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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA REVISIÓN DEL GEN TAS2R38 QUE CODIFICA PARA EL RECEPTOR DE PERCEPCIÓN AL SABOR AMARGO, Y SU IMPORTANCIA EN LA POBLACIÓN HUMANA TRABAJO MONOGRÁFICO DE ACTUALIZACIÓN QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA PRESENTA ALEJANDRA GONZÁLEZ GARZÓN CIUDAD DE MÉXICO 2017 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE: LUZ DEL CARMEN CASTELLANOS ROMÁN VOCAL: MIREYA RODRÍGUEZ PENAGOS SECRETARIO: ALFONSO RAFAEL SALGADO AGUAYO 1er. SUPLENTE: VERÓNICA GARROCHO VILLEGAS 2° SUPLENTE: ALBERTO ORTEGA VÁZQUEZ SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: LABORATORIO 307, BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL, EDIFICIO B 3° PISO, FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM. ASESOR DEL TEMA: M. EN C. LUZ DE CARMEN CASTELLANOS ROMÁN ____________________________________ SUSTENTANTE: ALEJANDRA GONZÁLEZ GARZÓN _______________________________ 2 Índice Índice ............................................................................................................................................................. 2 Índice de figuras ............................................................................................................................................. 4 Índice de cuadros .......................................................................................................................................... 4 Glosario ........................................................................................................................................................... 6 Resumen .......................................................................................................................................................... 8 Justificación ...................................................................................................................................................10 Objetivos ........................................................................................................................................................11 Sabores y su detección.................................................................................................................................12 Descubrimiento de la variable percepción de la PTC ...............................................................................16 Población que puede detectar el sabor del PTC/PROP .............................................................................18 Familia de genes TAS2R ................................................................................................................................20 Receptores T2R ...............................................................................................................................................21 Gen TAS2R38 ..................................................................................................................................................28 SNPs en el gen TAS2R38 .................................................................................................................................30 Haplotipos ......................................................................................................................................................31 Determinación fenotípica .............................................................................................................................34 Estudios límite de detección ............................................................................................................................ 34 Estudios con papel filtro .................................................................................................................................... 35 Estudios electrofisiológicos ............................................................................................................................... 36 Determinación genotípica ............................................................................................................................37 Amplificación de Genes ................................................................................................................................... 37 Toma de muestras .............................................................................................................................................. 40 Saliva / células de mucosa epitelial de la cavidad oral ......................................................................... 41 RFLPs ........................................................................................................................................................................ 42 Distribución de poblaciones: Hardy-Weinberg .......................................................................................... 44 Determinación del fenotipo con tiras de papel impregnadas con PTC y amplificación de un fragmento de ADN para la determinación genotípica del gen TAS2R38, realizado en el laboratorio de bioquímica experimental de la Facultad de Química de la UNAM ................................45 Determinación Fenotípica del gen TAS2R38 por medio de tiras impregnadas con PTC. ............. 45 Materiales ................................................................................................................................................... 45 3 Procedimiento ........................................................................................................................................... 45 Resultados .................................................................................................................................................. 45 Determinación Genotípica del gen TAS2R38 por medio de la amplificación de un fragmento de ADN por PCR .................................................................................................................................................. 47 Materiales ................................................................................................................................................... 47 Procedimiento ........................................................................................................................................... 48 Resultados .................................................................................................................................................. 48 Influencia del TAS2R38 en la salud ...............................................................................................................50 Cáncer ........................................................................................................................................................ 50 Regulación tiroidea ................................................................................................................................. 51 Influencia del gen TAS2R38 en las preferencias alimenticias y sus posibles implicaciones .......... 53 Obesidad ....................................................................................................................................................53 Adicción a cigarros ................................................................................................................................. 54 Alcoholismo ............................................................................................................................................... 54 El gen TAS2R38 y su posible implicación en otros sistemas .......................................................................56 Sistema digestivo ................................................................................................................................................. 56 Vías respiratorias .................................................................................................................................................. 56 Cerebro .................................................................................................................................................................. 57 Testículos ................................................................................................................................................................ 57 Piel ........................................................................................................................................................................... 57 Inmunidad ............................................................................................................................................................. 57 Placenta ................................................................................................................................................................ 58 Factores que modifican la percepción de sabores ...................................................................................59 Densidad de papilas gustativas ..................................................................................................................... 59 Envejecimiento .................................................................................................................................................... 59 Daño físico ............................................................................................................................................................ 