 5 ml de la solución metabólica y concentrar hasta obtener 2 ml 3. Colocar un ml de agua y 10 de acetato de etilo, agitar por 10 min. 4. Separar la fase de etil acetato y concentrar hasta obtener un volumen de 1 ml. 5. Usar el concentrado para la cromatografía. 6. Se aplican 10 microlitros del concentrado en una placa cromatografica de silica gel 60 F254 con la ayuda de un capilar. 7. Dejar secar después de cada aplicación 8. Se introduce la placa en la cuba cromatografica, hasta que el solvente recorre las ¾ partes de la placa. 27 9. Retirar de la cuba y dejar secar para luego observar en la lámpara UV 365 nm, 10. Revelar la placa y dejar secar, calentar en la estufa y anotar los Rf. Adsorbente: Silica gel 60 F254 (Merk) Sistema de solvente: Cloroformo-acetona-ácido fórmico (75:16.5:8.5) Revelado: Ácido sulfúrico-vainillina. Cálculo: 6). Rf = Distancia recorrida de la muestra Distancia recorrida del solvente …...ec. 6 4.4.8. Cuantificación de flavonoides15. Para droga seca y para producto final: 1. Se pesa 1 gr de muestra comprimida y se coloca en un matraz de bola de 250 ml 2. Añadir 20 ml de etanol al 50% y 8 ml de ácido sulfúrico concentrado. 3. Llevar a reflujo por 2 hrs en baño de agua. 4. Dejar enfriar y filtrar a través de filtro Buchner, utilizando papel de filtrar. 5. Lavar el residuo con 10 ml de etanol al 50% para desecharlo finalmente. 6. El filtrado se evapora en baño de agua hasta la mita del volumen inicial. 7. Enfriar sobre un baño de agua fría durante 30 min. 8. Filtrar, el papel con el residuo se lava con 70 ml de etanol al 96% caliente a 50°C 9. Se trasvasa a un matraz balón volumétrico de 100 ml y se afora con etanol al 96% 10. Determinar la absorvancia a 258 nm. 11. Como patrón se emplean 0.04 gr de quercetina, los cuales se deben disolver con etanol al 96% hasta completar un volumen de 50 ml, de esta solución tomar 1 ml y diluir a 100 ml con etanol al 50%. La expresión empleada para el cálculo es la siguiente: 7). 𝑋 = 𝐴𝑚∗𝑃𝑟∗5 𝐴𝑟 ∗ 100 …… ec. 7 Donde: X = Contenido de flavonoides totales expresados como quercetina (%) Am = Absorbancia de la solución muestra (nm) Pr = Peso de la sustancia de referencia (gr) Ar = Absorbancia de la solución de referencia (nm) 19 28 4.5. Análisis Microbiológico 4.5.1. Método de conteo de aerobios mesófilos totales en placa16. 1. Pesar 25 gr de materia prima vegetal en un erlenmeyer estéril. 2. Agregar 250 ml de agua peptonada al 0.1% estéril y homogenizar, de este modo se obtiene una dilución de 10-1. 3. Dejar reposar por una hora. 4. De esta dilución tomar 1 ml y mezclar con 9 ml de agua peptonada 0.1% y obtener una dilución de 10-2 . De este modo realizar otras diluciones. 5. Se preparan tubos de ensayo tapa rosca con 15 ml de medio de cultivo PCA (Plata Count Agar). 6. A cada tubo con agar se adiciona 1 ml de la dilución preparada en el agua peptonada al 0,1%. 7. Homogenizar en un vortex, y el contenido de cada tubo verter en cajas petri. 8. Incubar a 35+- 2°C por 48 horas. 9. Transcurrido ese tiempo, realizar la lectura. 10. Contar las colonias que se desarrollan y se anota el resultado de las placas con mayor número de colonias.18 4.5.2. Determinación de coliformes totales16. a) Prueba presuntiva. 1. Pesar 25 gr de materia prima vegetal en un erlenmeyer estéril. 2. Agregar 250 ml de agua peptonada al 0.1% estéril y homogenizar. De este modo se obtiene una dilución de 10-1. 3. Dejar reposar por una hora. 4. De esta disolución, tomar un ml, y mezclar con 9 ml de agua peptonada 0.1% y obtener una dilución de 10-2. 29 5. Colocar 1 ml de cada una de las diluciones en 10 ml de caldo lactosado. 6. Incubar por 24-48 horas a 35+- 2°C. 7. Observar si existe turbidez en el caldo lactosado y/o presencia de burbujas en la campana Durham (fermentación con formación de gas). b) Prueba confirmatoria. 