Patrones-de-pluripotencia-inducida-por-reprogramacion-celular-utilizando-un-sistema-auto-inducible

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
 
 
Patrones de Pluripotencia Inducida por Reprogramación 
Celular Utilizando un Sistema Auto-Inducible 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
Maestro en Ciencias 
 
PRESENTA: 
 
José Ángel Martínez Sarmiento 
 
 
 
TUTOR PRINCIPAL 
 
Luis Fernando Covarrubias Robles 
Instituto de Biotecnología, UNAM 
 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR 
 
Viviana Valadez Graham 
Tomás David López Díaz 
Instituto de Biotecnología, UNAM 
 
 
 
Cuernavaca, Morelos. Agosto, 2016 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
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objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
Jurado de Tesis 
Presidente Dra. Martha Verónica Vázquez Laslop (IBt, UNAM) 
Secretario Dr. Enrique Alejandro Reynaud Garza (IBt, UNAM) 
Vocal Dr. Christopher Wood (IBt, UNAM) 
Vocal Dra. Mónica Lamas Gregori (CINVESTAV sede Sur) 
Vocal Dr. Néstor Fabián Díaz Martínez (INPer) 
 
Lugar de Trabajo 
Este trabajo se realizó en el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional 
Autónoma de México (IBt-UNAM), en el Departamento de Genética del Desarrollo 
y Fisiología Molecular, en el Laboratorio de Degeneración y Regeneración Tisular 
a cargo del Dr. Luis Fernando Covarrubias Robles. 
 
Financiamiento y Apoyos 
Durante los estudios de maestría se contó con beca del Consejo Nacional de 
Ciencia y Tecnología (CONACyT) número 594821 para estudios de posgrado. Se 
contó además con apoyo del proyecto “Las células troncales y la reprogramación 
genómica en el contexto de la diferenciación dopaminérgica y la enfermedad de 
Parkinson” apoyado por el CONACyT (clave CB2009-131031-Q). 
 
Con parte de estos recursos se asistió a los congresos: 
 
XIII Congreso Nacional de Biología del Desarrollo. Lagos de Moreno, Jalisco, 
México. 8 – 12 de Marzo de 2016. Presentación del poster: “Generación de 
Fenotipos de Reprogramación Alternativos Utilizando un Vector Autoinducible”. 
 
Tercer Congreso de Células Troncales y Medicina Regenerativa. Facultad de 
Medicina, UNAM. 4 – 6 de Noviembre de 2016. Presentación de poster: 
“Construcción de un Vector Policistrónico autoinducible para generar 
Reprogramación Celular”. 
 
DEDICATORIAS 
 
A Dios y a mis padres 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A Luis por aceptarme en su laboratorio, por enseñarme, corregirme, apoyarme, 
por transmitirme su entusiasmo por la ciencia y sobre todo por su paciencia… 
 
A los miembros del laboratorio con quienes me tocó convivir durante estos años y 
de los cuales recibí siempre su ayuda y consejos: Dulce, Conchita, Alberto, Sergio, 
Celina, Vero, Gladys, Karen Mojica, Karen Ivette, Anabel, Álvaro, Omar, Francisco, 
Raúl, Gilda, David, Daniel, etc. Fueron una agradable compañía. 
 
A los miembros de mi comité tutoral, la Dra. Viviana Valadez y el Dr. Tomás López 
por su tiempo y aportaciones a este proyecto. Al jurado de tesis por todos sus 
comentarios y correcciones a este trabajo, los Dres. Martha Vázquez, Enrique 
Reynaud, Christopher Wood, Mónica Lamas y Nestor Díaz. 
 
A mis compañeritos y amigos de la maestría en especial a Laura, Alma, Osvaldo y 
Wendy, los extrañaré. 
 
A mis padres, mis tíos y mis hermanos, que siempre estuvieron al pendiente de mí 
y por todo su apoyo. 
 
Al CONACyT por el apoyo económico. 
 
ÍNDICE GENERAL 
 
RESUMEN .......................................................................................................................................................... 1 
1-INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................................. 2 
1.1-PLURIPOTENCIA Y DIFERENCIACIÓN CELULAR ................................................................................................. 2 
1.2-ESTADOS DE PLURIPOTENCIA .......................................................................................................................... 4 
1.3-CONTROL DEL ESTADO PLURIPOTENTE EN CÉLULAS TRONCALES EMBRIÓNICAS .............................................. 7 
1.4-REPROGRAMACIÓN CELULAR ........................................................................................................................ 10 
1.5-CARACTERIZACIÓN DEL PROCESO DE REPROGRAMACIÓN CELULAR ............................................................. 12 
1.6-SISTEMA DEL TRANSPOSÓN PIGGYBAC EN REPROGRAMACIÓN CELULAR ..................................................... 15 
1.7-MECANISMOS Y MODELOS DEL PROCESO DE REPROGRAMACIÓN CELULAR ................................................. 17 
1.8-ESTADOS ALTERNATIVOS DE PLURIPOTENCIA ................................................................................................ 22 
1.9-TRANSDIFERENCIACIÓN CELULAR ................................................................................................................. 24 
1.10-REPROGRAMACIÓN HACIA CÉLULAS PRECURSORAS NEURALES................................................................. 26 
2-JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................................................... 29 
3-HIPÓTESIS ................................................................................................................................................... 30 
4-OBJETIVOS .................................................................................................................................................. 31 
4.1- OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................................................... 31 
4.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................................................. 31 
5-MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................................ 32 
5.1-REACTIVOS .................................................................................................................................................... 32 
5.2-MÉTODOS DE RUTINA .................................................................................................................................... 35 
5.3-PROTOCOLOS PRINCIPALES .......................................................................................................................... 39 
5.3.1-Generación de líneas mESCs-w9.5 – conteniendo los Reprogramadores .......................... 39 
5.3.2-Cultivo de células troncales embriónicas murinas (mESCs). ................................................ 41 
5.3.3-Electroporación de Fibroblastos Murinos Embrionarios (MEFs) .......................................... 42 
5.3.4-Lipofección de células en monocapa (fibroblastos) ................................................................ 43 
5.3.5-Protocolo general de Reprogramación ...................................................................................... 44 
5.3.6-Tinción para Actividad de Fosfatasa Alcalina .......................................................................... 45 
5.3.7-Extracción de RNA ......................................................................................................................... 45 
5.4-EXPERIMENTOS ESPECÍFICOS: .......................................................................................................................46 
5.4.1-Construcción de Vectores ............................................................................................................ 46 
5.4.2-Protocolos de Reprogramación................................................................................................... 47 
5.4.3-Análisis funcional en líneas iPSCs CD1 ..................................................................................... 49 
5.4.4-Análisis funcional en líneas de mESCs w9.5 ............................................................................ 50 
5.4.5-Cultivo de líneas celulares para extracción de RNA ................................................................ 51 
6-RESULTADOS .............................................................................................................................................. 52 
6.1-SISTEMA AUTOINDUCIBLE PARA LA REPROGRAMACIÓN CELULAR ................................................................ 52 
 
6.1.1-Construcción y características de los sistemas autoinducibles MKOS- auto y MKOS-
orange. ....................................................................................................................................................... 52 
6.1.2- Determinación de la respuesta a la inducción del sistema MKOS-auto por RT-qPCR. ... 55 
6.2-INDUCCIÓN DE LA REPROGRAMACIÓN ............................................................................................................ 57 
6.2.1-Colonias en proceso de reprogramación hacia iPSCs utilizando los sistemas MKOS-
auto y MKOS-orange. .............................................................................................................................. 57 
6.2.2-Morfología de las colonias en reprogramación en MEFs-CD1 y 129. ................................... 62 
6.3-CÉLULAS TIPO-IPS CD1 DEPENDIENTES DE DOXICICLINA ............................................................................. 64 
6.3.1-Estado de dependencia a doxiciclina durante la reprogramación de MEFs-CD1. ............. 64 
6.3.2-Líneas tipo-iPSCs/CD1 dependientes de los transgenes MKOS obtenidas a partir de 
experimentos de reprogramación. ........................................................................................................ 66 
6.3.3-Determinación de los niveles de expresión de Oct4 total y Nanog en líneas tipo-
iPSC/CD1 dependientes de doxiciclina................................................................................................ 68 
6.4-GENERACIÓN DE IPSCS INDEPENDIENTES DE DOXICICLINA ........................................................................... 70 
6.4.1-Obtención de iPSCs independientes de doxiciclina a partir de MEFs-129 con los 
sistemas MKOS-auto y MKOS-orange. ................................................................................................ 70 
6.5-EXPRESIÓN DE LOS TRANSGENES MKOS EN MESCS.................................................................................... 73 
6.5.1-Efecto nocivo de la sobreexpresión de MKOS en mESCs w9.5. ........................................... 73 
6.5.2-Efecto de la inducción constante de los transgenes MKOS en la línea C11-auto. ............ 76 
7-DISCUSIÓN ................................................................................................................................................... 79 
7.1-REPROGRAMACIÓN CELULAR CON UN SISTEMA AUTOINDUCIBLE ................................................................... 79 
7.2-CÉLULAS TIPO IPS CD1 DEPENDIENTES DE LA EXPRESIÓN DE LOS TRANSGENES MKOS ............................ 83 
7.3-INDUCCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE MKOS EN CÉLULAS TRONCALES EMBRIÓNICAS ....................................... 87 
8-CONCLUSIONES.......................................................................................................................................... 91 
9-PERSPECTIVAS ........................................................................................................................................... 92 
10-ANEXOS ..................................................................................................................................................... 93 
Anexo 1. Vectores adicionales utilizados. ......................................................................................... 93 
11-BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................................... 100 
 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
Figura 1. Vías de Señalización Extrínsecas que Afectan el Estado de Pluripotencia “Naive” ...... 9 
Figura 2. Cinética de Reprogramación y Mecanismo de Activación y Represión de Genes por 
los factores OSK ................................................................................................................................... 20 
Figura 3. Modelo sobre las Fases del Proceso de Reprogramación. ............................................. 22 
 
