Tim-3-y-gal-9-como-biomarcadores-asociados-a-pobre-respuesta-al-tratamiento-en-pacientes-VIH

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
FACULTAD DE MEDICINA 
BIOMEDICINA 
 
TIM-3 Y GAL-9 COMO BIOMARCADORES ASOCIADOS A POBRE RESPUESTA 
AL TRATAMIENTO EN PACIENTES VIH+ 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
PRESENTA: 
 AQUILES RANFERI OCAÑA GUZMÁN 
TUTORA PRINCIPAL DE TESIS: DRA. ISABEL SADA OVALLE, Facultad de Medicina 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR: DRA. YOLANDA LÓPEZ VIDAL, Facultad de Medicina 
 DRA. GLORIA SOLDEVILA MELGAREJO, Instituto de Investigaciones Biomédicas 
 
 
MÉXICO, D.F. NOVIEMBRE, 2013 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
3 
 
 
Ciencias iológicas 
Dr. Isidro Ávila Martínez 
Director General de Administración Escolar, UNAM 
P resente 
COORDINACiÓN 
Me permito informar a usted que el Subcomité de 8101091a Experimental y Biomedicina, en su 
sesión ordinaria del dla 09 de septiembre de 2013, aprobó el jurado para la presentación de su 
examen para obtener el de grado de MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS del alumno OCANA 
GUZMÁN AQUILES RANFERI con numero de cuenta 512015130, con la tesis titulada " TIM-3 y 
GAL-9 COMO BIOMARCADORES ASOCIADOS A POBRE RESPUESTA AL TRATAMIENTO EN 
PACIENTES VIH+" , realizada bajo la dirección de la ORA. MARíA ISABEL SACA OVAllE: 
Presidente: 
Vocal : 
Secretario: 
Suplente: 
Suplente: 
DR. KAREN MANUCHARYAN AIRAPETIAN 
DRA. CLAUDIA GONZALEl ESPINOSA 
DRA. GLORIA SOLDEVILA MELGAREJO 
DR RAMCES FALFAN VALENCIA 
DRA. YOLANDA LÓPEl VIDAL 
Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo. 
ATENTAMENTE 
" POR MI RAZA HABLARA EL ESPIRITU" 
Cd. Universitaria, D.F" a 11 de noviembre de 2013 
yj'w evo ~r57 ' 
DRA. MARiA DEL CORO ARIZMENDI ARRIAGA 
COORDINADORA DEL PROGRAMA 
Unidad de Posgrado • Coordinación del Posgrado en Ciencias Biológicas Edificio B, ler. Piso, Circuito de Posgrados Cd. Universitaria 
Delegación CoyoacAn C.P. 04510 Méx.ico, O.F. Te!. 5623 7002 http://pcbiol.posgr'oldo.unam.mx 
4 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
Al Posgrado en Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Autónoma de 
México por permitirme realizar mis estudios de posgrado. 
 
 
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el apoyo recibido 
mediante la beca de posgrado que me otorgó y gracias a la cual me fue posible 
dedicarme en tiempo completo al programa. 
 
 
 
 
A los miembros del comité tutor por la dirección y apoyo en mis estudios de 
Posgrado. 
 
Tutor principal: Dra. Isabel Sada Ovalle 
Comité Tutorial: Dra. Yolanda López Vidal 
Dra. Gloria Soldevila Melgarejo 
 
 
 
 
 
5 
 
AGRADECIMIENTOS A TITULO PERSONAL 
Quiero agradecer a todas las personas quienes me han brindado su ayuda, sus 
conocimientos y su apoyo para la realización de este trabajo. Quiero agradecer a 
todos ellos cuanto han hecho por mí, para poder concluir esta etapa académica y 
por todas las oportunidades que se presentaron en este periodo. 
Agradezco especialmente a Diana Coria, por su compañía, apoyo, cariño 
comprensión y paciencia, elementos que siempre me han impulsado a seguir 
mejorando. 
Agradezco a todos los integrantes del laboratorio de Inmunología Integrativa, de 
quienes he obtenido amistades y conocimientos invaluables, y quedo 
especialmente agradecido con mi directora de tesis, Dra. Isabel Sada Ovalle, 
quien me ha apoyado en todo momento. 
Agradezco también el apoyo de mis amigos de toda la vida, quienes son una gran 
parte de mí y con quienes he compartido las más grandes alegrías. 
A todos ellos, gracias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
DEDICATORIA 
 
Este trabajo lo dedico a mi maravillosa familia, quienes siempre me han apoyado y 
de quienes siempre he tenido alegría, amor y compañía. Y dedico especialmente 
mi empeño en esta tesis a mi madre Noemi Ocaña Guzmán, que siempre me ha 
correspondido en todos sentidos, es mi amiga y es la persona más maravillosa de 
este mundo, a ella dedico los avances que he obtenido personal y 
profesionalmente, ya que ella me enseño el valor del trabajo y de la honestidad, 
por lo cual siempre estaré agradecido. 
 
7 
 
ÍNDICE 
A 
ABSTRACT....................................................................................................................................................................... 14 
B 
BIBLIOGRAFIA .......................................................................................................................................................... 77–81 
C 
CICLO DE REPLICACIÓN DEL VIH ...................................................................................................................... 31–32 
COMÓ FUNCIONA EL VIRUS ................................................................................................................................. 25–26 
CONCLUSIONES 
Conclusiones .................................................................................................................................................................. 77 
D 
DISCUSIÓN ................................................................................................................................................................ 72–76 
E 
EL AGENTE ETIOLOGICO ...................................................................................................................................... 16–18 
ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS TIM ........................................................................................................... 39–40 
G 
GALECTINA 9 ............................................................................................................................................................ 45–46 
H 
HIPÓTESIS ....................................................................................................................................................................... 49 
I 
INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH) ............................................... 24–25 
INMUNOPATOGENESIS DEL VIH. ........................................................................................................................ 37–38 
INTRODUCCIÓN........................................................................................................................................................ 15–16 
L 
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................................................................ 9 
M 
MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................................................... 54–58 
O 
OBJETIVOS ................................................................................................................................................................ 49–50 
ORIGEN VIH-1 ........................................................................................................................................................... 26–28 
8 
 
ORIGEN VIH-2 ........................................................................................................................................................... 28–29 
P 
PACIENTES Y MÉTODOS .......................................................................................................................................51–53 
PATOGENESIS DE LA TUBERCULOSIS .................................................................................................................. 18 
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.......................................................................................................................... 48 
PROTEINA TIM3 (T CELL INMUNOGLOBULIN AND MUCIN DOMINE) .............................................................. 39 
R 
RESPUESTA ADAPTATIVA EN TUBERCULOSIS ............................................................................................. 20–22 
RESPUESTA INMUNE INNATA EN TUBERCULOSIS ....................................................................................... 18–20 
RESULTADOS ........................................................................................................................................................... 59–68 
RESUMEN ........................................................................................................................................................................ 13 
T 
TIM-3 EN INFECCIONES VIRALES ....................................................................................................................... 40–41 
TIM-3 EN OTRAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS .............................................................................................. 43 
TRANSMISÓN DEL VIH ........................................................................................................................................... 33–36 
TROPISMO ................................................................................................................................................................. 29–31 
TUBERCULOSIS Y VIH .................................................................................................................................................. 38 
 
 
9 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
°C Grados centígrados 
DNA Ácido desoxirribonucleico 
DNAmt Ácido desoxirribonucleico mitocondrial 
RNA Ácido ribonucleico 
CCL Quimiocina con motivo cisteína-cisteína 
CCR Receptor para quimiocinas con motivo cisteína-cisteína 
CD Grupo de diferenciación 
CDC Centro para el control de enfermedades 
CMN Células mononucleares 
CR1 Receptor para complemento 1 
CR3 Receptor para complemento 3 
CR4 Receptor para complemento 4 
CTLA-4 Antígeno de linfocito T citotóxico 4 
CXCR Receptor para quimiocinas con motivo cisteína-X-cisteína 
DC Célula dendrítica 
EAE Encefalomielitis autoinmune experimental 
ECL2 Bucle extracelular para segundo correceptor 
ETS Enfermedades de transmisión sexual 
Gal-9 Galectina 9 
gp120 Glicoproteína de 120 kilodaltones 
 gp41 Glicoproteína de 41 kilodaltones 
HTLV-III Virus con tropismo por linfocitos T humanos de tipo 3 
IFN-γ Interferón gamma 
10 
 
IFN-γR1 Receptor de interferón gamma 1 
IFN-γR2 Receptor de interferón gamma 2 
IgV Dominio inmunoglobulina variable 
IL Interleucina 
iNOS Sintasa inducible de óxido nítrico 
LAG-3 Gen de activación de linfocitos 3 
LAM lipoarabinomanana 
LT Linfocito T 
M. tb Mycobacterium tuberculosis 
MA Macrófagos alveolares 
mAGP Complejo macromolecular ácido micólico-arabinogalactano 
peptidoglucano 
MCP-1 Proteína quimiotáctica de monocitos 
MDM Macrófago diferenciado de monocito 
MHC Complejo principal de histocompatibilidad 
MIP-1α Proteína inflamatoria de macrófagos 1 alfa 
MIP-1β Proteína inflamatoria de macrófagos 1 beta 
MN Monocito 
MR Receptor de manosa 
NK Célula asesina natural 
NKT Célula T asesina natural 
Nm Nanómetros 
NO Óxido nítrico 
OMS Organización mundial de la salud 
PBS Buffer de fosfato-salino 
11 
 
PD1 Proteína de muerte programada 1 
PFH Pruebas de función renal 
RNI Intermediarios reactivos de nitrógeno 
ROI Intermediario reactivo de oxigeno 
SIDA Síndrome de inmunodeficiencia adquirida 
SINAIVE Sistema nacional de vigilancia epidemiológica 
SIV Virus de la Inmunodeficiencia en simios 
SIVsm Virus de la inmunodeficiencia en simios mono gris 
SPA Proteína surfactante A 
TB Tuberculosis 
TBP Tuberculosis pulmonar 
Tc1 Célula T citotóxica 1 
Tc2 Célula T citotóxica 2 
Th1 Célula T colaboradora 1 
Th2 Célula T colaboradora 2 
TIM Proteína de célula T con dominios inmunoglobulina y mucina 
TLR Receptor tipo toll 
TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa 
VDR Receptor para vitamina D 
VHB Virus de la hepatitis B 
VHC Virus de la hepatitis C 
VHS Virus del herpes Simple 
VIH Virus de la inmunodeficiencia humana
12 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
RESUMEN 
 
