Influencia de TLR9 en Progenitores Linfoides

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Influencia de la señalización por TLR9 en el desarrollo y destino de los progenitores 
linfoides tempranos 
 
T E S I S 
 
Que como parte de los requisitos para obtener el grado de 
Maestro en Ciencias Químico-Biológicas 
 
Presenta 
 
Eduardo Vadillo Rosado 
 
Directores de tesis 
 
Dra. Elba Reyes Maldonado 
Dra. Rosana Pelayo Camacho 
 
 
 
 
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
SECRETARIA DE INVESTIGACION Y POSTGRADO 
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 
SECCION DE ESTUDIOS DE POSTGRADO E 
INVESTIGACION 
 
 
 
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
 
 
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 
 
 
 
Esclerosis múltiple y su tratamiento por 
medio de vacunoterapia. 
 
TESINA 
 
QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA OBTENER EL 
TÍTULO DE: 
 
QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO 
 
POR LA OPCIÓN DE SEMINARIO DE TITULACIÓN 
“TEMAS SELECTOS Y DE ACTUALIZACIÓN DE MICROBIOLOGÍA”. 
 
 
P R E S E N T A 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Investigación Médica en Enfermedades 
Oncológicas del Hospital de Oncología del Centro Médico Nacional SXXI y en el 
Laboratorio de Hematopatología del Departamento de Morfología de la Escuela 
Nacional de Ciencias Biológicas, IPN. 
 
El desarrollo del proyecto fue apoyado económicamente por CONACyT (CB-2006-C01-
61274) y el Fondo de Investigación en Salud del IMSS (2006-3602-16 y 2008-785-044). 
 
El alumno fue becario CONACyT (219608). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Mi vida ha dado un cambio radical y decisivo en estos dos últimos años de estudio. Mucho, 
sino es que todo, se lo debo a la gente que directamente ha influenciado mi carrera científica. 
Rosana Pelayo. Me has enseñado cada día como ser mejor científico y mejor persona. Tú 
eres la mejor tutora que pude haber encontrado. 
Lourdes Arriaga. Gracias por tus palabras tan oportunas y tus enseñanzas, así como por mi 
membrecía honoraria UIMIC. 
A la Dra. Antonieta Chávez por todas sus enseñanzas, paciencia y amistad. 
Al Dr. Héctor Mayani por su apoyo. 
A la ENCB por haberme abierto sus puertas y en especial al Dr. Luis Jiménez, por despertar 
nuevamente mi pasión por la Inmunología. 
A todos los miembros de la UIMEO por su apoyo, ayuda, compañerismo y profesionalismo. 
En otros laboratorios he encontrado nuevas amistades. Ismael, Javier, Marcela y Aniela. 
En la UIMEO, Karina, Lupita, Marta e Ileana. 
Elisa, gracias especiales a ti por tu amistad y lo que has hecho por mi familia. 
Alberto, Daniel, Dení, Giselle, Moisés ¿Qué les puedo decir a ustedes? 
A mi mamá, papá, Priscylla, Fabián y Alfonso. Los amo. 
Nancy, Te quiero. 
 
 
 
 
 
 
 
INDICE GENERAL Página 
 Abreviaturas i 
 Índice de Figuras ii 
 Índice de Tablas iii 
 Resumen iv 
 Abstract v 
I. INTRODUCCION 1 
I.1. Receptores que reconocen patrones (PRRs) 1 
I.2. Receptores tipo Toll (TLRs) 4 
I.2.a. Vías de señalización de los TLRs 8 
I.2.a.1. Vía dependiente de MyD88 8 
I.2.a.2. Vía independiente de MyD88 9 
I.3. Hematopoyesis 10 
I.3.a. Hematopoyesis múrina y TLRs 12 
I.3.b. Hematopoyesis humana y TLRs 16 
I.4. JUSTIFICACION 20 
I.5. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 20 
I.6. HIPOTESIS 21 
I.7. OBJETIVOS 21 
I.7.a. Objetivo general 21 
I.7.b. Objetivos particulares 21 
II. MATERIALES Y METODOS 22 
II.1. Purificación de células mononucleares a partir de médula ósea normal (MON), 
sangre de cordón umbilical (SCU) y sangre periférica movilizada (SPM) 22 
II.2. Congelación de CMN de MON, SCU y SPM 22 
II.3. Descongelación de CMN de MON, SCU y SPM 22 
II.4. Enriquecimiento de células CD34+ 23 
II.5. Caracterización de progenitores hematopoyéticos 23 
II.6. Caracterización de células maduras 24 
 
 
 
 
INDICE GENERAL Página 
 
II.7. Purificación de progenitores hematopoyéticos 24 
II.8. Estimulación de progenitores hematopoyéticos con CpG DNA 24 
II.9. Siembra de monocapas de células estromales MS-5 25 
II.10. Siembra de co-cultivo 25 
II.11. Cosecha 25 
II.12. Tinción intracelular del TLR9 en progenitores linfoides tempranos 26 
II.13. Ensayo de Incorporación de Bromodesoxiuridina (BrdU) 26 
II.14. RT-PCR para los transcritos codificantes de TLRs humanos 27 
III. RESULTADOS 28 
III.1. Diferencias en el contenido celular de MON, SCU y SPM 28 
III.1.a. Células troncales y progenitores hematopoyéticos 28 
III.1.b. Células hematopoyéticas de linajes mieloide y linfoide 31 
III.2. Expresión de TLRs durante la hematopoyesis temprana 35 
III.2.a. TLRs en el compartimiento CD34+ 35 
III.2.b. TLR9 en progenitores linfoides tempranos 37 
III.3. TLR9 y función temprana de los progenitores linfoides 39 
III.3.a. Proliferación 39 
III.3.b. Diferenciación 40 
III.3.b.1. Médula Ósea Normal 40 
III.3.b.2. Sangre Periférica Movilizada 40 
III.3.b.3. Sangre de Cordón Umbilical 41 
IV. DISCUSIÓN 45 
V. CONCLUSIONES 50 
VI. PERSPECTIVAS 51 
VII. BIBLIOGRAFÍA 52 
i 
 
ABREVIATURAS 
 INGLES ESPAÑOL 
APC Allophicocyanin Aloficocianina 
cDC Conventional Dendritic Cell Células Dendríticas Convencionales 
CLP Common Lymphoid Progenitor Progenitor Linfoide Común 
CMNs Células Mononucleares 
CMP Common Myeloid Progenitor Progenitor Mieloide Común 
CpG DNA DNA con motivos Citidina Fosfato Guanosina 
DAMPS Damage asociated Molecular Patterns Patrones Moleculares Asociados a Daño. 
ELP Early Lymphoid Progenitors Progenitor Linfoide Temprano 
ETP Early Thymic progenitors Progenitor de Células T y NK 
FITC Fluorecein Isothyocianate Isotiocianato de Fluoresceina 
FL Flt3 Ligand Ligando de Flt-3 
GMP Granulocyte and Monocyte progenitor Progenitor de Granulocitos y Monocitos 
HPC Hematopoietic Progenitor Cell Célula Progenitora Hematopoyética 
HSC Hematopoietic Stem Cell Célula Troncal Hematopoyética 
IFN Interpheron Interferón 
IKDC Interpheron Killer Dendritic cell Célula Asesina Productora de Interferón 
IL-15 Interleukin 15 Interleucina 15 
IL-7 Interleukin 7 Interleucina 7 
MEP Megakariocyte and Erythrocyte Progenitors Progenitor de Megacariocitos y Eritrocitos 
MON Médula Ósea Normal 
MPP Multipotent Progenitor Progenitor Multipotente 
MS-5 Mouse Stroma-5 Células Estromales de Ratón 
NK Natural Killer Célula Asesina Natural 
PAMPS Pathogen Asociated Molecular Patterns Patrones Moleculares Asociados a Patógenos 
pDC Plasmacytoid Dendritic Cells Célula Dendrítica Plasmacitoide 
PE Phycoerythrin Ficoeritrina 
PETxR Phycoerythrin Texas Red Ficoeritrina Rojo Texas 
PRRs Patterns Recognition Receptors Receptores que Reconocen Patrones 
SCF Stem Cell Factor Factor de células troncales 
SCU Sangre de Cordón Umbilical 
SPM Sangre Periférica Movilizada 
TLR Toll-Like Receptors Receptor tipo Toll 
 
 
 
 
 
 
 
 
ii 
 
INDICE DE FIGURAS Página 
 Figura 1. Los TLRs inducen la señalización de manera dependiente e 
independiente a MyD88 9 
 Figura 2. Hematopoyesis murina y TLRs 14 
 Figura 3. Hematopoyesis humana y TLRs 17 
 Figura 4. Diferencias relativas de progenitores mieloides provenientes de médula 
ósea normal, sangre de cordón umbilical y sangre periférica movilizada 27 
 Figura 5. El contenido de progenitores linfoides tempranos es significativamente 
mayor en sangre de cordón umbilical 28 
 Figura 6. La frecuencia de células B es similar en la MON, SCU y SPM 30 
 Figura 7. El compartimientode los monocitos en SCU es menor 30 
 Figura 8. Frecuencia comparativa de células NK, NKT y Linfocitos T 31 
 Figura 9. Frecuencia comparativa de las subpoblaciones de Linfocitos T 31 
 Figura 10. Abundancia de células dendríticas convencionales (CD11c+ BDCA2-) y 
plasmacitoides (BDCA2+ CD11clo/-) en las tres fuentes 32 
 Figura 11. La producción de células de linaje linfoide en cultivo es significativamente 
mayor a partir de progenitores de SCU 33 
 Figura 12. Las células CD34+ expresan transcritos de TLRs 34 
 Figura 13. Expresión de TLR9 en progenitores linfoides humanos 36 
 Figura 14. La exposición breve a ligandos de TLR9 no induce la proliferación 
de los progenitores 37 
 Figura 15. Producción de células NK y cDCs a partir de progenitores linfoides 
tempranos de MON estimulados con CpG DNA 40 
 Figura 16. Producción de células NK y cDCs a partir de progenitores linfoides 
y multipotentes de SPM estimulados con CpG DNA 41 
 Figura 17. La exposición de los progenitores de SCU a CpG no induce 
cambios en la diferenciación celular 42 
 Figura 18. En adultos, la estimulación de TLR9 promueve la diferenciación de 
los progenitores linfoides humanos a células NK y dendríticas 48 
 
iii 
 
INDICE DE TABLAS Página 
Tabla 1. Receptores que reconocen patrones (PRRs) 7 
Tabla 2. Frecuencia de progenitores hematopoyéticos en CMN de MON, 
SCU y SPM 29 
Tabla 3. Frecuencia de células sanguíneas maduras en CMN de MON, SCU y SPM 32 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
iv 
 