Figura 4. Sistema MKOS-auto y MKOS-orange ................................................................................. 55 
Figura 5. Análisis de la expresión del vector MKOS-auto por RT-qPCR. A Expresión de Oct4 
total de la línea F1-auto. ....................................................................................................................... 57 
Figura 6. Inducción de la Reprogramación hacia iPSCs. ................................................................. 60 
Figura 7. Cinética de surgimiento de colonias tipo mESC a partir de MEFs-129 y CD1 en la 
reprogramación. ................................................................................................................................... 61 
Figura 8. Colonias primarias en reprogramación a partir de MEFs-129 y CD1… .......................... 64 
Figura 9. Dependencia de doxiciclina de líneas tipo-iPSC/CD1. ..................................................... 66 
Figura 10. Evaluación de la dependencia de la expresión de los transgenes MKOS en líneas 
tipo-iPSC/CD1 ....................................................................................................................................... 67 
Figura 11. Expresión de Oct4 y Nanog en líneas tipo-iPSC/CD1 dependientes de doxiciclina. A
 ................................................................................................................................................................ 69 
Figura 12. Generación de iPSCs independientes de doxiciclina a partir de MEFs-129.. .............. 73 
Figura 13. Efecto de la inducción de los transgenes MKOS en líneas de mESCs w9.5 MKOS-
auto y ng/ml y 1.5 µg/ml de doxiciclina .............................................................................................. 75 
Figura 14. Comparación de las líneas C11-auto y F3-orange frente a la inducción con 
doxiciclina. ............................................................................................................................................ 76 
Figura 15. Inducción constante en la línea C11-auto no genera un estado de dependencia a los 
transgenes MKOS pero sí uno resistente a la inducción. ................................................................ 78 
Anexo 1. Vectores adicionales utilizados. ......................................................................................... 93 
 
 
 
 
ÍNDICE DE TABLAS 
 
Tabla 1. Lista de Primers Utilizados (Secuencias 5'  3') ............................................................... 94 
Tabla 2. Datos del RT-qPCR vs Oct4 total para las líneas iPSCs CD1 doxiciclina dependientes 95 
Tabla 3. Datos del RT-qPCR vs Nanog para las líneas iPSCs CD1 doxiciclina dependientes ..... 96 
Tabla 4. Datos del RT-qPCR vs Oct4 total para las líneas w9.5....................................................... 97 
Tabla 5. Datos del RT-qPCR vs Oct4 total para las línea w9.5 MKOS auto C11 a distintos 
tiempos y dosis de inducción. ............................................................................................................98 
Tabla 6. Datos del RT-qPCR vs Oct4 total para MEFs CD1 a distintas dosis de inducción. ........ 99 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
2i 2 inhibidores 
5-AZA 5-Azacitidina, “5-Azacytidine” 
AP Fosfatasa Alcalina, “Alkaline Phosphatase” 
BMP4 Proteína Morfogenética 4, “Bone Morphogenetic Protein 4” 
CAG “enhancer” temprano de CMV/ β actina de pollo, “CMV early 
 enhancer/chicken β actin” 
c-Myc “V-Myc Avian Myelocytomatosis Viral Oncogene Homolog” 
DMEM Medio Eagle Modificado de Dulbecco, “Dulbecco’s Modified Eagle 
 Medium” 
DNA Ácido Desoxirribonucleico, “Deoxyribonucleic Acid” 
DNMT metiltransferasa de DNA, “DNA Methyltransferase” 
Dox Doxiciclina, “Doxycycline” 
EDTA Ácido Etilendiaminotetraacético, “Ethylenediaminetetraacetic Acid” 
EpiSC Célula Troncal Epiblástica, “Epiblast Stem Cell” 
ERK Cinasa Regulada por Señal Extracelular, “Extracellular Signal 
 Regulated Kinase” 
ESC Célula Troncal Embriónica, “Embryonic Stem Cell” 
FGF2 Factor de Crecimiento de Fibroblasto 2, “Fibroblast Growth Factor 2” 
FIAU 1-(-2-deoxy-2-fluoro-1-b-D-arabino-furanosyl)-5-iodouracil 
GPS Glutamax, Penicilina, Estreptomicina 
GSK3 Cinasa Sintasa de Glicógeno 3, “Glycogen Synthase Kinase 3” 
H3K27ac Acetilación de la lisina 27 de la histona 3 
H3K27me3 Trimetilación en la lisina 27 de la histona 3 
H3K4me3 Trimetilación en la lisina 4 de la histona 3 
hESC Célula Troncal Embriónica humana, “human Embryonic Stem Cell” 
HSC Célula Troncal Hematopoyética, “Hematopoietic Stem Cell” 
ICM Masa Celular Interna,” Inner Cell Mass” 
iN Neuronas inducidas, “induced Neurons” 
iNPC Célula Progenitora Neuronal inducida,”induced Neural Progenitor 
 Cell” 
iPSC célula troncal pluripotente inducida, “induced Pluripotent Stem 
 Cell” 
iRSC Célula Troncal intermediamente Reprogramada, “intermediately 
 Reprogrammed Stem Cell” 
ITR Secuencia Terminal Repetida Invertida, “Inverted Terminal 
 Repeat” 
 
Klf4 Factor tipo kruppel 4, ”Kruppel-like factor 4” 
LIF Factor Inhibidor de la Leucemia, “Leukemia Inhibitory Factor” 
MAPK Proteína Cinasa Activada por Mitógeno, “Mitogen-Activated Protein 
 Kinase” 
Mbd3 proteína de unión a dominio metil-CpG 3, “Methyl-CpG binding 
 domain protein 3” 
MEF Fibroblasto Murino Embrionario, “Mouse Embryonic Fibroblast” 
mESC Célula Troncal Embriónica murina, “Mouse Embryonic stem 
 Cell” 
MKOS c-Myc, Klf4, Oct4 y Sox2 
NOD cepa murina Diabética No Obesa, “Non-Obese Diabetic mouse 
 strain” 
NSC Célula Troncal Neural, “Neural Stem Cell” 
NuRD Deacetilasa Remodeladora de Ncleosoma, “Nucleosome Remodeling 
 Deacetylase” 
Oct4 proteína de unión a Octámero 4, “Octamer-binding protein 4” 
PBS Solución Salina Amortiguadora de Fosfatos, “Phosphate Buffered 
 Saline” 
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa, “Polymerase Chain Reaction” 
PGC Célula Germinal Primordial, “Primordial Germ Cell” 
PGK Fosfoglicerato Cinasa, “Phosphoglycerate Kinase” 
RNA Ácido Ribonucleico, “Ribonucleic Acid” 
rsEpiSC Célula Troncal Epiblástica región-selectiva, “region selective Epiblast 
 Stem Cell” 
RT-qPCR Reacción en Cadena de la Polimerasa cuantitativa con Transcripción 
 Reversa, “Reverse-Transcriptase quantitative Polymerase Chain 
 Reaction” 
rtTA Transactivador reverso de tetraciclina, “tetracycline reverse 
 Transactivator” 
SCNT Transferencia Nuclear Somática, “Somatic Cell Nuclear Transfer” 
Sox2 (región Y determinante del sexo)-caja 2, “(Sex etermining region Y)- 
 bOX 2” 
STAT3 Transductor de la Señal y Activador de la Transcripción 3, “Signal 
 Transducer and Activator of Transcription 3” 
TAE Tris Acetato EDTA 
TBE Tris Borato EDTA 
TGFβ Factor de Crecimiento Transformante β, “Transforming Growth Factor 
 β” 
TRE Elemento Responsivo a Tetraciclina, “Tetracycline Responsive 
 Element” 
TSS Solución de Transformación y Almacenamiento, “Transformation and 
 Storage Solution” 
VPA Ácido Valproico, “Valproic Acid” 
 
1 
RESUMEN 
 
 
Patrones de Pluripotencia Inducida por Reprogramación 
Celular Utilizando un Sistema Auto-Inducible 
 
 
La expresión de los genes c-Myc, Klf4, Oct4 y Sox2 (MKOS) sobre células somáticas genera 
un estado de inestabilidad epigenética que conduce a la generación de células 
pluripotentes inducidas (iPSCs) e incluso otros fenotipos definidos mediante el cultivo en 
condiciones específicas. Se ha mostrado que la expresión elevada de los factores MKOS 
puede aumentar la eficiencia en la generación de iPSCs e incluso generar estados de 
pluripotencia alternativos. 
En este proyecto se construyó el sistema autoinducible de reprogramación MKOS-auto 
con el objetivo de generar niveles altos de expresión de los factores MKOS que 
potencialmente, genere estados inestables de pluripotencia. Se determinó el nivel de 
expresión alcanzado por el sistema en distintos tipos celulares. Se indujo la 
reprogramación de fibroblastos murinos embrionarios de distintas cepas a distintas dosis 
y tiempos de inducción y se realizaron análisis de dependencia a la expresión de los 
transgenes en las posibles iPSCs obtenidas. Además, se evaluó el efecto de su expresión 
en células troncales embriónicas. 
Los resultados indican que el sistema MKOS-auto es capaz de expresar niveles elevados de 
los transgenes MKOS y generar iPSCs convencionales a partir de fibroblastos de la cepa 
129 SiSv/mJ. Sin embargo, los fibroblastos de la cepa CD1 en reprogramación generan un 
estado dependiente de la expresión de los transgenes. Finalmente, la expresión en células 
troncales embriónicas ocasiona un efecto nocivo para la viabilidad de estas células. En 
conclusión los resultados indican que el sistema MKOS-auto es adecuado para producir 
iPSCs y potencialmente puede generar estados de plasticidad celular alternos. 
 