La proteína Tim-3 se expresa en diversos tipos celulares del sistema inmune. 
Desde su descubrimiento en el año 2002, diversos trabajos han confirmado la 
participación de Tim-3 en la regulación de la respuesta inmune, en especial de la 
respuesta de tipo Th1. Adicionalmente se ha descrito la participación de esta 
proteína, como regulador en la activación de células mieloides, sin embargo aún 
no es claro cuáles son las vías de señalización que esta proteína puede regular, 
tanto en células linfoides como en células mieloides, e inclusive se ha sugerido 
que tim-3 podría tener funciones distintas en los diferentes linajes celulares. 
Con la finalidad de evaluar la expresión y función de Tim-3 y Gal-9 en la capacidad 
bactericida de macrófagos infectados con la cepa H37Rv de Mycobacterium 
tuberculosis y si es dependiente de la interacción entre estas moléculas, se obtuvo 
sangre periférica de pacientes con infección por VIH adultos. A partir de las células 
mononucleadas totales, se recuperaron los monocitos CD14+ mediante la técnica 
de selección positiva por inmunomagneto. La expresión y la caracterización 
fenotípica se realizaron por citometría de flujo. Para evaluar la capacidad 
bactericida y/o bacteriostática de los macrófagos se utilizó un modelo de infección 
in vitro. Nuestros resultados mostraron que macrófagos infectados con 
Mycobacterium tuberculosis, limitan el crecimiento intracelular del patógeno 
cuando se cultivan en presencia de linfocitos T autólogos (50.9±17.6% en los 
pacientes VIH+ y 71.8±24.3% en sujetos control) (p=0.008). Cuando se bloqueó la 
interacción Tim-3/Gal-9 con anticuerpos específicos, los macrófagos de pacientes 
VIH+ incrementaron su capacidad para controlar el crecimiento intracelular de 
Mycobacterium tuberculosis (127.8±62.2% para Tim-3 y 105.2±48.1% para Gal-9) 
mientras que los controles sanos mostraron un comportamiento distinto 
(29.3±17.5% para Tim-3 y 28.7±11.5% para Gal-9) (p=0.0001). Al evaluar la 
expresión de Tim-3 y Gal-9 en distintas poblaciones de células de sangre 
periférica como los linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, células NK CD16+ 
CD56+, y monocitos CD14+, no se encontró ninguna diferencia estadísticamente 
significativa en relación a la frecuencia de las distintas poblaciones. 
 
14 
 
ABSTRACT 
 
Tim-3 protein is expressed in various cell types of the immune system. Since its 
discovery in 2002, several studies have confirmed the involvement of Tim-3 in the 
regulation of the immune response, especially Th1-type response. Additionally 
described the involvement of this protein, as a regulator in the activation of myeloid 
cells, however still not clear what are the signaling pathways that can regulate this 
protein in both lymphoid and myeloid cells, and even has suggested that Tim-3 
may have different functions in different cell lineages. 
With the aim of assessing whether the bactericidal macrophages infected with the 
Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain is dependent on the interaction of Tim-3 
and Gal-9, and to evaluate the expression of both molecules in mononuclear cells, 
peripheral blood was obtained from adult patientswith HIV infection. From the total 
mononuclear cells recovered monocytes using positive selection via magnetic 
micro beads coated with Abs to CD14. Expression and phenotypic characterization 
was performed by flow cytometry. To evaluate the bactericidal and/or bacteriostatic 
macrophages capacity we used an in vitro infection model. Our results showed that 
infected macrophages limit intracellular growth of Mycobacterium tuberculosis 
when grown in the presence of autologous T lymphocytes (50.9±17.6% patients 
VIH+ and 71.8±24.3% healthy donors) (p=0.008). When blocking the interaction 
Tim-3/Gal-9 with specific antibodies, macrophages from HIV+ patients increased 
their ability to control the intracellular growth of Mycobacterium tuberculosis 
(127.8±62.2% for Tim-3 and 105.2±48.1% for Gal-9) while the healthy donors 
showed an opposite behavior (29.3±17.5% for Tim-3 and 28.7±11.5% for Gal-9) 
(p=0.0001). To evaluate the expression of Tim-3 and Gal-9 in different type cells of 
peripheral blood such as lymphocytes T CD4+, Lymphocytes CD8+, NK cells 
CD16+ CD56+, and monocytes do not identify any statically differences in relation 
of the frequency of the different types cells analyzed. 
 
15 
 
INTRODUCCIÓN 
Tuberculosis 
De acuerdo con datos publicados por la organización mundial de la salud (OMS) en el año 
2012, se estimó que más de 2,000 millones de personas (un tercio de la población 
mundial) están actualmente infectadas con el bacilo de la tuberculosis [1]. Del 5% al 10% 
de las personas infectadas, desarrollan la forma activa de la enfermedad. Así mismo, se 
documentó un registro de 8.7 millones de casos nuevos y 1.4 millones de muertes a 
causa de esta enfermedad [1]. 
En México, de acuerdo con el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica ( SINAVE), 
en el año 2010 se documentaron un total de 18,848 casos nuevos de TB incluyendo la TB 
pulmonar (81.6%) y de aquellas formas extra pulmonares [2]. Adicionalmente se informó 
que del total de casos de TB pulmonar que se registraron 1,189 casos que 
correspondieron a pacientes co-infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana 
(VIH) [2]. 
Algunas de las condiciones que se han asociado con un riesgo incrementado para 
desarrollar la forma activa de la enfermedad, son la infección por el VIH, tratamiento anti-
TNF-alfa (en casos de enfermedades autoinmunes), tratamientos antineoplásicos 
diabetes mellitus y en general todas aquellas condiciones patológicas que favorezcan de 
alguna manera un estado de inmunosupresión [3]. 
El agente etiológico de la tuberculosis pulmonar es el bacilo Mycobacterium tuberculosis 
(M. tb), patógeno intracelular que tiene la capacidad de sobrevivir y persistir dentro de las 
células fagocíticas mononucleadas del hospedero. La vía de entrada de M. tb en la 
mayoría de los casos es la inhalación a través de las llamadas gotas de flügger [4]. La 
respuesta inmune del hospedero contra M. tb es fundamental ya que solo el 10% de las 
16 
 
personas infectadas desarrollarán la enfermedad a lo largo de su vida [5]. La primera 
interacción de M. tb con el sistema inmune es con los macrófagos alveolares, células 
epiteliales y células dendríticas las cuales dan inicio a la respuesta inmune innata y 
posteriormente, alrededor de la segunda semana después de exposición al bacilo se inicia 
la respuesta inmune celular. Esta respuesta incluye la participación de los linfocitos T 
CD4+, CD8+, NKT y γδ así como la producción de citocinas pro-inflamatorias (IL-2, IFN-γ, 
IL-12, IL-18 y TNF-α) [4]. 
 
 
EL AGENTE ETIOLOGICO: Mycobacterium tuberculosis 
El género Mycobacterium está integrado por bacilos largos de 3 a 5 µm de longitud, 
curvos, inmóviles, no esporulados, con abundantes gránulos citoplasmáticos. 
Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae son los agentes etiológicos de las 
dos enfermedades más frecuentes y conocidas que son ocasionadas por bacterias de 
este género, la tuberculosis pulmonar y la lepra. 
M. tb es un microorganismo de crecimiento lento, que al igual que la mayoría de las 
micobacterias, es aerobio estricto y su crecimiento se ve favorecido en presencia de 
dióxido de carbono a una concentración de 5-10%. La temperatura óptima de crecimiento 
es variable con un rango entre 30 y 42ºC. 
Como todas las células procariotas, las micobacterias poseen citoplasma, membrana 
celular y un espacio periplásmico que lo separa de una gruesa y compleja pared celular 
[6]. 
17 
 
La envoltura de M. tb, es una estructura compleja en la cual radica gran parte del éxito de 
este patógeno. Esta pared está constituida por la cápsula, la pared celular y la membrana 
plasmática [7]. 
La cápsula es la capa más externa de la envoltura de las micobacterias y sirve de 
protección contra múltiples factores externos. Por tanto, tiene una interacción directa con 
diversos elementos de la respuesta inmune. Algunos de los componentes más 
importantes de la cápsula son los ácidos micólicos y los glicolípidos. Estos glicolípidos 
junto con algunas proteínas son responsables de las características antigénicas de la 
bacteria [7, 8]. 
La pared micobacteriana se localiza por debajo de la cápsula y está separada por espacio 
periplásmico, está constituida por dos segmentos, superior e inferior, cuenta con un 
elevado contenido en lípidos (50-60%) que le confieren el carácter hidrofóbico y la hacen 
resistente a la hidrólisis enzimática [8]. La región inferior de la envoltura está conformada 
por el complejo macromolecular que incluye ácidos micólicos, arabinogalactano y 
peptidoglucano (mAGP); este complejo se denomina núcleo de la pared celular [7]. La 
región superior está compuesta por lípidos libres y glicolipídos [7]. 
La membrana celular tiene las características biológicas y bioquímicas de cualquier 
membrana, otorga a la célula protección osmótica, sirve para el transporte de iones y 
otras moléculas; sin embargo, en las micobacterias los fosfolípidos se caracterizan por 
estar altamente glicosilados dando lugar a moléculas como la lipoarabinomanana (LAM), 
que tienen un papel fundamental en la patogénesis de la tuberculosis [8]. 
A pesar de que los factores de virulencia de muchas bacterias son de naturaleza proteica 
y son codificados por genes contenidos en el cromosoma bacteriano, plásmidos o 
bacteriófagos, algunos de los lípidos de la pared celular de M. tb también han sido 
considerados como atributos patogénicos sumamente importantes, en donde ninguno de 
18 
 