 
RESUMEN 
Introducción. Los receptores tipo toll (TLRs) pueden ser detectados desde las etapas más 
primitivas del desarrollo hematopoyético en el ratón, y al ser estimulados, los progenitores 
hematopoyéticos proliferan y se diferencian obviando los requerimientos de factores de 
crecimiento y diferenciación. 
Objetivo. Definir cómo es influenciada la diferenciación hematopoyética de los progenitores 
linfoides humanos por componentes microbianos que estimulan al receptor tipo toll 9 (TLR9). 
Materiales y Métodos. Se purificaron progenitores multipotentes (MPP) y progenitores 
linfoides tempranos (ELP) de médula ósea (MO), sangre de cordón umbilical (SCU) y sangre 
periférica movilizada (SPM) por citometria de flujo. Los transcritos génicos del TLR9 en estas 
poblaciones fueron investigados, así como el potencial de diferenciación tras estimular con el 
ligando del este receptor (CpG ODN). A cuatro semanas de co-cultivo con células estromales 
en condiciones controladas para la diferenciación linfoide, se evaluó la producción de células 
B, NK y dendríticas por citometría de flujo. 
Resultados. Los progenitores hematopoyéticos expresaron transcritos de TLR9, así como el 
receptor. Cuando los MPP de MO fueron estimulados con CpG se registró un aumento en la 
producción de células dendríticas convencionales (cDCs), en tanto que sus contrapartes de 
SPM incrementaron el potencial de diferenciación hacia los linajes NK y dendrítico, y los ELP 
de SPM mostraron mayor producción de células NK. Sorprendentemente, los progenitores 
hematopoyéticos de SCU no mostraron diferencias en los patrones de diferenciación tras la 
estimulación con el mismo ligando. 
Conclusiones. La unión de CpG a su receptor en los progenitores hematopoyéticos de MO y 
SPM fortalece la producción de células de la respuesta inmune innata mientras que sus 
contrapartes de SCU aparentemente no alteran las decisiones de linaje. Estos hallazgos 
sugieren que el reconocimiento de componentes microbianos por TLR9 inicia desde las 
etapas más primitivas del sistema linfo-hematopoyético y madura funcionalmente con la 
edad. 
 
 
v 
 
 
ABSTRACT 
Introduction. In mice, Toll-like receptors can be detected in the most primitive stages of 
hematopoietic cells, and, when they get stimulated, hematopoietic progenitors proliferate and 
differentiate bypassing some growth and differentiation factors. 
Objective. Define how cell fate of lymphoid progenitors is stimulated by components that 
signal through Toll-like receptor-9 (TLR9). 
Materials y Methods. Multipotent progenitors (MPPs) and early lymphoid progenitors (ELPs) 
from normal bone marrow (NBM), umbilical cord blood (UCB) and movilized peripheral blood 
(MPB) were purified by flow cytometry. TLR9 transcripts and protein were investigated, and 
their differentiation potential evaluated upon TLR9 ligation. Four week co-cultures were 
conducted on stromal cells and lymphoid conditions to evaluate B, NK and dendritic cells 
production. 
Results. Hematopoietic progenitors expressed TLR9 transcripts as well as the receptor. After 
stimulation of NBM MPPs with CpG DNA, production of conventional dendritic cells (cDCs) 
raised while their MPB counterparts showed increased NK and cDCs development; MPB 
ELPs also produced more NK cells. Surprisingly, UCB progenitors showed no differences on 
differentiation pathway potentials after ligation. 
Conclusions. CpG DNA stimulation of TLR9 in normal bone marrow and mobilized 
peripheral blood hematopoietic progenitors directs innate immune cell production while their 
cord blood counterparts do not apparently modify lineage cell fate decisions. These findings 
suggest that TLR9 ligands recognition initiates on the most primitive stages of lymphoid 
development and that is functionally related to age. 
 
 
 
1 
 
I. INTRODUCCION 
 La producción de células sanguíneas está modulada por interacciones celulares, factores 
de crecimiento, citocinas y factores de transcripción que regulan de manera dinámica la 
expresión y agapago de genes que permite generar células con funciones específicas y vida 
limitada (Mayani, 2003). Se sabe que en condiciones como las infecciones bacterianas 
agudas pueden influir en la cantidad y frecuencia de las células circulantes; sin embargo, los 
mecanismos moleculares implicados en éste fenómeno apenas comienzan a ser descifrados 
(Marsh y cols., 1967). Una pieza fundamental para su comprensión ha sido la descripción de 
los distintos receptores que participan en la inmunidad innata, entre los que se encuentran 
los receptores tipo toll (TLRs). Han pasado poco más de 20 años desde que se definió al 
primero de estos receptores y su participación en la determinación de la polaridad dorso 
ventral de Drosophila melanogaster (Anderson et al., 1985), hasta la demostración de su 
conservación evolutiva desde plantas hasta humanos, así como su implicación actual en la 
inmunidad de la mosca y los vertebrados. 
 De los TLRs y su papel en el desarrollo hematopoyético se desconocen aún muchos 
aspectos. Sin embargo, la información generada en los últimos años ha revolucionado 
vertiginosamente nuestro aprendizaje acerca de la biología de las células troncales 
hematopoyéticas (HSCs) y las células progenitoras hematopoyéticas (HPCs), de las que se 
pensaba que no respondían a estímulos generados por agentes patógenos. Ahora 
comprendemos que su reconocimiento por estas células primitivas es posible y que al ser 
estimuladas no solo son inducidas a la producción de citocinas, factores de crecimiento y 
diferenciación, sino también a la maduración dependiente del estímulo al que se enfrenten. 
 
I. 1 Receptores que reconocen patrones (PRRs) 
 Los receptores que reconocen patrones (PRRs) son una familia creciente de receptores 
encargados del reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPS) y 
de algunas moléculas endógenas que son liberadas al espacio extracelular y a la sangre 
periférica cuando se genera daño celular; Estas son conocidas como patrones moleculares 
asociados a daño (DAMPs) (Tabla 1). LosPRRs, se encuentran codificados en línea 
germinal, no son clonales, se expresan en todas las células de un mismo tipo y su actividad 
es independiente del establecimiento de memoria inmunológica (Akira et al., 2006). Algunos 
2 
 
PRRs pueden hallarse en la matriz extracelular, como es el caso de las pentraxinas y las 
colectinas, estas se clasifican en cortas y largas con base en la estructura primaria de su 
promotor. La proteína C reactiva (PCR) y el componente amiloide P son pentraxinas cortas 
producidas por el hígado en respuesta a IL-1 e IL-6, mientras que la pentraxina 3 es una 
pentraxina larga producida por macrófagos y células dendríticas tras estimulación de sus 
TLRs, así como por una variedad de tejidos (Deban et al., 2009). Sus ligandos incluyen a la 
fracción C1q del complemento, cuerpos apoptóticos, histonas y patógenos (Myeong y Kim., 
2007). Las colectinas, por su parte, son una familia de lectinas calcio-dependientes que 
comparten una estructura semejante. También son producidas en el hígado y las más 
estudiadas son la lectina de unión a manana (MBL) y las proteínas surfactantes A y B. Estas 
participan en la opsonización, aglutinación, neutralización, la activación del complemento y 
fagocitosis, así como la modulación de la inflamación, alergias y remoción de cuerpos 
apoptóticos (Gupta y Sorolia., 2007; van de Wetering y cols., 2004). 
 Otros miembros de la familia de los PRRs se pueden hallar de manera soluble en el 
citoplasma, tal es el caso de los receptores tipo gen inducible del ácido retinoico I (RIG-1), 
también conocido como DDX58 o receptores tipo RIG1 (RLRs), el antígeno asociado a la 
diferenciación del melanoma 5 (MDA5 o IFIH1), el denominado LPG2 (por „laboratorio de 
genética y fisiología 2‟), y los receptores tipo dominio de oligomerización nucleotídica (NOD) 
o receptores tipo NOD (NLRs) (Malathi y cols., 2007; Bourchis y cols., 2007). RIG-1 y MDA5 
poseen un dominio N-terminal de reclutamiento de caspasa (CARD) se utiliza para la 
señalización y consecuente producción de interferón (Malathi y cols., 2007). Estos receptores 
junto con LPG-2 (Li y cols., 2009), reconocen al RNA de doble cadena (dsRNA) y RIG-I 
además, RNA de cadena sencilla 5´trifosfatado (ssRNA) que pueden ser encontrados en 
virus o en los estadios intermedios de replicación del material genético (Yoneyama y Fujita., 
2007). Debido a que RIG-I y MDA5 tienen similitudes estructurales, se les atribuyen 
funciones semejantes; sin embargo, estos receptores reconocen diferentes partículas virales 
y ello ha sugerido que el repertorio de citocinas que producen pudiera ser distinto (Kato y 
cols., 2006). LPG2 carece de dominio CARD pero es esencial para montar la respuesta 
antiviral mediada por RIG-I y MDA-5 a través de su dominio de ATPasa (Satoh y cols., 2010). 
Recientemente se ha descrito otro receptor citoplasmático encargado del reconocimiento de 
DNA de doble cadena, de nombre „activador de factores reguladores de interferón 
dependientes de DNA‟ (DAI), aunque también se le conoce como proteína de unión a DNA-Z 
3 
 
1 (ZBP1). Se desconoce si se trata de uno o varios receptores, pero al ser estimulado induce 
la producción de IFN vía el factor relacionado al interferón 3 (IRF3) (Takaoka y cols., 2007). 
 Respecto a los NLRs, a la fecha en humanos se han descrito 23 receptores, mientras que 
en ratón han sido 34 genes que codifican para los mismos receptores (Shaw y cols., 2008). 
Los NLRs son una familia de proteínas altamente conservadas a lo largo de la evolución que 
han sido implicadas en la detección de peptidoglicano a través de regiones ricas en leucina 
(LRRs) dentro de una estructura que semeja al ectodominio de los receptores tipo Toll 
(TLRs). Se cree que los NLRs permanecen inactivos hasta que las LRRs son activadas para 
señalizar por la porción amino terminal vía el factor nuclear kB (NF-kB), caspasa 1 y proteína 
cinasa activada por mitógenos (MAPK), produciendo una respuesta de tipo inflamatoria, con 
actividad antimicrobiana (Fritz y cols., 2006; Meylan y cols,. 2006). 
 Los receptores NOD-1 y NOD-2 detectan diferentes sub-estructuras de peptidoglicano 
(PGN) mientras que el segundo, además puede reconocer muramildipeptido (Girardin y cols., 
2003; Girardin, Travassos y cols., 2003; Inohara y cols., 2003), que es el PGN bacteriano 
más común. Estos receptores trabajan en conjunto con los TLRs potenciando la producción 
de citocinas proinflamatorias (Girardin, Travassos y cols., 2003), aunque no existe a la fecha 
evidencia de que se unan directamente a PGN, sugiriendo que otras moléculas adaptadoras 
pueden estar implicadas (Malathi y cols., 2007) en el reconocimiento. Cuando los NLRs son 
estimulados, se induce la producción de citocinas proinflamatorias a través de la vía de 
señalización del NF-kB (Girardin y cols., 2003). 
 Otros miembros de esta familia se anclan a la membrana celular, como el receptor del 
complemento 3 (CR3) también conocido como CD18/CD11b, que es del tipo de las β2 
integrinas y está implicado en el reclutamiento celular hacia sitios de inflamación, así como 
en la depuración de cuerpos apoptóticos (Gordon., 2002). Sus ligandos son componentes 
opsonizados de Mycobacterium tuberculosis, el componente de las levaduras zymosan, y 
ligandos endógenos. Los receptores Scavenger Clase A (SR-A) tienen especificidad por los 
ligandos polianiónicos como las lipoproteínas de baja densidad (LDL); estos pueden fungir 
como moléculas de adhesión in vitro y mediar la endocitosis y fagocitosis de componentes 
propios o extraños (Krieger y Stern., 2001). La mayoría de las células del sistema inmune 
innato, pueden reconocer moléculas presentes en los hongos y las micobacterias a través 
de los receptores tipo Lectina-C, entre los que se encuentran la Dectina-C, una proteína de 
4 
 
tipo II transmembranal que por medio de sus motivos ITAM induce la señalización cuando se 
une a glucanos β-1,3 y β-1,6 (Herre y cols., 2004), mientras que el receptor de manosa (MR) 
reconoce moléculas constitutivas de bacterias, hongos, células infectadas por virus, 
parásitos, así como a ligandos propios como la L-selectina/CD62L, lo que denota sus 
propiedades duales de reconocimiento (Gordon., 2002). Otros de los receptores que pueden 
ser expresados en la membrana celular, y probablemente los más estudiados actualmente, 
son los TLRs, cuya función es el reconocimiento de patógenos invasores desde las primeras 
etapas de un reto antigénico (Akira y Takeda., 2004). 
 