 
2 
1-INTRODUCCIÓN 
 
1.1-Pluripotencia y Diferenciación Celular 
 
A nivel celular, el desarrollo en mamíferos es un proceso unidireccional que inicia 
con la formación del cigoto unicelular y finaliza con el establecimiento de los tipos 
celulares especializados de los adultos. Se caracteriza por la pérdida progresiva 
del potencial de diferenciación de las células. De acuerdo a su potencial 
decreciente de diferenciación, los tipos de células que surgen se clasifican como: 
totipotentes, células que pueden generar a todos los tejidos de un organismo 
incluyendo tejido extraembrionario (p. ej. el cigoto y las blastómeras en estado de 
dos células); pluripotentes, células que generan todos los tejidos de un 
organismo, a excepción de los tejidos extraembrionarios (p. ej. las llamadas 
células troncales embriónicas o ESCs); multipotentes, células que generan varios 
tipos celulares de un mismo linaje (p. ej. las células troncales neurales o NSCs, 
células troncales hematopoiéticas o HSCs, etc.); unipotentes (solo pueden 
generar un tipo celular, p. ej. las espermatogonias) y células terminalmente 
diferenciadas (Hochedlinger & Plath, 2009; Jaenisch & Young, 2008). 
 
La pluripotencia se define como la capacidad de una sola célula para dar lugar a 
células de las tres capas germinales embrionarias, que son ectodermo, 
mesodermo y endodermo y por tanto a todas las células que formarán parte del 
organismo; sin embargo no puede generar a células del trofoectodermo, las cuales 
generarán tejidos extraembrionarios, como la placenta (Martello & Smith, 2014; 
Welling & Geijsen, 2013). Hacia el día E3.5-4.5 de desarrollo en el ratón, las 
células de la masa celular interna (ICM, “Inner Cell Mass”) del epiblasto pre-
implantación son las células pluripotentes típicas del embrión (Nichols & Smith, 
2009). Cuando las células de esta etapa son explantadas en condiciones definidas 
 
3 
(Evans & Kaufman, 1981; Martin, 1981), las células resultantes son conocidas 
como células troncales embriónicas (mESCs, “mouse Embryonic Stem Cells”) y se 
caracterizan porque pueden autorrenovarse manteniendo su pluriopotencia de 
manera indefinida in vitro mediante la suplementacióncon LIF (“Leukemia 
Inhibitory Factor”) (Chambers & Tomlinson, 2009; Niwa, Burdon, Chambers, & 
Smith, 1998; Young, 2011). 
 
Además de las mESCs, hay varios tipos de células pluripotentes en vertebrados. 
Las células germinales primordiales (PGCs, “Primordial Germ Cells”) entre los días 
de desarrollo embrionario E8.5-11.5 pueden derivar in vitro, bajo condiciones 
definidas, a células tipo ES llamadas células germinales embriónicas (EGCs, 
“Embryonic Germ Cells”) (Leitch et al., 2010). Estas células se autorrenuevan 
manteniendo sus características pluripotentes, generan teratomas, y forman 
quimeras capaces de contribuir a la línea germinal (Leitch et al., 2010; Surani, 
1999). Otro tipo celular pluripotente son las células troncales epiblásticas (EpiSCs, 
“Epiblast Stem Cells”). Estas células, a diferencia de las mESC, son derivadas del 
epiblasto post-implantación mediante la explantación de estas células hacia el día 
E5.5-7.5 de embriones de ratón en presencia de FGF2 y Activina (Brons et al., 
2007; Tesar et al., 2007). Estas células son capaces de generar las tres capas 
germinales in vitro, así como teratomas, características de la pluripotencia; sin 
embargo, son altamente ineficientes para generar quimeras cuando son 
inyectadas en epiblastos pre-implantación (Brons et al., 2007; D. W. Han et al., 
2011; Tesar et al., 2007; Wu et al., 2015). La presencia de distintos tipos de 
células pluripotentes durante el desarrollo temprano del embrión, indica la 
existencia de diversos estados de pluripotencia. 
 
La remoción de las condiciones que mantienen a las mESCs en estado 
pluripotente ocasiona la desregulación de factores de transcripción que mantienen 
el estado de pluripotencia y la consecuente desestabilización de la red de 
regulación de dicho estado y, por tanto, se inicia la transición hacia la cual las 
células inician su compromiso hacia la diferenciación activando programas 
 
4 
transcripcionales específicos de linaje (MacArthur et al., 2012; Z. D. Smith, Sindhu, 
& Meissner, 2016). En este punto, la diferenciación celular se puede definir como 
la adquisición de propiedades específicas tales como cambios manifiestos en la 
bioquímica y función por parte de las células. Estos cambios manifiestos están 
precedidos por un proceso cuyo resultado es el compromiso de la célula a un 
cierto destino. En este punto, aun cuando la célula no se pueda distinguir 
fenotípicamente con respecto a su estado no comprometido, su destino es 
restringido. Este proceso puede ser dividido en dos estados. El primero es una 
fase lábil denominada especificación, que es cuando la célula es capaz de 
diferenciarse autónomamente al colocarse en un ambiente neutral con respecto al 
presente en el embrión en desarrollo; en este estado todavía es posible cambiar el 
destino natural de la célula en respuesta a modificaciones del entorno (ej. 
trasplante a un sitio ectópico). El segundo estado es la determinación; se 
caracteriza porque la célula es capaz de diferenciarse autónomamente aun 
cuando se le coloca en otra región del embrión. Lo anterior permite la 
diferenciación de acuerdo con su destino original y el compromiso es irreversible 
(Gilbert, Developmental Biology 10th edition, 2013). 
 
1.2-Estados de Pluripotencia 
 
Actualmente los distintos tipos celulares pluripotentes pueden ser clasificados en 
dos estados fundamentales distintos: raso (en inglés “naive”) y preparado (en 
inglés “primed”) (Nichols & Smith, 2009), siendo el primero un estado más 
inmaduro de pluripotencia, mientras que el segundo uno más avanzado y 
propenso a la diferenciación. Estos estados celulares son estabilizados in vitro por 
diferentes condiciones de cultivo, expresan distintos marcadores, poseen diferente 
morfología, y dependen de distintas vías de señalización. 
 
Pluripotencia rasa. Corresponde a células derivadas del epiblasto pre-
implantación; dentro de este grupo están las células troncales embriónicas 
 
5 
(mESCs) y las células germinales embriónicas (EGCs). Se caracterizan por poder 
generar teratomas y quimeras con una alta eficiencia y contribuir a la línea 
germinal (Hackett & Surani, 2014; Weinberger, Ayyash, Novershtern, & Hanna, 
2016). Expresan altos niveles de los factores de transcripción OCT4, SOX2, 
NANOG, así como de otros marcadores de pluripotencia como ESRRB, KLF2, 
KLF4, REX1, STELLA, etc.; se caracterizan, además, por la utilización del 
“enhancer” distal del gen Oct4, y las células que provienen de hembras mantienen 
los dos cromosomas X en estado activo (XaXa), pueden expandirse desde una 
célula única eficientemente y, las colonias presentan forma de domo con bordes 
refringentes y definidos. Éstas células dependen para su mantenimiento de la 
señalización por LIF/Stat3 (van Oosten, Costa, Smith, & Silva, 2012) y BMP4 
(Ying, Nichols, Chambers, & Smith, 2003) entre otros. 
 
Pluripotencia preparada. A este estado pertenecen las células del embrión pos-
implantación y corresponde a las EpiSCs. Estas células crecen en colonias que 
tienen morfología plana (Brons et al., 2007; Tesar et al., 2007), no pueden generar 
quimeras, expresan bajos niveles o ausentes de los factores de transcripción 
NANOG, KLF2, KLF4, REX1, STELLA, entre otros; además expresan varios 
marcadores de genes de especificación de linaje (Weinberger et al., 2016), utilizan 
el “enhancer” proximal de Oct4, y en líneas de hembras han silenciado un 
cromosoma X (XaXi). Estas células son deficientes en su capacidad para ser 
disociadas y dependen de las vías de señalización de FGF/ERK y Activina 
A/Smad para su mantenimiento. 
 
Tanto en células humanas como en la mayoría de cepas murinas, la derivación de 
células del epiblasto pre-implantación en las condiciones para generar mESCs, no 
da como resultado células en estado raso, sino que más bien se estabilizan en un 
estado de pluripotencia preparado generando células tipo EpiSCs (J. Hanna, 
Markoulaki, et al., 2009). Esto puede deberse a la presencia de factores genéticos 
desconocidos aún que impiden la estabilización del estado raso in vitro y, por lo 
tanto, adquieran la configuración de EpiSCs (pluripotencia preparada). No 
 
6 
obstante, las ESCs humanas (hESCs, “human Embryonic Stem Cells”), a pesar de 
poseer tanto la morfología, como la dependencia de factores y patrones de 
expresión génica similares a las EpiSCs (Brons et al., 2007; Tesar et al., 2007; 
Thomson et al., 1998), no corresponden del todo a células pluripotentes 
preparadas, dado que recientemente se ha demostrado que presentan ciertas 
diferencias que las hace estar más cerca al estado raso que las EpiSCs 
(Weinberger et al., 2016). 
 
La marcada diferencia entre los dos estados de pluripotencia mencionados se 
hace notar en el hecho de que las señales que estabilizan un estado antagonizan 
el otro, de tal forma que las células en estado raso no pueden crecer bajo 
condiciones que sustentan a células en estado preparado y viceversa (J. Hanna, 
Markoulaki, et al., 2009). Por ejemplo, BMP4 que estabiliza a las mESCs (Ying et 
al., 2003) junto con LIF induce la diferenciación en EpiSCs; TGFβ y FGF2 que 
mantienen a las EpiSCs, inducen diferenciación de las mESCs; además, la 
autorrenovación de las mESCs es potenciada por inhibición de la señalización de 
ERK1/2, mientras que ésta mantiene a las EpiSCs (J. H. Hanna, Saha, & 
Jaenisch, 2010). No obstante, el estado de pluripotencia que asumen las células 
puede interconvertirse entre sí; por ejemplo las mESCs pueden diferenciarse hacia 
las EpiSCs in vitro promoviendo la señalización con TGF-β/Activina, o incluso 
células derivadas del epiblasto pre-implantación pueden derivar en EpiSCs 
directamente si son cultivadas en presencia de estos mismos factores. Asímismo, 
la conversión de las EpiSCs hacia las mESCs se puede lograr mediante la 
modulación de las vías de señalización (p. ej. inhibidores de GSK3β y FGF) (J. 
Hanna, Markoulaki,et al., 2009) o mediante la sobreexpresión de genes como Klf4 
y c-Myc (G. Guo et al., 2009; Martello, Bertone, & Smith, 2013). Lo anterior 
manifiesta que el estado de autorrenovación y pluripotencia de las células tanto 
rasas como preparadas es controlado por una intrincada interacción entre 
estímulos extrínsecos (modulando vías de señalización) y la red de regulación 
genética (factores de transcripción) intrínseca. 
 