59 Bibliografía .....................................................................................................................................................64 Anexo I. Sustancias que se unen a receptores de sabor amargo ............................................................70 Anexo II. Secuencias del gen TAS2R38 para los alelos dominante y recesivo. .......................................80 Secuencia del gen TAS2R38 del alelo dominante 129 ...................................................................................... 80 Secuencia del gen TAS2R3 del alelo recesivo 130 ............................................................................................ 81 4 Anexo III. Práctica realizada en el laboratorio de Bioquímica Experimental de la Facultad de Química de la UNAM.....................................................................................................................................82 Anexo IV. Información de apoyo .................................................................................................................87 Índice de figuras Figura 1. Tipos de papilas gustativas…………………………………………………………………………. 13 Figura 2. Conformación de una papila gustativa .............................................................................................. 13 Figura 3. Algunas sustancias sintetizadas por A. L. Fox para estudiar el sabor amargo de la PTC. ...... 16 Figura 4. Receptor acoplado a proteínas G del receptor de tiouracilo .......................................................... 21 Figura 5. Principales compuestos detectados por cada tipo de receptor.. ................................................... 23 Figura 6. Estructura general de los glucosinolatos. ......................................................................................... 24 Figura 7. Transducción de señales en la detección de sabores amargos.. ................................................. 25 Figura 8. Localización cromosómica del gen TAS2R38. ................................................................................. 28 Figura 9. Modelo de la región transmembranal del receptor TAS2R38 ........................................................ 29 Figura 10. Distribución de los haplotipos más comunes a nivel mundial.. ................................................... 32 Figura 11. Amplificación de un fragmento de ADN por PCR .. ..................................................................... 38 Figura 12. Genotipos obtenidos después de la restricción del gen con HaeIII. . ........................................ 49 Índice de cuadros Cuadro 1. Tipos de células TRC. ........................................................................................................................ 14 Cuadro 2. Algunos glucosinolatos encontrados en la familia Brassicaceae. .. ............................................ 24 Cuadro 3. Algunas sustancias usadas en la industria alimenticia para enmascarar sabores amargos.. 26 Cuadro 4. Agonistas inversos de T2Rs. ............................................................................................................. 27 Cuadro 5. SNPs del gen TAS2R38. ................................................................................................................... 30 Cuadro 6. RFLPs: Generación del sitio de corte para HaeIII..………………………………………...……43 5 Abreviaturas ADN: Ácido desoxirribonucléico dNTPs: Desoxinucleótidos C: Catadores CI: Catadores intermedios GPCR: Receptores acoplados a proteínas G DL50: Dosis letal 50 NC: No catadores pb: pares de bases PCR: Reacción en cadena de la polimerasa PROP: 6-n Propiltiouracilo PTC: Feniltiocarbamida RFLP: Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción SC: Súper catadores SNP: Polimorfismo de un solo nucleótido T2R: Receptores codificados por la familia de genes TAS2R TAS2R: Familia de genes en humanos que codifica para receptores que dan capacidad para percibir sabores amargos TRC: Células con receptores gustativos 6 Glosario Agonista: Molécula que activa al receptor Alelo: Variantes en la secuencia de un mismo gen que codifican para distintas versiones de un rasgo en particular; se localizan en una región específica en los cromosomas 1. Diplotipo: Combinación de dos haplotipos 2. Haplotipo: Conjunto de alelos presentes en un cromosoma en particular que generalmente se heredan juntos 3. Heterocigoto: Individuo con diferentes alelos en uno o más genes 2. Homocigoto dominante: Organismo que posee dos alelos dominantes. Homocigoto recesivo: Organismo que posee dos alelos recesivos. Homocigoto: Individuo que posee alelos idénticos en un locus 2. Homólogo: Genes con la misma función, que provienen de un ancestro común 2. Ligando: Molécula que se une al receptor. Loci: Plural de locus. Locus: Sitio de un gen en el cromosoma 2. Oligonucleótido: Fragmento corto de ADN de 15 a 30 nucleótidos 2. Ortólogo: Genes que tienen a un ancestro común en la evolución 2 Polimorfismo: Variación en la secuencia de un gen entre los individuos de una población. Pseudogen: Fragmento de ADN que tiene homología con genes funcionales, pero es inactivo por mutaciones que impiden su transcripción o expresión 2 Sustitución no sinónima: Sustitución de un nucleótido en el gen que da lugar a un aminoácido diferente. 7 Temperatura de fusión (Melting temperature): Temperatura donde el 50% de las moléculas de ADN están desnaturalizadas 2. 8 Resumen La preferencia por el consumode distintos alimentos está dada por diversos factores, tales como la disponibilidad de alimentos, aspectos culturales, económicos y ambientales, entre otros; sin embargo, los factores genéticos también son una parte importante de esta preferencia, ya que la elección de consumir ciertos alimentos es influenciada por la capacidad de percibir diferentes sabores a través de receptores expresados por algunos genes 4. Los mamíferos pueden diferenciar cinco tipos distintos de sabores: dulce, salado, ácido, amargo y umami. El sabor salado está relacionado con el equilibrio osmótico; los sabores dulce y umami se relacionan con alimentos energéticos, por lo que se asocian a sensaciones placenteras; mientras que los sabores amargo y ácido se asocian con sustancias potencialmente tóxicas, por lo que se relacionan a sensaciones desagradables 5; de esta manera, la detección de sabores está relacionada con la distinción de alimentos benéficos de los potencialmente dañinos, como un elemento evolutivo con implicaciones de sobrevivencia 6. La percepción de sabores amargos en humanos está determinada por receptores que son codificados por una familia de genes llamada TAS2R. Dentro de esta familia, uno de los genes más estudiados por sus características es el TAS2R38. Los receptores codificados por este gen detectan sustancias que contienen grupos isotiocianato, como la feniltiocarbamida, o PTC, por sus siglas en inglés 7. Los individuos con alelos dominantes de este gen pueden percibir la PTC como una sustancia de sabor amargo, mientras que las personas que sólo tienen alelos recesivos no perciben este sabor; esta dualidad en la percepción de esta sustancia fue descubierta en 1931 por Arthur L. Fox mientras sintetizaba feniltiocarbamida y uno de sus colegas se quejó del mal sabor de la sustancia, mientras que Fox no percibía ningún sabor. A partir de este hallazgo, comenzaron a realizarse estudios sobre la variabilidad en la percepción del sabor de esta sustancia. Actualmente, esta familia de genes, y en especial el gen TAS2R38 siguen siendo estudiados. En este gen, la identificación fenotípica se realiza con PTC o con propiltiouracilo y la identificación genotípica se realiza por medio de la amplificación de genes con la reacción en cadena de la polimerasa. 9 Las diferencias de este gen en los individuos tienen distintas connotaciones; diversos estudios relacionan a algunos genotipos de este gen con el desarrollo de enfermedades crónicas como obesidad y diabetes, así como a un consumo más frecuente de alcohol y cigarro; además, receptores del sabor amargo se han encontrado en otros sistemas, por lo que la expresión de los receptores de sabor amargo podría tener otras implicaciones en la salud. 10 Justificación El gen TAS2R38 ha sido uno de los primeros genes en ser estudiados a profundidad. A través del estudio de este gen, se han generado diversas hipótesis que lo relacionan al desarrollo de algunas enfermedades, a su presencia en otros tejidos y a posibles aplicaciones. La generación de conocimientos en torno a este gen puede facilitarnos el aprendizaje de diversos conceptos; como alelo, ligando, polimorfismo de un solo nucleótido, entre otros; que se enseñan en distintas materias de la Facultad de Química de la UNAM. En este trabajo se brinda una amplia perspectiva de información que ha sido presentada, para facilitar el acceso a ella y así relacionar los conocimientos adquiridos durante la licenciatura; de esta manera se presenta un material de apoyo para los alumnos de Bioquímica Experimental y para las personas interesadas en el tema. 11 Objetivos Objetivos generales El objetivo general del presente trabajo es recopilar y sintetizar la información que ha sido publicada sobre el gen TAS2R38. Objetivos particulares Realizar un material de apoyo para los alumnos de la materia Bioquímica Experimental, a través de la revisión y resumen de la información de diversas fuentes sobre la percepción de sabores, especialmente, los receptores de sabor amargo. Describir a la familia de receptores codificados por la familia de genes TAS2R, particularmente, el receptor codificado por el gen TAS2R38. Conocer los métodos para la identificación fenotípica y genotípica del gen TAS2R38. Identificar las posibles implicaciones que el gen TAS2R38, y en general la familia de genes TAS2R, pueden tener sobre la salud de las poblaciones. 