I. 2 Receptores Tipo Toll (TLRs) 
 Los receptores tipo Toll (TLRs) son proteínas transmembranales tipo 1 que contienen 
LRRs en su ectodominio. Poseen una región transmembranal y una porción 
intracitoplasmática conocida como dominio TIR (Toll/receptor de IL1) ( Gilliet y cols., 2008) 
(Figura 1). Cada uno de estos receptores tiene la capacidad para discriminar entre los 
distintos PAMPS (Kaisho y Akira., 2003). 
 El primer receptor Toll fue descubierto en 1985 por Anderson y cols en Drosophila 
melanogaster (Anderson y cols., 1985). Originalmente se estudiaba su papel en la polaridad 
dorso-ventral, pero más tarde se observó un papel fundamental en el reconocimiento de 
moléculas presentes en hongos que inducían la activación de cascadas de proteasas para el 
anclaje de la proteína Spaetze (Levashina y cols., 1999), que al ser reconocida por 
receptores Toll inducía la producción del péptido antimicrobiano Drosomicina (Akira y 
Takeda., 2004). El primer TLR descubierto en mamíferos fue el TLR4 (Medzhitov y cols., 
1997). Desde entonces, 10 TLRs se han descrito en humanos (Akira y Takeda., 2004) y 13 
en ratón (McGettrick y O´Neill., 2007). Estos receptores se expresan abundantemente en 
fibroblastos y células epiteliales, en células del sistema inmune como los macrófagos, 
subpoblaciones de células dendríticas, linfocitos B y T. Su expresión es regulada por 
patógenos,citocinas y factores ambientales (Akira y Takeda., 2004). Mientras los TLR1, 2, 4, 
5, 6 y 10 se encuentran en la membrana celular, los TLR3, 7, 8 y 9 se hallan en endosomas 
(Figura 1). Ya sea como monómeros, o en forma de heterodímeros, cada uno de ellos 
reconoce un patrón molecular distinto presumiblemente a través de las LRRs, las cuales 
5 
 
varían según el TLR, aunque aún no se conoce con precisión la manera en que son capaces 
de discriminar entre los diferentes PAMPS. 
 Uno de los TLRs más estudiados es TLR2, cuya función es reconocer peptidoglicano y 
porinas en las bacterias Gram-negativas, lipoarabinomanana en las Gram-positivas, 
fosfolipomanana en hongos, glicosilfosfatidilinositol en parásitos, y hemaglutinina. Este 
receptor forma complejos heterodiméricos con el TLR1 para detectar así triacil lipopéptidos 
que son moléculas constitutivas de bacterias y micobacterias, o con el TLR6 para reconocer 
diacil lipopéptidos y acído lipoteicóico (LTA), mismos que están presentes en bacterias y 
Zymosan (Akira y Takeda., 2004). El reconocimiento de moléculas constitutivas de los 
hongos se puede llevar a cabo por la asociación de los receptores de la familia de las 
lectinas con TLR2 y reconocer ligandos del tipo de los β-glucanos (Arancibia y cols., 2007). 
Estudios recientes han descrito la estructura del complejo heterodimérico formado por TLR1 
y 2 con el Pam3CSK4, un agonista sintético del TLR2, donde se demuestra como las 
cadenas lipídicas del agonista se unen al receptor por interacciones hidrofóbicas, que 
después se estabilizan por asociación con otras proteínas ( Jin y Lee., 2008). 
 El lipopolisacárido (LPS) o endotoxina, es el componente estructural más abundante de 
las bacterias Gram-negativas y es el ligando de TLR4. El TLR4 ha sido el más estudiado de 
los TLRs y se ha demostrado que es capaz de reconocer también manana, 
glicosilinositolfosfolípidos, proteínas de cápsides virales, proteínas de fusión del virus sincicial 
respitarorio (RSV), paclixatel (un diperteno de las plantas) y taxol (un agente antitumoral). 
Además, este receptor puede reconocer moléculas endógenas como las proteínas de choque 
térmico 60 y 70 kDa (HSP60 y 70), fibrinógeno, fibronectina, ácido hialurónico y heparán 
sulfato ( Akira y Takeda., 2004; Arancibia y cols., 2007). Cuando el LPS es liberado por las 
bacterias Gram-negativas, se forma un complejo con la proteína de unión a LPS (LBP) 
presente en el torrente sanguíneo. Una vez formado el complejo, unen a CD14 un 
glicosilfosfatidilinositol (GPI) que se puede hallar anclado a membrana celular o soluble en 
plasma ( Nagai y cols., 2006). Posteriormente el complejo se une a TLR4, donde la proteína 
adaptadora MD2 juega un papel crucial en la respuesta inflamatoria óptima. El TLR4 se 
expresa predominantemente en células fagocíticas (Arancibia y cols., 2007). 
 El flagelo es indispensable para la motilidad microbiana y está constituido por flagelinas, 
estas proteínas estan altamente conservadas en las bacterias y son reconocidas por TLR5, 
6 
 
disparando la respuesta inmune innata cuando los microorganismos han traspasado la 
barrera epitelial (Smith y cols., 2003). No todas las flagelinas tienen propiedades 
proinflamatorias, algunas bacterias como Helicobacter pylori puede evadir la respuesta 
inmune aprovechando esta característica (Andersen- Niessen y cols 2005). Por otro lado, la 
detección de microorganismos y ácidos nucléicos derivados de los mismos son esenciales 
para montar una respuesta inmune. El RNA de cadena sencilla ó doble (ssRNA y ds RNA, 
respectivamente) y el DNA no metilado, se conocen por inducir la síntesis de IFNα/β 
(Arancibia y cols., 2007). Todos los TLRs que reconocen ácidos nucléicos se expresan en 
endosomas, sitio al cual el ligando requiere ser internalizado para la posterior 
reconocimiento. El ambiente ácido y las enzimas presentes en este organelo son esenciales 
para la degradación y óptima activación de dichos receptores. Así, el TLR3 reconoce dsRNA 
que se encuentra presente en virus como el de influenza, además, puede ser generado como 
un producto intermediario en la replicación viral, o de la transcripción simétrica de los virus de 
DNA. Los TLR7 y 8 comparten ciertas propiedades y los genes que los codifican están 
situados en el cromosoma X (Akira y Takeda., 2004). Ambos receptores detectan ssRNA y 
algunos RNA de interferencia (siRNA) (Baltimore y cols., 2008). Por su parte, TLR9 reconoce 
DNA con motivos citidina fosfato guanosina (CpG), los cuales se encontran en el material 
genético del virus de herpes simple 1 y 2 (HSV-1 y HSV2, respectivamente) o del 
citomegalovirus murino (MCMV) (Akira y Takeda., 2004; Arancibia y cols., 2007). 
 Aún no se ha descrito el ligando de TLR10. Este receptor se expresa en la membrana 
celular, puede homodimerizarse o heterodimerizarse con TLR1 y TLR2, ( Hasan., 2005) los 
estudios de cristalografía de su dominio TIR sugieren que lleva a cabo el reconocimiento 
como estructura dimérica. Los genes que codifican para este receptor se han detectado en 
humanos y ratas, más no en ratones, lo que sugiere que al menos en las dos primeras 
especies, se encuentra conservado evolutivamente. Tanto TLR7 como TLR9 y TLR10 se han 
sido descrito en linfocitos B y en células dendríticas plasmacitoides (pDCs) (Hasan y cols., 
2005; Nyman y cols., 2008). 
 
 
 
 
7 
 
Tabla 1. Receptores que reconocen patrones (PRRs) 
Receptor Ligandos Ubicación 
Pentraxinas cortas 
 Proteína C Reactiva 
 Componente Amiloide P 
Pentraxinas largas 
 Pentraxina 3 
C1q 
Cuerpos apoptóticos 
Histonas 
Patógenos 
 
Matriz extracelular 
 Colectinas 
 Lectina de unión a manana 
 Proteína Surfactante A 
 Proteína Surfactante B 
Cuerpos apoptóticos 
Receptores tipo RIG-1 (RLRs) 
 Gen inducible del ácido retinoico 1 (RIG1) 
 
 Antígeno asociado a diferenciación del 
melanoma 5 (MDA5) 
 Laboratorio de Genética y Fisiología 2 (LPG2) 
 
RNA cadena sencilla 
RNA cadena doble 
Citoplasma 
RNA cadena doble 
Receptores tipo NOD (NLRs) 
 Dominio de oligomerización nucleotídica 
(NOD1) 
 
 Dominio de oligomerización nucleotídica 
(NOD2) 
Péptidoglicano 
Péptidoglicano 
Muramildipéptido 
Activador de factores reguladores de interferón 
dependientes de DNA (DAI) 
DNA cadena doble 
Receptor del complemento 3 (CR3) 
Componentes opsonizados de 
M. Tuberculosis 
Zymosan 
Membrana Celular 
Receptor Scavenger Clase A Lipoproteínas de baja densidad (LDL) 
Dectina C Glucanos β-1,3 y β-1,6 
Receptor de Manosa Manosa, L- Selectina 
 
TLR 1, 2 y 6 
Péptidoglicano, Porinas, 
Lipoarabinomanana 
Fosfolipomananas 
Glucosil fosfatidil inositol 
Hemaglutinina, triacil lipopéptidos 
 
TLR 2 y 6 
 
Diacillipopéptidos, Acido lipoteicóico 
Zymosan 
TLR4 
Lipopolisacárido (LPS) 
Manana 
Glicosilinositol fosfolípidos 
Proteínas de cápside 
Proteínas de fusión del virus sinsicial 
respiratorio, Paclixatel, Taxol, HSP60, HSP70, 
fibrinogeno, fibronectina, ácido hialurónico, 
Heparan sulfato. 
TLR10 Desconocido 
TLR5 Flagelina 
TLR3 RNA cadena doble 
Endosoma TLR7 y TLR8 RNA cadena sencilla y de interferencia 
TLR9 DNA con motivos CpG 
Los PRRs se encuentran solubles en los espacios extracelulares, anclados a membrana o libres en el citoplasma. 
 
