Preservacion-de-la-informacion-cristalografica-en-los-centros-metalicos-de-la-oxidasa-multicobre-de-thermus-thermophilus-mco-tth

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INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS BIOQUíMICAS 
 
 
 
PRESERVACIÓN DE LA INFORMACIÓN CRISTALOGRÁFICA EN LOS CENTROS 
METÁLICOS DE LA OXIDASA MULTICOBRE DE Thermus thermophilus (MCO-Tth) 
 
T E S I S 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
 
MAESTRO EN CIENCIAS 
 
 
P R E S E N T A: 
 
Q.F.B. Eduardo Rosas Benítez 
 
 
 
TUTOR PRINCIPAL: 
Dr. Enrique Rudiño Piñera, Instituto de Biotecnología, UNAM 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR: 
Dra. Adela Rodríguez Romero, Instituto de Química, UNAM 
Dr. Alfredo Torres Larios, Instituto de Fisiología Celular, UNAM 
 
 
 
 
MÉXICO, D.F. Agosto, 2013 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
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Agradecimientos 
 
Este proyecto se llevó a cabo en el Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos del 
Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autonoma de México, bajo la dirección del 
Dr. Enrique Rudiño Piñera. Fue financiado por CONACyT: proyecto No. 102370 y por el PAPIIT 
IN204611. 
 
 
Agradecesco primeramente al Dr. Enrique Rudiño por su amistad, comprensión y calidad 
humana dentro y fuera de las aulas. 
A mi madre por el soporte incondicional en esta asi como en todas las etapas de mi vida. 
A mis amigos, especialmente a los que siempre estuvieron para darme ánimos. 
A mis compañeros de laboratorio por el apoyo y amistad brindada, en especial a la Tec. Sonia 
Rojas por el apoyo a lo largo del desarrollo del proyecto. 
A la Dra. Adela Rodríguez del Laboratorio Nacional de Estructura de Macromoléculas LANEM 
del Instituto de Química, UNAM por las facilidades prestadas y los comentarios asertivos que 
ayudaron a dar forma a este trabajo. 
Al Dr. Alfredo Torres por las sugerencias y recomendaciones sobre el desarrollo de este 
proyecto. 
A la Dra. Vivian Stojanoff y sus colaboradores por las facilidades prestadas durante la estancia 
en el Sincrotrón de Brookheaven, NY. 
 
 
 
Vive como si fueras a morir mañana, 
aprende como si fueras a vivir siempre. 
Mahatma Gandhi 
 
 
 
 
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Contenido 
 
i. Lista de ilustraciones 5 
ii. Lista de tablas 11 
iii. Lista de ecuaciones 13 
iv. Abreviaturas 13 
v. Resumen 14 
vi. Abstract 16 
1. Introducción 17 
1.1 Mecanismo catalítico 18 
1.2 Sitio activo y estructura tridimensional de las MCOs 19 
1.3 Generalidades de la difracción por rayos X 22 
1.4 Daño por radiación 22 
1.5 Preservación de los datos cristalográficos 28 
1.6 Agentes radioprotectores o scavengers 29 
1.7 Uso de datasets compuestos 36 
1.8 Uso de líneas de alta y baja energía 38 
1.9 Atenuación de la intensidad del flujo 40 
2. Hipótesis 41 
3. Objetivo General 41 
3.1 Objetivos Particulares 41 
 
4. Sección experimental 42 
4.1 Sobreexpresión y purificación de la MCO-Tth recombinante 42 
4.2 Cristalización 43 
4.3 Colecta de datos 44 
4.4 Procesamiento de la información 45 
 
 
4 
 
4.5 Dosis de radiación absorbida 47 
 
5. Resultados y Discusión 49 
5.1 Sobreexpresión y purificación de la MCO-Tth recombinante 49 
5.2 Determinación cualitativa de los cobres T1 y T3 51 
5.3 Cristalización 51 
5.4 Impacto de la dosis de radiación absorbida en la MCO-Tth. 52 
5.5 Evaluación en la ocupación del CuT2 modificando el flujo de 
los rayos X en cristales de la MCO-Tth 67 
5.6 Impacto del uso de altas energía y disminución del efecto 
 fotoeléctrico en la MCO-Tth. 72 
5.7 Evaluación en la ocupación del CuT2 utilizando agentes 
radioprotectores en la MCO-Tth. 77 
 
6. Análisis y discusión de los resultados 84 
 
7. Conclusiones 93 
 
8. Perspectivas 95 
 
9. Bibliografía 96 
 
10 Apéndice 99 
10.1 Cálculo del flujo 99 
10.1 Consideraciones experimentales en una colecta de datos 110 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
i. Lista de ilustraciones 
 
Figura 1. Comparación de la estructura de la MCO-Tth bajo distintas dosis de radiación absorbida. La estructura A, 
resulta de la dosis más baja de radiación depositada (0.7 MGy), en la cual se observa la presencia de los cuatro 
iones cobre (la ocupación del CuT2 es de 0.13). La estructura B, muestra el daño a una dosis de radiación absorbida 
mayor (1.4 MGy), en la cual se presenta la depleción total del CuT2 del centro trinuclear de cobre (CTC). Cálculos 
considerando un flujo de 4.2x10
10 
fotones/segundo (Serrano-Posada & Rudiño-Piñera, en preparación)………..pag 15 
Figura 2. Diagrama esquemático de las MCOs, mostrando la distribución de los dominios estructurales y la relación 
geométrica entre los diferentes iones cobre presentes en esta proteína (Solomon et al. 1996b)……………………………18 
Figura 3. A Estructura general de la oxidasa multicobre de Thermus thermophilus (MCO-Tth) (código PDB 2XU9) y B, 
representación estructural del sitio activo catalítico donde se muestra al cobre T1, el cual es responsable de la 
remoción inicial de un electrón del sustrato, y más abajo los CuT2, CuT3 y CuT3´ formando el CTC, responsables de 
la reducción del oxígeno molecular en agua……………………………………………………………………………………………………………20 
Figura 4. A Residuos que coordinan a los cuatro iones cobre dentro de la MCO-Tth, así como residuos que se ha 
considerado están involucrados en la transferencia de protones hacia el sitio activo, el Asp106, el cual también se ha 
propuesto, desempeña un papel importante en la estabilización de las especies OH-/H2O vecinas al CuT2 y B, 
representación del mecanismo catalítico de la MCO-Tth………………………………………………………………………………………..21 
Figura 5. Fenómenos físicos involucrados en la exposición de un cristal a los rayos X. Dispersión elástica o de 
Thomson, inelástica o de Compton, efecto fotoeléctrico y generación de especies radiolíticas………………………………23 
Figura 6. Especies radiolíticas producidas por el daño primario al agua. Especies dependientes de la temperatura, 
pH y otros factores (Modificado a partir de Ward, 1988)………………………………………………………………………………………..24 
Figura 7. Pérdida de las ocupaciones afinadas de las cisteínas libres y las cisteínas formando puentes disulfuro en 
cristales de la proteína mirosinasa. Se muestra una notable disminución en el porcentaje de las cisteínas formando 
puentes disulfuro al aumentar la dosis depositada (Modificado a partir de Burmeister, 2000)……………………………….25 
Figura 8. Pérdida de la ocupación del CuT2 coordinado por dos histidinas en la MCO-Tth, se observa en la imagen A, 
dicho cobre con una ocupación de 0.16 esto después una dosis de radiación acumulada de 0.7 MGy. Al aumentar la 
dosis de radiación hasta 1.4 MGy, imagen B, se observa la escisión total del CuT2 (ocupación 0). (Cálculos 
considerando un flujo de 4.2x1010 fotones/segundo (Serrano-Posada, H., Tesis Doctorado, pág. 65)……………………..26 
Figura 9. Histograma del incremento relativo (%) de los PDAs para las cadenas laterales de distintos residuos en la 
acetilcolinesterasa de Torpedo califórnica (TcAChE) como consecuenciade la irradiación en un sincrotrón. La 
 
 
6 
 
línea horizontal indica el aumento medio de los PDAs de las cadenas laterales. Los números a lo largo del eje x 
indican el número de veces que se repite el residuo en la proteína. Las barras individuales muestran el incremento 
promedio de cada residuo comparando un segundo dataset con un dataset de referencia (Modificado a partir de 
Weik, et al. 2000)……………………………………………………………………………………………………………………………………………………27 
Figura 10. A-D Reducción dependiente de la dosis absorbida de una molécula de nitrato. La densidad electrónica de 
los aniones nitrato disminuye conforme aumenta la dosis de radiación depositada. Durante la reducción del anión 
nitrato se observa la conservación de la densidad electrónica alrededor del puente disulfuro; E-F, a dosis más altas 
(23.3 MGy) el NO3 reducido desaparece y de manera concomitante con esto aparece el daño en el puente disulfuro 
(De la Mora et al. 2011)………………………………………………………………………………………………………………………………………….32 
Figura 11. Intensidades relativas sumadas de datasets sucesivos graficados contra la dosis absorbida. El 
decaimiento en la intensidad es exponencial con la dosis, comportamiento de un cristal nativo de lisozima 
comparado con un cristal co-cristalizado con 0.5M de ascorbato (Modificado a partir de Barker et al. 2009)………..33 
 
Figura 12. Tetradecabromuro de hexatantalio, Ta6Br
2+
12. El clúster es compacto, de forma casi esférica con un radio 
aproximado de 4.3 Å……………………………………………………………………………………………………………………………………………….34 
Figura 13. Ciclofanos binucleares de cobre (Modificado a partir de Sugich-Miranda et al. 2010)……………………………35 
Figura 14. Capacidad antioxidante de los complejos ciclofanos de cobre Cu2PO y Cu2PC por el método TEAC 
(Modificado a partir de Sugich-Miranda et al. 2010)……………………………………………………………………………………………….36 
Figura 15. A Estrategia de colecta de datos en múltiples cristales, se muestra la distribución de la dosis absorbida 
de radiación por rayos X en función del ángulo de rotación en cristales individuales de peroxidasa de rábano. B, 
construcción de datasets compuestos a partir de la información procedente de los datos individuales. Los datasets 
compuestos representan las estructuras que recibieron distinta dosis de radiación depositada (Modificado a partir 
de Berglund et al. 2002)………………………………………………………………………………………………………………………………………….37 
Figura 16. Contribución relativa (%) al efecto fotoeléctrico, efecto Compton (dispersión inelástica) y efecto 
Thomson (dispersión elástica) explorando distintas energías (keV) en un cristal de lisozima de dimensiones 0.1 x 0.1 
x 0.1mm, usando un haz de tamaño constante. (Modificado a partir de Paithankar & Garman, 2010)……………………39 
Figura 17. Disminución del flujo de los rayos X por efecto de los atenuadores. Se observa una reducción del 20% del 
valor de flujo en cada ocasión que los rayos X atraviesan a los atenuadores en su camino desde la fuente hasta la 
muestra y el detector, resultando de esta forma en una reducción del 80% del flujo después de la colocación de 4 
atenuadores, lo que impacta en la dosis de radiación que recibe el cristal……………………………………………………………..40 
 
