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i UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS SOBREEXPRESIÓN, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA DARPINA ® CON UN MÓDULO DE REPETICIÓN DE ANQUIRINA DENOMINADA 5834. T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA P R E S E N T A : MARÍA MERCEDES CERVANTES LÓPEZ DIRECTORA DE TESIS: Dra. Itzhel García Torres Ciudad Universitaria, Cd. Mx., 2018 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. ii 1. Datos del alumno Cervantes López María Mercedes 99 82 41 96 99 Universidad Nacional Autónoma de México Biología 414008636 2. Datos del tutor Dra. Itzhel García Torres 3. Datos del sinodal 1 Dr. Gabriel López Velázquez 4. Datos del sinodal 2 Dr. Luis David Alcaraz Peraza 5. Datos del sinodal 3 M en C Enrique Hernández Hernández 6. Datos del sinodal 4 M en C José Ignacio De la mora De la mora 7. Datos del trabajo escrito. Sobreexpresión, purificación y caracterización de una darpina® con un módulo de repetición de anquirina denominada 5834. 74 p. 2018 iii Agradecimientos: Esta tesis se realizó bajo la dirección de la Dra. Itzhel García Torres en el grupo de estudio de Biomoléculas y Salud Infantil del Laboratorio de Errores Innatos del Metabolismo y Tamiz del Instituto Nacional de Pediatría. Se reconoce la asesoría técnica de la Técnico Académico Nallely Cabrera González, del departamento de Bioquímica y Biología Estructural del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México. Esta tesis forma parte del proyecto titulado “Desarrollo de una biblioteca de proteínas de alta afinidad que reconozcan blancos biológicos para el diagnóstico oportuno de enfermedades de relevancia en salud pública”, apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT, México) con número de registro 221583, y por Recursos Federales del Instituto Nacional de Pediatría con número de registro 053/2014. Para la culminación de este trabajo de tesis se contó con una beca de licenciatura otorgada por CONACyT con número de registro 26556. iv Dedicatoria: A mis padres, Víctor y Edith por su apoyo incondicional, amor y paciencia. v ÍNDICE Página Abreviaturas……………………………………………………………………………………..1 Resumen…………………………………………………………………………………………2 1. Introducción 1.1 Proteínas naturales con repeticiones de anquirina..……………………………………3 1.1.1 Proteínas con repeticiones de anquirina en Giardia lamblia………………………4 1.2 Diseño de Darpinas…………………………………………………………………….….5 1.3 Propiedades de las Darpinas………………………………………………………….....8 1.4 Ejemplos de aplicaciones de las Darpinas………………………………………….…..9 1.4.1 Redirección viral a tumores…………………………………………………………10 1.4.2 Chaperonas en cristalización de proteínas………………………………………..10 1.5 Darpinas con un módulo de anquirina…………………………………………………11 2. Justificación………………………………………………………………………………….13 3. Objetivos 3.1 Objetivo general…………………………………………………………………………...14 3.2 Objetivos particulares……………………………………………………………………..14 4. Materiales y métodos 4.1 Subclonación del gen que codifica para la darpina 5834 en el plásmido de expresión pET-3aHisTEVp………………………………………………..17 4.2 Estandarización de las condiciones de sobreexpresión………………………………19 4.3 Estandarización de las condiciones de purificación…………………………………...22 4.4 Sobreexpresión y purificación de la darpina 5834……………………………………..24 4.5 Comparación de tres métodos de cuantificación de proteína para determinar la concentración de la darpina 5834………………………………………27 4.6 Caracterización estructural de la darpina 5834………………………………………..31 4.7 Interacción de la darpina 5834 con extracto de proteínas solubles totales de Giardia lamblia………………………………………………………………………….32 5. Resultados 5.1 Subclonación del gen que codifica para la darpina 5834 en el plásmido de expresión pET-3aHisTEVp………………………………………………..38 5.2 Estandarización de las condiciones de sobreexpresión………………………………40 5.2.1 Efecto de la glucosa en la sobreexpresión de la darpina 5834………………….41 5.2.2 Efecto de la concentración de IPTG y el tiempo de inducción en la sobreexpresión de la darpina 5834………………………………………….42 5.3 Estandarización de las condiciones de purificación…………………………………...44 5.3.1 Efecto del aumento de la fuerza iónica en la lisis celular………………………...45 5.3.2 Efecto de la adición de imidazol 20 mM en el sobrenadante…………………….46 vi 5.4 Sobreexpresión y purificación de la darpina 5834……………………………………..47 5.5 Comparación de tres métodos de cuantificación de proteína para determinar la concentración de la darpina 5834………………………………………49 5.6 Caracterización estructural de la darpina 5834………………………………………..51 5.7 Interacción de la darpina 5834 con extracto de proteínas solubles totales de Giardia lamblia………………………………………………………………………….54 6. Discusión………………………………………………………………………………….…...60 7. Conclusiones…………………………………………………………………………….……69 8. Perspectivas……………………………………………………………………………….….69 9. Literatura citada………………………………………………………………………………70 1 ABREVIATURAS AMPc Adenosín monofosfato cíclico ARs Proteínas con repeticiones de anquirina CAP Proteína activadora por catabolitos DARPina Proteína diseñada con repeticiones de anquirina DMSO Dimetilsulfóxido DTT Ditiotreitol E64 L-trans-epoxisuccinil-leucilamida-(4-guanidino)-butano EDTA Etilen diamino tetraacético IMAC Cromatografía de afinidad a metales inmovilizados IPTG Isopropil--D tiogalactopiranósido LB Medio Luria-Bertani PMSF Fenil-metil- sulfonil fluoruro SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante TEA Trietanolamina TEVp Proteasa del virus del tabaco TIM Triosafosfato isomerasa Tm Temperatura media de desnaturalización 2 RESUMEN. Las proteínas con repeticiones de anquirina son una familia de proteínas que tienen por función biológica mediar interacciones proteína-proteína. A partir de éstas, se han diseñado moléculas con capacidad de reconocer específicamente blancos proteicos alas cuales se le denomina DARPinas por sus siglas en inglés: Designed Ankirin Repeat Proteins. Se han construido bibliotecas de estas proteínas, obteniendo una gran diversidad en estabilidad y solubilidad. Al igual que las proteínas con repeticiones de anquirina naturales, las darpinas presentan una estructura característica en la que un número variable de módulos estructurales (repeticiones) se apilan para formar a la proteína de repetición. En cada módulo de repetición, se han definido residuos de aminoácidos esenciales para mantener su estructura, mientras que los residuos responsables de interaccionar con las moléculas blanco se asignan al azar. En trabajos previos, las darpinas generadas de forma exitosa han sido aquellas de dos y tres módulos de anquirina, de igual manera, aquéllas que han sido probadas con blancos específicos presentan este tamaño. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue la sobreexpresión, purificación y caracterización de una darpina con un módulo de repetición de anquirina denominada 5834. Esta proteína presenta en las posiciones variables, dos aminoácidos no polares (Isoleucina y Valina), tres cargados negativamente (Aspartato y dos Glutamatos) y dos aminoácidos cargados positivamente (Histidinas). Debido a que no existen reportes de darpinas de un módulo de anquirina caracterizadas, en este trabajo se estandarizó el método para su purificación y cuantificación. Al obtener la proteína con alta pureza se caracterizó estructuralmente mediante dicroísmo circular y se evaluó su termoestabilidad. Posteriormente se enfrentó a la fracción soluble del lisado celular del parásito Giardia lamblia, esto último con la finalidad de identificar posibles interacciones entre la darpina 5834 y proteínas de este parásito. Como resultado de estas pruebas, se tienen al menos dos proteínas candidatas cuyas masas moleculares son de aproximadamente 26 y 34 kDa. Las cuáles serán identificadas en un futuro próximo mediante espectrometría de masas. 3 1. INTRODUCCIÓN. 1.1 Proteínas naturales con repeticiones de anquirina. Las Proteínas con Repeticiones de Anquirina (ARs) median muchas interacciones proteína-proteína en prácticamente todas las especies, se encuentran de forma intracelular, extracelular y de unión a la membrana, lo que indica que estas proteínas pueden adaptarse a ambientes diferentes (Bork, 1993). El hecho de que se han reportado más de 2000 ARs pone de manifiesto su importancia en la naturaleza (Letunic y cols., 2002). Las ARs están compuestas por módulos de repeticiones de anquirinas apilados, que consisten normalmente de 33 residuos de aminoácidos, cada uno formando un giro-β seguido por dos α-hélices antiparalelas y un asa que conecta con el giro- β de la siguiente repetición (Gorina & Pavletich, 1996; Sedgwick & Smerdon,1999) (figura 1). Además, la repetición de los módulos que las conforman las hacen versátiles, variadas y diferentes en tamaño, sin alterar su estructura básica (Forrer y cols., 2003). Figura 1. Ejemplo de una proteína natural con repeticiones de anquirina. La anquirina 1 (ANK 1), es un ejemplo de una proteína con repeticiones de anquirina que está presente en la naturaleza. Se observan 12 de las 24 repeticiones de anquirina que conforman a esta proteína, cada una de estas repeticiones presentan una estructura secundaria característica en la cual un giro-β es seguido por dos α-hélices antiparalelas y un asa que conecta con el giro-β de la siguiente repetición. Código PDB: 1N11. 