1. De los tubos positivos de caldo lactosado tomar 2 ó 3 asadas y sembrar en tubos de 10 ml de caldo BRILLA. 2. Incubar por 24-48 hs a 35+-2°C. 3. Observar si existe turbidez en el caldo lactosado y/o presencia de burbujas en la campana Durham (fermentación con formación de gas). 4. Los resultados se interpretan según la tabla de NMP (Número más probable). Cuadro NO. 3. Utilizado para la interpretación del NMP para la determinación de coliformes totales. Combinación de tubos NMP Combinación de tubos NMP 0-0-0 < 3 3-0-0 23 0-0-1 3 3-0-1 39 0-1-0 3 3-0-2 64 1-0-0 4 3-1-0 43 1-0-1- 7 3-1-1 75 1-1-0 7 3-1-2 120 1-1-1- 11 3-2-0 93 1-2-0 11 3-2-1 150 2-0-0 9 3-2-2 210 2-0-1 14 3-3-0 240 2-1-0 15 3-3-1 260 2-1-1 20 3-3-2 1100 2-2-0 21 3-3-3 >2400 Fuente Cásares , Armando. Control de Calidad Microbiológico de Materias Primas y Productos Fitofarmacéuticos. Farmaya. Guatemala. 30 Cuadro No. 4. Número de microorganismos cuantificados para valoración. Microorganismo Cuantificación en (NMP/g Valoración Coliformes totales 0-100 Aceptable Coliformes totales 100-460 Regular/Aceptable Coliformes totales ˃ 460 Inaceptable/Rechazado Coliformes totales 10 AceptableColiformes totales 10 Rechazado23 Fuente Cásares , Armando. Control de Calidad Microbiológico de Materias Primas y Productos Fitofarmacéuticos. Farmaya. Guatemala. 4.5.3. Determinación de coliformes fecales. a) Prueba presuntiva. 1. Se produce de igual forma que en la prueba presuntiva para coliformes totales. b) Prueba confirmatoria. 1. De los tubos positivos en caldo lactosado tomar 2 ó 3 asadas y sembrar en tubos 10 ml de caldo EC. 2. Incubar por 23-48 hs a 35+- 2°C 3. Observar si existe turbidez en el caldo lactosado y/o presencia de burbujas en la campana Durham (fermentación con formación de gas). 4. Los resultados se interpretan según la tabla de NMP.23 4.5.4. Investigación de salmonella 1. Pesar 25 gr de la muestra y colocarla en 225 ml de Caldo de Soya Tripticasa 2. Incubar a 35°C, por 24+- 2 hs 3. Transferir 0.1 ml a 10 ml de caldo tetrationato. Incubar de baño de agua a 42°C, por 18–24hs 31 4. Del caldo de tetrationato sembrar 10 microlitros en agar XLD, HE y BS, incubar a 35°C por 24+-2 hs 5. Examinar en las cajas para ver si hay presencia de colonias que pueden ser Salmonella 6. Morfológicamente las colonias de Salmonella se ven de la siguiente forma: 7. En agar HE: colonias azules o verde azuladas con la presencia o no de centros negros. Muchos cultivos de Salmonella pueden producir colonias grandes, con centros de brillo negro o también pueden aparecer colonias completamente negras. 8. En agar XLD: Colonias rosadas con o sin centros negros. Muchos cultivos de Salmonella pueden producir colonias grandes con centros negros brillantes o pueden aparecer colonias completamente negras. 9. En agar BS: Colonias cafés, grises o negras; algunas veces con brillo metálico. Alrededor del medio se forma al principio una coloración café, pero a medida que aumenta el tiempo de incubación, se produce un efecto llamado halo. 10. Si las colonias típicas están presentes en el agar BS luego de la incubación por 24 horas, coger con una asa 2 o más colonias. 11. Sembrar en agar BS e incubar otras 24+-2 hs adicionales. 12. Luego de las 48 hs de incubación, tomar 2 o más de las colonias típicas y transferirlas al agar inclinado TSI y/o LIA. Incubar los tubos a 35°C por 24+-2 hs. 13. Si no hay crecimiento en los tubos, se descarta la presencia de Salmonella. 14. En el tubo con TSI, el aparecimiento de coloración roja en el medio (alcalinidad), y/o la producción de H2S (ennegrecimiento del agar) nos confirma la presencia de Salmonella. 15. En el medio LIA las colonias típicas de Salmonella, producen alcalinidad (coloración púrpura) en el medio. La mayoría de los cultivos de Salmonella producen H2S en LIA. 16. Las pruebas confirmatorias se realizan mediante determinaciones bioquímicas (MR-VP, Simmons citrato, Urea, Indol, etc.) y/o con reacciones serológicas somáticas utilizando suero polivalente para Salmonella.23 32 4.5.5. Método de conteo de mohos en placa. 