Produccion-y-caracterizacion-de-anticuerpos-monoclonales-contra-Mycobacterium-arupense-aislada-de-agua-para-uso-y-consumo-humano

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
 FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
 
 
 
PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE 
ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA 
Mycobacterium arupense AISLADA DE AGUAS DE 
USO Y CONSUMO HUMANO 
 
 
 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
QUÍMICO FARMARCÉUTICO BIÓLOGO 
P R E S E N T A : 
JUAN SEBASTIAN CELIS MENESES 
 
 
 
 
MÉXICO, D. F. 2009 
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Anticuerpos Monoclonales 
 
Facultad de Química. UNAM 
 
 
 
 
 
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Facultad de Química. UNAM 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
 
Agradezco a la Dra. Yolanda López Vidal por todo su apoyo y asesoría brindada para la 
realización de la tesis. Al cDr. Hugo Esquivel Solis por su asesoría técnica y apoyo durante todo 
este proyecto. A la M. en C. Jacqueline Larracilla Camacho por su orientación y paciencia en el 
área de proteómica. 
 
 
 
Agradezco a la Universidad Nacional Autónoma de México, a la Facultad de Química y al programa 
PRONABES por el apoyo brindado durante la licenciatura. 
 
 
 
A la Dra. Ingeborg Becker Fauser. Facultad de Medicina. Departamento de Medicina Experimental 
en dónde se realizó la inmunización y mantenimiento de los ratones 
 
 
 
Dra. Annie Pardo. Facultad de Ciencias. Laboratorio de Bioquímica dónde se realizó la 
isotipificación de los anticuerpos. 
 
 
 
El trabajo fue parcialmente financiado por los proyectos: DGAPA-PAPIIT IN209708, “Estudio de la 
respuesta del macrófago activado por IFN-gamma a la infección por Mycobacterium tuberculosis”; 
CONACyT 68729, “Caracterización genética, proteómica e inmunológica de la subcepa Bacilo de 
Calmette-Guerin BCG-México”; Programa Transdiciplinario en Investigación y Desarrollo para 
Facultades y escuelas del Macroproyecto: Nuevas Estrategias Epidemiológicas, Genómicas y 
Proteómicas en Salud Pública SDEI.PTID.05.4 
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Opto por no ser un hombre común. 
Es mi derecho ser un hombre diferente, si puedo. 
Busco la oportunidad, no la seguridad. 
Rechazaré ser un ciudadano cuidadoso, humilde y aburrido al hacer que mi estado y mi nación 
vean por mí. 
Quiero soñar y construir, fracasar y triunfar, nunca ser un número entre aquellas almas tímidas 
y débiles que no han conocido ni la victoria ni el fracaso 
Sé que los llamados placeres momentáneos no pueden confundirme con un estado de felicidad. 
Sé que puedo obtener una medida de satisfacción interna de cualquier trabajo si planeo de 
manera inteligente y lo ejecuto valientemente. 
Sé que si pongo cada gota de fuerza que poseo – física, mental y espiritual- hacia el logro de 
una tarea valiosa, y si caigo extenuado por el camino, la “mano invisible” me alcanzará y me 
levantará. 
Sí, quiero vivir peligrosamente, planear mi proceder con base en riesgos calculados, resolver los 
problemas de cada día para tener paz interior. 
Sé que, si sé como hacer todo esto, sabré cómo vivir y, si sé cómo vivir, sabré cómo morir. 
 
H. B. Zachry 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
こ
の
世
界
で
あ
な
た
に
会
え
た
事
が
嬉
し
か
っ
た
。 
あ
な
た
か
ら
た
く
さ
ん
の
こ
と
を
学
ん
だ
、
あ
り
が
と
う
。 
あ
な
た
の
存
在
、
神
様
に
感
謝
し
て
い
ま
す
。 
 
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DEDICATORIAS 
A mis padres: 
Gracias por todo el apoyo y enorme cariño que me han brindado, por todo lo que me han 
enseñado, por su optimismo, por sus regaños y sobretodo por ser un ejemplo de perseverancia. 
Gracias por confiar en mí, estar conmigo y brindarme lo mejor de ustedes. 
 
A mis hermanas: 
Mis dos amadas hermanas Ana Olivia y Mayra Mónica, por tolerarme, por estar cerca, por 
preocuparse, por enseñarme y escucharme. Estoy muy agradecido de compartir esta vida con 
ustedes. 
 
A mi familia: 
Ti@s, prim@s, sobrin@s porque sin su apoyo no estaría hoy aquí. Gracias por trabajar conmigo, 
escucharme, aconsejarme, reírse y disfrutar conmigo todo este trayecto. Saben que son muy 
importantes para mí. 
 
A mis otros hermanos: 
Yoshino, Sakura, Judith, Nehi, Hine, Heni, Tania, Aki y Hide, por hacer esta vida divertida, por 
preocuparse por mí y no permitir que me rindiera. 
 
A mis amigos: 
Luz, Ere, Raúl, Karla, Gaby, Karen, Alicia, Tania, Myrna, a toda la banda pesada, por hacer 
placentera esta estancia. Con cada uno viví momentos muy especiales y siempre se quedarán 
grabados en mi corazón 
 
A l@s chic@s: 
Karina, Tere, Paty, Rox, Adriana, Jacqueline, Martha, Iliana, Gustavo, Gaby, Alicia, Karen, Alma, 
Alex, Mauricio, Paco, Erick, Lulú, Melissa, Elizabeth, Xavier y Hugo por hacer esta estancia tan 
agradable, por todo su apoyo y asesoría. 
 
A todos mis compañeros del Programa de Inmunología Molecular Microbiana pos su apoyo 
incondicional y ayuda. 
 
 
 
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INDICE 
 
 Página 
Resumen VII 
Abreviaturas VIII 
1. INTRODUCCIÓN 
1.1 Género Mycobacterium 1 
1.2 Tuberculosis 2 
1.3 Micobacterias No Tuberculosas 4 
 1.3.1 Generalidades 4 
 1.3.2 Pared celular 6 
 1.3.3 Identificación 8 
 1.3.4 Epidemiología 11 
 1.3.5 Micobacteriosis 12 
1.4 Mycobacterium arupense 13 
1.5 Anticuerpos Monoclonales 14 
 1.5.1 Respuesta humoral 14 
 1.5.2 Anticuerpos 15 
 1.5.3 Generación de Anticuerpos Monoclonales 17 
 1.5.4 Ventajas y desventajas 19 
 1.5.5 Aplicaciones de Anticuerpos Monoclonales 20 
2. JUSTIFICACIÓN 21 
3. OBJETIVOS 22 
4. OBJETIVOS PARTICULARES 22 
5. MÉTODOS 
5.1 Caracterización de Mycobacterium arupense 23 
 5.1.1. Características macroscópicas y microscópicas 23 
 5.1.2. Curva de crecimiento 23 
 5.1.3 Obtención de proteínas de extracto celular de M. arupense por 
sonicación 
23 
 5.1.4. Proteoma de M. arupense por electroforesis 2D 24 
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5.2. Inmunización 26 
5.3 Análisis del suero de los ratones inmunizados mediante ELISA 27 
5.4. Fusión, Selección y Proliferación de Hibridomas 28 
 5.4.1 Células de mieloma 28 
 5.4.2 Esplenocitos 28 
 5.4.3 Fusión 28 
 5.4.4 Selección y Clonaje 29 
 5.4.5 Cosecha 29 
 5.4.6 Selección de hibridomas productores de anticuerpos por el 
método de ELISA por quimioluminiscencia 
30 
5.5 Caracterización de Hibridomas 30 
 5.5.1 Determinación de Isotipo 30 
 5.5.2 Reacción cruzada 31 
6. RESULTADOS 32 
7. DISCUSIÓN 44 
8. CONCLUSIONES 49 
9. PERSPECTIVAS 50 
9. BIBLIOGRAFÍA 51 
ANEXO I 57 
ANEXO II 59 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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RESUMEN 
 
 
Antecedentes: Las micobacterias no tuberculosas están distribuidas ampliamente en 
diferentes ecosistemas. En los últimos años se ha observado un incremento en infecciones 
por MNT tanto en sujetos inmunocompetentes como inmunocomprometidos. Hasta el 
momento no hay evidencia de la transmisión de MNT de persona a persona por lo cual se 
propone el agua como principal vehículopara la transmisión. Actualmente, se han descrito 
más de 138 especies de micobacterias y algunas de ellas, como M. arupense, se asocian 
con patologías por lo que su identificación, aislamiento y caracterización requieren de 
herramientas rápidas y sencillas. Actualmente, la única forma de diferenciar a M. 
arupense es por su secuencia de los genes: 16S DNA ribosomal, hsp65 y rpoB, por lo que 
la producción de anticuerpos monoclonales puede ser una herramienta útil para la 
identificación de esta especie o bien para determinar la presencia de cepas de MNT por 
compartir epitopes comunes. 
Objetivo Producir y caracterizar anticuerpos monoclonales contra M. arupense aislada de 
agua para uso y consumo humano. 
Metodología A partir de diferentes cepas de MNT inmunizadas en ratones hembras 
Balb/C se seleccionó la cepa y el ratón que produjo la mayor respuesta humoral para 
realizar la fusión de los esplenocitos con células de mielonma SP2/0. Los hibridomas 
fueron separados y seleccionados mediante la técnica de ELISA para su posterior 
expansión y caracterización. El proteoma de M. arupense se realizó como parte de la 
caracterización de la cepa estudiada. 
Resultados Se seleccionaron seis hibridomas productores de anticuerpos capaces de 
reconocer a M. arupense, siendo del isotipo IgG2; las clonas Ma2D10 y Ma1D7fueron 
probada para determinar la reactividad cruzada con otras cepas de MNT, M. tuberculosis, 
M. bovis BCG y M. microti, obteniendose el mayor reconocimiento para M. arupense y una 
reactividad cruzada de 50, 20, 20 y 25%, respectivamente. 
Conclusiones Se produjeron y caracterizaron anticuerpos monoclonales contra M. 
arupense y muestran reactividad cruzada contra otras micobacterias 
 