 
7 
 
Figura 18. Algoritmo de integración (XDS), escalamiento (XSCALE), conversión de formato (XDSCONV) modelado 
(Coot) y afinamiento (Phenix/Refmac5) de los datos de colecta hasta la generación de una estructura afinada…….46 
Figura 19. A Archivo de entrada (input) y B, archivo de salida (output). En ambos casos se muestran los parámetros 
que deben de ser utilizados para el cálculo final de la dosis de radiación depositada, haciendo uso del programa 
RADDOSE y usando como ejemplo los datos de una fosfofructocinasa de Thermotoga maritima (PPK) (Paithankar & 
Garman, 2010)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..49 
Figura 20. A Cromatograma de la muestra obtenida después de dializar al extracto bacteriano conteniendo a la 
MCO-Tth, usando una columna de intercambio catiónico (SP Sepharose Fast Flow, GE Healthcare) y B, 
electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE 12%. Carril 1 marcador de peso molecular Fermentas, carriles 2-4 las 
fracciones obtenidas a partir de la purificación………………………………………………………………………………………………………50 
Figura 21. A Cromatograma de la MCO-Tth después de la cromatografía de intercambio catiónico usando una 
columna de exclusión molecular (SuperDex 75, GE Healthcare) y B, electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE 12%. 
Carril 1 y 2 (distintas concentraciones) con una banda única de ~50 kDa que corresponde al peso molecular 
aproximado de la MCO-Tth. La proteína purificada exhibió el color azul característico de las MCOs, carril 3 
marcador de peso molecular Fermentas…………………………………………………………………………………………………………………50 
Figura 22. A Espectro UV-Visible de la MCO-Tth en 20 mM Tris pH 8.0. Se muestra la presencia de los cobres T1 y 
T3, mediante sus picos característicos de absorción a 610 (CuT1) y 330 nm (CuT3). B, espectro de la MCO-Tth en su 
forma apo (Serrano-Posada, H., Tesis Doctorado, pág. 34)……………………………………………………………………………………..51 
Figura 23. Cristales de MCO-Tth crecidos a 4°C y una concentración de proteína de 20 mg/ml. Se presentan los 
cristales crecidos en 0.1 M Hepes pH 7.5 y 60, 65 y 70% (v/v) de MPD, mediante el método de gota colgante 
utilizando microseeding………………………………………………………………………………………………………………………………………….52 
Figura 24. Incremento del volumen de celda unitaria en cristales de ferritina dependiente de la dosis de radiación 
absorbida. Cada cruz representa el volumen calculado de la celda unitaria a partir de imágenes de 1°. El cristal es 
regresado a su posición original cada 5°. La línea sólida representa un ajuste de mínimos cuadrados. Modificado a 
partir de Ravelli et al. 2002……………………………………………………………………………………………………………………………………..55 
Figura 25. Expansión del volumen normalizado a partir de la estructura 1 (1001) de la celda unitaria como producto 
del aumento de la radiación en la MCO-Tth, se observa la dependencia casi lineal de dicho fenómeno…………………56 
Figura 26. Pérdida de reflexiones únicas en un cristal de MCO-Tth, producto del daño por la radiación absorbida a 
través de las 8 estructuras generadas……………………………………………………………………………………………………………………..57 
 
 
8 
 
Figura 27. A Incremento de los Parámetros de Desplazamiento Atómico (PDA) y B, incremento del valor B de 
Wilson producto de la dosis absorbida de radiación. Se observa una dependencia casi lineal de los valores con el 
incremento en la dosis de radiación……………………………………………………………………………………………………………………….58 
Figura 28. Estructuras con diferente dosis absorbida de radiación del CuT2 y de los aminoácidos que lo coordinan 
correspondientes a las estructuras 1 a 4 del cristal nativo (0.40 a 3.80 MGy) para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1 
sigma representados en azul…………………………………………………………………………………………………………………………………..60 
Figura 29. Estructuras con diferente dosis absorbida de radiación del CuT2 y de los aminoácidos que lo coordinan 
correspondientes a las estructuras 5 a 8 del cristal nativo (4.78-7.28 MGy) para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1 sigma 
representados en azul…………………………………………………………………………………………………………………………………………….61 
Figura 30. Estructuras con diferente dosis absorbida de radiación del CuT3´ y de los aminoácidos que lo coordinan 
correspondientes a las estructuras 1 a 4 del cristal nativo (0.40 a 3.80 MGy) para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1 
sigma representados en azul…………………………………………………………………………………………………………………………………62 
Figura 31. Estructuras con diferente dosis absorbida de radiación del CuT3´ y de los aminoácidos que lo coordinan 
correspondientes a las estructuras 5 a 8 del cristal nativo (4.80 a 7.28 MGy) para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1 
sigma representados en azul…………………………………………………………………………………………………………………………………..63 
Figura 32. Comparación de la densidad electrónica en un mapa 2fo-fc de la tapa-antena o “loop” de la MCO-Tth 
(residuos 294 a 307). Mapas 2fo-fc a 1 sigma………………………………………………………………………………………………………….64Figura 33. Superposición de los mapas de densidad electrónica 2fo-fc de la primera estructura con 0.40 MGy 
(densidad electrónica azul) de dosis de radiación acumulada y la última estructura generada con 7.28 MGy 
(densidad electrónica rosa). Mapas 2fo-fc a 1 sigma………………………………………………………………………………………………65 
Figura 34. Estructura del CuT2 y CuT3´ asi como de los aminoácidos que los coordinan correspondientes a los datos 
procedentes del cristal nativo colectado en la línea X4A (0.29 MGy) para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1 sigma 
representados en azul…………………………………………………………………………………………………………………………………………….67 
Figura 35. Estructuras con diferente dosis absorbida de radiación del CuT2 y de los aminoácidos que lo coordinan 
correspondientes a las estructuras A, cristal nativo atenuado imágenes 1 a 110 (0.02MGy) a 2.30Å; B, cristal nativo 
atenuado imágenes 360 a 470 (0.08MGy) a 2.50Å; C, cristal nativo colectado en un ánodo rotatorio AR60 (0.13 
MGy) a 2.0Å; D, cristal nativo AR120 colectado en un ánodo rotatorio (0.26 MGy) 1.60Å; E, cristal nativo colectado 
en un equipo ánodo rotatorio AR240 (0.51 MGy) 1.70Å para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1 sigma representados en 
azul…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………70 
Figura 36. Estructuras con diferente dosis absorbida de radiación del CuT3´ y de los aminoácidos que lo coordinan 
correspondientes a las estructuras A, cristal nativo atenuado imágenes 1 a 110 (0.02MGy) a 2.30Å; B, cristal nativo 
 
 
9 
 
atenuado imágenes 360 a 470 (0.08MGy) a 2.50Å; C, cristal nativo colectado en un ánodo rotatorio AR60 (0.13 
MGy) a 2.0Å; D, cristal nativo AR120 colectado en un ánodo rotatorio (0.26 MGy) a 1.60Å; E, cristal nativo 
colectado en un equipo ánodo rotatorio AR240 (0.51 MGy) a 1.70Å para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1 sigma 
representados en azul…………………………………………………………………………………………………………………………………………….71 
Figura 37. Efecto del ruido del detector utilizado, se observa este como círculos concéntricos aleatorios a lo largo 
de los patrones de difracción generados en el detector ImagePlate-Mar345, se puede observar la distribución 
aleatoria de estas líneas a lo largo de las imágenes A y B, lo que impacta en la eficiencia del detector disminuyendo 
este valor hasta 65%. Las imágenes C y D, corresponden a patrones de difracción de un detector ADSC Quantum 4R 
utilizado en líneas de energía estándar (específicamente X4A) en las cuales no se observan rayas aleatorias y el cual 
opera al 100% de eficiencia…………………………………………………………………………………………………………………………………….73 
Figura 38. Eficiencia en la absorción de los fotones incidentes por parte de la película de fósforo del detector Image 
Plate MAR345 y el detector MAR CCD en el rango de energías de 1-100 keV (Jakoncic et al. 2006)………………….…….74 
Figura 39. Estructuras del CuT2 y de los aminoácidos que lo coordinan de la MCO-Tth en alta energía con diferente 
dosis absorbida de radiación. En la imagen A1, se muestra a un cristal nativo (0.43 MGy), en la imagen A2, se 
muestra al mismo cristal nativo (0.76 MGy), cuya dosis de radiación depositada corresponde a la suma de dosis de 
la primera (A1) y segunda colecta (A2); la imagen de la estructura B, representa a un cristal nativo con 0.43 MGy de 
dosis de radiación depositada y finalmente la imagen C, representa a otro cristal nativo 0.76 MGy. Mapas 2fo-fc a 1 
sigma representados en azul…………………………………………………………………………………………………………………………………..76 
Figura 40. Estructuras del CuT3´ y de los aminoácidos que lo coordinan de la MCO-Tth en alta energía con diferente 
dosis absorbida de radiación. En la imagen A1, se muestra a un cristal nativo (0.43 MGy), en la imagen A2, se 
muestra al mismo cristal nativo (0.76 MGy), cuya dosis de radiación depositada corresponde a la suma de dosis de 
la primera (A1) y segunda colecta (A2); la imagen de la estructura B, representa a un cristal nativo con 0.43 MGy de 
dosis de radiación depositada y finalmente la imagen C, representa a otro cristal nativo 0.76 MGy. Mapas 2fo-fc a 1 
sigma representados en azul…………………………………………………………………………………………………………………………………..77 
Figura 41. Estructuras del CuT2 y de los aminoácidos que lo coordinan correspondientes a las estructuras 
procedentes de cristales sometidos a la técnica de soaking. A, 100mM NaNO3 1.5 minutos (0.41MGy) 1.50Å; B, 
100mM NaNO3 7 minutos (0.36MGy) 1.80Å; C, 500mM NaNO3 1 minuto (0.40MGy) 1.60Å. Mapas 2fo-fc a 1 sigma 
representados en azul…………………………………………………………………………………………………………………………………………….81 
Figura 42. Estructuras del CuT2 y de los aminoácidos que lo coordinan correspondientes a las estructuras 
procedentes de cristales sometidos a la técnica de soaking. D, 100mM ascorbato 10 minutos (0.62MGy) 1.80Å; E, 
100mM CuSO4 20 minutos (0.43MGy) 1.70Å; F, 5mM Cu2PC 3 minutos (0.58MGy) 1.82Å; G, 5mM Cu2PC 5 minutos 
(0.64MGy) 1.80Å y H, 5mM Cu2PO 8 minutos (0.55MGy) 1.55Å. Mapas 2fo-fc a 1 sigma representados en azul…...82 
 