1. Pesar 25 gr de materia prima vegetal en un erlenmeyer estéril. 2. Agregar 250 ml de agua peptonada al 0.1% estéril y homogenizar, de este modo se obtiene una dilución de 10-1. 3. Dejar reposar por 1 hora. 4. De esta dilución, tomar 1 ml y mezclar con 9 ml de agua peptonada 0.1% y obtener una dilución de 10-2. 5. Preparar cajas de petri con medio de cultivo OGY. 6. Sobre las cajas petri colocar 0.1 ml de las diluciones respectivas y extender mediante un extensor de vidrio. 7. Incubar a temperatura ambiente por 5-7 días. 8. Realizar el contaje. 9. El recuento del número de colonias formadas no debe ser mayor de 100 Colonias/caja.23 33 4.6. Preparación para la obtención de la tintura madre Método por Maceración. * Tomando en cuenta que la concentración de principios activos que deba tener la tintura madre, es aquella que el laboratorio quiera darle para su uso y fin. ** El tiempo y temperatura de maceración depende de la extracción y tipo de principios activos que se quieran extraer. 4.7. Control de calidad de la Tintura madre. 4.7.1. Descripción organoléptica. Para esta prueba se toma una alícuota de 25 ml de la tintura madre y se le pone en un vaso de precipitados de 50 ml, y se procede al análisis sensorial de: color, olor, turbidez y aspecto.22 34 4.7.2. Determinación del pH. La acidez o la alcalinidad de las soluciones acuosas se caracterizan por el valor del índice de hidrógeno, pH. El pH es por tanto un índice numérico que se utiliza para expresar la mayor o menor acidez de una solución en función de los iones hidrogeno. Se calcula teóricamente mediante la ecuación: pH = -log a (H+) a(H+) = actividad de los iones hidrógeno En la práctica la medición del pH se lleva a cabo por medio de la lectura de pH en la escala de un instrumento medidor de pH, ya sea igual o análogo. Esta lectura está en función de la diferencia de potencial establecida entre un electrodo indicador y un electrodo de referencia usando como solución de ajuste de la escala del medidor de pH, una solución reguladora del mismo. El ajuste del equipo se hace con la solución reguladora de pH adecuada al rango en que se realizará la determinación. Posteriormente se determinará el valor del pH de la muestra. 4.7.3. Determinación de la densidad relativa. Se entiende por densidad relativa a la relación entre masa de un volumen de la sustancia a ensayar a 25°C y la masa de un volumen igual de agua a la misma temperatura. Este término equivale a peso específico. Primeramente pésese el picnómetro vacío y seco y llénese con la porción de ensayo, manteniéndole a temperatura de 25°C durante 15 min. Y ajústese el líquido al nivel empleado, si es preciso, una tira de papel para extraer el exceso, secar posteriormente el picnómetro. Expresión del resultado: La densidad relativa a 25°C se calcula por la siguiente fórmula: 8). D25 = M1 - M …….ec. 8 M2 - M Donde: M1 = peso del picnómetro con la muestra (gr) a temp. ambiente M2 = peso del picnómetro con la muestra (gr) a temp. De 25°C 35 M = peso del picnómetro vacío. Los resultados se aproximan hasta la tercera cifra. 4.7.4. Determinación del Índice de Refracción. Se procede a medir directamente la muestra en el refractómetro. La fórmula utilizada es la siguiente: N d20 = n1 + 0.00044 (T – 20) Donde: (n)20 : índice de refracción corregido. (nT )d : índice de refracción determinado. 0.00044 y 20: factores de corrección matemático. T: temperatura a la que se realiza la lectura. 