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Estudiando Biologia

10/8/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD
NACIONAL
AUTÓNOMA
DE
MÉXICO
FACULTAD
DE
ESTUDIOS
SUPERIOR
CUAUTITLÁN
“Presencia
de
los
principales
genes
relacionados
en
la
vía
de
regulación
del
estrés
oxidativo
en
Candida
glabrata
mediante
análisis
bioinformático”
T
E
S
I
S
QUE
PARA
OBTENER
EL
TÍTULO
DE:
LICENCIATURA
EN
BIOQUÍMICA
DIAGNÓSTICA
P
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S
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:
MARIA
FERNANDA
VELEZ
GONZALEZ
ASESOR
DE
TESIS:
M.
EN
C.
MARITERE
DOMINGUEZ
ROJAS
CO-‐ASESOR:
M.
EN
C.
MARÍA
EUGENIA
SEPÚLVEDA
GONZÁLEZ
CUAUTITLÁN
IZCALLI,
ESTADO
DE
MÉXICO
2014

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Tesis Digitales
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FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN
UNIDAD DE ADMINISTRACIÓN ESCOLAR
DEPARTAMENTO DE EXÁMENES PROFESIONALES
VNlVEIl:'iDAD .NAC,lonAIL
ÁVP}¡OM.A DE
;;. N. ", .• \1.
.h~')'TAü DE ESTlJOIOS
ASUNTO?V(Jm~BA TORIO MUIc,o
M. en C. JORGE ALFREDO CUÉLLAR ORDAZ
DrRECTOR DE LA FES CUAUTlTLAN
PRESENTE
ATN: M. EN A. ISMAEL MAURICIO
Jefe del Departamento ~M~Profesionales
EXAMENES\frot~uautitlán.
Con base en el Reglamento General de Exámenes, y la Dirección de la Facultad, nos permitimos comunicar a usted que revisamos el: Trabajo de Tesis
Presencia de los principales genes relacionados en la via de regulación del estrés oxidativo en Candida glabrata mediante análisis bioinformático .
Que presenta la pasante: María Femanda Vélez González
Con número de cuenta: 307289173 para obtener el Título de: licenciada en Bioquímica Diagnóstica
Considerando que dicho trabajo reúne los requisitos necesarios para ser discutido en el EXAMEN PROFESIONAL correspondiente, otorgamos nuestro VOTO APROBATORIO.
A TENT AMENTE
"POR MI RAZA HABLARA EL EspíRITU"
Cuautitlán Izcalli, Méx. a 02 de Abril d~ 2014.
PROFESORES QUE INTEGRAN EL JURADO
NOMBRE
PRESIDENTE DI'. Victor Manuel Zendcjas Buitrón ' ___ _
VOCAL
SECRETARIO
le!". SUPLENTE Dra. Dolores Molina Jasso
-'----------~_._.-._---~~,------------~----_. __ ._-'
2<10. SUPLENTE
NOTA: los sinodales suplentos están obligados a presentarse el día y hora del Examen Profesional (art. 127).
IHM/rnmgm
1
CRÉDITOS INSTITUCIONALES
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Bacteriología Intestinal del
Hospital Infantil de México Federico Gómez y forma parte del proyecto de Fondos
Federales HIM/2011/012 titulado “PROTEÓMICA DEL LUMEN VACUOLAR DE
Candida glabrata”.
2
DEDICATORIA
A mi madre:
A la mujer que con dedicación y esfuerzo me ha apoyado en todo momento, que
es mi orgullo y fortaleza para seguir adelante.
A Rafael Gaytán:
Que ha sido mi compañero en los momento más difíciles y que ha estado para mí
incondicionalmente.
3
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a todos aquellos involucrados en la elaboración de ésta tesis que me
prestaron el tiempo y la paciencia.
A la M. en C. María Eugenia Sepúlveda González por sus valiosos consejos
y asesoría.
A la M. en C. Maritere Dominguez Rojas por su apoyo moral y sus
aportaciones a éste trabajo.
A Dr. en C. Juan Xicohtencatl Cortes por brindarme confianza, creer en mí y
por su apoyo incondicional.
A M. en C. Victor Manuel Luna Pineda por sus consejos, su conocimiento y su
apoyo.

ÍNDICE
Contenido
CRÉDITOS INSTITUCIONALES
...............................................................................................
1
ÍNDICE
...............................................................................................................................................
4
ABREVIATURAS
..............................................................................................................................
6
ÍNDICE DE FIGURAS
.....................................................................................................................
7
ÍNDICE DE TABLAS
........................................................................................................................
8
RESUMEN
........................................................................................................................................
9
ABSTRACT
.....................................................................................................................................
10
INTRODUCCIÓN
...........................................................................................................................
11
1.- CANDIDA: COMO PATÓGENO HUMANO
..........................................................................
11
1.1 Microbiología del género Candida y las especies de importancia clínica
...................
11
1.1.1 Candida glabrata
..........................................................................................................
12
1.1.2 Formas clínicas
.............................................................................................................
12
1.1.3 Epidemiología y patogenia
..........................................................................................
13
1.1.4 Diagnóstico
....................................................................................................................
14
1.1.5 Factores de virulencia
..................................................................................................
16
1. 2 Comparación entre los factores de virulencia de Candida glabrata y
Saccharomyces cerevisiae
.......................................................................................................
17
ANTECEDENTES
..........................................................................................................................
20
1.- FAGOCITOSIS Y SUPERVIVENCIA DE Candida glabrata
...............................................
20
1.1 Fagocitosis y estrés oxidativo en el macrófago
..............................................................
20
1.1.1 Especies reactivas del oxígeno
..................................................................................
21
1.2 Mecanismos de evasión de la fagocitosis
........................................................................
22
1.3 Autofagia
...............................................................................................................................
24
1.3.1 Microautofagia y macroautofagia
...............................................................................
25
1.3.2
Pexofagia
....................................................................................................................
26
1.4 La vacuola
............................................................................................................................
28
1.4.1 Proteínas canónicas de vacuola
................................................................................29
2.- HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS
...............................................................................
31

JUSTIFICACIÓN
............................................................................................................................
34
OBJETIVOS
....................................................................................................................................
35
OBJETIVO GENERAL
...............................................................................................................
35
OBJETIVOS PARTICULARES
.................................................................................................
35
DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO
.......................................................................................
36
MATERIAL Y MÉTODOS
..............................................................................................................
37
1. Material biológico
...................................................................................................................
37
2. Medios de cultivo y conservación de cepas
.......................................................................
37
3. Análisis bioinformático de los genes putativos de la vía de regulación del estrés
oxidativo de interés.
...................................................................................................................
37
4. Diseño de iniciadores
............................................................................................................
39
5. Obtención de biomasa
..........................................................................................................
40
6. Extracción de DNA de levaduras
.........................................................................................
40
7. PCR para la amplificación de los genes de interés
..........................................................
42
RESULTADOS
...............................................................................................................................
43
DISCUSIÓN
....................................................................................................................................
52
CONCLUSIONES
...........................................................................................................................
58
PROSPECTIVAS
...........................................................................................................................
59
REFERENCIAS
..............................................................................................................................
60
ANEXO 1: Técnicas complementarias para la PCR
.................................................................
66
ANEXO 2: Interpretación de los resultados obtenidos en YGOB
...........................................
68
ANEXO 3: Análisis de las secuencias conservadas de los genes estudiados entre S.
cerevisiae y C. glabrata mediante blasp
.....................................................................................
69

ABREVIATURAS

PCR: reacción en cadena de la polimerasa (del inglés, Polimerase Chain
Reaction).
YPD: Dextrosa, Extracto de Levadura y Peptona (Yeast Peptone Dextrose).
ROS: especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxigen Species).
H2O2: peróxido de hidrógeno.
O2-: ión superóxido.
HO-: radical hidroxilo.
CTA1: gen codificante de la enzima catalasa peroxisomal de S. cerevisiae.
CTT1: gen codificante para catalasa citosólica de S. cerevisiae.
Cta1Cg: gen putativo que codifica para la catalasa de C. glabrata.
PAS: sito de ensamblaje del fagóforo.
MIPA: aparato de membrana micropexofágica.
Atg11Cg: gen putativo en C. glabrata que codifica para una proteína
relacionada con la autofagia.
Pex3Cg: gen putativo en C. glabrata que codifica para una proteína
presente en la membrana peroxisomal.
PrA: Aspartil proteasa vacuolar ácida de S. cerevisiae.
Pep4Cg: gen putativo que codifica una aspartil proteasa vacuolar en C.
glabrata.
Act1Cg: gen putativo que codifica para actina en C. glabrata.
NCBI: Centro Nacional de Información Biotecnológica (National Center of
Biotechnology Information).
YGOB: Buscador de genes de levaduras (Yeast Gene Order Browser).
BLAST: Herramienta de Búsqueda de Alineamientos Locales Básicos
(Basic Local Alignment Search Tool)

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. ÁRBOL FILOGENÉTICO DEL SUBFILO Saccharomycotina.
Representa las relaciones evolutivas entre Saccharomyces y Candida
basado en el análisis de máxima verosimilitud de alineaciones de 153
genes ortólogos secuenciados en 21 especies. CTG: grupo genético de
especies que comparten variaciones en el código génetico. WGD (whole-
genome duplication) grupo que comparte una duplicación de su genoma
completa. Obtenido de Roetzer A, Gabldón T & Schüller C., 2010.