 
10 
 
Figura 43. Estructuras del CuT3´ y de los aminoácidos que lo coordinan correspondientes a las estructuras 
procedentes de cristales sometidos a la técnica de soaking. A, 100mM NaNO3 1.5 minutos (0.41MGy) 1.50Å; B, 
100mM NaNO3 7 minutos (0.36MGy) 1.80Å; C, 500mM NaNO3 1 minuto (0.40MGy) 1.60Å; D, 100mM CuSO4 20 
minutos (0.43MGy) 1.70Å. Mapas 2fo-fc a 1 sigma representados en azul……………………………………………………………..83 
Figura 44. Estructuras del CuT3´ y de los aminoácidos que lo coordinan correspondientes a las estructuras 
procedentes de cristales sometidos a la técnica de soaking. E, 100mM ascorbato 10 minutos (0.62MGy) 1.80Å; F, 
5mM Cu2PC 3 minutos (0.58MGy) 1.82Å; G, 5mM Cu2PC 5 minutos (0.64MGy) 1.80Å y H, 5mM Cu2PO 8 minutos 
(0.55MGy) 1.55Å. Mapas 2fo-fc a 1 sigma representados en azul…………………………………………………………………………..84 
Figura 45. Impacto del agente precipitante MPD en la resolución máxima de las estructuras que lo contienen 
reportadas en el PDB. Se compara la totalidad de estructuras presentes con MPD en esta base de datos (1,492) y el 
promedio de la resolución en la cual se han publicado dichas estructuras, siendo este número 1.98Å (barras azules), 
comparado con el número total de estructuras reportadas de 76,227 con un promedio de resolución de 2.19 Å 
(barras rojas)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..…90 
Figura 46. Espectros de absorción de rayos X mostrando la reducción del Cu
+2
 a Cu
+1
 después de la irradiación con 
rayos X. El espectro correspondiente al cobre oxidado (línea sólida) corresponde al cristal de C. gallica antes de la 
colecta de datos por rayos X, mientras el espectro reducido (línea discontinua) muestra la reducción del cobre 
durante la colecta de datos (De la Mora et al. 2012)………………………………………………………………………………………………92 
Figura 47. Diagrama esquemático de un PIN fotodiodo, donde se muestran las superficies semiconductoras 
extrínsecas “P” y “N”, las cuales generan un potencial eléctrico que permite el movimiento de los fotones a través 
de la superficie “Intrínseca”, permitiendo así la contabilización de los mismos como corriente eléctrica (Amperes). 
(Modificado a partir de Owen et al. 2009)…………………………………………………………………………………………………………….100 
Figura 48. Esquema de distribución general y posición del PIN fotodiodo como parte de la línea de colecta……….101 
Figura 49. Comportamiento del flujo dependiente de la corriente del anillo de almacenamiento. Se presentan de 
forma conjunta los datos de tres distintos días de calibración, utilizando un haz atenuado con 16 foils de aluminio, 
una apertura de slits de 150x150 y una distancia cristal-detector de 250 mm……………………………………………………...106 
Figura 50. Gráfica de disminución del valor de flujo (x 109 fotones/segundo) en la línea X6A cuando se modifica el 
tamaño de los slits………………………………………………………………………………………………………………………………………………..107 
Figura 51. Gráfica de disminución del valor de flujo (x 109 fotones/segundo) en la línea X6A cuando se atenúa 
mediante el uso de distinto número de foils de aluminio………………………………………………………………………………….....10811 
 
ii. Lista de tablas 
 
Tabla 1. Algunos de los agentes radioprotectores evaluados en la literatura y su efecto de protección en cristales de 
proteínas………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..31 
Tabla 2. Parámetros estadísticos de la colecta de datos, integración y escalamiento de 8 estructuras de la MCO-Tth 
procedentes de un cristal nativo con diferentes dosis de radiación………………………………………………………………………..53 
Tabla 3. Parámetros estadísticos del afinamiento de 8 estructuras de la MCO-Tth procedentes de un cristal nativo 
con diferentes dosis de radiación……………………………………………………………………………………………………………………………54 
Tabla 4. Parámetros estadísticos de la colecta de datos, integración, escalamiento y afinamiento de un cristal 
nativo colectado en la línea X4A……………………………………………………………………………………………………………………………..66 
Tabla 5. Parámetros estadísticos de la colecta, integración y escalamiento de los datos un cristal nativo de MCO-Tth 
(Estructura 1: imágenes 1 a 110 y Estructura 2: imágenes 361 a 470), colectado dos veces en la misma zona del 
cristal en la línea X6A atenuada y de tres cristales nativos de MCO-Tth (AR240, AR120 y AR60) en el equipo casero 
ánodo rotatorio bajo distintos regímenes de tiempo de colecta de imágenes………………………………………………………..68 
Tabla 6. Parámetros estadísticos del afinamiento de datos un cristal nativo de MCO-Tth (Estructura 1: imágenes 1 a 
110 y Estructura 2: imágenes 361 a 470), colectado dos veces en la misma zona del cristal en la línea X6A atenuada 
y de tres cristales nativos de MCO-Tth (AR240, AR120 y AR60) en el equipo casero ánodo rotatorio bajo distintos 
regímenes de tiempo de colecta de imágenes………………………………………………………………………………………………………..69 
Tabla 7. Parámetros estadísticos de la colecta e integración de los datos de cuatro estructuras a partir de tres 
cristales nativos de MCO-Tth colectados en alta energía, con distintos tiempos de exposición por imagen……………75 
Tabla 8. Parámetros estadísticos de la colecta, integración y escalamiento de los datos de tres cristales de MCO-Tth 
con NaNO3 como radioprotector en distintas concentraciones (100 y 500mM) y tiempos de remojado (1, 1.5 y 7 
minutos) en las líneas X4A y X4C…………………………………………………………………………………………………………………………….78 
Tabla 9. Parámetros estadísticos del afinamiento de los datos de tres cristales de MCO-Tth con NaNO3 como 
radioprotector en distintas concentraciones (100 y 500mM) y tiempos de remojado (1, 1.5 y 7 minutos) en las 
líneas X4A y X4C……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..78 
Tabla 10. Parámetros estadísticos de la colecta, integración y escalamiento de datos en la línea X6A de 5 cristales 
sometidos a la técnica de soaking, haciendo uso de distintos agentes radioprotectores con distintas 
concentraciones y bajo distintos tiempos de remojado………………………………………………………………………………………….79 
 
 
12 
 
Tabla 11. Parámetros estadísticos del afinamiento de datos en la línea X6A de 5 cristales sometidos a la técnica de 
soaking, haciendo uso de distintos agentes radioprotectores con distintas concentraciones y bajo distintos tiempos 
de remojado……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………80 
Tabla 12. Parámetros comparativos de los cristales analizados durante el desarrollo de este trabajo……………………85 
Tabla 13. Mediciones de la corriente en un PIN fotodiodo de superficie 300 x 300 µm. Datos de calibración de la 
línea X6A (1)……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….…102 
Tabla 14. Mediciones de la corriente en un PIN fotodiodo de superficie 300 x 300 µm. Datos de calibración de la 
línea X6A (2)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….102 
Tabla 15. Mediciones de la corriente en un PIN fotodiodo de superficie 300 x 300 µm. Datos de calibración de la 
línea X6A (3)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….103 
Tabla 16. Mediciones de la corriente en un PIN fotodiodo de superficie 300 x 300 µm. Datos de calibración de la 
línea X6A (4)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….105 
Tabla 17. Mediciones de la corriente en un PIN fotodiodo de superficie 51 x 51 µm. Datos de calibración de la línea 
X6A……………………………………………………………………………………………………………………………………………….………………………105 
Tabla 18. Mediciones de la corriente en un PIN fotodiodo de superficie 51 x 51 µm. Datos de calibración de la línea 
X4A. ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….….105 
Tabla 19. Mediciones de la corriente en un PIN fotodiodo. Calibración de la línea X4C……………………………………..…105 
Tabla 20. Porcentajes de disminución del flujo al manipular la apertura de los slits de la línea X6A……………………..107 
Tabla 21. Porcentaje de disminución del flujo al atenuar la línea X6A utilizando foils de aluminio…………………….…107 
Tabla 22. Valores de flujo (fotones/segundo) bajo distintas variaciones experimentales (slits y atenuación por foils 
de aluminio) tanto para las líneas X6A, X4A y X4C…………………………………………………………………………………………….….109 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
iii. Lista de ecuaciones 
 