4 En las ARs, el apilamiento modular de los motivos de repetición permite la incorporación de elementos no conservados que pueden contribuir tanto a la estabilidad estructural del dominio como a la unión a la molécula blanco. También, como en los casos de otros motivos1 estructurales repetitivos la repetición de anquirina se presta a la variación en el tamaño total del dominio2 Parte de la proteína que es estable de manera independiente. De esta manera, el pliegue de la repetición de anquirina puede reconocer y unirse a moléculas diana que varían considerablemente en tamaño y forma (Sedgwick & Smerdon, 1999). La importancia de los módulos de repetición en la comprensión de la función biológica, reside no sólo en su alta frecuencia entre las secuencias conocidas, sino también en sus capacidades de unión y estabilidad estructural sobre las proteínas (Andrade y cols., 2001). 1.1.1 Proteínas con repeticiones de anquirina en Giardia lamblia. Como se mencionó anteriormente las ARs se encuentran en prácticamente todas las especies, sin embargo, en parásitos existen pocos estudios analizando estas proteínas. En el laboratorio de Biomoléculas y Salud Infantil del Instituto Nacional de Pediatría, se ha estudiado al parásito Giardia lamblia, el cual es causante de la Giardiasis, enfermedad diarreica con mayor prevalencia en la población infantil. Enfocándonos en el estudio de las ARs de este organismo, se han reportado en Genbank, secuencias que codifican para proteínas con repeticiones de anquirina pertenecientes al genoma del protista G. lamblia. Uno de los trabajos realizados por Elmendorf y colaboradores (2005) analizando el genoma de este parásito encontraron 14 genes codificantes para proteínas con repeticiones de anquirina, las cuales se reporta que están ubicadas en el citoesqueleto de este organismo. 1 Motivo: patrón de plegamiento reconocible, en el caso de las ARs, el patrón es un giro-β seguido por dos α-hélices antiparalelas y un asa que conecta con el giro-β de la siguiente repetición. 2 Dominio: parte de la proteína estructuralmente estable de forma independiente y que puede estar involucrada en una determinada función. 5 1.2 Diseño de Darpinas. A partir de las proteínas con repeticiones de anquirina, se han diseñado moléculas con capacidad de reconocer blancos proteicos denominadas DARPinas (Designed Ankirin Repeat Proteins) (Forrer y cols., 2003). Se han generado colecciones de genes que codifican para darpinas insertados en vectores de sobreexpresión a los cuales se les ha denominado “bibliotecas de darpinas”, obteniendo una gran diversidad de éstas proteínas de formas estables y solubles. Al igual que las proteínas con repeticiones de anquirina naturales, las darpinas presentan una arquitectura característica en la que un número variable de módulos estructurales (repeticiones) se apilan para formar el dominio de la proteína de repetición (figura 2) (Stumpp y cols., 2008). Se han reportado dos enfoques diferentes en el diseño de darpinas; Binz y colaboradores (2003) generaron darpinas con una cubierta tanto en el extremo amino como carboxilo terminal (figura 2). Ambas cubiertas procedían de la proteína de unión a guanina-adenina. Por otro lado, Mosavi y colaboradores (2004) no incluyeron en su diseño alguna repetición especial como cubierta, lo que dio lugar a proteínas expresadas como cuerpos de inclusión (acumulaciones de agregados insolubles). De hecho, se ha demostrado que las cubiertas amino y carboxilo terminal son esenciales para el plegamiento eficaz de estas proteínas en la célula y así evitar la agregación (Stumpp y cols., 2008). 6 Figura 2. Diseño de las proteínas diseñadas con repeticiones de anquirina (Darpinas). Las darpinas están compuestas por dos cubiertas (Carboxilo y Amino-terminal) y un número variable de módulos de repetición. Fuente: tomado y modificado de Binz, H.K. et al. (2003). Para el diseño de las darpinas, el equipo de trabajo de Binz y cols., 2003 analizaron los aminoácidos conservados y variables, resultado de la realización de varios consensos, tomando en cuenta tanto las secuencias de aminoácidos como las estructuras cristalográficas de proteínas con repeticiones de anquirina reportadas. Inicialmente, se obtuvo el consensoA (Binz y cols., 2003), para lo cual se realizó un alineamiento de 229 secuencias de proteínas con repeticiones de anquirina naturales, el consenso A contiene los residuos 3-32. Con el fin de afinar el consenso A y definir los residuos faltantes (1, 2 y 33), se realizó un alineamiento de secuencias de proteínas AR con estructura conocida. El consenso B resultante, fue sometido a una búsqueda bioinformática, en la cual se realizó un análisis por BLAST contra las secuencias registradas en el GenBank. El alineamiento resultante constituyó el consenso C. Para ampliar el análisis, decidieron incluir datos estructurales para el refinamiento final que condujo al consenso D (figura 3). Con lo cual se definió un módulo de darpina de 33 aminoácidos, de los cuales 26 son posiciones conservadas y siete posiciones son variables, dicho módulo sirvió como un bloque de construcción para las bibliotecas de darpinas. 7 Posteriormente, se fusionaron diferentes módulos utilizando enzimas de restricción que fueron flanqueados por cubiertas en el extremo amino y carboxilo terminal con la finalidad de proteger el núcleo hidrofóbico del dominio de repetición, dando lugar a bibliotecas de darpinas con la siguiente constitución: N x C, dónde N corresponde a la cubierta N-terminal, x al número de repeticiones del dominio de anquirina y C a la cubierta C-terminal (Binz y cols., 2003). Figura 3. Secuencia consenso final del diseño del módulo de anqurina. Los elementos de la estructura secundaria se indican por encima de la secuencia. En rojo y con una letra x se indican las posiciones variables, los aminoácidos en color verde representan el motivo conservado TPLHLAA. Fuente: tomado y modificado de Binz y cols., 2003. Mientras que las repeticiones de anquirina internas tienen dos interfases hidrofóbicas, las repeticiones de cubierta tienen sólo una, de tal forma que la superficie expuesta es hidrofílica. Por lo tanto, estas repeticiones de cubierta son necesarias para formar un dominio con repeticiones de anquirina estable y plegado correctamente (Binz y cols., 2003). En cada módulo de repetición, se han definido residuos de aminoácidos esenciales para mantener la estructura de repetición, mientras que los residuos responsables de interaccionar con las moléculas blanco se asignan al azar, debido a que en esas posiciones se encontró casi cualquier aminoácido en el análisis por consenso. El motivo TPLHLAA en las posiciones 6 a 10 está altamente conservado en las ARs naturales y representa el extremo N-terminal de la primera hélice α (Binz y cols., 2003). De los 33 aminoácidos que constituyen cada módulo, 8 siete posiciones son variables. Debido a esto, al construir bibliotecas de darpinas se logra una diversidad de más de 10 millones por módulo, las bibliotecas con dos módulos de repetición alcanzan diversidades muy por encima de 1014 (Stumpp y cols., 2008). Este consenso no sólo ayudó a diseñar grandes bibliotecas, sino que también generó darpinas con propiedades mejoradas, por ejemplo: niveles altos de expresión, alta estabilidad y solubilidad (Binz y cols., 2003). 1.3 Propiedades de las Darpinas. Las proteínas con repeticiones median numerosas interacciones proteína-proteína claves en la naturaleza (Andrade y cols., 2001). La arquitectura repetitiva de las darpinas y la adaptación de su tamaño, permite que la superficie de unión a una proteína blanco sea modular y variable, obteniéndose interacciones de alta afinidad (Binz y cols., 2003). El número de módulos de repetición en una darpina puede adaptarse, permitiendo que la superficie de interacción de blanco potencial varíe en su dimensión. Se han creado bibliotecas con diferente número de módulos repetitivos, a partir de las cuales se han seleccionado darpinas que unen sus blancos con gran especificidad, selectividad y afinidad. Además, las darpinas se expresan de manera eficiente en el citoplasma bacteriano y son proteínas estables que carecen de cisteínas (Vogel y cols., 2007). La estabilidad térmica de las darpinas que hasta la fecha se han caracterizado (compuestas de 2 hasta 6 módulos de anquirina) por lo general es alta, con temperaturas medias de desnaturalización (Tm) entre 66 y 95.8 °C, con una notable tendencia que demuestra que las darpinas con mayor número de repeticiones son aún más estables (Binz y cols., 2003; Wetzel y cols., 2007). Por ejemplo, las darpinas con más de tres repeticiones internas son resistentes incluso a la desnaturalización por temperatura o agentes caotrópicos como el cloruro de guanidina (Boersma & Plückthun, 2011). 9 El peso molecular de un módulo de repetición en las darpinas sin considerar las cubiertas amino y carboxilo terminales, está justo por encima de 3.5 kDa. Las darpinas generadas hasta hoy, se componen de dos a seis módulos, por lo tanto su peso molecular oscila desde 14 hasta 21 kDa, que es aproximadamente un décimo del tamaño de un anticuerpo IgG convencional (≈ 150 kDa), o un tercio del tamaño de fragmento Fab que es el fragmento de anticuerpo más pequeño aprobado actualmente para su uso terapéutico (Leader y cols., 2008). Además, la expresión de darpinas funcionales puede realizarse en el citoplasma de Escherichia coli con rendimientos que alcanzan hasta 200 mg de proteína purificada / L, en la cepa XL1-blue (la producción puede ser mejorada utilizando cepas de expresión especializadas con enfoques de fermentación de alta densidad celular). La estabilidad de las darpinas permite protocolos simples de purificación a gran escala, rápidos y de bajo costo (Stumpp y cols., 2008). 