8 
 
I. 2. 1 Vías de señalización de los TLRs 
 Cuando los TLRs reconocen PAMPS, agonistas sintéticos o ligandos endógenos ( Rakoff 
y Medzhitov., 2009), inducen la producción de citocinas proinflamatorias e IFNα/β a través de 
una proteína adaptadora denominada de respuesta primaria de la diferenciación mieloide 88 
(MyD88), que fue descrita originalmente en leucemia mieloide aguda M1 tras la inducción de 
diferenciación y arresto del crecimiento en respuesta a IL-6 ( Lord y cols., 1990). Todos los 
TLRs excepto el TLR3 ( Takeda y Akira., 2004) (ver más adelante) induce la señalización a 
través de esta proteína. A la fecha se conocendos vías de señalización de estos receptores; 
la dependiente de MyD88 y la independiente de la misma (Kawai y cols., 1999) (Figura 1). 
 
1. 2. 1. 1 Vía dependiente de MyD88 
 La proteína adaptadora MyD88 es la primera en ser reclutada al dominio TIR del TLR 
(Figura 1). Esta porción del receptor está expuesta hacia el citoplasma en donde la cinasa 4 
asociada al receptor de IL1 (IRAK4), se une a MyD88 seguida por el reclutamiento de la 
cinasa 1 asociada al receptor de IL1 (IRAK1) (Adachi y cols 1998) y del factor asociado al 
receptor del factor de necrosis tumoral (TRAF6). Una vez acopladas, IRAK1 se fosforila y 
degrada en la membrana celular y TRAF6 se disocia del dominio TIR, uniéndose a otro 
complejo proteico formado por la cinasa 1 activada TGFβ (TAK1) y las proteínas de unión a 
TAK 1 y 2 (TAB1 y 2). Este complejo transloca al citoplasma en donde TRAF6 es 
ubiquitinizado, llevando a la activación de TAK1 que fosforila a la proteína cinasa activada 
por mitógenos (MAPK), que al translocarse al núcleo, induce la expresión de moléculas 
coestimuladoras. TAK1 también fosforila al complejo de la cinasa inhibidora del NF-kB (IKK) 
que está conformado por IKKα, IKKβ e IKKγ. Cuando IkB, que es la molécula que mantiene a 
NF-kB inactiva, se fosforila y se degrada en el proteasoma permitiendo la translocación de 
NF-kB al núcleo para inducir la expresión génica (Akira y Takeda., 2004; Takeda y Akira., 
2004). 
 
 
 
 
9 
 
1. 2. 1. 2 Vía independiente de MyD88 
 Además del TLR4 que puede inducir la señalización por ambas vías, TLR3 utiliza 
exclusivamente la vía independiente de MyD88. La molécula adaptadora implicada en este 
proceso se denomina dominio TIR, que contiene a la proteína adaptadora que induce a IFNβ 
(TRIF); esta se asocia al dominio TIR del TLR3, mientras que TLR4 utiliza a la molécula 
adaptadora relacionada a TRIF (TRAM), que funciona como puente entre el dominio TIR y 
TRIF (Figura 1). Cuando se induce la señalización de TLR4, TRIF se asocia a la proteína 1 
que interacciona con el receptor (RIP1), misma que es responsable de la activación de NF-
kB y TRIF activa a la cinasa 1 de unión a TANK (activador de NF-kB asociado al miembro de 
la familia TRAF) (TKB1) vía TRAF6. La TKB1 fosforila directamente a IRF3 e IRF7, que 
forman homodímeros que translocan al núcleo para promover la expresión de genes 
inductores de IFN y genes que codifican para moléculas de adhesión como CXCL10 ( Akira y 
Takeda., 2004). 
 
 
 
10 
 
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p65
TLR1,2,6 TLR4 TLR5 TLR10
M
y
D
8
8
TLR3 TLR9
Endosoma
TLR7
IR
A
K
4
IR
A
K
1
TRAF6
P
TAB1
TAB2
TAK1 P
MAPK
IKK
P
p65p50
p65
MAPK
p50
IκB
P
Citocinas
proinflamatoriasCD80, CD86
T
R
A
M
T
R
IF
T
R
IF
RIP1
TRAF6
IKK-ε
TKB1
IRF3/7
P
IFN
MD2
M
y
D
8
8
M
y
D
8
8
M
y
D
8
8
M
y
D
8
8
M
A
L
M
y
D
8
8
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
ADN
IRF3/7
P
NF-κB
Dominio TIR
 
Figura 1. Los TLRs inducen la señalización de manera dependiente e independiente de MyD88. TLR, receptor tipo 
Toll. TIR, dominio Toll / receptor de IL1. MyD88, gen de respuesta primaria de la diferenciación mieloide 88. IRAK4, cinasa 4 
asociada al receptor de IL1. IRAK1, cinasa 1 asociada al receptor de IL1. TRAF6, factor asociado al receptor del factor de 
necrosis tumoral. TAK1, cinasa 1 activada TGFβ. TAB1, proteína 1 de unión a TAK1. TAB2, proteína 2 de unión a TAB2. 
MAPK, cinasa activada por mitógenos. CD80 y CD86, proteínas co-estimuladoras. NF-kB, factor nuclear kappa B. IKKα, IKKβ 
e IKKγ., cinasas inhibidoras del factor nuclear-kappaB (NF-kB). TRIF, proteína adaptadora que induce a IFNβ. TRAM, 
molécula adaptadora relacionada a TRIF. RIP1, proteína 1 que interacciona con el receptor. TANK, activador de NF-kB 
asociado al miembro de la familia TRAF. TKB1, cinasa1 de unión a TANK. IRF3 y 7, factores relacionados al interferón 3 y 7. 
 
 
I. 2 Hematopoyesis 
 Las células sanguíneas y las del sistema inmune poseen un tiempo de vida limitado, por 
lo que tienen que ser sustituidas de manera constante. La hematopoyesis es el proceso por 
el cual se producen todas las células sanguíneas a partir de las células troncales 
hematopoyéticas (HSCs), mismas que constituyen el 0.01% de total de células nucleadas 
presentes en la médula ósea. Las HSCs tienen dos características principales: 
autorrenovación, es decir que al dividirse, por lo menos una de las células hijas conserva las 
Vadillo, 2010 
11 
 
características de troncalidad, y multipotencialidad que se refiere a la capacidad de originar a 
todos los distintos linajes sanguíneos (Mayani y cols., 2007). 
 En el ratón, las HSC que se encuentran dentro de la fracción Lin- c-Kit+ Sca1+ (LSK) dan 
origen a las células linfoides más primitivas de las que se tiene conocimiento, el progenitor 
linfoide temprano (ELP), que fue caracterizado en los ratones knock in RAG1/GFP permite 
evidenciar la transcripción del locus de la enzima que recombina los segmentos genéticos 
VDJ de la inmunoglobulina y del TCR, la recombinasa RAG1, evidenciando así el inicio del 
programa de diferenciación linfoide (Welner y cols., 2007). El ELP se ha descrito solamente 
en el ratón y es el productor principal de células dendríticas plasmacitoides 1 y 2 (pDC 1 y 
pDC2) que se subdividen con base en la expresión de RAG y el patrón de producción de 
citocinas ( Pelayo y cols., 2005); también, esta célula es la principal productora de células 
dendríticas asesinas productoras de interferon (IKDCs), que tienen la capacidad de presentar 
antígeno y de producir IFNγ (Welner y cols., 2007). El ELP da origen al progenitor linfoide 
común (CLP), descrito en el ratón como una población que expresa la cadena alfa del 
receptor de interleucina 7 (IL-7Rα), que tiene la capacidad de reconstituir de los linajes de 
células T, B y NK in vivo (Kondo y cols., 1997). Por su parte, Galy y cols describieron a su 
contraparte en humanos, caracterizada por la expresión de CD10 y la capacidad de producir 
LT, LB, NK and DCs. Tanto el CLP en ratón como su contraparte humana, tienen muy 
reducido potencial mieloide (Galy y cols 1995) y es el principal productor de células B. La 
transición de CLP a célula pro-B se regula por la activación del factor de transcripción Pax5 
que a su vez regula la expresión de CD19. Cuando este marcador se expresa, el progenitor 
habrá adquirido compromiso de linaje linfoide B ( Hardy., 2007). Estas células a medida que 
van madurando en la médula ósea, van adquiriendo moléculas de superficie como el receptor 
de células B (BCR), e inmunoglobulinas de superficie IgM e IgD. Una vez que han 
completado este proceso, los LB inmaduros migran al bazo donde pueden ser activados y/o 
diferenciarse a células plasmáticas o a linfocitos B de memoria. 
 Los linfocitos T maduran en el timo pero la identidad de las células que lo colonizan aún 
no está completamente identificada. Para que un progenitor linfoide múrino sea capaz de 
colonizar el timo, debe de expresar el receptor de quimiocinas CCR9 ( Schwarz y cols., 
2007), CD44, las integrinas α4 y β2 además del ligando 1 glucoprotéico de la P selectina 
(PSGL-1) (Bhandoola y cols., 2007), mientras que para poder diferenciarse in situ, debe de 
expresar Notch-1 y estar en contacto con sus ligandos tipo Delta-1 y 4 (DL1 y DL4), 
12 
 
expresados por el epitelio tímico ( Heinzel y cols., 2007). Los transcritos que codifican para 
esta molécula se han descrito en HSCs, MPPs, ELPs y CLPs, todas ellas con potencial de 
generar células T ( Bhandoola y cols., 2007). La célula más primitiva que llega al timo es el 
progenitor tímico temprano (ETP)que aún retiene cierto potencial para generar LB pero que 
es capaz de proliferar y diferenciarse a LT, a través de un proceso de selección positiva y 
negativa que posteriormente evitará el reconocimiento de antígenos propios y la consecuente 
autoinmunidad. Además de potencial de células T, las células que colonizan el timo pueden 
originar células NK, DCs y células mieloides ( Bell y Bhandoola., 2008), sin embargo, esta 
característica se pierde en el estadio DN3 que coincide con el rearreglo de los genes del 
TCR en donde algunas de estas células se diferencian a linfocitos Tγδ, y otras derivan a LT 
dobles positivos (CD4+ CD8+) que son los más abundantes en el timo y que se diferencian a 
LT unipositivos (CD4+ ó CD8+). 
 La diferenciación mieloide también se lleva a cabo en la médula ósea y da origen a los 
monocitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos, trombocitos y células cebadas a 
partir de los progenitores mieloides comunes (CMP), descritos en el humano por Akashi y 
cols, quienes propusieron que las rutas de diferenciación megacariocítica-eritroide y la 
granulocítica/monocítica eran mutuamente excluyentes (Akashi y cols., 2000). En el humano, 
estas células se pueden caracterizar dentro de la población Lin-CD34+CD38+ en la MO y en 
SCU con base en la expresión de la cadena alfa del receptor de IL3 (IL-3Rα/CD123) Manz y 
cols., 2002). Las células dendríticas tienen un programa único y pueden derivar de las rutas 
de diferenciación tanto linfoide como mieloide (Welner., 2007). Todas las vías de 
diferenciación se encuentran finamente reguladas por señales tanto intrínsecas (factores de 
transcripción, inhibidores de las cinasa dependientes de ciclinas, telomerasas y RNA de 
interferencia (Baltimore y cols.,2008) como extrínsecas (citocinas, quimiocinas, interacciones 
célula-célula e interacciones a través de la matriz extracelular). Cualquier defecto en la 
regulación de estos factores puede llevar a un estado patológico. 
 
