Purificacion-y-activacion-de-linfocitos-T-CD4-humanos--caracterizacion-de-pureza-viabilidad-y-expresion-de-marcadores-de-superficie

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
FACULTAD DE CIENCIAS 
 
 
 
PURIFICACIÓN Y ACTIVACIÓN DE LINFOCITOS 
T CD4+ HUMANOS: CARACTERIZACIÓN 
DE PUREZA, VIABILIDAD Y EXPRESIÓN 
DE MARCADORES DE SUPERFICIE 
 
 
T E S I S 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
LICENCIADA EN BIOLOGÍA 
P R E S E N T A: 
 
ALEJANDRA VERÓNICA SILVA CASTRO 
 
DIRECTORA DE TESIS 
DRA. LEONOR HUERTA HERNÁNDEZ 
 
 Ciudad Universitaria, Cd. Mx., 2017 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
Hoja de Datos del Jurado 
1. Datos del alumno 
Silva 
Castro 
Alejandra Verónica 
63653497 
Universidad Nacional Autónoma de México 
Facultad de Ciencias 
Biología 
309325084 
 
2. Datos del tutor 
Dra. 
Leonor 
Huerta 
Hernández 
 
3. Datos del sinodal 1 
M. en C. 
Erasmo 
Martínez 
Cordero 
 
4. Datos del sinodal 2 
Biol. 
Saúl 
Cano 
Colín 
 
5. Datos del sinodal 3 
Dr. 
Benito 
Estrada 
Mena 
 
6. Datos del sinodal 4 
M. en IBB. 
Diana Elodia 
Aguilar 
León 
 
7. Datos del trabajo escrito 
Purificación y activación de linfocitos T CD4+ humanos 
Caracterización de pureza, viabilidad y expresión de marcadores de 
superficie 
74 p 
2017 
Agradecimientos 
A la Dra. Leonor Huerta Hernández por darme la oportunidad de formar parte de 
su equipo de trabajo, por su tiempo y su paciencia, por el apoyo que me ha 
brindado y por su atención como mi tutora. 
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por la beca otorgada a 
través del proyecto 238931 
A la Dirección General de Asuntos del personal académico de la UNAM, proyecto 
PAPIIT IN211716. 
Al Q.F.B. Carlos Castellanos por su capacitación en el uso del citómetro de flujo. 
Al banco de sangre del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición 
Salvador Zubirán y al Q. Alonso Ramírez, por los paquetes leucocitarios que me 
brindaron para el presente trabajo. 
A mis hermanos Edith, Eduardo, Denis y Rodolfo, que sin su compañía, apoyo y 
afecto no hay motivación ni ejemplos para seguir. 
A mis abuelos Jorge y Guillermina, por la crianza y educación que me brindaron y 
que sin ellos no sería la persona que hoy soy. 
A mis tíos Norberto y Alejandra, que siempre se han preocupado y velado por mis 
hermanos y por mí y son un gran apoyo moral. 
A mi madre Guadalupe, que sin los sacrificios tan grandes que ha hecho yo no 
estaría aquí. 
A mi padre Rodolfo, que donde quiera que se encuentre siempre me ha dado la 
fuerza para seguir adelante. 
A Joel y mi Jillian, que son hoy por hoy los pilares que me impulsan a seguir 
luchando por mis objetivos personales y profesionales. 
A David, Mirna, Onasis, Memo e Isabel, que sin su compañía, enseñanzas y 
buenos momentos esto no sería igual. 
A mis mejores amigos, Ulises, Melissa y Carlos, por haber estado conmigo a lo 
largo de la carrera apoyándonos mutuamente y hacerlo más ameno. 
A la señora Gabriela, el señor Evaristo y sus familias, que sin el apoyo que me 
brindaron no hubiera logrado concluir mis estudios, así como a Erik por todo lo que 
vivimos y por ayudarme con algunas ilustraciones en el presente trabajo. 
1 
 
ÍNDICE 
 
ABREVIATURAS .................................................................................................... 3 
RESUMEN .............................................................................................................. 6 
INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 7 
1. Activación de los linfocitos T CD4+ ................................................................ 8 
2. Activación in vitro ........................................................................................ 13 
3. Marcadores de superficie que se estudiaron en este trabajo ...................... 15 
3.1 CD3 .......................................................................................................... 16 
3.2 CD4 .......................................................................................................... 18 
3.3 CD25 (IL-2Rα) .......................................................................................... 20 
3.4 CD54 (ICAM-1) ......................................................................................... 21 
3.5 CD184 (CXCR4) ....................................................................................... 22 
JUSTIFICACIÓN ................................................................................................... 24 
HIPÓTESIS ........................................................................................................... 25 
OBJETIVO ............................................................................................................ 25 
OBJETIVOS PARTICULARES .............................................................................. 25 
METODOLOGÍA ................................................................................................... 26 
1. Anticuerpos utilizados ................................................................................. 26 
2. Paquetes leucocitarios ................................................................................ 27 
3. Obtención de PBMCs por gradiente de Ficoll y su cultivo posterior. ........... 27 
4. Obtención de Linfocitos T CD4+ (selección negativa) ................................. 28 
5. Aumento de la pureza ................................................................................. 30 
6. Activación de los linfocitos con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 acoplados 
a perlas magnéticas ........................................................................................... 31 
7. Detección de los marcadores de superficie ................................................. 32 
9. Cambios morfológicos celulares .................................................................. 34 
RESULTADOS ...................................................................................................... 36 
2 
 
1. Rendimiento y pureza de los linfocitos T CD4+ purificados por selección 
negativa ............................................................................................................. 36 
2. Activación de linfocitos T CD4+ con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 
acoplados a perlas magnéticas ......................................................................... 39 
2.2 Efecto de la activación sobre la expresión de CD25 (IL-2Rα) y CD54 
(ICAM-1) ......................................................................................................... 43 
2.3 Efecto de la activación sobre la expresión de CD3, CD4 y CD184 (CXCR4)
 ....................................................................................................................... 45 
DISCUSIÓN .......................................................................................................... 52 
PERSPECTIVAS ................................................................................................... 61 
CONCLUSIONES ................................................................................................. 62 
BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................... 63 
 
 
3ABREVIATURAS 
Ac: Linfocitos T CD4+ activados 
Anti-CD3: Anticuerpo monoclonal que se une a CD3 en la superficie de los 
linfocitos T 
Anti-CD28: Anticuerpo monoclonal que se une a proteínas de la familia B7 
proporcionando una señal auxiliar durante la activación del linfocito T 
APC: Fluorocromo aloficocianina 
APCs: Células presentadoras de antígeno (por sus siglas en inglés) 
B7: Familia de glucoproteínas de estructura similar (B7.1 o CD80, y B7.2 o CD86) 
que actúan como receptores presentes sobre la membrana de las células 
presentadoras de antígeno 
BSA: Albúmina Sérica Bovina (por sus siglas en inglés) 
c-Fos, c-Myc, c-Jun, NFAT y NF-κB. 
CD11a/CD18: Integrina β2 (denominadas así porque su cadena beta es el CD18), 
cuya cadena α es el CD11a (o αL). Se expresa en todas las células 
hematopoyéticas y participa en su adhesión al endotelio por medio de su unión a 
las moléculas ICAM-1 e ICAM-2. Asimismo participa en las interacciones entre 
linfocitos T y B y monocitos. También se denomina LFA-1 
CD11b/CD18: Integrina β2, cuya cadena α es el CD11b (o αM). Se trata de una 
molécula de adhesión propia de monocitos y neutrófilos, capaz de interaccionar 
con la molécula ICAM-1, induciendo de este modo la adhesión de dichos tipos 
4 
 
celulares al endotelio, con su consiguiente extravasación. También recibe el 
nombre de CR3, por su capacidad de unir iC3b 
Citofluorometría: Tecnología biofísica basada en la utilización de luz láser sobre 
células que se emplea en su recuento y clasificación según sus características 
morfológicas, presencia de marcadores, y en la ingeniería de proteínas. 
Dynabeads: Microperlas magnéticas acopladas a los anticuerpos anti-CD3 y anti-
CD28 utilizadas para la activación de linfocitos T 
Fas (CD95): Proteína de superficie de 36 kDa con un dominio citoplasmático de 
muerte celular conservado 
FasL: Protenína de membrana de 40 kDa, es el ligando de Fas. 
FITC: Isotiocianato de fluoresceína (por sus siglas en inglés) 
FSC-H: Dispersión frontal de un haz de luz al incidir sobre una partícula (tamaño) 
ICAM-1: Molécula de Adhesión Intercelular-1 (CD54) 
IFM: Índice de Fluorescencia Media 
IL-2: Es una citocina que estimula la proliferación y diferenciación de células T y B 
IL-2Rα: Cadena α del receptor de IL-2 
ITAM: Immuno-receptor Tyrosine Activation Motif 
MHC: Complejo principal de histocompatibilidad 
NA: Linfocitos T CD4+ no activados correspondiente al día 0 
PBMCs: Células mononucleares de sangre periférica (por sus siglas en inglés) 
5 
 
PE: Ficoeritrina (por sus siglas en inglés) 
PFA: Paraformaldehído 
RPMI: Medio de cultivo celular 
SFBi: Suero Fetal Bovino inactivado 
SSC-H: Dispersión lateral de un haz de luz al incidir sobre una partícula 
(granularidad) 
TCR-CD3: Es un complejo de membrana requerido para la estable interacción de 
células T con células presentadoras de antígeno, así como de la comunicación 
intracelular mediada por TCR 
Th1: Subpoblación de linfocitos T cooperadores que regulan la respuesta 
inmunitaria contra agentes patógenos intracelulares 
Th2: Subpoblación de linfocitos T que regulan la respuesta inmunitaria contra 
agentes patógenos extracelulares 
TNF: Tumor Necrosis Factor 
VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Humana 
 
 
 
 
 
6 
 
RESUMEN 
 Durante la activación de los linfocitos T mediante la presentación de 
antígeno, el linfocito T virgen sufre cambios en su ciclo celular, en la dinámica y 
composición de la membrana ya que cambia la expresión de los marcadores de 
superficie, y además en la producción de citocinas. Con el propósito de determinar 
la respuesta a la activación de linfocitos T CD4+ con anticuerpos anti-CD3 y anti-
CD28 acoplados a perlas magnéticas, un estímulo que simula la presentación de 
antígenos, se determinaron algunas características como pureza, viabilidad, 
morfología celular y expresión de marcadores de superficie. Se dejó el estímulo 
por 3 y 6 días y, al término, se determinó la expresión de marcadores inducibles 
con la activación, como CD25 (IL-2Rα) y CD54 (ICAM-1); así como la expresión de 
CD3, CD4 y CD184 (CXCR4), a través del uso de citofluorometría. La activación 
provocó la expresión muy alta de CD25 y CD54 al tercer día, mientras que para 
CD3 y CD184 provocó una disminución muy marcada de su expresión, la cual 
continuó hasta el sexto día. Por otra parte, CD4 disminuyó sólo al sexto día de 
activación. En la viabilidad celular, se encontró una marcada disminución (entre 
25 a 55%) en todos los casos al tercer día, debida al efecto de muerte celular 
inducida por activación (AICD). Por lo tanto, en nuestras condiciones 
experimentales, la activación a través de éste modelo fue óptima después de 3 
días de activación, a la vez que generó una disminución considerable en la 
proporción de células viables. 
 