12 Sabores y su detección Los humanos eligen sus alimentos con base en factores socioculturales, nutricionales, ambientales y fisiológicos; pero las propiedades sensoriales de un alimento también son importantes para su consumo, siendo el sabor una de las características más importantes para la elección de los alimentos; esta propiedad le permite al organismo diferenciar entre los alimentos benéficos de los dañinos 8. En la percepción del sabor se involucran, además, el olfato retronasal, que se refiere a la percepción de estímulos olfatorios provenientes de la cavidad oral, y la percepción de la temperatura y la textura de los alimentos, así como el dolor generado por alimentos picantes 9. Para que un sabor sea percibido, es necesario que las moléculas de sabor se pongan en contacto directo con los receptores que se encuentran en las papilas gustativas de la cavidad oral; esta información es procesada en el sistema nervioso central en donde se regula el reconocimiento de estímulos, las necesidades metabólicas y la inducción de reflejos fisiológicos 8,10. En comparación con la percepción de otros estímulos, por ejemplo olores, los receptores que detectan los sabores son sensores de corto alcance que son activados por concentraciones límite de algunas sustancias; la concentración mínima en la que son detectadas muchas sustancias amargas es del rango de los nanomoles 7. Los receptores de sabor se encuentran dentro de células presentes en el paladar blando, faringe, laringe, epiglotis y algunas papilas gustativas 2,5. Las papilas gustativas se clasifican en foliares, fungiformes, circunvaladas y filiformes. Las papilas gustativas filiformes no perciben sabores, su función es desgastar los alimentos en el proceso de masticación 11 (Figura 1). 13 Figura 1. Tipos de papilas gustativas. Modificado de la referencia 11. Las papilas gustativas son agregados de células que inician reflejos fisiológicos que preparan a los intestinos para la absorción, así como a otros órganos para ajustes metabólicos relacionados con la ingesta de alimentos 12. Las papilas gustativas están distribuidas a lo largo de la cavidad oral y todas tienen funciones similares. La parte apical de las papilas gustativas está en contacto directo con el ambiente externo de la cavidad oral por medio de poros 13 (Figura 2). Figura 2. Conformación de una papila gustativa. Modificado de la referencia 14 14 Las células presentes en las papilas gustativas de muchos mamíferos pueden detectar cinco tipos de sabor: dulce, salado, ácido, amargo y umami; en humanos, estas células son conocidas como células con receptores gustativos (TRC por sus siglas en inglés), se encuentran dentro de las papilas gustativas. El tiempo de vida de las células TRC es de aproximadamente 10 días 13. Estas células se clasifican en células de tipo I, capaces de detectar los sabores salados; células de tipo II capaces de detectar sabores amargos, dulces y umami; y células de tipo III, que detectan sabores ácidos 12 (Cuadro 1). Dentro de estas células se encuentran los receptores que se encargan de realizar la transducción de señales para la detección de sabores. La transducción de señales es un proceso en el que factores extracelulares promueven cambios en el estado y actividad de las células 15. Tipo de célulasTRC Sabor que detectan Tipo de receptor dentro de la célula. I Salado Canales iónicos II Amargo, dulce y umami GPCR III Ácido Canales iónicos Cuadro 1. Tipos de células TRC, tomado de la referencia 12. Los receptores que detectan sabores salados y ácidos tienen canales iónicos que los conforman, sus ligandos son Na+, K+, Ca2+ y H+. Cuando alguno de estos ligandos atraviesa el canal, se produce un cambio en el potencial de membrana, provocando una despolarización membranal que es transformada en impulsos nerviosos. En general, entre mayor sea la concentración de iones, mayor será la despolarización en la célula 16. Los receptores que detectan los sabores dulce, amargo y umami están formados por receptores acoplados a proteínas G, también conocidos como GPCR 5,11. Estos conforman la familia de receptores más grande en humanos 15; están formados por siete subunidades protéicas transmembranales cuya función es actuar como segundos mensajeros dentro de la célula. Las proteínas G actúan por medio de una cascada de señalización para transmitir 15 una señal dada por algún estímulo como la luz, los olores, los sabores, las hormonas y los neurotransmisores 17 y producir una reacción en la célula 16. Estructuralmente, las proteínas G se dividen en 3 dominios principales: extracelular, transmembranal e intracelular 18. Las proteínas G se dividen en cinco principales grupos: Glutamato, Rodopsina, Adhesión, Rizados (Frizzled)/Sabor2 (Taste2) y Secretina. El tipo de receptores acoplados a proteínas G que interaccionan con las moléculas de sabor amargos, son los Rizados 18. La detección de los sabores comienza cuando una sustancia se disuelve en la saliva, después cruza una capa de mucosidad hasta alcanzar las microvellosidades de las células TRC y de esta manera, activar a los respectivos receptores, los cuales pueden generar impulsos nerviosos que tienen como resultado sensaciones de sabor, olor o irritación 11. La respuesta placentera que se efectúa al detectar los sabores dulces, y el disgusto producido con la percepción de los sabores amargos están presentes desde el nacimiento. Se llegó a esta conclusión por medio de la observación de reflejos gustofaciales negativos en recién nacidos 8. La respuesta a sabores salados se desarrolla dentro del primer año de vida 11. El sabor salado está relacionado con el equilibrio osmótico; los sabores dulce y umami se vinculan con alimentos energéticos por lo que se identifican con sensaciones agradables; mientras que los sabores amargo y ácido se asocian con sustancias potencialmente tóxicas, por lo que se relacionan con sensaciones desagradables 5. El sabor dulce y el sabor amargo desencadenan reacciones innatas para discriminar entre lo atractivo o dañino de los alimentos 19, no obstante, el gusto por los sabores amargos puede adquirirse por experiencias cotidianas 8. En la actualidad, existen evidencias que indican cómo los individuos difieren de manera importante en la percepción de sabores por variaciones genéticas, lo que conduce diferencias en la expresión de los receptores 10 y por ende, una percepción distinta de algunos sabores en la población. 16 Descubrimiento de la variable percepción de la PTC En 1931, mientras Arthur L. Fox trabajaba con una sustancia llamada “feniltiocarbamida”, o PTC por sus siglas en inglés; descubrió accidentalmente que esta sustancia posee un fuerte sabor amargo para algunos individuos y para otros es una sustancia completamente insípida. Todo comenzó cuando un poco de PTC se esparció por el aire y su colega, C.R. Noller que trabajaba cerca, se quejó del sabor amargo de la sustancia; sin embargo, Fox no percibía ningún sabor. Fox y su colega, decidieron hacer pruebas sobre la percepción del sabor de la PTC con personas sin importar edad, sexo o etnia. Fox encontró que la mayoría de las personas caían en dos categorías: las que podían percibir el sabor amargo o catadores (fenotipo conocido también como “taster”) y las que no podían percibir este sabor o no catadores (o también denominado “nontaster” o “taste blind”) 20. De este estudio se reportó que el 60% de la población estudiada sí podía percibir el sabor amargo de la PTC, mientras que el 40% restante, no percibía el sabor amargo de esta sustancia 21. A partir de este hallazgo, Fox sintetizó distintas sustancias con estructuras similares a la PTC y encontró que las sustancias con sabor amargo tenían un grupo C=S, por lo que él dedujo que existía una relación entre este grupo y el sabor amargo (Figura 3). Años más tarde, Hopkins sugirió que el grupo N-C=S era crucial para la percepción del sabor amargo 22,23. Al grupo N-C=S también se le conoce como grupo isotiocianato o grupo tiourea 24. Figura 3. Algunas sustancias sintetizadas por A. L. Fox para estudiar el sabor amargo de la PTC. Modificado de la referencia 21. 17 De los experimentos sobre la percepción de la PTC y el sabor de sustancias relativas a la PTC de Fox, surgieron tres hipótesis principales: 1) La habilidad de detectar la presencia de la PTC era producida por un componente hereditario que seguía el principio Mendeliano 21. 2) Las personas que no percibían el sabor de la PTC tenían algún componente en la saliva que en conjunto con el PTC, producía un precipitado muy insoluble que no permitía degustar la sustancia 21. 