 
7 
1.3-Control del estado pluripotente en células troncales 
embriónicas 
 
La pluripotencia intrínseca de las células de la masa celular interna (”ICM”) y de 
las ESCs que de ahí derivan, se alcanza a través de la interacción de vías de 
señalización, que conducen a cambios en moléculas de RNA regulatorio, enzimas 
modificadoras de la cromatina y factores de transcripción (Jaenisch & Young, 
2008; Young, 2011). Entre estos últimos, OCT4 (también conocido como POU5F1) 
(Nichols et al., 1998), SOX2 (que funciona como heterodímero con OCT4) (Masui 
et al., 2007) y NANOG (Chambers et al., 2003; Chambers et al., 2007; Silva et al., 
2009) son de importancia central; esto se manifiesta por el hecho de que la 
eliminación de estos factores desestabiliza la red de pluripotencia y 
consecuentemente las células entran en diferenciación. Oct4, Sox2 y Nanog están 
altamente expresados en las mESCs y actúan uniéndose a sus promotores entre 
sí. Ellos mismos activan su expresión así como la de otros genes específicos de 
pluripotencia. En conjunto todo esto, mantiene una red regulatoria que controla el 
estado de autorrenovación y pluripotencia. Notoriamente, estos factores también, 
reprimen la expresión de genes específicos de linaje (Jaenisch & Young, 2008; 
Loh et al., 2006; Masui et al., 2007; Young, 2011). Otros factores de transcripción 
que participan en el mantenimiento del fenotipo pluripotente son ESRRB, REX1, 
TBX3, KLF4, KLF2, SALL4, entre otros (Zhao, Ji, Zhang, Li, & Ma, 2012). Las 
mESCs muestran marcas de metilación tanto de activación (H3K4me3) como de 
represión (H3K27me3) en genes de desarrollo; éstos dominios bivalentes 
mantienen silenciados los genes, mientras que los genes de pluripotencia se 
mantienen principalmente con marcas de metilación activas (Bernstein et al., 2006; 
Mikkelsen et al., 2008). La característica anterior es una propiedad importante de 
las mESCs que contribuye a que estas células, además de mantener su estado 
pluripotente, puedan suprimir las múltiples vías de diferenciación, conservando su 
capacidad para responder a señales de diferenciación (Z. D. Smith et al., 2016; 
Young, 2011). De esta forma se manifiesta la pluripotencia funcional, es decir, la 
capacidad para salir del estado de pluripotencia y responder a las señales de 
 
8 
diferenciación que tiene como consecuencia la generación de todos los tipos 
celulares del embrión. 
 
A diferencia de las células del epiblasto in vivo, en el cual el estado de 
pluripotencia y autorrenovación es efímero (Martello & Smith, 2014), las mESCs se 
mantienen en un estado de autorrenovación artificial indefinidamente en parte 
gracias al factor inhibidor de leucemia, LIF (Niwa et al., 1998). LIF es un miembro 
de la familia de citocinas tipo IL-6 (interleucina-6) y señaliza a través de su unión a 
LIFR y su heterodimerización con gp130, lo que conduce a la activación de la vía 
JAK/STAT, en la cual STAT3 fosforilado (el efector crítico de LIF) se transloca al 
núcleo e induce la expresión de sus genes blanco, entre ellos Klf4, Tfcp2l1 y 
Gbx2. Paralelamente se activan la vía de la MAPK, que regula negativamente la 
pluripotencia, y la vía de la PI3K, que entre sus acciones está la activación de la 
expresión de Tbx3, que junto con Klf4 activan la expresión de Sox2, Nanog y Oct4, 
y así contribuyen al establecimiento y mantenimiento de la red de pluripotencia (U. 
Graf, Casanova, & Cinelli, 2011; Posfai, Tam, & Rossant, 2014). Otro factor 
importante para el mantenimiento de las mESCs es BMP (“Bone Morphogenic 
Protein”), el cual está presente en el suero utilizado para crecer mESCs. BMP 
pertenece a la familia de TGF-β y media sus acciones a través de la fosforilación 
de proteínas SMAD 1/5/8, que al formar complejos con Smad4, translocan al 
núcleo activando factores como los Id1/2 (“inhibitor of differentiation”), evitando así 
la diferenciación de las mESCs (Posfai et al., 2014; Ying et al., 2003). 
 
Las mESCs mantenidas en condiciones convencionales de cultivo (suero/LIF), 
aunque conservan el estado de pluripotencia rasa a nivel de población, presentan 
heterogeneidad en la expresión de genes de pluripotencia (por ejemplo, Nanog y 
Rex1), muestran cierta variabilidad morfológica y distinta propensidad hacia la 
diferenciación (Chambers et al., 2007; Hayashi, Lopes, Tang, & Surani, 2008; 
Toyooka, Shimosato, Murakami, Takahashi, & Niwa, 2008). No obstante, 
condiciones químicamente definidas, mediante cultivo en ausencia de suero y 
presencia de inhibidores químicos específicos de la vía FGF/ERK (PD0325901) y 
 
9 
de GSK3 (CHIR99021), denominados como 2i (dos inhibidores) (Ying et al., 2008), 
generan una población altamente homogénea, tanto en morfología como en 
expresión, con niveles globales de hipometilación, permitiendo mantener un 
estado de pluripotencia funcionalmente superior al obtenido en condiciones 
suero/LIF. Como muestra de ello es la capacidad del cultivo en condiciones 2i de 
derivar líneas de mESCs de cepas previamente recalcitrantes para dicha 
derivación en condiciones de suero/LIF. (J. Hanna, Markoulaki, et al., 2009; 
Nichols et al., 2009; Ying et al., 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Vías de Señalización Extrínsecas que Afectan el Estado de Pluripotencia “Naive”. 
BMP4 (presente en el suero) vía SMADs activa a genes Id (“inhibitor of differentiation”), lo que mantiene el 
estado “naive”. LIF actúa en varias vías, pero principalmente actúa mediante JAK/STAT3, donde STAT3 
fosforilado activa genes como Klf4 y Tcfp2l1. La señalización vía WNT inhibe a GSK3, lo que permite la 
estabilización de β-catenina que en consecuencia reprime inhibición de varios genes de pluripotencia como 
Esrrb. CHIRON (CHIR99021) imita la señalización de WNT al inhibir a GSK3. FGF4 activa la vía MAPK, ERK 
fosforilado promueve la transición hacia el estado “primed”, lo que es bloqueado por PD03 (PD0325901). 
Las flechas indican activación, las barras indican represión o bloqueo. Las líneas sólidas indican que actúan 
directamente sobre un blanco o éste se conoce; las líneas punteadas indican una interacción indirecta o 
inferida. Adaptado de Hackett & Surani, 2014. 
 
La secreción autócrina de FGF4 por parte de las mESCs activa vía MEK/ERK, la 
cual predispone a las células a señales inductivas que dirigen su compromiso 
hacia linajes específicos (Kunath et al., 2007). La señalización a través de WNT en 
las mESCs estabiliza a la β-catenina (siendo su principal regulador negativo 
 
10 
GSK3) la cual interacciona tanto con OCT4, potenciando su actividad, como con 
TCF3, evitando su acción represora sobre OCT4/SOX2 (Kelly et al., 2011). En 
conjunto, el medio 2i protege a las mESCs de estímulos inductores de 
diferenciación (vía FGF4/MEK/ERK1/2) y coadyuva a mantener su pluripotencia 
(estabilización de β-catenina). En base al estado adquirido en el cultivo 2i/(+/-LIF) 
se definió el término estado basal (“ground state”) de pluripotencia como un 
estado raso optimizado comparable molecularmente al presente en el epiblasto 
pre-implantación in vivo, a diferencia del estado raso generado en cultivo 
suero/LIF (Hackett & Surani, 2014) (Figura 1). El entendimiento de los 
mecanismos y factores que gobiernan el estado pluripotente en las células 
troncales embriónicas, fue crítico para poder generar estrategias que permitiesen 
obtener células pluripotentes mediante reprogramación de células diferenciadas 
hacia un estado tipo ESC. 
 