Ecuación 1. Mecanismo de reacción del nitrato frente a los electrones solvatados (De la Mora et al. 2011)………….32 
Ecuación 2. A Mecanismo de formación del radical hidroxilo y B, reacción del ascorbato/ácido ascórbico frente a los 
radicales hidroxilo (De la Mora et al. 2011)…………………………………………………………………………………………………………….33 
Ecuación 3. Cálculo del flujo de rayos X a partir del valor de corriente detectada (ampereres) por un PIN fotodiodo 
de superficie 300 x 300 µm. Considerando un factor de conversión de 377, derivado de la energía de los fotones 
incidentes, así como de los coeficientes de atenuación y absorción de rayos X en el silicio puro………………………….101 
 
iv. Abreviaturas 
 
MCOs oxidasas multicobre 
MCO-Tth oxidasa multicobre de Thermus thermophilus 
PDB Banco de datos de Proteínas (por sus siglas en ingles) 
MGy 1 x 106 (Gy); unidad S.I. para indicar la dosis de radiación ionizante absorbida 
MPD 2-metil-2,4 pentanodiol 
EPR resonancia magnética paranuclear (pos sus siglas en ingles) 
CTC centro trinuclear de cobre 
IP intermediario peróxido 
IN intermediario nativo 
ER estado de reposo 
ETR estado totalmente reducido 
keV 1 x 106 (eV); unidad S.I que representa la energía cinética que adquiere un electrón cuando es 
acelerado por una diferencia de energía potencial de 1 voltio 
IPTG Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido 
PDAs parámetros de desplazamiento atómico 
SDS-PAGE electroforesis en geles de poliacrilamida y SDS (por sus siglas en ingles) 
Tris Tris(hidroximetil)aminometano 
HEPES Acido 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazina etansulfonico 
 
 
 
 
 
 
14 
 
v. Resumen 
Las oxidasas multicobre (MCOs por sus siglas en ingles) son enzimas que contienen iones cobre, los 
cuales tienen un papel central en la catálisis de estas enzimas, interviniendo en la oxidación de diversos 
sustratos y generando una transferencia de electrones a un átomo de oxígeno para su conversión en 
agua con la adición de protones, todo esto bajo un mecanismo de reacción catalítica, que si bien ha sido 
profusamente estudiado en diversos sistemas, aun no se encuentra caracterizado en su totalidad. 
Adicionalmente, es muy común que las estructuras cristalográficas de las MCOs resulten en la pérdida, 
parcial o total, de ocupación en uno o varios de los iones cobre. En nuestro grupo de trabajo se ha 
determinado la estructura cristalográfica de la oxidasa multicobre de Thermus thermophilus (MCO-Tth) 
(código PDB 2XU9). Sin embargo, la exposición a los rayos X produce modificaciones específicas en la 
estructura: la ocupación de uno de los cuatro cobres catalíticos en esta metaloenzima, el CuT2, está 
particularmente afectada, inclusive en dosis de radiación absorbida muy bajas (0.7 MGy) (Figura 1). Por 
lo tanto en este proyecto se exploraron distintas condiciones como el uso de moléculas 
radioprotectoras, el uso de líneas de alta energía en fuentes sincrotrónicas, así como laatenuación en 
líneas estándar del flujo de rayos X. Todo lo anterior con el fin último de preservar la ocupación de los 
cobres en estudios cristalográficos en MCOs, particularmente del CuT2 en los cristales de la MCO-Tth. 
La catálisis en metaloenzimas depende de la preservación de los metales, y al escindirlos durante los 
experimentos de difracción de rayos X, pueden producirse cambios grandes o sutiles en la estructura que 
pueden conducir a conclusiones biológicas equivocadas. Una vez conseguido este objetivo pretendemos 
utilizar las estructuras generadas para intentar comprender de manera más amplia el mecanismo 
catalítico de este grupo de enzimas. Esta última posibilidad se basa en el hecho de que en nuestro 
laboratorio se logró describir parcialmente el mecanismo catalítico de la MCO-Tth, lo anterior utilizando 
solamente datos cristalográficos y controlando la dosis depositada en los cristales. Sin embargo, la 
temprana escisión del CuT2, debida a la susceptibilidad diferencial de los iones cobre en la MCO-Tth ante 
la dosis de radiación depositada y a los flujos electrónicos concomitantes limitó el análisis del 
mecanismo. Los resultados de este trabajo muestran la complejidad del sistema, sin embargo se puede 
señalar que el proceso de daño a los CuT2 y T3´ es un proceso multifactorial, el cual puede ser evitado 
mediante distintas estrategias; al reducir la dosis de radiación depositada a valores inferiores a 0.3 MGy, 
mediante colectas de datos con tiempos cortos, para así evitar el aumento en la probabilidad de daño 
secundario y mediante la pre-reducción del sistema de cobres con agentes reductores. También se 
 
 
15 
 
plantea el hecho de que el sistema cristalino de la MCO-Tth pueda encontrarse protegido del daño por 
radiación mediante el efecto de scavenger del MPD. 
 
 
Figura 1. Comparación de la estructura de la MCO-Tth bajo distintas dosis de radiación absorbida. La estructura A, 
resulta de la dosis más baja de radiación depositada (0.7 MGy), en la cual se observa la presencia de los cuatro 
iones cobre (la ocupación del CuT2 es de 0.13). La estructura B, muestra el daño a una dosis de radiación absorbida 
mayor (1.4 MGy), en la cual se presenta la depleción total del CuT2 del centro trinuclear de cobre (CTC). Cálculos 
considerando un flujo de 4.2x1010 fotones/segundo (Serrano-Posada & Rudiño-Piñera, en preparación). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
vi. Abstract 
Multicopper oxidases (MCOs) are a group of enzymes that contain copper ions, which play a central role 
in the catalysis of this enzymes, intervening in the oxidation of different substrates through the 
transference of electrons to an oxygen atom to generate water with the presence of protons, all this 
under a catalytic reaction mechanism, although it has been extensively studied in various systems, is not 
yet fully characterized. Previous observations showed that crystallographic structures of MCOs are 
commonly affected by X-rays, resulting in a partial or total loss of occupancy in one or more copper ions. 
The crystallographic structure of the Thermus thermophilus multicopper oxidase (MCO-Tth) (PDB code: 
2XU9) has been determined successfully by our group, however the exposure to X-rays produces specific 
modifications in the coordinates: the occupancy of one of the four catalytic coppers; CuT2, is particularly 
affected even at low absorbed dose (0.7 MGy). In this work several approaches were evaluated in order 
to preserve the occupancy of the metallic centers, especially for CuT2 in the MCO-Tth. The strategies 
employed, included the use of radioprotectant molecules, high and low synchrotron energy data 
collection as well as attenuation of the X-ray flux. 
Metalloenzymes catalysis depends on the preservation of their metals, however during X-ray diffraction 
experiments metal elimination may lead to wrong biological conclusions. Once achieved this objective 
we intend to use the generated structures to try to understand more broadly the catalytic mechanism of 
this group of enzymes. This last possibility is based on the fact that in our laboratory the catalytic 
mechanism of the MCO-Tth was partially described, using only crystallographic data and controlling the 
dose deposited in the crystals. However early cleavage of CuT2 due to differential susceptibility of 
copper ions in MCO-Tth to deposited radiation dose and concomitant electron fluxes limited the analysis 
of the mechanism. The results of this study show the complexity of the system, however it can be stated 
that the process of damage to CuT2 and T3´ coppers is a multifactorial process, which can be avoided by 
different strategies; by reducing the radiation dose deposited to values as low as 0.3 MGy, by short-time 
data collections to avoid the increase in the probability of secondary damage and by the pre-reduction of 
the copper system. There is also the fact that the crystalline system of the MCO-Tth can be protected 
from radiation damage by scavenger effect of MPD. 
 
 
 
 
 
 
17 
 
1. Introducción 
Las oxidasas multicobre (MCOs) son un grupo de proteínas con secuencias y estructuras similares que 
intervienen en sistemas redox, siempre con la participación de varios iones cobre (Messerschmidt & 
Huber, 1990), catalizando la oxidación de un gran número de compuestos fenólicos (Leontievsky et al. 
1997). En esta familia se incluyen proteínas como las lacasas (p-difenol: di-oxígeno oxidoreductasas, EC 
1.10.3.2), las ferroxidasas, las ascorbato oxidasas así como a la ceruloplasmina entre otras. También se 
denominan proteínas multicobre azules, debido a su color azul característico, el cual se debe a la 
interacción entre una cisteína y uno de sus iones cobre. Estas proteínas se encuentran presentes en 
plantas superiores, hongos, bacterias e insectos participando en la síntesis y degradación de lignina, en la 
respuesta a heridas en plantas, detoxificación, pigmentación, resistencia a concentraciones 
potencialmente letales de cobre así como otros procesos fisiológicos (Mayer et al. 2002; Morozova et al. 
2007). 
Los átomos de cobre en estas proteínas multicobre han sido clasificados en tres tipos (T1, T2 y T3) 
debido a sus propiedades espectroscópicas (Solomon et al. 1996a). Como ya se mencionó con 
anterioridad, la interacción covalente fuerte entre un átomo de azufre de la cisteína que coordina al 
CuT1 genera una transferencia de carga SCys → Cu
+2, la cual proporciona el color azul característico de 
esta familia de enzimas. El CuT2, o cobre normal, no presenta propiedades espectroscópicas, mientras 
que los cobres T3 muestran una máxima absorción cerca de los 330nm, lo anterior debido a que se 
encuentran antiferromagnéticamente acoplados por un hidroxilo (OH-). Los CuT1 y T2 son detectables 
por resonancia paramagnética nuclear (EPR por sus siglas en inglés) (Solomon et al. 1996a). 
El CuT1 se localiza en una cavidad del dominio 3, mientras que el centro trinuclear de cobre (CTC) 
CuT2/T3/T3´ está en la intercara de los dominios 1 y 2. Los residuos que coordinan a estos últimos tres 
iones cobre están distribuidos equitativamente en cada dominio (ocho histidinas, cuatro en cada 
dominio) (Figura 2). Las estructuras cristalográficas reportadas de las MCOs sustentan que se trata de 
moléculas monoméricas cuyos aminoácidos implicados en la unión a los cobres están altamente 
conservados (Kumar et al. 2003). La arquitectura molecular, como ocurre en todas las oxidasas azules de 
cobre, contiene dominios barril-β. El tercer dominio tiene una conformación β-sándwich, así como 
cuatro regiones de alfa hélices cortas resultando en una estructura globular (Ducros et al. 1998) 
 
 
 
18 
 
 
Figura 2. Diagrama esquemático de las MCOs, mostrando la distribución de los dominios estructurales y la relación 
geométrica entre los diferentes iones cobre presentes en esta proteína (Solomon et al. 1996b). 
 