Figura 2. REPRESENTACIÓN DE LA AUTOFAGIA: Representación de
las múltiples vías autofágicas específica y no específica en la vacuola
durante la privación de nutrientes. Imagen tomada de Li SC, Kane. 2009

25
Figura 3. ALINEAMIENTO DE LOS GENES DE INTERÉS EN VARIAS
LEVADURAS. Esta vista parcial de la página de resultados de la base
de datos YGOB, muestra los genes ortólogos (recuadro rojo) y la sintenia
de gen PEX3 (recuadro verde), de S. cerevisiae comparadas con otras
levaduras del subfilo Saccharomycotina, entre ellas C. glabrata, levadura
más cercana desde el punto de vista genético.

47
Figura 4. FOTOGRAFÍA QUE MUESTRA LOS AMPLIFICADOS DE LOS
GENES Cta1Cg, Pex3Cg, AtgCg11, Pep4Cg y Act1Cg La figura presenta
las bandas correspondientes a los amplicones en el siguiente orden:. 1:
marcador de talla molecular; 2: control negativo de Cta1Cg; 3: Cta1Cg; 4:
control negativo de Pex3Cg; 5: Pex3Cg; 6: control negativo de AtgCg11; 7:
AtgCg11; 8: control negativo de Pep4Cg; 9: Pep4Cg; 10 control negativo de
Act1Cg; 11: Act1Cg.

51
Figura 5. VISTAS PARCIALES DE LOS RESULTADOS EN YGOB. Las
figuras muestran el formato de resultados obtenidos en este navegador
así como la organización de los mismos.

68
Figura 6. SECUENCIAS CONSERVADAS DE LOS GENES DE
INTERÉS OBTENIDAS MEDIANTE EL ANÁLISIS CON BLASTP:
para
cada gen se presentan secuencias conservadas que demuestran
funciones similares.
69

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Especies de Candida aisladas en muestras clínicas de
recién nacidos del Instituto Nacional de Perinatología: Periodo 2002-
2006.

13
Tabla 2. Características generales de los genomas de C. glabrata y
S. cerevisiae.

18
Tabla 3. Mezcla de reacción para la amplificación por PCR.
42
Tabla 4. Condiciones de amplificación de los genes en estudio.

42
Tabla 5. Análisis bioinformático de los genes CTA, PEX3, ATG11,
PEP4 y ACT de S. cerevisiae en GenBank.

43
Tabla 6. Secuencias homólogas de los genes CTA, PEX3, ATG11,
PEP4 y ACT de S. cerevisiae encontradas en C. glabrata mediante
análisis bioinformático.

44
Tabla 7. Alineamiento en ClustalW2 de las secuencias de la levadura
molde con C. glabrata.

45
Tabla 8. Análisis tipo tblastx para comparar los genes de interés en
C. glabrata con los de S. cerevisiae.

46
Tabla 9. Alineamiento de las secuencias proteicas en blastp.
48
Tabla 10. Características obtenidas en UniProt de las proteínas
putativas de C. glabrata en la vía de regulación del estrés oxidativo.

49
Tabla 11. Características generales de los oligonucleótidos utilizado
para la amplificación por PCR de los genes de interés. 50

RESUMEN

Candidaglabrata ha surgido como un patógeno emergente en los últimos años,
colocándose entre la segunda y tercera causa más común de candidiasis
sistémica en pacientes inmunosuprimidos, después de Candida albicans. Al estar
relacionada filogenéticamente con S. cerevisiae, se ha propuesto como modelo de
estudio para encontrar genes ortólogos en C. glabrata mediante análisis
bioinformáticos. Puesto que S. cerevisiae es una levadura no patógena se sugiere
que pequeñas diferencias en el genoma pueden hacer que una levadura se vuelva
patógena.
C. glabrata, presenta alta resistencia intrínseca al estrés oxidativo, lo que le
ayuda a sobrevivir e incluso dividirse en el interior de los macrófagos, mediante
mecanismos de regulación como la pexofagia, un tipo de autofagia que le permiten
mantener la producción de proteínas esenciales a partir del reuso de moléculas
obtenidas por degradación de componentes subcelulares.
La falta de descripción de la pexofagia asociada al estrés oxidativo permite
enfocar este estudio en la localización de genes putatitvos de esta vía en C.
glabrata mediante el análisis bioinformático.
Como resultado del análisis realizado se obtuvieron las secuencias
putativas de los genes de interés así como de sus respectivas proteínas, su
posible localización y función. Los genes putativos que se encontraron en el
genoma de C. glabrata fueron: un solo gen de catalasa Cta1Cg, enzima cuya
función es catalizar la conversión de peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno
molecular. Pex3Cg, gen relacionado con la pexofagia y que juega un papel
esencial en la biogénesis y degradación de peroxisomas. Atg11Cg, que codifica
una proteína necesaria para la fusión de las vesículas autofágicas con la vacuola,
y Pep4Cg, que codifica para proteasa vacuolar canónica que junto con otras
enzimas proteolíticas son capaces de degradar cualquier componente subcelular,
además de verse involucrada en procesos relacionados con el estrés nutricional.
Además por PCR se obtuvo el amplificado de estas secuencias.
Se puede inferir que C. glabrata posee similar vía para control del estrés
oxidativo, sin embargo, se debe corroborar por un análisis de expresión y la
purificación de las proteínas involucradas.

ABSTRACT

Candida glabrata has emerged as an emerging pathogen in recent years, standing
between the second and third most common cause of systemic candidiasis in
immunosuppressed patients, after Candida albicans. C. glabrata is
phylogenetically related to S. cerevisiae, that has been proposed as a model of
study to find orthologous genes using bioinformatic analysis. S. cerevisiae is a
nonpathogenic yeast suggests that small differences in the genome may cause a
pathogenic yeast.
C. glabrata, has intrinsic high resistance to oxidative stress, which helps to
survive and even divided within macrophages through regulatory mechanisms
such as pexophagy, a type of autophagy that allow to maintain production of
essential proteins from reuse of molecules obtained by degradation of subcellular
components.
The pexophagy associated with oxidative stress has not be described, this study
could be approach to localization the putatitve genes of this pathway in C. glabrata
by bioiniformatic analysis.

As a result of sequence analysis of the putative genes of interest and their
respective proteins, their location and function can be obtained. The putative genes
were found in the genome of C. glabrata were one Cta1Cg catalase gene, an
enzyme whose function is to catalyze the conversion of hydrogen peroxide to water
and molecular oxygen. Pex3Cg, pexophagy related gene, which plays an essential
role in biogenesis and degradation of peroxisome. Atg11Cg which encodes a
protein required for fusion of autophagyc vesicles to the vacuole, and Pep4Cg,
which encode a canonical vacuolar protease along with other proteolytic enzymes
are capable of degrading any subcellular component, as well as being involved in
nutritional stress related processes. Moreover PCR amplified from these
sequences were obtained.
It can be inferred that C. glabrata has similar route for control of oxidative
stress, however, should be corroborated by analysis of expression and purification
of the proteins involved.

INTRODUCCIÓN

1.- CANDIDA: COMO PATÓGENO HUMANO

1.1 Microbiología del género Candida y las especies de importancia clínica
Los hongos pertenecientes al género Candida, son levaduras alargadas o
ligeramente redondas de 3 a 7 micras; se han aislado de vegetales, suelo, agua,
aire, alimentos y algunas de ellas forman parte de la biota normal de la piel y
mucosas de mamíferos en boca, vagina, vías respiratorias altas, tracto
gastrointestinal, etc.; sin embargo es considerada un patógeno oportunista ya que
en presencia de inmunosupresión en el hospedero se puede favorecer su invasión
y diseminación (Cabello, 2010). Se reproducen por gemación formando
blastoconidios o células hijas (Vazquez & Sobel, 2011; Castañón, 2012).
En este género se ha identificado aproximadamente 150 especies de las
cuales 9 especies son patógenas y el 90% de las infecciones se atribuyen a:
Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parasilopsis,
Candida tropicalis (Vazquez & Sobel, 2011). Sin embargo en México no se tiene
clara la epidemiología de las candidiasis.

1.1.1 Candida glabrata
A diferencia de C. albicans y otras especies no albicans asociadas a candidiosis,
C. glabrata no puede formar pseudomicelios a temperaturas mayores a 37 °C;
presenta un genoma haploide y es una levadura no dimórfica (Fidel et al., 1999;
Pfaller & Diekema, 2007).
Históricamente, C. glabrata fue clasificada en el género Torulopsis en 1894
debido a su falta de formación de pseudohifas. Sin embargo, en 1978 se
determinó que la capacidad de producir pseudohifas no era un factor suficiente
para caracterizar a los miembros del género Candida y se propuso que Torulopsis
glabrata se incluyera en el género de Candida (Fidel et al., 1999).
1.1.2 Formas clínicas
C. glabrata presenta como C. albicans tres formas de candidiasis: la cutánea o
superficial, mucocutánea e invasiva o sistémica (Cabello, 2010). El cuadro clínico
es poco característico y constituye una de las causas de fiebre de origen
desconocido. Las candidiasis superficiales son frecuentes, de fácil tratamiento y
no atentan contra la vida del paciente, en tanto que las sistémicas son de
evolución aguda o crónica y son generalmente graves. C. glabrata se ha hallado
en infecciones sistémicas intrahospitalarias y es habitualmente resistente a los
compuestos azólicos (Fidel et al., 1999; Castañón, 2012).
Se ha reportado que las localizaciones más frecuentes son los pulmones, el
esófago, los riñones, el hígado, el bazo y el intestino delgado; sin embargo las
manifestaciones clínicas dependerán de la localización de la infección; por ejemplo

se puede presentar esofagitis, neumonitis, cistitis, pielonefritis, endocarditis, entre
otras (Castañón, 2012).
1.1.3 Epidemiología y patogenia
Es un padecimiento cosmopolita, sin preferencia por edad o sexo siempre y
cuando se presenten los factores de oportunismo. La fuente de infección es el
humano mismo, mediante fómites y animales. La vía de entrada se puede dividir
en endógena y exógena; la vía endógena se produce por una respuesta inmune
inadecuada, variación de pH, disminución de flora normal, etc., mientras que la
forma exógena involucra un inóculo importante a través de sondas, catéteres o
procedimientos invasivos (Cabello, 2010).
En México no se han llevado a cabo estudios representativos de las
candidiasis, sin embargo en algunos hospitales se han hecho algunos reportes
que muestran que C. glabrata se encuentra entre los primeros cuatro lugares de
aislamientos de infecciones en sangre por este género(Kamran et al., 2004;
Haynes, 2001) (Tabla 1).
Tabla 1: Especies de Candida aisladas en muestras clínicas de recién nacidos del
Instituto Nacional de Perinatología: Periodo 2002-2006.
Especie Hemocultivo n= 13 (%)
Urocultivo
n= 16 (%)
Líquido cefalorraquídeo
n= 6 (%)
TOTAL
n= 35 (%)
C. albicans 5 (38.4) 6 (37.5) 3 (50) 14 (40)
C. parapsilosis 4 (30.7) 3 (18.7) 1 (16.6) 8 (22.8)
C. glabrata 0 2 (12.5) 0 2 (5.7)
C. guillermondii 0 0 1 (16.6) 1 (2.8)
Candida sp* 4 (30.7) 5 (31.2) 1 (16.6) 10 (28.5)
Tabla tomada de Figueroa R., et al, 2007.