3) Existían diversos factores que podían modificar la percepción de dicha sustancia 21. Para comprobar estas hipótesis, se realizaron distintos experimentos por otros científicos. En 1931, Snyder realizó ensayos con esta misma sustancia en 100 familias. En este estudio, Snyder encontró que la dualidad en la percepción de la PTC existía, con un 68.5% de catadores, y un 31.5% de no catadores en la población que él estudio. El autor dedujo que esta dualidad en la percepción de la sustancia era debido a una herencia Mendeliana recesiva, que no estaba ligada al sexo 25. En un estudio independiente, en ese mismo año, Blakeslee llegó a las mismas conclusiones que Snyder sobre la herencia Mendeliana recesiva en la habilidad de percibir la PTC 26; y, además, realizó experimentos con saliva de individuos catadores y no catadores. En estos ensayos, se midió el pH de la saliva de los voluntarios para determinar si la acidez o alcalinidad de esta era un factor que influía en la percepción de la PTC; y también, removió la saliva de la lengua de individuos no catadores, y colocó saliva de individuos catadores para observar si existía algún factor en la saliva que permitía percibir la PTC. En ambos ensayos con saliva no se encontró una relación con la habilidad de percibir PTC 26. De estos estudios, se llegó a la conclusión de que la hipótesis sobre la herencia Mendeliana, era acertada, aunque con algunas reservas, ya que existían individuos que no seguían el principio Mendeliano 22,26. La PTC no se encuentra en la naturaleza, pero posee una estructura similar a muchas sustancias encontradas en plantas distribuidas ampliamente en la Tierra; estas sustancias son funcionalmente diversas y muchas de ellas son tóxicas, por lo que deben ser evitadas. 18 Población que puede detectar el sabor del PTC/PROP Aproximadamente el 75% de la población mundial puede percibir sustancias con grupos isotiocianato como sustancias amargas, mientras que el otro 15% de la población lo percibe como una sustancia sin sabor 20. El estatus de catador o no catador también es relacionado por algunos autores con la sensibilidad a la percepción de dulzura, acidez y cremosidad de alimentos cotidianos; el picor de chiles y la amargura y astringencia del alcohol. La sensibilidad intensa a estas cualidades sensoriales de los alimentos están generalmente asociadas a individuos catadores 27; esta diferencia en la percepción de algunos alimentos y bebidas puede significar unadiferencia en los hábitos alimenticios, que podría desencadenarse en el desarrollo de algunas enfermedades crónicas 11. La identificación de la sensibilidad a la PTC se realiza mediante la observación fenotípica del receptor; por medio de la degustación de PTC 20 o de propiltiouracilo (también conocido como PROP), que resulta ser una sustancia más adecuada para estos experimentos, ya que se conoce de mejor manera la toxicidad de esta sustancia al ser utilizada en el tratamiento contra el hipertiroidismo 28. En ratas, la dosis letal 50 (DL50) de la PTC es de 3 mg/kg 29, mientras que la DL50 del PROP es de 1250 mg/kg 30. Por otro lado, aunque la sensibilidad a la PTC ha sido descrita como un rasgo hereditario bimodal; es decir, que algunos sujetos pueden detectar el sabor amargo de esta sustancia, mientras que otros no la perciben; la evidencia sugiere que la sensibilidad a este tipo de compuestos tiene una gran variabilidad; se ha demostrado que la cantidad de PTC que se puede detectar entre individuos puede variar hasta en cinco órdenes de magnitud 20; en este sentido, se clasifican a los catadores de acuerdo a su sensibilidad a la percepción del sabor amargo como catadores intermedios y súper catadores 20,23. Los individuos no catadores son aquellos que detectan PTC/PROP a concentraciones muy altas o que no pueden detectarlo; los catadores intermedios son los que pueden percibir PTC/PROP como moderadamente amargos y los individuos súper catadores pueden percibir de manera muy intensa la amargura de la PTC/PROP aún en concentraciones bajas 31,32. 19 Para facilitar la lectura de este trabajo, se abreviarán los diferentes estatus de percepción de PTC/PROP como: Catador= C; No catador= NC; Catador intermedio= CI y Súper catador= SC. Estudios recientes indican que la relación del genotipo con el fenotipo no es estricta en este gen 5, ya que existe una dominancia incompleta; así como otros diversos factores como la variación de la secuencia del gen, es decir, la percepción puede variar con respecto a la variación alélica que el individuo posee. En los humanos, la habilidad de detectar los sabores amargos está mediada por receptores que son codificados por una familia de genes llamada TAS2R, y que son expresados en algunas papilas gustativas 33. 20 Familia de genes TAS2R La determinación de la presencia de las sustancias amargas que se encuentran en algunos alimentos, es mediada por receptores codificados por la familia de genes TAS2R. En humanos, a este grupo de genes usualmente se le denomina hTAS2R 34. Esta familia de genes se encuentran en cuatro loci cromosomales; el gen TAS2R1 se localiza en el brazo corto del cromosoma 5; los genes TAS2R3, -4, -5, -16, -38, -39, -40, -41 y -60 se encuentran en dos loci del cromosoma 7 y los 15 genes restantes se encuentran en el brazo corto del cromosoma 13 35. Los genes que codifican receptores para la percepción de sabores amargos han sido identificados en algunos mamíferos, en pollos, ratas y en algunos peces; el número de genes varía en cada especie, se piensa que la percepción de sabores amargos en animales está directamente relacionado a su hábitat y a su dieta 36. La evolución de estos genes en mamíferos ha tenido extensas pérdidas y ganancias de genes de percepción de sabores amargos por la posible asociación de éstos con el cambio en el entorno y en los alimentos 36. En comparación con los chimpancés, la familia de genes TAS2R en humanos ha tenido mayor pérdida de genes funcionales, por lo que, en teoría, los humanos percibimos una menor cantidad de sustancias de sabor amargo que los chimpancés 37. En el caso de los chimpancés, también existe una percepción variable a la PTC por haplotipos distintos del gen equivalente al TAS2R38; este hallazgo sugiere que existió una selección convergente en el locus de este gen en humanos y chimpancés por factores aún desconocidos 38. 21 Receptores T2R A los receptores que son codificados por la familia de genes TAS2R se les conoce frecuentemente como T2Rs, o como taste receptor 2, TAS2R 7 y menos frecuente como TRBs 35. Los receptores codificados por esta familia de genes, se nombran de acuerdo al gen que los codifica, de esta forma, el receptor codificado por el gen TAS2R38 es llamado T2R38. El número de receptores de esta familia es distinto entre especies; se ha identificado que el genoma humano codifica 25 receptores funcionales; estos genes expresan receptores que se localizan en la superficie celular y pueden coexpresarse en una misma célula 7, así mismo, esta familia de genes posee 11 pseudogenes 39. Los pseudogenes se definen como una secuencia similar a los genes funcionales, pero que no se traducen en una proteína funcional por mutaciones, deleciones o codones de paro prematuros 39. Los genes de la familia TAS2R codifican para receptores heptahélicos acoplados a proteínas G 35 (Figura 4); algunos de estos receptores requieren de cofactores para desempeñar su función 7. Figura 4. Receptor acoplado a proteínas G del receptor de tiouracilo. Modificado de la referencia 40. 22 Las estructuras de estos receptores han sido predichas por modelos computacionales y por homología con otros receptores, ya que el estudio de las estructuras de estos receptores es complejo por la dificultad que representa el cristalizar las proteínas con cruces membranales para su análisis con rayos X 41. La región transmembranal se compone principalmente de aminoácidos hidrofóbicos acomodados en la membrana plasmática. La porción extracelular de las hélices transmembranales participan en la unión con el ligando, mientras que la porción intracelular está involucrada con la activación en la transducción de señales 42. Los receptores poseen dominios conservados, por lo que se cree que algunos receptores son activados por moléculas similares entre sí ya que según algunos resultados de estudios realizados, se sabe que las moléculas que activan receptores se unen a las hélices transmembranales de éste, siendo partes vitales para su activación 42; así mismo, se presenta la posibilidad de que exista sólo un sitio de unión para diversos compuestos 7; sin embargo, existen compuestos, como la PTC, que sólo activan a un receptor (T2R38); mientras que otras moléculas, por ejemplo, el difenidol, activa a 15 receptores distintos 43. Se ha encontrado que los receptores codificados por TAS2R31, -43 y -46 poseen un amplio espectro en la detección de sustancias amargas; se ha demostrado que su actividad en conjunto puede ser suficiente para percibir la mitad de todos los compuestos amargos que pueden ser detectados por el ser humano 7. Por otro lado, se sabe que los receptores codificados por los genes TAS2R3, -5, -8, -9, -13, -49 y -50 son activados por uno a tres compuestos 7; mientras que receptores codificados por TAS2R1, -4, -7, -30, -31 y -40 tienen un rango mayor de detección de sustancias (Ver ANEXO I). En la Figura 5 se enlistan los principales compuestos detectados por cada tipo de receptor. 23 Figura 5. Principales compuestos detectados por cada tipo de receptor. Modificado de referencia 35. Muchas sustancias de sabor amargo se encuentran distribuidas ampliamente en la naturaleza, algunas de estas son funcionan como un mecanismo de defensa de plantas contra depredadores, por lo que estas sustancias son potencialmente tóxicas; un ejemplo de estas sustancias so los glucosinolatos, que se encuentran en muchos vegetales de la familia Brassicaceae, como la col de Bruselas o el brócoli (Figura 6). Algunos glucosinolatos son precursores de sustancias con grupos isotiocianato por su hidrólisis con una enzima llamada mirosinasa, que es activada cuando existe daño en el tejido de la planta 44. En el cuadro 2 se muestran algunosglucosinolatos encontrados en vegetales de la familia Brassicaceae. 