7 
 
INTRODUCCIÓN 
Los linfocitos son las células del sistema inmunitario encargadas de la 
respuesta inmune adaptativa porque son capaces de reconocer diversos 
determinantes antigénicos y de distinguirlos específicamente. Esta respuesta de 
reacción frente a una infección es lenta ya que se adapta (como lo indica su 
nombre) para reconocer, eliminar y memorizar al agente patógeno invasor. Existen 
distintas subpoblaciones de linfocitos, caracterizadas por las funciones que llevan 
a cabo y por sus características fenotípicas. Tal es el caso de los linfocitos T, que 
son los mediadores de la inmunidad celular y que migran de la médula ósea hacia 
el timo para madurar allí. A su vez, las subpoblaciones de linfocitos T se clasifican 
gracias a sus proteínas de membrana en linfocitos T cooperadores (CD4) y T 
citotóxicos (CD8). Se le denomina “cúmulo de diferenciación” (Cluster of 
Differentiation por sus siglas en inglés) a las proteínas que se encuentran en la 
superficie celular utilizadas como marcador de diferenciación linfocítica. Los 
linfocitos T maduros que nunca se han expuesto a un antígeno se llaman 
vírgenes, y los linfocitos T que han sido estimulados por un antígeno y que han 
sobrevivido, se diferencian en células de memoria que desencadenarán futuras 
respuestas inmunitarias más rápidas e intensas. Los linfocitos vírgenes y de 
memoria son denominados conjuntamente como células en reposo y 
morfológicamente son indistintos y pequeños (8-10 μm) con un gran núcleo y 
heterocromatina densa, un borde de citoplasma delgado y pocos organelos. Los 
linfocitos en reposo se encuentran en la fase G0 del ciclo celular y una vez 
estimulados entran en la fase G1. En este momento son denominados linfocitos 
activados y morfológicamente son más grandes (10-12 μm), aumentan el tamaño 
8 
 
del citoplasma y de organelos, así como de RNA citoplasmático, por lo que son 
denominados como linfoblastos (Abbas, A., et al 2008). 
En sangre periférica existen aproximadamente 2,000 linfocitos/mm3 para 
ser un total de 1011 linfocitos circulantes. Durante la infección aguda, el recuento 
de linfocitos aumenta cuatro veces o más. La supervivencia de un linfocito 
activado depende de la unión de los receptores al antígeno, de los propios 
antígenos y de las citocinas tales como la IL-2, IL-4, IL-6, IL-9, IL-16 e IL-17 (Owen 
et al, 2014). 
 
1. Activación de los linfocitos T CD4+ 
 El inicio de las respuestas inmunitarias celulares precisa que los linfocitos T 
CD4+ vírgenes y los antígenos que van a reconocer estén en el mismo tejido 
linfático. Estos linfocitos se encuentran en los órganos linfáticos secundarios 
(ganglios linfáticos y tejido linfoide asociado a mucosas) y para ser activados 
deben reconocer a su antígeno a través de las células presentadoras de antígeno 
(APCs) que son un subgrupo de leucocitos caracterizados por expresar en su 
membrana el complejo principal de histocompatibilidad (MHC). El MHC es un 
conjunto de glicoproteínas unidas a la membrana celular y son capaces de 
presentar antígenos cargados en surcos formando complejosestables con 
ligandos peptídicos. Estos complejos son desplegados sobre la superficie celular 
para ser reconocidos por las células T a través del receptor de célula T (TCR). 
Existen dos tipos principales de MHC: clase I y clase II. El MHC clase I se 
encuentran en todas las células nucleadas del cuerpo y presentan antígenos 
9 
 
originados a partir del citosol de las células. Éstos antígenos son presentados a 
células T CD8+ encargadas de reconocer y matar a las células que expresan los 
antígenos intracelulares. En cambio, el MHC clase II se encuentra casi 
exclusivamente sobre las APCs, como células dendríticas, y presentan antígenos 
provenientes de espacios extracelulares que han sido fagocitados o endocitados 
por estas células (Figura 1). El antígeno es procesado por la célula y, 
posteriormente el MHC clase II presenta el péptido antigénico a las células T CD4+ 
que quedan activadas y estimulan la inmunidad para destruir a los invasores 
extracelulares. Como resultado, se obtiene la expansión de linfocitos específicos 
para un antígeno y la posterior diferenciación de linfocitos efectores y de memoria 
(Goldsby, R., et al 2005; Abbas, A., et al 2008; Owen et al, 2014). 
 
Figura 1. Esquema general y topológico de la activación de linfocitos T vírgenes y efectores 
por un antígeno. Los antígenos son transportados por la célula dendrítica a través de su 
internalización mediante fagocitosis o endocitosis, y después son procesados y presentados por el 
MHC clase II. La célula dendrítica llega a los ganglios linfáticos y comienza la presentación de 
Los linfocitos T virgenes 
circulan en los ganglios 
linfáticos y se encuentran 
con sus antígenos 
Linfocito T 
virgen 
Activación de los 
linfocitos T vírgen en el 
ganglio linfático 
Activación de los 
linfocitos T efectores 
en el lugar de la 
infección 
10 
 
antígeno a los linfocitos T vírgenes que circulan en estos ganglios. La activación de estas células 
produce la diferenciación en células efectoras y de memoria que pueden quedarse en el ganglio o 
viajar a los tejidos infectados donde las células efectoras se activan de nuevo por el antígeno. 
(Imagen tomada y modificada de Abbas 2012). 
 
 Existe otra subpoblación de linfocitos CD4+ denominada T cooperadores 
(TH) y son muy importantes porque guían la actividad de otras células inmunitarias 
y son esenciales para seleccionar la vía que tomará la respuesta inmunitaria. La 
activación de éstos linfocitos es a través de la interacción complejo TCR-CD3 con 
el MHC clase II en la célula dendrítica. Para lograr la completa activación se 
requiere de la participación del correceptor CD4 (señal 1) así como de una señal 
coestimuladora (señal 2), proveída por la APCs a través de la interacción de 
proteínas de la familia B7 (CD80, CD86) con CD28 en la célula TH (Abbas, A., et 
al 1999; Owen et al, 2014). A este conjunto de moléculas esenciales en la sinapsis 
inmunológica se le conoce como complejo de activación supramolecular central 
(cSMAC, por sus siglas en inglés) (Owen, J., et al 2014). 
 Por otro lado, la afinidad del TCR hacia su péptido es muy baja, lo que 
sugiere que durante la presentación de antígeno, otras interacciones ligando-
receptor pueden ser necesarias para aumentar la eficiencia de la activación como 
es el caso de la integrina LFA-1 en las células T y su ligando ICAM-1 (CD54) en la 
APCs (Dubey, C., et al, 1996) (Figura 2). Estas moléculas se encuentran en la 
periferia del cSMAC para estabilizar la señal 1, por lo que a este conjunto 
secundario se le conoce como complejo de activación supramolecular periférico 
(pSMAC, por sus siglas en inglés) (Owen, J., et al 2014). 
 
11 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Sinapsis inmunológica entre célula T CD4
+
 y APCs. La activación es iniciada a través 
del complejo TCR-CD3 y el CD4 en el linfocito TH con el MHC clase II en la APCs (señal 1) y se 
completa a través de la interacción de CD28 (TH) con moléculas de la familia B7 (APCs) (señal 2) y 
las moléculas de adhesión (LFA-1 - ICAM-1). cSMAC (complejo de activación supramolecular 
central), pSMAC (complejo de activación supramolecular periférico) (Imagen tomada de Owen, J., 
et al 2014). 
 