Un estudio epidemiológico realizado en 1999 por Fidel y et al., en Estados
Unidos reportó que C. albicans presentaba un 50% de frecuencia, mientras que C.
tropicalis, C. parapsilosis y C. glabrata se encontraban en un 15 a un 30 %, las
demás especies incluyendo C. kefyr representaban menos de un 1% en las
candidiasis (Fidel et al., 1999).
1.1.4 Diagnóstico
La identificación de las levaduras se realiza mediante el examen directo con
hidróxido de potasio (KOH) del 10 al 15% y frotis teñidos con la técnica de Gram
en muestras como esputo, líquido cefalorraquídeo, materia fecal, sangre, piel,
orina, lavado bronquial y/o macerados de muestras de tejido (Forbes et al., 2009);
para la observación de la morfología celular sugestiva de las levaduras, con la
tinción Gram, se tiñen como estructuras Gram positivas y para C. glabrata podrán
apreciarse blastoconidios sin la presencia de pseudomicelio (Tapia, 2008).
En el agar Dextrosa Sabouraud con y sin cicloheximida, C. glabrata crece
en un promedio de 2 a 5 días a temperatura ambiente o a 37°C produciendo
colonias blandas, lisas, brillantes de color crema con un olor a levadura
característico (Castañón, 2012; Forbes et al., 2009). Existen medios cromogénicos
que permiten la identificación de las especies de Candida como el agar
BIGGY/Nickerson que en el caso C. glabrata crece como colonias marrón claro y
para C. albicans y C. krusei muestra colonias rojas amarronadas; el CROMO-
AGAR Candida® que es uno de los más usados en donde C. glabrata presenta
colonias rosa-violeta, brillantes y de borde regular, a diferencia de C. albicans que

crece como colonias verdes; C krusei como colonias rugosas de color rosa pálido
y C. tropicallis presenta colonias azules brillantes (Madhavan et al., 2011; Nayak et
al., 2012).
Se pueden realizar auxonogramas para determinar la asimilación de
carbohidratos y compuestos nitrogenados ya que C. glabrata hidroliza trehalosa
pero no maltosa; y/o zimogramas para determinar la presencia de enzimas
(Freydiere et al., 2003; Lopez et al., 2001).
También se pueden realizar pruebas inmunológicas para la detección de
antígenos mediante la prueba de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay);
principalmente en candidosis sistémica y mucocutánea (Cabello, 2010; Castañón,
2012).
Sin embargo por el tiempo que estas metodologías requieren, hace que el
diagnóstico se prolongue. Es por esto que se han propuesto técnicas basadas en
la Biología Molecular con el fin de dar un diagnóstico temprano; siendo la PCR la
técnica más conveniente para identificar las cepas de Candida (Vazquez & Sobel,
2011; Tapia, 2008; Brooks et al., 2011). Esta técnica y sus variantes como un
método para el diagnóstico ha demostrado tener gran sensibilidad; sin embargo no
se usan de rutina (Vijayakumar et al., 2012; Aittakorpi et al., 2012; Fidel et al.,
1999).
Los estudios anatomopatológicos complementan el diagnóstico ayudando a
estudiar la citología e histopatología de muestras sólidas, en donde se pueden

demostrar las levaduras; esto puede complementarse con tinciones como la
tinción hematoxilina-eosina, con ácido periódico-de Schiff, Papanicolau y tinciones
argénticas como Gomori, Grocott o Gridley; (Tapia, 2008).
1.1.5 Factores de virulencia
Para que una infección se establezca, los patógenos deben evadir la respuesta
inmunitaria del hospedero, y pueden hacerlo mediante lo que se conoce como
factores de virulencia que se expresan dependiendo del sitio y el tipo de infección,
así como la respuesta que se presente por parte del hospedero (Naglik et al.,
2003).
En C. albicans se han demostrado varios factores que contribuyen a su
adhesión a células epiteliales y endoteliales (como la producción de proteinasas y
fosfolipasa), mientras que en C. glabrata no se han encontrado los mismos
mecanismos; esto haría pensar que C. glabrata es menos virulenta sin embargo
tiene la capacidad de adherirse mediante manoproteínas, receptores de
fibronectina, laminina y proteínas de unión a fibrinógeno que se consideran
importantes medios de adherencia a las células endoteliales y / o epiteliales (Fidel
et al., 1999).
C. glabrata puede formar biopelículas lo que le confiere la capacidad de
sobrevivir en zonas como piel y mucosas que tienen escasos nutrientes y están
sometidas a estrés osmótico debido a las condiciones fisicoquímicas y a la
presencia de otros microorganismos (Fidel et al., 1999).

En cuanto a la resistencia antifúngica C. glabrata presenta una resistencia
adquirida. En estudios para evaluar la resistencia de C. albicans, C. glabrata y S.
cerevisiae a varios azoles se han demostrado al menos tres mecanismos de
resistencia: cambios en la enzima lanosterol desmetilasa dependiente de
citocromo P-450, cambios en la D5-6 esterol-desaturasa, y un mecanismo de
eflujo de fármaco-dependiente de energía (Fidel et al., 1999).
Otros factores de virulencia incluyen enzimas como la catalasa y proteasas
que le permiten tener una alta resistencia a varios tipos de estrés como el
nutricional u oxidativo (Roetzer A; Gabaldón T et al., 2011).
1. 2 Comparación entre los factores de virulencia de Candida glabrata y
Saccharomyces cerevisiae
C. glabrata de todas las especies de Candida no albicans, es la que se relaciona
más con S. cerevisiae ya que se han encontrado varias secuencias ortólogas entre
ellas; lo que sugiere que cambios genéticos pueden permitir su adaptación hacia
una levadura patógena (Castaño et al., 2006) (Tabla 2).
Aunque también se ha encontrado que C. glabrata ha perdido genes para
varias rutas metabólicas, entre ellas la ruta de asimilación de galactosa. Roetzer y
colaboradores en 2010 han reportado que las principales diferencias entre C.
glabrata y S. cerevisiae que le permiten adaptarse a la vida parasitaria en
mamíferos se deben a la expresión de genes de adhesión, su alta resistencia a
fármacos y la capacidad de adaptarse a una ambiente hostil (Roetzer A;
Gabaldón T., et al., 2011; Kaur et al., 2005).

Tabla 2: Características generales de los genomas de C. glabrata y S. cerevisiae.
CARACTERÍSTICA C. glabrata S. cerevisiae
Tamaño del genoma (Mb) 12.3 12.1
Número de cromosomas 13 16
Número de genes 5283 5516
Contenido de G + C (%) 38.8 38.3
Contenido de intrones (%) 1 5

A diferencia de S. cerevisiae, C. glabrata puede formar biopeliculas
(Roetzer et al, 2008).
S. cerevisiae presenta dos catalasas mientras que C. glabrata sólo presenta
una; sin embargo C. glabrata posee una alta resistencia intrínseca al estrés
oxidativo y S. cerevisiae no. Además Roetzer A; Gabaldón T. et al., 2011
informaron que C. glabrata puede suprimir la producción de especies reactivas de
oxígeno (ROS) producidas por fagocitos mientras que S. cerevisiae tiene poco
control sobre las ROS.
La figura 1 muestra el árbol filogenético del subfilo Saccharomycotina, y se
puede observar que de todas las especies de Candida presentadas, C. glabrata,
es la que más está relacionada con S. cerevisiae.
Se muestra el parecido a nivel genómico entre las dos especies. Obtenido de Castaño I., et al,. 2006.

Figura 1. ÁRBOL FILOGENÉTICO DEL SUBFILO Saccharomycotina.Representa las relaciones
evolutivas entre Saccharomyces y Candida basado en el análisis de máxima verosimilitud de
alineaciones de 153 genes ortólogos secuenciados en 21 especies. CTG: grupo genético de
especies que comparten variaciones en el código génetico. WGD (whole-genome duplication)
grupo que comparte una duplicación de su genoma completa. Obtenido de Roetzer A, Gabldón T
& Sculler C., 2011.