24 Figura 6. Estructura general de los glucosinolatos. Algunos Glucosinolatos encontrados en la familia Brassicaceae Nombres comunes Nombres químicos de los grupos R- Sinigrina 2-Propenil Gluconapina 3-Butenil Glucobrassicanapina 4-Pentenil Progoitrina 2(R)-2-Hidroxi-3-butenil Epiprogoitrina 2(S)-2-hidroxi-3-butenil Gluconapoleiferina 2-Hidroxi-4-pentenil Glucoibervirina 3-Metiltiopropil Glucoerucina 4-Metiltiobutil Dehidroerucina 4-Metiltio-3-butenil Glucoiberina 3-Metilsulfinilpropil Glucorafanina 4-Metilsulfinilbutil Glucorafenina 4-Metilsulfinil-3-butenil Glucoerisolina 4-Mercaptobutil Cuadro 2. Algunos glucosinolatos encontrados en la familia Brassicaceae. Modificado de la referencia44. En los receptores codificados por los genes de la familia TAS2R, la detección de sabores amargos comienza cuando un compuesto de sabor amargo, o ligando, se une al receptor para así comenzar la transducción de señales 45. En este proceso, se produce un cambio conformacional en el receptor, activando a una proteína reguladora conocida como Gα- gustducina 35, que libera las subunidades Gβ3 y Gγ13. Estas subunidades activan la fosfolipasa Cβ2 (O PLCβ2), que hidroliza el fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2) a inositol 25 trifosfato (IP3) y diacil glicerol 45. El IP3 estimula la liberación de Ca2+ intracelular, mismo que activa los canales TRPM5, que llevan a la despolarización de la membrana celular para así activar algunos canales mediante su cambio de potencial y finalmente, liberar ATP y excitar los nervios gustatorios aferentes 35,46 (Figura 7). Figura 7. Transducción de señales en la detección de sabores amargos. Modificado de referencia 12. En esta transducción de señales también se ven involucradas algunas otras actividades en la célula, como comunicación y regulación celular 47. Algunos de los genes que conforman la familia TAS2R participan en otras funciones del organismo; estudios realizados muestran la posibilidad de que miembros de la familia TAS2R participen en la expresión de proteínas auxiliares y de transporte, mismas que han mostrado una mejora en la expresión de receptores de olores, así como el plegamiento y el transporte vesicular desde compartimentos intracelulares hacia la superficie celular 35. Los receptores de la familia de genes TAS2R se encuentran también en otros tejidos regulando otras funciones además de la percepción de sabores amargos; esto fue descubierto por la presencia de α-gustducinas en órganos extraorales como los intestinos, el páncreas, el cerebro, el corazón, entre otros 43,48. En tejidos no gustatorios se ha propuesto 26 que estos receptores funcionan por medio de la cascada de señalización de las subunidades βγ 42. Unos ejemplos de las posibles funciones de receptores T2R en otros órganos son, en el intestino; estos receptores censan el contenido luminal y se relaciona también con la proximidad de la producción de ghrelina y serotonina producida por células enteroendrócrinas; por lo que se infiere su función como reguladora en cuanto a la ingestión de compuestos amargos y la expulsión de sustancias tóxicas del intestino 43; en los bronquios, la expresión de estos genes se relaciona con una respuesta de broncodilatación al unirse el receptor con algún agonista 49. Más adelante se hablará sobre la función de estos receptores en otros órganos con más detalle. Por otro lado, se han encontrado algunas sustancias que actúan como agonistas inversos o como antagonistas de los receptores T2R. Un agonista inverso es un compuesto que, al unirse con el receptor, reduce la actividad de éste, mientras que un antagonista es un compuesto que se une al receptor, pero que no induce una respuesta 42. Estas sustancias son utilizadas para cubrir o enmascaran el sabor amargo de alimentos y bebidas (Cuadro 3). Cuadro 3. Algunas sustancias usadas en la industria alimenticia para enmascarar sabores amargos. Modificado de la referencia 42. Además, han sido identificados 13 compuestos antagonistas para algunos T2Rs (Cuadro 4). El uso de estas sustancias podría tener tres ventajas principales: la primera, mejorar el sabor Algunas sustancias usadas en industria alimenticia para enmascarar sabores amargos Gluconato de sodio Glutamato monosódico Aspartame Acetato de sodio Esterubina Eriodictiol Ácido 2,4-dihidrobenzóico Neodiosmina Taurina Enterodiol 27 de alimentos y bebidas; la segunda, incrementar la aceptación de medicamentos, especialmente en formulaciones para niños; y la tercera, reducir o prevenir los efectos de algunos fármacos en tejidos extraorales. La forma en la que estas sustancias bloquean la actividad de los T2R no ha sido explicada aún, pero se supone que actúan por un mecanismo de inhibición competitiva o por inhibición alostérica 42. Sustancias que inhiben o disminuyen la actividad de T2Rs T2R sobre el que actúan GIV3727 31 3HDC 4, 7, 3820, 40, 43, 46 3HP 3043, 40, 43, 46 Probenecid 16, 38, 43 Sakuranetina 31 6-metoxisakuranetina 31 Jaceosidina 31 4-fluoro-6-metoxiflavonona 14, 39 6,3-dimetoxiflavanona 14, 39 6-metoxiflavanona 4 GABA 4 BCML 4 ABA 4 Cuadro 4. Agonistas inversos de T2Rs, modificado de la referencia 40. 28 Gen TAS2R38 Dentro de la familia de genes TAS2R, uno de los mejor caracterizados es el TAS2R38, codifica para un receptor de función variable entre individuos sobre la detección de isotiocianato; por ejemplo, la PTC o el PROP 2,4. Estas sustancias son detectadas por un sabor amargo intenso por las personas que tienen al menos un alelo dominante del gen TAS2R38. El gen TAS2R38 se encuentra localizado en el cromosoma 7, en el brazo largo en la posición 34 (7q34) (Figura 8) 50. Este gen también es conocido como gen PTC, T2R38 o T2R61 50. Está formado por aproximadamente 1100 pb, que codifican una proteína de 333 aminoácidos 51. Al igual que los otros receptores codifcados por la familia de genes TAS2R, el receptor codificado por el gen TAS2R38 está acoplado a proteínas G, y se conforma por siete subunidades transmembranales 41. En la lengua, el receptor codificado por el gen TAS2R38 se expresa en las papilas gustativas fungiformes y en las circunvaladas 52. El receptor funcional codificado por este gen posee un sitio de unión para el agonista entre las hélices transmembranales 3 y 6 (Figura 9); de este sitio de unión puede inferirse la interacción de la PTC con los aminoácidos Triptófano 99, Asparagina 103 y Metionina 100 de la hélice transmembranal 3, y Serina 259 de la hélice transmembranal 6 41, en donde la Asparagina 103 interactúa directamente con el ligando, mientras que los otros aminoácidos se ubican cerca del sitio de unión, contribuyendo a la unión al definir la forma óptima del receptor 41. Figura 8. Localización cromosómica del gen TAS2R38. Referencia 50 29 Figura 9. Modelo de la región transmembranal del receptor TAS2R38, hélice 1: limón, hélice 2: rojo; hélice 3: verde; hélice 4: rosa, hélice 5: azul, hélice 6: morado, hélice 7: gris; la posición promedio de PTC se encuentra en naranja. Tomado de referencia 41. 30 SNPs en el gen TAS2R38 En el gen TAS2R38 existen variaciones alélicas que afectan la percepción de algunos compuestos amargos; las variaciones que este gen posee son 3 polimorfismos de un solo nucleótido 53 (SNP por sus siglas en inglés), sustituciones no sinónimas que producen distinta afinidad del receptor hacia su ligando, traduciéndose en diferentes niveles de percepción de sustancias con grupos isotiocianato entre individuos 54. Estas sustituciones ocurren en las posiciones de los aminoácidos 49, en donde puede haber alanina o prolina, nombrándosecomo A49P, Ala49Pro, G145C y rs713598 55; 262 en donde puede haber alanina o valina, también encontrada como A262V, Ala262Val, T785C y rs1726866 55; y 296 en donde hay valina o isoleucina, también encontrada como V296I, Val296Ile, A886G y rs10246939 55 (Cuadro 5). Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) del gen TAS2R38 Posición y nucleótido variables Nombre de acuerdo al cambio de nucleótido Posición y aminoácido variables Nombre basado en el cambio de aminoácido Nombre basado en la clasificación de NCBI 145 Guanina o Citosina G145C 49 Alanina o Prolina A49P Ala49Pro rs713598 785 Timina o Citosina T785C 262 Alanina o Valina A262V Ala262Val rs1726866 886 Adenina o Guanina A886G 296 Valina o Isoleucina V296I Val296Ile rs10246939 Cuadro 5. SNPs del gen TAS2R38. Modificado de la Referencia 55. 31 Haplotipos La variación de los aminoácidos 49, 262 y 296, da como resultado haplotipos con diferente distribución a nivel mundial 5 (Figura 10). Un haplotipo es un conjunto de alelos presentes en un cromosoma en particular que generalmente se heredan juntos. Aunque existe la posibilidad de ocho combinaciones en los aminoácidos, sólo seis con efecto en la sensibilidad de sabores han sido observados: el haplotipo sensible o C: prolina- alanina-valina (PAV) y el haplotipo insensible o NC: alanina-valina-isoleucina (AVI) son los más comunes 5. Las otras variantes son menos comunes; alanina-alanina-isoleucina (AAI), alanina-alanina-valina (AAV), prolina-alanina-isoleucina (PAI) y prolina-valina-isoleucina (PVI). Las combinaciones alanina-valina-valina (AVV) y prolina-valina-valina (PVV) son aún menos comunes 56. Al ser PAV y AVI los haplotipos más comunes mundialmente (aproximadamente el 51% y 43 % respectivamente 28), se les toma como referencia para denominar a un individuo como “catador” u homocigoto dominante (diplotipo PAV/PAV), heterocigoto (diplotipo PAV/AVI) y “no catador” u homocigoto recesivo (diplotipo AVI/AVI). Los haplotipos AAI y PVI se observan principalmente en población descendiente de africanos 23,57, siendo esta población la más polimórfica a nivel mundial 28; el haplotipo AAV es más común en población descendiente de europeos 57. La prevalencia de los individuos NC es de aproximadamente 3% en el occidente de África, del 6-23% en población china, aproximadamente 40% en India y 30% en población americana 23. 