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ABREVIATURAS 
 
ADN Ácido desoxiribonucleico 
ARN Ácido ribonucleico 
BAAR Bacilo Ácido Alcohol Resistente 
BCG Bacilo de Calmette-Guèrin 
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium 
DMSO Dimetil sulfóxido 
DO Densidad Óptica 
DTT Ditiotreitol 
ELISA Enzime linked inmunosorbent assay 
G Gravedad 
ｈ Hora 
HAT Hipoxantina-Aminopterina- Timidina 
H2O2 Peróxido de Hidrógeno 
HT Hipoxantina-Aminopterina 
Ig Inmunoglobulina 
IAA Iodoacetamida 
M Molaridad 
MAb Anticuerpo monoclonal 
MAC Complejo M. avium-M. intracellulare 
MAIS Complejo M. avium-M. intracellular- M. scrofulaceum 
mg Miligramos 
min Minutos 
mL Mililitros 
mM Milimolar 
MM Masa Molecular 
MTB Complejo M. tuberculosis 
MNT Micobacterias no tuberculosas 
NaCl Cloruro de Sodio 
nm Nanómetros 
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PEG Polietilen glicol 
pI Punto Isoeléctrico 
OADC Ácido oleico, Albúmina- Dextrosa-Catalasa 
OMS Organización Mundial de la Salud 
PPD Derivado Proteico Purificado 
rpm Revoluciones por minuto 
ｓ Segundos 
SDS-PAGE Electroforesis en Gel de Poliacrilamida-Dodecil 
Sulfato de Sodio 
UV Ultravioleta 
V Volts 
VIH Virus de la Inmunodeficiencia Humana 
ZN Tinción Ziehl-Neelsen 
% Porcentaje 
g Microgramos (1X10-6 g) 
m Micrómetro (1X10-6 m) 
ºC Grados Celsius 
 
 
 
 
 
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1. Introducción 
 
1.1 Género Mycobacterium 
 
El género Mycobacterium se encuentra ubicado dentro del orden de los 
Actinomycetales y es el único género de la Familia Mycobacteriacea (Figura 1). Las 
especies de este género tienen un elevado contenido de G+C (61 a 71%, excepto M. 
leprae que contiene 55%) que es una característica compartida con otros géneros 
relacionados que también contienen ácidos micólicos en la pared celular, como Gordonia 
(63-69 %mol), Tsukamurella (68-74 % mol), Nocardia (64-72 %mol) y Rhodococcus (63-
73% mol) (1, 9). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1: Ubicación taxonómica de Mycobacterium 
 
 Las micobacterias son microorganismos aeróbicos (con excepción de algunas 
especies que pueden crecer en atmósferas con oxígeno reducido), no esporuladas, sin 
movilidad, pleomórficas (curvas y/o rectas), miden de 0.2-0.8 µm de ancho por 2-7 µm de 
largo sin cápsula y no presentan una agrupación característica. (1, 2). Contienen una 
pared celular gruesa con un elevado contenido en lípidos lo que le confiere el 60% del 
peso seco. 
 
La morfología colonial varía entre especies, de lisa a rugosa, con o sin pigmento 
(amarillas, naranjas o raramente rosas) 
Dominio: Bacteria 
 Clase: Firmicutes 
 Subclase: Actinobacteria 
 Superorden: Actinobacteridae 
 Orden: Actinomycetales 
 Suborden: Corynebacterineae 
 Familia: Mycobacteriaceae 
 Género: Mycobacterium 
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Dentro del género Mycobacterium están descritas más de 130 especies (3), las 
cuales se clasificaron en tres grupos de acuerdo a la función de la entidad clínica 
producida. 
i. Complejo M. tuberculosis (MTB) causante de la tuberculosis, lo constituyen 
las especies M. tuberculosis, M. bovis, M. canetii, M. africanum y M. microti. 
ii. M. leprae, agente causal de la lepra 
iii. Micobacterias no tuberculosas que causan micobacteriosis 
 
1.2 Tuberculosis 
 
La tuberculosis se define como una enfermedad infecto-contagiosa que se identifica 
por la presencia de lesiones semejantes a tubérculos y necrosis caseosa. Afecta 
principalmente el pulmón y es causada por un grupo de micobacterias conocidas como 
“complejo MTB”, el cual consiste en micobacterias con un 99.9% de identidad a nivel de 
nucleótidos y secuencias idénticas de ARN ribosomal 16S, pero difieren en su hospedero, 
fenotipo y patogenicidad. De esta manera las especies M. tuberculosis, M. canetti y M. 
africanum, tienen como hospedero al humano; mientras que M. pinnipedii y M. microti 
infectan roedores; M. caprae cabras y M. bovis vacas (4). 
 
 M. tuberculosis es el principal agente causal de la tuberculosis humana, fue 
descubierto por Robert Koch en 1882, al aislar la bacteria de lesiones tuberculosas de 
animales infectados, por lo que también se le conoce como el „bacilo de Koch‟. 
 
M. tuberculosis se transmite de persona a persona por vía aérea, al toser o 
estornudar, ya que se generan aerosoles que se conforman de pequeñas gotas de saliva 
las cuales contienen abundantes bacilos (Figura 2). La tuberculosis se manifiesta 
generalmente en su forma pulmonar pero también afecta a otros órganos, como ganglios 
linfáticos, riñón, oviductos, epidídimo, esqueleto, meninges, intestino y otros sitios; 
asociada o no, al proceso pulmonar. En la infección secundaria se disemina por vía 
hematógena e infecta simultáneamente diversos órganos. En todos los sitios la contención 
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de la infección se da por la formación de una estructura organizada denominada 
“granuloma tuberculoso” (5, 6, 7). 
 
 
Figura 2. Vía de transmisión de la tuberculosis. La transmisión se 
realiza principalmente de persona a persona por la exposición a un 
paciente con tuberculosis pulmonar activa. Tomada de 
www.cpmc.columbia. 
 
La tuberculosis representa un serio problema de salud a nivel mundial, ya que se 
estima que anualmente se infectan de 8 a 10 millones de personas y mueren de 2 a 3 
millones (figura 3). Debido a que hace unos años hubo aumento en el número de casos 
de tuberculosis, en abril de 1993 la Organización Mundial de la Salud (OMS) declaró el 
estado de emergencia global contra la tuberculosis. 
 
Un diagnóstico presuntivo se realiza con el Derivado Proteico Purificado (PPD por 
sus siglas en inglés), pero se han observado falsos positivos lo cual se debe a que el 
PPD contiene una mezcla de antígenos micobacterianos pobremente definidos; los cuales 
son compartidos con otras micobacterias por lo que una reacción falsa positiva podría serocasionada por antígenos compartidos con la vacuna de M. bovis BCG o por antígenos 
compartidos por micobacterias no tuberculosas (22, 23). 
 
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http://www.cpmc.columbia/
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100-299
300 ó más
No estimado
0-24
25-49
50-99
 
Figura 3: Distribución mundial de la tuberculosis. Casos de tuberculosis 
por 100 000 habitantes estimados para el año 2005. OMS, 2007. 
 
1.3 Micobacterias No Tuberculosas 
 
1.3.1 Generalidades 
 
Las micobacterias no tuberculosas han sido denominadas de diferente forma a lo 
largo de los años, Pinner denominó a estos microorganismos como micobacterias atípicas 
por la creencia de que eran cepas de M. tuberculosis inusuales (8), otras denominaciones 
son: anónimas, no clasificadas, ambientales, oportunistas, micobacterias diferentes al 
bacilo de la tuberculosis (MOTT por sus siglas en inglés) y micobacterias no tuberculosas 
(MNT) que es el término acuñado por la Asociación Americana de Tórax (10). 
 
Las MNT comprenden todas aquellas micobacterias que no forman parte del 
complejo MTB ni a la especie M. leprae distinguiéndose por ser patógenos no obligados y 
encontrarse en el ambiente como saprófitos, comensales y simbiontes (11, 12). Están 
distribuidas en una gran variedad de ecosistemas en regiones templadas y tropicales; han 
sido aisladas de una amplia variedad de reservorios ambientales: agua, suelo, aire, 
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protozoarios, animales, humanos, plantas y alimentos (13, 14). Se sugiere que la 
transmisión es por ingestión, inhalación e inoculación de fuentes naturales y hasta el 
momento no se ha demostrado la transmisión de persona a persona (15). 
 
Existen varios reportes que evidencian la presencia de micobacterias en agua para 
uso y consumo humano, en sistemas de agua de hospitales y clínicas, suministros de agua 
de hemodiálisis, sistemas industriales de agua caliente, máquinas de hielo, piscinas y 
construcciones para suministro de agua dañados. Las especies M. avium, M. chelonae, M. 
fortuitum, M. gordonae, M. kansasii y M. xenopi. fueron detectadas con mayor frecuencia 
(15, 16). 
 
En los últimos 50 años se han propuesto diferentes clasificaciones para las 
micobacterias. La clasificación más común es la propuesta por Runyon en 1959 con base 
en su velocidad de crecimiento y en la capacidad de sintetizar pigmento no hidrosoluble 
(13). En base a su velocidad de crecimiento se clasifican como micobacterias de 
crecimiento rápido y lento. Las micobacterias de crecimiento rápido forman colonias en 
menos de 7 días y esto se debe a que contienen dos cistrones 16S rRNA (excepto M. 
chelonae y M. abscessus que sólo tienen un cistrón) por otra parte las micobacterias de 
lento crecimiento requieren 7 días o más para formar colonias y contiene un solo cistrón. 
La presencia de un solo cistrón también confiere resistencia innata a una amplia variedad 
de agentes antimicrobianos (12). La producción de pigmento está en relación con la 
exposición a la luz: 
a) Fotocromógenas si la producción depende de la luz 
b) Escotocromógenas si es independiente de la luz 
c) No cromógenas si no producen pigmento 
 
De esta clasificación surgieron cuatro grupos de trascendencia clínica: Grupo I 
(fotocromógenas), Grupo II (escotocromógenas), Grupo III (no cromógenos) de crecimiento 
lento y Grupo IV (no cromógenas) de crecimiento rápido (Tabla 1). Aunque esta 
clasificación tiene cierta utilidad, actualmente, con la aparición de nuevas especies y las 
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diferentes características parece ser que se requiere un mejor método para su 
clasificación. 
 