1.4-Reprogramación Celular 
 
Existendiferentes métodos por los cuales se puede inducir experimentalmente 
que células somáticas terminalmente diferenciadas adquieran un estado 
pluripotente (Jaenisch & Young, 2008; Yamanaka & Blau, 2010). Entre éstos 
métodos están: (1) La transferencia nuclear somática (SCNT, “Somatic Cell 
Nuclear Transfer”), también conocida como clonación, que involucra introducir el 
núcleo de una célula somática en el citoplasma de un ovocito enucleado (Gurdon, 
1962; Wilmut, Schnieke, McWhir, Kind, & Campbell, 1997) conduciendo a la 
generación de un organismo genéticamente idéntico al de la célula somática 
original; esto demuestra que todos los genes necesarios para crear un organismo 
están presentes en el núcleo de una célula especializada, los cuales son activados 
frente a la exposición de factores presentes en el citoplasma del ovocito. (2) La 
fusión celular entre una célula somática y una pluripotente (ESC) (Silva, 
Chambers, Pollard, & Smith, 2006; Tada, Takahama, Abe, Nakatsuji, & Tada, 
2001); estos experimentos demostraron que el fenotipo de una célula pluripotente 
puede ser dominante frente al de una célula somática, y activar genes 
 
11 
previamente silentes. (3) La reprogramación celular mediada por factores de 
transcripción que implica la generación de células troncales pluripotentes a partir 
de células somáticas adultas a las cuales se les reprograma el genoma hacia un 
estado tipo embriónico in vitro mediante la introducción y expresión forzada de 
ciertos genes considerados cruciales para el mantenimiento de la 
pluripotencialidad de las ESCs (Hochedlinger & Plath, 2009; Walia, Satija, Tripathi, 
& Gangenahalli, 2012; Young, 2011); los factores más comúnmente introducidos 
son Oct4 (POU5F1), Sox2 (SRY-box2), Klf4 (Krüppel-like factor 4) y c-Myc 
(OSKM, factores de Yamanaka) (Takahashi & Yamanaka, 2006). La importancia 
biológica de estas estrategias experimentales radica en el hecho de que 
demuestran que la identidad de una célula terminalmente diferenciada no es fija e 
irreversible, sino más bien es plástica pues la expresión de diversos genes del 
genoma de estas células puede ser revertida hacia un estado pluripotente. 
 
La conversión de células somáticas hacia un estado pluripotente mediante 
reprogramación celular se basó en el hecho de que la sobreexpresión de factores 
de transcripción individuales en células relacionadas cercanamente podía inducir 
cambios a destinos celulares estables. Entonces, se hicieron intentos para 
reprogramar tipos celulares más allá de los límites del linaje de las células de 
origen y de su estado diferenciado. Estos intentos incluyeron la posibilidad de 
inducir pluripotencia en células diferenciadas, conduciendo finalmente a la 
obtención de las llamadas iPSCs (“induced Pluripotent Stem Cells”) (Takahashi & 
Yamanaka, 2006). Dichas células son aparentemente equivalentes a las ESCs en 
cuanto a su potencial de desarrollo y expresión génica (Okita, Ichisaka, & 
Yamanaka, 2007; Wernig et al., 2007). El descubrimiento de dicho proceso tiene 
grandes repercusiones en el campo de la medicina y presenta ventajas sobre los 
procesos de SCNT y fusión celular en cuanto a su facilidad de realización y en 
cuanto al mantenimiento del número normal de cromosomas de las células que se 
obtienen. Generar células pluripotentes de manera personalizada evita el rechazo 
inmunológico, lo que las hace más viables para terapias de medicina regenerativa; 
por ejemplo, la derivación de iPSCs del mismo paciente, permite la corrección de 
 
12 
la mutación causante de una enfermedad, la diferenciación posterior in vitro hacia 
el tipo celular somático afectado y el trasplante de las células sanas al paciente. 
Alternativamente se pueden utilizar estas células derivadas de iPSCs para 
investigar fármacos contra distintas enfermedades (Hirschi, Li, & Roy, 2014; 
Robinton & Daley, 2012). La importancia de elucidar mecanísticamente cómo 
sucede el proceso de reprogramación, tiene implicaciones en la posibilidad de 
generar estrategias más eficientes para obtener iPSCs clínicamente aplicables. 
Además, desde el punto de vista biológico esto nos permitirá llegar al 
entendimiento de cómo se define molecularmente la identidad celular y cómo 
ocurren los procesos que permiten a las células cambiar dicha identidad hacia 
estados celulares distintos cuando son expuestas a diferentes condiciones, es 
decir, de la plasticidad celular. 
 
1.5-Caracterización del Proceso de Reprogramación Celular 
 
El trabajo donde se reporta por primera vez la obtención de iPSCs a partir de 
fibroblastos murinos (Takahashi & Yamanaka, 2006) y posteriormente de 
fibroblastos humanos (Takahashi et al., 2007) estuvo a cargo de S. Yamanaka y 
fueron generadas en base a un marcador de selección (resistencia a neomicina) 
bajo el promotor de Fbx15, un gen expresado en células pluripotentes; sin 
embargo las colonias de iPSCs, a pesar de presentar una morfología, capacidad 
proliferativa y formación de teratomas similar a las de las células troncales 
embriónicas, fallaron en generar quimeras adultas por lo que no adquirieron un 
estado pluripotencia similar al de las ESCs (Takahashi & Yamanaka, 2006). En 
estudios posteriores se obtuvieron células iPSCs con capacidad de generar 
quimeras adultas y transmisión a la línea germinal en base a selección por la 
expresión de los promotores endógenos de Nanog (Okita et al., 2007) o de Oct4 
(Wernig et al., 2007). La expresión de estos genes es de suma importancia para 
mantener el estado pluripotente de las ESC, lo que refleja que las iPSCs obtenidas 
en base a selección de células expresando estos marcadores, presentan 
características más similares a las ESCs en cuanto a su pluripotencia. 
 
13 
Posteriormente se dio cuenta que se pueden obtener células iPSCs con 
características pluripotentes seleccionadas únicamente en base a criterios 
morfológicos (Meissner, Wernig, & Jaenisch, 2007), evitando así el uso de células 
modificadas genéticamente con marcadores de selección para pluripotencia como 
células de partida. Sin embargo, se ha reportado evidencia de que las células iPS 
mantienen cierta memoria epigenética (marcas de metilación residuales) 
provenientes del tejido somático de origen, lo que favorece su diferenciación hacia 
linajes relacionados a la célula donadora, restringiendo destinos celulares 
alternativos (K. Kim et al., 2010; Polo et al., 2010). Dicho estado de 
reprogramación incompleta, puede ser superado añadiendo agentes desmetilantes 
como 5-AZA o mediante “knock down” de metiltransferasas (como DNMT1) (K. 
Kim et al., 2010) que ayudan al borrado epigenético del estado celular anterior; 
esto también puede lograrse añadiendo suplementos como vitamina C (Esteban et 
al., 2010) o por pasaje continuo de las líneas iPSCs (Polo et al., 2010). Asimismo, 
la estabilización del fenotipo pluripotente se caracteriza por la independencia de la 
expresión de los genes reprogramadores (Golipour et al., 2012), lo cual se 
manifiesta en el silenciamiento de los transgenes (en el caso de los vectores 
retrovirales) (Hotta & Ellis, 2008; Wernig et al., 2007), la adquisición de un estado 
de hipometilación global del DNA y la reactivación del cromosoma X, 
características presentes en mESCs (Polo et al., 2012). 
 
La obtención de iPSCs además se puede lograr sustituyendo alguno(s) de los 
factores de la combinación original (MKOS) por factores de transcripción tales 
como Esrrb (Feng et al., 2009), Nanog, Lin28, Sall4 (Buganim et al., 2012) o Nr5a2 
(Heng et al., 2010). Estos factores también son importantes en el mantenimiento 
del fenotipo pluripotente (Young, 2011), por lo que su sobreexpresión en células 
somáticas (en ciertas combinaciones) es capaz de generar células tipo-ESC. Así 
mismo, también se pueden obtener iPSCs restringiendo la expresión de c-Myc, y 
manteniendo la expresión de Oct4, Sox2 y Klf4, aunque con una eficienciamás 
reducida y cinética más lenta (Nakagawa et al., 2008; Wernig, Meissner, Cassady, 
& Jaenisch, 2008). Igualmente, se ha demostrado que se pueden omitir varios 
 
14 
factores del coctel de reprogramación estándar (OSKM) para generar iPSCs 
cuando se parte de células que expresan endógenamente niveles elevados de 
alguno de estos factores, como lo es el caso de las células troncales neurales que 
expresan endógenamente Sox2 (J. B. Kim et al., 2009; Radzisheuskaya et al., 
2013). También se ha demostrado que es posible lograr reprogramación utilizando 
únicamente Oct4 y Sox2 (Huangfu et al., 2008) o solamente Oct4 a partir de 
células diferenciadas (fibroblastos), aunque con ayuda de compuestos químicos 
(Y. Li et al., 2011) o incluso, se ha prescindido totalmente de factores de 
transcripción y se ha obtenido reprogramación utilizando únicamente compuestos 
químicos, aunque con una eficiencia reducida y una cinética de alrededor del 
doble tiempo en comparación con sistemas convencionales mediado por factores 
de transcripción (Hou et al., 2013). 
 
La eficiencia de generación de iPSCs es extremadamente baja como se muestra a 
continuación y no alcanza el 1% aun utilizando distintos métodos para introducir 
los genes reprogramadores, tales como vectores virales (0.0001-0.1%) (Carey et 
al., 2009; Takahashi & Yamanaka, 2006; Wernig et al., 2007) (Sommer et al., 
2009), transposones (0.1%) (Woltjen et al., 2009), plásmidos (0.001%) (Okita, 
Nakagawa, Hyenjong, Ichisaka, & Yamanaka, 2008), etc. No obstante también hay 
que considerar que los métodos para evaluar la eficiencia de reprogramación no 
son homogéneos; algunos se estiman en base a la detección de actividad de 
fosfatasa alcalina (Aasen et al., 2008), un marcador de pluripotencia, pero no del 
todo específico. Actualmente lo más comúnmente utilizado es la expresión 
endógena de Oct4 (Polo et al., 2012) o Nanog (Okita et al., 2007). La eficiencia de 
reprogramación depende de una variedad de condiciones. Por ejemplo, los 
sistemas que permiten una alta expresión de los factores de reprogramación son 
más eficientes en la generación de iPSCs (Warren et al., 2010), en comparación 
de aquellos con una dosis subóptima de inducción (W. Zhou & Freed, 2009). Lo 
anterior podría deberse a que un bajo nivel de expresión no es suficiente para 
generar una perturbación que supere la robustez de la red transcripcional del 
estado somático inicial y por tanto, no pueda iniciar la transición hacia el nuevo 
 
15 
estado celular (iPSCs) (Adachi & Scholer, 2012). En base a esta hipótesis, un 
enfoque que permitiese obtener niveles más elevados, presentaría una mejoría 
significativa en la eficiencia de reprogramación. La eficiencia de generación y la 
calidad de las iPSCs además están influenciadas por: la combinación y la 
estequiometría de los factores de reprogramación, siendo importante una 
expresión alta de Oct4 sobre los transgenes Sox2, Klf4 y c-Myc (Carey et al., 
2011; Papapetrou et al., 2009; Tiemann et al., 2011); la producción adecuada de 
los factores de reprogramación (Chantzoura et al., 2015; S. I. Kim et al., 2015); el 
trasfondo genético de las células utilizadas (Schnabel, Abratte, Schimenti, 
Southard, & Fortier, 2012); el tipo celular de partida, es decir, desde un precursor 
multipotente (Marthaler et al., 2013) o de un tipo celular somático distinto, como 
los queratinocitos o células endoteliales en donde la eficiencia de reprogramación 
es dos órdenes de magnitud mayor que de los fibroblastos (Aasen et al., 2008; 
Panopoulos et al., 2011); y las condiciones de cultivo utilizadas, en especial, el uso 
de LIF y 2i (Esteban et al., 2010; D. W. Han et al., 2011; Hou et al., 2013; Tang et 
al., 2012). Todos estos factores y condiciones afectan de manera importante el 
estado de las iPSCs obtenidas. 
 