ANTECEDENTES

1.- FAGOCITOSIS Y SUPERVIVENCIA DE Candida glabrata

Ante una infección fúngica la primera línea de defensa contra los hongos
patógenos son los macrófagos y neutrófilos que los fagocitan (Cuellar et al., 2009;
Dementhon et al., 2012; Temple et al., 2005). Después de la internalización en el
fagosoma, los microorganismos patógenos se enfrentan con enzimas hidrolíticas,
un pH ácido de entre 4,5-5,0 y las sustancias reactivas de oxígeno (ROS)
liberadas al formarse el fagolisosoma. Sin embargo, C. glabrata es capaz de
sobrevivir e incluso dividirse en el interior de los macrófagos lo que demuestra que
cuentan con mecanismos de desintoxicación de ROS muy eficaces conformados
por enzimas como catalasas, superóxido dismutasas, peroxidasas, reductasas,
glutatión y ascorbato (Scandalios, 2005; Cuellar et al., 2009; Jandric & Schüller,
2007; Kaur et al., 2007).
1.1 Fagocitosis y estrés oxidativo en el macrófago
Al ser fagocitado un microorganismo, éste debe adaptarse a las condiciones del
medio que lo rodea de lo contrario morirá; para esto debe mantener en
homeostasis del medio interno. Esto lo realiza mediante una compleja modulación
del metabolismo y la expresión de genes para asegurar una respuesta adecuada.

En particular para contrarrestar el efecto de las ROS, Roetzer A; Klopf E. et
al., 2011 han propuesto que C. glabrata ha adaptado su transcripción de genes
protectores del estrés oxidativo.
1.1.1 Especies reactivas del oxígeno
Las especies reactivas del oxígeno como peróxido de hidrógeno (H2O2), el ión
superóxido (O2-) y el radical hidroxilo (HO-) son subproductos del metabolismo
aeróbico normal que causan muerte oxidativa; por tal motivo la mayoría de los
organismos aeróbicos poseen mecanismos para mantener niveles muy bajos de
estas especies mediante moléculas antioxidantes como glutatión y tiorredoxina,
incluso la tirosina se ha propuesto que tiene un papel protector contra el estrés
oxidativo. Además, varias enzimas como la superóxido dismutasa, catalasa,
peroxidasa y peróxidasa de glutatión tienen la capacidad de eliminar ROS.
Durante la fagocitosis, el macrófago produce ROS en el fagolisosoma
mediante la NADPH oxidasa que por procesos de transferencia de electrones
genera los aniones (O2-, HO-) los cuales son capaces de dañar todas las
biomoléculas de los patógenos fagocitados; por tal motivo la producción de
enzimas y moléculas antioxidantes que combatan el estrés oxidativo están
directamente relacionadas con la virulencia de Candida glabrata ya que le
permiten sobrevivir y reproducirse en el macrófago principalmente mediante la
catalasa (Cuellar et al., 2009; Jandric & Schüller, 2007; Segal, 2005; Temple et al.,
2008).

En los microorganismos, estos aniones pueden actuar como moléculas de
señalización ya que se ha observado un aumento en la transcripción de algunos
genes como el de catalasa para la protección oxidativa; además el peróxido de
hidrógeno promueve la transición morfológica de las levaduras de Candida
(Nasution et al., 2008). También se ha señalado que C. glabrata puede suprimir la
producción de ROS, sin embargo no se conoce el mecanismo exacto por el que lo
lleva a cabo (Roetzer A; Klopf E. et al., 2011).
1.2 Mecanismos de evasión de la fagocitosis
Uno de los mecanismos de sobrevivencia de Candida ante la fagocitosis es
mediante modificaciones en su fenotipo (también conocido como switching) y varía
entre las diferentes especies, por ejemplo C. lusitaniae forma cadenas que no
pueden ser fagocitadas, C. glabrata al ser fagocitada sobrevive y se duplica dentro
de los macrófagos rompiendo finalmente a la célula y C. albicans forma hifas que
deforman la membrana y la interrumpen saliendo por fagolisis. Estos mecanismos
se deben a la composición de la pared celular por ejemplo C. glabrata tiene 50%
más manosa y tres veces menos quitina que C. albicans y a medida que los
mananos están expuestos en la cara externa de la pared celular, es más probable
que sea fácilmente reconocida por los receptores de los fagocitos (receptor de
manosa, TLR4, Galactine-3) haciendo que se fagocite rápidamente (Cuellar et al.,
2009; Dementhon et al., 2012).
Se han realizado pruebas de estrés oxidativo y metabólico con el fin de
analizar los niveles de expresión de algunos de éstos genes involucrados en la

resistencia a la fagocitosis como es el caso del gen de catalasa (CTA1) (Roetzer
et al., 2010).
1.2.1 Catalasa
La catalasa es una enzima altamente conservada presente en procariontes y
eucariontes; se encarga de la conversión catalítica del peróxido de hidrógeno en
agua y oxígeno molecular que son sustancias inocuas para las células (Hartig &
Ruis, 1986). Su función radica en aumentar la velocidad de la descomposición del
peróxido de hidrógeno aproximadamente 1000 millones de veces, por lo tanto esta
enzima es indispensable para un patógeno en el ambiente altamente oxidante del
fagolisosoma (Melo et al, 2007).
La mayoría de las catalasas existen como tetrámeros de subunidades de
65KD, cada uno con un grupo prostético hierro-protoporfirina IX (hemo) en la parte
más interna de la estructura. La localización celular se determina por la presencia
o ausencia de secuencias conservadas de importación al peroxisoma o a la
mitocondria (Hartig & Ruis, 1986; Scandalios, 2005).
Saccharomyces cerevisiae tiene dos catalasas, Ctt1p codificada por CTT1 y
Cta1p codificada por CTA1. Ctt1p es citosólica y Cta1p se localiza en el
peroxisoma y la mitocondria, pues su secuencia presenta motivos internos de
exportación a estos organelos (Petrova et al., 2004). Ambas catalasas son
importantes para la defensa al estrés oxidante por H2O2 en S. cerevisiae. Sin
embargo C. glabrata sólo presenta el gen para una catalasa que es ortóloga a
CTA1 de S. cerevisiae con un 85% de similitud (Cuellar et al., 2009).

Se han hecho estudios sobre los factores de transcripción de la catalasa en
S. cerevisiae (ScYap1, ScSkn7 y ScMsn2/ScMsn4) encontrando que tienen un
papel central en la respuesta al estrés oxidativo ya que si faltan o están
disminuidos puede afectar directamente en la sobrevivencia de la levadura. Sin
embargo se ha observado en modelos murinos que C. glabrata con ausencia de la
catalasa no afecta en la sobrevivencia de la levadura, por lo que se infiere puede
restituirse el equilibrio mediante otros mecanismos antioxidantes (Roetzer, 2011;
Cuellar et al., 2009).
1.3 Autofagia
Las células para su crecimiento y desarrollo requieren de un equilibrio entre la
síntesis de proteínas y la biogénesis de orgánulos con la degradación de los
mismos. Para esta función las células tienen varios mecanismos de degradación
de proteínas y orgánulos que ya no son de utilidad permitiendo que puedan ser
reciclados. Las rutas que más se han estudiado para este recambio son la
autofagia y la degradación mediada por el proteosoma (Klionsky, 2004; Jandric &
Schüller, 2007; Cao et al., 2008).
La autofagia que se ha definido como un proceso “autodigestivo”; es un
mecanismo para el reciclaje de los componentes celulares y orgánulos que juega
un papel importante durante la ausencia de nutrientes, diferenciación celular,
envejecimiento y muerte celular. (Fainboim et al., 2011) Es un proceso altamente
regulado por el cual componentes presentes en el citosol son secuestrados y
llevados a la vacuolaque es el orgánulo encargado de degradar cualquier

componente subcelular (Suzuki et al., 2002; Klionsky, 2004; Jandric & Schüller,
2007).
1.3.1 Microautofagia y macroautofagia
La autofagia se puede dividir en microautofagia y macroautofagia. La
microautofagia consiste en el secuestro de sustancias citosólicas y orgánulos
mediante proyecciones de la membrana vacuolar que da como resultado la
formación de cuerpos micro-autofágicos. Por otro lado, en la macroautofagia hay
formación de vesículas de doble membrana que se fusionan con la membrana
vacuolar, depositando así el contenido de las vesículas en la vacuola para su
degradación (Dunn et al., 2005; Jandric & Schüller, 2007).

Figura 2. REPRESENTACIÓN DE LA AUTOFAGIA: Representación de las múltiples vías
autofágicas específica y no específica en la vacuola durante la privación de nutrientes. Imagen
tomada de Li SC, Kane

Microautofagia
del
núcleo
(PMN)

Macroautofagia
(no
específica)

Pexofagia

Peroxisoma
Microautofagia
(no
específica)
Núcleo

Vacuola

Estos procesos eliminan de manera selectiva orgánulos superfluos y
componentes celulares que no sean necesarios a fin de sostener la síntesis de
proteínas esenciales durante la privación de nutrientes (Dunn et al., 2005).