1.4 Ejemplos de aplicaciones de las Darpinas. Debido a sus propiedades mencionadas en el capítulo anterior, las darpinas han sido usadas como proteínas de reconocimiento de diferentes blancos, para su uso en biomedicina e investigación básica y aplicada. Una de las aplicaciones de estas proteínas ha sido el utilizarlas como alternativa de anticuerpos. Durante mucho tiempo, los anticuerpos se han considerado como las moléculas modelo de proteínas de unión (Boersma & Plückthun, 2011), la clave de este éxito se debe a que los anticuerpos pueden ser seleccionados para unirse con alta afinidad y especificidad a prácticamente cualquier antígeno (Stumpp y cols., 2008). Sin embargo, presentan algunas limitaciones: son costosos de producir, muestran baja penetración en los tejidos, presentan una estructura compleja y se unen bivalentemente a su epitope (Holliger & Hudson, 2005). Además los anticuerpos presentan enlaces disulfuro, los cuales son esenciales para la estabilidad de su estructura nativa y actividad biológica (De Marco, 2009). Los enlaces disulfuro requieren de un ambiente oxidante para su estabilidad por lo 10 que el ambiente reductor del citoplasma de los organismos procariotas (al no poseer el entorno oxidante del retículo endoplásmico como en eucariotas) dificulta la obtención en organismos como E. coli (Gaciarz y cols., 2017). Esto ha dado oportunidad para que los andamios distintos a las inmunoglobulinas, como las darpinas, sean diseñados como proteínas de unión específicas, con la capacidad de superar las deficiencias de los anticuerpos. 1.4.1 Redirección viral a tumores utilizando darpinas como adaptadores. Los sistemas virales para la administración de genes necesitan superar el problema de la direccionalidad específica hacía células y tejidos (Boersma & Plückthun, 2011). En este sentido, las darpinas se han utilizado con éxito en aplicaciones de redirección viral, a continuación se menciona un ejemplo. Los adenovirus se han investigado como posibles vectores génicos para aplicaciones terapéuticas durante mucho tiempo. Dreier y colaboradores (2011), crearon un adaptador biespecífico que se puede producir en E. coli de manera eficiente que consta de cuatro darpinas en tándem. Tresde éstas se unen y envuelven alrededor del dominio knob, dominio presente en la proteína fibra del adenovirus; la cuarta darpina se une al blanco celular de interés, en este caso HER2 (un biomarcador de la superficie celular en células cancerígenas humanas). Estos adaptadores mostraron un aumento significativo en la transducción, medido por la actividad de luciferasa. Esta nueva estrategia que consiste en alterar el tropismo natural del adenovirus serotipo 5 (Ad 5) con adaptadores racionalmente diseñados es muy prometedora para futuros desarrollos en terapia génica. En principio, las darpinas pueden generarse contra cualquier blanco y este enfoque de adaptador proporciona una estrategia versátil para desarrollar una amplia gama de vectores génicos específicos de cierta enfermedad. 11 1.4.2 Chaperonas en cristalización de proteínas. Una solución para aquellas proteínas con dificultad para cristalizar es formar un complejo no covalente con una proteína auxiliar, lo que se conoce como "chaperona" de cristalización (Sennhauser y cols., 2007). La co-cristalización con proteínas de unión específicas puede ser una ayuda importante en este proceso, ya que estas proteínas proporcionan superficies rígidas e hidrofílicas para formar contactos estables proteína-proteína. Además, la homogeneidad conformacional de la proteína puede aumentarse para obtener cristales adecuados y así obtener estructuras cristalográficas de alta resolución (Huber y cols., 2007). Ejemplos de selección y cristalización de proteínas diana en complejo con darpinas son los realizados por Sennhauser y colaboradores (2007), en uno de sus trabajos utilizaron la proteína de unión a la maltosa (MBP) de E. coli como proteína diana. La estructura del complejo se determinó a una resolución de 2.3 Å, esta estructura mostró que la interfase entre la darpina denominada Off7 y la MBP en realidad implica principalmente residuos al azar de los tres módulos de repetición de Off7, se trata principalmente de aminoácidos en las posiciones variables. La interfase en la darpina se caracteriza por siete residuos aromáticos, de los cuales cuatro son tirosinas. En otro estudio, utilizaron como proteína blanco a la cinasa bacteriana aminoglucósido fosfotransferasa (APH), la cual media la resistencia a antibióticos de muchas bacterias patógenas y es homóloga estructuralmente a las proteínas cinasas de eucariotas. Seleccionaron una darpina inhibidora de la cinasa intracelular altamente afín, denominada 3a. La estructura APH/3a con ADP (adenosín difosfato) unido se determinó a una resolución de 2.15 Å. En este caso, la darpina se unió a dos segmentos helicoidales en la región C-terminal de la APH. En la superficie de la darpina, los residuos de interacción se localizan principalmente en la repetición de terminación N-terminal, en los módulos de repetición 1 y 2 y, en menor medida, en el módulo 3 (Sennhauser y cols., 2008). 12 1.5 Darpinas con un módulo de anquirina. Existe una diversidad de trabajos reportados en los cuales se hace uso de la tecnología de las darpinas, algunos ejemplos se han mencionado en el apartado (1.4), estos trabajos principalmente están dirigidos al área de biomedicina. Sin embargo, estos ensayos hacen uso de darpinas con más de un módulo de repetición de anquirina, de hecho, la mayoría de estos trabajos utilizan darpinas de 2 a 3 módulos de repetición de anqurina. Por otro lado, la mayoría de estos enfoques han estado dirigidos al estudio de enfermedades causantes del mayor número de muertes en el mundo, entre ellas algunos tipos de cáncer (Organización Mundial de la Salud, 2017) y los principales blancos que se han estudiado son dirigidos al estudio de éstas. Hasta la fecha, no hay reportes de purificación y caracterización de darpinas con un módulo de anquirina y mucho menos, la utilización de éstas proteínas en posibles aplicaciones. Esto es debido a que se ha reportado en trabajos previos (Binz y cols., 2003; Mosavi y cols., 2004), que las darpinas con un módulo de anquirina resultan ser proteínas inestables y con dificultades para ser purificadas. Por esta razón, esta tesis se enfocó en la expresión, purificación y caracterización de la darpina 5834, la cual es una darpina con un módulo de anquirina, esto se llevó a cabo empleando una estrategia diferente a la anteriormente reportada (Binz y cols., 2003). Este trabajo, es uno de los primeros estudios de darpinas con un módulo de anquirina y representa uno de los primeros reportes del uso de esta tecnología en experimentos con organismos parasitarios. 13 2. JUSTIFICACIÓN. Las darpinas son moléculas con potencial para ser usadas como proteínas de reconocimiento a diferentes blancos, por tal motivo, se ha estudiado y propuesto su utilización en múltiples aplicaciones. Sin embargo, las darpinas compuestas por un módulo de anquirina, son proteínas poco estudiadas, a diferencia de las darpinas con más de un módulo. Por esta razón, en este trabajo se sobreexpresó, purificó y caracterizó a la darpina 5834, la cual está conformada por un módulo de anquirina. Por lo tanto, nuestra finalidad fue la de aportar nuevo conocimiento sobre las características de esta proteína e iniciar los estudios para su posible aplicación a futuro. 14 3. OBJETIVOS. 3.1 GENERAL Sobreexpresar, purificar y caracterizar estructural y funcionalmente a la darpina con una repetición de anquirina denominada 5834. 3.2 PARTICULARES Subclonar el gen de la darpina 5834 desde el plásmido pET-3a al plásmido de sobreexpresión pET-3aHisTEV. Estandarizar las condiciones de sobreexpresión y purificación. Sobreexpresar la darpina 5834 en la cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS. Purificar la darpina 5834 por medio de cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC). Comparar tres métodos de cuantificación de proteína para la darpina 5834. Analizar la estructura secundaria de la darpina 5834 mediante dicroísmo circular (DC). Analizar la termoestabilidad de la darpina 5834 mediante dicroísmo circular (DC). Evaluar la interacción entre la darpina 5834 y la fracción soluble de lisado celular del parásito Giardia lamblia. 