Tabla 1: Clasificación de Runyon de algunas especies de MNT 
CLASIFICACIÓN DE MICOBACTERIAS NO TUBERCULOSAS 
GRUPO 
RUNYON 
DEFINICIÓN ESPECIES PATOGENICIDAD FRECUENCIA 
DE 
AISLAMIENTO 
I Crecimiento lento y 
fotocromógenos: formación 
de pigmento amarillo si se 
pone a la luz 
M. kansasii 
 
M. marinum 
Generalmente 
patógeno 
Frecuente 
 
Raro 
II Crecimiento lento y 
escotocromógenos: 
Formación de pigmento 
amarillo, naranja a rojo, si 
se expone a la luz y 
también en la oscuridad 
 
M. gordonae 
 
M. szulgai 
 
Non patógenos 
 
Generalmente 
patógeno 
 
Frecuente 
 
Raro 
III Crecimiento lento y no 
cromógenos: Pigmentación 
muy lenta o ausente 
Complejo M. 
avium-
intracellulare* 
 
Patógeno 
 
Frecuente 
IV Micobacterias de 
crecimiento rápido 
M. fortuitum** 
M. 
chelonae** 
A veces 
patógeno 
Frecuente 
*También se conoce como complejo MAIS: M. avium-intracellulare-scrofulaceum 
**También se conoce como complejo M. fortuitum-chelonae 
 
1.3.2 Pared celular 
 
La pared celular peptidoglicana contiene ácido meso-diaminopimélico, alanina, 
ácido glutámico, glucosamina, ácido murámico, arabinosa y galactosa. Los ácidos 
micólicos con los lípidos libres en la capa más externa (como la trehalosa 6,6‟-dimicolato o 
Factor Cordón), la cual le proporcionan una barrera impermeable hidrofóbica. Otros ácidos 
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grasos importantes son las ceras, fosfolípidos, ácidos micoserosoicos y ácidos ftienoicos 
(1). 
 
La envoltura celular del género Mycobacterium consta de cuatro capas (Figura 4): la 
más interna es el peptidoglicano con moléculas de N-acetilglucosamina y ácido N-
acetilmurámico que da forma y rigidez a la bacteria. La segunda capa está constituida por 
arabinogalactanos que se encuentran unidos a ácidos micólicos de la tercera capa que 
está formada por ácidos grasos de cadena larga (60-90 átomos de carbono) que son de 
importancia taxonómica. La capa más externa se encuentra constituida por lípidos como la 
trehalosa 6,6‟ dimicolato. 
 
Los glucolípidos son un grupo de compuestos (sulfolípidos, micósidos, micolatos de 
trehalosa, etc.) que se encuentran asociados no covalentemente a los ácidos micólicos y 
se ubican en la periferia de la pared. Los micolatos de trehalosa y sulfolípidos se 
encuentran principalmente en las cepas de micobacterias más virulentas. El 
lipoarabinomanana (LAM) es una molécula anclada a la membrana citoplasmática y se le 
considera como el equivalente del lipopolisacárido de bacterias gramnegativas debido a 
que provoca una importante respuesta antimicrobiana en macrófagos. En las cepas de 
micobacterias más virulentas el LAM está cubierto con residuos de manosa (manLAM) 
(18). 
 
Figura 4. Esquema de la pared ceular del género Mycobacterium (Infect Immun, 
1996). 
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 La composición de la pared celular de la micobacteria le confiere menor 
permeabilidad y es responsable, entre otras cosas, de la ineficiencia ante múltiples 
antimicrobianos, así como la característica de la ácido alcohol resistencia con 
determinadas tinciones para su visualización. 
 
1.3.3 Identificación 
 
I. Identificación fenotípica 
 
a) Microscopía.- Una característica compartida por el género Mycobacterium es la ácido 
alcohol resistencia, la cual es la capacidad de resistir la decoloración con alcohol 
ácido. Además, existen algunas características microscópicas que orientan la 
identificación de algunas especies, por ejemplo el factor cordón para Mycobacterium 
tuberculosis (17). 
 
b) Velocidad de crecimiento. Se basa en los días de incubación que un cultivo en medio 
sólido necesita para la detección de colonias visibles macroscópicamente. Las 
micobacterias que tardan más de 7 días se clasifican como micobacterias de lento 
crecimiento, mientras las que lo hacen en menos de 7 días se les considera de 
crecimiento rápido. El inóculo para realizar el subcultivo es un factor crítico en el 
desarrollo de este análisis (1). 
 
c) Temperaturade crecimiento. En general las micobacterias crecen entre 35-37°C, sin 
embargo, algunas micobacterias como M. marinum, M. ulcerans y M. haemophilum 
tienen mejor desarrollo a temperaturas bajas (30°C) mientras que, otras requieren de 
temperaturas elevadas, por ejemplo M. xenopi que crece a 45°C pero no a 28°C (17). 
 
d) Características de las colonias 
i. Producción de pigmento. Se basa en la capacidad de producir pigmentos 
carotenoides que puede estar relacionado con la exposición a la luz. 
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ii. Morfología colonial. Las características morfológicas se pueden observar en los 
medios a base de huevo o de agar (Lowenstein Jensen o Middlebrook 7H9, 
respectivamente). 
iii. Pruebas bioquímicas. En 1992 se establecieron las bases para la identificación 
bioquímica de las micobacterias de crecimiento lento, entre los que se encuentra 
un número limitado de pruebas bioquímicas que, junto con pruebas genéticas y 
moleculares, permiten la caracterización de las especies de este grupo de 
bacterias. En el caso de las micobacterias de crecimiento rápido tienen mucha 
variabilidad lo que hace que estas pruebas sean poco confiables para su 
caracterización fenotípica. 
 
La identificación mediante pruebas bioquímicas requiere experiencia y el 
conocimiento de su fundamento, además requiere resultados coherentes de un 
conjunto de pruebas bioquímicas para llegar a la identificación específica de las 
especies de micobacterias (10, 19). 
 
II. Identificación molecular 
 
El análisis de la longitud de fragmentos obtenidos por enzimas de restricción en los 
productos de PCR de genes específicos es usado ampliamente para la identificación de 
especies de micobacterias. La secuenciación de genes conservados es un método 
sensible y preciso, pero con la desventaja de que se requiere experiencia y presupuesto. 
Recientemente, las pruebas de DNA son utilizadas debido a su disponibilidad en estuches 
comerciales, como el sistema AccuProbe Gen Probe, que son altamente específicos y 
sensibles con la desventaja de que se identifica un número limitado de especies. 
 
Por otra parte, el desarrollo de la hibridación reversa de productos de PCR con 
sondas complementarias en tiras de nitrocelulosa o nylon, han permitido la detección e 
identificación simultánea de micobacterias (24); por ejemplo: la prueba de INNO-LiPA 
Micobacteria tiene como región blanco el espacio intergénico 16S-23S rDNA, el cual se 
sugirió como un blanco potencial dentro del genoma para encontrar información 
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filogenética. Trabajos previos sugieren el uso de esta región por el alto nivel de variación 
de secuencia espaciadora y la buena reproducibilidad de la secuenciación ITS (25, 26). 
 
III. Identificación cromatográfica 
 
Existen tres tipos de técnicas cromatográficas utilizadas en la identificación de 
especies de micobacterias basadas en los ácidos micólicos: Cromatografía en capa fina 
(TLC), cromatografía de gases (GLC) y cromatografía de líquidos de alta eficiencia 
(HPLC). La TLC y HPLC permiten un análisis directo de los ácidos micólicos, mientras que 
la GLC se basa en el análisis de la descomposición de éstos. 
 
La TLC permite la diferenciación de ésteres de siete tipos de ácidos micólicos 
conocidos. Una vez que los ácidos micólicos son liberados, son extraídos como micolatos 
por medio de metil-esterificación. Posteriormente, se colocan sobre una lámina de silica 
gel (fase estacionaria) para separar por capilaridad con la elución de solventes (fase 
móvil). La identificación generalmente se realiza por comparación del patrón con cepas de 
referencia (17). 
 
En el caso de la HPLC, los ácidos micólicos son liberados de las células completas 
por medio de saponificación y extracción con cloroformo, para transformarse a ésteres de 
bromofenacil absorbidos por UV. Los extractos se inyectan en una columna para eluirse 
por la fase móvil, un gradiente de metanol y cloruro de metileno. Las fracciones eluidas 
son cuantificadas por absorción UV con un detector da 254-260 nm. Recientemente, la 
sensibilidad del método se incrementó por el reemplazo de la detección por UV por 
absorción de fluorescencia (17, 20, 21). 
 
En el análisis por HPLC, los ácidos micólicos son separados con base en su 
polaridad y la longitud de su cadena de carbonos, la más polar y la más corta eluye 
primero. La distribución de los picos más grandes en el cromatograma, la posición sobre la 
base de su tiempo de retención y el peso en comparación con los otros picos son los 
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parámetros utilizados para el análisis. Cada especie se identifica por la comparación visual 
con un patrón de número, posición y peso particular de los picos (17). 
 
Con la GLC todos los componentes de la pared celular son analizados. Una vez 
extraídos los ácidos grasos como metil ésteres por medio de metanolisis, son sometidos a 
trifluoroacetilación, lo cual mejora la detección por alcohol. Posteriormente, son inyectados 
en el cromatógrafo de gases donde son transportados a través de una columna con 
temperatura controlada por un gas acarreador. La cuantificación de los productos se 
determina por el detector de ionización por flama. La identificación se realiza en base al 
tiempo de retención y se confirma por espectrometría de masas (17). 
 
1.3.4 Epidemiología 
 
Actualmente, se han identificado más de 138 especies de micobacterias no 
tuberculosas. De las especies conocidas de micobacterias, cerca de una tercera parte 
fueron asociadas con enfermedades en humanos. Las especies de MNT asociadas con 
enfermedad son: 
 
M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. simiae, M. habana, M. interjectum, M. xenopi, 
M. heckeshornense, M. szulgai, M. fortuitum, M. immunogenum, M chelonae, M. marinum, 
M. genavense, M. bohemicum, M. haemophilun, M. celatum, M. conspicuum, M. 
malmoense, M. ulcerans, M. smegmatis, M. wolinskyi, M. goodii, M. thermoresistible, M. 
neoaurum, M. vaccae, M. palustre, M. elephantis, M. septicum y M. nonchromogenicum 
(10, 29). 
 