I. 2. 1 Hematopoyesis murina y TLRs 
 Gran parte del conocimiento adquirido acerca de la hematopoyesis y los factores que la 
regulan se debe a los modelos animales. En Drosophila melanogaster, las HSC dan origen a 
células cristal y a plasmatocitos en condiciones normales, pero cuando las larvas de la 
13 
 
mosca se retan antigénicamente, los plasmatocitos que son equivalentes a las células 
mieloides en vertebrados, proliferan y dependiendo de la naturaleza del reto, se diferencian a 
células fagocíticas o a lamelocitos discoidales o adherentes que tienen capacidad fagocítica 
nula, pero participan encapsulando al agente para su degradación posterior en donde la vía 
de señalización de Toll/Cactus se ve implicada ( Qui y cols., 1998). 
 Aún antes de que se conociera la existencia de los TLRs, se sabía que la administración 
de endotoxina a ratones podía inducir la movilización de neutrófilos de la médula ósea, 
además de incrementar el número de precursores mieloides in situ ( Marsh y cols., 1967). En 
este proceso inflamatorio, la movilización de células de médula ósea es mediada por TNFα, 
que por sinérgia con la IL-1β aumenta la mielopoyesis y moviliza a los linfocitos y sus 
progenitores al bazo, por disminución de la expresión de los transcritos y de la proteína 
CXCL12 en la médula ósea (Ueda y cols., 2004). Además de estos estímulos, las señales de 
daño, como la del CpG DNA, inducen la producción de IL8 y provocan la movilización de 
progenitores hematopoyéticos a sangre periférica (Nardini y cols., 2005). 
 Actualmente se sabe que los TLRs se encuentran implicados en la hematopoyesis de los 
vertebrados. Nagai y cols, describieron que los TLRs 2, 4 y CD14 se expresan desde los 
estadios más primitivos de la diferenciación hematopoyética y que al ser estimulados con sus 
ligandos Pam3CSK4 y LPS, respectivamente, los inducen a entrar a ciclo celular (lo que 
explica el aumento de precursores mieloides descrito por Quesensberry y cols., 1973), cuya 
señalización vía MyD88 promueve la diferenciación de los progenitores mieloides a 
granulocitos y macrófagos, obviando los requerimientos de factores de crecimiento y 
diferenciación. También se ha demostrado que la estimulación de progenitores linfoides 
comunes (CLP) con LPS, promueve la producción de células dendríticas y que cuando se les 
estimula con Pam3CSK4 se producen células B y dendríticas (Nagai y cols., 2006) (Figura 2). 
Estos hallazgos indicaron por primera vez que desde las etapas más primitivas, estas células 
son capaces de reconocer señales microbianas extrínsecas y promover o modificar los 
patrones normales de diferenciación hacia la producción celular necesaria para el combate 
de un patógeno específico. Posteriormente, se estableció que los CLPs purificados de 
ratones que cursaban con una infección aguda por el virus herpes simple (HSV-1), abatían 
casi por completo la producción de linfocitos B, pero en cambio, se producían células 
dendríticas convencionales (cDCs), células dendríticas productoras de IFN (IKDCs) y células 
dendríticas plasmacitoides (pDCs) del TLR9. Cuando los CLPs fueron purificados y 
14 
 
estimulados con ligandos de TLR9, se observó el mismo fenómeno. Sin embargo, cuando los 
progenitores mieloides comunes (CMPs) se estimularon con ligandos de TLR9, éstos 
mostraron mayor producción de células mieloides y menor DCs (Figura 2). La producción de 
células dendríticas provenientes de CLPs fué independiente de TNFα así como de IFNα/β, 
IFNγ (Welner y cols., 2008). 
 Por otro lado, existen evidencias recientes que sugieren que las células hematopoyéticas 
más primitivas en el ratón pueden reconocer moléculas presentes en las levaduras e hifas de 
Candida albicans, y en respuesta proliferar y diferenciarse de manera dependiente del TLR2 
y MyD88, dando como resultado la producción de neutrófilos y macrófagos ( Yañez y cols., 
2009; Yañez y cols., 2010) (Figura 2). Un estudio previo apoya estos resultados ya que 
demuestran que cuando un ratón deficiente de factor estimulante de colonias de granulocitos 
(G-CSF) y de factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF), son 
retados con Candida albicans, estos mismos desarrollan neutrofília tanto en MO como en 
sangre periférica, lo que sugiere la generación de células mieloides de novo por efecto de 
este microorganismo (Basu y cols., 2000). 
 Recientemente, Chen y cols, han demostrado que las células troncales embrionarias 
(CTEs) del ratón expresan transcritos que codifican para los TLR1-9 y para la proteína 
adaptadora MyD88, además de expresar TLR2 y TLR4. Cuando las CTEs se estimulan con 
LPS se induciden a proliferar y diferenciarse a linaje mieloide. No obstante estos hallazgos, la 
función de los TLRs en dichas etapas del desarrollo es una pregunta abierta (Lee y cols., 
2009). 
 En el ratón, a diferencia del humano, el TLR4 se expresa en los linfocitos B (Chiron y 
cols., 2008). Los linfocitos B vírgenes (Bv) expresan además los TLRs 2, 7 y 9 y al 
estimularlos, se diferencian a células plasmáticas. Los linfocitos B de memoria (Bm) pueden 
diferenciarse in vitro a células plasmáticas tras estimular al TLR7 y 9, aunque estos agonistas 
no son suficientes para activar la respuesta humoral in vivo, sugiriendo que la activación de 
las células Bm requieren de más señales como la activación vía BCR, o la cooperación de T 
para diferenciarse (Richard y cols., 2008). Cuando los linfocitos B son estimulados con 
partículas tipo virus acopladas a ssRNA ó CpG DNA, pueden sufrir cambio de clase y 
diferenciarse a células plasmáticas productoras de IgG2a, un fenómeno mediado por la 
expresión de TLRs e independiente de IFN (Peng., 2005; Jegerlehner y cols., 2007; Hinton y 
15 
 
cols., 2008). Los linfocitos B también pueden ser inducidos a madurar a través de la 
estimulación vía TLR4. Hayashi y cols, evaluaron su proceso de maduración con base en el 
aumentode la población CD23+ (receptor de baja afinidad para Fcε considerado como 
marcador de madurez del linaje B) en presencia de agonistas de TLR4 y TLR2, resultando en 
aumento del porcentaje de células CD23+ con estímulo de LPS ó lípido A, pero su inhibición 
a través de Pam3Cys (ligando de TLR2) (Hayashi y cols., 2005). Por otro lado, los linfocitos T 
pueden ser inducidos a proliferar y a producir citocinas cuando de manera simultánea se 
estimula su TCR o los TLRs 2, 5, 7 y 8 de manera individual, sin embargo, cuando se 
estimulan el TLR3 y 9, estas células no proliferan pero aumentan su sobrevida por un 
mecanismo asociado a la activación de NF-κB, y por la regulación positiva de la proteína 
antiapoptótica Bcl–Xi (Gelman y cols., 2004; Kabelitz., 2007). Otra población de los LT 
implicada en el reconocimiento hematopoyético de ligandos de TLRs son los LT reguladores 
con fenotipo CD25+CD4+ (Treg). Sutmuller y cols, reportaron que cuando se estimula el TLR2 
y el TCR simultáneamente, estas células proliferan tanto in vitro como in vivo, resultando en 
una pérdida parcial del fenotipo de Treg in vitro y demostrando que el TLR2 regula la función 
de las Treg (Sutmuller y cols., 2006). Además del TLR2, el TLR5 y TLR8 han mostrado la 
misma actividad que TLR2 en Treg (Crellin y cols., 2005; Peng y cols., 2005). Sin embargo, 
estos hallazgos han sido retados recientemente, en un estudio que indica que la estimulación 
con Pam3CSK4 no modifica la función supresora o la expresión de FoxP3, pero si induce la 
expresión de Bcl–X(L), aumentando la sobrevida celular. Estos hallazgos sugieren que los 
ligandos de TLRs podrían ser utilizados como blancos terapéuticos en la modulación de las 
células Treg así como en enfermedades autoinmunes (Chen y cols., 2009). 
16 
 
LPS ó Pam3CSK4 ó
C. albicans
LSK+
CLP
GMP
M N
HSV ó
CpG DNA
LPS Pam3CSK4
cDC cDC B
B
pDC IKDC cDC
+
+
+ +
CMP
CpG DNA ó
C. albicans
CP
CpG DNA ó
LPS
 
Figura 2. Hematopoyesis murina y TLRs. Las células en estadios tempranos de diferenciación que son estimuladas 
con ligandos de TLRs se inducen a madurar y modifican sus patrones normales de diferenciación. LSK
+
. Lin
- 
Sca1
+
c-
kit
+
. CLP, Progenitor linfoide común. pDC, Célula dendrítica plasmacitoide. IKDC, Célula dendrítica productora de interferón. 
cDC, Célula dendrítica convencional. B, Linfocito B. CP, Célula plasmática. CMP, Progenitor mieloide común. GMP, 
Progenitor de granulocitos y monocitos. M, Macrófago. N, Neutrófilo. LPS, Lipopolisacárido. HSV, Virus Herpes simple. 
 