32 Figura 10. Distribución de los haplotipos más comunes a nivel mundial, de referencia 28 . La aparición del haplotipo AAI y PVI en África podría ser el resultado de una presión selectiva que favoreció la aparición de estas sustituciones. La incidencia de estos haplotipos podría tener ventajas en otros procesos fisiológicos 58. Existe una incógnita sobre la predominancia de los haplotipos PAV y AVI; si la percepción de sabores amargos nos protege de la ingestión de sustancias tóxicas, ¿por qué el haplotipo que genera un receptor “no funcional” es tan frecuente?; hipótesis que se tienen al respecto indican la posibilidad de que este haplotipo codifica para un receptor funcional que identifica alguna otra sustancia amarga 28; o alguna sustancia encontrada en flora específica de África antes de la expansión del humano por todo el mundo 59. También se ha sugerido que los microorganismos patógenos son el principal objetivo en la selección natural de algunos haplotipos, ya que los receptores codificados por el gen TAS2R38 se expresan en diversos sistemas, incluyendo el respiratorio y el entérico hecho que ha sido ligado a la habilidad de algunas células a matar bacterias 28. 33 Sensibilidad al ligando con relación al SNP En algunos estudios se ha comparado la sensibilidad a PROP o PTC en individuos con diferentes haplotipos, con el propósito de encontrar la relación de los distintos SNPs del gen TAS2R38 con la sensibilidad a sus ligandos 53,57. De acuerdo a los resultados de estos estudios, en la posición 49 reside el cambio más significativo, ya que en A49P los individuos con prolina son sensibles a sustancias con isotiocianatos y los que poseen alanina son no sensibles 53; la alanina en la posición del SNP V262A incrementa la sensibilidad a PROP y la valina en lugar de la isoleucina en el último SNP (I296V) fue asociada a un incremento en la sensibilidad a PROP 57. Estos resultados indican una variabilidad en la sensibilidad de la percepción de ligandos para este receptor dependiendo del haplotipo que el individuo posee; pero, por otro lado, aunque en el SNP A49P se encuentra el cambio más importante para la percepción de los ligandos del receptor en discusión, la presencia de alanina no es imperativo de insensibilidad a los ligandos; ya que la combinación de los distintos aminoácidos producidos por los 3 SNPs en este gen resultan en sensibilidades variantes en los haplotipos menos comunes; por ejemplo, en estudios recientes realizados por Boxer y su equipo de trabajo, se compararon los haplotipos AAI/AVI contra AVI/AVI; de este estudio se encontró que el haplotipo AAI confiere la habilidad de percibir PROP 56. Los haplotipos AAV, AAI y PAI han sido relacionados con distintos niveles de sensibilidad al PROP: AAV < AAI < PAI; lo que explica, en parte, los distintos niveles de percepción a los ligandos del receptor TAS2R38 56. Por esta razón, aunque la percepción del sabor amargo de la PTC o del PROP puede ser indicativo de alelos dominantes en el individuo, su relación en cuanto a la intensidad o la cantidad de sustancia percibida y el genotipo no es estricta 60. 34 Determinación fenotípica Existen algunos protocolos que han sido establecidos para la identificación fenotípica mediante el uso de tiras con PROP o PTC, que son las sustancias utilizadas en la determinación del estatus de C o NC. Los estudios que se realizan comúnmente son límites de detección y pruebas con papel filtro 61,62. Estudios límite de detección En este tipo de estudios se utilizan soluciones de PTC o PROP a distintas concentraciones para detectar el límite en el que estas sustancias son percibidas. Usualmente se utilizan los métodos de tres soluciones o el método de una solución. En el método de tres soluciones, se utilizan distintas concentraciones de PTC o PROP y de NaCl. El método original utilizaba cinco concentraciones distintas de las sustancias; en tiempos más recientes, se utilizan tres soluciones de concentraciones 0.032, 0.32 y 3.2 mM de PROP y 0.01, 0.1 y 1 mM de NaCl 61,62. Los sujetos que realizan esta evaluación prueban la solución de PROP y la de NaCl de manera intercalada y de menor a mayor concentración. Los individuos que perciben de mayor manera el NaCl son clasificados como NC, los individuos que perciben el PROP con mayor intensidad son clasificados como SC y los individuos que perciben de manera similar ambas sustancias son clasificados como CI. En la clasificación de SC y CI existe discrepancia en los resultados, por lo que suele ser utilizada otra escala llamada “proporción PROP” (o PROP ratio en inglés); en este método se utilizan 5 concentraciones de PROP y de NaCl y a la intensidad percibida se les da un valor numérico de acuerdo a experiencias cotidianas 63. Para calcular si el individuo es CI o SC, se dividen (PROP4/NaCl4 + PROP5/NaCl5) /2, en donde PROP4 y PROP5 representan las intensidades percibidas de la cuarta y la quinta concentraciones más altas de PROP, y NaCl4 y NaCl5 las intensidades percibidas de la cuarta y quinta concentraciones más altas de NaCl. Un valor de Proporción de PROP de 1.2 o superior indica que el individuo es SC 61. La clasificación por este método puede ser subjetiva, ya que los resultados dependen de la percepción del individuo 62. En el método de una solución, los sujetos evalúan una concentración de 0.32 mMde PROP y 0.1 mM de NaCl. Se utiliza una escala numérica obtenida de resultados basados en experiencias cotidianas para comparar entre individuos y obtener el estatus de cada uno. 35 Las soluciones a distintas concentraciones son preparadas disolviendo el PROP o NaCl en agua purificada con ayuda de una parrilla con agitación magnética, y almacenadas por un día a 4°C. Antes de la evaluación, las sustancias se llevan a temperatura ambiente. 62 Estudios con papel filtro Los estudios realizados con papel filtro impregnado con PTC o con PROP han sido ampliamente utilizados para la determinación fenotípica de los individuos, ya que es un método que permite la clasificación de los individuos de manera rápida; sin embargo, este método es poco específico, ya que la concentración del reactivo es variable en el papel 62, además, la mayoría de las veces en este método no se utiliza ninguna referencia 61. Para preparar los papeles filtro impregnados con PROP, se prepara primero una solución 50 mM de esta sustancia en agua purificada hirviendo con ayuda de una parrilla magnética agitadora. Los papeles filtro deben ser sumergidos en esta solución por 30 segundos para después eliminar el exceso de solución, secándolos a 121 °C por una hora. Para comprobar la concentración de PROP en los discos, se hace una solución con el PROP de los discos de papel y se mide su absorbancia con espectrofotómetros 62. A los voluntarios que realizan estas pruebas se les pide no consumir alimentos ni bebidas (excepto agua), en por lo menos 30 minutos antes del experimento; también es necesario que los voluntarios no consuman medicamentos ni tabaco en por lo menos 48 horas antes del experimento 64,62. Para estos estudios es necesario asegurarse de tener una concentración homogénea tanto en las soluciones como en el papel impregnado. Se debe tener un adecuado manejo en el almacenamiento de las soluciones usadas en los experimentos, así como del PROP ya que esta sustancia sufre de fotodescomposición 64. Una manera de evitar los pasos de preparación constante de las soluciones y su almacenamiento, es la creación de tiras con PROP comestibles, hechas con hidroxipropilmetilcelulosa 64; con este cambio en el método se piensa que existe un mejor manejo y control de los reactivos. 36 Con el objeto de obtener resultados confiables, se buscó un estándar que pudiera ser utilizado sin que afectara la percepción del sabor amargo, por lo que en muchos de estos estudios sobre el estatus de los individuos, se utilizaron como referencia soluciones de NaCl, ya que se pensaba que la sensibilidad al sabor del NaCl no variaba con el estatus del individuo 61; sin embargo, estudios realizados por Prutkin sobre la percepción del sabor salado del NaCl y la percepción de PROP, indican que la intensidad del sabor salado del NaCl incrementa en función de la concentración de PROP en algunos casos y en otros, la intensidad del sabor del PROP disminuye 63. No obstante, el uso de NaCl como estándar sigue siendo usado en algunos experimentos sobre el estatus de los individuos. Estudios electrofisiológicos La respuesta al estímulo de la PTC/PROP es subjetiva, ya que las experiencias cotidianas de cada individuo pueden influir en la clasificación de la intensidad del sabor. En un estudio realizado con registros electrofisiológicos en la lengua de individuos voluntarios, se determinó que existen diferencias en la despolarización de las células que contienen receptores de sabor amargo por medio de una despolarización distinta en cada clasificación 31. El estudio electrofisiológico en la lengua se realiza colocando un electrodo en la superficie dorsal y otro en la superficie ventral de la lengua del individuo voluntario, permitiendo las variaciones de potencial en respuesta a estímulos con PROP realizados con discos de papel impregnados de esta sustancia. La respuesta generada se caracteriza por una rápida despolarización inicial, seguida de una disminución lenta que varía en función del fenotipo del individuo 31. Este estudio podría determinar el fenotipo de los individuos sin involucrar factores personales de cada voluntario. 