ellos es considerado como un factor de virulencia esencial, pues la patogenia del bacilo 
parece ser un fenómeno multifactorial. 
PATOGENESIS DE LA TUBERCULOSIS 
La patogénesis de la TB es resultado de la interacción entre los factores de virulencia de 
M. tb con la compleja respuesta inmune del hospedero. 
La TB pulmonar es la presentación clínica más común durante la infección por M. tb [4] y 
tiene preferencia por los ápices pulmonares en donde la concentración de oxígeno es 
mayor, aunque en ocasiones se pueden identificar múltiples focos infecciosos [9]. 
M. tb transita de las vías aéreas superiores a las inferiores hasta alcanzar el espacio 
alveolar en donde se encuentra con elementos del sistema inmune innato. Las células del 
epitelio alveolar contienen péptidos antimicrobianos que participan en la eliminación de los 
patógenos como parte de la inmunidad innata [10-12]. El bacilo es fagocitado por los 
macrófagos alveolares que constituyen la primera línea de defensa a nivel del parénquima 
pulmonar. En estos focos de infección incipiente comienza la formación de un infiltrado de 
linfocitos T y B, macrófagos y células dendríticas (DC), originando una respuesta 
inflamatoria semejante a la observada en la neumonía bacteriana o de la comunidad [9]. 
Los macrófagos y/o las células dendríticas que han fagocitado a M. tb migran a los 
ganglios linfáticos regionales para iniciar la respuesta inmune adaptativa [9]. 
RESPUESTA INMUNE INNATA ENTUBERCULOSIS 
En el espacio alveolar existen mecanismos innatos de defensa que involucran a diferentes 
tipos celulares como macrófagos alveolares, DC, neutrófilos, células epiteliales alveolares 
tipo I y tipo II [10] y algunos factores solubles como mucina, lisozima, lactoferrina, proteína 
surfactante A (SPA), defensinas, catelicidinas, fosfolipasa A, inmunoglobulinas y proteínas 
19 
 
del complemento, cuya función es mantener la homeostasis pulmonar y eliminar 
partículas y/o bacterias que tienen acceso al tracto respiratorio [9]. La catelicidina es uno 
de estos péptidos antimicrobianos que es inducida por la vitamina D, a través del receptor 
para vitamina D (VDR). La deficiencia en esta vitamina se ha asociado con riesgo 
incrementado para desarrollar tuberculosis pulmonar [9]. 
La fagocitosis de M. tb puede ser favorecida por la propia bacteria, ya que en su superficie 
cuenta con una serie de compuestos que le permite interactuar con diversos receptores 
presentes en las DC y macrófagos [4, 9, 13]. Algunos de los receptores más importantes 
son: receptores para complemento CR3, CR1, CR4, receptores tipo Toll (TLR2 y TLR4), 
receptor de manosa (MR), CD14, y receptores de tipo “carroñero” (scavenger) [4, 5, 12, 
14] los cuales median la producción de óxido nítrico (NO) y citocinas pro-inflamatorias 
como TNF-α, IL-1 y [9, 13]. 
Como parte de la respuesta inmune humoral el macrófago puede reconocer diversos 
elementos séricos, que son depositados en la superficie bacteriana, tales como los 
anticuerpos, los cuales son posteriormente reconocidos por receptores para el fragmento 
Fc [13]. Gracias a la unión de estos receptores con sus ligandos en la superficie de M. tb, 
se activan vías de señalización intracelular que culminan en la producción de citocinas 
como IL-12, IL-23, IL-27, IL-1, INF-γ y TNF-α, las cuales además de promover la 
activación de las células fagocíticas, sirven como vínculo para iniciar la respuesta 
adaptativa. Se ha demostrado previamente que los macrófagos que internalizan a la 
micobacteria mediante TLR2, además de producir IL-10 que tiene un efecto inhibitorio de 
la respuesta inmune, producen menos IL-12, en comparación con DC las cuales utilizan 
receptores distintos para la internalización del bacilo [14]. IL-12 es una citocina que 
participa en la respuesta inmune innata y adaptativa al favorecer la activación de diversos 
tipos celulares [14]. 
20 
 
El macrófago cuenta con diversos mecanismos para eliminar a M. tb tales como la fusión 
fagolisosomal, en donde se pueden identificar proteasas, hidrolasas, peroxidasas que 
contribuyen a la acidificación de la vacuola, y a la degradación de la micobacteria. Esta 
fusión del fagosoma con el lisosoma puede ser prevenida por M. tb al modificar el 
ensamble de actina y alterar el trafico citoplásmico de las vesículas, evitando de esta 
manera la fusión del fagosoma con el lisosoma [14]. Por eso no es sorprendente que el 
bacilo pueda modificar la capacidad migratoria y de maduración de estas células, por 
ejemplo, al inducir la producción de IL-10 por parte de los macrófagos infectados regula el 
estado de activación de la respuesta inmune innata y la respuesta adaptativa. 
La respuesta inmune innata iniciada por macrófagos, DC y células epiteliales alveolares 
favorece el reclutamiento de células mieloides al pulmón [15]. Este reclutamiento celular 
es mediado por una amplia variedad de quimiocinas como CCL2, ¿CCl3? (CCL3?), 
¿CCl7? (CCL7?) , CCl12?, CXCL2, CXCL3 y CXCL10 [14]. 
 
RESPUESTA ADAPTATIVA EN TUBERCULOSIS 
Macrófagos y DC que fagocitan a la micobacteria migran a los nódulos linfáticos para 
llevar a cabo la presentación antigénica en el contexto de moléculas MHC (por las siglas 
en inglés: (Major Histocompatibility Complex) clase I y clase II. Dentro del fagosoma M. tb 
impide su acidificación y fusión con el lisosoma como un mecanismo de evasión de la 
respuesta inmune [4, 9, 16]. Los antígenos micobacterianos de naturaleza proteica son 
acoplados a moléculas MHC-1 en la célula presentadora de antígeno y presentados a 
linfocitos T CD8+, o bien, acoplados a moléculas MHC-II y presentados a los linfocitos T 
CD4+ [4, 9, 15]. 
21 
 
La diseminación de la bacteria a los nódulos linfáticos en el pulmón ocurre alrededor de 
los nueve días posteriores al ingreso del bacilo al tracto respiratorio y cronológicamente 
correlaciona con el inicio de la respuesta inmune adaptativa [12]. Una vez que los 
linfocitos T son activados y se diferencian en células efectoras retornan al parénquima 
pulmonar en respuesta a un gradiente de quimiocinas y citocinas, participando en la 
eliminación del patógeno (Imagen 1) [12]. 
El perfil de citocinas presentes en el microambiente pulmonar es crítico para el control del 
crecimiento de M. tb, ya que se ha reportado en distintos trabajos que la secreción de 
citocinas de tipo TH1 como IL-2, IFN-γ, IL-12, IL-18, TNF-α, CCL5, MCP-1, MIP-1α e IL-8 
favorece el control del crecimiento intracelular bacteriano [9, 17, 18]. 
El IFN-γ es una citocina que favorece los mecanismos bactericidas de los macrófagos al 
inducir la expresión de más de 200 genes que codifican para proteínas involucradas en la 
respuesta inmune tales como: MHC-I, MHC-II e iNOS, entre otras [4, 9]. Además favorece 
la producción de intermediarios reactivos del oxígeno (ROI) y del nitrógeno (RNI) [9]. Se 
ha demostrado en el modelo murino de infección, que la deficiencia genética para producir 
IFN-γ o mutaciones en los genes que codifican para las subunidades α (IFN-γR1) y β 
(IFN-γR2) del receptor para IFN-γ (IFN-γR), incrementan la susceptibilidad a infecciones 
por patógenos como Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium, Mycobacterium 
abscessus y otras micobacterias atípicas. Se ha propuesto que en estos pacientes la 
infección se disemina por la inadecuada formación del granuloma, debido a la falta en la 
activación celular mediada por IFN-γ que limita la producción del factor de necrosis 
tumoral alfa (TNF-α) y quimiocinas [4, 9]. 
Otra citocina importante en la respuesta inmune contra M. tb es el TNF-α, que se requiere 
para la adecuada formación y mantenimiento del granuloma, orquestar el tráfico de 
macrófagos y leucocitos así como favorecer la respuesta inmune adaptativa [13]. El 
22 
 
granuloma es una estructura organizada, formada por la agregación de macrófagos 
maduros o macrófagos epitelioides y otros tipos celulares como células B, NK, DC, 
neutrófilos y que sirve como barrera de contención para el proceso infeccioso [19]. Se ha 
demostrado en el ratón que el TNF-α es la principal citocina responsable de la formación y 
mantenimiento de granuloma, ya que los ratones deficientes en TNF-α o que presenten 
mutaciones en los genes que codifican para los receptores tipo I y tipo II de TNF-α, son 
más susceptibles a la infección y esto tiene como resultado muerte y cargas bacterianas 
muy elevadas en comparación con ratones de tipo silvestre [13, 20]. En el modelo murino 
la eliminación de M. tb es principalmente mediada por la producción de óxido nítrico 
inducida por el TNF- α [13]. La principal fuente celular de esta citocina son los macrófagos 
activados, aunque también puede ser secretado por linfocitos T, células NK y mastocitos 
[4]. 
 