Muchos de los esfuerzos en este campo se han enfocado en generar estrategias 
que permitan un aumento realmente significativo en la eficiencia de obtención de 
células reprogramadas, no solo para cuestiones de aplicación clínica, sino para 
facilitar estudios que permitan un entendimiento más profundo de cómo es el 
mecanismo que subyace el proceso de conversión de un estado celular a otro. 
 
1.6-Sistema del Transposón piggyBac en Reprogramación 
Celular 
 
Los estudios para generar iPSCs se facilitaron con la implementación del sistema 
de reprogramación secundaria (Nagy, 2013), el cual consiste en la derivación 
inicial de iPSCs de células conteniendo una integración estable de los genes 
 
16 
reprogramadores cuya expresión es activada de manera inducible. Uno de los 
sistemas inducibles utilizados es el sistema Tet-On, donde el transactivador 
reverso de tetraciclina (rtTA), en respuesta a doxiciclina, activa la expresión de los 
genes asociados a un promotor dependiente del elemento de respuesta a 
tetraciclina (Bockamp et al., 2002; Lewandoski, 2001). Con las iPSC iniciales (i.e., 
primarias) se generan quimeras y de éstas, se obtienen los fibroblastos 
embrionarios “reprogramables” que ya contienen los transgenes integrados, 
evitando así la influencia de la eficiencia de transfección y permite partir de 
poblaciones más homogéneas al tener los transgenes en el mismo sitio del 
genoma. Este sistema de reprogramación secundaria, además de aumentar la 
eficiencia de reprogramación 25 a 50 veces a comparación de una reprogramación 
primaria (Nagy, 2013), permite un análisis más detallado y preciso de las fases de 
la reprogramación y la dilucidación del proceso mecanístico subyacente, debido a 
que la expresión de los transgenes puede ser activada o desactivada a voluntad 
añadiendo o quitando doxiciclina del medio de cultivo. 
 
Entre los sistemas de reprogramación secundaria destacan aquellos que utilizan el 
transposón piggyBac (Woltjen et al., 2009; Yusa, Rad, Takeda, & Bradley, 2009). 
Éste es un elemento genético móvil que se transpone eficientemente entre 
vectores y cromosomas mediante un mecanismo de “cortar y pegar”. Durante la 
transposición, la enzima transposasa reconoce secuencias repetidas terminales 
invertidas (ITRs) específicas localizadas en ambos extremos del transposón, 
moviendo el contenido desde el sitio original para integrarlo eficientemente a sitios 
cromosomales con la secuencia TTAA (Fraser, Ciszczon, Elick, & Bauser, 1996). 
Recientemente se ha generado una transposasa modificada la cual presenta una 
eficiencia de más de 10 veces en generar eventos de transposición (Yusa, Zhou, 
Li, Bradley, & Craig, 2011). La secuencia original del DNA donde se encontraba 
integrado el transposón piggyBac, queda intacta después de que éste es escindido 
por la transposasa (Walia et al., 2012). Una de las ventajas de utilizar 
transposones es que se evitan los riesgos inherentes a los vectores retrovirales y 
lentivirales frecuentemente utilizados en experimentos de reprogramación (Pera, 
 
17 
2009; Ruggieri et al., 2014). El sistema de transposón piggyBac para 
reprogramación puede contener un solo transcrito policistrónico que codifica a los 
cuatro genes reprogramadores; además, la expresión de dichos genes puede ser 
dirigida por un promotor constitutivo o uno inducible basado en el sistema rtTA-
doxiciclina (Bockamp et al., 2002; Di Matteo et al., 2012). Éste último ha resultado 
muy eficiente para la generación de células pluripotentes inducidas (Woltjen et al., 
2009). 
 
1.7-Mecanismos y Modelos del Proceso de Reprogramación 
Celular 
 
Nagy y cols. (Nagy & Nagy, 2010) han propuesto que el proceso de 
reprogramación puede ser visto de la siguiente manera. Cuando las contrapartes 
endógenas de los genes reprogramadores son activados a un nivel tal que pueden 
mantener la pluripotencia sin necesidad de factores exógenos, se define como 
“punto de compromiso”; alcanzando este punto, la célula se convertirá 
irreversiblemente en iPSC. Sin embargo, si se suprime la expresión de los factoresreprogramadores previo al punto de compromiso, la célula retornará a su estado 
diferenciado inicial, lo que define el “punto de no retorno”. El intervalo comprendido 
entre estos dos puntos, es decir, cuando la célula no transita a iPSC ni tampoco 
vuelve a ser el tipo diferenciado que era, puede ser equivalente a lo que se conoce 
como estado de reprogramación parcial. Se ha propuesto que las células en este 
estado son susceptibles a responder al entorno de tal manera que este influye de 
manera determinante en el destino estable final (J. Kim et al., 2011; Thier et al., 
2012). 
 
Utilizando principalmente sistemas de reprogramación secundaria y analizando los 
cambios transcripcionales y de la cromatina a distintos tiempos después de la 
inducción de los factores fue posible definir tres fases distintas del proceso de 
reprogramación: Iniciación, Maduración y Estabilización (Samavarchi-Tehrani et 
 
18 
al., 2010). Partiendo de fibroblastos murinos, la fase de Iniciación se caracteriza 
por la activación de genes responsables de proliferación, metabolismo, 
organización del citoesqueleto, así como la pérdida de la identidad somática inicial 
(Polo et al., 2012); entre los cambios que ocurren en esta fase inicial está la 
expresión temprana de marcadores como SSEA1, la tinción para actividad de 
fosfatasa alcalina (AP) (Brambrink et al., 2008) y la transición mesénquima-epitelio 
(MET). La MET es regulada por la señalización BMP-Smad e inducida por la 
expresión de los transgenes, siendo además necesaria (en fibroblastos) para la 
transición a la fase de maduración (Samavarchi-Tehrani et al., 2010). La fase de 
Maduración se caracteriza por una activación gradual de la expresión endógena 
de genes de pluripotencia como Nanog, Utf1, Sall4, Esrrb, Gdf3, Fbxo15 y Oct4 
(Golipour et al., 2012; Polo et al., 2012). En la transición de la fase de Maduración 
hacia la fase de Estabilización, existen dos poblaciones celulares en el proceso de 
reprogramación que pueden ser competentes o no competentes. Los marcadores 
que predicen la transición a la última fase son Dppa2, Lin28a y Utf1, entre otros, 
cuya expresión en la fase de Maduración se restringe únicamente a las células 
competentes que avanzarán hacia la fase de Estabilización, y que finalmente 
culminarán generando iPSCs bona fide (Buganim et al., 2012; Golipour et al., 
2012). Es importante destacar que estos estudios señalan que la expresión 
endógena de genes como Oct4 o Nanog, comúnmente utilizados para diagnosticar 
la eficiencia de reprogramación en la fase de Maduración, no es suficiente para 
diagnosticar la conversión hacia iPSCs. 
 
En base a estos experimentos es posible definir distintos modelos y mecanismos 
(Figura 2 y 3) que intentan describir el comportamiento por el cual ocurre la 
transición a un estado pluripotente durante la reprogramación (Buganim, Faddah, 
& Jaenisch, 2013; Hochedlinger & Jaenisch, 2015; Theunissen & Jaenisch, 2014): 
 
1) Determinístico: establece que todas las células en inducción transitan al estado 
pluripotencia a una latencia definida y rápida (Di Stefano et al., 2014; Rais et al., 
2013) o bien, únicamente un subtipo de células “élite” son las capaces de generar 
 
19 
iPSCs, por ejemplo aquellas con ciclos ultrarrápidos de división celular (S. Guo et 
al., 2014). No obstante, existen escasos reportes en los cuales se muestra este 
tipo de comportamiento e incluso el trabajo donde se reporta la reprogramación 
determinística mediante la eliminación del componente Mbd3 del complejo 
represor NuRD (Rais et al., 2013) es contradctorio (dos Santos et al., 2014). 
 
2) Estocástico: establece que la expresión de los genes reprogramadores 
desencadenan en la célula una serie de respuestas aleatorias de activación o 
represión de genes que en algún punto establecerá las condiciones para la 
conversión hacia iPSC, la cual además es variable entre las células en inducción y 
predominantemente toma largo tiempo (Buganim et al., 2012; J. Hanna, Saha, et 
al., 2009). No obstante el proceso puede acelerarse, por ejemplo mediante 
inhibición de la vía p53-p21 o por la sobreexpresión de Nanog (J. Hanna, Saha, et 
al., 2009; Hong et al., 2009). Este modelo explica la variación de tiempo para la 
aparición de colonias iPSCs y la baja eficiencia de reprogramación. 
 