1.3.2 Pexofagia

Los peroxisomas son pequeños orgánelos subcelulares que intervienen en
funciones metabólicas anabólicas y catabólicas (Passarge, 2009). Principalmente
se encargan del metabolismo de lípidos mediante la β-oxidación de los ácidos
grasos derivados de acetil-CoA y la eliminación de peróxidos (Kraft et al., 2009).
El número y tamaño de los peroxisomas varía de acuerdo a las
necesidades fisiológicas, generalmente el número varía entre 1 y 20, es por esta
razón que su producción puede ser inducida y también su eliminación mediante un
proceso de autofagia conocido como pexofagia (Kraft et al., 2009; Bertoni, 2009;
Roetzer A, Gabldón T. et al., 2011; Till et al., 2012; Williams, 2013).
La pexofagia se define como una degradación de peroxisomas con el fin de
proporcionar aminoácidos para la síntesis de las proteínas esenciales. Se han
usado modelos experimentales para conocer el proceso de la pexofagia en
levaduras como Pichia pastoris, Hansenula polymorpha y S. cerevisiae
encontrando grandes similitudes que hablan de un proceso conservado para la
supervivencia de estas levaduras. Se ha propuesto que tras una señal de glucosa
aún desconocido, se forman extensiones de la vacuola que promueven la

formación de membranas de secuestro que reconocen e ingieren a los
peroxisomas (Dunn et al., 2005; Cao et al., 2008).
La pexofagia se divide en dos rutas la macropexfagia y la micropexofagia.
Durante la macropexofagia que se cree ocurre cuando la célula detecta niveles
bajos de ATP, se forma una doble membrana originada desde un sitio conocido
como sitio de ensamblaje de fagóforo (PAS) que forma las vesículas llamadas
autofagosomas que secuestran peroxisomas individuales; que después se
fusionan con la vacuola para su degradación (Kawamata et al., 2008; Dengjel et al.,
2012; Till et al., 2012).
Mientras que la micropexofagia ocurre cuando la célula detecta niveles altos
de ATP, en donde los peroxisomas son directamente secuestrados por una
prolongación de la membrana vacuolar mediante un complejo conocido como
aparato de membrana micropexofagica (MIPA). MIPA es una estructura transitoria
con forma de copa que aparece en la cara citosólica de la membrana del
peroxisoma que ayuda a la fusión de las membranas secuestrantes.
Una vez secuestrados los peroxisomas por cualquiera de las dos vías al
llegar a la vacuola se fusiona el pexofagosoma mediante proteínas específicas y
se degradan rápidamente los peroxisomas por las enzimas hidrolíticas obteniendo
así aminoácidos, lípidos y azúcares que son regresados al citoplasma para su
reuso (Dunn et al., 2005; Cebollero et al., 2009; Kraft et al., 2009; Till et al., 2012).
Los genes que están involucrados en la biogénesis, mantenimiento y
degradación de los peroxisomas se conocen como genes PEX y también se ha

propuesto una nomenclatura unificada para los procesos de autofagia conocidos
como genes ATG que son altamente conservados en levaduras (Dunn et al., 2005;
Suzuki et al., 2007; Cebollero et al., 2009; Motley et al., 2012; Till et al, 2012).
1.3.2.1 PEX3 y ATG11
El gen PEX3 se ha visto que en S. cerevisiae y P. pastoris codifica para una
proteína que es esencial para la formación del peroxisoma y es un receptor de
reconocimiento para la formación de PAS, ya que en mutantes carentes de este
gen no pueden inducir la pexofagia (Kraft et al., 2009; Roetzer A. et al., 2010; Till
et al., 2012). Por otro lado se ha reportado que niveles excesivos de PEX3
resultan en la formación de numerosas vesículas de membrana peroxisomal; por
lo que la regulación de los niveles de PEX3 se requieren para el control en el
número de peroxisomas (Cebollero et al., 2009).
Yorimitsu & Klionsky et al., 2005 reportó que en S. cerevisiae ATG11 recluta
proteínas necesarias para la fusión con la vacuola e interactúa con la maquinaria
principal y los receptores para la autofagia selectiva en los modelos de levaduras
antes mencionadas y también se involucra en la macro y micropexofagia.
1.4 La vacuola
La vacuola en hongos está descrita como el análogo del lisosoma en células de
mamífero ocupa aproximadamente un 25 % del total del volumen intracelular,
participa en numerosos procesos celulares como la degradación de
macromoléculas y secuestro de toxinas endógenas y exógenas, homeostasis del
pH, osmoregulación y regulación del volumen hídrico, además de permitir el

recambio de aminoácidos, ácidos carboxílicos, carbohidratos y algunas vitaminas
(Klionsky et al., 1990; Sarry et al., 2007; Li & Kane, 2009; Cebollero et al, 2009).

Es un sitio importante de recambio de proteínas, varias proteínas recién
sintetizadas, son transportadas a través de la vía secretora del retículo
endoplásmico al complejo de Golgi y después se desvían a la vacuola. Otras
proteínas como la fosfatasa alcalina entra en la vacuola por fusión de las vesículas
que llegan desde el complejo de Golgi, otras son proteínas citoplasmáticas entran
a la vacuola por la vía autofágica (Sarry et al., 2007).
1.4.1 Proteínas canónicas de vacuola
Mediante la purificación de vacuolas intactas se han hecho estudios sobre los
contenidos vacuolares mediante western blot, microarreglos, electroforesis,
actividad enzimática, etc.
Se ha encontrado que las enzimas canónicas de S. cerevisiae, más
abundantes en vacuola son la carboxipeptidasa Y (CpY), la proteinasa A (PEP4),
la proteasa vacuolar B (PRB1) y aminopeptidasas (APEI), además presenta otras
enzimas como la fosfatasa alcalina, la RNasa y la alfa-manosidasa. En general
las proteasas poseen múltiples funciones en la naturaleza que van desde la
regulación de procesos celulares sutiles mediante la activación de distintas
preproteínas hasta la degradación no específica de proteínas para el reciclaje de
biomoléculas y todas las proteasas vacuolares están implicadas en la degradación
y reutilización de péptidos, es por eso que se asocian con el proceso de autofagia
(Sarry et al., 2007).

1.4.1.1. Pr A, Pr B y Cp Y
La proteinasa A (Pr A) es una aspartil proteasa ácida codificada por el gen PEP4,
tiene un papel importante en la fisiología de la célula en condiciones de estrés ya
que se ha visto que aumenta su capacidad proteolítica durante el estrés nutricional
y ante cambios de presión y pH, además de que está involucrada en la
maduración de otras proteínas como la Pr B y la Cp Y; incluso de su propia
maduración medianteun proceso autocatalítico dependiente de pH (Kato et al.,
2006; Palmer et al., 2007; Sarry et al., 2007; Roetzer et al., 2008).
La proteinasa B (Pr B) es codificada por el gen PRB1 y al igual que PrA, es
esencial para la maduración y activación de otras proteasas vacuolares (Komeda
et al., 2002).
La carboxipeptidasa Y (Cp Y) pertenece a las serin carboxipeptidasas que
catalizan la hidrólisis de carboxilo terminal de los aminoácidos de péptidos y
proteínas, se clasifican en dos grupos: tipo C, cuando tienen afinidad por un
residuo de aminoácido hidrófobo (como CpY codificada por el gen PRC1); y tipo
D, cuando tienen alta afinidad por residuos con cargas positivas (básicos) (Satoh
et al., 2004).

2.- HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS

La bioinformática se define como la intersección entre la biotecnología y las
ciencias de la computación que ayudan a la comprensión de los procesos
moleculares y genéticos fundamentales que controlan la salud y la enfermedad
(Teuffel et al., 2006).
Los grandes proyectos de secuenciación de genomas han proporcionado
una gran cantidad de información que debe ser gestionada de una manera
eficiente y precisa para poderla analizar. Ésta gran cantidad de información no
podría ser analizada de manera manual por lo que para hacer eficiente este
proceso se ha llegado a la gestión informática mediante el uso de bases de datos,
aplicaciones y protocolos automáticos los cuales sirven para almacenar, organizar
y analizar mediante sistemas computacionales y programas datos de información
biológica y clínica (Teuffel et al., 2006; Bethesda, 2005)
Estas bases de datos incrementan la rapidez del análisis de secuencias
tanto nucleotídicas como proteínicas; se han creado recientemente varias
herramientas como bases genómicas, buscadores, herramientas para
alineamientos de secuencias, buscador de SNP (single nucleotide polymorphism),
herramientas de predicción de genes, buscadores de expresión, y algoritmos para
la predicción de promotores, además de herramientas que predicen las

secuencias protéicas, su estructura, función, interacciones moleculares,
modificaciones, etc.
(Bethesda, 2005).
Las herramientas bioinformáticas para la comparación de secuencias y su
alineamiento son esenciales y para ello se utilizan programas que utilizan
algoritmos que facilitan el alineamiento de las secuencias como BLAST (basic
local alignment search tool) y Clustal W (Bethesda, 2005).
Las bases de datos más comunes son: la base de datos del Laboratorio de
Biología Molecular Europeo (EMBL) del instituto Europeo de Bioinformática (EBI),
la base de datos GenBank y la base de datos de Japón (DDBJ).
GenBank es la base de datos del Instituto Nacional de Salud (NIH); se creó
en 1982 y tiene una colección de secuencias de ADN públicamente disponibles
que se actualiza cada dos meses. GenBank se diseñó para proporcionar y
fomentar la distribución y coordinación de la información actualizada y completa de
la secuencia de ácidos nucleicos y sus transcritos a través de internet y de manera
gratuita.
Mediante esta base de datos se puede obtener la localización de un gen de
interés, el organismo al que pertenece, su número de acceso en dicha base de
datos, referencias relacionadas de otros autores, información sobre la función de
la secuencia, los ARNm y sus localizaciones y regiones codificantes así como las
mutaciones que presenta y en dónde se encuentran (Teuffel et al., 2006).
BLAST (Basic Local Aligment Search Tool) es una herramienta
bioinformática que se usa con frecuencia para el cálculo de la similitud entre

secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos. Su motor de búsqueda es NCBI
(Nacional Center of Biotechnology Information) (Johnson, 2008).
Para la comparación de las secuencias de nucleótidos o aminoácidos entre
un mismo organismo o entre otros es una herramienta importante ya que permite
inferir la función de los genes recién secuenciados o predecir la función de nuevos
genes y explorar las relaciones evolutivas. También permite realizar una búsqueda
de las secuencias similares a la secuencia de interés (Johnson, 2008).
Hay diferentes variaciones de BLAST, por ejemplo se puede comparar una
secuencia de ADN con otra de ADN (blastn) o una secuencia nucleotídica con otra
(blastx) que mediante métodos estadísticos analiza las secuencias que tienen un
nivel significativo de similitud con la secuencia de consulta (Johnson, 2008).
También existen programas bioinformáticos para el diseño de
oligonucleótidos para PCR o para diseñar sondas de hibridación, como Primer3 y
MPprimer. Además hay programas como Oligo analizer de IDT (Integrated DNA
Tecnologies) que ayudan a evaluar la especificidad y eficiencia de los
oligonucleótidos. Éstos programas consideran varios factores como la temperatura
de fusión de oligonucleótido, la longitud , su contenido de GC, la estabilidad 3 ', la
estructura secundaria prevista, la probabilidad de alineamiento o la amplificación
de secuencias indeseables (por ejemplo intercalados repeticiones), la probabilidad
de formación de dímeros entre dos copias de la misma imprimación, y la exactitud
de la secuencia de origen (Wubin, 2010; Help Bioinfo http://bioinfo.ut.ee/primer3-
0.4.0/; Help IDT https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/).