 Diversas observaciones de investigadores han propuesto que el encuentro 
entre una célula T virgen y una dendrítica se da en tres etapas: 1) un periodo 
inicial de 1 a 2 horas cuando las células hacen contactos seriados breves (de 5 a 
15 minutos) con las dendríticas, seguido de 2) un periodo de 2 a 14 horas de 
uniones más estables (>6 horas) de la célula T con la dendrítica que, a su vez, es 
seguido de 3) un periodo durante el cual las células se desunieron y volvieron 
unirse unas con otras, mostrando una conducta de “arremolinado” alrededor de las 
12 
 
dendríticas. Estas tres etapas precedieron a los primeros signos de proliferación, 
que empezaron 24 a 36 horas después del encuentro inicial con antígeno y 
continuaron hasta el cuarto y quinto día después de la introducción de antígeno 
(Owen, J., et al 2014). 
La proliferación de los linfocitos T como resultado de la activación, depende 
de una combinación de señales provenientes del receptor para el antígeno, los 
coestimuladores y los factores de crecimiento, principalmente la IL-2. Los linfocitos 
T CD4+ producen IL-2 y responden preferentemente a ella de manera autócrina 
(secreción de una citocina por una célula que ella misma recibe en sus 
receptores), parácrina (secreción de una citocina que actúa sobre células cerca 
de la célula secretora) y endócrina (secreción de una citocina que actúa sobre 
otras células y tiene que viajar a través del torrente sanguíneo), asegurando así 
que los linfocitos T antígeno-específicos sean los que proliferen más. Este proceso 
es conocido como expansión clonal. Durante la activación también ocurre una 
cascada de señalización dentro del linfocito T provocando la transcripción de 
genes. Estos genes se clasifican en tres categorías: 
 Los genes inmediatos, que se expresan en el transcurso de media hora tras 
el reconocimiento de antígeno, y constituyen varios factores de 
transcripción. 
 Los genes tempranos, que se expresan en más de dos días después del 
reconocimiento de antígeno, y constituyen la IL-2, IL-2R, IL-3, IL-6, IFN-γ, 
entre otros. 
13 
 
 Los genes tardíos, que se expresan más de dos días después del 
reconocimiento de antígeno, y constituyen varias moléculas de adhesión. 
Unas 48 horas después de la activación, el linfocito T virgen crece y se 
convierte en un blastocito que comienza a experimentar ciclos de división celular 
dos o tres veces por día durante cuatro a cinco días, creando así una extensa 
clona de células progenitoras, que se diferencian en subpoblaciones de células T 
de memoria o efectoras (Goldsby, R., et al 2005) 
Una vez eliminados los antígenos, aproximadamente 90% de linfocitos T 
activados mueren por apoptosis, y el otro 10% sobreviven para diferenciarse en 
linfocitos T de memoria y efectores (Abbas, A., et al 2008; Owen et al, 2014). La 
muerte celular es un evento normal durante la activación inmunológica y se 
conoce como AICD (activation induced cell death). Es un mecanismo 
homeostático de gran importancia, ya que contribuye en la disminución del fondo 
común de células T activadas, una vez erradicado el antígeno y elimina células T 
autorreactivas solitarias, estimuladas por antígenos propios. Este fenómeno es 
inducido por la activación celular a través del receptor de células T (TCR) e 
involucra los receptores de muerte en la membrana, incluyendo a Fas (CD95) y 
Fas ligando (FasL) (Owen, J. et al 2014). 
 
2. Activación in vitro 
 Los linfocitos T CD4+ de sangre periférica en estado de reposo (fase G0 del 
ciclo celular) producen bajos niveles de citocinas, por lo que su estimulación in 
vitro se usa para facilitar la expansión y principalmente el estudio de su función 
14 
 
celular. Existenmoléculas mitogénicas como lectinas y anticuerpos monoclonales 
anti-CD3 y anti-CD28 que promueven la proliferación policlonal, mientras que el 
antígeno específico produce una expansión monoclonal u oligoclonal (Munck 
Petersen C., et al 1992; Trickett A., et al 2003). 
Si la estimulación es producida con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 
acoplados a perlas magnéticas, esto da como resultado una activación más 
parecida a la fisiológica (figura 3). De esta manera, las células T pueden 
expandirse eficientemente usando los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 
inmovilizados (Levine B., et al 1996). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Diagrama de activación in vitro de los linfocitos T con perlas magnéticas 
acopladas a anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. Se hace la comparación entre la activación in 
vivo (parte superior) y la activación in vitro (parte inferior). (Imagen tomada y modificada del inserto 
de Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 con permiso de Thermofisher). 
15 
 
La activación in vitro es un procedimiento muy usado para diversos 
estudios, como la expresión de marcadores de superficie (fenotipo), estudios de 
funciones de las células como migración, producción de citocinas, efectos 
citotóxicos y replicación de virus como el VIH y tiene varias ventajas; entre ellas 
destaca la activación de las células T sin necesidad de APCs, las células 
activadas se mantienen in vivo, existe una máxima reproducibilidad sin 
contaminación por anticuerpos solubles y la expansión de células activadas es de 
100 a 1000 veces. En cuanto a aplicaciones posteriores, las células T activadas 
pueden ser analizadas ya sea para transfecciones de DNA, transducción de 
señales extracelulares, intracelulares o intercelulares o para el estudio de 
señalización del TCR, proteómica, expresión génica, etc. Además, las células T 
pueden dejarse en cultivo para que puedan diferenciarse en subpoblaciones de 
linfocitos T cooperadores o expandirlos policlonalmente o mediante especificidad 
de antígeno (Langsdorf, C., et al; Aarvak, T., et al). 
 
3. Marcadores de superficie que se estudiaron en este trabajo 
Como se sabe, los linfocitos en reposo expresan distintos receptores en la 
superficie de sus membranas, lo que permite clasificarlos ya sea dentro de una 
subpoblación u otra, dependiendo del repertorio expresado. Sin embargo, se sabe 
que la activación produce un cambio en la expresión génica que regula el cambio 
en el fenotipo de una célula, como en el caso de la expresión de la cadena α del 
receptor de IL-2 (Owen, J., et al, 2014). En la siguiente tabla se describen 
brevemente, los marcadores de superficie que fueron analizados antes y después 
16 
 
de la activación in vitro de los linfocitos T CD4+ con anticuerpos anti-CD3 y anti-
CD28 acoplados a perlas magnéticas: 
Marcador celular Función 
CD3 
Asociado con el TCR es requerido en la 
superficie celular para la transducción de 
señales 
CD4 
Es el correceptor para las moléculas del MHC 
clase II y es el receptor principal de la gp120 
del VIH-1 y VIH-2 
CD25 Es la cadena α del receptor de IL-2 
CD54 
Es una molécula de adhesión intercelular 
(ICAM-1) que se une a la integrina 
CD11a/CD18 (LFA-1) y a la integrina 
CD11b/CD18 (Mac-1), receptor de rinovirus 
CD184 
También llamado CXCR4, actúa como cofactor 
para la fusión y entrada del VIH-1 a la línea 
celular T. Es receptor de la quimiocina CXCL12 
que retiene y activa linfocitos T 
 
Tabla 3. Marcadores analizados y su función general. (Información adquirida de Janeway’s 
Immunology 2012) 
 
3.1 CD3 
Este receptor es un complejo hexamérico formado por las moléculas CD3γ, 
CD3δ y CD3ε, y la cadena ζ con un dominio extracelular corto (figura 3.1). Está 
asociado al TCR en células T y es el encargado de iniciar la transmisión 
intracelular de las señales que se producen por el reconocimiento del ligando por 
17 
 
el receptor (Owen, J., et al, 2014). Tiene un par de dominios citoplasmáticos largos 
con múltiples copias de sitios de activación del inmunorreceptor basados en 
tirosina (ITAM, por sus siglas en inglés). La fosforilación de residuos de ITAM-
tirosina permite el acoplamiento de moléculas adaptadoras, que dan lugar a las 
cascadas de señalización para la activación celular (Murphy, 2012). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3.1. Cadenas γ, δ, ε y ζ del CD3 asociadas al TCR. En la imagen se muestran los 
dímeros δε, γε y ζζ (dominios extracelulares cortos), las barras en amarillo que componen los 
dominios citoplasmáticos de los dímeros son ITAM (motivos de activación de inmunorreceptor 
basados en tirosina). En el esquema están señalados el TCR, el CD4 y la interacción de éstos con 
el MHC clase II en la APCs. También se muestran el receptor CD28 en la célula T y su ligando 
CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2) en la APCs. Se señalan también los puentes disulfuro. (Imagen 
tomada y modificada de Owen, J., et al 2014). 
 
ITAM 
18 
 
3.2 CD4 
Es una glicoproteína monomérica de membrana de 55 kDa que contiene 
cuatro dominios extracelulares tipo inmunoglobulina (D1 a D4), una dominio 
transmembranal hidrofóbico, y un dominio citoplasmático largo que contiene tres 
residuos de serina que pueden ser fosforilados (figura 3.2) (Owen, J., et al, 2014). 
Sus dominios extracelulares se unen a regiones conservadas de moléculas del 
MHC clase II. Esta interacción aumenta la avidez de la unión de la célula T a su 
blanco. También ayuda al acercamiento de los dominios citoplasmáticos del 
TCR/CD3 y su correceptor respectivo, para así iniciar la cascada de señalización 
de activación de la célula. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3.2. Receptor CD4. Se ilustran los cuatro dominios (D1-D4) extracelulares de tipo 
inmunoglobulina, así como los puentes disulfuro. (Imagen tomada y modificada de Owen, J., et al 
2014). 
Ex
tr
ac
el
u
la
r 
C
it
o
p
la
sm
a 
Membrana 
19 
 
Por otra parte, es el principal receptor para que se una el VIH (Levy, J., 
2007) ya que algunos estudios indican que la región D1 del CD4 interactúa con la 
glicoproteína gp120 viral (DeRossi et al, 1991). Esta unión provoca cambios 
conformacionales tanto en CD4 como en gp120 teniendo como consecuencia la 
exposición del receptor de quimiocina CXCR4 (CD184) que funciona como 
correceptor para la unión del virus en linfocitos T CD4+ (Myszka, D., et al 2000). A 
su vez, se expone el dominio de fusión de la proteína viral gp41, que actúa como 
un arpón (Moore, J., et al 1990) acercando ambas membranas y provocando la 
fusión de la bicapa lipídica viral con la bicapa celular y de esta manera pueda 
introducirse al citosol de la célula la cápside viral quedando infectada la célula 
(Chan, D., et al 1998) (figura 3.2.1). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3.2.1. Entrada del VIH a la célula. (Fuente: US National Institutes of Health-National 
Institute of Allergy and Infectious Diseases). 
 
VIH-1 
Bucles 
variables 
de gp120 
CXCR4 
CCR5 
Célula 
20 
 
3.3 CD25 (IL-2Rα) 
Es el receptor de superficie de la IL-2. La cadena α es monomérica y tiene 
baja afinidad, es decir, puede unirse a la IL-2, pero es incapaz de transducir una 
señal desde ella. Al estar presente, contribuye a contactos adicionales con el 
ligando de IL-2 (Owen et al, 2014). Por otra parte, el IL-2Rβγ dimérico es de 
afinidad intermedia, es decir, puede transducir una señal y el IL-2Rαβγ trimérico es 
de alta afinidad, del cual depende casi toda la señalización fisiológica (figura 3.3). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3.3. Comparación de las tres formas del receptor de IL-2. Estructura tridimensional de la 
forma de tres cadenas del receptor de IL-2, con IL-2 unida. (Imagen tomada de Wang, X. et al 
2005). 
 