23 
 
 
Imagen 1. Patogénesis de la infección por Mycobacterium tuberculosis. El bacilo llega a 
través de las vías respiratorias por inhalación y se sitúa en el tejido pulmonar, principalmente en los 
alveolos de lóbulo superior; los fagocitos presentes en el tejido pulmonar internalizan a la bacteria y 
migran a los nódulos linfáticos locales (nódulos de la zona mediastinal y supraclavicular), donde 
presentan antígenos y activan a los linfocitos vírgenes. Una vez activados, los linfocitos T proliferan 
y adquieren funciones efectoras, que ejercen después de migrar al sitio de la infección. (Imagen 
modificada desde: Cooper A. 2003) 
 
24 
 
INFECCIÓNPOR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH) 
Emerge una nueva enfermedad 
El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) se describió por primera vez el 5 de 
Junio de 1981 en el reporte semanal de morbi-mortalidad publicado por el Centro para el 
Control de Enfermedades (CDC) en Atlanta GA, Estados Unidos. Los médicos habían 
registrado varios casos de pacientes con enfermedades poco frecuentes tales como el 
sarcoma de Kaposi, infecciones por Pneumocystis carinii y tumores de lento crecimiento 
[21]. En poco tiempo se identificó que el principal grupo de riesgo para esta enfermedad 
eran hombres homosexuales [22]. 
Posteriormente se observó que esta nueva enfermedad afectaba también a pacientes con 
hemofilia, receptores de transfusiones sanguíneas y usuarios de drogas intravenosas. 
Para el año de 1982 ya se podían identificar varios casos de padres e hijos de aquellos 
individuos afectados. En este mismo año (1982) el CDC publicó una definición 
operacional de SIDA basada en los principales signos y síntomas de la enfermedad, “El 
SIDA describe a una enfermedad adquirida que resulta en una deficiencia del sistema 
inmune. En Francia, Portugal y España se le conoce como SIDA, que quiere decir 
síndrome de inmunodeficiencia adquirida” 
La mayor parte de estos pacientes murieron sin explicación médica convincente sobre la 
etiología de fondo que les llevo a presentar este tipo de infecciones oportunistas. Un sin 
número de hipótesis fueron propuestas, pero desde el inicio se hizo evidente que estos 
pacientes tenían en común un estado de inmunodeficiencia caracterizada por una baja 
frecuencia de células T CD4+ en sangre periférica [21]. 
Aun cuando el síndrome había sido identificado y recibido un nombre que lo describía, la 
causa etiológica era desconocida al igual que el mecanismo de transmisión y los 
medicamentos capaces de curarla y/o prevenirla. El estudio de estos pacientes llevo a la 
25 
 
comunidad científica a proponer que el agente etiológico más probable era un virus. De 
esta forma investigadores de diversos países se dieron a la tarea de trabajar en 
colaboración donde se podían compartir tejidos y muestras sanguíneas. En el año de 
1983 en el Instituto Pasteur de Francia, Luc Montagnier, Harald zur Hausen y Françoise 
Barré-Sinoussial descubren al virus de la inmunodeficiencia humana [23]. En abril de 1984 
Robert Charles Gallo en el Instituto Nacional del Cáncer de los Estados Unidos publica 
una serie de 4 trabajos en los que identifica a un virus llamado HTLV-III como responsable 
del SIDA. 
 
¿COMÓ FUNCIONA EL VIRUS? 
Existen dos subtipos principales del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el 1 y el 
2 que pertenece a la familia de los lentivirus. Ambos provienen del SIV (simian 
Immunodeficiency virus) identificado en África. Se ha propuesto que el origen del VIH-1 
fueron los chimpancés que habitan en África Central mientras que el VIH-2 proviene de 
los monos grises (Sooty Mangabey) que habitan el oeste de África. 
Un virus es un fragmento de material genético cubierto de proteínas que carece de pared 
celular y solo puede replicarse dentro de la célula huésped. Los virus tienen muy pocos 
genes comparados con otros organismos, el VIH cuenta con 10 genes aproximadamente 
en comparación con el virus de la viruela que tiene entre 200 y 400 genes. 
El material genético de la mayor parte de los virus es ácido desoxirribonucleico (DNA por 
sus siglas en inglés); sin embargo, algunos virus como el VIH tienen en su lugar al ácido 
ribonucleico (RNA por sus siglas en inglés) y son llamados retrovirus. El VIH pertenece a 
la familia de los lentivirus lo que significa que son de “acción o efecto” lento. En el humano 
26 
 
la infección por lentivirus lleva al desarrollo de enfermedad en un período de tiempo largo 
y suelen afectar el sistema inmunológico y el sistema nervioso central [24]. 
El VIH al igual que otros virus debe invadir las células para replicarse. Una vez dentro de 
la célula huésped, el VIH forma nuevas partículas virales convirtiendo su RNA en DNA 
para así formar nuevas cadenas de RNA. Esta conversión del material genético es llevada 
a cabo por una enzima llamada transcriptasa reversa la cual cambia de RNA a DNA y 
nuevamente a RNA. Una vez que están listas las copias virales salen de la célula para 
continuar el proceso infeccioso. 
El VIH-1 y VIH-2 se replican en células del sistema inmune, son considerados como 
patogénicos, aunque el estado de inmunodeficiencia puede ser menos grave en 
individuos infectados con VIH-2 [25]. Los macrófagos y las células T CD4+ activadas son 
los principales blancos de la infección por el VIH [25]. La frecuencia de las células que 
contienen DNA viral es de cinco a diez veces mayor en los tejidos linfoides que en las 
células mononucleares en sangre periférica y la diferencia en la replicación viral en tejidos 
linfoides excede a la de la sangre por 10 a 100 veces, por lo que el virus se acumula 
principalmente en nódulos linfoides [25]. 
La infección por VIH se caracteriza por una fase aguda de intensa replicación viral y 
diseminación a los nódulos linfáticos; una fase crónica, a menudo asintomática, con 
activación inmune persistente; y finalmente una fase avanzada caracterizada por pérdida 
en las funciones de la células CD8+, y severa depleción de células CD4+, lo que 
finalmente lleva al paciente, a adquirir el síndrome de inmunodeficiencia humana [26]. 
ORIGEN VIH-1 
Algunos virus filogenéticamente relacionados al VIH, son lentivirus que infectan a simios 
denominados como SIV. Los distintos virus que causan inmunodeficiencia en simios son 
27 
 
denominados colectivamente con las siglas SIV y seguidas de un sufijo para indicar la 
especie de origen ya que se encuentran en varios primates incluyendo entre otros a los 
monos verde africanos, monos gris africanos, mandriles, chimpancés y otros [24]. 
Sorpresivamente, gran parte de estos virus, parecen no ser patogénicos en sus 
hospederos naturales, a pesar de agruparse en un solo grupo filogenético junto con el 
virus humano. 
En estudios donde se han tomado muestras del VIH-1 alrededor de todo el mundo se ha 
logrado establecer que este virus es altamente heterogéneo en relación a su genética, lo 
cual indica una rápida y elevada tasa de evolución [27]. El VIH-1 se puede clasificar en 
tres subtipos distintos con una prevalencia distinta para cada uno de ellos. Los grupos N y 
O, son poco frecuentes y ampliamente restringidos a Camerún y países aledaños. La gran 
mayoría (quizás el 98%) de las infecciones por VIH a nivel mundial, son ocasionadas por 
el VIH-1 del grupo M [27]. 
Un virus genéticamente relacionado con el VIH-1 fue identificado en 1989 en Gabón [27]. 
Este virus pertenece a la familia de virus de la inmunodeficiencia en simios (SIV), y fue 
aislado en dos chimpancés (Pan Troglodytes) cautivos, sin embargo durante muchos 
años no se consideró realmente a los chimpancés como la fuente del VIH, debido a que 
se desconocía si estos podían infectarse en la vida silvestre [27]. Durante la década 
siguiente alrededor de mil chimpancés fueron analizados encontrando solamente un caso 
de infección por SIV en un chimpancé originario de Bélgica. Esto llevo a los 
investigadores a considerar que tanto los humanos como los chimpancés habían sido 
infectados por una fuente distinta [24, 27]. 
Posteriormente, nuevos análisis de DNA mitocondrial (DNAmt) fueron utilizados para 
conocer la subespecie a la que correspondían los ejemplares infectados por el SIV. 
Primero se caracterizaron las subespecies con base en las diferencias genéticas entre las 
28 
 
4 subespecies de chimpancés africanos, (Pan troglodytes verus, Pan troglodytes ellioti, 
Pan troglodytes troglodytes y Pan troglodytes schweinfurthii) [27]. En las secuencias de 
DNAmt se encontró que los dos chimpancés de Gabón pertenecían a la sub especie Pan 
troglodytes troglodytes, y eltercero, corresponde a la subespecie Pan troglodytes 
schweinfurthii y posteriormente se confirmó que la vasta mayoría de los mil chimpancés 
pertenecían a la sub-especie Pan troglodytes verus [24, 27]. Entonces la escasa 
frecuencia de chimpancés infectados con el SIV, podía ser explicada por la ausencia de 
infección en la subespecie que había sido ampliamente analizada. 
Las cepas virales identificadas en los chimpancés forman un grupo monofilético en 
conjunto con todas las cepas de VIH-1 dejando fuera al virus encontrado en el espécimen 
de Bélgica. Todas las caracterizaciones subsecuentes han conformado un grupo de virus 
subespecie-especifico, lo cual explica la inusual divergencia entre las cepas aisladas de 
Gabón y Bélgica. Mediante todas estas observaciones se ha podido implicar a una 
subespecie única, Pan troglodytes troglodytes como la fuente del virus humano [27]. 
ORIGEN VIH-2 
En 1986 un virus morfológicamente similar, pero antigénicamente distinto al VIH-1 fue 
descubierto como el causante de SIDA en pacientes en el oeste de África [24]. Este nuevo 
agente denominado virus de la inmunodeficiencia humana-2 (VIH-2), guarda una relación 
lejana con respecto al VIH-1, pero estrecha con el SIV que causa inmunodeficiencia en 
macacos [24]. En 1989 un virus ampliamente relacionado al VIH-2 se encontró en el mono 
gris africano (sootey mangabey, SIVsm), y este virus presentaba una elevada prevalencia 
entre animales cautivos y también en los que viven de manera silvestre, y además no es 
patogénico en su hospedero natural [24, 28]. 
29 
 