I. 2. 2 Hematopoyesis humana y TLRs 
 Por razones éticas, el conocimiento de la hematopoyesis humana a la fecha es muy 
limitado en comparación al adquirido en los modelos animales; sin embargo, la cercanía 
filogenética con otros mamíferos ha permitido hacer analogías que pueden ser aplicadas a 
nuestra especie en donde, las infecciones causadas por Parvovirus B19 y Epstein-Barr 
inducen la depleción de linfocitos de la médula ósea al ser movilizados a la periferia mientras 
que la mielopoyesis se ve incrementada (Young y cols., 1989). Se ha descrito que la 
infección causada por el virus herpes humano 7 (HHSV-7) en células CD34+ de SCU, 
promueve la diferenciación de los progenitores hematopoyéticos hacia linaje mieloide, donde 
se pudo observar pérdida gradual del antígeno CD34 y la consecuente ganancia de CD33, 
CD14 y CD15 (Mirandola y cols., 2000). Al igual que en el ratón, la estimulación del TLR9 en 
estadios primitivos de la diferenciación indujo la producción de IL8 (Kim y cols., 2005). Sioud 
Vadillo, 2010 
17 
 
y cols, describieron la expresión de transcritos que codifican para el TLR4, TLR7, TLR8, 
MyD88 e IRAK1 en la población de células CD34+ de MON, lo que sugiere una vía de 
señalización funcional que al ser activada con R848 (ligando de los TLR7/8) y RNAs de 
interferencia con capacidad inmunoestimulatoria como el siRNA-27, inducen la diferenciación 
hacia monocitos, macrófagos y células dendríticas se caracterizaron por la expresión de 
CD13, CD14 y CD11c (Sioud y cols., 2006) (Figura 3). Un año más tarde, demostraron que 
cuando las células CD34+ de MO se estimulan con Loxoribina (ligando del TLR7) y 
Pam3CSK4 (ligando del TLR2), al igual que con R848 (ligando de TLR7/8), son capaces de 
producir factores como IL6, 8, 10, GM-CSF, G-CSF, TNFα, IL-1β, MCP-1, MIP1α y MIP-1β, 
IL-1Rα e IP-10, que en conjunto pueden regular positiva o negativamente la diferenciación 
hacia el linaje mieloide con producción de monocitos y células dendríticas, así como la 
sobrevivencia celular (Figura 3). También observaron que a partir de células CD34+ la 
diferenciación hacia células dendríticas mieloides (mDCs) es dependiente de la estimulación 
autócrina de TNFα (Sioud y Fløisand., 2007). Por otro lado, De Luca y cols, determinaron que 
las HSCs y HPCs expresan niveles comparables de transcritos de los TLRs 1 y 6; mayor 
expresión de transcritos codificantes para el TLR3 en HSCs, y poca o nula expresión de los 
transcritos de TLR2, 4, 7, 8, 9 y 10. Las células Lin- CD34+ provenientes de sangre de cordón 
umbilical que se estimularon con R848, LPS, Poly I:C, CpG DNA y Pam3CSK4 inhibieron la 
producción de células B, mientras que la diferenciación hacia el linaje mieloide se mantuvo o 
se promovió in vitro. Por el contrario, estas mismas células estimuladas con flagelina no 
inhibieron la producción de células B y mostraron incremento discreto en la producción de 
células mieloides. En este trabajo se pudo también observar incremento en la producción de 
células con fenotipo megacariocitoide, evaluado por la expresión del CD41a a partir de HSCs 
y HPCs estimuladas con Pam3CSK4. El ligando también mostró promover la diferenciación 
de HSCs a progenitores mieloides comunes (CMPs), y en menor grado de progenitores de 
granulocitos y monocitos (GMPs), así como de progenitores de megacariocitos y eritrocitos 
(MEPs). Estos hallazgos sugieren que los fenomenos descritos en el ratón pueden ser 
extrapolados al humano, y que los progenitores hematopoyéticos son sensibles a señales 
microbianas extrínsecas además de responder con la producción de células de la respuesta 
inmune innata a expensas de la linfopoyesis de B ( De Luca y cols., 2009). Los linfocitos B 
humanos expresan niveles bajos o nulos de transcritos de TLRs, pero como en el ratón, los 
linfocitos B vírgenes solo pueden proliferar y diferenciarse cuando existe activación 
18 
 
simultanea de su BCR. Por el contrario, los linfocitos B de memoria que se caracterizan por 
la expresión de CD27, ehiben preferentemente transcritos de TLRs 6, 7, 9 y 10. Los TLRs 1 y 
2 se encuentran en bajas proporciones en ambas poblaciones. Cuando los linfocitos B se 
estimulan con CpG las Bm proliferan, se diferencian a células plasmáticas productoras de 
IgG en respuesta a CpG, mientras que los Bv solo lo hacen si son activadas de manera 
simultánea con el BCR (Bernasconi y cols., 2003) (Figura 3), sugiriendo de que los TLRs son 
regulados a través del desarrollo celular. 
Por su parte, los linfocitos T humanos expresan transcritos de los TLRs 1, 2, 3, 5, 7 y 9 y 
actúan como co-estimuladores para la proliferación y producción de citocinas cuando son 
activados vía TCR. Caron y cols, estimularon LT humanos con ligandos de los TLR5, TLR7 y 
TLR8 en ausencia de células presentadoras de antígeno (APCs) y bajas concentraciones de 
antígenos T-dependientes y T-independientes, observaron que los LT CD4+ proliferaban y 
producían IFNγ, IL8 e IL10, no así cuando la misma población se estimulaba con ligandos de 
TLR3 y TLR4. A su vez, la respuesta de los LT de memoria (Tm) fue más potente que la de 
los LT vírgenes (Tv) (Caron y cols., 2005), fenómeno que semeja a los Bv y Bm respecto a la 
respuesta a ligandos de TLRs. Cuando los LT CD4+ y CD8+ fueron retados con Pam3Cys 
también se observó co-estimulación para la producción de citocinas y proliferación(Koma-
Koma y cols., 2004). 
 
 
 
 
 
19 
 
cDC
B
+
MEP
GMP
CMP
Pam3CSK4
HSC
Lin- CD34+
si RNA-27,
Loxoribina
Flagelina
R848, LPS, 
Poly I:C,
CpG DNA Pam3CSK4
Flagelina
Mk
M
CP
CpG DNA
HPC
Pam3CSK4
 
Figura 3. Hematopoyesis humana y TLRs. Las células hematopoyéticas humanas que son estimuladas con ligandos 
de TLRs se inducen a madurar y a modificar sus patrones normales de diferenciación. HSC, Célula troncal 
hematopoyética. HPC, Célula progenitora hematopoyética. CMP, Progenitor mieloide común. MEP, Progenitor de 
megacariocitos y eritrocitos. GMP, Progenitor de granulocitos y monocitos. B, Linfocito B. CP, Célula plasmática. M, 
Macrófago. cDC, Célula dendrítica convencional. Mk, Megacariocito. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Vadillo, 2010 
20 
 
I. 3 JUSTIFICACION 
 En los últimos veinte años, se han llevado a cabo más de 125,000 transplantes de células 
hematopoyéticas alrededor del mundo para el rescate de la hematopoyesis, así como para 
fortalecer la inmunidad innata y adquirida en numerosos tipos de cáncer, deficiencias 
inmunológicas y enfermedades genéticas. Después del transplante, la reconstitución del 
sistema inmune depende de varios factores, incluyendo la ncalproliferación, maduración y 
diferenciación de los progenitores linfo-hematopoyéticos del donador. A menudo, el éxito de 
este proceso se ve amenazado por infecciones oportunistas como las causadas por virus 
Herpes, Citomegalovirus, bacterias y Aspergillus, promovidas por las terapias 
inmunosupresoras de las que es objeto el hospedero. Entender el destino de las células 
troncales y los progenitores linfoides hematopoyéticos humanos en circunstancias de 
infección tendrá un impacto importante y directo en la biología del transplante y el 
mejoramiento de estrategias terapéuticas para las enfermedades hematológicas. 
 
 
I. 4 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
 Se desconoce si los componentes y/o productos bacterianos y virales afectan 
directamente la función de las células troncales y precursores linfo-hematopoyéticos; más 
aún, no existe información acerca del momento ontogénico en el humano en que se 
adquiere el repertorio funcional de los receptores tipo Toll (TLRs), responsables del rápido 
reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos. La evidencia de que 
algunas células de la médula ósea expresan TLR7/8 y TLR9, y son capaces de responder a 
ellos a través de la diferenciación a linaje mieloide o la producción de IL-8, respectivamente, 
sugiere que en humanos las células hematopoyéticas más primitivas están provistas de 
estos receptores. 
 
 
 
21 
 
I. 5 HIPOTESIS 
 La exposición de los progenitores linfoides humanos a ligandos del TLR9 promueve la 
diferenciación a células del sistema inmune innato. 
 
 
I. 6 OBJETIVOS 
I. 6. 1 Objetivo general 
 Definir cómo es influenciada la diferenciación hematopoyética de los progenitores linfoides 
humanos a través de la estimulación vía TLR9. 
 
I. 6. 2 Objetivos particulares 
1. Conocer y comparar los patrones de expresión del receptor humano tipo Toll 9 (TLR9) 
en células troncales hematopoyéticas (HSCs) y progenitores linfoides tempranos (ELPs) 
purificados médula ósea normal (MON), sangre de cordón umbilical (SCU) y sangre 
periférica movilizada (SPM). 
2. Evaluar el potencial de diferenciación linfoide de progenitores hematopoyéticos humanos 
de cordón umbilical y sangre periférica movilizada. 
3. Determinar si la unión de TLR9 en los progenitores linfoides purificados desestabiliza la 
decisión del linaje en condiciones de cultivo controladas. 
 
 
 
 
 
 
22 
 
II. MATERIAL Y METODOS 
II. 1 Purificación de células mononucleares a partir de médula ósea normal (MON), 
sangre de cordón umbilical (SCU) y sangre periférica movilizada (SPM) 
 La MON se recolectó de fragmentos óseos de pacientes sometidos a cirugía para 
inserción de prótesis de cabeza del fémur. Los fragmentos óseos se lavaron con solución 
amortiguadora de fosfatos (PBS) de manera seriada al menos tres veces. La SPM se obtuvo 
de donadores de células hematopoyéticas que recibieron tratamiento con factor estimulante 
de colonias de granulocitos (G-CSF) (Filgastrim) vía subcutánea a dosis de 16 µg / kg de 
peso por 5 días y después se realizó la recolección. La SCU fue recolectada por punción de 
la vena umbilical y contenida en bolsas de recolección con anticoagulante y se utilizó sin 
dilución previa. A partir de cada una de las tres fuentes se purificaron las células 
mononucleares (CMNs) por gradiente de densidad en Ficoll–Paque Plus (GE Healthcare). 
Después de colectados los anillos de CMN, las células se lavaron 2 veces con PBS y 
contadas para su posterior congelación o utilización en selección de células primitivas. 
 
II. 2 Congelación de CMN de MON, SCU y SPM 
 Una vez contadas, las células fueron resuspendidas a una densidad máxima de 108 
células/mL en medio de congelación (Recovery cell culture freezing medium, GIBCO) y 
congeladas gradualmente hasta su almacenamiento a -80° C (NUAIRE Ultra Low freezer). 
 