JUSTIFICACIÓN

C. glabrata ha mostrado un aumento significativo en las infecciones nosocomiales,
razón por la que estudios conjuntos han tratado de mejorar las técnicas de
diagnóstico así como su tratamiento específico.
Por otra parte su capacidad de supervivencia durante la fagocitosis al estrés
oxidativo ha despertado el interés por estudiar los mecanismos específicos de este
fenómeno. Los estudios aislados han mostrado que la pexofagia se activa en
respuesta al estrés oxidativo, o la presencia de catalasa peroxisomal en C.
glabrata, sin embargo no se ha reportado la presencia de los genes involucrados a
lo largo de la vía de la regulación del estrés oxidativo, reportadas en otras
especies como Pichia pastoris.
Este trabajo pretende estudiar los principales genes ortólogos en C.
glabrata de los genes CTA1, PEX3, ATG11 y PEP4, involucrados en el estrés
oxidativo, a partir de S. cerevisiae mediante el análisis bioinformático lo que
permitirá contribuir en el conocimiento de esta vía abriendo la posibilidad de
estudiar su expresión génica y así ayudar a encontrar posibles blancos
terapéuticos alternativos.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL
Corroborar mediante análisis bioinformático y PCR la presencia de los genes CTA1Cg,
Atg11Cg, Pex3Cg y PEP4Cg relacionados en la vía de regulación del estrés oxidativo en
Candida glabrata.

OBJETIVOS PARTICULARES
• Analizar y comparar las secuencias de C. glabrata y S. cerevisiae mediante
análisis bioinformático, para obtener las secuencias putativas en C. glabrata de los
principales genes relacionados con estrés oxidativo: CTA1Cg, Atg11Cg, Pex3Cg,
PEP4Cg.
• Diseñar los oligonucléotidos específicos de los genes CTA1Cg, Atg11Cg, Pex3Cg,
PEP4Cg de C. glabrata.
• Corroborar mediante PCR la presencia de los genes de interés.

DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO

I C. glabrata CBS 138 I
I I
Estudio bioinformático de los genes putativos Crecimiento de C. glabrata en YPD.
CTA1Cg, Atg11Cg, Pex3Cg , PEP4Cg de C.
glabrata.
Diseño de
: Extracción de DNAI
oligonucleótidos
específicos para los
genes de interés
Amplificación de 1m
genes de interés f--
mediante PCR.

MATERIAL Y MÉTODOS

1. Material biológico
Se utilizó la cepa tipo de C. glabrata CBS138 (ATCC 2001).
2. Medios de cultivo yconservación de cepas
Caldo YPD (Dextrosa, Extracto de Levadura y Peptona). 1% de extracto de
levadura, 2% peptona de caseína, 2% de dextrosa. Se esterilizó en autoclave a
120°C durante 15 min.
Para la preparación de agar YPD, se adicionó agar bacteriológico al 1.5%.
Medio de conservación: caldo YPD con glicerol al 20%, esterilizado por filtración.
3. Análisis bioinformático de los genes putativos de la vía de regulación del
estrés oxidativo de interés.
Inicialmente se buscaron las secuencias conocidas en S. cerevisiae de los genes
ATG11, PEP4, PEX3, ACT y CTA siguiendo las siguientes estrategias:
a) Se buscaron las secuencias nucleotídicas reportadas de los genes ATG11,
PEP4, PEX3, ACT y CTA presentes en S. cerevisiae en la base de datos
del GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y el buscador YGOB (Yeast
Gene Order Browser) (http://ygob.ucd.ie/).
b) Una vez obtenidas las secuencias de cada gen en formato FASTA, se
realizó un análisis de alineamiento con el programa (BLAST) de los genes

de interés correspondientes en S. cerevisiae, para encontrar las secuencias
ortólogas en el genoma de C. glabrata.
c) Para identificar si los genes son ortólogos en C. glabrata se examinaron los
mismos genes en la base de datos YGOB de S. cerevisiae, las secuencias
obtenidas se compararon con las del GeneBank.
d) Para corroborar lo anterior, a las secuencias encontradas en C. glabrata se
les realizó un segundo análisis de alineamiento:
a. A partir de secuencias nucelotídicas se realizó un alineamiento para
encontrar la presencia de dichos genes en secuencias nucleotídicas
de otras especies de levaduras por el análisis blastn
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TY
PE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome).
b. Se buscó, por la herramienta blastx
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&PAGE_TY
PE=BlastSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAG
E=blastn), las secuencias de aminoácidos utilizando como molde las
secuencias nucleotídicas conocidas.
c. Para confirmar que se trata de la proteína de interés se realizó a
partir de las secuencias de aminoácidos obtenidas el análisis blastp
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TY
PE=BlastSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAG
E=blastx).

d. Finalmente a partir de la secuencias aminoacídicas se buscaron las
secuencias nucleotídicas en posibles traducciones del marco de
lecutra mediante tblastx (
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastx&PAGE_TY
PE=BlastSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAG
E=blastp).
e. El análisis de la función proteica de las secuencias traducidas se
realizaron mediante la base de datos UNIPROT
(http://www.uniprot.org/). Y la probable localización subcelular de las
proteínas se efectuó con la base de datos de Softberry
(http://www.softberry.com).
f. Se realizaron alineaciones en ClustalW2 para corroborar el
porcentaje de similitud entre las secuencias de los genes de interés
entre C. glabrata y S. cerevisiae
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).
4. Diseño de iniciadores
a) Se diseñaron oligonucleótidos específicos para la amplificación de los
genes de interés a partir de las secuencias putativas de C. glabrata,
considerando: la longitud del oligonucleótido y las del amplificado, la Tm, el
%GC, la formación de dímeros (auto-complementariedad y heterodímeros).
Con el programa Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0) se obtuvieron
las secuencias tentativas, que se modificaron manualmente según las
características de la secuencia deseada.

b) Se confirmó la especificidad y diseño de los iniciadores con ayuda de los
programas Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)
de NCBI y Oligo analizer de la página de IDT (Integrated DNA
Technologies; https://www.idtdna.com/analizer/Applications/OligoAnalyzer/)
5. Obtención de biomasa
A partir de un cultivo puro, la levadura se incuba toda la noche a 37 °C en
agitación constante en caldo YPD con proporción aire: líquido (5:1). El
cultivo se centrifugó a 4,000 rpm por 10 min a 4 °C.
6. Extracción de DNA de levaduras
1) La biomasa obtenida del cultivo de C. glabrata en caldo YPD se lavó 2
veces con un mL de agua destilada estéril.
2) Se agregaron 300 µL de buffer Tris – EDTA – β-mercaptoetanol a pH 7.6, y
se agregó 100 µL de Liticasa (5U/uL). Se mezcló por inversión.
3) Se incubó por 30 min a 37°C, mezclando por inversión en intervalos de 15
min.
4) Se centrifugó a 13,000 rpm durante 3 min. y se decantó el sobrenadante.
5) Se procedió con el Kit Wizard, Promega para la extracción de DNA,
agregando 100 µL buffer de lisis de núcleos y 100 µL de solución de
precipitación de proteínas y se agitó en vórtex durante 20 seg.
6) Se colocó inmediatamente en hielo por 5 min y nuevamente se centrifugó a
13,000 rpm / 3 min.

7) En un nuevo tubo para microcentrífuga de 1.5 mL se colocaron 300 µL de
isopropanol y se trasvasó el sobrenadante obtenido del inciso anterior
evitando el arrastre del paquete celular.
8) Se mezcló por inversión y se centrifugó a 13,000 rpm durante 2 min.
9) Se decantó el sobrenadante y se agregó 300 µL de etanol al 70%,
mezclándose por inversión.
10) Se centrifugó a 13,000 rpm durante 2 min. Posteriormente se decantó y se
dejó secar el paquete durante 10–15 min.
11) Se resuspendió la pastilla de DNA con 50 µL de solución rehidratante para
DNA y se guardó a -20°C.
En caso de que el DNA arrastrara proteínas en el rendimiento final y para
obtener mayor pureza, el sobrenadante obtenido de la lisis celular, se colocó
en un tubo para microcentrífuga de 1.5 mL con 300 µL de cloroformo–alcohol
isoamílico en una proporción 24:1 mezclando por inversión. Se centrifugó a
13,000 rpm 2 min. Con cuidado, se tomó la fase acuosa (sobrenadante)
evitando no arrastrar la interfase (fase orgánica), para pasarla al tubo que
contiene el Isopropanol y se continúa la metodología antes descrita.
Una vez obtenido el DNA se procedió a cuantificarlo y analizar su pureza e
integridad. Ver anexo 1.