15 4. MATERIALES Y MÉTODOS: 4.1 Generación de una biblioteca de darpinas con un módulo de anquirina. La generación de una biblioteca de darpinas con un módulo de anquirina o módulo variable se realizó previamente en el laboratorio de Biomoléculas y Salud Infantil del Instituto Nacional de Pediatría por la Dra. Itzhel García Torres; sin embargo, esta tesis se elaboró haciendo uso de la secuencia nucleotídica que codifica para una de las proteínas codificadas en dicha biblioteca, por lo que en este apartado se explicará brevemente cómo fue generada. Para generar darpinas con un módulo de anquirina, se utilizó un plásmido denominado pET3aΔ/cubiertas amino-carboxilo, el cual contiene las secuencias que codifican para las cubiertas amino-carboxilo terminales flanqueadas por los sitios para las enzimas de restricción (NdeI y BamHI) respectivamente. Además, entre la secuencia que codifica para los extremos amino y carboxilo terminal de las darpinas, se encuentran las secuencias de reconocimiento para las enzimas de restricción BpiI y BsaI, esto con el fin de insertar posteriormente la secuencia que codifica para el módulo variable. Así mismo, este plásmido se denominó pET3aΔ debido a que todos los sitios de restricción para las enzimas BpiI y BsaI fueron mutados (comercialmente por la empresa Genscript, Piscataway, NJ, E.U.A) con la finalidad de que exista un solo sitio para ambas enzimas y que corresponda al sitio de inserción de la secuencia que codifica para el módulo variable. Por otra parte, la secuencia que codifica para el módulo variable se obtuvo pormedio del método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ensamble utilizando tres oligonucleótidos degenerados que se muestran en la tabla 1. Los oligonucleótidos Int 1 e Int 3 poseen en sus extremos los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción BpiI y BsaI, respectivamente. Estas reacciones de PCR se hicieron a diferentes temperaturas de alineamiento (tabla 2) para favorecer que se incorporaran distintas bases en las posiciones variables gracias a los oligonucleótidos degenerados. 16 Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados en la reacción de PCR de ensamble para la obtención del módulo variable. Oligonucleótido Secuencia Int 1 T CAT ATG CTA GGA AGA CCT GAC GTT AAC GCT NWB GAC NWB NWB GGT NWB ACT CCG CTG CAC CTG GCT GCT Int 1 a T CAT ATG CTA GGA AGA CCT GAC GTT AAC GCT RSR GAC RSR RSR GGT RSR ACT CCG CTG CAC CTG GCT GCT Int 1 b T CAT ATG CTA GGA AGA CCT GAC GTT AAC GCT TSG GAC TSG TSG GGT TSG ACT CCG CTG CAC CTG GCT GCT Int 2 ACT CCG CTG CAC CTG GCT GCT NWB NWB GGT CAC CTG GAA ATC GTT GAA Int 2 a ACT CCG CTG CAC CTG GCT GCT RSR RSR GGT CAC CTG GAA ATC GTT GAA Int 2 b ACT CCG CTG CAC CTG GCT GCT TSG TSG GGT CAC CTG GAA ATC GTT GAA Int 3 GGT CAC CTG GAA ATC GTT GAA GTT CTG CTG AAG DAC GGA GCT GAC GTG AGA CCT TAG GGA TCC CCC AAA Las posiciones en color rojo representan las posiciones variables, en dónde el triplete de nucleótidos puede codificar para cualquier aminoácido excepto Glicina, Prolina y Cisteína. En el oligonucleótido Int 3 se representa en color azul la posición variable, en la cual el triplete de nucleótidos puede codificar únicamente los siguientes aminoácidos: Asparagina, Histidina y Tirosina. Para las posiciones degeneradas se usó el siguiente código: N= A+G+C+T, W= A+T, B= G+T+C, R=A+G, S=G+C, y D=G+A+T. 17 Tabla 2. Temperaturas y combinaciones de oligonucleótidos utilizados para la obtención del módulo variable. Temperatura de alineamiento Oligonucleótidos (Int) 45 1a, 2a, 3 55 1,2,3 55 1a,2a, 3 55 1b, 2b, 3 56 1,2, 3 57 1, 2, 3 57 1a, 2a, 3 57 1b, 2b, 3 58 1,2, 3 Una vez obtenidos los amplicones a distintas temperaturas de alineamiento, estos fueron purificados y digeridos con las enzimas de restricción BsaI y BpiI, con la finalidad de insertarlos en el plásmido de expresión pET3aΔ/cubiertas amino- carboxilo mediante una reacción de ligación utilizando la enzima T4 DNA Ligasa (Thermo Scientific). Posterior a la ligación se realizó la transformación en células competentes E. coli (Top 10), se extrajo DNA plasmídico y mediante PCR utilizando los oligonucleótidos universales T7 Promotor y T7 Terminador se corroboró la presencia del inserto en las clonas transformantes. 4.1.2 Subclonación del gen que codifica para la darpina 5834 en el plásmido de expresión pET-3aHisTEVp. Este trabajo se enfocó en las clonas obtenidas a una temperatura de alineamiento de 58° C, específicamente aquella que contenía la secuencia de DNA que codifica para la darpina 583, esto con la intención de acotar el trabajo al estudio de una sola darpina. Con el fin de purificar la darpina 5834 mediante cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC), el DNA codificante para esta proteína se subclonó en el plásmido de expresión pET3aHisTEVp (Enríquez y cols., 2011) (figura 4), el cual contiene una etiqueta de 6 residuos de histidina que se localiza en el extremo amino terminal (N-Ter) de la proteína de interés. Así mismo, este 18 plásmido posee una secuencia de reconocimiento para la proteasa del virus del tabaco (TEVp). Para realizar la subclonación se digirió el plásmido pET3a Δ/cubiertas amino- carboxilo/ 5834 con las enzimas de restricción NdeI y BamHI; de esta forma se liberó el gen que codifica para la proteína 5834 y se clonó en el plásmido pET3aHisTEVp (digerido previamente con las mismas enzimas de restricción), la reacción de ligación se realizó utilizando la enzima T4 DNA ligasa. Figura 4. Esquema representativo de los vectores pET3a y pET3aHisTEVp. A) Esquema del plásmido pET3a, Novagen. B) Esquema del plásmido pET3a, en donde se muestran algunos de sus sitios de restricción. C) Esquema del plásmido pET3aHisTEVp, se observa la inserción de la 19 secuencia codificante para la etiqueta de histidinas y el sitio de reconocimiento de la TEVp. En recuadros rojos se señalan las enzimas de restricción que se utilizaron para la subclonación del gen de la darpina 5834. Fuente: tomado y modificado de Enríquez y cols., 2011. Una vez que se corroboró la presencia del inserto que codifica para la darpina 5834, el DNA de la clona seleccionada se secuenció por el método de Sanger en la Unidad de Síntesis y Secuenciación de DNA, del Instituto de Biotecnología, UNAM. 4.2 Estandarización de las condiciones de sobreexpresión. Con la finalidad de obtener las mejores condiciones para purificar a la proteína 5834, se probaron diferentes condiciones en la sobreexpresión y purificación de la misma. Estas modificaciones se basaron en observaciones al trabajo con darpinas de Binz y colaboradores (2003), las cuales se tomaron como referencia para seleccionar los cambios analizados. Entre las variables utilizadas en la sobreexpresión se encuentran la adición de glucosa al medio de cultivo, diferentes concentraciones de IPTG y diferentes tiempos de inducción. Para evaluar estas variables, se llevaron a cabo experimentos independientes y al mismo tiempo, en los cuales se analizó una condición a la vez. 4.2.1 Adición de glucosa al 1% al medio de cultivo. En estos experimentos se analizó la sobreexpresión de la darpina 5834 utilizando 1% de glucosa en el medio de cultivo, el fundamento de la adición de glucosa se plantea en la sección de discusión (páginas 61 y 62). Para ello se realizó un precultivo con 10 mL de medio Luria Bertani (LB) suplementado con ampicilina (100 μg/mL) y un inóculo de la cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS transformada con el gen de la proteína 5834 en el plásmido de expresión pET3aHisTEVp, el precultivo se incubó a 37°C por 12 horas en agitación constante. Después del tiempo de incubación se cosecharon las células mediante centrifugación a 924 g en una centrífuga Hettich durante 15 minutos. 20 El botón de células se resuspendió en 500 μL de medio LB nuevo, y se utilizó para inocular 25 mL de medio LB con ampicilina y 1% de glucosa y 25 mL de medio LB con ampicilina sin glucosa, este último fue utilizado como control. Ambos cultivos iniciaron en un valor de DO600nm de 0.1 y se incubaron a 37°C hasta alcanzar una DO600 nm de 0.8-1, en ese momento se indujo la expresión de la darpina 5834 adicionando 0.4 mM de IPTG y se incubaron a 30°C durante toda la noche con agitación constante. Las células se cosecharon por centrifugación a 2717 g por 20 min, el botón de celulas se resuspendieron con 2 mL de amortiguador de lisis (Tris 50 mM pH 8.0, NaCl 50 mM) suplementado con 2mM de fenilmetil sulfonil fluoruro (PMSF) disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO). La ruptura celular se llevó a cabo mediante sonicación utilizando un sonicador Branson sonifier 450 (VWR Scientific), se realizaron 6 ciclos de 45 s con descansos de 2 min 30 s entre cada ciclo. Una vez realizada la sonicación, se centrifugó el lisado celular a 7547 g por 40 minutos. Se tomaron alícuotas del cultivo no inducido, inducido, lisado celular y sobrenadante, las cuales fueron visualizadas por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizante al 16 % en presencia de dodecilsulfato sódico SDS-PAGE, utilizando la técnica de Laemmli (1970) y teñidos con azul de Coomassie. 4.2.2 Evaluación en la inducción de la proteína 5834 utilizando diferentes concentraciones de IPTG y diferentes tiempos de incubación. Para probar el efecto de diferentesconcentraciones de IPTG y diferentes tiempos de inducción, se elaboró un precultivo con 15 mL de medio LB suplementado con ampicilina (100 μg/mL) y un inóculo de la cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS transformada con el gen de la proteína 5834 en el plásmido pET3aHisTEVp. El precultivo se incubó a 37°C por 12 horas en agitación constante. Se centrifugó el precultivo a 924 g durante 15 min, las células se resuspendieron en 500 μL de medio LB nuevo, el cual se utilizó para inocular 4 tubos Falcon de 50 mL conteniendo 25 mL de medio LB con ampicilina (100 μg/mL). 