IL-Rγ 
21 
 
3.4 CD54 (ICAM-1) 
Es una molécula de adhesión que pesa 75 a 115 kDa. Se compone de un 
dominio citoplasmático, uno transmembranal y cinco dominios extracelulres de tipo 
inmunoglobulina (figura3.4). Funciona como ligando para CD11a/CD18 o 
CD11b/CD18, así como también es un receptor para rinovirus y para eritrocitos 
infectados con parásitos del paludismo. Promueve el desarrollo, la adhesión 
celular y la activación de células T por presentación de antígeno (Owen et al, 
2014). Ayuda a sostener las señales generadas porque permite las interacciones 
celulares a largo plazo. Como se encuentra alrededor del cSMAC, forma parte del 
complejo de activación supramolecular periférico. En células T en reposo, se 
expresa en un nivel bajo y tiene avidez por LFA-1 (molécula asociada a función 
leucocitaria) (Buckle, A., et al 1990). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3.4. Estructura de ICAM-1. Las asas azules representan los dominios tipo inmunoglobulina 
y la letra C quiere decir que son regiones constantes. (Imagen de Owen, J., et al 2014). 
 
22 
 
3.5 CD184 (CXCR4) 
También llamada CXCR4, es una glicoproteína de ~40 kDa que funciona 
como receptor de quimiocina CXCL12, promueve la apoptosis durante la 
mielopoyesis y es el principal correceptor en las células T para la entrada del VIH 
(Owen et al, 2014). Contiene siete dominios transmembranales y señaliza a través 
de proteínas G (Berger, E., et al 1999). La región amino terminal en el dominio 
extracelular está involucrada en la unión al VIH (Potempa, S., et al 1997) (figura 
3.5). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3.5. Receptor CXCR4. (Imagen tomada de De Clercq, E. 2003) 
 
Ex
tr
ac
el
u
la
r 
In
tr
ac
el
u
la
r 
23 
 
La quimiocina CXCL12, también llamada factor derivado de células 
estromales (SDF1) es expresada constitutivamente por células del estroma de la 
médula ósea, timo, corazón, pulmón, hígado y bazo y uno de sus roles es retener 
células precursoras en este microambiente (Murphy, K. 2012). Es una molécula 
fuertemente quimiotáctica para los linfocitos (Bleul, C., et al, 1996). Los factores 
derivados de las células estromales 1-α y 1-β son citocinas pequeñas que activan 
leucocitos y son inducidos por estímulos proinflamatorios tales como 
lipopolisacáridos, TNF o IL-1. Esta activación se da cuando un linfocito al ser 
extravasado migra y durante el proceso de rodamiento se alenta la célula, lo cual 
permite interacciones entre quimiocinas presentadas sobre la superficie del 
endotelio y los receptores sobre el leucocito. Los eventos de transducción de señal 
causados por esas uniones dan cambio a la conformación y agrupación de 
integrinas (p. ej., LFA-1) sobre el leucocito (Owen et al, 2014). A medida que un 
linfocito entra en la fase G1 del ciclo celular, deja de expresar CXCR4 para poder 
migrar a otras partes del cuerpo (Murphy, K. 2012). 
 
 
 
 
 
24 
 
JUSTIFICACIÓN 
Particularmente, la investigación in vitro sobre los factores que influyen en 
la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) debe 
considerar las variaciones del fenotipo de las células T CD4+, tanto en condiciones 
basales como en respuesta a la activación, dado que la infección in vitro por el 
VIH-1 es óptima en células activadas. Es relevante conocer la variabilidad en el 
fenotipo de los linfocitos causada por el procedimiento de activación específico, en 
este caso, el uso de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 acoplados a perlas 
magnéticas. 
En este trabajo se caracterizaron los linfocitos T CD4+ humanos obtenidos a 
partir de paquetes leucocitarios, determinando: rendimiento, pureza, viabilidad y 
expresión de marcadores de activación antes y después de su estimulación a 
través del receptor de células T (TCR) y de una molécula coestimuladora (CD28). 
Los marcadores de superficie investigados corresponden a aquellos que 
definen al subtipo de células T cooperadoras, a los receptores al VIH-1 y a dos 
importantes marcadores de activación. El conocimiento de la variación de estos 
factores apoya el planteamiento de protocolos experimentales sobre el VIH-1. 
 
 
25 
 
HIPÓTESIS 
La respuesta a la activación de los linfocitos T CD4+ de paquetes 
leucocitarios es diferente entre diferentes individuos y durante distintos tiempos de 
activación. 
 
OBJETIVO 
 Determinar la respuesta a la activación de los linfocitos T aislados de 
paquetes leucocitarios de diferentes individuos y a distintos tiempos de activación, 
analizando la expresión de los marcadores de activación CD25 (cadena alfa del 
receptor para la IL-2) y de la molécula de adhesión CD54 (ICAM-1), así como de 
los receptores CD3, CD4 y CD184. 
 
OBJETIVOS PARTICULARES 
 Purificar linfocitos T CD4+ provenientes de 6 paquetes leucocitarios 
mediante selección negativa utilizando el Kit CD4+ T Cell Isolation human 
MACS® Miltenyi Biotec 
 Determinar el rendimiento de la purificación 
 Activar los linfocitos T CD4+ durante 3 y 6 días 
 Determinar la viabilidad celular 
 Determinar el nivel de expresión de los marcadores CD3, CD4, CD25, 
CD54 y CD184 
26 
 
METODOLOGÍA 
 La activación de los linfocitos T CD4+ de sangre periférica se evaluó 
mediante la expresión de los marcadores CD25 (IL-2Rα) y CD54 (ICAM-1), así 
como la viabilidad celular por medio del método de exclusión por azul de tripano 
en dos diferentes tiempos de activación (3 y 6 días) elegidos con base en el 
tiempo que tarda la expresión del IL-2Rα sobre la célula, así como el tiempo en 
que tardan en dividirse los blastocitos (cuatro a cinco días). Como grupo control se 
utilizaron linfocitos T CD4+ de sangre periférica no activados que corresponden al 
día 0. Para determinar los niveles de expresión de los marcadores CD3, CD4 y 
CD184 (CXCR4) se pusieron en los linfocitos diferentes anticuerpos acoplados a 
los fluorocromos APC, FITC y PE dirigidos contra los marcadores mencionados, 
mediante el análisis por citometría de flujo. Una vez identificada la población de 
linfocitos T CD4+, en el software Attune® Cytometric se seleccionarán las células 
dobles positivas (CD25+/CD54+) y en estas células se evaluarán los niveles de 
expresión de los marcadores. 
1. Anticuerpos utilizados 
Anticuerpo Marca 
No. de 
catálogo 
Fluorocromo 
acoplado 
Control de isotipo 
CD3 
BD 
Pharmingen 
555342 APC APC Mouse IgG2a, κ 
CD4 
BD 
Pharmingen 
555349 APC APC Mouse IgG1, κ 
CD25 
BD 
Pharmingen 
555431 FITC FITC Mouse IgG1, κ 
CD54 
BD 
Pharmingen 
555511 PE PE Mouse IgG1, κ 
CD184 
BD 
Pharmingen 
555976 APC 
APC Mouse 
(BALB/c) IgG2a, κ 
27 
 
Tabla 1. Anticuerpos utilizados. Estos anticuerpos se usaron para marcar los linfocitos T 
CD4
+
 aislados de los paquetes leucocitarios. Posteriormente, se analizaron éstos linfocitos a través 
de un citofluorómetro. 
 
 
 
2. Paquetes leucocitarios 
Seis paquetes leucocitarios fueron proporcionados por el Servicio de Medicina 
Transfusional del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador 
Zubirán provenientes de donadores sanos. Se determinó que los individuos fueran 
sanos basado en la serología proporcionada por el mismo instituto, es decir, que 
las pruebas reactivas fueron negativas para agentes patógenos. El número de 
experimentos se determinó de acuerdo al tiempo que llevó la realización de cada 
ensayo (aproximadamente 2 semanas cada uno). 
 
3. Obtención de PBMCs por gradiente de Ficoll y su cultivo posterior. 
 En un tubo BD Falcon de 50 ml se colocaron 20 ml de PBS 1X y 10 ml de 
sangre previamente atemperada a 37°C resuspendiendo el contenido. En otro 
tubo BD Falcón de 50 ml se colocaron 15 ml de Ficoll-Paque™ PLUS (temperatura 
ambiente) y posteriormente se le añadieron 30 ml de la mezcla de PBS/sangre 
inclinando el tubo y colocando la pipeta en posición perpendicular con velocidad 
lenta para mantener separadas ambas fases (sangre/ficoll). Se centrifugó este 
tubo (centrífuga marca eppendorf mod. 5804 R) a 1000 × g por 30 min, 20°C, sin 
freno ni acelerador (0). Una vez formadas las diferentes fases en el tubo (Figura 
1), se retiró la mayoría del plasma sanguíneoy con una micropipeta de 1000 µl se 
extrajo el anillo de PBMCs (aprox. 4 ml) y se colocó en 20 ml de PBS 1X en un 
28 
 
tubo de 50 ml, para luego llevarlo a un volumen de 45 ml resuspendiendo para 
homogenizar. Se centrifugó el tubo a 350 × g por 10 min con freno y acelerador 
normal (9) y, posteriormente se decantó el sobrenadante. Se disgregó el botón 
celular, se añadieron 45 ml de PBS 1X y se resuspendió para luego centrifugar en 
las mismas condiciones, repitiendo estos pasos por cuatro veces más. Se 
disgregó nuevamente el botón celular para luego añadir 10 ml de PBS 1X y 
resuspender para hacer una dilución 1:50 de células y azul de tripano, 
respectivamente y contar las PBMCs obtenidas en un hemocitómetro. Se 
apartaron 2 x 106 de PBMCs en un tubo eppendorf estéril y se centrifugó a 1500 
rpm por 5 min, decantando el sobrenadante y resuspendiendo el botón celular en 
1 ml de medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino 
(SFB) (Gibco) inactivado durante 30 minutos a 56° C; al medio se le adicionó 100 
U/ml de penicilina (Gibco) y 100 μg/ml de estreptomicina (Gibco). Se incubaron 
estas PBMCs a 37° C, con 5% de CO2 (95% de oxígeno) durante toda la noche y 
se fijaron las células con 500 µl de PFA al 4% y 500 µl de PBS 1X al día siguiente. 
 