1.1 Mecanismocatalítico 
Las lacasas o MCOs (usados como sinónimo por algunos autores, sin embargo en este trabajo 
denominadas como MCOs) han sido estudiadas ampliamente desde distintas perspectivas, las que 
incluyen puntos de vista bioquímicos, espectroscópicos, así como estructurales por difracción de rayos X. 
Estas enzimas catalizan la oxidación de una amplia variedad de sustratos orgánicos e inorgánicos 
acoplado a la reducción del oxígeno bimolecular a agua, dicha oxidación del sustrato mediante la 
remoción de un electrón a la vez puede llevar a la generación de radicales libres, que en ocasiones dan 
lugar a especies inestables, las cuales tienden a polimerizar para recuperar su estabilidad (Bourbonnais 
et al. 1997). De esta manera, las MCOs acumulan electrones provenientes de reacciones de oxidación 
individuales, cuando se tienen cuatro electrones, la enzima puede transferir estos electrones al oxígeno 
molecular para formar como producto final de la reacción al agua (Andréasson et al. 1976). Los 
electrones son transferidos desde el CuT1 hacia el CTC por un canal de ~13Å, el cual se detalla en el 
apartado de Sitio Activo y Estructura Tridimensional de las MCOs, al llegar Inicialmente el O2 al CTC se 
reduce en dos etapas de 2 e- cada una: la primera de ellas genera al intermediario peróxido (IP) y la 
segunda representativa de la enzima totalmente oxidada genera al intermediario nativo (IN), la cual es la 
única forma totalmente oxidada que es catalíticamente relevante. Mientras que la formación del IP es la 
etapa limitante en la velocidad de reacción, el decaimiento del IP al IN es bastante rápido, como 
resultado el IP no puede ser atrapado en la forma silvestre de la holoenzima (enzima con los 4 iones 
cobre presentes) y debido a esto es difícil detectarlo bajo condiciones normales de reacción (Yoon et al. 
2007). Estructuralmente en el IP un átomo de oxígeno del peróxido está coordinado al CuT3, mientras el 
otro átomo de oxígeno se coordina al CuT2 y al mismo tiempo interactúa con el CuT3´. En la reacción del 
 
 
19 
 
O2 en el CTN, no hay H
+ involucrados y por lo tanto la formación IP es independiente del pH (Yoon et al. 
2007). Por el contrario en la conversión del IP al IN hay H+s involucrados y por lo tanto la reacción de 
ruptura del enlace -O-O- es dependiente del pH (Palmer et al. 2002). En el CTC, un átomo de oxígeno del 
IN está en la mitad del CTC y otro átomo de oxígeno, perteneciente al OH-, esta simétricamente ubicado 
entre los dos cobres T3 (Augustine et al. 2010). Adicionalmente, el IN es precursor del estado de reposo 
(ER) con un OH- coordinado entre los dos CuT3 y una molécula de H2O coordinada al CuT2. Sin embargo, 
el decaimiento del IN al ER no es catalíticamente relevante, porque únicamente ocurre en ausencia de 
electrones (Yoon et al. 2007). Por lo tanto bajo condiciones catalíticas, el IN no se detecta porque 
reacciona rápidamente con el sustrato o agente reductor para formar el estado totalmente reducido 
(ETR) que inicia el siguiente ciclo catalítico, evitando formar así el ER (Augustine et al. 2010). Sin 
embargo, el ER es el estado más común en las estructuras cristalográficas de las MCOs determinadas a la 
fecha, porque el ciclo catalítico de reducción del O2, inducida por rayos X, no es eficiente en el estado 
cristalino y es precisamente esta característica la que ha hecho que este mecanismo pueda ser estudiado 
por cristalografía de rayos X (Hakulinen et al. 2006). Es notable considerar que cuando alguno de los 
cobres se pierde durante este proceso dinámico de transporte de electrones y coordinación de 
intermediarios se ve interrumpida y por tanto el mecanismo catalítico se detiene. 
 
1.2 Sitio activo y estructura tridimensional de las MCOs 
El análisis de la estructura del sitio activo de las MCOs (Figura 3) muestra que el CuT2 y los dos cobres T3 
(CuT3 y CuT3´) están cercanos entre sí formando un CTC (Leontievsky et al. 1997). El átomo de CuT1 está 
presente como Cu+2 en el estado de reposo de la enzima, este se encuentra coordinado por dos 
nitrógenos de dos histidinas y un azufre de una cisteína. La geometría de esta coordinación se describe 
como una coordinación trigonal distorsionada bipiramidal, con una posición axial vacante donde el 
sustrato tiene entrada (Ducros et al. 1998). Mientras que los dos átomos de CuT3 están coordinados 
cada uno por tres histidinas (Ducros et al. 1998), el CuT2 está coordinado solamente por dos histidinas, 
lo cual convierte a este último ion metálico en el más lábil de los cuatro cobres con respecto a su energía 
de coordinación, esta afirmación quedo en evidencia en las estructuras cristalográficas de las MCOs de 
Coprinus cinereus (código PDB 1HFU) y Trametes hirsuta (código PDB 3V9C), en las que el CuT2 se 
encontró en ocupaciones fraccionales (Ducros et al. 1998). Es importante mencionar que el CuT2 se 
encuentra localizado en el canal de salida de las moléculas de H2O (de manera específica a un canal de 
25Å de longitud), producto del ciclo catalítico de la reducción del O2 y por lo tanto parecería estar más 
expuesto al daño por dosis de radiación absorbida, debida a electrones hidratados que se generan como 
 
 
20 
 
resultado de la radiólisis de moléculas de agua en los experimentos de difracción de rayos X. De esta 
forma y con el objetivo de determinar la dosis de radiación mínima requerida para la eliminación 
completa del CuT2 en la estructura de la MCO de Coriolopsis gallica (C. gallica), De la Mora y 
colaboradores (2012), mediante el estudio de estructuras a baja y alta dosis de radiación, demostraron 
que el CuT2 es escindido de las estructuras cristalográficas a una dosis de radiación absorbida de entre 
0.6 y 4 MGy. 
 
 
Figura 3. A Estructura general de la oxidasa multicobre de Thermus thermophilus (MCO-Tth) (código PDB 2XU9) y B, 
representación estructural del sitio activo catalítico donde se muestra al cobre T1, el cual es responsable de la 
remoción inicial de un electrón del sustrato, y más abajo los CuT2, CuT3 y CuT3´ formando el CTC, responsables de 
la reducción del oxígeno molecular en agua. 
La oxidación del sustrato ocurre en una pequeña cavidad cercana al CuT1 y la reducción del O2 en el CTC 
(Leontievsky et al. 1997). Los cuatro electrones extraídos a partir de los sustratos deben ser transferidos 
del sitio del CuT1 al CTC que se encuentran a una distancia de ~13Å. El transporte se realiza por la vía 
CuT1-Cys455-His444 o His446-CuT3 (los números entre paréntesis indican la numeración en la MCO-Tth): la 
conexión más directa entre los sitios de oxidación del sustrato y de reducción del oxígeno molecular 
(Figura 4). Dos canales de solvente generan un acceso al CTC, en donde uno de los canales le permite al 
O2 difundir hasta el CTC específicamente en los dos cobres T3 donde se lleva a cabo su reducción, 
mientras que el otro canal permite la salida del producto final agua, desde el CuT2 hasta el exterior de la 
proteína (Bento et al. 2005). 
De la Mora y colaboradores, (2012) en una MCO de C. gallica y Quintanar y colaboradores, (2005) en una 
MCO de Saccharomyces cerevisiae (Fet3p) observaron la presencia de dos residuos ácidos conservados 
 A B 
 
 
21 
 
en la segunda esfera de coordinación de cada una de sus respectivas modelos de trabajo, los cuales se 
encuentran localizados en las cercanías del CTC, los cuales desarrollan un papel fundamental durante la 
catálisis del O2: Glu487 en Fet3p y Asp452 en Cg L, localizados en las cercanías del CTC ,donando los 
protones necesarios en el ciclo catalítico, mientras que el Asp94 en Fet3p y Asp76 en C. gallica, permite la 
desprotonación del agua unida al CuT2, y de esta manera, direccionando la transferencia de electrones 
del CuT1 al CTC. Es preciso señalar que de la misma forma que sucede con otras MCOs azules, la MCO-
Tth presenta estos residuos ácidos conservados. El Glu451 numerado así en la MCO-Tth, es el encargadode donar los protones necesarios para la reducción del O2, mientras que el Asp106 no parece estar 
implicado en la trasferencia de H+ al CTC, sin embargo desempeña un papel importante en la 
estabilización de las especies OH-/H2O coordinadas al CuT2 vía puentes de hidrógeno con una molécula 
de H2O estructural, liberando el producto final que es agua del CuT2. 
 
Figura 4. A Residuos que coordinan a los cuatro iones cobre dentro de la MCO-Tth, así como residuos que se ha 
propuesto están involucrados en la transferencia de protones hacia el sitio activo, el Asp106, el cual también se ha 
propuesto, desempeña un papel importante en la estabilización de las especies OH-/H2O vecinas al CuT2 y B, 
representación del mecanismo catalítico de la MCO-Tth. 
A B 
 
 
22 
 
1.3 Generalidades de la difracción por rayos X 
La gran mayoría de estructuras 3D de macromoléculas son determinadas mediante el uso de 
cristalografía (el 85% de los depósitos en el PDB fueron obtenidos por esta técnica y el 100 % de las 
MCOs o lacasas), la cual emplea la difracción de rayos X en cristales. Cuando un cristal es expuesto a una 
fuente de rayos X, estos últimos pueden ser absorbidos (dispersión inelástica), difractados por los 
arreglos periódicos y ordenados de electrones presentes en los átomos del cristal (dispersión elástica) 
(2% de interacción entre los rayos X y el cristal de proteína), o simplemente pasar de largo por el cristal 
(98% de los rayos X incididos) (Nave, 1995 y Garman & Owen, 2006). El fenómeno de dispersión elástica 
denominado también como dispersión de Thomson corresponde al 0.16% del total de rayos X incididos y 
es responsable de la generación de un patrón de difracción el cual permite la determinación final de la 
estructura cristalina 3D de la proteína (Figura 5). Sin embargo, durante los experimentos de difracción, 
los rayos X pueden perder parte de su energía por interacción con la materia mediante fenómenos 
físicos como la dispersión Compton, la cual corresponde también aproximadamente al 0.16% del total de 
radiación incidida sobre el cristal, dicho efecto deposita cantidades mínimas de energía comparado con 
el efecto fotoeléctrico, el cual corresponde aproximadamente al 1.68% del total de rayos X incididos, en 
dicho efecto la energía incidente es absorbida totalmente y un electrón de capa externa es liberado 
(efecto de fotoionización), los porcentajes presentados son considerando un fotón incidente con energía 
de 12.4 keV (0.9998 Å) (Carugo & Carugo, 2005). 
 