Mediante estos hallazgos se estableció que el mono gris africano es la principal fuente del 
VIH-2, y el hecho de que este es habitualmente cazado por humanos, como una medida 
de seguridad para la agricultura del oeste de África, ofrece una posible ruta de transmisión 
al ser humano [24]. 
Desde el hallazgo del virus de tipo 2, se han identificado ocho distintos linajes los cuales 
se han denominado como grupos A-H, por homología con el VIH-1, aunque solo los 
grupos A y B se han diseminado entre los humanos en un grado apreciable [24, 27]. El 
VIH-2 del linaje A es encontrado principalmente en África del Oeste, mientras que el linaje 
B predomina en Cote d’Ivoire. En tanto los demás linajes se encontraron inicialmente en 
un solo individuo cada uno, esto sugiere una incidencia de infección muy baja, con una 
muy limitada diseminación secundaria [24]. 
Es importante destacar que la mayoría de los individuos infectados con el VIH-2 no 
progresan a SIDA y aquellos que si desarrollan el síndrome presentan síntomas clínicos 
indistinguibles de los pacientes infectados con VIH-1. Además las personas infectadas 
con VIH-2 cursan con cargas virales que tienden a ser menores con respecto a quienes 
están infectados con el VIH-1, este hecho podría explicar la baja tasa de transmisión y la 
ausencia de transmisión materno-fetal [24]. 
TROPISMO 
Debido a que los pacientes con SIDA mostraron como característica común disminución 
de la población de células CD4, fue lógico sospechar que estas células podrían ser el 
blanco principal del VIH. En 1986 se confirmó que la glicoproteína CD4 cuya función 
normal es actuar como correceptor del MHC clase II durante el reconocimiento de 
antígenos por células T, es también el receptor primario para el VIH [29]. Posteriormente 
se estableció que el VIH requería de algún otro elemento para realizar una infección 
30 
 
exitosa, ya que el receptor CD4 solo, no permitía la infección en un modelo con línea de 
células no humanas, transfectadas para que expresarán la molécula CD4 humana [30]. 
En 1996 se identificó otra proteína con una estructura característica de la familia de 
receptores acoplados a proteínas G que permitía la fusión de las membranas viral y 
citoplasmática y con ello la entrada del VIH a la células CD4+, esta proteína fue llamada 
en un inicio fusina y ahora es conocida como receptor CXCR4 [30]. 
Antes de la identificación del correceptor CXCR4, ya era conocido que el VIH se replicaba 
en cultivos con líneas celulares de linfocitos CD4 y en macrófagos derivados de 
monocitos, identificando de esta forma cepas de virus con tropismo por linfocitos T 
(Tropismo-T o T-trópico ), o con tropismo por macrófagos (Tropismo-M o M-trópico) [30]. 
Este hecho hizo pensar que las cepas virales M-trópicas, podrían utilizar un correceptor 
distinto a las cepas T-trópicas [30]. El primer indicio de este hecho se reportó en 1995, 
cuando se demostró que quimiocinas-β como RANTES, MIP-1α y MIP-1β producidas por 
linfocitos CD8, inhiben la actividad del VIH. Estas quimiocinas tienen como receptor 
común a CCR5 el cual pertenece a la familia de receptores de quimiocinas, y al igual que 
CXCR4, tiene la estructura común de los receptores que se acoplan a la proteína G, con 
siete dominios transmembranales [30]. Finalmente estos hechos, tanto la supresión de 
actividad viral con el uso de quimiocinas-β y la similitud molecular de CCR5 con CXCR4 
llevaron a la identificación de CCR5 como el correceptor para las cepas de VIH M-
trópicas. 
Actualmente se ha propuesto una nueva clasificación para las distintas cepas de VIH-1, 
en las cuales se denomina con el indicativo R5 a los aislados virales que utilizan CCR5 
como correceptor y no utilizan CXCR4, mientras que las cepas que utilizan el correceptor 
CXCR4 y no utilizan CCR5, se denominan virus X4. Adicionalmente se han identificado 
31 
 
aislados virales que pueden utilizar ambos correceptores a los cuales se les denomina 
virus con tropismo dual [30]. 
CICLO DE REPLICACIÓN DEL VIH 
Los virus VIH-1 y VIH-2 ingresan en los linfocitos T CD4+ vía los correceptores CCR5 y 
CXCR4. CXCR4 es expresado sobre linfocitos T vírgenes, mientras que el CCR5 se 
expresa en linfocitos T activados y efectores/memoria [25]. 
El VIH inicia la interacción con la superficie de la célula blanco mediante las glicoproteínas 
gp120 y gp41 situadas en el exterior de las partículas virales. Para que el virus forme la 
primera unión con la célula blanco, la glicoproteína gp120 se une al receptor CD4 y 
después a un correceptor secundario, que en la mayor parte de los casos es CCR5 o 
CXCR4 [31]. Este reconocimiento es indispensable para que el virus llegue a penetrar en 
la célula y continúe con el proceso de infección (Imagen 2). 
Una vez reconocido el virión por los receptores de superficie, se vacía dentro de la célula 
fusionándose la envoltura lipídica del virión con la membrana plasmática de la célula. RNA 
mensajeros que forman el genoma viral y sus proteínas asociadas están protegidos por la 
cápside y la nucleocápside, y todo este conjunto es internalizado al citoplasma en donde 
se elimina la cubierta proteica dejando al RNA del virus libre en el citoplasma para ser 
procesado. La enzima transcriptasa reversa, sintetiza DNAc (DNA complementario, 
monocatenario) a partir de una cadena de RNA viral formándose una molécula hibrida 
DNA/RNA. En un segundo ciclo de replicación se complementa la cadena de DNA 
formando así DNA de doble cadena lineal [31]. 
El paso siguiente es la integración del genoma viral en el genoma de la célula huésped. 
Para ello ocurre una translocación de la molécula de DNA viral del citoplasma al núcleo, y 
por efecto de una enzima integrasa contenida en el cápside viral, se inserta el DNA viral 
32 
 
en el DNA celular. Posteriormente la información genética del virus será transcrita por los 
elementos que conforman a la maquinaria transcripcional de la célula hospedera [31]. El 
producto es ácido ribonucleico mensajero (mRNA por sus siglas en inglés) complejo 
(constituido por intrones y exones) que debe ser procesado para poder ser traducido. Una 
vez procesado, el mRNA puede salir del núcleo a través de los poros nucleares. 
En el citoplasma el mRNA es traducido, dando origen a poliproteínas, las cuales deberán 
ser escindidas por una tercera enzima viral quees una proteasa específica. Las proteínas 
del virus se asocian con mRNA provirales, para formar los componentes internos de la 
estructura del virión, los que constituyen la cápside y su contenido. 
El último paso es la gemación, cuando los nucleoides víricos inmaduros se aproximan a la 
membrana plasmática y se hacen envolver en una vesícula que termina por 
desprenderse, formando un nuevo virión o partícula viral [32]. En cada célula infectada se 
ensamblan varios miles de nuevos virus lo que finalmente ocasiona la muerte de la célula 
hospedera. 
La terapia antirretroviral se enfoca en inhibir la acción de las tres enzimas virales 
integrasa, proteasa y transcriptasa reversa así como compuestos químicos cuya función 
es bloquear la fusión y la entrada del virus a la célula (imagen 2) [33]. 
33 
 
 
Imagen 2. Ciclo de replicación del VIH y blancos de la terapia antirretroviral. (Imagen 
modificada desde: Fauci AS, Nat Med 2003) 
TRANSMISÓN DEL VIH 
La vía principal de transmisión del VIH es por contacto sexual [26]. Otras formas de 
transmisión menos frecuentes incluyen: exposición a productos de la sangre, uso de 
agujas contaminadas y transmisión materno-fetal [26]. 
La infectividad del VIH es baja si se compara con el resto de los patógenos asociados con 
enfermedades de transmisión sexual (ETS). La transmisión homosexual entre varones 
tiene mayor eficiencia y por ello se presenta con mayor frecuencia. Esto se debe a la 
conducta sexual que caracteriza a este grupo (mayor número de parejas, prácticas con 
mayor potencial de lesionar las mucosas). La transmisión heterosexual es de menor 
eficiencia y debido a ello las tasas globales de infección son menores en comparación con 
34 
 
la población homosexual [34]. En cualquier caso, la transmisión está ampliamente 
condicionada por múltiples factores descritos a continuación. 
 Infectividad del individuo portador: incrementada en presencia de grandes 
concentraciones de virus, en estado avanzado de la enfermedad o en la primo 
infección. De hecho se ha podido establecer que por debajo de cierto umbral para 
la carga viral plasmática (<1500 copias/ml) la transmisión prácticamente no se 
produce [35]. 
 Conducta sexual: Determina un grado variable de transmisión en función de 
factores como: 
o Número de relaciones sexuales: El riesgo de transmisión incrementa de 
manera directa con el número de relaciones con un portador del virus. 
o Vía y manera del contacto: la estimación de que el virus se transmita de 
manera exitosa, varía entre las distintas formas de contacto, siendo la 
relación anal receptiva la más riesgosa con una estimación de contagio de 
1 en 10 a 1 en 1600 [34]. 
o Lesiones en la mucosa: aunque se sabe que la transmisión puede 
producirse a través de la mucosa intacta, la presencia o generación de 
lesiones durante el contacto sexual incrementan presencia y exposición de 
macrófagos y células de Langerhans y con ello la posibilidad de ser 
infectado por el virus. 
La transmisión también se presenta por exposición a productos de la sangre, lo cual 
incluye a un grupo de prácticas médicas que en un inicio contribuyeron de manera 
importante a incrementar los casos de infección por VIH. 
35 
 