4. Obtención de Linfocitos T CD4+ (selección negativa) 
 Se empleó el kit CD4+ T Cell Isolation Kit human (descrito en la Tabla 2) 
para obtener linfocitos T CD4+ mediante selección negativa (las células que 
presentaron el fenotipo CD3+CD4+CD8- no se marcaron con anticuerpos 
acoplados a perlas magnéticas), para lo cual se utilizaron 80 x 106 PBMCs de las 
recién obtenidas después de su aislamiento con ficoll centrifugándolas a 300 × g 
por 10 min, se decantó el sobrenadante y se resuspendió el botón celular en 320 
29 
 
µl de buffer MACS® Rising Solution (PBS, pH 7.2, 0.5% de albúmina de suero 
bovino (BSA) y EDTA 2 mM por dilución del Stock BSA MACS® (cat: 130-091-
376) 1:20 con la solución de lavado autoMACS® (cat: 130-091-222)) mantenido a 
2-8°C. Se le añadieron 80 µl de CD4 + T Cell Biotin-Ab Cocktail incubando a 2-8° 
C durante 5 minutos. Posteriormente, se añadieron 240 µl de buffer MACS Rising 
Solution y 160 µl de CD4+ T Cell Microbead Cocktail, se resuspendió y se incubó a 
2-8° C durante 10 minutos. Se colocó una columna magnética LS (marca MACS 
Miltenyi Biotec cat: 130-042-401) previamente enfriada en el congelador en un 
imán acoplado a una base de metal especial y se humedeció con 3 ml de buffer 
MACS Rising Solution desechando los residuos. Después se colocaron las células 
para obtener mediante selección negativa los linfocitos T CD4+ (Figura 2) y se lavó 
la columna con 3 ml de buffer MACS Rising Solution para obtener el sobrenadante 
enriquecido. Se descartó la columna, se centrifugó el sobrenadante enriquecido 
(compuesto por linfocitos T CD4+) durante 5 minutos a 1500 rpm y se decantó, 
manteniendo el botón celular. Se resuspendió el botón celular en 2 ml de medio 
AIM-V (Gibco) y se hizo una dilución con azul de tripano de 1:10 para contar éstos 
linfocitos en el hemocitómetro. 
Nombre del Kit Componentes Descripción 
CD4
+
 T Cell Isolation Kit 
human MACS® Miltenyi 
Biotec cat: 130-096-533 
1 ml de coctel de 
anticuerpo anti-Biotina de 
célula T CD4
+
 humana 
Coctel de anticuerpos 
monoclonales humanos 
conjugados con biotina contra 
CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, 
CD36, CD56, CD123, TCRγ/δ y 
CD235a (glicoforina A) 
30 
 
2 ml de coctel de 
microperlas de célula T 
CD4
+
 humana 
Microperlas conjugadas al 
anticuerpo monoclonal antibiotina 
(isotipo: IgG1 de ratón) y al 
anticuerpo monoclonal anti-CD61 
(isotipo: IgG1 de ratón) 
Tabla 2. Kit utilizado para el aislamiento de linfocitos T CD4
+
. 
 
5. Aumento de la pureza 
 Se ajustó el sobrenadante enriquecido a 2 x 106 células/ml de medio AIM-V 
y se adicionaron 10 ml a las botellas adherentes. Se incubaron a 37°C y un 
ambiente de 5% de CO2 y 95% de aire, durante 2 horas para favorecer la 
adherencia de los monocitos contaminantes a la superficie de la botella. Se 
recuperó el sobrenadante lavando las paredes de las botellas y se transfirió a 
tubos de 15 ml (Corning cat: 430055), se centrifugaron a 1600 rpm por 5 min para 
resuspender el botón celular en 2 ml de PBS 1X. Se hizo una dilución 1:10 con 
azul de tripano, se contaron las células en un hemocitómetro. Se centrifugó 
nuevamente el tubo, se decantó el sobrenadante y se ajustó la suspensión celular 
a 1 x 106 células/ml en medio de cultivo RPMI suplementado con 10% de SFBi, se 
transfirieron en botellas de cultivo de 25 cm2 (Corning cat: 430168) e incubaron a 
37° C con 5% de CO2 durante toda la noche. 
 
31 
 
6. Activación de los linfocitos con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 
acoplados a perlas magnéticas 
Se centrifugó a 1500 rpm por 5 min el sobrenadante enriquecido después 
de permanecer en incubación toda la noche, se decantó el sobrenadante y se 
resuspendió el botón celular en 2 ml de medio RPMI, se tomaron 10 µl del botón 
celular y se diluyeron en 90 µl de azul de tripano. Se tomó de esta dilución 10 µl y 
se colocaron en el hemocitómetro para contar los linfocitos viables. Se ajustó la 
suspensión celular a 2 x 106 células/ml de PBS 1X. Posteriormente, se reservaron 
1.4 * 106 infocitos T CD4+ y el resto se colocaron 1 ml en una placa de 24 pozos 
de fondo plano en las coordenadas B3 y B4. En el resto de los pozos se colocaron 
2 ml de PBS 1X para evitar la evaporación de los pozos importantes a lo largo del 
tiempo de activación celular. 
 Posteriormente, se lavaron las Dynabeads acopladas a los anticuerpos anti-
CD3 y anti-CD28 (Gibco cat: 11131D) resuspendiendo el vial durante 30 segundos 
en el vortex, transfiriendo después 300 μl a un tubo eppendorf de 1 ml para 
mantener una relación 1:3 célula-perla (el volumen total del vial de Dynabeads es 
de 2 ml con un total de 80 x 106 Dynabeads). Luego se añadió un volumen igual 
de PBS 1X para mezclarlo en el vortex durante 5 segundos. Se colocó el tubo 
dentro de un campo magnético de un imán durante 1 minuto y se descartó el 
sobrenadante. Se retiró el tubo del imán y se resuspendieron las perlas en el 
mismo volumen inicial con medio de cultivo RPMI. A los pozos B3 y B4 se les 
añadieron 150 μl, respectivamente, de las perlas lavadas, resuspendiendo para 
homogenizar toda la superficie del pozo. 
32 
 
 Se dejó el estímulo por 3 días (pozo B3) y por 6 días (B4), para luego 
comparar la expresión de los marcadores de interés contra la expresión de los 
linfocitos T CD4+ no activados (día 0). En los días 3, 4 y 5 de activación, se 
añadieron 250 μl de medio de cultivo RPMI sin mover las células del fondo del 
pozo B4. 
7. Detección de los marcadores de superficie 
Se utilizaron los anticuerpos de la Tabla 1 para hacer 
inmunofenotipificaciones directas de los marcadores de superficie a través de la 
técnica de citometría de flujo, dividiendo en tres categorías celulares (células no 
activadas (día 0), células activadas 3 días y células activadas 6 días) como se 
describe a continuación. 
Se centrifugaron las células no activadas a 1500 rpm a 4°C por 3 min y se 
decantó el sobrenadante, se lavaron con 1 ml de PBS 1X/Azida de sodio (0.1%) 
mantenido a 4° C y se resuspendieron en 100 μl de PBS 1X/Azida de sodio (0.1%) 
por cada 1 x 106 células. A las células activadas 3 días y 6 días se les quitaron las 
perlas recolectándolas de los pozos en tubos eppendorf y se colocaron dentro del 
campo magnético de un imán durante 2 min; se recuperó el sobrenadante en 
nuevos tubos eppendorf y se centrifugaron a 1500 rpm a 4°C por 3 min. Se 
decantó el sobrenadante y se lavaron y ajustaron igual que las células no 
activadas (ver arriba). 
Para las células no activadas se etiquetaron 14 tubos eppendorf. Como 
controles: células sin anticuerpo (1), anti-CD3 (1), anti-CD25 (1), anti-CD54 (1); 
isotipos:isotipo anti-CD3/CD184, isotipo anti-CD4, isotipo anti-CD25 e isotipo anti-
33 
 
CD54; muestras: anti-CD3 + anti-CD25 + anti-CD54 (2), anti-CD4 + anti-CD25 + 
anti-CD54 (2), anti-CD184 + anti-CD25 + anti-CD54 (2) y para las células 
activadas durante 3 y 6 días se etiquetaron 14 tubos (controles: células sin 
anticuerpo (1), anti-CD4 (1), anti-CD25 (1), anti-CD54 (1); isotipos: isotipo anti-
CD3/CD184, isotipo anti-CD4, isotipo anti-CD25 e isotipo anti-CD54; muestras: 
anti-CD3 + anti-CD25 + anti-CD54 (2), anti-CD4 + anti-CD25 + anti-CD54 (2), anti-
CD184 + anti-CD25 + anti-CD54 (2)). Para las tres categorías se les añadió a cada 
tubo 10 μl de las células ajustadas. Todos los tubos fueron colocados en una 
cama de hielo para añadirles 2 μl del respectivo anticuerpo e incubarlos a 4°C 
durante 30 min en oscuridad. 
 Acabada la incubación, se lavaron todas las células con 1 ml de PBS 1X/ 
Azida de sodio (0.1%) y se resuspendieron las células en 500 μl de PBS 1X con 
500 μl de PFA 4% incubándolas durante 20 min en hielo y oscuridad y 
resuspendiéndolas cada 5 min. Se lavaron nuevamente y se resuspendieron en un 
volumen final de 1 ml de PBS 1X frío. Para evaluar la expresión de los 
marcadores, se utilizó el citómetro de flujo (marca Attune® Acoustic Focusing 
Cytometer Blue/Red) con el software Attune® Cytometric v1.2.5. 
En los distintos dot plots obtenidos de tamaño contra granularidad se 
delimitó la región de interés R1 y de ésta se obtuvieron otros dot plots hijos que 
mostraban en el eje horizontal el marcador CD25 y en el eje vertical el marcador 
CD54. Estos dot plots se dividieron en cuatro regiones (R2-R5) y sólo se tomaron 
como células activadas aquellas que estuvieran dentro de la región R3, es decir, 
que fueran positivas para ambos marcadores (dobles fluorescentes). De la región 
34 
 