1.4 Daño por radiación 
El efecto fotoeléctrico es la interacción dominante en las energías de interés para la cristalografía de 
rayos X, la energía de este fotoelectrón liberado es dependiente de la energía del fotón incidente, la cual 
es disipada totalmente en el cristal, contribuyendo de esta forma en ocasiones a uno o varios de los 
siguientes eventos: ruptura mecánica de la matriz del cristal, calentamiento, eventos de ionización de 
residuos y escisión de enlaces, dañando a los cristales, especialmente cuando fuentes de radiación de 
alta intensidad son utilizadas (Carugo & Carugo, 2005 y Murray et al. 2004). 
Este proceso de daño por radiación debido principalmente al efecto fotoeléctrico es un componente en 
ocasiones indeseable pero inherente a la colecta de datos en cristalografía de rayos X, el cual resulta en 
ocasiones en detalles estructurales erróneos, impactando de manera negativa en el modelo final tanto 
de manera específica como general (Owen et al. 2006). Así la estructura 3D generada en los 
 
 
23 
 
experimentos podría diferir de la estructura de la molécula de la proteína nativa (Carugo & Carugo, 
2005). 
 
Figura 5. Fenómenos físicos involucrados en la exposición de un cristal a los rayos X. Dispersión elástica o de 
Thomson, inelástica o de Compton, efecto fotoeléctrico y generación de especies radiolíticas. 
 
En términos generales el daño por radiación puede ser separado en daño primario y secundario. El daño 
primario resulta de la absorción directa de los rayos X, es decir de la dispersión inelástica, la cual produce 
un flujo de electrones secundarios propagados desde sus sitios de creación principalmente por 
transferencias tipo túnel (Messer et al. 2000), así como una cascada de reacciones radioquímicas las 
cuales ocurren en una escala de tiempo de femtosegundos (Teng & Moffat, 2000), donde la energía 
absorbida no es distribuida de forma uniforme y por tanto es depositada en cantidades de 20-100 eV, en 
áreas que inicialmente pueden ser de 50Å de diámetro; estas regiones se denominan “spurs” o espuelas 
(Ravelli & McSweeney, 2000). El daño secundario involucra principalmente el movimiento por difusión 
en el solvente de radicales y electrones de baja energía, los cuales afectan a cadenas laterales, 
estructuras secundarias e incluso a moléculas completas (Warkentin & Thorne, 2010). A pesar de que no 
se conozca con certeza la probabilidad relativa de que ocurran estos eventos, se ha estimado que cada 
fotón absorbido puede producir aproximadamente 500 eventos de ionización a partir de fotones a 12 
keV (O´Neill et al. 2002). El aumento de la energía térmica le permite a los productos reactivos la 
difusión a través del cristal causando daños, esta difusión es además altamente dependiente del tiempo 
(Garman, 1999). La interacción entre la radiación ionizante y el alto contenido de solvente en cristales de 
 
 
24 
 
proteínas (20-80% v/v) desarrolla un papel significativo en la liberación de radicales libres a partir del 
solvente (radiólisis), dicho fenómeno es responsable de la generación de distintas especies radiolíticas 
(Figura 6), entre las que destacan radicales OH• (radicales hidroxilo), H• (radicales hidrógeno), electrones 
hidratados, así como protones, dichos productos generados en el medio de la proteína reaccionan con 
distintas estructuras de esta, generando daño en su estructura (Burmeister, 2000). Sin embargo, las 
primeras especies formadas por eventos de foto-absorción en el agua son los electrones hidratados así 
como los radicales hidroxilo (Ravelli & McSweeney, 2000). 
 
 
H2O H2O
+• + e- (ionización) 
H2O H2O* (ionización electrónica) 
H2O
+• + H2O H3O
+ + •OH 
e- +nH2O e
-
aq 
H2O* H
• + •OH 
e-aq + H
+ H• 
Figura 6. Especies radiolíticas producidas por el daño primario al agua. Especies dependientes de la temperatura, 
pH y otros factores (Modificado a partir de Ward, 1988). 
 
Este daño generado por la radiación X incidente, el movimiento por difusión, las transferencias 
electrónicas tipo túnel y especies radiolíticas está asociado con la ruptura de enlaces y modificaciones 
estructurales. Estas modificaciones varían dependiendo del ambiente donde se encuentre el residuo 
involucrado, pero ocurren preferentemente y por orden de facilidad de escisión sobre centros metálicos, 
ruptura de puentes disulfuro (Figura 7), descarboxilación de ácidos aspárticos y glutámicos, pérdida de 
hidroxilos en tirosinas y desmetilación de metioninas (De la Mora et al. 2011). 
La interacción de las distintas especies generadas producto de la radiación depende del flujo de fotones 
y el tiempo de vida individual de cada uno de los radicales generados en la proteína, así las reacciones de 
recombinación tienden a ocurrir especialmente con flujos de fotones altos, los cuales deben de ser 
similares o superiores a la tasa de radicales que se pierden (O´Neill et al. 2002). 
Radiación ionizante 
Radiación ionizante 
 
 
25 
 
 
Figura 7. Pérdida de las ocupaciones afinadas de las cisteínas libres y las cisteínas formando puentes disulfuro en 
cristales de la proteína mirosinasa. Se muestra una notable disminución en el porcentaje de las cisteínas formando 
puentes disulfuro al aumentar la dosis depositada (Modificado a partir de Burmeister, 2000). 
 
El daño por radiación a una molécula también puede ser clasificado en base a la generaciónde especies 
involucradas como: A, Daño directo: es el daño a una molécula debido a la dispersión inelástica de los 
rayos X y/o la interacción directa con los electrones primarios y/o secundarios y B, daño indirecto, el cual 
genera modificaciones al cristal de la proteína como consecuencia de la interacción con otras moléculas 
dañadas, sus productos radiolíticos, el alto contenido de solvente en los cristales y los radicales 
generados a partir de este (Kmetko et al. 2011 y De la Mora et al. 2011). 
En proteínas que contienen centros metálicos, los iones metálicos son más susceptibles a la dosis 
absorbida de radiación por rayos X que cualquier otro residuo de aminoácido presente, incluso con bajas 
dosis de radiación depositada (Owen et al. 2006). Esta dosis de radiación depositada en el cristal de 
proteína propicia la generación de dos efectos principales sobre los centros metálicos uno de ellos es la 
reducción en el estado de oxidación de los mismos, debido a su capacidad de aceptar electrones por 
parte de los metales, mientras que el otro impacta como una reducción en la ocupación de los centros 
metálicos (De la Mora et al. 2011 y Carugo & Carugo, 2005). De la Mora y colaboradores (2012), 
observaron que en el caso de las MCOs azules, la geometría de los centros metálicos, así como la 
distancia entre los iones metálicos y sus ligandos varía dependiendo del estado de oxidación de los 
átomos de cobre, sugiriendo que estas alteraciones son catalíticamente relevantes en la unión, 
activación y reducción del O2. En el caso de la MCO-Tth los iones cobre que presenta aparecen 
Átomos de S en cisteínas libres 
Átomos de S en puentes disulfuro 
O
cu
p
ac
ió
n
 
Afluencia de 1015 fotones/mm2 
 
 
26 
 
principalmente reducidos, si estos metales forman parte de centros redox, se puede generar incluso la 
escisión parcial o total del metal, lo que se manifiesta como una reducción en la ocupación de estos 
átomos metálicos y, como resultado de esto, en potenciales modificaciones estructurales producto de 
esta escisión (Figura 8). 
 
 
Figura 8. Pérdida de la ocupación del CuT2 coordinado por dos histidinas en la MCO-Tth, se observa en la imagen A, 
dicho cobre con una ocupación de 0.16 esto después una dosis de radiación acumulada de 0.7 MGy. Al aumentar la 
dosis de radiación hasta 1.4 MGy, imagen B, se observa la escisión total del CuT2 (ocupación 0). (Cálculos 
considerando un flujo de 4.2x1010 fotones/segundo (Serrano-Posada, H., Tesis Doctorado, pág. 65). 
 
Adicional al daño especifico descrito en párrafos anteriores, el cual impacta en el modelado final de la 
estructura, existen otro tipo de efectos negativos que impactan sobre la calidad del cristal, y por tanto 
sobre las estructuras tridimensionales generadas, a este tipo de daño se le denomina de manera 
genérica como daño inespecífico o daño terciario, y es resultado inevitable de la colecta de datos y de la 
exposición del cristal a los rayos X. Este tipo de daño se manifiesta esencialmente como una disminución 
de la calidad global de los datos obtenidos, reducción del poder de difracción del cristal, resolución, 
mosaicismo, así como aumento de los valores B, factores de temperatura o parámetros de 
desplazamiento atómico (PDA) tanto globales como individuales (Figura 9) así como incremento de los 
parámetros y volumen de la celda unitaria. El aumento en el volumen de la celda unitaria debido a la 
absorción de los rayos X, se ha planteado que es debida a las repulsiones electroestáticas entre las 
cargas que se generan por efecto de los electrones durante la exposición (Ravelli et al. 2002). Sin 
embargo, el movimiento propio de las moléculas por el incremento en la temperatura, la generación de 
gases y la radiólisis del solvente también podrían estar involucrados. 
 
A B 
 
 
27 
 
 
Figura 9. Histograma del incremento relativo (%) de los PDAs para las cadenas laterales de distintos residuos en la 
acetilcolinesterasa de Torpedo califórnica (TcAChE) como consecuencia de la irradiación en un sincrotrón. La línea 
horizontal indica el aumento medio de los PDAs de las cadenas laterales. Los números a lo largo del eje x indican el 
número de veces que se repite el residuo en la proteína. Las barras individuales muestran el incremento promedio 
de cada residuo comparando un segundo dataset con un dataset de referencia (Modificado a partir de Weik, et al. 
2000). 
 