Recientemente, la frecuencia de asociación de micobacterias con enfermedades va 
en aumento, por ejemplo Mycobacterium arupense es asociado con infecciones en tendón 
y pulmón (27, 28). 
 
A mediados de 1980 y principios de 1990 debido al advenimiento de la infección con 
VIH, la tuberculosis resurge con la aparición de cepas multifármaco resistentes. En años 
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recientes las micobacterias no tuberculosas reemergen como la principal causa de 
infecciones oportunistas en individuos con VIH/SIDA. Por otro lado, las enfermedades por 
MNT en individuos inmunocompetentes son principalmente pulmonares, mientras que en 
los pacientes con VIH/SIDA e individuos inmunodeficientes, las enfermedades por MNT 
afectan otros órganos o son diseminadas (30). 
 
1.3.5 Micobacteriosis 
 
Las enfermedades causadas por MNT tienen diversas manifestaciones y fueron agrupadas 
de manera general como micobacteriosis. Se ha reportado que son las causantes de 
enfermedades localizadas y diseminadas dependiendo de la predisposición local y/o el 
grado del déficit de la respuesta inmune (10, 31). 
 
Un incremento en las infecciones por MNT se ha observado en pacientes 
inmunosuprimidos, aunque cada vez se diagnostica mayor número de infecciones 
micobacterianas en sujetos inmunocompetentes (29, 31), por ejemplo enfermedad 
pulmonar localizada, adenitis, infecciones de tejido blando, infecciones de 
articulaciones/hueso, úlceras de piel; las enfermedades generalizadas se presentan con 
mayor frecuencia en individuos inmunodeficientes como pacientes trasplantados o con 
leucemia. A continuación se mencionanenfermedades asociadas a MNT: 
 
 Infecciones pulmonares debidas a MNT.- Las principales especies causantes de 
estas infecciones son las del complejo MAC, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. simiae, 
M. habana, M. szulgai, M. fortuiutum, M. vaccae, M. malmoense y M. kansassi, 
estas se relacionan principalmente a bronquitis crónica, bronquiectasias y 
enfermedad obstructiva crónica (10, 29). 
 
 Ganglios linfáticos.- Los aislamientos del complejo MAC así como de M. 
scrofulaceum fueron reportados como causantes de linfadenitis. Otras especies 
causantes de linfadenitis cervical en países del oeste e india son M. bohemicum, M. 
szulgai y M. interjectum (10, 29). 
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 Huesos y articulaciones.- Aislados del complejo MAC, M. szulgai, M. fortuitum, M. 
non-chromogenicum y M. kansasii fueron reportados como causa de infecciones en 
hueso y en articulaciones. Recientemente, M. arupense se identificó como causante 
de infección en articulaciones (10, 29, 32, 33, 34). 
 
 Infecciones cutáneas.- M. szulgai, M. marinum, M. ulcerans y M. vaccae fueron 
reportados como causantes de infecciones en la piel. M. marinum se ha reconocido 
como organismo causante de lesión granulomatosa, adquirida en piscinas y tanques 
de peces. Las lesiones papulares causadas, pueden confundirse con esporotricosis 
(10). 
 
 Enfermedades intestinales crónicas. El agente causal de la enfermedad de Crohn es 
M. avium sp paratuberculosis: miembros de esta especie se han reportado como 
agentes causales de enteritis en el ganado vacuno, cabras y ovejas (10, 12). 
 
 Enfermedad diseminada en individuos inmunocomprometidos.- Las principales 
especies de MNT que causan esta enfermedad son: MAC, M. kansasii, M. 
scrofulaceum, M. xenopi y M simiae. 
 
1.4 Mycobacterium arupense 
 
M. arupense es un microorganismo identificado en el 2006 mediante secuenciación 
genética por 16S rRNA, hsp65 y rpoB. Esta nueva micobacteria fue aislada de esputo, 
tendones, lavado bronquial, tendovaginitis purulenta y de una herida en un dedo por lo cuál 
se sugirió que Mycobacterium arupense es un microorganismo de importancia clínica. De 
acuerdo a los estudios realizados se considera a M. arupense como una micobacteria 
perteneciente al complejo de Mycobacterium terrae (27, 28). 
 
Las colonias de esta bacteria son no cromógenas, de rápido crecimiento en medio 
Lowentein-Jensen a 30°C (5-7 días) y de lento crecimiento (10-12 días) a 37°C, no crece a 
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42°C. El patrón de ácidos micólicos por FL-HPLC es indistinguible del obtenido por M. 
nonchromogenicum. En la Tabla 2 se muestran algunas características de este nuevo 
microorganismo (28). 
 
Tabla 2.Características diferenciales con micobacterias estrechamente relacionadas 
Característica M. arupense M. terrae M. nonchromogenicum M. hiberniae 
Microscopía 
Cadenas 
Largas cortas largas Cortas 
Reducción de 
nitrato (37°c 22h) 
- (+) - + 
Arylsufatasa (3 días) - - - - 
Β-Galactosidasa + + + + 
Fosfatasa ácida 
(37°C 20 h) 
+ + + + 
Leucin arilamidasa +/- - - + 
Cistin arilamidasa - - - - 
α-Glucosidasa - - + - 
β- Glucosidasa - - + - 
Crecimiento a 42 °C - - + - 
Tolerancia a NaCl 
5% 
- - - - 
+, positivo; (+) débilmente positivo; +/-, variable; -, negativo 
 
1.5 Anticuerpos Monoclonales 
 
1.5.1 Respuesta humoral 
 
La respuesta inmune humoral es mediada principalmente por las inmunoglobulinas; 
esto sucede una vez que los linfocitos B han sido activados y diferenciados a células 
plasmáticas, las cuales son capaces de producir anticuerpos. La producción de estas 
células ocurre en la médula ósea donde maduran, y posteriormente migran a los órganos 
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linfoides secundarios o periféricos para que se realicen las etapas de reconocimiento y 
activación (35, 38, 39). 
 
1.5.2 Anticuerpos 
 
Las inmunoglobulinas son un amplio grupo de proteínas presentes en el suero, 
principalmente en forma soluble conocidas como anticuerpos o anclados a membranas de 
linfocito B formando el receptor para antígeno de estas células (BCR) (36, 37, 38, 39). 
 
Las moléculas de los anticuerpos comparten características estructurales y 
fisicoquímicas semejantes. Cada molécula está constituida por cuatro cadenas 
polipeptídicas, dos de las cuales son de 55-77 kDa (cadenas pesadas) y las dos restantes 
de 25 kDa (cadenas ligeras). Estas cadenas se encuentran unidas por puentes disulfuro 
conformando una estructura en forma de Y. Las cadenas pesadas y ligeras tienen una 
región variable y otra conservada. La región variable de los anticuerpos se conoce como 
fracción de unión al antígeno (Fab) mientras que la región constante se conoce como 
fracción cristalizable (Fc), ver Figura 5 (38, 40). 
 
 
Figura 5. Estructura de los anticuerpos. Cada anticuerpo se compone de dos 
cadenas ligeras y de dos cadenas pesadas. 
 
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Cinco isotipos principales se conocen y están compuesto de cadenas pesadas (µ, δ, 
γ, α y ε) y dos cadenas ligeras (κ y λ). Las inmunoglobulinas formadas por cada uno de 
esos tipos de cadena pesada se conocen como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente 
y contienen cualquiera de los isotipos de cadena ligera (Figura 6) (38, 39). 
 
 
Figura 6. Representación de isotipos de anticuerpos 
 
Las clases más abundantes son IgG (75% de las Ig totales) e IgM 
(aproximadamente 10%). Las moléculas de anticuerpos se dividen en distintas clases y 
subclases basada en la estructura de sus regiones de la cadena pesada por esto mismo 
en los humanos, los IgG se subdividen en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. 
 
Cuando son secretadas las IgM e IgA se polimerizan de tal manera que se 
encuentra en el plasma a las IgM de forma pentamérica y en las secreciones de mucosas 
a las IgA en forma de dímeros. Esta formación de polímeros se debe a la asociación de la 
proteína J la cual mantiene unida la estructura polimérica por puentes disulfuro con los 
extremos carboxilo terminal de la cadena pesada. 
 
La función principal de los anticuerpos es unirse de forma específica a un 
determinado antígeno, debido a que las moléculas antigénicas son mayores que su región 
de unión con el anticuerpo, este se une a ciertas regiones denominadas epitopos o 
determinantes antigénicos (38, 39, 40, 41). Una vez que el anticuerpo se une al antígeno 
surgen diferentes consecuencias, las cuales dependerán de la estructura, la localización 
anatómica y el isotipo del anticuerpo (42). Las principales actividades biológicas de los 
anticuerpos se muestran en la Tabla 3 (43). 
 
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Tabla 3: Actividades Biológicas de los Anticuerpos 
Unión a antígenos Transporte Desgranulación de células 
Bloqueo a la invasividad de 
los virus 
Activación del 
complemento 
Bloqueo o estimulación de 
receptores 
Neutralización de toxinas Opsonización Modulación 
Limpieza inmunológica Colaboración en citolisis 
 
1.5.3 Generación de anticuerpos monoclonales 
 
En 1975 George Köhler y Cesar Milstein desarrollaron la técnica que consiste en 
fusionar células de bazo de un ratón inmunizado con células de mieloma, lo cual permitía 
desarrollar poblaciones homogéneas de células productoras de anticuerpos específicos, 
por la capacidad de estas células de proliferar indefinidamente y secretar anticuerpos 
específicos contra el antígeno usado para la inmunización. 
 
Los linfocitos provenientes del bazo aportan la capacidad de sintetizar el anticuerpo 
deseado y el mieloma la capacidad de proliferar (44-45). Para lograr la unión de las células 
se usa un agente fusógeno, el cual originalmente fue el virus Sendai inactivadoy 
actualmente se usan fusógenos químicos como el polietilenglicol. 
 