21 Para la inducción de la sobreexpresión de la proteína de interés se hicieron ensayos con dos diferentes concentraciones de IPTG (0.3 y 0.5 mM) y diferentes tiempos de incubación (3 y 12 horas), para la evaluación de la concentración de IPTG se mantuvo el tiempo constante y cuando se evaluó el tiempo, la concentración fue constante (véase tabla 3). En todos los casos los cultivos iniciaron en un valor de DO600nm de 0.1 y se incubaron a 37 °C hasta alcanzar una DO600nm de 0.8-1, en este momento se indujo la expresión de la darpina 5834 adicionando las diferentes concentraciones de IPTG y se incubaron a 30°C. El botón de células, previamente centrifugadas, se resuspendió con 2 mL de amortiguador de lisis (Tris 50 mM pH 8.0, NaCl 50 mM) complementado con 2mM de PMSF disuelto en DMSO, y se realizó la sonicación utilizando 6 ciclos de 45 s con descansos de 2 min 30 s entre cada ciclo de sonicación. El lisado celular se centrifugó a 7547 g por 40 minutos. Se tomaron alícuotas del cultivo no inducido, inducido, lisado celular y sobrenadante, las cuales fueron visualizadas por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 16 % en presencia de dodecilsulfato sódico SDS-PAGE, utilizando la técnica de Laemmli (1970), teñidos con azul de Coomassie. Tabla 3.- Diferentes concentraciones y tiempos de incubación evaluadas en la sobreexpresión de la darpina 5834. Concentraciones de IPTG (mM) Tiempo de incubación Cultivo 1 0.3 12 h Cultivo 2 0.5 12 h Cultivo 3 0.4 3 h Cultivo 4 0.4 12 h Para la realización de estas pruebas se analizó una variable a la vez, en los cultivos 1 y 2 se analizaron diferentes concentraciones de IPTG, para ello se utilizó el mismo tiempo de incubación en ambos experimentos (12 h) este tiempo es el empleado en el protocolo habitual. En los cultivos 22 3 y 4, la condición que se analizó fue el tiempo de incubación, por lo tanto la concentración de IPTG fue la misma para ambos ensayos (4 mM). 4.3 Estandarización de las condiciones de purificación. Por otra parte, en la purificación, se probó aumentar la concentración de NaCl (aumento de la fuerza iónica) para la lisis celular y añadir imidazol al sobrenadante una vez realizada la lisis celular, esto último para aumentar la astringencia del sistema. El fundamento de estas pruebas se explica a mayor profundidad en la sección de resultados y discusión. Para esto se desarrollaron experimentos independientes, en los cuales se analizó una condición a la vez. 4.3.1 Lisis celular en presencia de 500 mM de NaCl. La concentración previa de NaCl utilizada en la lisis celular fue de 50 mM, en esta prueba se aumentó la concentración a 500 mM, para ello se realizó un precultivo con 15 mL de medio LB complementado con ampicilina (100 μg/mL) y un inóculo de la cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS transformada con el gen de la proteína 5834 en el plásmido pET3aHisTEVp. Se incubó a 37°C por 12 horas en agitación constante. Se centrifugó el precultivo a 924 g por 15 minutos, el botón celular se resuspendió en 500 μL de medio LB nuevo, el cual se utilizó para inocular 500 mL de medio LB con ampicilina (100 μg/mL). Una vez alcanzada la DO600nm de 0.8-1 se indujo la sobreexpresión de la proteína de interés utilizando IPTG a una concentración de 0.4 mM, y se incubaron durante 12 horas a 30 °C. Se cosecharon las células por centrifugación a 2717 g por 20 minutos. El botón de células se resuspendió con 30 mL de amortiguador de lisis (Tris 50 mM pH 8.0, NaCl 500 mM) complementado con 2mM de PMSF disuelto en DMSO, y se realizó la sonicación en un sonicador Branson sonifier 450 (VWR Scientific), mediante 6 ciclos de 45 s con descansos de 2 min 30 s entre cada ciclo. Posteriormente se centrifugó el sonicado a 7547 g por una hora y el sobrenadante se puso en contacto con la resina de afinidad a níquel ProfinityTM (IMAC Ni- 23 Charged Resin, Bio-Rad), previamente equilibrada con 5 volúmenes de amortiguador de lisis; se incubó por 30 minutos en agitación constante a temperatura ambiente. Enseguida se filtró el sobrenadante y se recolectó la fracción no adherida a la resina (NA). Después se realizó un lavado con 80 mL de amortiguador (Tris 50 mM pH 8, NaCl 50 mM) y se recolectó el lavado. La proteína adherida en la resina se eluyó con 30 mL de amortiguador de lisis (Tris 50 mM pH 8, NaCl 50 mM) complementado con Imidazol 200 mM y se incubó 30 minutos en agitación constante a temperatura ambiente. El eluido se concentró en un tubo centricon de paso de corte de 10 kDa (Amicon Ultra, Merck Millipore), por medio de centrifugación a 924 g hasta un volumen de 3 mL. Se tomaron alícuotas del lisado celular, sobrenadante, fracción no adherida a la resina y fracción de lavado, las cuales fueron visualizadas por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 16 % en presencia de dodecilsulfato sódico SDS-PAGE, utilizando la técnica de Laemmli (1970), teñidos con azul de Coomassie. 4.3.2 Adición de 20 mM de Imidazol en el sobrenadante. Para probar si la adición de imidazol en la purificación de la proteína 5834 reducía la unión inespecífica de proteínas a resinas con metal inmovilizado como el níquel, se hizo un precultivo de 15 mL de medio LB suplementado con ampicilina (100 μg/mL) y un inóculo de la cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS transformada con el gen de la proteína 5834 en el plásmido pET3aHisTEVp. Se incubó a 37°C por 12 horas en agitación constante. Se centrifugó el precultivo a 924 g por 15 minutos, se resuspendió el botón celular en 500 μL de medio LB nuevo, las cuales se utilizaron para inocular 500 mL de medio LB con ampicilina. Alcanzada la DO600nm de 0.8-1 se indujo la expresión de proteínas utilizando IPTG a una concentración de 0.4 mM, y se incubaron durante 12 horas a 30 °C. Se cosecharon las células por centrifugación a 2717 g por 20 minutos. El botón de células se resuspendió con 30 mL de amortiguador de lisis (Tris 50 mM pH 8.0, NaCl 500 mM) complementado con 2mM PMSF disuelto en DMSO, y se realizó la 24 sonicación, se realizaron 6 ciclos de 45 s con 2 min 30 s de descanso. Posteriormente, se centrifugó el lisado celular a 7547 g por una hora. Una vez clarificado el lisado celular y separado el sobrenadante, a este último se le añadió 20 mM de imidazol y se puso en contacto con la resina de afinidad a níquel, se incubó por 30 minutos en agitación constante a temperatura ambiente. Se filtró el sobrenadante y se recolectó la fracción no adherida a la columna (NA). Después se realizó un lavado con 80 mL de amortiguador (Tris 50 mM pH 8.0, NaCl 50 mM) y se recolectó el lavado. La proteína adherida en la resina se eluyó con 30 mL de amortiguador de lisis (Tris 50 mM pH 8.0, NaCl 50 mM) adicionado con Imidazol 200 mM; se incubó 30 minutos en agitación constante a temperatura ambiente. El eluido se concentró en un tubo centricon de paso de corte de 10 kDa, por medio de una centrifugación a 924 g hasta un volumen de 3 mL. Se tomaron alícuotas del lisado celular, sobrenadante, fracción no adherida a la resina y fracción de lavado, las cuales fueron visualizadas por medio de SDS- PAGE al 16%, utilizando la técnica de Laemmli (1970), teñidos con azul de Coomassie. 4.4 Sobreexpresión y purificaciónde la darpina 5834. Una vez estandarizadas las condiciones de sobreexpresión y purificación (véase 4.2 y 4.3) se realizó la purificación de la darpina 5834. Para ello se realizó un precultivo en 20 mL de medio LB complementado con ampicilina (100 μg/mL), en el cual se sembraron células E. coli BL21(DE3)pLysS transformadas con el gen de la proteína 5834 y se dejaron crecer a 37 °C en agitación constante durante 12 horas. Posteriormente se centrifugó este precultivo a 924 g por 15 minutos y se inocularon 500 μL en 1L de medio LB con ampicilina (100 μg/mL), se incubó por 4 horas a 37°C, al alcanzar una DO600 de 0.8-1 fueron inducidos con 0.5 mM de IPTG y se incubaron a 30°C por 12 horas (condiciones de sobreexpresión estandarizadas). Las células se cosecharon por centrifugación a 2717 g por 20 minutos. Se realizó la sonicación del botón de células en amortiguador de lisis Tris 50 mM pH 8.0, 25 NaCl 500 mM (condición de purificación estandarizada en la sección 4.3.1, el aumento de la fuerza iónica mejoró el proceso de purificación) y 2 mM de PMSF disuelto en DMSO. Se realizaron 6 ciclos de 45 s cada uno con 2 min 30 s de descanso. Posteriormente se centrifugó el sonicado a 7547 g por una hora, la fracción del sobrenadante se puso en contacto con la resina de afinidad a níquel y se incubó por 30 minutos en agitación constante a temperatura ambiente. Se filtró el sobrenadante y se recolectó la fracción no adherida a la columna (NA). Después se realizó un lavado con 80 mL de amortiguador (Tris 50 mM pH 8.0, NaCl 50 mM) y se recolectó el lavado. La proteína adherida en la resina se eluyó con 30 mL de amortiguador de lisis (Tris 50 mM pH 8.0, NaCl 50 mM) complementado con Imidazol 200 mM; se incubó 30 minutos en agitación constante a temperatura ambiente. El eluido se concentró en un tubo centricon de paso de corte de 10 kDa, por medio de una centrifugación a 924 g hasta un volumen de 3 mL. La proteína se almacenó precipitándola con sulfato de amonio al 75%. 