Como parte del estudio sobre el efecto de la dosis de radiación depositada en cristales de proteína, así 
como sobre el impacto de la misma en la calidad y vida del cristal, Henderson (1990), mediante 
observaciones en experimentos de microscopia electrónica, y asumiendo que los electrones y los rayos X 
eran similares en su capacidades dañando el orden interno de las proteínas criopreservadas, propuso un 
límite de dosis para los experimentos de cristalografía de proteínas criopreservadas a 77K, definido como 
la dosis de radiación absorbida en la cual el cristal de una proteína pierde la intensidad de sus reflexiones 
a la mitad de su valor original y el cual equivale a 2x107Gy. Años más tarde Owen y colaboradores, (2006) 
recalcularon este límite de radiación tolerado utilizando cristales de ferritina en su forma apo y holo y 
rayos X, considerando que el límite de dosis experimental no puede ser calculado solo en términos de la 
disminución del poder de difracción, cambios en parámetros estadísticos como Rmeas, valor B de la gráfica 
de Wilson, así como la calidad de la densidad electrónica de los residuos dañados fueron considerados, 
obteniendo un número estimado de 3x107Gy y definido genéricamente como “límite de Garman”. 
 
 
In
cr
em
en
to
 r
el
at
iv
o
 d
e 
lo
s 
P
D
A
s 
(%
) 
 
 
 
28 
 
1.5 Preservación de los datos cristalográficos 
Paralelo a la evolución de la cristalografía se han desarrollado distintas técnicas para lograr contender 
contra los daños generados por los rayos X. El primero de estos acercamientos denominado 
criopreservación se desarrolló bajo la premisa de que la difusión de especies radiolíticas producidas a 
partir del solvente que rodea a los átomos de la proteína, disminuye significativamente al disminuir la 
temperatura, evitando así la difusión y reacción de estos radicales y especies radiolíticas con los distintos 
aminoácidos presentes en la proteína. Hoy en día es sabido que la disminución de temperatura en 
cristales de proteína hasta 100 K genera un aumento, en algunos de los casos estudiados, de hasta el 
70% en la tolerancia de la dosis de radiación, comparado con cristales de proteína irradiados a 
temperatura ambiente (298 K), si bien la efectividad depende de la proteína, la fuente y sobre todo el 
flujo de rayos X empleados, el contenido de solvente en el cristal, etc. (Nave & Garman, 2005). Se han 
analizado en varias publicaciones las especies formadas por exposición a los rayos X, así como la 
movilidad de las mismas en distintas condiciones para poder así explicar la efectividad de la 
criopreservación. Se ha descrito la presencia de protones móviles en la forma de hielo amorfo a 
aproximadamente 115K (Fisher & Devlin, 1995) y a pesar de que radicales OH• son atrapados en cristales 
de hielo (Symons, 1999), se ha reportado su movilidad a 77K en cristales de ADN (Lange et al. 1995). De 
la misma forma Jones y colaboradores (1987), así como Rao y colaboradores (1983), mostraron la 
presencia de electrones móviles interactuando con estructuras de la proteína, principalmente puentes 
disulfuro a temperaturas de hasta 77K. 
Debido a la gran aceptación de las técnicas de criopreservación y su adopción en la colecta de datos en 
cristalografía de rayos X, se siguieron desarrollando técnicas que permitieran aumenta la calidad de los 
datos obtenidos. Lo anterior debido a que el simple uso de técnicas de criopreservación y la disminución 
en la difusión de las especies radiolíticas por la reducción detemperatura, en muchos casos no fue 
suficiente para mitigar el daño producido por la radiación en los cristales de proteína, esto considerando 
además que las fuentes sincrotrónicas de rayos X generan flujos cada vez más intensos con la idea de 
emplear cristales más pequeños, pero aumentando al mismo tiempo los daños causados por la dosis 
depositada. Así se llegó al uso de compuestos que introducidos en el medio de la proteína, es decir el 
líquido madre donde crecen los cristales, interaccionan más eficientemente que los átomos de las 
proteínas con las especies radiolíticas, salvaguardando de esta manera a los átomos proteicos. 
 
 
 
 
 
29 
 
1.6 Agentes radioprotectores o scavengers 
De esta manera se empezó a probar el uso de compuestos radioprotectores también denominados 
scavengers como potenciales agentes protectores compatibles con el medio de la proteína, los cuales 
pueden reducir el daño por radiación al menos en dos formas: 1) de manera competitiva, es decir 
compitiendo con la proteína por los radicales libres y productos radiolíticos formados en el solvente y 2) 
de manera regenerativa o restitutiva, reparando daños químicos generados en residuos específicos de la 
proteína (p.ej. transferencia de H+ desde grupos sulfihidrilos a radicales biológicos formados) (Kmetko, et 
al. 2011). 
En la presencia o ausencia de compuestos radioprotectores, los centros producidos por los efectos 
directos de la radiación, ya sea ganancia o pérdida de electrones pueden sufrir eventos de 
recombinación generando un estado excitado el cual puede o no generar daño. Estos procesos de 
recombinación compiten de forma activa con los eventos de migración. La migración de estos centros 
reactivos puede ocurrir mediante efecto túnel (temperatura independiente) o mediante saltos o hopping 
(temperatura dependiente) a sitios específicos dentro de la proteína donde los radicales tienden a 
localizarse. Es preciso considerar que debido a estos eventos de recombinación se debe de proceder con 
cautela en el uso de ciertos agentes radioprotectores ya que estos pueden ser radiolisados generando 
radicales dentro de la proteína, los cuales a su vez pueden reaccionar con la proteína, aunque en un nivel 
de varios órdenes de magnitud menor que los radicales primarios generados (O´Neill et al. 2002). 
Con el fin de mitigar el daño por radiación en cristales de proteínas a temperatura ambiente, el primer 
acercamiento al uso de agentes radioprotectores fue realizado por Zaloga y Sarma (1974) remojando 
cristales de inmunoglobulina en una solución 1.2, 2 y 30mM de estireno y monitoreando su efecto en 
dos reflexiones distintas a temperatura ambiente, encontrando que la concentración de 2mM generó 
una mejora en la resolución pasando de 5.5 Å a 4 Å, además de propiciar un aumento de diez veces el 
tiempo de vida del cristal. Sin embargo, en otros estudios se observó que usando concentraciones más 
altas de estireno y a temperaturas de 100 K, la calidad de la difracción se vio deteriorada debido a la 
polimerización del mismo (Murray & Garman, 2002). Cascio et al. (1984) encontraron que al sustituir el 
agua en la solución madre con 10 a 20% (v/v) de polietilenglicol (PEG) con peso molecular de 4000 a 
20,000 en los cristales de α-amilasa de páncreas de cerdo, canavalina y fructosa 1,6 difosfatasa, se 
generaba una reducción en el daño por radiación evaluado como un aumento de 20 a 90 horas en el 
tiempo de vida del cristal difractado en un generador de rayos X de ánodo rotatorio a 8 keV. Betts (2004) 
remojó cristales de neuraminidasa N9 de virus de influenza con 0.5 M de ascorbato y al analizar los 
 
 
30 
 
mapas de densidad electrónica se encontró que solo existió una protección en los residuos exteriores de 
la proteína, pero no existió protección para aquellos residuos que se localizan en el interior de la misma, 
lo que sugirió para los autores una falta de penetración de las moléculas de ascorbato en el interior de la 
proteína. De la misma forma se evaluó el efecto de la glucosa en concentraciones 0.5 M por 30 minutos y 
12 horas en los mismos cristales de neuraminidasa N9, sin embargo en esta ocasión no se observó un 
efecto favorable, solo se exacerbó el daño generado a los cristales. Murray y Garman, (2002) evaluaron 
de nueva cuenta el efecto radioprotector del ascorbato, esta vez usando a la lisozima, a una 
concentración de 1.0 M y mediante cocristalización, en esta ocasión se observó la protección de puentes 
disulfuro así como una disminución en el incremento de los PDAs, tanto globales como específicos de los 
residuos de cisteína, además de la disminución en el aumento del valor de B de Wilson comparándolos 
contra el cristal nativo. De la misma forma con cristales de lisozima cocristalizados con ascorbato y 
mediante el uso de un microespectrofotómetro, Murray & Garman (2002) observaron el efecto de 
disminución de la señal a 400nm atribuible en el cristal nativo a la formación de radicales anión 
disulfuro, mismo efecto que observaron McGeehan y colaboradores (2009), encontraron la misma 
disminución en la señal a 400nm evaluada en los sistemas disulfuro usando 0.3 M y 1.0 M de ascorbato. 
Sin embargo, al evaluar el compuesto TEMP (2,2,6,6-tetrametil-4-4piperidona) no se observó un efecto 
de protección en los puentes disulfuro estudiados. Más tarde Barker y colaboradores (2009), estudiaron 
el efecto diferencial de los scavengers de electrones solvatados (es
-) y de radicales OH•, 1,4 
benzoquinona y ascorbato respectivamente, ambos en la concentración de 0.5 M donde se observó en 
ambos casos un aumento de la tolerancia a la dosis de radiación absorbida, una disminución en el 
incremento de los valores de B de Wilson, así como en los ADPs globales y específicos de las cisteínas 
involucradas en la formación de puentes disulfuro. De la Mora y colaboradores (2011), investigaron el 
efecto de 0.1 M ascorbato mediante cocristalización y de 0.5 M de nitrato de sodio (ion nitrato) 
remojado durante 4 y 8 minutos en cristales de lisozima, evaluando mediante microespectrofotometría 
la aparición de señales a 580 nm atribuible a los electrones solvatados, así como la aparición de una 
señal a 400 nm la cual corresponde a la formación del radical anion disulfuro RS-SR•´-, encontrando que 
ambos compuestos aumentaban la tolerancia a la dosis de radiación absorbida de manera global y de 
forma específica protegiendo a puentes disulfuro y residuos ácidos. Entre otros de los compuestos que 
se han propuesto y evaluado como posibles agentes radioprotectores están el ácido nicotínico, ácido 
5,5´ditiobis-2-nitro-benzoico, etanol, tiourea, metilmetacrilato, clorostireno, cisteína, glutatión, 2,3- 
dicloro-1,4-naftoquinona, t-butanol, (N-2-hidroxi-etilpiperazina-N´-2-acido etenosulfonico (HEPES), 
tris(hidroxi-metil)aminoetano (Tris), etilenglicol entre otros, con resultados variables dependiendo de la 
proteína y las condiciones donde se evalúen (Macedo et al 2009). En la Tabla 1 se presentan algunos de 
 
 
31 
 
los agentes radioprotectores evaluados en la literatura, así como algunas observaciones de su efecto 
protector en cristales de proteínas. 
 