Una vez que las células se fusionaron se cultivan en el medio Hipoxantina, 
Aminopterina y Timidina (HAT), donde la aminopterina inhibe la síntesis de ácidos 
nucleicos. Como las células de mieloma carecen de las enzimas necesarias (HPGRT o 
TK) para reciclar los ácidos nucleicos mueren por la falta de purinas (Figura 7). A 
diferencia de las células de mieloma, los esplenocitos contienen estas enzimas, sin 
embargo, carecen de la capacidad de proliferar indefinidamente, por lo cual al cabo de 
unas semanas, las clonas observadas son aquellas que realizaron un re-arreglo exitoso de 
los cromosomas de los esplenocitos con las células de mieloma, es decir, son células 
inmortales y resistentes a la aminopterina (Figura 8) (44, 45, 46). 
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Figura 7. Rutas metabólicas de importancia en la selección de híbridos en un medio 
que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT). Cuando la ruta es 
bloqueada con aminopterina (estrella), la célula depende de la ruta de salvamento 
usando las enzimas HPGRT y timidin cinasa. 
 
Figura 8. Selección de hibridomas considerando las características de las células de 
mieloma y de los esplenocitos. 
 
 
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1.5.4 Ventajas y desventajas 
 
La producción de anticuerpos depende del número de linfocitos B, su velocidad de 
síntesis y su persistencia posterior a su producción. Esta última es dependiente del isotipo 
debido a que cada uno tiene un tiempo de vida media diferente y funciones biológicas 
diferentes por lo cuál los sitios de acceso varían entre cada isotipo. Las características 
más importantes de una respuesta mediada por anticuerpos son el isotipo, la especificidad 
y la afinidad. 
 
La especificidad determina la capacidad del anticuerpo de distinguir al antígeno de 
otras proteínas. 
 
La afinidad se refiere a la fuerza de unión del anticuerpo con su antígeno si se 
considera al primero con un solo sitio de unión y al antígeno monovalente, por lo tanto, a 
mayor afinidad, menor anticuerpo se requiere para detectar el antígeno. La fuerza total de 
unión de una molécula con más de un sitio de unión se denomina avidez. 
 
Para monitorear la respuesta inmune se analiza el suero, debido a que es rico en 
anticuerpos específicos de naturaleza policlonal contra el antígeno con que se inmunizó, 
sin embargo su aplicación tiene varias desventajas: 
 Cada antisuero es distinto de otro aunque se haga en animales genéticamente 
iguales con los mismos protocolos. 
 La afinidad varía de acuerdo al estado en que se encuentra el animal al momento 
de tomar la sangre. 
 Los volúmenes de producción son limitados por lo cual su aplicación en pruebas 
clínicas y experimentos se restringe. 
 A pesar de realizar una purificación cromatográfica pequeñas poblaciones de 
anticuerpos interactúan inespecíficamente y se confunde el análisis de resultados. 
 Tienen la capacidad de formar complejos inmunes con el antígeno, lo cual permite 
precipitar proteínas o aglutinar células. 
 
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Una manera de resolver estos problemas es mediante la producción de anticuerpos 
monoclonales, sin embargo, su producción es costosa y requiere de experiencia, por lo 
cuál es importante considerar los objetivos para elegir la mejor opción (38, 39, 46, 47). 
 
1.5.5 Aplicaciones de anticuerpos monoclonales. 
 
Identificación y estudio de moléculas 
 Permiten la detección de antígenos en muestras complejas, determinar sitios de 
producción, expresión, deposición y actividad de moléculas en células o tejidos, también 
permiten definir antígenos de diferenciación celular o definir poblaciones celulares. 
 
Diagnóstico 
 Para determinar componentes de la sangre como marcadores de enfermedad, por 
ejemplo, diagnóstico de enfermedades parasitarias, bacterianas, o virales por medio de la 
detección de antígenos, niveles altos de complejos inmunes, proteínas en fase aguda, 
marcadores de cáncer, endocrinopatías, factores de crecimiento, etc. 
 
Purificación de moléculas y células. 
 Cromatografía de afinidad, con anticuerpos para purificar su antígeno; también se 
usan para el marcaje fluorescente de células para su separación por FACS (Fluorescence 
Activated Cell Sorting). 
 
Aplicaciones terapéuticas. 
 Se usan en la inducción de inmunosupresión a fin de tratar enfermedades 
autoinmunes o para neutralizar toxinas, o incluso para dirigirlos contra antígenos de 
células tumorales que permitan visualizarlos e inducir citotoxicidad (38, 39, 47, 48). 
 
Por lo descrito anteriormente, una manera eficiente de identificar las diferentes especies 
de micobacterias es empleando anticuerpos monoclonales capaces de diferenciarlas. 
 
 
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2. Justificación 
 
En los últimos años el incremento de los reportes de infecciones por MNT tanto en 
pacientes inmunocomprometidos como inmunocompetentes, así como los reportes de 
aislamientos ambientales, han llevado al desarrollo de técnicas rápidas y específicas que 
permitan la identificación de cepas ambientales y/o clínicas. 
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3. Objetivo 
 
 Producir y caracterizar anticuerpos monoclonales contra M. arupense aislada de 
agua para uso y consumo humano. 
 
 
 
 
 
4. Objetivos particulares 
 
Inmunizar ratones Balb-C con micobacterias y elegir la cepa con la mayor respuesta 
humoral. 
Titulación de los sueros de ratones inmunizados contra micobacterias. 
Caracterización de anticuerpos monoclonales contra Mycobacterium arupense. 
Obtener hibridomas productores de anticuerpos monoclonales contra 
Mycobacterium arupense. 
Obtener el proteoma del extracto celular de Mycobacterium arupense. 
 
 
 
 
 
 
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5. Métodos 
 
5.1 Caracterización de Mycobacterium arupense 
 
5.1.1 Características Macroscópicas y Microscópicas 
 
A partir del aislamiento realizado previamente en el Programa de Inmunología 
Molecular Microbiana se recuperó a cepa de M. arupense en medio 7H10, se realizó la 
observación macroscópica de las colonias y se determinaron las características 
microscópicas de la cepa mediante una Tinción de Ziehl-Neelsen y Auramina-Rodamina 
(ver anexo I). 
 
5.1.2 Curva De Crecimiento 
 
1) Una vez recuperada la cepa Mycobacterium arupense en medio 7H10, se realizó un 
subcultivo en medio líquido 7H9 en un volumen de 50 mL a 37º C en agitación 
constante. 
2) Se tomaron 500µL del cultivo líquido y se adicionaron a 125 mL de medio 7H9 
fresco, se determinó la DO a partir de este momento. Se usó como blanco medio 
7H9 sin inocular. Se realizó por duplicado. 
3) Se determinó la DO cada 24 horas. 
4) Se estableció la fase media logarítmica de crecimiento. 
 
5.1.3 Obtención de Proteínas de Extracto Celular de M. arupense por Sonicación 
 
1) A partir de dos cultivos independientes de Mycobacterium arupense en fase media 
logarítmica, se cosecharon las bacterias mediante centrifugación a 5000 RCF por 
10 minutos. 
2) Se decantó el sobrenadante y se resuspendió el paquete celular en H2Od estéril. Se 
centrifugaron a 5000 RCF por 10 minutos (Por duplicado). 
3) Se decantó el sobrenadante y se determinó el peso húmedo del paquete bacteriano. 
4) Se ajustó el paquete a 300 mg/mL. 
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5) A la suspensión de bacterias se le aplicaron 15 pulsos de 60 segundos con 
sonicador. 
6) Cada 5 pulsos se agregó inhibidor proteasasde tal manera que obtuvimos una 
concentración final de 1 µg/mL. 
7) Se cuantificaron las proteínas por el método de Bradford. 
 
5.1.4 Proteoma de M. arupense Por Electroforesis de Doble Dimensión (49-52) 
 
5.1.4.1 Rehidratación de tiras gradiente inmóvil de pH (IPG) 
 
1) Se determinó el volumen necesario de muestra para contener 100 µg de proteína en 
180 µL de solución amortiguadora de rehidratación. Se mantuvo la muestra a 4°C. 
2) Se pesaron las cantidades correspondientes para mezclar la solución amortiguadora 
de rehidratación con la muestra 
Urea 75.6 mg 
Tiourea 27.4 mg 
CHAPS 7.2 mg 
DTT 27.7 mg 
 
3) Preparación de la mezcla en el siguiente orden: 
a. La Urea se Rehidrtó con la muestra de proteínas y se mezcló. 
b. Se agregó la tiourea y posteriormente se mezcló. 
c. Se adicionó el CHAPS y se agitó hasta obtener la solución. 
d. EL DTT se agregó justo en el momento de usarse. 
e. Se agregó a la mezcla 2µL de solución de azul de bromofenol al 1%. 
f. Se mezcló bien y se midió el volumen final. De ser necesario se agregó 
H2Od. 
g. Finalmente se transfirieron 180 µL de mezcla de rehidratación en un tubo 
eppendorf nuevo y se agregaron 2 µL de anfolinas. 
4) Se niveló la bandeja de rehidratación. 
5) Se cargaron 180 µL de la mezcla en el centro del carril. 
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6) Se tomó una tira IPG y se retiró la cubierta de plástico más delgada con un 
movimiento continuo. 
7) Se colocó la tira IPG en el carril donde está la muestra con la parte del gel hacia 
abajo asegurándose de que no queden burbujas. 
8) Se cubrió el carril con aceite mineral. 
9) Se colocó la tapa de la bandeja de rehidratación y se dejó sin moverse de 10 a 16 
horas. 
 
5.1.4.2 Isoelectroenfoque de proteínas en tiras IPG 
 
1) Se retiraron las tiras IPG de la bandeja de rehidratación y se escurrió el exceso de 
aceite. 
2) Se ajustó el sistema de enfriamiento (Multitemp III) a 17°C. 
3) Se colocaron las tiras sobre el alineador, con el lado de la tira que tiene el gel y la 
muestra hacia arriba y con el extremo ácido (+) hacia el ánodo. 
4) Se cortaron dos tiras de papel para electrodos (Amersham) y se humedecieron con 
H2Od. Se retiró el exceso de agua y se colocaron sobre las tiras IPG de manera que 
cubrían sólo 2 mm del gel de la tira de IPG. 
5) Los electrodos se colocaron sobre las tiras. 
6) Se vertió aceite mineral al centro del alineador hasta cubrir las tiras IPG. 
7) Se colocó la tapa del Multiphor II y se conectaronr los electrodos del equipo a la 
fuente de poder. 
8) La corrida se realizó de la siguiente manera: 
a. 30 min a 500V 
b. 30 min a 1000V 
c. 30 min a 1500 V 
d. 30 min a 2000 V 
e. 24 horas contínuas a 2500 V para que completen 52,000 VH. 
 