R3 se obtuvieron distintos histogramas que muestran la intensidad media de 
fluorescencia para cada marcador por día de activación y ésta se utilizó para 
calcular el índice de fluorescencia media basado en la siguiente fórmula: 
𝐼𝐹𝑀 =
𝐼𝑛𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑐𝑢𝑒𝑟𝑝𝑜
𝐼𝑛𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑖𝑠𝑜𝑡𝑖𝑝𝑜
 
De esta manera se obtuvieron los gráficos de los resultados. 
8. Pruebas estadísticas 
Se realizó la prueba t-Student para saber si existían diferencias 
significativas entre las medias del porcentaje de expresión de cada marcador para 
cada día de activación, los índices de fluorescencia media, la viabilidad y el 
rendimiento. 
También se empleó el análisis de correlación lineal para saber si el efecto 
de la activación sobre la viabilidad se asoció con el IFM, es decir, si hay alguna 
relación directa o inversa entre las células sobrevivientes frente a la expresión de 
los marcadores CD25 y CD54. 
9. Cambios morfológicos celulares 
Otra característica importante a evaluar fue si la activación contribuía al 
cambio morfológico celular, para lo cual se tomaron fotografías de las células en la 
placa de cultivo, partiendo de las células en estado basal, luego a las que se les 
añadieron las perlas magnéticas a un día de activación, a los 3 días de activación 
y finalmente hasta el día 6 de activación, utilizando un microscopio invertido. Se 
retiraron las perlas magnéticas del cultivo el cual fue colocado en tubos eppendorf 
35 
 
estériles de 2 ml y utilizando un magneto durante 2 min. Se recuperó el 
sobrenadante y se centrifugaron los tubos para lavar las células en PBS 1X/Azida 
de sodio (0.1%). Se tiñeron las células con los fluorocromos acoplados a los 
anticuerpos anti-CD25 y anti-CD54 durante 30 min. Se lavaron los pellets y se 
fijaron las células con PFA al 4% para analizar la morfología mediante citometría 
de flujo. A través de dot plots de tamaño contra granularidad se determinó la 
morfología celular partiendo del estado basal o de reposo (día 0), al día 3 de 
activación y al día 6 de activación (figura 10a). En ellos se dibujó una región 
poligonal (R1, en rojo) que indica la población de interés y se puede observar que 
el tamaño y la granularidad aumentan conforme cambian los diferentes tiempos 
experimentales, así como un incremento en los restos celulares (parte inferior 
izquierda). Para distinguir que el aumento en el tamaño y granularidad de las 
células era debido a la activación, se hicieron nuevos dot plots basados en la 
región R1 de tamaño vs granularidad en donde se evalúan los canales de emisión 
de dos fluorocromos: en el eje horizontal se encuentra el canal BL-1 en donde se 
lee el fluorocromo FITC correspondiente a CD25 y en el eje vertical se encuentra 
el canal BL-2 donde se lee el fluorocromo PE correspondiente a CD54. Se 
dividieron los distintos dot plots en cuatro regiones y se tomó como células 
activadas únicamente a las que cayeron en la región de dobles positivas (CD25 y 
CD54) ubicadas dentro de la región R3 (figura 10b). Las distintas regiones o 
cuadrantes se establecieron de acuerdo a las células no activadas (día 0) y a las 
células teñidas con los respectivos isotipos. 
 
36 
 
RESULTADOS 
1. Rendimiento y pureza de los linfocitos T CD4+ purificados por 
selección negativa 
Se obtuvieron linfocitos T CD4+ de sangre periférica mediante la separación 
de PBMCs por gradiente de ficoll y posteriormente se realizó la purificación 
linfocitaria a través del marcaje de células con un coctel de anticuerpos (ver tabla 
2) acoplados a perlas magnéticas que no presentaban el fenotipo CD3+CD4+CD8- 
(selección negativa). Estas células se colocaron dentro de una columna magnética 
y de esta forma atravesaron la columna aquellas células que presentaban el 
fenotipo CD3+CD4+CD8-.Después se analizaron las PBMCs para distinguir las 
distintas poblaciones celulares de acuerdo al tamaño y granularidad (parámetros 
obtenidos del software) y los linfocitos T mediante citometría de flujo (figura 4). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Tamaño contra granularidad de PBMCs y linfocitos T CD4
+
. En la gráfica de la 
izquierda se ilustra la distribución de las distintas subpoblaciones de células mononucleares de 
sangre periférica obtenidas mediante separación por centrifugación en gradiente de ficoll. En la 
gráfica de la derecha dentro de la región poligonal se muestra la subpoblación de linfocitos T CD4
+
 
obtenidos por selección negativa. 
 
 
 
 
Monocitos 
Linfocitos 
Fragmentos 
37 
 
 
 Para saber que la región R1 de la figura 4 efectivamente eran linfocitos T 
CD4+, se obtuvo un histograma de esa región (figura 5) en el cual se muestra la 
intensidad media de fluorescencia del anticuerpo anti-CD4 (azul) comparada con 
la intensidad media de fluorescencia del control de isotipo (rosa). En el eje x está 
representado el canal de emisión RL1 para el fluorocromo APC al que están 
acoplados ambos anticuerpos y en el eje y está representado el número de 
células. En la esquina superior derecha está representado el porcentaje de células 
positivas para CD4 y el IFM. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Intensidad media de fluorescencia de CD4. 
 
Para la selección negativa se utilizaron un máximo de 8 x 107 PBMCs de las 
cuales se obtuvieron linfocitos T CD4+ purificados en rangos de las 8 x 106 a 18.8 
x 106 células (figura 6). El gráfico del rendimiento consiste en el número de 
PBMCs usadas comparado contra el número de linfocitos promedio obtenido de 
 
Control 
de 
 isotipo
 
CD4 
 
38 
 
un total de seis experimentos independientes. Posteriormente, se realizó la prueba 
t-Student y se encontró una diferencia significativa entre las medias de PBMCs 
obtenidas respecto al número de linfocitos T CD4+. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Rendimiento celular. En todos los casos, se utilizó como número base 80 x 10
6
 PBMCs 
de los cuales sólo el 30% son linfocitos (T y B) y de estos el 80% son linfocitos T.Datos obtenidos 
de seis experimentos. La barra representa la media ± desviación estándar (p<0.0001) 
 
Para saber si las células obtenidas tenían la pureza suficiente (>90%) para 
trabajar con ellas, se tomaron en cuenta las células marcadas con los anticuerpos 
anti-CD3 y anti-CD4 que cayeron dentro de la zona de células positivas en los dot 
plots proporcionados por el software del citómetro de flujo. Para establecer esa 
zona se comparó el histograma del control de isotipo contra el histograma de 
células positivas (datos no mostrados). Con los números arrojados por los dot 
plots se estableció el porcentaje de pureza promedio de los seis experimentos 
(figura 7). 
 
39 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Pureza de linfocitos T CD4
+
. Las células fueron teñidas con anticuerpos anti-CD3 y anti-
CD4. Datos obtenidos de seis experimentos. La barra representa la media ± desviación estándar. 
 
 
2. Activación de linfocitos T CD4+ con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 
acoplados a perlas magnéticas 
Para saber si la activación afectó la viabilidad celular se cuantificó el 
número de células vivas por el método de exclusión por azul de tripano en 
diluciones de 1:10 durante los diferentes tiempos experimentales y se obtuvo la 
media (figura 8). Se realizó la prueba t-Student para determinar si existían 
diferencias estadísticas significativas entre las células no activadas frente a las 
células activadas 3 y 6 días, así como la comparación entre las medias de las 
células activadas durante 3 y 6 días. Se encontraron diferencias significativas 
entre todas las comparaciones, por lo que se pudo observar que la viabilidad 
celular fue alta cuando los linfocitos se encuentran en reposo (NA) comparada con 
la viabilidad de las células activadas a los 3 días (A 3 días), ya que ésta se ve 
40 
 
disminuida. Sin embargo, se logra una recuperación al sexto día de activación (A 6 
días). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Viabilidad celular. En el eje horizontal están representados los tiempos de activación 
(NA: No activados (día 0); A 3 días: Activados 3 días; A 6 días: Activados 6 días) y en el eje vertical 
está representado el porcentaje de células vivas. Las barras representan la media ± desviación 
estándar (p<0.0022) 
 
 
 Las siguientes fotografías muestran el cambio morfológico que sufrieron los 
linfocitos T CD4+ al ser activados por los anticuerpos anti-CD3 y antiCD28. La 
figura 9a muestra las células en estado basal y luego a las que se les añadieron 
las perlas magnéticas (figura 9b, día 1 de activación), a los 3 días de activación 
(figura 9c) y finalmente hasta el día 6 de activación (figura 9d). 
 
 
41 
 
Morfología de los linfocitos T CD4+ no activados 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Cultivos de linfocitos T CD4
+
con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 acoplados a 
perlas magnéticas. a) linfocitos purificados no activados; b) linfocitos estimulados 1 día. La 
morfología de las células en estado activado cambia y se vuelven alargadas ya que comienza la 
migración celular. La polarización destacada en el círculo rojo está conformada por el pseudópodo 
o frente de migración (f), el urópodo posterior o cola (u) y los puntos oscuros son las perlas 
magnéticas (p); c) linfocitos a los 3 días. A este tiempo las células han crecido y puede apreciarse 
la complejidad citoplasmática debida a la activación así como proyecciones membranales; d) 
linfocitos a los 6 días. La morfología se mantiene durante el tiempo de activación. Aumento 400x. 
 