37 Determinación genotípica Para la amplificación de un fragmento específico de ADN por PCR, es necesaria la extracción de células de las cuales sea posible extraer ADN. Para la amplificación de fragmentos del gen TAS2R38 se han seguido varios procedimientos que involucran la extracción de ADN, y su posterior amplificación mediante la Reacción en cadena de la polimerasa. Amplificación de Genes La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR por sus siglas en inglés, es una técnica en la que un fragmento específico de ADN es amplificado exponencialmente mediante la acción de una enzima polimerasa termoestable y cambios de temperatura que permiten la desnaturalización de la cadena de ADN, la alineación de los cebadores, la polimerización y la renaturalización del ADN. La concentración del fragmento de ADN inicial es muy baja, pero aumenta conforme la reacción procede, ya que las nuevas cadenas de ADN sintetizadas se convierten en nuevos moldes. El proceso consiste en tres pasos: desnaturalización, alineación y extensión (Figura 11); el procedimiento se realiza en ciclos 65. En el primer paso, la reacción es expuesta a temperaturas de entre 90 a 94 °C. La alta temperatura separa las dos hebras de ADN, al romper los puentes de hidrógeno que las mantiene unidas. A este proceso se le conoce como desnaturalización. Después la temperatura disminuye de 50 a 60 °C para permitir el alineamiento de los cebadores con el fragmento de ADN complementario; por último, la temperatura incrementa a 70°C para la elongación de cada cebador, en donde la polimerasa incorpora desoxirribonucleótidos (dNTPs) a la hebra molde 65; esta reacción ocurre en el sentido 5’ → 3’ 3. Estos pasos son repetidos alrededor de 30 veces 3. Al fragmento de ADN amplificado, también se le conoce como amplicón. 38 Figura 11. Amplificación de un fragmento de ADN por PCR 3. Para la amplificación de un fragmento de ADN específico, se necesitan dos cebadores, los cuales se alinean a cada extremo del fragmento de ADN que se está amplificando. Los cebadores son secuencias de nucleótidos sintetizados a partir de la secuencia conocida del fragmento a amplificar; los cebadores usualmente constan de 18 a 25 nucleótidos 66. En el diseño del cebador, es necesario tomar en cuenta algunas consideraciones, como el contenido de GC que debe ser del 40 al 60% con una distribución uniforme; su temperatura de fusión no debe variar más de 5°C y la temperatura de fusión del ADN amplificado no debe diferir de la temperatura de fusión de los cebadores más de 10°C; y por último, deben evitarse repeticiones de más de 3 pb 66. El diseño de cebadores actualmente se realiza por medio de programas computacionales; un ejemplo de éstos es el Primer designing tool, desarrollado por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI por sus siglas en 39 inglés). Este programa permite el diseño de cebadores con características específicas, como la temperatura de fusión, entre otras 67. En muchas ocasiones, al analizar por electroforesis el resultado de la PCR, se presenta una banda de bajo peso molecular inesperada que resulta de la dimerización de los cebadores por poseer secuencias complementarias. La polimerasa más utilizada en los procesos de amplificación se aísla de Thermus aquaticus, una bacteria termófila, la cual es una característica importante en el caso de una enzima que es expuesta a ciclos de temperaturas altas, que una enzima de un organismo mesófilo no toleraría 3. La enzima obtenida de Thermus aquaticus es llamada Taq polimerasa. La reacción en cadena de la polimerasa es un método muy utilizado para la amplificación deuna secuencia específica de ADN; sin embargo, el fragmento amplificado debe ser menor a 5000 pb para ser replicado correctamente al usar una enzima como Taq polimerasa, sin embargo, existen enzimas de alta procesividad que pueden amplificar fragmentos de hasta 19000 pb con polimerasas como PfuUltra, y de 23000 pb con enzimas como Herculasa II 68. Existen distintas variantes PCR, algunas de ellas son PCR de punto final, que es la reacción descrita anteriormente; PCR de tiempo real o qPCR, en donde se utiliza un termociclador con detector de fluorescencia, que mide la fluorescencia de tintes fluorescentes sensibles a la cantidad de amplicón producido, de esta forma se puede saber la concentración de ADN en tiempo real; la PCR con cebador oligonucleótido degenerado o PCR-DOP en donde se utilizan secuencias de oligonucleótidos que se sintetizan en paralelo para que tengan la misma base en ciertas posiciones y difieren en otras para amplificar una variedad mayor de ADN, la PCR con transcriptasa reversa o RT-PCR, en la cual, se sintetiza ADN complementario de una sola cadena, mediante ARN como molde mediante el uso de transcriptasas reversas; entre otras 66. La PCR que es utilizada en el Laboratorio de Bioquímica Experimental de la Facultad de Química de la UNAM para amplificar un fragmento de la secuencia del gen TAS2R38 es la PCR de punto final. Este método fue creado en 1983 por Kary Mullis en su búsqueda de un método que le simplificara la secuenciación de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP por sus siglas en inglés) 65. 40 Toma de muestras El muestreo de fluidos biológicos tiene varios propósitos, por ejemplo, para diagnóstico clínico o para investigación. En años recientes, los fluidos biológicos han sido utilizados en distintas áreas de la genética; del manejo de estas muestras depende la calidad de los resultados. Las muestras biológicas son complejas ya que contienen una gran cantidad de componentes, como células, iones, proteínas, etc. El tipo de analito que va a analizarse marca las pautas para la elección del fluido con el que se requiere trabajar. Además del tipo de analito que requiere extraerse de la muestra, también se necesitan evaluar los tiempos de muestreo y las posibles limitaciones que puedan interferir en el estudio a realizar. En el caso de la amplificación de genes, es necesaria la extracción de un fluido biológico que contenga células nucleadas. Estas células pueden ser tomadas de diversas fuentes, como son: la sangre, los folículos capilares y las células bucales entre otras. Sangre La sangre es el fluido biológico más usado en diagnósticos clínicos. Se compone de agua, proteínas, glucosa, iones, hormonas, dióxido de carbono, plaquetas, lípidos y células, incluyendo glóbulos rojos y blancos; esto hace que la sangre sea una de las mezclas más complejas que pueden ser analizadas. Su recolección se realiza por medio de la punción en venas, regularmente del brazo. Debe ser realizada por personal capacitado y es necesaria la correcta disposición de los residuos generados durante la extracción. La extracción de sangre conlleva algunos riesgos por el uso de aditamentos invasivos, como hematomas en el sitio de punción, síncope, sangrado o alergia a los suministros utilizados en la toma de la muestra, como al yoduro utilizado en la asepsia, o el látex utilizado en las ligaduras. Como en este tipo de extracción existe un riesgo, es necesario un consentimiento informado en donde se le explique al individuo donador los posibles riesgos de la extracción de sangre 69. Este fluido necesita un pretratamiento para la separación de las células nucleadas para extraer el ADN de estas células. 41 Saliva / células de mucosa epitelial de la cavidad oral La saliva es una mezcla compleja que se compone principalmente de agua, electrolitos, minerales, hormonas, enzimas, inmunoglobulinas, citosinas, péptidos, además de células que se desprenden de la mucosa epitelial. Las muestras se obtienen por medio de la recolección en viales en el caso de la saliva, o en el caso de la recolección de las muestras de células de mucosa epitelial, se utilizan enjuagues vigorosos de algunos segundos de duración con solución salina, esta muestra después es recolectada y procesada. Otro método comúnmente utilizado para la recolección de células epiteliales de mucosa oral, es por medio de hisopos que son frotados en la mucosa epitelial de la cavidad oral, para después procesar la muestra y extraer el ADN de las células remanentes del hisopo y amplificar el gen por PCR. La recolección de esta muestra es no invasiva, rápida y sin dolor 70 . Otro de los puntos importantes que debe mencionarse, es el procesamiento y almacenamiento de las muestras. Se debe extraer el ADN de las muestras poco tiempo después de recolectarlas, ya que el ADN es degradado, disminuyendo su calidad y cantidad. En cuanto al almacenamiento; el ADN aislado de las células debe permanecer congelado a - 20°C para mantener su calidad 70; no existen datos sobre el tiempo máximo que las muestras de ADN congelado permanece viable para su amplificación, pero existe evidencia de que las muestras de ADN almacenadas a -80°C pueden ser estables por décadas 69. En los estudios relacionados con el gen TAS2R38, regularmente se utilizan muestras de células epiteliales de mucosa bucal y de saliva; estas muestras facilitan el trato con los voluntarios y hace de éste un estudio rápido. 