 
5.1.4.3 Equilibrio y 2ª Dimensión 
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1) Se preparó DTT [15 mg/mL] en un tubo con 5 mL de buffer de equilibrio e IAA [37.5 
mg/mL] en 5 mL de buffer de equilibrio. 
2) Al terminar el isoelectroenfoque se retiró la tira IPG de la cámara. 
3) Se colocó la tira en la solución con DTT en agitación por 15 min. 
4) La tira se colocó en la solución con IAA en agitación por 15 min. 
a. Se retiró el isopropanol de la parte superior del gel y se lavó con solución 
amortiguadora de corrida (ver anexo II). Al final del lavado se llenó con buffer 
de corrida. 
b. Se impregnó un pequeño trozo de papel filtro con 5 µL de marcador de masa 
molecular. 
c. Se eliminó el exceso de solución amortiguadora de equilibrio de la tira. 
La tira se colocó en la parte superior del gel. 
d. Posteriormente se colocó el papel filtro impregnado con el marcador de masa 
molecular. 
 
La corrida se programó a 50 V y posteriormente se ajustó a 100 V 2h y 
posteriormente se ajustó a 150V. 
 
5.1.4.4 Fijación y Tinción con Plata de Geles de Poliacrilamida con Proteínas 
 
1) Al finalizar la corrida electroforética se agregó solución de impregnación y se agitó 
por 20 min. 
2) Se agregó 10 mL de la solución de revelado. 
3) Posteriormente se eliminó la solución de revelado. 
4) Se agregó solución de paro, se capturó la imagen del gel y se realizó el análisis. 
 
5.2. Inmunización 
La micobacteria irradiada en solución salina isotónica se ajustó a una DO de 0.8. Se 
utilizaron 5 ratones hembras Balb/c entre 6-8 semanas de edad por cada cepa de 
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micobacterias seleccionada del cepario del Programa de Inmunología Molecular 
Microbiana. Facultad de medicina, UNAM. 
Antes de realizar la inmunización se tomó una muestra de sangre por punción en la 
vena del plexo maxilar del ratón y posteriormente se inyectó la suspensión por vía 
intraperitoneal en un volumen no mayor a 200 µL. El esquema de inmunización fue el 
siguiente: 
 
Tiempo T0 T1 T2 T3 T4 
Día 0 14 33 73 90 
 
A partir del segundo T2 se eligió la cepa para continuar con las inmunizaciones 
para seleccionar al ratón con mejor respuesta para realizar la fusión celular. 
 
5.3 Análisis Del Suero De Los Ratones Inmunizados mediante la técnica de ELISA 
 
1. Se adicionaron 100 µL de una solución amortiguadora de bicarbonatos que contenía 
5µg/mL de proteína para recubrir la pared de la microplaca, se incubó toda la noche 
a 4°C. 
2. Se lavó la placa con 250 µL de PBS durante un minuto a temperatura ambiente con 
agitación constante. Los excesos de PBS se eliminaron invirtiendo la placa y 
golpeándola contra una gasa. 
3. La placa se bloqueó con 150 µL de PBS-albúmina 1% durante 1h a 37°C 
4. Se realizaron 3 lavados con 250 µL de PBS-Tween 20 durante 1 minuto a 
temperatura ambiente con agitación constante, posteriormente se eliminaron los 
excesos de PBS-Tween 20 de la microplaca. 
5. Se realizaron diluciones seriadas de 1:25, 1:125, 1:625, 1:3125, 1:15625 por 
duplicado utilizando PBS como diluyente PBS. Se incubó 1 h a 37°C. 
6. Se lavó la microplaca con 250 µL de PBS-Tween 20 durante 1 minuto. Este punto 
se realizó por triplicado y al terminar se eliminaron los excesos. 
7. El anticuerpo conjugado (AP Rabbit anti Mouse IgG1, ZYMED® laboratories) se 
utilizó con una dilución 1:1000. Se incubó 1h a 37 °C. 
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8. Se agregó 100 µL de solución reveladora y se dejó revelando por 20 minutos a 
tempertura ambiente protegiendo la placa de la luz, transcurrido este tiempo se 
agregaron 50 µL de NaOH 3M. 
 
5.4 Fusión, Selección Y Proliferación De Hibridomas 
 
Éste método se realizó con el kit ClonaCell-HY de la empresa StemCell (53, 54, 55). 
 
 5.4.1 Células De Mieloma (Sp2/0) 
 
1) La densidad celular se ajustó a 2X105 células viables/mL, en un volumen final de 
100ml. 
2) Se centrifugaron las células en un tubo de 50 ml a 1100 rpm a temperatura 
ambiente por 10 min, posteriormente se realizaron 3 lavados con 30 ml de Medio B. 
Se retiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en 25 ml de medio B. 
3) Las células se contaron con azul de tripano (la viabilidad debe ser mayor al 95%). 
4) Se ajustó el volumen para tener 2x107 células. 
 
5.4.2 Esplenocitos 
 
1) El bazo se disgregó en una suspensión celular, posteriormente se lavaron los 
esplenocitos 3 veces con medio B centrifugando a 1350 rpm a temperatura 
ambiente por 10 min y removiendo el sobrenadante con pipeta. Después del lavado 
final se resuspendieron las células en 25 ml de medio B. 
2) Las células se contaron con una solución de ácido acético 3% y azul de metileno y 
se calculó un volumen para tener en 25 ml de medio B 1x108 células. Las células se 
colocaron a 37 C. 
 
5.4.3 Fusion 
1) Se adicionaron las células de mieloma (2x107) y los esplenocitos viables (1x108), en 
un tubo de 50 ml y se centrifugó por 10 min a 1350 rpm a temperatura ambiente. 
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2) Se disgregó el paquete celular suavemente y se adicionó lentamente 750 μL de 
PEG gota a gota por 1 min sin agitación. 
3) Se agregaron 3 ml del medio B a la mezcla de fusión, por un periodo de 4 minutos. 
4) Se adicionaron lentamente 5 ml del medio B a las células y se incubaron por 15 min 
en el baño a 37 C. 
5) Se agregaron lentamente 15 ml de medio A y se centrifugaron las células a 1350 
rpm por 7 min. 
6) El paquete celular se resuspendió lentamente en 10 ml de Medio C. La suspensión 
se transfirió a un frasco de cultivo de 75 cm2 con 40 ml de Medio C y se incubó de 
16 a 24 horas a 37 C con 5% de CO2. 
 
5.4.4 Selección y Clonaje 
 
1. La suspensión de células fusionadas se transfirió en un tubo de 50 ml y se 
centrifugó por 10 min a 1350 rpm a temperatura ambiente desechando el 
sobrenadante. Se resuspendieron las células en Medio C en un volumen final de 5 
ml. 
2. Se transfirió la suspensión celular en 45 ml de Medio D y se mezcló por inversión. 
Se mantuvo en reposo durante 15 min a temperatura ambiente. 
3. Finalmente se colocaron 9.5 ml de la suspensión celular con ayuda de una aguja del 
#16 dentro de cada caja de petri de 100 mm y se incubaron las placas de 10 a 14 
días. 
 
5.4.5 Cosecha 
1. Después de los 10 o 14 días se observaron colonias las cuales se removieron con 
una pipeta de 10 μl en una caja de 96 pozos que contenía 200 μl de Medio E. Se 
incubaron las placas de 1 a 4 días. 
2. Se transfirieron 150 μl del sobrenadante de cada hibridoma a un pozo de una caja 
de 96 pozos nueva y se analizó por ELISA. 
3. Al alcanzar una densidad de 4x105 células se congelaron en SFB + 10% DMSO 
mientras que las clonas seleccionadas fueron expandidas en medio E. 
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5.4.6 Selección De Hibridomas Productores De Anticuerpos Por El Método De ELISA 
Por Quimioluminiscencia. 
 
El primer tamizaje de las clonas productoras de anticuerpos se realizó con la 
metodología descrita en el apartado 5.3 y posteriormente se realizó la selección de las 
clonas candidatas para la caracterización mediante el método de ELISA por 
quimioluminiscencia. 
1. Se adicionaron 100 µL de una solución amortiguadora de bicarbonatos que contenía 
5µg/mL de proteína para recubrir la pared de la microplaca de poliestireno blanco, 
posteriormente se incubó toda la noche a 4°C. 
2. La placa se bloqueó con 150 µL de PBS-albúmina 1% durante 1h a 37°C. 
3. Se realizaron diluciones seriadas de concentrado, 1:5, 1:25, 1:125, utilizando como 
diluyente PBS. Se adicionaron 100 µL por pozo y cada dilución se realizó por 
duplicado. La plca se incubó 1 h a 37°C. 
4. El anticuerpo conjugado (AP Rabbit anti Mouse IgG1, ZYMED® laboratorios, HRP 
Rabbit anti mouse IgG2a, ZYMED® laboratorios) se utilizó con una dilución 1:1000 
La placa se incubó 1h a 37 °C. 
5. Se agregaron 100 µL de solución reveladora de AP (MILLIPORE®) por 5 min. 
Transcurrido este tiempo se realizó la lectura en el equipo GENios Plus. 
6. Se agregaron 100 µL de solución reveladora de HRP (MILLIPORE®) por 5 minutos 
a temperatura ambiente y finalmente se realizó la lectura en el equipo GENios Plus. 
 