3) Una modificación de este último modelo establece igualmente que la fase inicial 
se caracteriza por ser estocástica, sin embargo, hacia el final del proceso éste es 
jerárquico-determinística, en el que la consecución de un determinado evento 
conduce a una secuencia predecible de activación o represión de genes que 
finaliza con la conversión hacia iPSCs (Buganim et al., 2012). En fibroblastos en 
reprogramación, la activación de la expresión endógena del gen Sox2 conduce a 
una serie de eventos que finalizan con la adquisición estable del fenotipo 
pluripotente tipo ESC (Buganim et al., 2012; Golipour et al., 2012). Éste último es 
en general el modelo que mejor describe el proceso de reprogramación 
actualmente. 
 
El entendimiento mecanístico del proceso de reprogramación involucra conocer 
cómo actúan Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc, los cuales son factores de transcripción 
que reconocen secuencias específicas de DNA activando o reprimiendo la función 
 
20 
de los genes específicos a los que se unen; sin embargo poco se conoce acerca 
de cómo la expresión ectópica de MKOS lleva a la generación de iPSCs. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Cinética de Reprogramación y Mecanismo de Activación y Represión de Genes por 
los factores OSK. A Se muestra la aparición de distintos marcadores de pluripotencia durante el 
proceso de reprogramación, así como el tiempo necesario de expresión de los transgenes; la 
expresión de los genes endógenos Oct4 y Nanog aparece tardíamente en el proceso. Adaptado de 
Jaenisch & Young, 2008. B Parte superior: modelo del mecanismo de acción de los factores de 
reprogramación. Durante la transición hacia iPSCs, las células somáticas expresando los 
transgenes (círculos azul claro) deben de activar los genes endógenos de pluripotencia (círculos 
azul oscuro). Parte inferior: los genes somáticos deben ser reprimidos (p. ej. metilación de DNA e 
histonas), mientras que los genes de pluripotencia deben ser activados (p. ej. acetilación de 
histonas). O, Oct4, S, Sox2, K, Klf4, M, c-Myc, N, Nanog, X, otros factores de pluripotencia. 
Adaptado de Hochedlinger & Jaenisch, 2015. 
 
21 
Mediante un análisis global de la unión de los factores MKOS durante la 
reprogramación en fibroblastos se demostró que los patrones de unión de Klf4, 
Sox2 y Oct4 (pero no c-Myc) son muy diferentes entre las células ya 
reprogramadas (iPSCs) y las células parcialmente reprogramadas. Esto indica que 
los genes que estos factores regulan inicialmente no son aquellos a los cuales se 
unen normalmente en el estado pluripotente (Buganim et al., 2013; Sridharan et 
al., 2009). Posteriormente se sugirió que los factores Oct4, Sox2 y Klf4 permiten la 
activación de los genes esenciales para el establecimiento y mantenimiento del 
estado pluripotente actuando como factores pioneros (Soufi, Donahue, & Zaret, 
2012). Un factor pionero es un subtipo de factor de transcripción que tiene la 
capacidad de unirse a sitios de DNA con cromatina cerrada (a los cuales no se 
unen normalmente factores de transcripción) y reclutar a otros factores que 
permitan la apertura cromatínica y la activación transcripcional (Drouin, 2014; 
Iwafuchi-Doi & Zaret, 2014). 
 
 
 
Además, se ha observado que durante la reprogramación los factores MKOS 
durante la reprogramación actúan de manera distinta entre sí. Un ejemplo de lo 
anterior es Klf4, que reprime genes somáticos al inicio del proceso, mientras que 
hacia las fases tardías de la reprogramación activa genes de pluripotencia; en 
contraste, Oct4 y Sox2 activan la expresión de genesde pluripotencia (como 
Nanog) de manera progresiva, lo cual depende de la susceptibilidad de estos 
genes blanco de ser transcripcionalmente activados en base a su estructura 
cromatínica, que es inicialmente represiva (Polo et al., 2012). Es probable que la 
forma de actuar de c-Myc no sea regulando la actividad de un grupo de genes 
específicos, sino más bien como un amplificador general de la expresión. c-Myc 
actuaría universalmente en los genes con marcas asociadas a cromatina abierta 
como H3K4me3 y H3K27ac, usualmente presentes en genes activos 
transcripcionalmente (Nie et al., 2012). Esto podría explicar la función de c-Myc en 
la reprogramación pues aumentaría la expresión de los genes inducidos por Oct4, 
Sox2 y Klf4; además, esto explicaría el hecho de que a pesar de no ser necesario 
para la reprogramación celular, la ausencia de c-Myc disminuye notablemente el 
 
22 
número de iPSCs obtenidas (Nakagawa et al., 2008; Wernig, Meissner, et al., 
2008). Además, recientemente se ha implicado a c-Myc en el mantenimiento del 
estado de autorrenovación y pluripotencia en mESCs, (K. N. Smith, Singh, & 
Dalton, 2010; Varlakhanova et al., 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Modelo sobre las Fases del Proceso de Reprogramación. La inducción fibroblastos 
con MKOS inicia con una fase estocástica larga, seguida por una fase determinística corta. En la 
etapa inicial, por acción de los factores se asumen distintos destinos (apoptosis, senescencia, 
transformación, transdiferenciación o reprogramación). Las células que asumieron el proceso de 
reprogramación avanzan después a una fase intermedia con expresión estocástica de genes de 
pluripotencia. Se piensa que en esta etapa hay un evento limitante desconocido aún y que 
contribuye a la latencia de esta fase. Finalmente la activación de Sox2 endógeno inicia eventos 
determinísticos que finalizan con la estabilización del estado de pluripotencia y la generación de 
iPSCs. Adaptado de Buganim et al., 2013. 
 
 
1.8-Estados alternativos de pluripotencia 
 
Durante la reprogramación se sabe que la expresión de los genes MKOS ocasiona 
la adquisición de muchos destinos distintos entre los que se encuentra el estado 
de pluripotencia tipo ESC que está favorecido por las condiciones de cultivo 
utilizadas (Chung et al., 2014; Polo et al., 2012). En base a esto, es probable la 
obtención de un espectro de fenotipos con capacidad pluripotente. Muestra de ello 
 
23 
son los estados de reprogramación parciales que surgen durante el proceso 
normal de reprogramación, los cuales se caracterizan por un silenciamiento 
incompleto de los genes somáticos iniciales y la expresión aberrante de los genes 
de pluripotencia endógenos; no obstante, estas células pueden mantenerse 
relativamente estables y expandirse por varias generaciones al mantener la 
expresión constante de los genes reprogramadores (Mikkelsen et al., 2008; Polo et 
al., 2012; Sridharan et al., 2009). Por otra parte, la expresión de los factores 
MKOS más allá del tiempo necesario para generar iPSCs independientes de los 
transgenes, ocasiona que estas células (ya pluripotentes) no puedan estabilizarse 
en el estado de pluripotencia “naive“ convencional de las células troncales 
embriónicas (Golipour et al., 2012). 
 
Recientemente se describió un nuevo estado de pluripotencia, conocido como de 
las “células clase F” (Tonge et al., 2014), que se caracteriza por una expresión 
muy elevada de los transgenes Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc, y una cinética de 
crecimiento ultrarrápida; éstas células son dependientes de estos factores para su 
crecimiento (en especial de c-Myc). Además, a pesar de que expresan Nanog y 
forman teratomas, no son capaces de generar quimeras como las ESC o las 
iPSCs. Este nuevo estado de pluripotencia, según los autores, aunque solamente 
puede existir si se mantiene una expresión elevada y constante de los transgenes, 
es un estado estable que mantiene un perfil único de expresión génica teniendo 
marcadores como Avil, Fetub, Insm1, krtdap, NGN3, Nkx2-3, Tppp3, y morfología 
de las colonias difusa (F, “fuzzy”), entre otras características fenotípicas que las 
distinguen de las células iPSs, las ESCs, los fibroblastos o incluso de las células 
parcialmente reprogramadas. De igual manera se ha reportado la estabilización de 
un estado intermedio de reprogramación en fibroblastos humanos el cual, al igual 
que las células clase F, no ha sufrido la transición mesénquima-epitelio. Estas 
células se denominan iRSCs (“intermediately Reprogramed Stem Cells”), son 
expandibles a baja densidad y expresan Sox2 y Nanog endógenos, además de los 
transgenes MKOS; al cultivarse a mayor densidad, resumen el proceso de 
reprogramación hacia iPSCs (Teshigawara, Hirano, Nagata, Ainscough, & Tada, 
 
24 
2016). Finalmente, se ha descrito el aislamiento de un nuevo estado de 
pluripotencia al modificar las condiciones de cultivo para derivar EpiSCs (Wu et al., 
2015). Este nuevo estado es más similar al estado preparado pero difiere de éste 
último en cuanto a la expresión génica, el crecimiento, y la identidad espacial. 
Estas células se integran principalmente en la región posterior del epiblasto post-
implantación por lo que se denominan rsEpiSCs (“region-selective Epiblast Stem 
Cells”). De manera importante éstas células también pueden ser derivadas 
mediante reprogramación celular con MKOS ajustando las condiciones de cultivo 
para generar rsEpiSCs en vez de iPSCs; lo mismo sucede al generar EpiSCs 
mediante reprogramación (D. W. Han et al., 2011). 
 
Estos experimentos indican que el ambiente externo influye determinantemente en 
el destino de las células en reprogramación por lo que modulando las condiciones 
de cultivo es posible modificar su identidad hacia distintos estados celulares en 
particular. Asimismo, demuestran la posibilidad de la existencia de estados de 
pluripotencia distintos a los convencionalmente conocidos ("naive" y "primed") que 
pueden ser generados al variar las condiciones de reprogramación celular. Su 
importancia radica en el hecho de que pueden presentar características útiles en 
cuanto a su capacidad de diferenciarse más eficientemente hacia un tipo celular 
específico (Tonge et al., 2014) o menos probabilidad de ser tumorigénicas 
(Weissbein & Benvenisty, 2015). 
 