II. 3 Descongelación de CMN de MON, SCU y SPM 
 Las muestras provenientes del banco de células de la Unidad de Investigación Médica en 
Enfermedades Oncológicas (UIMEO) que se encontraban a -80°C, se descongelaron en 
baño maría a 37°C. Inmediatamente después, el medio de congelación se eliminó por 2 
lavados con α-MEM al 10% de suero fetal bovino (SFB) y en caso de ser necesario, las 
células descongeladas fueron tratadas con DNAsa a 200U/ml por espacio de 30 a 60 minutos 
para liberar las células que estuvieran atrapadas por el DNA proveniente de las células 
destruidas a consecuencia de la descongelación. Finalmente, el número de células viables 
fue estimado utilizando azul tripan (GIBCO). 
23 
 
 II. 4 Enriquecimiento de células CD34+ 
 El enriquecimiento de células CD34+ se realizó utilizando un estuche comercial de 
selección positiva (Miltenyi Biotec). Brevemente, 100x106 CMN se diluyeron 300 μL de PBS 
al 0.5% de albúmina sérica bovina (BSA), y se adicionó reactivo para bloqueo de receptores 
de fracciones Fc y anticuerpo monoclonal de ratón α-CD34 humano acoplado a perlas 
magnéticas. Después de una incubación de 30 minutos y lavado, las células fueron pasadas 
en 500 μL de solución amortiguadora por la columna de selección que ha sido previamente 
acondicionada con PBS al 0.5% de BSA. La columna se lavó repetidamente con PBS al BSA 
0.5%, y la muestra eluida fuera del campo magnético para la recolección de las células 
CD34+. 
 
II. 5 Caracterización de progenitores hematopoyéticos 
 La identificación de los diferentes progenitores tempranos se realizó por citometría de flujo 
multiparamétrica, de acuerdo a lo reportado previamente (Manz y cols., 2002) y utilizando 
combinaciones de anticuerpos que incluían aquéllos dirigidos contra marcadores de linaje 
conjugados a ficoeritrina (PE): CD3 (BD Pharmigen) CD8 (BD Pharmigen), TCR (BD 
Pharmigen), CD19 (Invitrogen), CD56, CD14 (BD Pharmigen), CD11b (BD Pharmigen), CD20 
y CD235a (Invitrogen). Para progenitores mieloides se utilizaron además los anticuerpos anti- 
CD34-FITC (Invitrogen), CD38-APC (Invitrogen), CD45RA-PETxR (Invitrogen) y CD123-
PECy5 (BD Pharmigen). Las diversas poblaciones se distinguieron como sigue: células 
troncales hematopoyéticas (HSC): CD34+LIN-CD38-CD45RA-, progenitores mieloides 
comunes (CMP): CD34+LIN-CD38+CD123+CD45RA-, progenitores de granulocitos y 
monocitos (GMP): CD34+LIN-CD38+CD123+CD45RA+, progenitores de megacariocitos y 
eritroblastos (MEP): CD34+LIN-CD38+CD123-CD45RA-. Por otro lado, para la caracterización 
de progenitores linfoides se utilizaron los mismos anticuerpos dirigidos contra marcadores de 
linaje, además de CD34-FITC (Invitrogen), CD45RA-PETxR (Invitrogen), CD7-APC 
(Invitrogen) y CD10-PECy5 (BD Pharmigen). Los progenitores de células T y NK se 
identificaron comoCD34+LIN-CD45RA+CD7+CD10-, mientras que los posibles progenitores 
linfoides tempranos (ELP) como CD34+LIN-CD45RA+CD7+CD10+ y los progenitores linfoides 
comunes (CLP) como CD34+LIN-CD45RA+CD7-CD10+. Todas las muestras fueron adquiridas 
en un citómetro FACSAria (BD) y los datos analizados con el programa FlowJo Treestar. 
24 
 
 
II. 6 Caracterización de células maduras 
 La caracterización de células maduras se realizó por citometria de flujo multiparamétrica 
utilizando los anticuerpos CD56-FITC, CD19-FITC, TCR-FITC, CD64-FITC, CD123-PE, HLA-
DR PECy5 (BD Pharmigen), BDCA2-APC (Miltenyi Biotec) y CD11c-PE (Invitrogen) para 
células dendríticas convencionales y plasmacitoides; CD19-FITC, CD11c-PE, CD16-BioTxR 
(BD Pharmigen) y CD56-APC (BD Pharmigen) para células B y NK; CD56-PE (BD 
Pharmigen), CD3-Bio-PETxR (Invitrogen), CD4-APC (BD Pharmigen) y CD8-FITC 
(Invitrogen) para células T, NK y NKT; CD13-APC (BD Pharmigen), CD14-PE (BD 
Pharmigen), CD11b-PE-Cy5 (BD Pharmigen) y CD33-FITC (BD Pharmigen) para monocitos. 
 
 II. 7 Purificación de progenitores hematopoyéticos 
 La purificación de las distintas poblaciones de progenitores hematopoyéticos se realizó 
por selección por citometría de flujo (sorting) en un equipo FACSAria (BD), tras la tinción de 
las CMN CD34+ previamente enriquecidas por columna. Los anticuerpos monoclonales 
utilizados fueron CD34-PECy7 (eBioscience), CD38-FITC (Invitrogen), CD45RA-TxR y 
Linaje-PE (CD3, CD8, TCR, CD19, CD56, CD14, CD11b, CD20 y CD235). Las poblaciones 
fueron recibidas del equipo en PBS-3% SFB y preparadas para su cultivo bajo diversas 
condiciones controladas. 
 
II. 8 Estimulación de progenitores hematopoyéticos con CpG DNA 
 Las células purificadas fueron divididas a partes iguales, una fue estimulada con 5 µg de 
CpG A y 5 µg de CpG B (InvivoGen) durante 48 horas en placa de 96 pozos, de fondo 
redondo en medio α-MEM (GIBCO), mientras que la otra mitad se incubó en las mismas 
condiciones pero sin estímulo. Una vez concretada la estimulación, las células fueron 
lavadas repetidamente para eliminar el exceso de ligandos y evitar la posible estimulación de 
células en vía de diferenciación durante el tiempo de co-cultivo. 
 
25 
 
 
II. 9 Siembra de monocapas de células estromales MS-5 
 Se utilizaron células estromales de médula ósea de ratón MS-5 como soporte para la 
diferenciación de los progenitores hematopoyéticos primitivos. Las células fueron expandidas 
seriadamente en frascos de cultivo y cosechadas con tripsina-EDTA al 0.05% (GIBCO). Para 
su utilización en co-cultivos se contaron y sembraron 10,000 células en placas de 48 pozos 
de fondo plano con medio α-MEM 10% SFB hasta alcanzar el 80% de confluencia. 
 
II. 10 Sistema de co-cultivo 
 Cuando las células estromales alcanzaron 80% de confluencia, cantidades definidas de 
progenitores hematopoyéticos se co-cultivaron utilizando medio α-MEM 10% de SFB y co-
cultivadas por 4 semanas en presencia de IL-7 (5 ng/ml), IL-15 (10 ng/ml), SCF (2 ng/ml) y 
Flt3-L (1 ng/ml) (Preprotech). Adicionalmente para preservar a las células estromales a lo 
largo del co-cultivo y evitar la formación de vacuolas adipocíticas que dañaran el crecimiento 
de células B se utilizó DUP697 10-7 M. Tras 4 semanas de cultivo con cambio de medio 
semanal, se realizó la cosecha y evaluó el potencial de diferenciación de los progenitores. 
 
II. 11 Cosecha 
 Al finalizar el tiempo de co-cultivo, las células hematopoyéticas que permanecían en 
suspensión se cosecharon con los sobrenadantes y mezclaron con las adheridas a la 
monocapa estromal, que fueron despegadas de la placa de cultivo por adicionando de PBS-
EDTA. Después de filtrar la suspensión a través de una malla de 100 m para eliminar los 
posibles grumos, las células hematopoyéticas se contaron, resuspendieron, y se bloquearon 
FcR con gammaglobulinas inespecíficas. Los potenciales de diferenciación de cada 
progenitor se evaluaron a través de tinciones de linaje, utilizando los anticuerpos 
monoclonales: CD56-FITC para identificar células NK, CD19-PETxR para células B, CD11c-
APC y CD123-PE para células dendríticas. La adquisición de datos se realizó en los 
citómetros de flujo FACS Aria BD y Cyan Beckman Coulter. 
26 
 
 
II. 12 Tinción intracelular del TLR9 en progenitores linfoides tempranos 
 Después del enriquecimiento de las células CD34+, se realizó la tinción extracelular de 
progenitores con los anticuerpos monoclonales CD34-PECy7, CD45RA-PETxR, CD7-APC, 
CD10-APC y LIN-FITC (CD235a, CD56, CD19, CD3 y CD11b). Estas células se fijaron y 
permeabilizaron con BD Cytofix/Cytoperm y BD Cytofix/Cytoperm Plus de acuerdo a las 
especificaciones del fabricante, los FcR se bloquearon con IgG inespecíficas por 15 minutos. 
Posteriormente se dividieron las suspensiones celulares por partes iguales para realizar la 
tinción intracelular con anticuerpo anti-TLR9 conjugado a PE de rata anti humano 
(eBioscience) e IgG2a-PE de rata (eBioscience) como control de isotipo. La reacción Ag-Ab 
se incubó a temperatura ambiente por 30 minutos, después de lo cual las células fueron 
lavadas y resuspendidas en PBS 3% SFB para su adquisición en el citómetro de flujo. 
 
II. 13 Ensayo de incorporación de Bromodeoxiuridina (BrdU) 
 Posterior al enriquecimiento de células CD34+, las células fueron estimuladas durante 48 
horas con 5µg/mL de CpG DNA A y B en medio α-MEM, en presencia de citocinas que 
promovían la diferenciación linfoide, en placa de 96 pozos de fondo redondo. La tinción 
extracelular de los progenitores se realizó con los anticuerpos CD34-PECy7, CD45RA-
PETxR, CD7-APC y CD10-PE. Entonces, las células fueron fijadas y permeabilizadas con BD 
Cytofix/Cytoperm solución amortiguadora, incubadas en hielo durante 25 minutos y sujetas a 
una segunda permeabilización con BD Cytofix/Cytoperm Plus solución amortiguadora 
durante 10 minutos, y a una nueva fijación y permeabilización por cinco minutos. Se utilizó 
DNAsa para exponer los epitopos de BrdU, después de lo cual se bloquearon los FcR con 
IgG inespecíficas. La reacción con anticuerpo anti-BrdU conjugado a FITC se incubó a 
temperatura ambiente por 20 minutos, y tras un lavado se realizó la adquisición de datos por 
citometria de flujo. 
 