5.5. Caracterización de Hibridomas 
 
5.5.1. Determinación de Isotipo 
1. Se humedeció el filtro con 25 l de Beadlyte Cytokine Assay Buffer por pozo y se 
aspiró. 
2. Se adicionaron 50 l de la muestra en cada pozo. 
3. Las esferas se sonicaron 15 segundos en un baño de sonicación y se mezcló 
vigorosamente con pipeta. Se adicionaron 25 l de esta solución por pozo. 
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4. La placa se cubrió y se mezcló con vortex a baja velocidad. Se incubó 15 minutos 
en oscuridad a temperatura ambiente. 
5. Se aspiró para retirar el líquido y se resuspendió en 50 l de Beadlyte Cytokine 
Assay Buffer, mezclando con vortex. Se repitió este paso por duplicado. Y se 
resuspendieron las esferas en 75 l de Beadlyte Cytokine Assay Buffer. Se colocó 
la placa sobre papel secante y se mezcló con vortex a baja velocidad. No sobre 
secar. 
6. Se diluyó Beadlyte anti-mouse k Light Chain, PE 1:100 en Beadlyte Cytokine Assay 
Buffer. 
7. La suspensión se mezcló vigorosamente por pipeteo y se agregaron 25 l de la 
solución de revelado al pozo. 
8. Se crubrió y se mezcló con vortez a baja velocidad. Se incubó 15 minutos en 
oscuridad a temperatura ambiente en el agitador de placas. 
9. La lectura se realizó en el equipo Luminex 100 . 
 
5.5.2. Reacción cruzada. 
Se siguió el método 5.4.6 usando las cepas de la Tabla 4 para sensibilizar la placa y 
el sobrenadante de las dos clonas con mayor título de anticuerpos como anticuerpo 
primario en una dilución 1:11. 
Tabla 4. Cepas elegidas para realizar las pruebas de reacción cruzada. 
MNT MTC BCG 
M. arupense M. tuberculosis H37Rv M. bovis BCG Japón 
M. abcesus M. tuberculosis manila BCG México 
M. nonchromogenicum tipo I M. microti BCG Danesa 
M. nonchromogenicum tipo II BCG Tice 
M. peregrinum BCG Phipps 
M. avium ambiental 
M. avium clínica 
 
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6. Resultados 
 
6.1 Caracterización de Mycobacterium arupense 
 
6.1.1 Características Macroscópicas y Microscópicas 
 
La evaluación macroscópica se realizó mediante el examen visual del desarrollo de las 
colonias en la superficie de placas de agar Middlebrook 7H10. Las colonias se 
caracterizaron de acuerdo a tamaño, forma, borde, color, consistencia, elevación y 
velocidad de crecimiento. 
 
Tabla 5. Características de la cepa Mycobacterium arupense 
Morfología colonial Morfología microscópica Clasificación de Runyon 
Colonias de 1-2 mm de 
diámetro, circulares, margen 
ondulado, rugosas, color 
blanco mate, cremosas 
Bacilos cortos ácido alcohol 
resistentes, delgados que 
forman grupos. 
Rápido crecimiento 
 
La morfología microbiana mostró bacilos cortos y delgados ácido alcohol resistentes que 
forman agrupaciones, que da la apariencia de bacilos largos (Figura 9 y 10). 
 
 
Figura 9. Tinción con Auramina Rodamina. Se observa en color 
verde los bacilos cortos. 
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Figura 10. Tinción de Ziehl Neelsen. Los bacilos cortos se observan en grupos. 
 
6.1.2 Curva De Crecimiento 
 
En la gráfica 1 se muestra la curva de crecimiento realizada en 2 cultivos independientes 
en medio líquido Middlebrook 7H9 con agitación constante; en esta gráfica se determinó 
que la fase media logarítmica se encuentra a una DO de 0.9 a una longitud de onda de 
600 nm (señalada con flechas), la cual se alcanza entre el 9º y 10º día. 
 
 
Gráfica 1: Curva de crecimiento de la cepa Mycobacterium arupense 
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6.1.3 Proteoma de Mycobacterium arupense 
 
A partir de dos cultivos independientes en fase media logarítmica cultivados en medio 
Midlebrook 7H9, el lisado de las micobacterias se efectuó por sonicación para realizar el 
proteoma de Mycobacterium arupense (Figura 11) con tiras de IPG con un gradiente de 4-
7. 
 
 
 
Figura 11. Imagen representativa de los geles obtenidos por 2D-PAGE al 12% 
del extracto celular de Mycobacterium arupense teñidos con nitrato de plata. 
 
Tabla 6. Parámetros evaluados para la normalización de los geles 2D-PAGE 
Parámetro 
 Experimento 
Prom Des. Est CV 1 2 
Cuenta Total 
Pixel 4565392 4518146 4541769 33407.97 0.74 
Puntos válidos 23250.6 18519.8 20885.2 3345.18 16.02 
Puntos totales 876 733 804.5 101.12 12.57 
Densidad total 32489 32680 32584.5 135.06 0.41 
A B 
 
pI 
M
asa m
o
lecu
lar 
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Las imágenes de estos geles 2D-PAGE se analizaron con el software PD-QUEST 
seleccionando los puntosque representan proteínas; posteriormente, se construyó un gel 
maestro (Figura 12) el cual es la suma de ambas imágenes de los 2D-PAGE. A partir del 
gel maestro se identificaron un total de 876 puntos, a los cuales se les asignó un pI y MM 
de acuerdo a su distribución en el gel con relación a los marcadores de masa molecular y 
al gradiente de pH de la tira IPG. A partir de estos datos se realizó el análisis de la 
distribución y frecuencia de las proteínas de acuerdo a su pI y MM (gráficas 2, 3 y 4). 
 
Figura 12. Gel maestro del extracto celular de Mycobacterium arupense. Del lado izquierdo 
se muestra la escala de masa molecular y en la parte inferior el intervalo de pH. 
M
asa m
o
lecu
lar 
pI 
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Gráfica 2. Distribución de proteínas de acuerdo al punto isoeléctrico y masa molecular. 
 
 
Gráfica 3. Histograma de frecuencias de proteínas de acuerdo al punto isoeléctrico 
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Gráfica 4. Histograma de frecuencias de proteínas conforme a la masa molecular 
En las grafica 2 a 4 se observaron que la mayoría de las proteína se localizaron entre los 
20 al los 100 kDa de MM, mientras que para el pI fue entre el intervalo de pH de 4.5 y 6. 
 
6.2. Inmunización. 
 
A partir del cepario del programa se seleccionaron 6 micobacterias de importancia 
ambiental y una subcepa de M. bovis BCG (Tabla 7) para realizar la inmunización de los 
ratones con el objetivo de obtener anticuerpos monoclonales. 
Tabla 7. Micobacterias seleccionadas a partir del cepario del Programa de 
Inmunología Molecular Microbiana, Facultad de medicina, UNAM. 
Micobacterias inoculadas 
Mycobacterium cheloneae 
Mycobacterium peregrinum 
Mycobacterium arupense 
M. nonchromogenicum tipo I 
M. nonchromogenicum tipo II 
M. gordonae 
M. bovis BCG Danesa 
 
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6.3 Análisis Del Suero De Los Ratones Inmunizados. 
 
A partir del suero de los 5 ratones inmunizados para cada tiempo y cada cepa de 
micobacterias se realizó la titulacion del isotipo IgG1 por el método de ELISA para 
observar el incremento en la respuesta inmune humoral y determinar con esto la cepa y el 
ratón candidato para realizar la fusión celular. 
 
 En la gráfica 5 se observa el título sérico de los ratones de la cepa Mycobacterium 
arupense y en la gráfica 6 se observa el título de anticuerpos del ratón con mayor título al 
tiempo 2 de cada una de las cepas, Mycobacterium arupense (recuadro rojo) fue la 
micobacteria que mostró el mayor título en la respuesta humoral. 
 
 
Gráfica 5. Titulación sérica de los ratones inmunizados con las diferentes micobacterias. 
En esta imagen se muestran los resultados obtenidos de la cepa Mycobacterium arupense 
en tres diferentes tiempos (A, B, C). 
 
A B 
C 
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Gráfica 6. Comparación del título de anticuerpos al T2 obtenido a partir del ratón con 
mayor título para cada cepa 
 
Como se observa en la tabla 8 el ratón que obtuvo mayor título en la respuesta humoral de 
la cepa M arupense es el ratón C, por lo cual se seleccionó para realizar la esplenoctomía 
y realizar la fusión celular para la obtención de anticuerpos monoclonales. 
 
Tabla 8. Título de anticuerpos de los ratones correspondientes 
a la cepa M. arupense al tiempo 3. 
Ratón Título 
A 1:631 
B 1:1479 
C 1:1585 
D 1:1380 
E 1:120 
 
 
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6.4 Fusión, Selección y Proliferación De Hibridomas 
A partir de la fusión celular se obtuvo un total 297 clonas, la selección de 11 clonas (Tabla 
9) se determinó con base en los valores de absorbancia más altos que se determinaron 
por ELISA por su respuesta contra M arupense para su posterior expansión y 
caracterización. 
 
Tabla 9.Hibridomas positivos contra la cepa Mycobacterium arupense 
Clona Clona Clona Clona 
1D7 2H8 3E1 3G3 
2D10 2H12 3E2 3G5 
2E7 3D8 3G2 
 
Posteriormente se eligieron sólo las clonas que mostraron mayor respuesta contra la 
bacteria para su posterior expansión y caracterización. 
 
 
Gráfica 7. Gráfica representativa de la selección de las clonas productoras de anticuerpos 
mediante ELISA de los sobrenadantes de las clonas seleccionadas 
 
Como parte del escrutinio para determinar el isotipo de anticuerpos monoclonales 
se analizaron los sobrenadantes de las clonas mediante la técnica de ELISA por 
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inmunofluorescencia. En la gráfica 8 se muestra los resultados para el ensayo para 
determinar la presencia del isotipo IgG1, mismo que resultó negativo. 
 
 
Gráfica 8.Respuesta de los sobrenadantes al anticuerpo contra IgG1. 
 
En el ensayo para determinar el isotipo IgG2 (Gráfica 9) se determinó que las clonas 
mostraron una reacción positiva. 
 
 
Gráfica 9.Respuesta de los sobrenadantes al anticuerpo contra IgG2a. 
 