1.9-Transdiferenciación Celular 
 
Dado el hecho de que la expresión de factores de transcripción específicos en 
células terminalmente diferenciadas genera células pluripotentes, surgió el 
cuestionamiento de si ciertos factores de transcripción podían inducir la conversión 
de un estado celular somático a otro (i.e., transdiferenciación); es también llamada 
cambio de linaje o conversión de linaje o reprogramación directa (T. Graf & Enver, 
2009; Xu, Du, & Deng, 2015). La transdiferenciación inducida tiene la ventaja que 
 
25 
evita los múltiples pasos de especificación necesarios para generar un tipo celular 
específico y que generalmente requiere de protocolos de diferenciación a partir de 
células troncales embriónicas. Al igual que el proceso de reprogramación hacia 
pluripotencia, la transdiferenciación se basa en la expresión forzada de factores de 
transcripción en un tipo celular somático que definen la identidad de un estado 
celular determinado; la transdiferenciación puede llevarse a cabo por la 
sobreexpresión de un único factor de transcripción maestro, como es el caso de la 
conversión de fibroblastos hacia mioblastos (Davis, Weintraub, & Lassar, 1987; 
Weintraub et al., 1989), aunque generalmente se requiere la cooperación de varios 
factores de transcripción que controlan la identidad del estado celular al cual se 
quiere transdiferenciar. Este procedimiento ha conducido a la obtención de células 
como cardiomiocitos (Ieda et al., 2010), hepatocitos (Sekiya & Suzuki, 2011), 
neuronas (Vierbuchen et al., 2010), etc. Una de las características de latransdiferenciación es que no transita por un estado pluripotente intermedio, sino 
más bien la conversión es directa de un estado celular somático a otro (T. Graf & 
Enver, 2009), por lo cual, las células están diferenciadas terminalmente y no se 
pueden dividir. La falta de capacidad proliferativa limita número de células 
disponibles para su análisis así como su posible utilización en terapia 
regenerativa. 
 
Una de las desventajas de la conversión de linaje es que es necesario identificar 
inicialmente cuáles son los genes maestros que controlan la red genética 
regulatoria central de cada tipo somático al cual se quiere convertir. Esto puede 
ser superado utilizando otra metodología conocida como reprogramación indirecta, 
que, aunque el resultado final es similar, el mecanismo de conversión es distinto. 
En este caso, la conversión de linaje puede lograrse en todos los casos mediante 
la sobreexpresión de los genes reprogramadores (MKOS) por corto tiempo, 
seguida por una fase de mantenimiento y estabilización del nuevo tipo celular en 
un medio de cultivo específico. Esto ha permitido generar una variedad de tipos 
celulares como precursores neurales, cardiomiocitos, células pancreáticas, etc. 
(Efe et al., 2011; J. Kim et al., 2011; K. Li et al., 2014; Thier et al., 2012). La 
 
26 
reprogramación indirecta se basa en el aprovechamiento de la inestabilidad 
epigenética ocasionada por la sobreexpresión de los genes reprogramadores, lo 
cual crea un estado con plasticidad para responder a señales externas que guíen 
posiblemente la estabilización hacia un fenotipo celular en particular (J. Kim et al., 
2011; Yu, Liu, Tang, & Ding, 2014); sin embargo, no está claro cómo se genera 
este estado inestable, ni de qué manera exactamente se conduce a la adquisición 
de un nuevo fenotipo (Xu et al., 2015). 
 
Recientemente, se ha propuesto que durante la reprogramación indirecta se 
genera un estado transitorio de pluripotencia previo a la conversión hacia el 
fenotipo celular deseado. (Bar-Nur et al., 2015; Maza et al., 2015). Ya que las 
células pluripotentes generan teratomas al trasplantarse a un huésped 
inmunodeficiente, es importante demostrar la seguridad de este procedimiento. 
Una alternativa para superar el problema de la generación de células post-
mitóticas es la conversión hacia un fenotipo celular menos diferenciado, en 
concreto, hacia precursores multipotentes, como es el caso de la reprogramación 
hacia precursores neurales, los cuales además de poder generar más de un tipo 
celular, son expandibles, lo que facilita su análisis y su aplicación. 
 
1.10-Reprogramación hacia Células Precursoras Neurales 
 
La denominación “célula troncal neural” (“Neural Stem Cell”, NSC) se usa para 
describir a células que: (a) generan tejido neural; (b) tienen capacidad de auto-
renovación y; (c) pueden dar lugar a células diferentes a ellas mismas (Gage, 
2000). Los tipos celulares generados por las NSCs son neuronas, oligodendrocitos 
y astrocitos. Las NSCs aparecen primero durante el desarrollo embrionario desde 
el ectodermo neural, están altamente regionalizadas in vivo con distintas marcas 
de expresión génica y producen una extraordinaria diversidad de tipos celulares 
neuronales. Sin embargo, después de la formación del sistema nervioso central, la 
mayoría de las NSCs embrionarias mueren o son muy escasas (Q. Zhou & 
 
27 
Tripathi, 2012). Algunas sin embargo, persisten en la adultez en nichos especiales 
y se convierten en NSCs adultas como las de la zona subventricular y del 
hipocampo. 
 
En el caso de las células neurales, el primer reporte de reprogramación directa 
para este tipo fue la generación de neuronas (iNs, “induced Neurons”) a partir de 
fibroblastos murinos mediante la expresión de Ascl1, Brn2 y Myt1l (Vierbuchen et 
al., 2010); las iNs presentan diversas características fenotípicas propias de 
neuronas que por ser postmitóticas no se pueden amplificar. Posteriormente, se 
lograron obtener supuestas células troncales o progenitoras neurales inducidas 
con capacidad proliferativa y por tanto son expandibles y capaces de diferenciarse 
a múltiples linajes in vitro e in vivo. Estas células fueron denominadas iNSCs 
(“induced Neural Stem Cells”) o iNPCs (“induced Neuronal Progenitor Cells”), y se 
obtuvieron mediante reprogramación directa, por ejemplo, utilizando solo la 
expresión de Sox2 (Ring et al., 2012), Brn4, Sox2, Klf4 y c-Myc o E47 (D. W. Han 
et al., 2012), Brn2, Sox2 y FoxG1 (Lujan, Chanda, Ahlenius, Sudhof, & Wernig, 
2012), Ascl1, Ngn2, Hes1, Id1, Pax6, Brn2, Sox2, Klf4 y c-Myc (Sheng et al., 
2012), o mediante reprogramación indirecta utilizando los factores Oct4, Sox2, Klf4 
y c-Myc (Corti et al., 2012; J. Kim et al., 2011; Thier et al., 2012), o incluso 
únicamente con compuestos químicos (Y. C. Han et al., 2016). Sin embargo, éstos 
enfoques para inducr NSCs, en conjunto con los demás métodos de 
transdiferenciación hacia otros fenotipos, presentan los mismos problemas: baja 
eficiencia de generación (Lujan & Wernig, 2012) y sobre todo que las células 
obtenidas no son funcionalmente similares a sus contrapartes silvestres (Xu et al., 
2015). Por ejemplo, la mayoría de estos enfoques no han generado poblaciones 
con las características de NSC esperadas (tripotencia y autorrenovación); algunas 
solo producen neuronas y astrocitos pero no oligodendrocitos y no son 
autorrenovables (J. Kim et al., 2011). En otros casos, no se ha determinado bien si 
poseen la característica de autorrenovación (Thier et al., 2012), o las neuronas 
generadas a partir de estos precursores presentan una morfología atípica o la 
diversidad es limitada (D. W. Han et al., 2012). También existen casos en las que 
 
28 
las células generadas son dependientes de la expresión de los transgenes para 
mantener el nuevo fenotipo (Lujan et al., 2012; Sheng et al., 2012). 
 
Lo anterior indica que para lograr una conversión eficaz no es suficiente la 
presencia de los factores específicos de linaje o el crecimiento en un medio 
“neural” que favorece la diferenciación neuronal sino que requiere además de los 
factores de maduración necesarios para establecer correctamente el nuevo 
fenotipo. Recientemente se demostró que el co-cultivo de células endoteliales con 
una monocapa de células similar al microambiente del nicho vascular endógeno 
permitió la especificación correcta y la conversión de estas células hacia células 
progenitoras hematopoyéticas, las cuales se injertaron y diferenciaron hacia los 
subtipos hematopoyéticos de manera eficiente in vivo (Sandler et al., 2014). Esto 
apunta a que la presencia de un nicho endógeno puede instruir correctamente a 
las células para adquirir el fenotipo nuevo. 
 
Recientemente se determinó que el sistema nervioso en desarrollo contiene un 
fuerte ambiente neurogénico que puede inducir no solo la diferenciación neuronal 
de células troncales embriónicas con alta eficiencia sino además su especificación 
correcta. En este trabajo, el trasplante de cuerpos embrioides derivados de 
mESCs hacia explantes de mesencéfalo embrionario de ratón (E10.5) generó, 
66.32±5.08% células β-III tubulina(+) (marcador de diferenciación neuronal) y 
65.53±4.86% Lmx1a(+) (marcador de diferenciación dopaminérgica), indicando una 
robusta diferenciación hacia neuronas dopaminérgicas (Baizabal & Covarrubias, 
2009). El tejido embrionario podría proporcionar un ambiente de diferenciación 
constituido no solo por factores difusibles sino también por un medio que permita 
la interacción directa célula-célula, lo que puede representar un potente factor 
promotor de la diferenciación específica de fibroblastos en reprogramación y lograr 
así su conversión con alta eficiencia hacia células neuronales con fenotipos 
funcionalmente más similares a sus contrapartes endógenas que lo reportado 
hasta el momento. 
 
29 
2-JUSTIFICACIÓN 
 
 
La reprogramación celular