7. PCR para la amplificación de los genes de interés
Para este procedimiento se diluye el DNA a una concentración de 20 ng/uL, la cual
se realizó según los datos obtenidos del análisis espectrofotométrico y se preparó
la mezcla de reacción con Master Mix, Promega. La hidratación y cuantificación de
los oligonucleótidos se realizó conforme al anexo 1.
Tabla 3. Mezcla de reacción para la amplificación por PCR.
Reactivo (µL)
Agua 6.5
Master Mix 1 12.5
Oligo 1 10pM 0.5
Oligo 2 10pM 0.5
DNA (20 ng/µL) 5
TOTAL 25
1 Marca Promega: Contiene los dNTP’s, MgCl2, buffer y la Taq polimerasa.

Las condiciones finales de la PCR se estandarizaron para cada uno de los genes
de estudio y quedan resumidos en la tabla 4.
Tabla 4. Condiciones de amplificación de los genes en estudio.
Condición Temperatura Tiempo
Desnaturalización
inicial
94 °C 5 min.
25 ciclos de:
Desnaturalización
Alineamiento
Extensión

94 °C
56 °C
72 °C

45 seg.
45 seg.
45 seg.
Extensión final 72 °C 7 min.

RESULTADOS

1. Identificación y análisis bioinformático de los genes codificantes para
CTA1, PEX3, ATG11, PEP4 y ACT1 de S. cerevisiae.
Mediante la búsqueda realizada en la base de datos GenBank, se obtuvieron los
números de acceso de los genes codificantes para catalasa (CTA), proteína señal
de la membrana de los peroxisomas (PEX3), proteína de membrana vacuolar
(ATG11) y proteinasa A (PEP4) de S. cerevisiae para la vía de regulación del
estrés oxidativo, además se analizó el gen de la actina (ACT1), que se utilizó
como el gen de referencia. La tabla 5 resume las características de los genes que
detallan las secuencias nucleotídicasy aminoacídicas, así como la función de las
proteínas.
Tabla 5. Análisis bioinformático de los genes CTA, PEX3, ATG11, PEP4 y ACT de S.
cerevisiae en GenBank.
Gen Nombre Tamaño (gen)
Tamaño
(proteína) Función
No. Acceso
(Gen)
No. Acceso
(proteína)
CTA1 YDR256C 1548 pb 515 aa
Catálisis del
peróxido de
hidrógeno
NM_001180564.1 NP_010542
CTT1 YGR088W 1689 bp 562 aa
Catálisis del
peróxido de
hidrógeno
NM_001181217.1 NP_011602.2
PEX3 YDR329C 1326 pb 441 aa
Proteína de
ensamblaje
peroxisomal
NM_001180637.3 NP_010616.3
ATG11 YPR049C 3537 pb 1178 aa
Proteína
adaptadora
durante la
pexofagia
NM_001184146.1 NP_015374.1
PEP4 YPL154C 1218 bp 405 aa
Aspartil
proteasa
vacuolar
NM_001183968.1 NP_015171.1
ACT1 YFL039C 1128 pb 375 aa
Proteína
estructural del
citoesqueleto
NM_001179927.1 NP_116614.1

2. Análisis bioinformático de las secuencias
ortólogas en el genoma de C. glabrata correspondientes con los genes
de S. cerevisiae.
A partir de las secuencias reportadas en la tabla 5 de los genes de S. cerevisiae,
se realizó el análisis de alineamiento (BLAST) y se obtuvieron las cinco
secuencias ortólogas esperadas en C. glabrata. Cada uno de los genes de S.
cerevisiae alinearon con una sola secuencia en el genoma de C. glabrata, cabe
señalar que ninguna de estas secuencias está asignada y se reportan como genes
putativos con la función proteica analizada.
Con estas secuencias se determinó la longitud del gen, el número de acceso en
NCBI y se realizó la traducción a secuencias aminoacídicas (Tabla 6). En cuanto a
tamaño molecular se observó que las secuencias tienen longitudes muy
semejantes en ambas especies.
Tabla 6. Secuencias homólogas de los genes CTA, PEX3, ATG11, PEP4 y ACT de S.
cerevisiae encontradas en C. glabrata mediante análisis bioinformático.
Gen Nombre*
Tamaño
(gen)
Tamaño
(proteína)
No. Acceso**
(Gen)
No. Acceso**
(Proteína)
blastn
(% alineamiento)
Cta1Cg CAGL0K10868g 1524 pb 507 aa XM_448688.1 XP_448688.1 100
Pex3Cg CAGL0M01342g 1419 pb 472 aa XM_449403.1 XP_449403.1 4
Atg11Cg CAGL0H08558g 3333 pb 1110 aa XM_447172.1 XP_447172.1 6
Pep4Cg CAGL0M02211g 1248 bp 415 aa XM_449442.1 XP_449442.1 83
Act1Cg CAGL0K12694g 1128 pb 360 aa XM_448768.2 XP_448768.2 100
*nombre del gen asignado en YGOB; **accesos obtenidos de NCBI.

Dado los bajos porcentajes de alineamiento en Pex3Cg y Atg11Cg, se decidió
utilizar la herramienta informática Clustal W2, que nos muestra el aliniamiento de
las bases entre varias secuencias. Este alineamiento presentó valores de
identidad muy diferentes a blastn (Tabla 7) que predecían identidad entre las
secuencias.

Tabla 7. Alineamiento en ClustalW2 de las secuencias de la levadura molde con C.
glabrata.
Gen
Secuencia
de C.
glabrata
Longitud
(bp)
Secuencia de
S. cerevisiae
Longitud
(bp) Puntuación
CTA1 XM_448688.1 1524 NM_001180564.1 1548 70.14
PEX3 XM_449403.1 1419 NM_001180637.3 1326 51.58
ATG11 XM_447172.1 3333 NM_001184146.1 3537 49.41
PEP4
XM_449442.1 1248 NM_001183968.1 1218 65.27
ACT XM_448768.2 1128 NM_001179927.1 1128 90.78

Confirmación de la ortología de las secuencias putativas en C. glabrata
2.1. Confirmación de las secuencias putativas de los genes de interés
de C. glabrata.
Utilizando las secuencias de los genes mostrados en la tabla 6, se realizaron otros
alineamientos tipo BLAST para corroborar las características de las secuencias
putativas.
Con el análisis blastn el porcentaje de similitud para los genes Pex3Cg y Atg11Cg
fué bajo, 4 y 6% respectivamente, además se procedió a realizar el análisis
mediante tblastx, para comparar las secuencias nucleotídicas de C. glabrata con
las de S. cerevisiae considerando los seis marcos de traducción posibles.

Con este tipo de análisis, por su alta sensibilidad, se elevó el porcentaje de
similitud en los alineamientos, como se muestra en la tabla 8, Pex3Cg y Atg11Cg
mostraron 89 y 63% de similitud respectivamente, en tanto que los otros genes
presentaron entre el 91 y 100% de similitud. También mediante este análisis se
reportaron secuencias únicas para cada gen.
Tabla 8. Análisis tipo tblastx para comparar los genes de interés en C. glabrata con
los de S. cerevisiae.
Gen % alineamiento Valor e
Cta1Cg 99 0.0
Pex3Cg 89 5e-61
Atg11Cg 63 1e-158
Pep4Cg 91 3e-138
Act1Cg 100 0.0

El valor E nos indica la probabilidad del alineamiento, entre menor sea este
valor (menor a 0.02) la probabilidad de que el alineamiento se deba únicamente al
azar es casi nulo y por lo tanto tiene una mayor posibilidad de ser homologo. En
todas las secuencias analizadas se obtuvo un valor de E menor a 0.02 lo que
confirma la homología entre ellas.
Organización genómica espacial
Para comparar la sintenia, se trabajó con la base de datos de levaduras YGOB, la
cual utiliza la comparación de genomas de levaduras relacionadas para observar
la homología de secuencias en genes individuales y su organización genómica
espacial (para la interpretación ver Anexo 2).

Mediante la base de YGOB se buscaron los genes pertenecientes a S. cerevisiae
CTA1, PEX3, ATG11, PEP4 y ACT1 obteniendo las secuencias ortólogas en C.
glabrata.
Además se obtuvo información sobre la localización de cada gen: catalasa CTA1
se encuentra localizado en el cromosoma K de C. glabrata en tanto que el gen
PEX3 está ubicado en el cromosoma M, ATG11 se encuentra en el cromosoma
H, el gen PEP4 en el cromosoma M y el gen ACT1 se encuentra en el cromosoma
K y todos los genes presentan ortología en otras especies como Kazachstania
africana y Kazachstania naganishii; además que se presenta sintenia, es decir el
mismo orden entre los genes de C. glabrata y S. cerevisiae, para Pex3Cg,
Atg11Cg, Pep4Cg y Act1Cg (Ver ejemplo fig. 3) .

Figura 3. ALINEAMIENTO DE LOS GENES DE INTERÉS EN VARIAS LEVADURAS. Esta vista parcial de
la página de resultados de la base de datos YGOB, muestra los genes ortólogos (recuadro rojo) y la sintenia
de gen Pex3 (recuadro verde), de S. cerevisiae comparadas con otras levaduras del suphilum
Saccharomycotina, entre ellas C. glabrata, levadura más cercana desde el punto de vista genético.