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6.5. Caracterización de Hibridomas 
 
A partir de los sobrenadantes de las clonas se realizó la isotipificación de los anticuerpos 
con el ensayo MULTIPLEX, los resultados de este ensayo (Gráfica 10) mostraron la 
presencia mayoritaria de un isotipo. 
 
 
Gráfica 10. Determinación de isotipo de las clonas contra M. arupense el isotipo 
mayoritario correspondió a IgG2. 
 
 
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Gráfica 11. Evaluación de reactividad cruzada entre el anticuerpo monoclonal 
Ma2D10 y Ma 1D7 contra otras micobacterias 
 
El mayor reconocimiento se observó para la cepa homóloga, seguida de las otras 
micobacterias no tuberculosas, las cepas del complejo MTB, las subcepas BCG y la de 
menor reactividad fue para M. microti 
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7. Discusión. 
 
La identificación de micobacterias no tuberculosas ha tomado gran importancia por la 
asociación a patologías, falsos positivos en el diagnóstico por el PPD y la disminución de 
la eficacia protectora de la vacunación con BCG (56). Estas micobacterias están 
ampliamente distribuidas en diferentes ecosistemas donde el agua es considerado como el 
principal vehículo, por lo cual, diferentes autores realizaron estudios para identificar las 
especies de micobacterias presentes en agua con el fin de dilucidar cuáles son las 
especies con las que estamos en contacto frecuente (10-16). 
 
 En la ciudad de México el grupo del Programa de Inmunología Molecular Microbiana 
aisló diferentes especies de micobacterias no tuberculosas a partir de muestras 
provenientes de la Zona Metropolitana de la Ciudad de México, a partir de estos estudios: 
las cepas de micobacterias con mayor prevalencia y/o de importancia clínica se 
seleccionaron, entre las que se encontraba la cepa Mycobacterium arupense. La 
caracterización de esta cepa es de importancia debido a que existen pocos reportes sobre 
esta especie de MNT y por su asociación con patologías, lo cual está probablemente 
relacionado a la baja especificidad de sus pruebas bioquímicas, y a la identificación 
ineficaz mediante el patrón de ácidos micólicos por HPLC. Cabe mencionar que Castillo-
Rodal y López-Vidal (manuscrito enviado, Appl Envior Microbiol 2009) reportaron el 
aislamiento de Mycobacterium arupense de agua para uso y consumo humano. 
 
 Mycobacterium arupense es un bacilo corto que suele formar grupos dando la 
apariencia de bacilos largos. El crecimiento en fase media logarítmica se alcanza a una 
densidad óptica de 0.9 el cual se logra entre el 9° y 10° día; en esta fase la bacteria se 
encuentra metabólicamenteactiva expresando una gran cantidad de proteínas lo que 
incrementó la probabilidad de encontrar proteínas de baja expresión para la obtención del 
proteoma de esta cepa. Además, al existir una mayor cantidad de proteínas, esperábamos 
que se formara una respuesta inmune humoral en contra de la mayor cantidad de epítopes 
y con esto aumentar la posibilidad de obtener un ratón con una respuesta inmune eficiente 
contra alguna proteína específica de la especie para realizar la fusión celular. 
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 La proteómica combina la separación de proteínas a gran escala y la sensibilidad de 
la identificación de estas por lo que es ampliamente usada en estudios de geles de 
segunda dimensión para estudios de distribución de proteínas, expresión diferencial, 
interacciones entre éstas y las posibles modificaciones post-traduccionales. A pesar de 
estas ventajas las réplicas de los proteomas tienen diferencias, las cuales no se atribuyen 
a un factor único, más bien, es una mezcla de factores como la diferencia en la regulación 
de expresión génica, procesos diferentes de modificación prost-traduccional, mutaciones 
puntuales y diferencias génicas aún no descritas, por esto, es necesario realizar una 
plantilla integral, en el cual se incorporan las imágenes de cada réplica para formar una 
imagen que reúna el mayor número de proteínas con el fin de tener un mapa 
representativo de todas las proteínas que expresa la muestra en un momento definido (57-
58). 
 
 Para este proteoma se utilizó un gradiente de pH de 4-10 debido a que en ensayos 
previos y en otras publicaciones de geles de 2D-PAGE de otras micobacterias se ha 
observado que las proteínas se concentran en este intervalo (59-60); para comparar los 
proteomas independientes y construir el gel maestro se evaluó el coeficiente de variación 
de diferentes parámetros que son proporcionados por el programa PD Quest (ver tabla 6) 
el cuál para ser válido debe de permanecer siempre inferior a un coeficiente de variación 
del 30%. En la figura 12 se localizaron 876 proteínas que se distribuyeron en tiras de 
inmovilinas con gradiente de pH inmóvil encontrándose la mayor cantidad en un intervalo 
de 4.51 a 5.75 (Gráfica 3), además, la mayor cantidad de estas oscila entre 20 a 80 kDa lo 
cual nos indica que hay la mayor parte de estas son de bajo peso molecular (Gráfica 4). 
 
 En los geles que se presentan no se puede realizar un estudio comparativo de 
abundancia de proteínas, debido a que la técnica empleada para la tinción con nitrato de 
plata no permite realizar esta comparación, sin embargo, al realizar una tinción con azul de 
Coomassie en la cual la intensidad del punto está relacionada con la abundancia de la 
proteína este análisis sería factible (61). 
 
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 Actualmente, éste es el primer reporte del proteoma de esta micobacteria, por lo 
que al conocer la distribución de proteínas se podrían realizar análisis comparativos con 
los proteomas de otras micobacterias, tanto tuberculosas como no tuberculosas con el fin 
de identificar proteínas únicas para cada especie de micobacteria, así como realizar 
estudios comparativos entre la expresión de proteínas de Mycobacterium arupense 
proveniente de aislamientos clínicos como de aislamientos ambientales. 
 
 Las cepas seleccionadas para la inmunización se irradiaron en el Instituto Nacional 
de Investigaciones Nucleares debido a que se desconoce el riesgo patogénico, así como 
limitar la secreción de proteínas para que la respuesta montada sea contra componentes 
de la membrana y de sustancias intracelulares. Como se puede observar en la tabla 7, la 
mayor parte de las micobacterias pertenecen al grupo de MNT excepto Mycobacterium 
bovis BCG Danesa, la cual se seleccionó porque es una de las vacunas que se emplearon 
en México y en la etapa inicial del proyecto se deseaba comparar la respuesta humoral 
causada por la vacuna contra la causada por MNT. 
 
 La sangría de los ratones se realizó mediante punción en la vena del plexo maxilar; 
esta técnica es fácil y no es tan invasiva ni traumática como lo es la toma de muestra de la 
comisura externa de los párpados en el seno venoso con un capilar, además, se obtiene 
suficiente sangre para evaluar la respuesta humoral montada por los ratones después de 
cada inmunización. El análisis del suero de los ratones se evaluó para cada cepa a partir 
de la cual se eligió el ratón con mayor respuesta en el tiempo 2 (Gráfica 6) por lo que se 
seleccionó a la micobacteria con una mayor respuesta, siendo M. arupense para realizar la 
fusión celular. En esta misma gráfica podemos observar que la micobacteria que causó 
menor respuesta fue Mycobacterium bovis BCG Danesa esto podría deberse a que esta 
micobacteria causa principalmente una respuesta de tipo TH1 lo cual explicaría el título de 
anticuerpos observado. 
 
 Al inmunizar los ratones se monta una respuesta inmune para eliminar al antígeno; 
al inmunizar varias veces los ratones con el mismo antígeno, se propicia el incremento de 
la respuesta inmune adquirida lo cual provoca que aumenten los linfocitos B con memoria, 
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que al diferenciarse a células plasmáticas se incrementa la cantidad de anticuerpos 
capaces de reconocer al antígeno. 
 
 Al realizar la fusión de las células de mieloma con los esplenocitos, sólo los 
hibridomas estables son capaces de sobrevivir en el medio HAT (Figura 7 y 8), además de 
esto, el medio del kit empleado contiene metilcelulosa, otorgandole una consistencia 
semisólida con la cuál se pueden dispersar los hibridomas para facilitar su separación, por 
otra parte, esta característica del medio les permite tener nutrientes y crecer en forma de 
colonias, por lo cual, al tomar las colonias se espera que éstas sean hibridomas 
productores de un mismo tipo de anticuerpo, es decir, anticuerpos monoclonales. Al 
finalizar la fusión se aislaron 297 colonias de hibridomas que se colocaron en placas de 96 
pozos. De estos pozos se tomó el sobrenadante para seleccionar únicamente las clonas 
productoras de anticuerpos que reconocieran al antígeno inmunizado. Finalmente se 
seleccionaron sólo 11 colonias capaces de reconocer a la cepa M. arupense usando como 
control positivo suero de ratón inmunizado que por su naturaleza policlonal reconoce 
varios epítopes del antígeno dando como resultado una mayor señal con el anticuerpo 
secundario (anti IgG1). Sólo el 1.4% de los hibridomas se seleccionó para su proliferación 
por tener la mejor señal con el anticuerpo secundario. Una explicación es que durante la 
fusión no sólo existe la unión linfocito B-mieloma, sino que también puede existir la unión 
de otros esplenocitos con las células de mieloma, estas uniones podrían ser estables, pero 
no producirían anticuerpos. Otra opción es que los anticuerpos producidos no monten una 
respuesta suficiente por lo cual no se consideraron para su proliferación. 
 
 Debido a que la producción de anticuerpos monoclonales tiene costos muy elevados 
se realizó otro tamizaje para seleccionar las clonas con el mayor título de anticuerpos 
respuesta mediante análisis con ELISA con el anticuerpo secundario de conejo anti IgG1 
de ratón, por lo cual sólo se seleccionaron 6 clonas para su proliferación (Gráfica 7). 
 
 Posteriormente, se realizó la titulación por el método de ELISA de las clonas con el 
mayor crecimiento mediante ELISA por inmunofluorescencia para evaluar la presencia de 
un isotipo de anticuerpo. En estos resultados observamos que al revelar con el anticuerpo 
Neevia docConverter 5.1
Anticuerpos Monoclonales 
 
Facultad de Química. UNAM 
 
anti-IgG1 tenían la misma tendencia al comparase con el suero hiperinmune; (Gráfica 8)