42 RFLPs Una forma sencilla de determinar el genotipo de los individuos, es por medio de los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLPs por sus siglas en inglés), resultantes de la restricción enzimática, en este caso, del fragmento amplificado del gen TAS2R38. Por medio de la restricción enzimática en sitios específicos del gen, pueden generarse fragmentos de distintas longitudes en el gen, mismos que es posible observar como distintos patrones de bandas en geles de agarosa. En el Laboratorio de Bioquímica Experimental de la Facultad de Química de la UNAM se utilizan cebadores que permiten la amplificación de un fragmento de 221 pb del gen TAS2R38, los cebadores son: 5’-CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGG-3’ (Sentido) 5'-AGGTTGGCTTGGTTTGCAATCATC-3' (Antisentido) El cebador sentido se alinea con una secuencia igual en la secuencia del gen TAS2R38, excepto por el nucleótido 43 que es diferente en el alelo dominante. La secuencia del cebador se cambió en un nucleótido para dirigir un cambio en el fragmento amplificado del alelo dominante y así, generar un sitio de corte para la enzima de restricción de tipo II HaeIII, en el sitio G145C (Cuadro 6), por lo que la restricción con la enzima del alelo dominante genera dos fragmentos de ADN, uno de 44 pb y otro de 177 pb, mientras que la amplificación del alelo recesivo no genera ningún sitio de corte para HaeIII por lo que, después de la restricción con la enzima, sólo se observa una banda de ADN en un gel de agarosa después de la electroforesis 27; de esta manera, puede inferirse el genotipo del individuo en PAV o AVI. 43 Cebador Sentido: ccttcgtttt cttggtgaat ttttgggatg tagtgaagag gcgg Secuencia del alelo dominante: 61 atttcagtcc tggagtttgc agtggggttt ctgaccaatg ccttcgtttt cttggtgaat 121 ttttgggatg tagtgaagag gcagccactg Amplificación del fragmento del alelo dominante: ccttcgtttt cttggtgaat ttttgggatg tagtgaagag gcggcc… Secuencia del alelo recesivo: 61 atttcagtcc tggagtttgc agtggggttt ctgaccaatg ccttcgtttt cttggtgaat 121 ttttgggatg tagtgaagag gcaggcactg Amplificación del alelo recesivo: ccttcgtttt cttggtgaat ttttgggatg tagtgaagag gcgggc… Sitio de cortepara HaeIII generado No se genera sitio de corte Cuadro 6. RFLPs: Generación del sitio de corte para HaeIII, diagrama del gel de agarosa Carril 1. Homocigoto recesivo (AVI/AVI), Carril 2. Homocigoto dominante (PAV/PAV), Carril 3. Heterocigoto (PAV/AVI) Gel de agarosa 44 Algunos autores han utilizado otras enzimas como Fnu4HI, AatII 71,72, FokI, BseXI 73, Eco47III, RSAI 32 para determinar otros sitios de corte en el gen con procedimientos similares. Distribución de poblaciones: Hardy-Weinberg La distribución de una población puede ser calculada por medio de la ecuación de Hardy- Weinberg. Este modelo indica una relación matemática entre las frecuencias alélicas y las frecuencias genotípicas, y está dado por p2 + 2pq + q2 =1 AA=p2 Aa=2pq aa=q2 En donde A representa el alelo dominante y a, el alelo recesivo. También se tiene la relación p + q = 1 en donde p es igual a la frecuencia del alelo dominantes y q es igual a la frecuencia del alelo recesivo. De esta manera, puede tenerse una aproximación de la distribución de un alelo en la población74. 45 Determinación del fenotipo con tiras de papel impregnadas con PTC y amplificación de un fragmento de ADN para la determinación genotípica del gen TAS2R38, realizado en el laboratorio de bioquímica experimental de la Facultad de Química de la UNAM En el laboratorio de Bioquímica Experimental de la Facultad de Química de la UNAM se realizaron experimentos con alumnos y maestros de la misma facultad para la determinación del fenotipo con tiras de papel impregnadas con PTC y la amplificación de un fragmento de ADN para la determinación genotípica para el gen TAS2R38. Determinación Fenotípica del gen TAS2R38 por medio de tiras impregnadas con PTC. En este experimento participaron 73 voluntarios pertenecientes a la Facultad de Química de la UNAM siguiendo el protocolo de práctica utilizado en el laboratorio (Anexo III). El propósito fue obtener un porcentaje aproximado de los diferentes estatus de catadores de PTC en la población de la Facultad de Química; por lo que la edad o el sexo de los voluntarios no fueron factores tomados en cuenta en este estudio. Materiales Tiras de papel filtro impregnadas con 3 μg PTC (Precision Laboratories) Tiras de papel filtro control (Precision Laboratories) Procedimiento Se les pidió a los voluntarios que no consumieran alimentos o bebidas (excepto agua) por lo menos 30 minutos antes del experimento. A los voluntarios, primero se les dio a probar la tira de papel control, después la tira de papel impregnada con PTC. Los resultados se clasificaron de acuerdo a la intensidad en la percepción del sabor amargo en “Gran sensibilidad al PTC”, “Media sensibilidad al PTC” y “Sin sensibilidad al PTC”. Resultados Los resultados arrojaron que un 65% de la población estudiada puede percibir el sabor amargo de la PTC (15% con gran sensibilidad y 50% con sensibilidad media); mientras que un 35% no tuvo sensibilidad al PTC (Gráfico 1). 46 Gráfica 1. Distribución de población de acuerdo al fenotipo de los voluntarios por su percepción a la PTC. 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 P o rc e n ta je d e v o lu n ta ri o s Distribución de fenotipos de acuerdo a la percepción de PTC Mayor sensibilidad a la PTC Sensibilidad Media a la PTC Sin sensibilidad a la PTC 47 Determinación Genotípica del gen TAS2R38 por medio de la amplificación de un fragmento de ADN por PCR En este experimento participaron 17 voluntarios que fueron incluidos también en la determinación fenotípica por medio de tiras impregnadas con PTC. El objetivo de este experimento fue, en primer lugar, la observación de las bandas de ADN de distinto tamaño generadas por la amplificación por PCR y su posterior digestión con una enzima de restricción; y en segundo lugar, relacionar los resultados del nivel de percepción de la PTC de cada individuo con su genotipo. Para la extracción de ADN se utilizó la resina de intercambio iónico Chelex ®. Esta resina tiene alta afinidad a iones metálicos; está compuesta de estireno y divinilbenceno con iones iminodiacetato, mismos que actúan como grupos quelantes. La presencia de Chelex ® durante la ebullición de las muestras de saliva, evita la degradación del ADN que se produce por la presencia de los iones metálicos que se encuentran en la muestra y que actúan como cofactores de algunas nucleasas 75. Materiales Solución salina al 0.5% (p/v) (J.T. Baker) Microcentrífuga (Thermo Scientific) Suspensión de Chelex® al 10% (BioRad)75 Termobloque a 100°C (Labnet International) Reactivos para PCR: o Agua libre de nucleasas grado molecular (Thermo Scientific) o MgCl2 25mM (Thermo Scientific) o 10X Amortiguador Taq + KCl (Thermo Scientific) o Mezcla de dNTPs 10 mM cada uno (Thermo Scientific) o Taq Polimerasa 500 U/μL (Thermo Scientific) o Oligo Reverse 1.6 μg/μL o Oligo Forward 7.7 μg/μL 48 Termociclador ( SelectCycler II, BioProducts) Condiciones del termociclador utilizadas para la amplificación o 94°C por 5 minutos o 94°C por 30 segundos o 63°C por 45 segundos o 72°C por 45 segundos o 4°C al final de la reacción HaeIII 10.000 U/mL Marcador de peso molecular 2-Log Ladder 0.1-10.0 kb 1mg/mL (BioLabs) Amortiguador de carga Blue Loading Dye 6X (BioLabs) Solución de bromuro de etidio (8.3x10-4mg/mL) Procedimiento Se extrajeron células de la mucosa epitelial de la boca enjuagando por 1 minuto con 10 mL solución salina al 0.5% (p/v) enjuagando por 1 minuto, después 4.5 mL de esta solución se centrifugaron a 10 000 rpm y se resuspendió el botón celular en 100 μL de esta solución. A 100 μL de una suspensión de Chelex ® al 10%, se le agregaron 30 μL de la suspensión celular, para después ser calentado a 100°C por 10 minutos en el termobloque. Posteriormente, el sobrenadante fue separado por centrifugación a 12 000 rpm por 2 minutos, y 3 μL de él se usaron para la amplificación por PCR (ver Anexo III). Después de la amplificación se hizo la restricción del fragmento de ADN, usando 10 μL de la solución de ADN amplificado y 0.5 μL de HaeIII, incubándolo a 37°C por 60 minutos. Muestras sin procesar con HaeIII y procesadas con la enzima se corrieron en un gel de agarosa al 2% p/v en TBE 0.5X, por 75 minutos a 118 V y se utilizó 2-Log-DNA ladder como marcador de peso molecular. Resultados En los resultados que se obtuvieron, existió una relación entre el fenotipo (percepción del sabor amargo de la PTC) y el genotipo (observado por el patrón de bandas en el gel de agarosa). Un ejemplo de los resultados obtenidos en el patrón de bandas se observa en la Figura 12. 30 ciclos 49 Figura 12. Genotipos obtenidos después de la restricción del gen con HaeIII. Carriles: PM: peso molecular; 1, 2, 3 y 4: ADN sin restringir; 1.2: homocigoto dominante; 2.2: homocigoto recesivo; 3.2 y 4.2: heterocigoto. En los resultados obtuvimos una relación entre el fenotipo y el genotipo observados; todos los individuos que percibieron el sabor amargo de la PTC de las tiras de papel impregnadas con este reactivo, tuvieron un genotipo heterocigoto u homocigoto dominante; mientras que los voluntarios que no percibieron la PTC tuvieron un genotipo homocigoto recesivo. Con los resultados obtenidos del experimento sobre la percepción del sabor de las tiras impregnadas con PTC y de acuerdo a la ecuación de Hardy-Weinberg, puede inferirse que el 48% de la población de la Facultad de Química posee por lo menos un alelo dominante, que el 16% posee ambos alelos dominantes y que el 35% tiene dos alelos recesivos. 1 1.2 2 2.2 3
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