4.4.1 Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970). La electroforesis en geles de poliacrilamida es una técnica analítica empleada para separar proteínas. La técnica descrita como SDS-PAGE, permite separar las proteínas en función de su peso molecular debido a que este detergente les incorpora una carga neta negativa, confiriendo a todas las proteínas un cociente carga/masa similar. En este trabajo, la técnica de electroforesis utilizada para visualizar el desarrollo de los experimentos de sobreexpresión y purificación fue la reportada por Laemmli, 1970. En esta técnica se utilizan dos amortiguadores cuya diferencia entre ellos es el pH (6.8 gel concentrador y 8.8 gel separador). En este trabajo se utilizó el gel separador a un porcentaje del 16% de acrilamida (tabla 4). Las electroforesis se realizaron a un voltaje de 80 V durante 30 minutos, posteriormente, incrementando a 120 V por hora y media. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie y en algunos experimentos con coomassie coloidal, después se destiñeron con agua. 26 Reactivos Porcentaje de acrilamida 16% Acrilamida 2.66 mL Tris/ SDS pH 8.8 1.3 mL Agua 1.04 mL APS 10 % 50 uL TEMED 5uL Tabla 4.- Volúmenes para la preparación de un gel de acrilamida al 16%. 4.4.2 Digestión de la etiqueta de histidina con la proteasa del virus del tabaco (TEVp). Para los experimentos de cuantificación de la proteína y caracterización de esta por dicroísmo circular (sección 4.5 y 4.6, respectivamente), fue necesario remover la etiqueta de histidinas a la proteína para evitar que ésta interfiriera en los experimentos antes mencionados. Esto se realizó mediante la exposición a la proteasa del virus del tabaco (TEV), a una relación de 25:1 (proteína 5834:TEVp), se incubó por un periodo de 12 horas a temperatura ambiente, en presencia de ditiotreitiol (DTT) 1mM y amortiguador de digestión (Tris 50 mM, EDTA 0.5 mM, pH 8). Posterior a la incubación se diluyó en 14 mL de amortiguador de trietanolamina (trietanolamina 100 mM pH 7.4), la etiqueta de histidinas y la TEVp se separaron de la proteína haciéndola pasar por una columna que contenía resina (previamente equilibrada en amortiguador de trietanolamina). Para corroborar que este paso de hidrólisis con la TEVp se llevó a cabo de manera eficiente, se visualizó la proteína antes y después de la digestión con la TEV mediante una electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida al 16 % con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970), teñidos con azul de Coomassie. 27 Para la realización de los experimentos referentes a la interacción con la fracción soluble del lisado celular de G. lamblia (sección 4.7), la proteína 5834 se concentró hasta un volumen de 1 mL y se le dejó la etiqueta de histidinas para posteriormente adherirla a la resina con afinidad a niquel. 4.5 Comparación de métodos de cuantificación de proteína. Nuestra proteína de estudio, darpina 5834, carece de aminoácidos aromáticos en su secuencia, por esta razón no fue posible realizar su cuantificación a través de espectrofotometría a 280 nm. Debido a esto se utilizaron métodos de cuantificación colorimétricos para cuantificarla; para cada uno de los métodos de cuantificación se realizó una curva patrón, utilizando como estándar una solución de albúmina sérica bovina (BSA) a una concentración de 1 mg/mL. Se determinó la concentración de la proteína 5834 utilizando 2.5 y 5 μL de proteína. La verificación de los resultados de cuantificación se hizo mediante geles SDS-PAGE al 16%, utilizando como referencia 15 μg de la proteína triosafosfato isomerasa de G. lamblia (GlTIM), cuyo peso molecular correspondiente a la proteína monomérica es de 27 kDa y su coeficiente de extinción molar es 26720 M-1 cm-1. 4.5.1 Cuantificación de proteínas utilizando Ácido Bicinconínico (BCA). El método de BCA combina la reacción de Biuret (reacción de la proteína con Cu+2 en un medio alcalino para dar origen a iones Cu+). El producto de la reacción presenta un color púrpura, formado por la interacción de dos moléculas de BCA con el ión Cu+ que absorbe a 562 nm (García & Vázquez, 1998). Los reactivos para este ensayo son los siguientes: Reactivo A: carbonato de sodio 188 mM, bicarbonato de sodio 113 mM, ácido bicinconínico 29 mM y tartrato de sodio 8.24 mM en una solución de NaOH 0.2 N. Reactivo B: Sulfato de cobre 250 mM. 28 Se mezclaron 50 partes del reactivo A con una parte del reactivo B. Se añadió 950 μL del reactivo (A+B) a los tubos de la curva patrón (a los cuales se les añadió BSA en un rango de concentración de 0-40 mg/mL) y tubos con darpina 5834, preparados como se indica en la Tabla 5. Se incubaron por 30 min a 37 °C y se leyó la absorbancia a 562 nm usando un espectrofotómetro modelo Cary 50 Bio (Varian). Los resultados obtenidos de las muestras con 2.5 y 5 uL de la darpina 5834, se interpolaron dentro de este rango de concentraciones usando la curva patrón de BSA. Tabla 5. Protocolo tipo para la cuantificación de proteínas por el método de BCA. Reactivos Tubos Estándar BSA (mg/mL) H2O Reactivo BCA Blanco 0 50 μL 950 μL 1 4 46 μL 2 8 42 μL 3 16 34 μL 4 24 26 μL 5 32 18 μL 6 40 10 μL Muestras Darpina 5834 2.5 μL 47.5 μL Darpina 5834 5 μL 45 μL 4.5.2 Cuantificación de proteínas mediante el método de Bradford. El método de Bradford involucra la unión del colorante Azul Brillante de Coomassie G-250 a las proteínas (se une principalmente a residuos de arginina, triptófano, tirosina, histidina y fenilalanina), provocando un cambio en el máximo de absorción de 465 a 595 nm y se monitorea midiendo el incremento en la absorción a 595 nm. Para la cuantificación con este método se añadió 200 μL del reactivo de Bradford a los tubos de la curva patrón (a los cuales se les añadió BSA en un rangode concentración de 0-20 mg/mL) y tubos con darpina 5834 (2.5 y 5 29 uL), preparados como se indica en la Tabla 6. Posteriormente se leyó la absorbancia a 595 nm. Los resultados obtenidos de las muestras con 2.5 y 5 uL de la darpina 5834 se interpolaron dentro de este rango de concentraciones usando la curva patrón obtenida con el método de Bradford. Tabla 6. Protocolo tipo para la cuantificación de proteínas por el método de Bradford. Reactivos Tubos Estándar BSA (mg/mL) H2O Reactivo Bradford Blanco 0 800 μL 200 μL 1 2.5 797.5 μL 2 5 795 μL 3 7.5 792.5 μL 4 10 790 μL 5 15 785 μL 6 20 780 μL Muestras Darpina 5834 2.5 μL 797.5μL Darpina 5834 5 μL 795 μL 4.5.3 Cuantificación de proteínas mediante el método de Lowry. El método de Lowry se basa en la reacción de Biuret, en la que los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el cobre (Cu2+) en condiciones alcalinas para producir Cu+ (Noble y Bailey, 2009), seguido de la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu (fosfomolibdato y fosfotunsgtato) produciendo un color azul característico con máximos de absorbancia a 750 nm (Walker et al., 1985). Los reactivos que se utilizan para este método son los siguientes: Reactivo A: Carbonato de sodio 188 mM en NaOH 0.1 N. Reactivo B: Sulfato de cobre 62 mM disuelto en tartrato de sodio y potasio. 30 Reactivo C: solución alcalina de cobre, mezcla con 50:1 (reactivo A y reactivo B). Reactivo D: Reactivo Folin diluido en condiciones ácidas (HCl 0.2 N). Para la elaboración de este ensayo se añadió 500 μL del reactivo de Lowry a los tubos de la curva patrón (a los cuales se les añadió BSA en un rango de concentración de 0-40 mg/mL) y tubos con darpina 5834 (2.5 y 5 uL), realizados como se indica en la Tabla 7. Posteriormente se incubaron los tubos 10 min a temperatura ambiente y se leyó la absorbancia a 750 nm. Los resultados obtenidos de las muestras con 2.5 y 5 uL de darpina 5834 se interpolaron dentro de este rango de concentraciones usando la curva patrón obtenida con el método de Lowry. Tabla 7. Protocolo tipo para la cuantificación de proteínas por el método de Lowry. Reactivos Tubos Estándar BSA (1 mg/mL) H2O Reactivo Lowry Blanco 0 100 μL 500μL 1 4 96 μL 2 8 92 μL 3 16 84 μL 4 24 76 μL 5 32 68 μL 6 40 60 μL Muestras Darpina 5834 2.5 μL 97.5 μL Darpina 5834 5 μL 95 μL 31 4.6 Caracterización estructural de la darpina 5834. 4.6.1 Análisis de la estructura secundaria mediante Dicroísmo Circular. La estructura secundaria de la darpina 5834 se estimó a partir del espectro de dicroísmo circular (DC) llevado a cabo en el UV lejano (190-280 nm). La proteína pura se diluyó en amortiguador de fosfato de sodio (25 mM, pH 7.4) a una concentración de 0.2 mg/mL. Los datos fueron colectados en un espectropolarímetro J-810 (Jasco, Easton, Maryland, USA) a una temperatura constante de 25 °C en una celda de cuarzo de 0.1 cm de paso óptico. Los datos se procesaron en el programa Origin®Pro 2015. 4.6.2 Análisis de termoestabilidad mediante Dicroísmo Circular. El análisis de termoestabilidad se determinó por dicroísmo circular a 222 nm, la proteína pura se diluyó en amortiguador de fosfato de sodio (25 mM, pH 7.4) a una concentración de 0.2 mg/mL. Las mediciones fueron colectadas en un espectropolarímetro, con un aumento de la temperatura de 1°C cada 2.5 minutos, desde los 20 a 90°C, en una celda de cuarzo de 0.1 cm de paso óptico. La fracción desnaturalizada (fD) se calculó con la ecuación 1. Posteriormente, mediante un ajuste al modelo de Boltzman se determinó la temperatura media de desnaturalización (Tm). Los datos se procesaron en el programa Origin®Pro 2015. fD= (ƴN – ƴ) / (ƴN –ƴD) Ecuación 1. Ecuación para determinar la fracción desnaturalizada fD en donde: ƴN y ƴD corresponden a los valores de elipticidad de la especie nativa y desnaturalizada, respectivamente; los cuales se determinaron a partir de una extrapolación líneal de la porción inicial y final de la curva de elipticidad (ƴ) contra la temperatura. 