4.7.5. Determinación de sólidos totales. Transferir a una cápsula previamente tarada, 5 ml de muestra y llevar a baño maría, completar la evaporación en estufa a 105°C por 3 hs, pesar las cápsulas, y repetir el procedimiento hasta peso constante con intervalos de 30 minutos. Los resultados se expresan en porcentaje de sólidos totales y se reportan en cifras enteras, según fórmula: 9). St = Pr - P X 100 …….ec. 9 V Donde: Pr = masa de la cápsula más el residuo (gr) P = masa de la cápsula vacía (gr) V = volumen de la porción de ensayo 100 = factor matemático para el cálculo.22 4.8. Tamizaje Fotoquímico.36 4.8.1. Ensayo de Dragendorff. Utilizado para detectar la presencia de alcaloides. Se debe tomar en cuente que si el extracto eta disuelto en solvente orgánico, este debe evaporarse en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 ml de ácido clorhídrico al 1% en agua. Si se trata de un extracto acuoso, a la alícuota se le añade 1 gota de ácido clorhídrico concentrado, (calentar suavemente y dejar enfriar hasta acidez). Para el ensayo, a la solución acuosa ácida se le añade 3 gotas del reactivo de Dragendorff, y se observa: Opalescencia : (+) Turbidez definida : (++) Precipitado : (+++) 4.8.2. Ensayo de Mayer. Se procede de la forma descrita previamente. A la solución ácida se le adiciona una pizca de cloruro de sodio en polvo, se agita y se filtra. Al filtrado adicionar 2 ó 3 gotas de la solución reactiva de Mayer. Tras observación se reporta de la siguiente manera: Opalescencia : (+) Turbidez definida : (++) Precipitado abundante: (+++) En el caso de alcaloides cuaternarios y/o amino-óxidos libres, éstos solo se encontraran en el extracto acuoso y para considerar su presencia la reacción debe ser (++) ó (+++), en todos los casos, ya que un resultado (+), puede provenir de una extracción incompleta de bases primarias, secundarias o terciarias. 4.8.3. Ensayo de Wagner. Se parte de la solución ácida, de igual forma que en los casos anteriores. A esta solución, se le adiciona 2 ó 3 gotas del reactivo de Wagner y se reportan los resultados de igual forma que en la reacción anterior. 4.8.4. Ensayo de Baljet. 37 Es útil para reconocer la presencia de compuestos con agrupamiento lactonico, en particular cumarinas, aunque otros compuestos lactonicos pueden dar resultado positivo. Sí la alícuota de la muestra a probar no está en alcohol, debe evaporarse el solvente en baño de agua y redisolverse en 1 ml de alcohol. Seguidamente, se añade 1 ml del reactivo. La prueba es positiva, cuando aparece una coloración o precipitado de color rojo (++ y +++) respectivamente. 4.8.5. Ensayo de Borntrager. Es útil para detectar la presencia de quinonas. Si la alícuota no está en cloroformo debe evaporarse el solvente en baño de agua hy el residuo redisolverse en 1 ml de cloroformo. Se adiciona 1 ml. de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amonio al 5% en agua. Se agita mezclando las fases y se deja en reposo hasta su ulterior separación. El ensayo es positivo cuando la fase acuosa alcalina (superior) se colorea de rosado, en este caso se reporta (++) o rojo, para lo cual se reporta (+++). 4.8.6. Ensayo de Lieberman-Buchard. Permite reconocer en un extracto la presencia de triterpenos y/o esteroides, en ambos tipos de productos debe poseer un núcleo del androstano, insaturado en el anillo B y la posición 5-6. Para ello, si la alícuota no se encuentra en cloroformo debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 ml de cloroformo. Se adiciona 1 ml de anhídrido acético y se mezcla bien. Por la pared del tubo de ensayo se dejan resbalar 2-3 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar. Un ensayo positivo se tiene por un cambio rápido de coloración: Rosado a azul (muy rápido) Verde intenso a visible (rápido) Verde oscuro a negro (final de la reacción). El tercer cambio generalmente ocurre cuando el material evaluado tiene cantidades importante de estos compuestos. Para realizar este ensayo no puede haber agua en el medio de reacción pués ésta, con el ácido sulfúrico reacciona de forma violenta y puede ocurrir un accidente. La reacción de Liebermann-Burchard es también utilizada para diferenciar las estructuras esteroides de los triterpenoides, las primeras producen coloración azul o azul verdoso, mientras que para las segundas se observa rojo, rosado o 38 púrpura. Estas coloraciones pueden variar por interferencias producidas por carotenos, xantofilas y esteroides saturados que puedan estar presentes. 