 
 
27 
 
II. 14 RT-PCR para los transcritos que codifican TLRs humanos 
 La extracción de RNA se realizó a partir de células CD34+ doblemente enriquecidas por 
columnas de selección positiva. Las células se lisaron con fenol (Trizol) y se congelaron a -
80°C para su proceso posterior. Una vez reunidas las fracciones a trabajar, se descongelaron 
y atemperaron por cinco minutos, después se adicionaron 200 µL de cloroformo (SIGMA), se 
homogenizaron y centrifugaron a 12000 rpm / 15 minutos. La fase acuosa se recolecto 
recolectada, utilizando glucógeno (5-10 µg, Invitrogen) como acarreador, se precipitaron los 
ácidos nucléicos con isopropanol (SIGMA). Posterior a la centrifugación (12000 rpm / 10 
min), se lavaron los ácidos nucléicos con Etanol (Merck) al 75%. La integridad del RNA se 
verificó por medio del corrimiento en gel de agarosa (Roche) al 1%. Se realizó la 
cuantificación por espectrofotometría (Nanodrop ND-1000 ) y normalizó la cantidad de RNA 
a 2000 µg para su conversión en cDNA con la enzima M-MLV y a las siguientes condiciones: 
25°C-10minutos, 37°C-50 minutos, 70°C-10 minutos, y finalmente 4°C para mantenimiento. 
La PCR se realizó utilizando Taq polimerasa, cebadores (primers) específicos para cada TLR 
(provistos por InvivoGen), y cDNA de líneas transfectadas con cada TLR como controles 
positivos (InvivoGen). La PCR fue corrida por 50 ciclos de 95°C/30 segundos, 60°C/30 
segundos y 72°C/1 minuto, seguidos de 5 minutos a 72°C y mantenimiento a 4°C. Como gen 
constitutivo se utilizó la β2-microglobulina, utilizando las siguientes condiciones de reacción: 
35 ciclos de 94°C/45 segundos, 56°C/un minutoy 72°C/30 segundos, seguidos de 7 minutos 
a 72°C y mantenimiento de productos a 4°C. Los productos de PCR se evidenciaron en geles 
de agarosa al 1% con bromuro de etidio (SIGMA) para tinción de ácidos nucléicos y Cyan 
Track (Invitrogen) como solución amortiguadora de carga. 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
III. RESULTADOS 
III. 1 Diferencias en el contenido celular de MON, SCU y SPM 
III. 1. a. Células troncales y progenitores hematopoyéticos 
 Debido principalmente a las limitantes éticas que tiene el trabajo con muestras biológicas 
de origen humano, especialmente médula ósea, y a la bajísima frecuencia de las células 
troncales y progenitoras, no existen estudios que reporten comparaciones precisas entre 
dichas subpoblaciones celulares provenientes de las distintas fuentes. Como primer 
acercamiento a su manejo y conocimiento, quisimos evaluar el contenido de todos los 
progenitores hematopoyéticos primitivos en MON, SCU y SPM. Para ello se realizaron 
tinciones con combinaciones de anticuerpos marcados con fluorocromos, que identificaron 
progenitores mieloides (Manz y cols 2002) o linfoides en muestras de 3 individuos distintos 
para cada una de las fuentes (Figura 4 A-C y Figura 5 A-C, respectivamente). La media de 
los porcentajes obtenidos para los diversos progenitores corresponde a la frecuencia del total 
de las CMN y se muestra comparando las tres fuentes celulares (Figuras 4D y 5D, Tabla 2). 
Se aprecia que, en general, la sangre de cordón umbilical contiene mayor proporción de 
todas las subpoblaciones de células primitivas, en comparación con las otras fuentes 
celulares. Por ejemplo, hay mayor frecuencia de HSC en la SCU que en MON (Figura 4D y 
Tabla 2), los progenitores multipotentes (MPP) también parecen estar más representados en 
la SCU que en la SPM, aunque no muestran diferencia aparente con la MON, al igual que los 
GMPs. Así mismo, las frecuencias de progenitores de megacariocitos y eritrocitos (MEP) en 
la SCU son significativamente mayores que en las otras fuentes estudiadas. Por otro lado, 
las tinciones para progenitores linfoides mostraron diferencias en algunas poblaciones 
celulares dependiendo de la fuente. Nuevamente, las frecuencias de los progenitores 
linfoides tempranos (ELP) y progenitores de células T y NK estuvieron significativamente 
incrementadas en la SCU en comparación con MON y SPM (Figura 5 A-D y Tabla 2). En 
contraste, no hubo diferencias apreciables entre las frecuencias de progenitores de B (CLPs) 
de las tres fuentes (Figura 5 A-D y Tabla 2). Finalmente, se remarca que en nuestro análisis 
la MON y SPM contuvieron números relativos similares de progenitores hematopoyéticos. 
29 
 
 
 
 
Figura 4. Diferencias relativas de progenitores mieloides provenientes de médula ósea normal (A), Sangre de 
Cordón Umbilical (B) y Sangre Periférica Movilizada (C). Los diagramas mostrados son representativos de tres muestras 
distintas. El promedio de las HSC (Lin
- 
CD34
+
 CD38
-
), MPP (Lin
- 
CD34
+
 CD38
+
), CMP (Lin
- 
CD34
+
 CD38
+ 
CD123
low 
CD45RA
-
), GMP (Lin
- 
CD34
+
 CD38
+ 
CD123
low 
CD45RA
+
), y MEP (Lin
- 
CD34
+
 CD38
+ 
CD123
- 
CD45RA
-
), con sus respectivas 
desviaciones estándar se muestran en (D). * denota p≤0.05. 
 
A 
B 
C 
D 
30 
 
 
 
 
Figura 5. El contenido de progenitores linfoides tempranos es significativamente mayor en sangre de cordón 
umbilical. (A) Médula Ósea Normal. (B) Sangre de Cordón Umbilical. (C) Sangre Periférica Movilizada. Los diagramas 
mostrados son representativos de tres muestras distintas. El promedio de las células Lin- CD34+, ELP (Lin
- 
CD34
+
 CD38
+ 
CD45RA
+ 
CD7
+ 
CD10
+
), Progenitores de células T y NK ELP (Lin
- 
CD34
+
 CD38
+ 
CD45RA
+ 
CD7
+ 
CD10
-
) y Progenitores de B 
(ELP (Lin
- 
CD34
+
 CD38
+ 
CD45RA
+ 
CD7
- 
CD10
+
, se muestran en (D). ** denota p≤0.005. 
 
A 
B 
C 
D 
31 
 
Tabla 2. Frecuencia de progenitores hematopoyéticos en CMN de MON, SCU y SPM. 
 HSC MPP CMP GMP MEP ELP CLP ETP 
MON 0.15 
±0.07 
1.95 
±0.85 
0.32 
±0.14 
0.92 
±0.5 
0.11 
±0.03 
0.02 
±0.01 
0.46 
±0.38 
0.3 
±0.18 
SCU 0.89 
±0.63 
2.87 
±1.01 
1.06 
±0.87 
1.19 
±0.45 
0.33 
±0.11 
0.09 
±0.02 
0.33 
±0.25 
0.53 
±0.22 
SPM 0.51 
±0.24 
1.56 
±0.39 
0.47 
±0.13 
0.56 
±0.16 
0.14 
±0.05 
0.02 
±0.01 
0.21 
±0.05 
0.21 
±0.07 
Se muestran los valores de Media y Desviación Estándar resultantes del análisis de tres muestras biológicas. 
 
 
III. 1. b. Células hematopoyéticas de linajes linfoide y mieloide. 
 Para conocer la frecuencia de células diferenciadas en las mismas fuentes -SCU, SPM y 
MON-, se realizaron tinciones específicas para cada uno de los linajes hematopoyéticos. Las 
células B fueron identificadas con base en la expresión de CD19, y aunque se observó un 
porcentaje ligeramente mayor en la SPM, las diferencias entre los 3 grupos no mostraron ser 
significativas (Figura 6 y Tabla 3). En contraste, los monocitos, caracterizados por la co-
expresión de CD13 y CD14 en su superficie, fueron marcadamente más frecuentes en la 
SPM que en SCU (p ≤ 0.05). El análisis de la médula ósea presentó una tendencia similar a 
la mostrada por su contraparte en SPM, aunque las diferencias entre las 2 fuentes no mostró 
significancia (Figura 7 y Tabla 3). 
 Para el resto de las poblaciones linfoides, esto es, células NK CD56+, células T CD3+ y 
células NKT CD56+CD3+, no se observaron diferencias sustanciales entre las distintas 
fuentes, a excepción de la significativamente baja frecuencia de células T en MON. (Figura 8 
y Tabla 3). En congruencia con su natural proporción, los linfocitos T CD4+ fueron los que 
contribuyeron mayormente a la descrita diferencia significativa (Figura 9 y Tabla 3). Por 
último, las células dendríticas convencionales (CD11c+ BDCA2-) y plasmacitoides (BDCA2+ 
CD11clo/-), provenientes tanto de linaje linfoide como mieloide, parecen conservarse en 
frecuencia relativamente constante (Figura 10 y Tabla 3). 
 
32 
 
 
Figura 6. La frecuencia de células B es similar en la MON, SCU y SPM. Análisis de células CD19+ por citometría de flujo. 
La tabulación de la Media de frecuencias ± SD se muestra en el panel derecho. 
 
 
 
 
Figura 7. La frecuencia de monocitos en SCU es menor. Los monocitos fueron identificados en las tres fuentes celulares 
en base a la expresión de CD13 y CD14 por citometría de flujo. La frecuencia comparativa es mostrada en gráficas de 
barras de la Media ± SD. * denota p≤0.05. 
 
 
 
 
 
 
 
 
33 
 
 
Figura 8. . Frecuencia comparativa de células NK, NKT y Linfocitos T. (A) Diagramas representativos de la 
identificación de células NK (CD56
+
) , NKT (CD3
+ 
CD56
+
) y Linfocitos T (CD3
+
) por citometría de flujo. (B) Frecuencias 
comparativas de células NK, NKT y linfocitos T entre fuentes celulares. Media ± SD, * denota p≤0.05. 
 
 
 
Figura 9. Frecuencia comparativa de las subpoblaciones de linfocitos T. Las subpoblaciones CD4
+
 y CD8
+ 
de linfocitos 
T se identificaron por citometría de flujo de las distintas fuentes celulares (A) y la Media de sus frecuencias tabulada (B). * 
denota p≤0.05. 
 
A 
B 
A 
B 
34 
 
 
Figura 10. Frecuencia de células dendríticas convencionales (CD11c
+
 BDCA2
-
) y plasmacitoides (BDCA2
+ 
CD11c
lo/-
) 
en las tres fuentes. (A) Diagramas representativos de la identificación por citometría de flujo. (B) Frecuencia comparativa. 
Media ± SD. * denota p≤0.05. 
 
 
Tabla 3. Frecuencia de células sanguíneas maduras en CMN de MON, SCU y SPM. 
 Monocitos NK 
Células 
B 
Células 
T CD4+ CD8+ NKT cDC pDC 
MON 7.33 
±7.8 
0.85 
±0.56 
12.27 
±12.98 
16.07 
±10.34 
5.94 
±2.55 
8.82 
±6.58 
1.55 
±0.99 
0.8 
±1.12 
0.31 
±0.23 
SCU 0.39 
±0.35 
0.5 
±0.22 
8.87 
±3.22 
59.22 
±4.67 
48.6 
±2.01 
6.1 
±2.1 
0.2 
±0.08 
1.3 
±1.3 
1.1 
±1.32 
SPM 3.66 
±1.29 
0.33 
±0.09 
16.01