Transfusión sanguínea: en caso de que la sangre esté contaminada con el VIH, la 
probabilidad de infectar al receptor es de 60%-95% de los casos. Desde que se aplica la 
búsqueda sistemática de anticuerpos del VIH en todas las muestras de sangre para 
trasfundir -1985 - el riesgo de infección por transfusión se ha convertido en un riesgo 
teórico residual [36]. Tan sólo escaparían al control los hipotéticos casos de donantes que 
no se autoexcluyesen a pesar de sus prácticas de alto riesgo y que se encuentren en la 
fase de primo infección, aún sin anticuerpos detectables en sangre [36]. 
Trasplantes: Los órganos vascularizados de un paciente infectado obviamente podrían 
transmitir la infección al receptor, lo que ha ocurrido en múltiples casos, sobre todo antes 
de 1985. Estar consciente sobre la infección por el VIH en el donante es uno de los 
elementos críticos en la prevención. Se ha documentado que muestras no vascularizadas, 
liofilizadas o tratadas con alcohol (hueso, córneas, tendones, fascias), procedentes de 
donante infectado, no han transmitido la infección [36]. 
Uso de drogas por vía parenteral: Este hábito es responsable de una muy importante 
proporción de casos de infección por VIH en el mundo occidental, de manera directa 
(compartiendo las jeringas de inyección) o indirecta (transmisión sexual a las parejas de 
los usuarios de drogas). La transmisión del virus es más eficiente cuando se produce por 
el acto de compartir instrumentos para drogadicción intravenosa, que en las relaciones 
sexuales. En el comienzo de la pandemia, en poco tiempo las comunidades de usuarios 
de drogas por vía parenteral pasaron a tener tasas de infectados muy altas [36]. 
Transmisión perinatal o materno-fetal: La transmisión de madre a hijo puede producirse 
principalmente durante el parto (18%) debido a la exposición e ingestión por parte del feto, 
de secreciones y sangre maternas contaminadas durante el parto vaginal, durante la 
gestación (6%) o en el postparto a través de la leche materna (4%). En conjunto por estos 
mecanismos es ocasionado el 90% de los casos de infección por VIH en niños en todo el 
36 
 
mundo [37]. Algunos factores relacionados a la madre que incrementan la posibilidad de 
infectar al infante son enfermedad avanzada, cargas virales plasmáticas elevadas, 
tabaquismo y uso activo de drogas por vía intravenosa. Actualmente, con el tratamiento 
antirretroviral, cesárea y suprimir la lactancia se han conseguido tasas de transmisión tan 
bajas como del 1.6% [36]. 
37 
 
INMUNOPATOGENESIS DEL VIH. 
El curso clínico de la infección por el VIH incluye tres estadios principales: 1) infección 
primaria, 2) latencia clínica y 3) síndrome de inmunodeficiencia humana (SIDA). 
1. Infección primaria: desde el punto de vista virológico se presenta un incremento en 
el número de copias de RNA viral por ml (más de 107) de sangre periférica. Este 
fenómeno representa la diseminación sistémica del virus principalmente a los 
nódulos linfáticos [38]. Este incremento inicial en la replicación viral es seguido por 
la disminución de las copias virales en sangre periférica como resultado de la 
activación de la respuesta inmune. Esta disminución en la viremia se ha asociado 
con la recuperación del síndrome viral agudo lo cual generalmente ocurre 6 a 8 
semanas después del inicio de los síntomas [39]. 
2. Latencia clínica: se caracteriza porque los pacientes mantienen niveles 
relativamente bajos de copias virales en sangre periférica en ausencia de 
síntomas clínicos, sin embargo, al mismo tiempo incrementan la replicación viral a 
nivel de tejido linfoide. Durante esta etapa la concentración de linfocitos T CD4+ 
fluctúa entre 200 y 500 células/μl [40, 41]. A nivel inmunológico se puede 
identificar un incremento relativo en la frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos 
para proteínas virales (nef, tat) [40, 42, 43]. 
3. SIDA o enfermedad avanzada: En esta etapa se incluye a todos aquellos 
pacientes con niveles de linfocitos T CD4+ menores a 200 células/μl o aquellos 
que tengan manifestaciones clínicas que definen al SIDA [41]. En esta etapa 
también se observa que el número de copias virales en sangre periférica 
incrementa nuevamente a niveles semejantes a los observados en el tejido 
38 
 
linfoide. Los pacientes desarrollan un estado de inmunosupresión severa 
secundario a la destrucción del tejido linfoide crónicamente inflamado. 
 
TUBERCULOSIS Y VIH 
La reducción en el número de linfocitos T CD4+ es uno de los principales eventos que 
contribuyen al desarrollo y o reactivación de la tuberculosis pulmonar entre los pacientes 
VIH positivos [44]. 
Es la condición de inmunodeficiencia ocasionada por lainfección por VIH, la que facilita la 
adquisición secundaria de otras infecciones por patógenos oportunistas. Entre los países 
con distintas tasas de prevalencia, los pacientes VIH positivos tienen una probabilidad de 
20 a 37 veces mayor de contraer o reactivar TB, en comparación con los pacientes VIH 
negativos. En los datos de la OMS disponibles en 2008, se indica que de los 9.27 millones 
de casos incidentes de TB (2007), 1.37 millones correspondieron a pacientes VIH 
positivos. TB es la infección oportunista más común y la causa individual de muerte más 
frecuente entre las personas infectadas por el VIH. La OMS reporta que en 2009, 456,000 
pacientes VIH positivos murieron después de contraer TB [1]. 
39 
 
PROTEINA TIM3 (T CELL INMUNOGLOBULIN AND MUCIN DOMAIN) 
Las proteínas de la familia TIM (T-cell immunoglobulin and mucine domain, por sus siglas 
en inglés) han sido descritas de manera reciente como importantes reguladoras de la 
respuesta inmune [45]. Como su nombre lo indica, estas proteínas fueron inicialmente 
descritas como moléculas que se expresan en la superficie de los linfocitos T. Tim-3 se 
expresa en los linfocitos T CD4 que secretan IFN-γ, linfocitos T CD8+, DC y células de 
origen mieloide como los monocitos y macrófagos [46, 47]. 
 
ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS TIM 
La familia de proteínas TIM en el ratón comprenden ocho genes, de los cuales solo cuatro 
codifican proteínas funcionales (TIM-1 – TIM-4), en tanto que en el humano se han 
identificado tres genes que codifican para Tim-1, Tim-3 y Tim-4 [43]. Cada uno de los 
genes en el humano, codifica para una proteína de tipo I que se localiza en la membrana 
plasmática celular. La proteína Tim-3 tiene un tamaño de 281 aminoácidos, y una 
homología total de 77% con la proteína murina [48]. La estructura de las proteínas TIM, 
consta de un dominio inmunoglobulina variable (IgV) con dos cadenas anti paralelas, en 
las que se encuentran cuatro cisteínas conservadas en la región variable de todos los 
miembros de la familia TIM, esto indica que son regiones altamente conservadas. El 
dominio mucina, varía considerablemente su longitud entre los distintos miembros de 
esta familia, siendo Tim-3 la molécula con el dominio tipo mucina de menor longitud [43]. 
Esta región es particularmente rica en treonina, prolina y serina. Las proteínas TIM 
atraviesan la membrana celular, mediante un tallo embebido en la bicapa lipídica, y 
continúan al interior de la célula con un dominio citoplásmico, de un tamaño aproximado 
de 42-77 aminoácidos, el cual es el dominio de mayor similitud entre humano y ratón. En 
40 
 
esta región de Tim-1 y Tim-3 se encuentran sitios para fosforilación, pero en el caso de 
Tim-1 existen dos subtipos: uno de ellos es Tim-1a, se expresa principalmente en células 
de hígado humano y no contiene la secuencia de aminoácidos sobre la cual actúa la 
enzima treonin cinasa; el otro subtipo, Tim-1b, se encuentra principalmente en riñón 
humano y conserva dos residuos de treonina, que la hacen susceptible a la fosforilación 
[43]. 
TIM-3 EN INFECCIONES VIRALES 
Tim-3 ha sido involucrado como una molécula que participa en la inmunopatogénesis de 
infecciones de tipo viral ya sea como regulador negativo o estimulando la respuesta 
inmune. Numerosos estudios han documentado que la expresión de Tim-3 se incrementa 
después de la infección crónica por el virus de herpes simple (VHS) o VIH, en distintos 
modelos animales y en estudios de cohortes [49-51]. 
En la infección por el VIH o por los virus de la hepatitis B y C (VHB, VHC), la función de 
Tim-3 es como receptor inhibitorio similar a la de PD-1, (programmed cell death 1), LAG-3 
(lymphocyte activation gene-3) o CTLA-4, asociándose la expresión de estas moléculas 
con un fenotipo exhausto. Adicionalmente, la expresión de Tim-3, se correlaciona en 
muchos casos con los niveles de carga viral y de manera inversa con la cuenta de 
linfocitos T CD4+ en el caso de la infección por VIH [51]. Este fenotipo exhausto de los 
linfocitos T se presenta durante el curso crónico de diversas enfermedades, en el cual, los 
linfocitos T antígeno-específicos, pierden la habilidad de entrar en el ciclo celular 
(proliferar), así como para producir IL-2. Posteriormente, estas células exhaustas dejan de 
secretar otras citocinas como son INF-γ y TNF-α y con ello pierden importantes funciones 
efectoras, incluyendo la capacidad de lisar células infectadas o de activar a células 
fagocíticas [51]. 
41 
 
En el año 2008, Jones y colaboradores demostraron que durante la infección por VIH los 
linfocitos T CD4+ y CD8+ sobre-expresan Tim-3, este fenómeno se asoció con un fenotipo 
disfuncional caracterizado por una capacidad limitada para producir citocinas y una pobre 
respuesta proliferativa. La expresión incrementada de Tim-3 en los linfocitos T CD8+ de 
pacientes VIH+ correlacionó de manera directa con la carga viral y la expresión del 
marcador de activación CD38, y de manera indirecta, con el conteo de linfocitos T CD4+. 
Más aún, algunos pacientes con infección crónica por VIH y bajo tratamiento antirretroviral 
mostraron activación persistente de los linfocitos T evidenciada por la co-expresión de 
CD38 y Tim-3 [51]. El bloqueo de la señalización de Tim-3 con el uso de anticuerpos anti-
Tim-3 humano restauró la capacidad proliferativa y la producción de citocinas en linfocitos 
T antígeno específicos en pacientes VIH+ [51]. 
 