3. Función putativa proteica de los genes de la ruta de estrés oxidativo de
C. glabrata.

A partir de las secuencias aminoacídicas traducidas de los genes de interés se
realizó el análisis blastp con la finalidad de alinear los aminoácidos de C. glabrata
comparados con los de S. cerevisiae.
Tabla 9. Alineamiento de las secuencias proteicas en blastp.
Proteína* % Identidad Valor E
ycgCta1 81 0.0
ycgPex3 40 1e-117
ycgAtg11 35 0.0
ycgPrA 63 0.0
ycgAct1 100 0.0
*Proteína putativa

La tabla 9 muestra porcentaje de identidad del 35 al 100 % en las proteínas
putativas, los valores más cercanos al 100% de identidad nos hablan de la
homología que existe entre las proteínas, mientras que los valores bajos como
sería el caso de ycgPex3 y ycgAtg11, nos hablan de divergencia entre ellos.
Otra vía para verificar la homología es analizar la función y los dominios de
la secuencia problema en el caso de las enzimas y las superfamilias en las otras
proteínas. La caracterización se completa con la búsqueda en la base de datos de
UNIPROT para obtener las propiedades de la proteína: nombre, longitud de la
secuencia, su probable función molecular así como su localización subcelular.
Ésta última se corroboró mediante la base de datos de Softberry.
Para cada una de las proteínas problema encontramos que: la función
correspondía a la esperada, así como la localización subcelular (Tabla 10). En el
caso de ycgAtg11 y ycgPex 3 que presentaron baja similitud, por UNIPROT se

corroboró que la función de la secuencia de aminoácidos en C. glabrata es
semejante a la deS. cerevisiae. Además para verificar la función se analizaron los
dominios y superfamilias correspondientes a cada proteína con lo cual se obtuvo
en todos los casos que cada proteína compartía una secuencia conservada con la
función esperada, por ejemplo ycgPex3 comparte en ambos casos la superfamilia
peroxina-3, ycgPrA pertenece a la superfamilia de la pepsina-retropepsina y tiene
un multidominio de aspartil proteasa (Ver anexo 2).

Tabla 10. Características obtenidas en UniProt de las proteínas putativas de C.
glabrata en la vía de regulación del estrés oxidativo.

Gen Proteína Longitud (aa) Función**
Localización
subcelular**
No. Acceso
(NCBI)
No.
Acceso
(UniProt)
Secuencia
conservada
(NCBI)
Cta1Cg ycgCta1 507
Protección
oxidativa por
peróxido de
hidrógeno
(peroxidasa).
Citosol y
peroxisomas. XP_448688.1 Q6FM56
Multidominio
de catalasa
(KatE)
Pex3Cg ycgPex3* 472
Biogénesis
peroxisomal,
participa en el
importe de
proteínas a la
membrana
peroxisomal
Membrana
peroxisomal,
retículo
endoplásmico.
XP_449403.1

Q6FK41 Superfamilia peroxina-3
Atg11Cg ycgAtg11* 1110
Participa en la
vía de transporte
a la vacuola,
pexofagia,
mitofagia y
nucleofagia.
Recluta otras
proteínas ATG.
Membrana
vacuolar. XP_447172.1 Q6FRH2
Superfamilia
ATG11
Pep4Cg ycgPrA 415 Aspartil proteasa (endopeptidasa). Vacuola
XP_449442.1
Q6FK02
Multidominio
de aspartil
proteasa
(Asp)
Act1Cg ycgAct1 375 Motilidad celular.
Citoplasma
(citoesqueleto)
.
XP_448768.2 P60009
Multidominio
de actina
(ACTIN)

*Proteína no designada.

4. Diseño de oligonucleótidos
Se diseñaron los oligonucleótidos específicos usando como molde las secuencias
tentativas de los genes en C. glabrata, el análisis de los oligonucleótidos se llevó
a cabo mediante Primer3 y Oligo Analizer. La tabla 11 resume las características
de los mismos, los cuales se diseñaron para que presentaran muy cercana
temperatura de alineamiento.
Tabla 11. Características generales de los oligonucleótidos utilizado para la
amplificación por PCR de los genes de interés.
G
EN

Oligonucleótidos
Long.
(bp)
AMPL.
(bp)
Tm
(°C)
GC
%
H
o
m
o
-
d
ím
e
ro
s
H
e
te
ro
-
d
ím
e
ro
s
C
TA
1
SENTIDO
CCACTCCAGAAAACCAAGTTGC
ANTISENTIDO
TGGACATAGTGCCATTCACC

21
145

56.7

57.2

4
PE
X
3
SENTIDO
GCTGAGAAAGCAGGGAAGC
ANTISENTIDO
CCAAATTGAGACCGCACTTC

21
147

56.4

56.7

57.9

52.3

4
A
TG
11
SENTIDO
CGCTGCTACATGAACAAGGA
ANTISENTIDO
GCCGAAGGTTCCAAACCC

18
157

55.2

56.8

61.1

4
PE
P4

SENTIDO
TTCACACTGGGTGGAGTTGA
ANTISENTIDO
CGCAGCACCAGTGTTTTCTA

20
147

56.2

55.6

7
A
C
T1
SENTIDO
CGGTAACGAAAGATTCAGAGC
ANTISENTIDO
AGCAATACCTGGGAACATGG

20
181

53.5

54.9

47.6

50.0

4
4
Long: longitud del gen; bp: pares de bases; AMPL: tamaño del amplicón esperado; Tm:
temperatura de alineamiento; GC: porcentaje guanina-citosina.

5. Amplificación de los genes Cta1Cg, Pex3Cg, Atg11Cg, Pep4Cg y Act1Cg
por PCR.

La figura 4 muestra los amplificados de cada secuencia en estudio con sus
respectivas tallas moleculares, que presentan el número de pares de bases
esperadas.

Figura 4. FOTOGRAFÍA QUE MUESTRA LOS AMPLIFICADOS DE LOS GENES Cta1Cg,
Pex3Cg, AtgCg11, Pep4Cg y Act1Cg La figura presenta las bandas correspondientes a los
amplicones en el siguiente orden: . 1: marcador de talla molecular; 2: control negativo de Cta1Cg;
3: Cta1Cg; 4: control negativo de Pex3Cg; 5: Pex3Cg; 6: control negativo de AtgCg11; 7: AtgCg11;
8: control negativo de Pep4Cg; 9: Pep4Cg; 10 control negativo de Act1Cg; 11: Act1Cg.

DISCUSIÓN

C. galbrata es una levadura que va adquiriendo mayor importancia cada día, pues
su relación hospedero – levadura tiene un comportamiento peculiar, de ahí la
importancia de estudiar sus diferentes vías metabólicas y de señalización. Sin
embargo el reto que se presenta es que sólo se tienen, dentro del genoma
secuenciado, pocos genes identificados por su estructura molecular.
S. cerevisiae al ser una levadura filogenéticamente relacionada con C.
glabrata se ha propuesto como modelo de estudio para extrapolar posibles
funciones de genes, incluso sobre otras especies de Candida. Sus genomas
tienen tamaños parecidos así como el porcentaje CG, además de tener un número
similar de genes; las diferencias entre ambas especies radican principalmente en
la expresión de genes de adhesión que presenta C. glabrata, su alta resistencia a
fármacos y la capacidad de adaptación ante los ambientes adversos. (Castaño et
al., 2006; Roetzer A; Gabaldón E. et al., 2011; Kaur et al., 2005)
En 1997 el consorcio internacional terminó la secuenciación del genoma de
S. cerevisiae y en 2004 Dujon y colaboradores, liberaron los proyectos de los
genomas de C. glabrata y otras especies de Candida; este hecho permitió poder
realizar búsquedas de los genes codificantes para proteínas presentes en ésta
levadura mediante análisis bioinformáticos que permiten realizar análisis
presuntivos para conocer la similitud entre genes de diferentes especies, así como
las posibles proteínas que codifican, su posible función, localización, etc.

La capacidad de resistencia a la fagocitosis y en particular a la presencia de
ROS por parte de la C. glabrata es un fenómeno parcialmente estudiado. En el
presente estudio se reconoció, al igual que Cuellar et al., 2009, la presencia de un
solo gen que codificara para la enzima catalasa ortóloga con respecto a la enzima
de localización peroxisomal de S. cerevisiae. En este estudio se encontró una
similitud del 99%, en tanto que Cuellar y col., reportan el 85%; esta diferencia
puede ser atribuida al desarrollo de algoritmos más robustos que permiten analizar
las secuencias con mayor sensibilidad. Cabe resaltar que este gen no presenta
sintenia con los genomas de levaduras del subfilo Saccharomycotina; esto puede
deberse a que se presentó gran divergencia de estos genes durante su evolución,
de ahí que se explique que no se encontró ninguna secuencia que presentara
homología con la catalasa citosólica (Ctt1) de S. cerevisiae solo con la de
localización peroxisomal (Cta1) (Cuellar et al., 2009). La localización subcelular se
predijo mediante el análisis bioinformático ubicando esta enzima en el citosol y
peroxisomas como una proteína de 507 aminoácidos (Hartig, 1986; Petrova,
2004).
Una vez expuesta la célula a estrés oxidativo y nutricional, Roetzer y
colaboradores en 2010 han descrito que la cantidad de peroxisomas presentes en
las levaduras depende del estado nutricional en el que se encuentre la célula; ya
que las levaduras aumentan el número de sus peroxisomas al ser fagocitadas por
macrófagos y la vía pexofágica se activa para la posterior eliminación de los
peroxisomas.

La vía pexofágica que es un tipo de autofagia, se ha estudiado en especies
como P. pastoris H. polymorpha y S. cerevisiae. La regulación de la biogénesis y
la degradación de peroxisomas se llevan a cabo mediante genes PEX y se ha
observado que la mayoría de los genes que participan en la autofagia y pexofagia
son ortólogos en varias levaduras (Till et al., 2011; Dunn et al., 2005; Cebollero et
al., 2009; Kraft et al., 2009).
El gen PEX3 es esencial ya que en células carentes de éste no pueden
iniciar la vía pexofágica (Dunn et al., 2005; Kraft et al., 2009; Roetzer, et al., 2010;
Till et al., 2011; Bertoni, 2009; Williams, 2013). En C. glabrata se encontró la
presencia del gen ortólogo Pex3Cg, que presenta