32 4.6.3 Análisis de la estructura secundaria post-desnaturalización. Para analizar la estructura secundaria de la darpina 5834 después de su desnaturalización térmica, se empleó la misma muestra de proteína utilizada en los dos experimentos anteriores (4.6.1 y 4.6.2). Posterior al análisis de termoestabilidad (4.6.2), se realizó el descenso de temperatura de los 90° a los 25° C y se llevó a cabo el análisis de dicroísmo circular en el UV lejano (190-280 nm). Los datos fueron colectados en un espectropolarímetro a una temperatura constante de 25 °C en una celda de cuarzo de 0.1 cm de paso óptico. Los datos se procesaron en el programa Origin®Pro 2015. 4.7 Interacción de la darpina 5834 con extracto de proteínas totales de G. lamblia. El objetivo de este experimento fue probar la interacción entre la darpina 5834 y la fracción soluble del lisado de trofozoitos de G. lamblia. El experimento se conformó por dos etapas: en la primera etapa se obtuvieron las proteínas solubles totales de cultivos celulares del parásito G. lamblia; a la par se unió la darpina 5834 a la resina de afinidad a níquel, esto se realizó por medio de la etiqueta de 6 residuos de histidina presentes en el extremo aminoterminal de la darpina 5834. La segunda etapa consistió en probar la interacción entre la darpina 5834 (previamente adherida a la resina de afinidad) y la fracción soluble del lisado celular del parásito G. lamblia. 4.7.1 Obtención de proteínas totales solubles de G. lamblia. Para obtener las proteínas solubles de G. lamblia, a partir de 8 tubos con cultivos de trofozoitos de G. lamblia cepa WB (aproximadamente 15 a 18 millones de células por tubo), crecidos a confluencia en medio TYI-S-33 como se describió previamente (Mowatt y cols., 1991), fueron enfriados a 4 °C durante una noche, se realizó la centrifugación a 924 g por 15 minutos y se desechó el sobrenadante. Al botón de células se le agregaron 200 μL de amortiguador (Trizma 50 mM pH 8.5, NaCl 100 mM) y se centrifugó a 924 g por 10 minutos y se lavó con 500 μL del mismo amortiguador, este proceso se repitió 4 veces. 33 Con el objetivo de lisar los parásitos, a la pastilla celular lavada y obtenida mediante centrifugación se le adicionó, 400 μL de amortiguador de lisis (Trizma 50 mM pH 8.5, NaCl 100 mM) al cual se le añadió 1 mM de L-trans epoxisuccinil- leucil-amido (4-guanidino) butano (E64, inhibidor de cisteín proteasas) y 2 mM de PMSF (inhibidor de serín proteasas). A continuación se realizaron 7 ciclos de sonicación de 40 s, intercalando descansos de 2 minutos y medio. Se centrifugó el lisado celular a 7547 g por 40 minutos para separar los restos celulares de la fracción soluble (extracto de proteínas solubles de G. lamblia) y posteriormente se determinó la concentración de las proteínas totales a 280nm en un espectrofotómetro NanoDrop One (Thermo Scientific). 4.7.2 Estandarización de cantidad de darpina 5834 y volumen de resina acoplada a Níquel. Para obtener las condiciones adecuadas para la unión de la proteína 5834 a la resina de níquel, se realizaron experimentos en los cuales se probaron diferentes volúmenes de resina y diferentes cantidades de darpina 5834 (tabla 8). Todas las pruebas se realizaron en tubos eppendorf de 1.5 mL y la resina empleada fue lavada previamente con 500 mM de Imidazol y H2O, y equilibrada con amortiguador de Trizma 50 mM pH 8.5, NaCl 100 mM. Tabla 8. Condiciones probadas en la adhesión de la darpina 5834 a resina. Volumen de resina (μL) Cantidad de proteína 5834 (mg) Tiempo de incubación 20 0.1 1, 2 y 12 h 50 0.250 100 0.5 250 1 Se muestran las cantidades de proteína y los volúmenes de resina utilizados. Cada una de estascondiciones se realizó a diferentes tiempos de incubación (1, 2 y 12 h) en frío. 34 Todas las incubaciones se llevaron a cabo en frío con agitación constante. Concluido el tiempo de incubación de cada experimento se centrifugó a 1887 g por 10 minutos y se recolectó el sobrenadante (fracción no adherida a la resina). Para el lavado, se agregó 1 mL de amortiguador (Trizma 50 mM pH 8.5, NaCl 100 mM) y se dejó por 10 min en agitación constante. Posteriormente, se centrifugó a 1887 g por 10 min y se recolectó el sobrenadante (fracción de lavado). Se monitoreó el resultado de cada condición por medio de SDS-PAGE al 16%, utilizando la técnica de Laemmli (1970), teñidos con azul de Coomassie coloidal. De cada condición se analizó la fracción no adherida a la resina y la fracción de lavado. La condición con un mejor resultado, fue la condición utilizada para la interacción (sección 4.7.3). 4.7.3 Interacción entre la proteína 5834 adherida a resina y proteínas solubles de G. lamblia. Una vez adherida la proteína 5834 a la resina, utilizando la condición estandarizada (250 μL de resina y 1 mg de proteína, 2 horas de incubación), se añadió 1.5 mg de extracto total de proteínas solubles de G. lamblia para obtener una relación de 1:1.5 (mg/mg) de proteína 5834 con respecto al extracto total de proteínas solubles de G. lamblia. Se incubó por 2 horas en agitación constante y temperatura de 4° C. Después de la incubación se centrifugó a 1887 g por 10 minutos y se recolectó el sobrenadante (fracción no unida). Se lavó con 500 μL de amortiguador (Trizma 50 mM pH 8.5, NaCl 100 mM) en agitación constante por 10 minutos y centrifugación a 1887 g por 10 minutos. Se recolectó el sobrenadante (fracción de lavado). Para la elución se emplearon 500 μL de Trizma 50 mM pH 8.5, NaCl 100 mM adicionado con 200 mM de imidazol y se incubó 30 minutos en agitación constante. Posterior a la incubación se realizó una centrifugación a 1887 g por 10 minutos, y se recolectó el sobrenadante (eluido de la interacción). Este se concentró en un tubo centricon de paso de corte de 10 kDa (Amicon Ultra 0.5, Merck Millipore), por medio de una centrifugación a 924 g hasta un volumen de 35 100 μL y se realizó un cambio de buffer, para remover el imidazol, con 300 μL de amortiguador (Trizma 50 mM pH 8.5, NaCl 100 mM) y centrifugación a 1887 g por 10 minutos, este paso se realizó 3 veces. Los pasos de la interacción se monitorearon mediante una electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) al 16% (Laemmli, 1970), teñidos con azul de Coomassie coloidal. La interacción entre las proteínas solubles de G. lamblia y la proteína 5834 se realizó dos veces, la segunda interacción se utilizó como control solo las proteínas de G. lamblia en resina (sección 4.7.4). 4.7.4 Unión inespecífica de proteínas solubles de G. lamblia a la resina de afinidad (control). Con el fin de observar si existían proteínas inespecíficas que se unieran a la resina acoplada a níquel sin estar la darpina 5834 presente, se realizó un experimento control en el cual se adicionó 1.5 mg de extracto de proteína solubles de G. lamblia a 250 μL de resina, se incubó durante 2 horas a 4°C y agitación constante. Una vez terminada la incubación se centrifugó a 1887 g por 10 minutos y se recolectó el sobrenadante (fracción no unida a la resina). Se lavó con 1 mL de amortiguador (Trizma 50 mM pH 8.5, NaCl 100 mM), este paso se hizo dos veces. Posteriormente se centrifugó a 1887 g por 10 minutos y se recolectó el sobrenadante (fracción de lavado). Por último se eluyó con 500 μL de amortiguador (Trizma 50 mM pH 8.5, NaCl 100 mM y 200 mM de Imidazol) y se incubó 30 minutos en agitación constante. Posterior a la incubación se realizó una centrifugación a 1887 g por 10 minutos, y se recolectó el sobrenadante (eluido, proteínas de G. lamblia que pudo haber interaccionado con la resina con níquel, sin estar la darpina 5834 presente). Este se concentró en un tubo centricon de paso de corte de 10 kDa (Amicon Ultra 0.5, Merck Millipore), por medio de una centrifugación a 1887 g hasta un volumen de 100 μL. Después se realizó un cambio de buffer, para remover el Imidazol, con 300 μL de amortiguador (Trizma 50 mM pH 8.5, NaCl 100 mM) y centrifugación a 1887 g por 10 minutos, este paso se realizó 3 veces. 36 4.7.5 Estimación del peso molecular de las proteínas candidatas de la interacción. Para estimar el peso molecular de las proteínas obtenidas a partir de la interacción entre la fracción soluble de cultivos de G. lamblia y la darpina 5834, se realizó una curva de referencia para la cual se calculó la movilidad electroforética relativa (Rf) de las proteínas del marcador de peso molecular (Broad Range; Biorad). El Rf de estas proteínas se calculó dividiendo la distancia (cm) recorrida por la proteína en cuestión, entre la distancia recorrida por el amortiguador de carga. Posteriormente se trazó un gráfico con el logaritmo de los pesos moleculares de las proteínas conocidas (Broad Range) contra el Rf calculado de éstas (tabla 9). Tabla 9. Datos de la curva de referencia utilizada en la estimación de los pesos moleculares de las proteínas candidatas de interacción. Proteína Peso molecular (Da) Log peso molecular Rf Miosina 200,000 5.30 0.03 β-galactosidasa 116,250 5.06 0.09 Fosforilasa b 97,400 4.98 0.11 Albúmina sérica Bovina 66,200 4.82 0.15 Ovoalbúmina 45,000 4.65 0.25 Anhidrasa carbónica 31,000 4.49 0.34 Inhibidor de la tripsina de soya 21,500 4.33 0.54 Lisozima 14,400 4.15 0.69 Aprotinina 6,500 3.81 0.79 En el caso de las proteínas candidatas de interacción, de igual manera se calculó el Rf de cada una el cual se interpoló en la ecuación de la recta, previamente obtenida de la curva de referencia, obteniendo así los logaritmos de los pesos moleculares de las proteínas candidatas a los cuales se les aplicó el antilogaritmo para obtener el peso molecular aproximado de estas. 