4.8.7. Ensayo de resinas. Para detectar este tipo de compuestos, adicionar a 2 ml de la solución alcohólica, 10 ml de agua destilada. La aparición de un precipitado, indica un ensayo positivo. 4.8.8. Ensayo de Fehling. Identifica en un extracto la presencia de azúcares reductores. Para ello si la alícuota del extracto no se encuentra en agua, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1-2 ml de agua. Se adicionan 2 ml del reactivo y se calienta en baño de agua de 5 a 10 min. El ensayo se considera positivo si la solución se colorea de rojo o aparece precipitado rojo. El reactivo se prepara de la siguiente forma: Solución A: Se pesan 35 gr de sulfato cúprico hidratado cristalizado y se disuelve con agua hasta un volumen total de 1000 ml. Solución B: Se pesan 150 gr de tartrato de sodio y potasio y 40 gr de hidróxido de sodio y se disuelve con agua hasta un volumen total de 1000 ml. Las soluciones se tienen preparadas de forma independiente y se mezcla igual cantidad en volumen de cada una de ellas justo en el momento de realizar el ensayo. Dicha mezcla es la que se adiciona a la alícuota a evaluar. 4.8.9. Ensayo de Espuma. Reconoce en un extracto la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como triterpenica. De modo que sí la alícuota se encuentra en alcohol, se diluye con 5 veces su volumen en agua y se agita la mezcla fuertemente durante 5-10 min. El ensayo se considera positivo si aparece espuma en la superficie del líquido de más de 2 mm de altura y persistente por más de 2 min. 4.8.10. Ensayo del cloruro férrico. Prueba para recocer la presencia de compuestos fenólicos y/o taninos en un extracto vegetal. Si el extracto de la planta se realiza con alcohol, el ensayo determina tanto fenoles como taninos. A una alícuota del extracto alcohólico se le 39 adicionan 3 gotas de una solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica (cloruro de sodio al 0.9% en agua). Si el extracto es acuoso, el ensayo determina fundamentalmente taninos. A una alícuota del extracto se añade acetato de sodio para neutralizar y tres gotas de una solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica, un ensayo positivo puede dar la siguiente información general: Desarrollo de una coloración rojo-vino, compuestos fenólicos en general. Desarrollo de una coloración verde intensa, taninos del tipo pirocatecólicos. Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo pirogalotánicos. 4.8.11. Ensayo de Shinoda. Permite reconocer la presencia de flavonoides en un extracto de un vegetal. Si la alícuota del extracto se encuentra en alcohol, se diluye con 1 ml de ácido clorhídrico concentrado y una parte de cinta de magnesio metálico. Después de la reacción se espera 5 min, se añade 1 ml de alcohol amílico, se mezclan las fases y se deja reposar hasta que se separen. Si la alícuota del extracto se encuentra en agua, se procede de igual forma, a partir de la adición del ácido clorhídrico concentrado. El ensayo se considera positivo, cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmesí o rojo; intensos en todos los casos. 4.8.12. Ensayo de Gelatina. Sobre el extracto etanólico se añade solución de gelatina (1%) que contiene además NaCl, da la formación de un precipitado de taninos.24 4.8.13. Ensayo de principios amargos y astringentes. El ensayo se realiza saboreando una gota del extracto acuoso del vegetal y reconociendo el sabor de cada uno de estos principios bien diferenciados en el paladar.24 40 5. OBTENCION DE RESULTADOS 5.1. CONTROL DE CALIDAD DE LAS MATERIAS PRIMAS VEGETALES. 