 Después de observar el cambio morfológico en los linfocitos T CD4+ 
activados, como se mencionó en la sección de metodología, se determinaron las 
distribuciones de las células en dot plots de tamaño y granularidad por día de 
activación (figura 10a). Se observó el aumento de tamaño y complejidad a través 
del tiempo, así como la expresión de los marcadores CD25 y CD54 mediante 
citofluorometría (figura 10b). 
a) b) 
d) c) 
10 μm 10 μm 
10 μm 10 μm 
42 
 
a) 
 Día 0 Día 3 Día 6 
 
 
 
 
b) 
 Día 0 Día 3 Día 6 
 
 
 
 
Figura 10. Dot plots de linfocitos T CD4
+
en estado basal (Día 0) y activados con los 
anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 acoplados a perlas magnéticas durante 3 y 6 días. a) se 
representa el tamaño contra la granularidad característicos de los linfocitos T CD4
+
 no estimulados 
(Día 0) encerrados en la región poligonal R1 (en rojo) y después de ser activados durante 3 y 6 
días; b) dot plots basados en la región R1 divididos en cuatro regiones (R2-R5) que muestran las 
células en estado de reposo en la región R4 (en azul) y las células dobles positivas que expresan 
los marcadores de superficie que denotan activación (CD25-FITC y CD54-PE) en la región R3 (en 
rosa). El porcentaje en todos los casos se refiere al número de células dentro de cada región. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
43 
 
2.2 Efecto de la activación sobre la expresión de CD25 (IL-2Rα) y CD54 
(ICAM-1) 
Una de las características de los linfocitos T CD4 + es que la expresión de 
los receptores CD25 y CD54 son inducibles con la activación celular. Los 
resultados de la tinción por cada marcador se graficaron en porcentaje promedio 
(figuras 11a y 11c). También se graficaron los índices de fluorescencia media 
promedio (figuras 11b y 11d). En ambos casos se realizó la prueba t-Student para 
distinguir diferencias significativas entre las medias de células NA frente a los 3 y 6 
días de activación, y con esto, se determinó que el número de células que 
expresaron los marcadores de activación CD25 y CD54 fue del 80 al 100% a los 3 
días de activación, mostrando que la activación se logró de manera eficiente. El 
nivel de expresión de los marcadores de activación, mostrado como la intensidad 
media de la fluorescencia respecto al control de isotipo, mostró una variabilidad 
considerable y decayó significativamente al sexto día. 
 
a) 
 
 
 
 
 
44 
 
 
b) 
 
 
 
 
 
 
 
 
c) 
 
 
 
 
 
 
 
45 
 
d) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Expresión de CD25 y CD54. Los linfocitos T CD4
+
 fueron obtenidos por selección 
negativa y estimulados con los anticuerpos durante 3 y 6 días. Se detectaron los marcadores de 
activación al retirar el estímulo, mediante la fluorescencia de los fluorocromos. a y c) Media del 
porcentaje de células que expresan el marcador de activación CD25 (IL-2R) y CD54 (ICAM-1) 
respectivamente; b y d) Media del índice de fluorescencia media por día de activación (azul: no 
activadas (día 0); rojo: activadas 3 días; verde: activadas seis días) de los marcadores CD25 y 
CD54, respectivamente. Las barras representan la media ± desviación estándar (p<0.0001), 
 
 
2.3 Efecto de la activación sobre la expresión de CD3, CD4 y CD184 
(CXCR4) 
Una vez confirmada la activación celular, tanto morfológica como 
semicuantitativamente (expresión de marcadores de activación), el siguiente paso 
fue determinar si la activación influyó en los niveles de expresión de los 
marcadores de superficie característicos de los linfocitos T CD4+, de sangre 
periférica: CD3, CD4 y CD184 (CXCR4), para lo cual se analizaron las células 
tanto en estado basal (no activados) correspondientes al día 0 como activadas con 
anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 acoplados a perlas magnéticas durante 3 y 6 
días como está descrito en la metodología. Se obtuvieron los resultados mediante 
46 
 
el uso de citometría de flujo tomando en cuenta el IFM y el porcentaje de células 
positivas para el marcador en cuestión (figura 12). En ellos se traslapa la curva de 
intensidad media de fluorescencia del control de isotipo (rosa) y la curva de 
intensidad media de fluorescencia del marcador evaluado (azul) para observar el 
cambio a lo largo del tiempo. 
La figura 12a ilustra los resultados para el marcador CD3 donde en estado 
de reposo elIFM es de 227.3 y el porcentaje de células positivas es de 96.4%, 
mientras que para el día 3 el porcentaje es de 97.8% y el IFM es de 7.96. En el día 
6 de activación el porcentaje es de 70.3% y su IFM es de 0.6. La figura 12b 
muestra el marcador CD4 en reposo con un porcentaje de 96.5% y un IFM de 
229.09, al día 3 de activación tiene un porcentaje de 97% y un IFM de 298.58 y al 
día 6 de activación tiene un porcentaje de 70.3% y un IFM de 27.62. La figura 12c 
representa la fluorescencia para el marcador CD184 con un porcentaje de 97.8% y 
un IFM de 191.44 para el día 0, mientras que para el día 3 de activación el 
porcentaje es de 97.8% y el IFM es de 7.6. En el día 6 de activación, el IFM para 
CD184 fue de 2.21 y el porcentaje fue de 71.9%. 
Para cada marcador de superficie se hicieron gráficas, en las cuales se 
determinó la media del porcentaje de células positivas (figuras 13a, c y e) y la 
media del IFM (figuras 13b, d y f). Se realizó la prueba t-Student para comparar las 
medias de células NA frente a las activadas durante 3 y 6 días, así como la 
comparación entre las medias de las células activadas durante 3 y 6 días. Los 
casos en donde hubo diferencias significativas (p<0.0001) fueron: porcentaje de 
CD3 (Na vs A 6 días; A 3 días vs A 6 días), IFM de CD3 (Na vs A 3 días; Na vs A 
47 
 
6 días; A 3 días vs A 6 días); porcentaje de CD4 (Na vs A 6 días; A 3 días vs A 6 
días), IFM de CD4 (Na vs A 6 días); porcentaje de CD184 (Na vs A 6 días; A 3 
días vs A 6 días), IFM de CD184 (Na vs A 3 días; Na vs A 6 días; A 3 días vs A 6 
días). Basado en lo anterior, se pudo apreciar una clara disminución a lo largo del 
tiempo sólo en el nivel de expresión en CD184 y en CD3. En los casos restantes, 
la disminución en ambos parámetros sólo se apreció al sexto día de activación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
48 
 
 Día 0 (No activados) Día 3 (activados) Día 6 (activados) 
a) 
 
 
 
b) 
 
 
 
 
c) 
 
 
 
 
Figura 12. Efecto de la activación de los linfocitos T CD4
+
 sobre la expresión de marcadores 
de superficie. Se representan los histogramas de los linfocitos no activados (Día 0) y los linfocitos 
activados durante 3 y 6 días. La curva azul representa las células marcadas con el anticuerpo 
correspondiente acoplado a un fluorocromo (APC) y la curva rosa representa el control de isotipo. 
En la parte superior derecha se encuentran los porcentajes de células positivas y el índice de 
fluorescencia media para cada curva. Los histogramas son representativos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
49 
 
 
a) 
 
 
 
 
 
 
 
b) 
 
 
 
 
 
 
 
 
50 
 
 
c) 
 
 
 
 
 
 
 
d) 
 
 
 
 
 
 
 
 
51 
 
e) 
 
 
 
 
 
 
f) 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13. Efecto de la activación de los linfocitos T CD4
+
 sobre la expresión de CD3, CD4 y 
CD184 en los diferentes donadores. Los linfocitos T CD4
+
 fueron obtenidos por selección 
negativa y estimulados con las perlas durante 3 y 6 días durante los cuales se mantuvieron en 
incubación con medio RPMI suplementado con 10% de SFBi a 37°C con 5% de CO2. Se retiró el 
estímulo y se detectaron los marcadores por citometría de flujo. Las gráficas muestran los 
porcentajes de células positivas y su media (a, b, e, f, i, j) y el Índice de Fluorescencia media y su 
media (c, d, g, h, k, l). La barra representa la media ± desviación estándar. NA (No activados, en 
azul), A 3 días (activados 3 días, en rojo) y A 6 días (activados 6 días, en verde). 
 
 
52 
 
DISCUSIÓN 
 Los paquetes leucocitarios de banco de sangre son productos 
secundarios que se desechan por las instituciones de salud, por lo cual son una 
fuente excelente de leucocitos para fines experimentales, debido a que se puede 
obtener un alto número de células humanas primarias y funcionales. 
Este trabajo muestra el establecimiento de las técnicas para purificar, 
activar y fenotipificar los linfocitos T CD4+ humanos, obtenidos a partir de dichos 
paquetes en donde se determinó: rendimiento, pureza, viabilidad y expresión de 
marcadores de superficie, en condiciones activadas y no activadas. Los resultados 
pueden apoyar el planteamiento de protocolos experimentales con el conocimiento 
de la variación de estos factores, ya que en nuestro laboratorio el modelo celular 
básico para realizar investigaciones son los linfocitos T CD4+, y la activación 
celular influye en los resultados que se esperaría obtener si los marcadores de 
superficie aquí estudiados fueren el blanco de investigación. 
Estas observaciones son relevantes para nuestro grupo de investigación, en 
el cual actualmente se estudia el efecto de la activación de linfocitos T por medio 
de citocinas y no por medio del TCR. La activación por citocinas se conoce como 
activación colateral (“bystander”), y una de sus características distintivas es que la 
regulación negativa de CD3 no se lleva a cabo. Así, junto con otros análisis, el 
mantenimiento de la expresión de CD3 servirá como criterio de activación 
colateral. 
 