42 
 
 
Imagen 3. Expresión diferencial de Tim-3 en la superficie de células T. En pacientes con 
infección progresiva por VIH, Tim-3 es sobre-expresado en la membrana de las células T CD4+ y 
CD8+; la sobre-expresión ocasiona alteración en la sobrevida, proliferación, funcionalidad y 
producción de citocinas en estas células. 1) Al bloquear la interacción de Tim-3 con su ligando 
mediante la adición de Tim-3 soluble o anticuerpos específicos anti-Tim-3 se restaura la 
funcionalidad de linfocitos en pacientes con infección por VIH. 2) A pesar de existir una pequeña 
población celular que expresa Tim-3 y PD1, la expresión de estas moléculas es distinta en la 
mayoría de las células, lo cual sugiere que estas proteínas definen a distintas poblaciones de 
células T disfuncionales en pacientes VIH+ (Imagen Modificada desde: Kuchroo V.K JEM; 2006) 
 
43 
 
TIM-3 EN OTRAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS 
En el caso de infecciones por bacterias intracelulares como lo es la infección por M. tb, se 
ha demostrado en ratones C57BL/6 infectados con la cepa virulenta H37Rv, que Tim-3 
participa en un mecanismo por el cual se inhibe el crecimiento bacteriano. En un modelo 
murino de infección en aerosol con M. tb se utilizó a Tim-3 (proteína de fusión, Tim3-Ig ) 
como agente inmunoterapéutico y se demostró una reducción en la carga bacteriana en 
órganos blanco (pulmón y bazo) [52]. Posteriormente, en experimentos de infección in 
vitro, se comprobó que macrófagos infectados con M. tb pueden ser activados en 
presencia de la proteína de fusión Tim3-Ig lo cual ocasiona inhibición del crecimiento 
bacteriano mediante un mecanismo independiente de INF-γ y de la enzima sintetasa 
inducible de óxido nítrico (iNOS). La activación de estos fagocitos (gráfico 4) indujo la 
activación de la caspasa-1 y producción de IL-1β, las cuales fueron requeridas para 
mediar la actividad bactericida [52]. Este efecto ocasionado por el tratamiento con Tim3-
Ig, no fue identificado en macrófagos que no expresan a Gal-9 (Gal9-/-) [52]. 
En pacientes con TBP se ha medido la frecuencia de células linfoides y mieloides Tim-3+ 
y se ha identificado que los pacientes con TBP tienen una menor frecuencia de células 
Tim-3+ vs. sujetos sanos (p=0.01). La reducción en la expresión de Tim-3 se localizó 
principalmente en los monocitos (CD33+ CD14+). Posteriormente en un modelo de 
infección in vitro se ha documentado que los monocitos diferenciados a macrófagos 
(MDM) e infectados con M. tb-H37Ra (novirulenta) y M. tb-H37Rv (virulenta) disminuyen 
la expresión de Tim-3 (50%) y Gal-9 (35%) (p<0.05) cuando se compara con MDM no 
infectados. En este trabajo también se identificó que el bloqueo de la interacción Tim-3 y 
Gal-9 con anticuerpos específicos de bloqueo incrementa el crecimiento intracelular 
bacteriano por un mecanismo dependiente de la secreción de citocinas pro-inflamatorias. 
44 
 
 
 
Imagen 4. Mecanismos hipotéticos por los cuales la interacción entre Tim-3 y su ligando 
induce activación de macrófagos o células dendríticas. A) Cuando el ligando de Tim-3 es 
expresado en un macrófago o DC, e interactúa con Tim-3 expresado sobre un linfocito 
Th1, ocasiona activación de la célula fagocítica. B) si el ligando de Tim-3 es expresado 
por otra célula (Linfocito T o B) la interacción con Tim-3 induce activación del macrófago 
indirecta, reduciendo las señales inhibición, o proporcionando señales de activación a 
través de mediadores solubles inducidos por interacciones similares a la del complejo 
TCR-péptido-MHC. (Imagen modificada desde: Kuchroo V.K, Nat. Rev. 2003) 
 
45 
 
GALECTINA 9 
Uno de los ligandos para Tim-3 es Galectina 9 (Gal-9) [46, 52, 53], la cual fue inicialmente 
identificada en pacientes con linfoma de Hodgkin, enfermedad que se caracteriza por una 
elevada frecuencia de eosinofilos [54]. Gal-9, es una lectina que pertenece a una familia 
de 15 miembros y que se caracterizan por tener un dominio de reconocimiento de 
carbohidratos (CRD por sus siglas en inglés) con un tamaño aproximado a 130 
aminoácidos y por su alta afinidad por las β-galactosidasas [55, 56]. Las galectinas tienen 
diversas actividades biológicas como adhesión, agregación celular, proliferación, 
modulación en procesos inflamatorios, activación de muerte celular, y también funciones 
reguladoras en la actividad inmunológica [47, 56]. 
En base a su estructura las galectinas se clasifican en tres grupos: 
1. Galectinas prototipo. 
2. Galectinas quimera. 
3. Galectinas de repetición en tándem. 
Las galectinas prototipo poseen un dominio CRD (galectina 1, 2, 5, 7,10, 11,13,14 y 15), y 
comúnmente forman dímeros mediante interacciones no covalentes para crear lectinas 
bivalentes funcionales [57]. Galectina-3 es el único miembro de las galectinas de tipo 
quimera. Posee un dominio CRD en el extremo C-terminal similar al de las galectinas 
prototipo, y además exhibe un dominio CRD en el extremo N-terminal que es responsable 
de las interacciones entre varias subunidades para formar complejos mediante 
oligomerización [57]. Esta galectina se une a proteínas glicosiladas y participa en el 
reclutamiento de lectinas adicionales para la formación de complejos multivalentes [57]. 
Finalmente el grupo de galectinas de repetición en tándem, al que pertenece Gal-9, 
46 
 
cuenta con dos dominios CRD unidos mediante un péptido. Los dominios CRD de estas 
galectinas pueden reconocer diferentes ligandos simultáneamente [57]. 
Se ha demostrado que Gal-9 modula diversas vías de señalización intra y extracelular 
[46]. Se expresa en monocitos, macrófagos, fibroblastos, células endoteliales y células T 
activadas [58]. Cuando Gal-9 interacciona con Tim-3 incrementa el flujo de calcio 
intracelular, induce agregación y muerte de los linfocitos T CD4+ de tipo Th1 [46]. 
Gal-9 funciona como regulador de la expresión de citocinas involucradas en procesos 
inflamatorios. Kojima y colaboradores, utilizando un modelo experimental animal, 
demostraron el efecto de regulación en la producción de citocinas proinflamatorias a 
través de un tratamiento con una forma soluble de Gal-9 [56]. 
La modulación de la interacción entre Tim-3 y Gal-9 ha mostrado tener importantes 
efectos in vivo. Kuchroo, V. y colaboradores demostraron que el uso de anticuerpos anti-
Tim-3 exacerba la encefalomielitis experimental autoinmune (EAE) mientras que el uso de 
la proteína de fusión de Tim-3 (Tim3-Ig) exacerba la respuesta inmune de tipo Th1. [59, 
60] Estos datos, en conjunto, demuestran la relevancia de la interacción de Tim-3/Gal-9 
regulando la respuesta inflamatoria de tipo Th1 [52]. 
 
 
47 
 
 
48 
 
Imagen 5. Relevancia bioquímica y funcional de los complejos formados por 
galectinas y glicoproteínas. A) representación esquemática de la estructura de 
diferentes miembros de la familia de galectinas. B) representación esquemática de la 
formación de complejos entre galectinas multivalentes y carbohidratos multivalentes. C) 
importancia biológica de los complejos galectinas-glicoproteínas. (Imagen modificada 
desde: Rabinovich G.A; Curr Opin Struct Biol 2008) 
 
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
La TB es la infección oportunista más común y la causa individual de muerte más 
frecuente entre las personas infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana 
(VIH). La asociación epidemiológica entre TB y VIH subraya la importancia de identificar y 
modificar nuevos mecanismos inmunológicos a través de los cuales se pueda hacer más 
eficiente el control o la eliminación de la infección por M. tb. Se ha descrito que tanto la 
elevada expresión de Tim-3, documentada previamente en pacientes VIH+, junto con la 
baja expresión de Tim-3, documentada en pacientes con TBP, se podrían asociar con el 
desarrollo de una respuesta inmune ineficiente. La expresión incrementada de Tim-3 
podría ser deletérea dado que se ha observado que Tim-3 puede mediar un estado de 
activación inmune persistente, mientras que la pobre expresión de dicha molécula sería 
insuficiente para interaccionar con las moléculas disponibles de Gal-9. Consideramos que 
el fino control en la expresión de Tim-3 parece ser un aspecto central en el control de 
algunas enfermedades infecciosas. Es posible que la reducción en la expresión de Tim-3 
en pacientes con VIH secundaria al tratamiento antirretroviral pueda favorecer la 
interacción eficiente de Tim-3/Gal-9 y facilite el control de la infección por M. tb. De ser 
así, la reducción en la expresión de Tim-3 en pacientes con VIH+ que reciben terapia 
antirretroviral, podría ser utilizada como un “marcador biológico” cuya expresión pueda 
asociarse con la probabilidad de desarrollar TB. 
49 
 
 
 
HIPÓTESIS 
La disminución en la expresión de Tim-3 que es secundaria al inicio del tratamiento 
antirretroviral permitirá que la interacción entre Tim-3 y Gal-9 sea eficiente para activar en 
los macrófagos mayor actividad micobactericida que permitirá controlar el crecimiento 
intracelular o eliminar a M. tb. 
OBJETIVOS 
Objetivo General: Evaluar los cambios en la expresión de Tim-3 y Gal-9 en respuesta al 
tratamiento anti-retroviral así como la participación de la interacción entre Tim-3 
(expresado en los linfocitos T) y Gal-9 (expresada en los MDM) en la habilidad de los 
MDM para eliminar a M. tb en células provenientes de pacientes VIH+. 
 
Objetivos Particulares: 
1. Evaluar la expresión de Tim-3 y Gal-9 en linfocitos T CD4+, CD8+, células NK 
(CD16+ CD56+) y monocitos de sangre periférica de pacientes VIH+ y comparado 
con un grupo control (basal, 2 y 6 meses tratamiento anti-retroviral). 
2. Evaluar la participación de la interacción entre Tim-3 y Gal-9 en el control del 
crecimiento bacteriano en pacientes VIH+ versus. sujetos control. 
3. Evaluar la participación de Tim-3/Gal-9 en el control del crecimiento intracelular de 
M. tb con linfocitos de pacientes VIH+ y controles. 
50 
 
4. Evaluar la participación de citocinas proinflamatorias secretadas por los MDM 
infectados con M. tb -H37Rv in vitro en el control del crecimiento bacteriano 
mediado por linfocitos T de pacientes VIH+ y donadores sanos. 
 