5.1.1. Determinación del contenidode humedad Cuadro No. 5. Resultados de la determinación de humedad en ginkgo biloba, ajenjo y manzanilla como materia prima verde. Realizado en el departamento de control de calidad del laboratorio GuillMar. Octubre de 2013 Humedad % Limites (%) Gynkgo biloba 2.50 Máx. 10 Ajenjo 9.60 8-14 Manzanilla 7.46 7-14 En este cuadro se muestran los porcentajes de humedad de cada materia prima verde, valores que se encuentran dentro de las especificaciones dadas por las Normas Oficiales OMS (1998), para evitar el crecimiento bacteriano y que se pueda dar paso al uso requerido. 5.1.2. Determinación de cenizas totales Cuadro No. 6. Resultados de la determinación de cenizas totales de ginkgo biloba, ajenjo y manzanilla, como materia prima verde. Realizado en el departamento de control de calidad del laboratorio GuillMar. Octubre de 2013 Cenizas totales % Limites (%) Gynkgo biloba 0.85 Máx. 15 Ajenjo 6.55 Máx. 14 Manzanilla 8.66 Máx. 12 El porcentaje de cenizas totales de las especies vegetales es un indicativo del contenido total de minerales en la muestra, por lo que al observar los resultados vemos que los valores se encuentran dentro de las especificaciones dadas por las Normas Oficiales OMS (1998) y USP (2001). 5.1.3. Determinación de cenizas solubles en agua. 41 Cuadro No. 7. Resultados de la determinación de cenizas solubles en agua de ginkgo biloba, ajenjo y manzanilla, como materia prima verde. Realizado en el departamento de control de calidad del laboratorio GuillMar. Octubre de 2013 Cenizas solubles en agua % Limites (%) Gynkgo biloba 0.10 Máx. 8 Ajenjo 4.37 Máx. 7 Manzanilla 3.55 Máx. 7 El porcentaje de cenizas solubles en agua de las especies vegetales se encuentran dentro de los límites establecidos dados por las Normas Oficiales OMS (1998) y USP (2001), por lo que podemos decir que corresponden al material de tipo orgánico. 5.1.4. Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico. Cuadro No. 8. Resultados de la determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico de ginkgo biloba, ajenjo y manzanilla, como materia prima verde. Realizado en el departamento de control de calidad del laboratorio GuillMar. Octubre de 2013 Cenizas insolubles en HCl % Límites (%) Gynkgo biloba 1.90 Inferior a: 3.5 Ajenjo 3.07 Máx.: 6 Manzanilla 1.56 Máx.: 5 Los valores de esta determinación en las especies vegetales analizadas se encuentran dentro de las especificaciones dadas por las Normas Oficiales OMS (1998) y USP (2001). Indicándonos por tal razón que no existe la presencia de arena o tierra en ninguna de ellas. 5.1.5. Determinación de metales pesados (Plomo). La determinación de plomo dio negativa mediante la técnica colorimétrica. Esta prueba se determinó para descartar la presencia de este metal tóxico, lo cual indica contaminación por gasolina con plomo que es usual para cultivos ubicados en zonas acercadas a la urbanidad o a la circulación vehicular. 5.1.6. Análisis Microbiológico. Cuadro No. 9. Resultados de la determinación de aerobios, mesófilos totales, coliformes totales, coliformes fecales, salmonella, mohos y levaduras en ginkgo 42 biloba, ajenjo y manzanilla, como materia prima verde. Realizado en el departamento de control de calidad del laboratorio GuillMar. Octubre-Noviembre de 2013. (Límites establecidos por la OMS. (WHO. 1988) Microorganismos Ginkgo biloba Ajenjo Manzanilla Límites máximos aceptados Aerobios Mesófilos totales 11 24 30 104 Coliformes totales Ausencia Ausencia Ausencia Menos de 10 a 100 Coliformes fecales Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Salmonella Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Mohos y Levaduras Ausencia Ausencia 6.0 < 100 Parámetros estudiados en este cuadro nos indican: Aerobios mesófilos totales: Parámetro total de higiene. Coliformes totales y fecales: Contaminación fecal. Salmonella: Contaminación de alto riesgo. Mohos y levaduras: Micotoxigenicidad potencial. Los valores ilustrados en el cuadro 5, nos demuestra que las plantas secas de ginkgo biloba, ajenjo y manzanilla, están aceptadas dentro de los límites establecidos para ser usadas en la elaboración de fitofármacos, según lo que se indica para un adecuado proceso de post-cocecha. 