53 
 
Se ha demostrado que la activación de los linfocitos con anticuerpos anti-
CD3 y anti-CD28 es más parecida a la producida in vivo, por lo que se decidió 
usar este modelo, acoplándolos a perlas magnéticas, de modo que los anticuerpos 
pudieron ser retirados después de pasado el tiempo de activación. La activación 
con los anticuerpos se efectuó durante 3 y 6 días. 
La purificación con el CD4+ T Cell Isolation Kit human MACS (Miltenyi) 
produjo una obtención muy eficiente de estas células, con porcentajes mayores a 
94% de células T CD4+ en 5 de 6 casos, lo cual fue coincidente con lo reportado 
por la empresa que elaboró el kit, asegurando una pureza ≥90%, estándar mínimo 
utilizado para realizar investigación con células purificadas. 
 Un requisito importante durante la purificación, fue comprobar el 
rendimiento celular, por lo cual se comparó el número de células obtenido por μl 
de sangre con parámetros normales en sangre. La media de linfocitos en sangre 
periférica es de 2500/μl y en proporción son 2:1 de CD4+:CD8+ (Owen et al., 
2013). Se encontró también, que el rendimiento de linfocitos T CD4+ fue en 
promedio de 14 x 106 células con una viabilidad del 100%, a partir de 10 ml de 
suspensión leucocitaria original. De acuerdo a los valores de referencia de la tabla 
4, se comprobó que los valores linfocitarios obtenidos estuvieron dentro de los 
rangos normales encontrados en individuos sanos (Abbas, A., et al 2012). 
 
 
 
54 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 4. Hemograma normal. Valores de cifras de células sanguíneas normales para humanos 
adultos. (Tomado y modificado de Inmunología celular y molecular, Abbas 2012). 
 
Los linfocitos T CD4+ de sangre periférica se mantienen como células en 
reposo, es decir, en fase del ciclo celular G0, y una vez que se da el encuentro con 
su antígeno específico, cambian de fase en el ciclo celular y se denominan 
linfocitos T CD4+ activados. En este estado cambian de tamaño, complejidad y 
producen citocinas, así como se ve afectada su supervivencia. La activación de las 
células con los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 acoplados a perlas magnéticas 
produjo el cambio morfológico esperado en las células, con aumento de tamaño y 
signos de polarización (Alberts, B. 2010). 
La activación produjo siempre una disminución de la viabilidad celular, 
aunque de manera muy variable, reduciéndola a valores de entre el 90 y el 40%, 
con un promedio general del 61.2% al tercer día de activación, mientras que, para 
el sexto día, el promedio fue de 74.3%. La reducción en la viabilidad podría 
explicarse por apoptosis producida por AICD, la cual es muy común cuando se 
involucra la activación por TCR (Owen, J. et al 2014). 
55 
 
La estimulación de las células T CD4+ con los anticuerpos anti-CD3 y anti-
CD28 indujo expresión de los marcadores de activación CD25 y CD54en la 
mayoría de las células, después de 3 y 6 días de activación, mostrando la 
efectividad de las condiciones experimentales utilizadas. Sin embargo, es 
interesante notar que las células de los distintos individuos tuvieron niveles 
distintos de intensidad de la fluorescencia para estos marcadores, es decir, su 
nivel de expresión fue variable en las mismas condiciones experimentales. Esto 
indica que las células de diferentes individuos pueden tener distinta susceptibilidad 
a la activación, pero posiblemente ligadas a susceptibilidad a enfermedades 
autoinmunes, por ejemplo, debido a que los individuos con mayor resistencia a 
AICD podrían mantener un número mayor de células activadas por más tiempo 
(Zhang, J. et al 2004). 
La activación, medida como la expresión de CD25 y CD54 fue mayor a los 3 
días de la incubación con los anticuerpos, y decayó a los 6 días. La vialidad celular 
en cambio, fue mejor en el día 6 que en el día 3, lo cual es congruente con AICD 
(figura 14). 
 
 
 
 
 
 
56 
 
a) 
 
 
 
 
 
 
b) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14. Viabilidad vs IFM. Los marcadores mostrados son: a) CD25 y; b) CD54, ambos al día 0 
(NA), día 3 y 6 de activación. Las líneas continuas y punteadas representan la relación entre la 
viabilidad y la activación de las células. 
 
Dado lo anterior, cabría suponer que las diferencias en la viabilidad celular 
pueden ser producidas por diferentes niveles de activación en diferentes 
experimentos. La figura 14a muestra que el nivel de expresión de CD25 tuvo una 
57 
 
relación inversa con la viabilidad celular después de 3 días de activación, de modo 
que a mayor nivel de activación se observó una menor viabilidad (p<0.0018), 
congruente nuevamente con AICD. La viabilidad de estas células incrementó al 
día seis de activación (p<0.0001) y el IFM disminuyó, lo que podría ser resultado 
de la expansión de las células sobrevivientes aunado a la producción y el 
consecuente aumento en la concentración de IL-2, aunque para corroborar esto, 
hacen falta experimentos para medir las concentraciones de IL-2. Budd menciona 
que las células T en reposo, una vez que encuentran a su antígeno vía TCR 
comienzan a expandirse clonalmente y es en este momento que son parcialmente 
dependientes de IL-2 y si en estas condiciones la citocina es una limitante, las 
células comenzarán a morir. Por otro lado, si la citocina está presente, las células 
serán sensibles a AICD vía Fas (Algeciras-Schimnich, et al1999; Van Parijs, et al 
1999). La relación inversa entre la viabilidad y la activación también se observó 
para el marcador ICAM-1 (CD54) durante los 3 y 6 días de activación, solamente 
cuando se realizó la prueba t-Student comparando la media entre viabilidad y el 
IFM (p<0.0019). Esta relación posiblemente se puede explicar porque la función 
de CD54, es mantener la sinapsis inmunológica durante la presentación de 
antígeno entre el linfocito T y las perlas magnéticas acopladas a anti-CD3 y anti-
CD28, y, entre más moléculas de CD54 se expresen en la célula, mayor será el 
tiempo de unión a la perla, asegurando así la activación completa del linfocito T 
CD4+, llevándose a cabo las tres etapas de uniones transitorias y estables. 
El aumento en la viabilidad pudo deberse a la proliferación de las células 
activadas y a la aparición de las células T de memoria que reposan en la etapa G0 
58 
 
del ciclo celular (Owen, J., et al 2014) con el consecuente cambio en la proporción 
perlas:célula. 
El porcentaje de células que expresaron CD3, CD4 Y CXCR4 (CD184) fue 
mayor al 90%, antes de la activación, en todos los individuos. Sin embargo, para 
CD4+ no se observaron cambios significativos en el porcentaje de células y en el 
IFM después de 3 días de activación, pero sí para 6 días de activación. Por otra 
parte, el porcentaje de células CD3+ y CD184+ decayó en 2 de los 6 individuos a 
los 6 días de activación. Aunque el porcentaje de células positivas para estos 
últimos marcadores fue alto, la intensidad media de fluorescencia mostró una 
variación considerable entre los individuos, y decayó drásticamente con el tiempo 
de activación, lo cual hace pensar que la activación afecta la expresión de CD3 y 
CD184 disminuyéndolos al producirse la activación. 
La intensidad de la fluorescencia para CD3 mostró que la expresión de este 
marcador decayó con el tiempo de activación. Este evento es típico de la 
activación mediada por el receptor de las células T (TCR) durante la presentación 
de antígenos. Tal como en el estudio realizado por Diehn, M., et al los productos 
de los genes implicados en el reconocimiento del TCR fueron reprimidos por 
efecto de la activación de las células T. Los genes involucrados fueron PLC, LAT, 
LCK, TRIM y CD3ζ, al igual que los genes que codifican para las subunidades del 
TCR. Minami, Y., et al también concuerdan con la rápida internalización y 
degradación del TCR. Algunos estudios sugieren que el complejo TCR:CD3 se 
recicla (Krangel, M., 1987; Minami et al, 1987), mientras que otros han encontrado 
evidencia de su internalización, pero no de su reciclaje (Tax, W., et al, 1987). 
59 
 
La inhibición en la expresión de CD3 y CD4 es congruente con un 
mecanismo regulador de las células, después de la activación mediada por el 
TCR, como se describe en el párrafo anterior (Cai, Z., et al 1997). La inhibición y la 
degradación de receptores de membrana es común en los receptores que están 
asociados a la actividad de proteínas tirosina cinasas (PTK) y en muchos casos, 
se ha demostrado que estos procesos están controlados por la actividad de 
tirosina cinasa (Dumont, C., et al 2002). 
Por otro lado, el decremento del nivel de expresión de CXCR4 debido a la 
activación por el TCR coincide con el trabajo de con Murphy (2012), en el que éste 
decremento se dio debido al cambio de fase en el ciclo celular, aunado a la 
activación de linfocitos debida al rodamiento durante la extravasación para dar por 
resultado la liberación de las células activadas a la circulación (Owen, J., et al 
2014). En un estudio realizado por Secchiero et al., se demostró que la activación 
de linfocitos T CD4+ de sangre periférica vía CD3 disminuye la expresión de 
CXCR4 y que muy por el contrario, cuando se utiliza CD28 para activar las células, 
la expresión de CXCR4 aumenta. Por otro lado, al utilizar ambos anticuerpos 
acoplados a perlas magnéticas, se observó una expresión del marcador 
intermedia entre ambos anticuerpos por separado. 
La disminución de la expresión de CD4 al día 6 de activación reportada aquí 
contrasta con un estudio previo efectuado en nuestro grupo, en el cual se observó 
que la expresión de CD4 aumentó después de la activación con el mismo tipo de 
estímulo (Cortés, C., 2013). Esta diferencia pudo deberse a que en el trabajo 
previo, el índice de fluorescencia media (IFM) se calculó con base en la unión del 
60 
 
control de isotipo a las células no activadas. En cambio, en el presente estudio el 
IFM se calculó respecto a la unión del control de isotipo determinada en paralelo 
en las células activadas. Como se observa en la figura 10, la unión del control de 
isotipo aumentó en las células activadas durante 6 días, por lo cual es necesario 
corregir la lectura de unión del anticuerpo anti-CD4 respecto a este control. Si esta 
corrección se realiza, entonces se obtiene que la expresión de CD4 no aumenta. 
El incremento en la unión de ambos anticuerpos (isotipo y anti-CD4) a las células 
activadas puede ser producto del incremento del volumen celular y a cambios en 
la composición de la membrana plasmática (Harder, T., 2012). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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PERSPECTIVAS 
 Para experimentos futuros de infección de linfocitos T CD4+ con el VIH-1 se 
puede considerar que los linfocitos T CD4+ purificados de banco de sangre con los 
procedimientos descritos aquí, se encuentran en reposo. 
Se