Tabla 1. Algunos de los agentes radioprotectores evaluados en la literatura y su efecto de protección en cristales de 
proteínas. 
PROTEÍNA RADIOPROTECTOR CONDICIÓN OBSERVACIÓN REFERENCIA 
Neuraminidasa N9 
(Virus Influenza) 
0.5 M Ascorbato 12 
hrs soaking o 
remojado 
1.9M K
3
PO
4
 pH 6.8 / 
40%v/v glicerol 
Protección solo de los residuos 
exteriores de la proteína. 
Betts, 2003. 
Neuraminidasa N9 
(Virus Influenza) 
0.5 M Glucosa soaking 1.9M K
3
PO
4
 pH 6.8 / 
40%v/v glicerol 
Incremento en el daño generado en 
la proteína. 
Betts, 2003. 
Inmunoglobulina 2mM Estireno soaking --- Aumento de la resolución de 5.5 a 4Å 
así como aumento del tiempo de vida 
del cristal por un factor de diez. 
Zaloga, et al. 1974 
Lisozima (HEWL)Solución saturada de 
Estireno mediante 
Cocristalización 
Acetato de sodio y 
NaCl pH 4.5 / Glicerol 
Bajo estas condiciones no se observó 
un efecto detectable 
Murray & Garman, 
2002. 
Lisozima (HEWL) 1.0 M Ascorbato 
mediante 
cocritalización 
Acetato de sodio y 
NaCl pH 4.5 / Glicerol 
Protección de puentes disulfuro, 
mantenimiento de los PDAs y B-
Wilson comparados con el cristal 
nativo. 
Murray & Garman, 
2002. 
Lisosima (HEWL) 1.0 M 1,4 
benzoquinona 
mediante 
cocritalizacion 
Acetato de sodio y 
NaCl pH 4.5 / Glicerol 
Menor daño en las estructuras, 
protección específica en puentes 
disulfuro evitando su ruptura. 
Barker, et al. 2009. 
Lisosima (HEWL) 0.5M Ascorbato 
mediante 
cocritalizacion 
Acetato de sodio y 
NaCl pH 4.5 / Glicerol 
Menor aumento en los valores B-
Wilson comparado con cristales 
nativos así como de los PDAs de las 
Cisteinas. 
Barker, et al. 2009. 
 
Para fines de este proyecto se evalúo el uso de distintos compuestos radioprotectores principalmente 
aquellos asociados con mecanismos de reacción de captura de electrones, electrones hidratados y 
grupos hidroxilo. Entre los compuestos que se evaluaron se encuentran ejemplos clásicos de 
radioprotectores como: 
 
 Nitrato de sodio: Se ha observado que en solución acuosa a temperatura ambiente, esta 
pequeña molécula es un excelente captador del exceso de electrones (Anbar et al. 1967). Este 
compuesto reacciona de forma exotérmica con los electrones solvatados (eaq
-) presentes en el 
medio con una constante de afinidad de k(eaq-)= 9.7 x 10
9 M-1 s-1 (Buxton et al. 1988), de acuerdo 
a la Ecuación 1. De forma significativa y en altas concentraciones también se ha observado que 
el nitrato intercepta a electrones pre-solvatados de forma eficiente con una afinidad de k= 1013 
M-1 s-1 (Hiroki et al. 2002). De la Mora y colaboradores (2011) observaron la reducción dosis 
dependiente del nitrato de sodio correlacionado con la protección generada sobre un puente 
disulfuro vecino. Se presume que esta molécula interacciona con el ambiente propiciado por la 
cascada de electrones generada después de los eventos de difracción e ionización, captando el 
 
 
32 
 
exceso de electrones, dicho compuesto se ha observado se ve reducido por acción de las 
cascadas electrónicas, evitando así la reducción de residuos y centros metálicos dentro de la 
proteína (Figura 10). 
 
 NO3
- + eaq
- → NO3
2- + H2O → NO2 + 2OH
- 
 
Ecuación 1. Mecanismo de reacción del nitrato frente a los electrones solvatados (De la Mora et al. 2011). 
 
 
Figura 10. A-D Reducción dependiente de la dosis absorbida de una molécula de nitrato. La densidad 
electrónica de los aniones nitrato disminuye conforme aumenta la dosis de radiación depositada. Durante 
la reducción del anión nitrato se observa la conservación de la densidad electrónica alrededor del puente 
disulfuro; E-F, a dosis más altas (23.3 MGy) el NO3 reducido desaparece y de manera concomitante con 
esto aparece el daño en el puente disulfuro (De la Mora et al. 2011). 
 
 Acido ascorbico/Ascorbato: molécula radioprotectora, la cual funciona en solución como un 
poderoso antioxidante removiendo del medio radicales OH• de manera efectiva (kOH•= 8 x 10
9 M-1 
s-1) (Schuler et al. 1974). Estas especies OH•, son radicales altamente oxidantes limitados solo 
por la difusión, los cuales remueven electrones al interactuar con ellos, por ejemplo generando 
eventos de descarboxilación en algunos residuos (Hug et al. 2000 y Wisniowski et al. 2002). 
A B C 
D
A. 
E F 
Cys 6 
Cys 27 
Cys 6 
Cys 27 
Cys 6 
Cys 27 
Cys 6 Cys 6 Cys 6 
Cys 27 Cys 27 Cys 27 
NO3 
 
 
33 
 
Cuando se trata de soluciones acuosas la primera especie formada es H2O
•+, la cual rápidamente 
se convierte en un radical hidroxilo, •OH, a través de la reacción indicada en la ecuación 2A. La 
especie •OH ahora reacciona con el ascorbato de acuerdo a la ecuación 2B. 
 
 A H2O
•+ + H2O → H3O
+ + •OH 
 B AH- + •OH → AH• + OH- → A•- + H2O 
 
Ecuación 2. A Mecanismo de formación del radical hidroxilo y B, reacción del ascorbato/ácido ascórbico 
frente a los radicales hidroxilo (De la Mora et al. 2011). 
 
Así mismo se considera que a altas concentraciones este radioprotector podría donar sus 
electrones a sitios inicialmente dañados (De la Mora et al. 2011). Este efecto reparador se ha 
observado sobre radicales triptófano formados, frente a los cuales en solución acuosa y a 
temperatura ambiente el ácido ascórbico ha intervenido como un donador de electrones, 
generando de nueva cuenta la especie neutra triptófano (Wardman, 1989) 
 
 
 
Figura 11. Intensidades relativas sumadas de datasets sucesivos graficados contra la dosis absorbida. El 
decaimiento en la intensidad es exponencial con la dosis, comportamiento de un cristal nativo de lisozima 
comparado con un cristal co-cristalizado con 0.5M de ascorbato (Modificado a partir de Barker et al. 
2009). 
 
In
te
n
si
d
ad
 r
e
la
ti
va
 I/
I 0
 
Dosis Absorbida (MGy) 
nativo nativo 
0.5M ascorbato 
 
 
34 
 
 Conglomerados o “clúster” de tantalio: Tetradecabromuro de hexatantalio, Ta6Br
2+
12: Este grupo 
de moléculas fue diseñado originalmente para realizar experimentos de reemplazo isomórfico 
sobre ASP y ASN, para resolver el problema de fases. Dichos compuestos han demostrado 
experimentalmente ser altamente afectados por la dosis absorbida, se ha observado que en 
cristales remojados con conglomerados grandes de Ta6Br
2+
12, existe una absorción mayor que en 
cristales derivatizados con otros metales como platino o SeMet en varios rangos de energía. El 
clúster es un octaedro regular que consiste de seis átomos metálicos y 12 átomos de bromo a lo 
largo de las doce esquinas del octaedro (Figura 12). El clúster es compacto, de forma casi 
esférica con un radio aproximado de 4.3 Å. Una molécula de Ta6Br
2+
12 agrega 856 electrones a la 
proteína, lo que aumenta de manera considerable el poder de difracción (Knäblein et al. 1997). 
Jones et al. 1984 evaluaron el efecto del FeCN3-6, el cual actúa como un aceptor de electrones 
móviles, observando que los electrones del medio son preferentemente transferidos al átomo 
de Fe, el cual se reducirá, previniendo la transferencia de electrones hacia otras estructuras de la 
proteína. Halliwell & Gutteridge (1999) observaron que compuestos y complejos que presentan 
como parte de su estructura metales de transición actúan como aceptores de electrones libres y 
por esta razón podrían ser utilizados para interaccionar con el ambiente propiciado por la 
cascada de electrones generada después de los eventos de difracción e ionización, captando el 
exceso de electrones, protegiendo de esta forma a residuos y centros metálicos. Sin embargo, se 
advierte que la presencia de estos iones metálicos generan un aumento en la dosis de radiación 
absorbida hasta niveles de radiación acumulada potencialmente dañinos para la proteína 
cristalizada. 
 
 
Figura 12. Tetradecabromuro de hexatantalio, Ta6Br
2+
12. El clúster es compacto, de forma casi esférica con 
un radio aproximado de 4.3 Å. 
 
 
35 
 
 Ciclofanos binucleares de cobre: De la misma forma que los clúster de tantalio, se evaluaran 
nuevos compuestos producto de una colaboración con el Departamento de Investigación en 
Polímeros y Materiales de la Universidad de Sonora y con el Centro de Investigación en 
Alimentación y Desarrollo del mismo estado. Mediante la evaluación de estos compuestos de 
estructura macrocíclica con dos iones cobre coordinados (Figura 13), se combinaran dos de las 
estrategias planteadas para mitigar el daño por radicación una que involucra la presencia de los 
metales presentes en su estructura, los cuales como se ha planteado anteriormente funcionan 
como captadores de electrones y electrones solvatados, por