37 5. RESULTADOS. Como se mencionó (sección 4.1), a partir de una biblioteca de darpinas con un módulo de anquirina, previamente realizada en el laboratorio, se eligió estudiar a la darpina 5834. En la tabla 10, se muestran las clonas positivas (aquellas en las cuales se corroboró por PCR que presentaban el DNA codificante para darpinas), que se obtuvieron a diferentes temperaturas de alineamiento con las diferentes combinaciones de oligonucleótidos. Para fines de este trabajo nos enfocamos en las clonas obtenidas a una temperatura de alineamiento de 58° C, específicamente aquella que contenía la secuencia de DNA que codifica para la darpina 5834. Es importante mencionar que la línea de investigación del laboratorio involucra el estudio de otras darpinas obtenidas a diferentes temperaturas de alineamiento y que este trabajo es sólo una vertiente del proyecto de investigación. A la temperatura de alineamiento de 58 °C se obtuvieron dos darpinas, de las cuales se eligió la 5834 debido a la variabilidad de los residuos de aminoácidos que presenta (abordado en la discusión). Tabla 10. Clonas positivas obtenidas a diferentes temperaturas de alineamiento con diferentes combinaciones de oligonucleótidos. Temperatura de alineamiento Oligonucleótidos (Int) Clonas positivas 45 1a, 2a, 3 11 55 1,2,3 7 55 1a,2a, 3 46 55 1b, 2b, 3 23 56 1,2, 3 16 57 1, 2, 3 1 57 1a, 2a, 3 5 57 1b, 2b, 3 4 58 1,2, 3 9 En color verde se señala las características (temperatura de alineamiento y combinación de oligonucleótidos) en las cuales se obtuvo la clona 5834, la cual fue elegida para el desarrollo de este trabajo. 38 5.1 Subclonación del gen que codifica para la darpina 5834 en el plásmido de expresión pET-3aHisTEVp. La clona que contiene la secuencia que codifica para la darpina 5834 se subclonó del plásmido pET3a Δ/cubiertas amino-carboxilo/ 5834 al plásmidode expresión pET3aHisTEVp, utilizando las enzimas de restricción NdeI y BamHI que flanquean la secuencia que codifica para la proteína de interés y que así mismo se encuentran en el sitio múltiple de clonación del plásmido pET3aHisTEVp. Una vez lograda la subclonación en el plásmido pET3aHisTEVp, el DNA que codifica para esta proteína se secuenció por medio del método de Sanger. El resultado de la secuenciación se muestra en la Figura 5. En dónde se identifican la secuencia codificante para la etiqueta de 6 histidinas, las cuales se emplearon para posteriormente purificar la proteína mediante cromatografía de afinidad en un solo paso. Además, en el electroferograma se señalan las cubiertas amino y carboxiloterminal, así como el módulo de anquirina de la proteína 5834. La secuencia codificante presenta aproximadamente 375 pb. 39 Fi gu ra 5 . El ec tr o fe ro gr am a d e l a cl o n a 5 8 3 4 . En r ec u ad ro c o lo r ro jo s e se ñ al a la s ec u en ci a co d if ic an te p ar a 6 h is ti d in as ; en c o lo r an ar an ja d o s e se ñ al a la s ec u en ci a co d if ic an te p ar a el s it io d e u n ió n d e la p ro te as a d el v ir u s d el t ab ac o ( TE V p ), e n re cu ad ro c o lo r am ar ill o s e p re se n ta la s ec u en ci a c o d if ic a n te p ar a la c u b ie rt a am in o te rm in al . En r ec u ad ro c o lo r ve rd e se m u es tr a el m ó d u lo d e an q u ir in a d e la p ro te ín a 5 8 3 4 , y p o r ú lt im o en re cu ad ro co lo r n eg ro se p re se n ta la cu b ie rt a ca rb o xi lo te rm in al d e la p ro te ín a. 40 La traducción de la secuencia nucleotídica se realizó por medio del servidor Expert Protein Analysis System (ExPASy). En la figura 6, se muestra la secuencia de aminoácidos que integran a la darpina 5834. Figura 6. Secuencia de aminoácidos de la proteína 5834. La secuencia de aminoácidos de la cubierta aminoterminal están señalados con color amarillo, el módulo de anquirina está representado en color gris y dentro de ella en color rojo se muestran los aminoácidos variables específicos de la proteína 5834. En color azul se representa la cubierta aminoterminal. 5.2 Estandarización de las condiciones de sobreexpresión de la darpina 5834. Con el fin de obtener un mayor rendimiento en la sobreexpresión de la darpina 5834, se probaron algunas modificaciones en el protocolo de sobreexpresión, éstas modificaciones se sustentaron en trabajos previos, en los cuales se mejoraba la sobreexpresión de proteínas con repeticiones de anquirina diseñadas (Binz y cols., 2003; Dreier y cols., 2011) o en otros casos la sobreexpresión de proteínas en general (De Bellis & Schwartz, 1990; Novy & Morri, 2001). Las condiciones probadas fueron las siguientes: adición de 1% de glucosa en medio LB, diferentes concentraciones de IPTG y diferentes tiempos de inducción. A continuación se muestran los resultados obtenidos en cada una de estas modificaciones: 1 10 20 30 35 M D L G K K L L E A A R A G Q D D E V R I L M A N G A D V N A I D D E G H T 40 45 50 55 60 70 P L H L A A E V G H L E I V E V L L K H G A D V N A Q D K F G K T A F D I S 80 I D N G N E D L A E I L Q G S 41 5.2.1 Efecto de la glucosa en la sobreexpresión de la darpina 5834. Una de las modificaciones que se probaron para mejorar la sobreexpresión de la darpina 5834 fue la de adicionar 1% de glucosa al medio de cultivo (LB). Existen reportes de proteínas que son potencialmente tóxicas para la célula bacteriana y esto provoca una disminución en la sobreexpresión de la misma, para probar si este era el caso de la darpina 5834 se realizó la sobreexpresión de la darpina en medio de cultivo con 1 % de glucosa (en la página 64 de la discusión, se aborda el fundamento de la adición de glucosa al medio), a la par, se sobreexpresó en medio de cultivo sin glucosa el cual se utilizó como control. Es importante mencionar que no se observaron diferencias en el crecimiento bacteriano en los cultivos con y sin glucosa. A nivel de sobreexpresión, hubo una disminución en la sobreexpresión de la darpina 5834 al adicionar 1 % de glucosa en medio LB (figura 7, carriles 6-9), en comparación con el medio de cultivo sin glucosa (figura 6, carriles 1-4). Al comparar los carriles 4 y 9, fracción del sobrenadante, la banda correspondiente a la proteína 5834 es mayor en la condición sin glucosa, por lo que se determinó no adicionar glucosa para futuras purificaciones de la darpina 5834. Figura 7. Efecto de la adición de glucosa en la sobreexpresión de la proteína 5834. Gel Laemmli SDS-PAGE al 16%. Carriles: 1. Cultivo sin inducir (sin glucosa); 2. Cultivo Inducido con 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Sin glucosa Con 1% glucosa 6.5 14 21.5 31 45 66.2 97.4 116.2 kDa 42 0.4 mM de IPTG (sin glucosa); 3. Lisado celular (sin glucosa) 25 μg; 4. Fracción celular soluble (sin glucosa) 25 μg; 5. Marcador de peso molecular en kDa (Broad Range, Bio-Rad); 6. Cultivo sin inducir (con glucosa); 7. Cultivo Inducido con 0.4 mM de IPTG (con glucosa); 8. Lisado celular (con glucosa) 25 μg; 9. Fracción celular soluble (con glucosa) 25 μg. Para cargar los carriles sin inducir e inducido (1, 2, 6 y 7) se normalizó el número de células con respecto a la densidad óptica. La flecha indica la banda correspondiente a la darpina 5834 con etiqueta de histidinas y secuencia de reconocimiento para la proteasa del virus del tabaco (TEVp). 5.2.2 Efecto de la concentración de IPTG y el tiempo de inducción en la sobreexpresión de la darpina 5834. Para probar si existían diferencias en la sobreexpresión de la darpina 5834 cambiando la concentración de IPTG y el tiempo de inducción, se llevó a cabo la expresión de la proteína en experimentos independientes y analizando una condición a la vez. Las condiciones probadas fueron las siguientes: concentración de IPTG (0.3 y 0.5 mM) y tiempo de inducción (3 y 12 h). En todos los casos los cultivos iniciaron en un valor de DO600nm de 0.1 y se incubaron a 37 °C hasta alcanzar una DO600nm de 0.8- 1, en este momento se indujo la expresión de la darpina 5834 adicionando las diferentes concentraciones de IPTG (0.3 y 0.5 mM) y se incubaron a 30°C por diferentes tiempos (3 y 12 h) con lo que se asume que el crecimiento celular fue similar aún en las diferentes condiciones. La inducción con 0.5 mM de IPTG mostró un ligero aumento en la sobreexpresión de la proteína 5834, con respecto a la inducción con 0.3 mM de IPTG. Además, se observaron diferencias en las bandas de otras proteínas que se co-expresan con la darpina 5834, esto se observa en la figura 8 (carril 9) en dónde hay una menor expresión de una de las proteína que se co-expresó con la darpina 5834 a diferencia del carril 4 en donde se indujo con 0.3 mM de IPTG. 43 Figura 8. Efecto de la concentración de IPTG en la sobreexpresión de la proteína 5834. Gel Laemmli SDS-PAGE al 16% teñido con azul de Coomassie. Carriles: 1. Cultivo sin inducir (25 μg); 2. Inducido con 0.3 mM de IPTG (25 μg); 3. Lisado celular; 4. Fracción celular soluble; 5. Marcador de peso molecular en kDa (Broad Range, Bio-Rad); 6. Cultivo sin inducir (25 μg); 7. Cultivo inducido con 0.5 mM de IPTG (25 μg); 8. Lisado celular; 9. Fracción celular soluble. Para cargar los carriles sin inducir e inducido (1, 2, 6 y 7) se normalizó
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