51 
 
PACIENTES Y MÉTODOS 
Diseño del estudio 
Prolectivo, longitudinal, observacional. 
 
Pacientes 
Se invitó a participar a todos los pacientes consecutivos con diagnóstico de infección por 
VIH que acudieron al Departamento de Infectología, Clínica de VIH/SIDA del Instituto 
Nacional de CienciasMédicas y Nutrición Salvador Zubirán en el período comprendido 
entre agosto del 2011 a diciembre del 2012. 
 
Criterios de Inclusión: 
1. Hombres o mujeres mayores de 18 años. 
2. Diagnóstico de VIH confirmado por Western-blot. 
3. Vírgenes a tratamiento antirretroviral. 
4. Con más de 100 CD4/ml. 
 
Criterios de no inclusión: 
1. Embarazo (esto se documenta mediante determinación de gonadotropina 
coriónica humana). 
52 
 
2. Neoplasia activa (excepto sarcoma de Kaposi de localización no-visceral o 
carcinoma escamoso o basocelular de piel). 
3. Uso de cualquiera de los siguientes medicamentos en los 180 días previos al inicio 
del estudio: quimioterapia sistémica, corticoesteroides e inmunomoduladores 
(factores de crecimiento, inmunoglobulinas, interleucinas e interferones). 
4. Enfermedad hepática al inicio del estudio (documentada por PFH). 
5. Pacientes con infecciones oportunistas o infecciones relacionadas a VIH. 
 
Criterios de Eliminación: 
1. Que el paciente sea hospitalizado por cualquier motivo. 
2. Pacientes que por reacciones adversas tengan que suspender el tratamiento 
antirretroviral. 
3. Pacientes que retiren su consentimiento. 
 
TAMAÑO DE MUESTRA 
El número total de pacientes y controles sanos será de 10 en cada grupo. 
 
CONSIDERACIONES ÉTICAS 
53 
 
El estudio se apega a los principios de la Declaración de Helsinki para la investigación en 
seres humanos. El estudio fue aprobado por el Comité de Ciencia y Bioética del Instituto 
Nacional de Enfermedades Respiratorias (Protocolo No. C29-10). 
 
CONSENTIMIENTO INFORMADO 
Cada participante (casos y controles) firmó una carta de consentimiento informado 
después de haber recibido una explicación amplia de los objetivos y beneficios esperados 
del protocolo, así como de sus posibles complicaciones. 
 
 
54 
 
MATERIALES Y MÉTODOS 
Reactivos 
Perlas inmunomagnéticas acopladas a un anticuerpo monoclonal anti-CD14 (Miltenyi-
Biotech, Bergisch Gladbach, Germany). Lymphoprep densidad 1.077 (AXIS-SHIELD, 
Oslo, Norway). MEM aminoácidos no esenciales, MEM aminoácidos esenciales, Piruvato 
de sodio, L-glutamina, medio de cultivo RPMI-1640, suero fetal bovino, azul de tripano 
obtenidos de Gibco (Invitrogen, Life Technologies New York, USA). Agar Middlebrook 
7H10, asparagina, enriquecimiento para medio OADC (Difco Becton Dickinson, USA). 
Glicerol, Dimetil-Sulfóxido Tween 80, Tween 20 y sales utilizadas para la preparación de 
los amortiguadores fueron obtenidos de Sigma (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, 
Germany). Anticuerpo murino IgG anti-human Tim-3 donado por el Doctor Vijay K. 
Kuchroo, Escuela de Medicina de Harvard. Anticuerpo murino anti-human Gal-9, 
Anticuerpo murino anti-human PD1, anticuerpo murino para control de isotipo IgG1 
(Biolegend, California USA). 
 
 
 
 
 
 
55 
 
 
Tabla 1. Anticuerpos monoclonales empleados en este estudio. 
 
 
Obtención de células mononucleadas (CMN) e inmunofenotipificación 
A partir de una muestra de 16 mL de sangre periférica se obtuvieron las células 
mononucleadas (CMN) por centrifugación a 1300 g durante 15 minutos a 15°C en tubos 
BD Vacutainer CPT. Posteriormente se resuspendieron en medio de cultivo 
complementado (RPMI 1640, HEPES 10mM, L-glutamina 200 mM) y se evaluó la 
viabilidad celular por el método de exclusión del colorante azúl tripano. Para la citometría 
de flujo multiparamétrica las células fueron teñidas durante 30 minutos con anticuerpos 
monoclonales contra las siguientes marcas: CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD38, CD56, 
PD-1, Tim-3 y Gal-9. Para cada una de las tinciones se incluyeron los respectivos 
controles de isotipo y FMO (fluorescence minus one, por sus siglas en ingles). 
Posteriormente las células se suspendieron con solución amortiguadora salina de fosfato 
Analito Detector Fluorocromo Fabricante No. de 
Catalogó 
Clona 
CD3 Anti-CD3 PE/Cy5 Biolegend 300310 HIT3a 
CD3 Anti-CD3 APC-Cy7 Biolegend 300318 HIT3a 
CD3 Anti-CD3 PE-Cy7 Biolegend 300316 HIT3a 
CD3 Anti-CD3 APC Biolegend 300312 HIT3a 
CD4 Anti-CD4 PE/Cy7 Biolegend 300512 RPA-T4 
CD4 Anti-CD4 PE Biolegend 300508 RPA-T4 
CD4 Anti-CD4 APC/Cy7 Biolegend 300518 RPA-T4 
CD8 Anti-CD8 PE/Cy7 Biolegend 300914 HIT8a 
CD8 Anti-CD8 FITC BD Phamingen 555366 HIB19 
CD14 Anti-CD14 PE Biolegend 325606 HCD14 
CD16 Anti-CD16 FITC Biolegend 302006 3G8 
CD16 Anti-CD16 APC/Cy7 Biolegend 302018 3G8 
CD28 Anti-CD20 FITC Biolegend 302906 CD28.2 
CD56 Anti-CD56 FITC Biolegend 318304 HCD56 
TIM-3 Anti-TIM3 PE Biolegend 345006 F38-2E2 
Gal-9 Anti-GAL9 PE Biolegend 348906 9M1-3 
HLA-DR Anti-HLA-DR APC/Cy7 Biolegend 307618 L243 
56 
 
(PBS) y se fijaron en paraformaldehído al 1%. Las muestras fueron ¿adquiridas? en un 
citometro FACSAria (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJo (Tree Star). 
 
Diferenciación de monocitos a macrófagos 
Los monocitos fueron purificados a partir de las CMN mediante perlas inmunomagnéticas 
acopladas a un anticuerpo monoclonal murino de isotipo IgG2a anti-CD14. Posteriormente 
se sembraron un total de 1x105 células en placas de cultivo de 96 pozos. Para la 
diferenciación de los monocitos en macrófagos los monocitos purificados fueron 
cultivados durante 7 días en medio complementado (RPMI 1640, HEPES 10mM, L-
glutamina 200 mM, SFB 10%) y se obtuvieron macrófagos maduros. El fenotipo se 
confirmó en base a su morfología y expresión de superficie de los marcadores CD14 y 
CD68. 
 
Modelo de infección in vitro de macrófagos humanos con M. tuberculosis 
La cepa M. tb -H37Rv fue cultivada hasta la fase logarítmica de crecimiento en medio 
líquido Middlebrook 7H9 complementado con 0.05% Tween 80 y medio de 
enriquecimiento ADC (BD) a 37ºC. Posteriormente, las alícuotas en las que se cuantificó 
la concentración de bacterias y se mantuvieron a -70°C. Para la infección in vitro se 
descongeló una alícuota de M. tb -H37Rv y se centrifugó a (5500 g, durante 8 minutos) se 
suspendieron en 1.0 mL de medio de cultivo RPMI 1640 complementado con 2% suero 
humano, 10% suero fetal bovino y 0.05% tween 80 para favorecer la fagocitosis [52]. Se 
preparó la dilución correspondiente y se adicionó a los macrófagos a una relación 10:1. 
La duración de la infección in vitro fue de 2 horas. Posteriormente para eliminar el exceso 
de bacterias libres, se resuspendió al menos 3 veces con medio RPMI suplementado sin 
antibiótico y se continuo con las diferentes condiciones experimentales establecidas. 
57 
 
 
Evaluación del crecimiento micobacteriano 
El crecimiento micobacteriano se evaluó 24 (inóculo inicial) y 72 horas después de que los 
MDM fueron infectados o las diferentes fracciones celulares fueron adicionadas al cultivo 
[52]. Los macrófagos en cultivo fueron lisados durante 3 minutos con agua destilada y 
posteriormente se inocularon 3 diluciones seriales en placas de agar Middlebrook 7H11 
que se incubaron durante 3 semanas a 37ºC dentro del laboratorio de bioseguridad nivel 3 
[52]. Las unidades formadoras de colonias fueron contadas 3 semanas después. Este 
ensayo se realizó con cada una de las muestras de los pacientes y controles n=10. 
 
Ensayos de bloqueo de la interacción entre Tim-3 y Gal-9. 
La interacción Tim-3/Gal-9 se bloqueó y previo al co-cultivo se incubaron los linfocitos T 
autólogos con anticuerpos específicos anti-Tim-3 (clona 4A4, 10μg/mL) o los macrófagos 
infectados con anticuerpos anti-Gal9 (clona 9M1-3 Biolegend, 10μg/mL). En todos los 
experimentos se incluyeron los respectivos controles de isotipo [52]. 
 
Tratamiento con IL-1β 
MDM infectados con M. tb fueron tratados con IL-1β a la concentración final de 10 ng/mL. 
En los días 1 y 4 post-infección las células fueron lisadas y se inocularon diluciones 
seriales en placas de agar Middlebrook 7H10. Las unidades formadoras de colonias se 
enumeraron 21 días después de la infección [61]. 
 
Medición de IL-1β, IFN-γ y TNF-α 
58 
 
Los sobrenadantes de los cultivos fueron recuperados