5.2. DETERMINACIÓN DE LOS PARAMETROS DE CALIDAD DE LA TINTURA MADRE (T.M.). 5.2.1. Descripción Organoléptica. Cuadro No. 10. Resultados de la descripción organoléptica de las tinturas madre de Gynkgo biloba, Ajenjo y Manzanilla. Realizado en el departamento de control de calidad del laboratorio GuillMar. Noviembre de 2013 Descripción Organoléptica Ginkgo biloba Ajenjo Manzanilla Color Verde marrón Verde obscuro Verde Olor Escaso, ligeramente amargo Herbal amargo Floral dulzón 43 Turbidez No No No Aspecto Líq. Verde Seco Líq. Verde Obscuro Líq. Verde Amarillento Se debe indicar que los parámetros organolépticos de calidad de las tinturas madre no tienen estándares de referencia con los cuales se les puede comparar, ya que estas tienen sus propios valores y características dependiendo de cada especie analizada, de las partes de la planta. 5.2.2. Parámetros físicos. Cuadro No. 11. Resultados de la determinación de parámetros de calidad de las tinturas madre de Gynkgo biloba, Ajenjo y Manzanilla. Realizado en el departamento de control de calidad del laboratorio GuillMar. Noviembre de 2013 Determinaciones Gynkgo biloba (T.M.) Ajenjo (T.M.) Manzanilla (T.M.) pH 5.03 5.93 5.833 Índice de Refracción 1.3700 1.5297 1.3635 Densidad Relativa 0.983 0.967 0.833 Contenido Etanolico 24.65 24.03 25.09 Sólidos Totales: (Límite mín. 6%) 15% Máx. 7.048 8.039 6.755 En el cuadro n° 7 se observa los valores que arrojarón el estudio de las tinturas madre de ginkgo biloba, ajenjo y manzanilla, donde estos valores están acorde a las especificaciones de la metodología de la OMS, pero cabe recordar que son valores para tinturas madre en general y no específicos para cada planta, el contenido etanolico esta en relación a la densidad, valor que se determino según bibliografía 22. La determinación de sólidos totales tiene como límite Mín. 6%, en nuestro caso tuvimos que todas las (T.M.) están dentro del valor establecido, por lo tanto son aceptables. 5.2.3. Determinación de flavonoides por cromatografía de capa fina. Se utilizó dos tipos de solventes para la fase móvil, y la cromatografía se realizó en placas de sílica gel y además de óxido de aluminio por separado. Sistema solvente Cloroformo-acetona-ácido fórmico (75:16.5:8.5). Con este solvente se pudo diferenciar los componentes de la muestra analizada, gracias a que permite una mejor separación y que se puede apreciar mediante la aparición 44 de manchas más claras para el cálculo del Rf para la identificación de los compuestos. El revelador empleado fue ácido sulfúrico-vainillina. Cuadro n° 8 Determinación de Rf de las quercetinas en tinturas madre de Gynkgo biloba, Ajenjo y Manzanilla. Realizado en el departamento de control de calidad del laboratorio GuillMar. Diciembre de 2013. Cuadro No. 12. Determinación de Rf de las tinturas madre de Gynkgo biloba, Ajenjo y Manzanilla. Realizado en el departamento de control de calidad del laboratorio GuillMar. Diciembre de 2013. Cálculos Rf Compuesto identificado Color Estándar A Rf = 6.7/7.2 = 0.94 Quercetina Amarilo verdoso Muestra de Gynkgo biloba B Rf = 7.0/7.2 =0.97 Quercetina Verde marrón Muestra de Ajenjo C Rf = 7.1/7:2 = 0.98 Quercetina Verde seco Muestra de Manzanilla D Rf = 6.8/7:2 = 0.93 Quercetina Amarillo vedoso Los resultados expresados en el cuadro n°
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