Validacion-para-la-determinacion-de-protenas-en-alimentos-por-el-metodo-Micro-Kjeldahl

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
 
VALIDACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS EN 
ALIMENTOS POR EL MÉTODO MICRO-KJELDAHL 
 
 
 
TRABAJO ESCRITO VÍA CURSOS 
DE EDUCACIÓN CONTINUA 
 
 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA DE ALIMENTOS 
 
 
 
 
PRESENTA 
ISAURA HERNÁNDEZ RODRÍGUEZ 
 
 
 
 
MÉXICO, D.F. 2011 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: María del Socorro Alpízar Ramos 
 
VOCAL: Profesor: María de los Ángeles Olvera Treviño 
 
SECRETARIO: Profesor: Sergio Velázquez Montero 
 
1er. SUPLENTE: Profesor: Silvia Reyes Salinas 
 
2° SUPLENTE: Profesor: Jorge Rafael Martínez Peniche 
 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
LABORATORIO NACIONAL DE PROTECCIÓN AL CONSUMIDOR 
 
 
ASESOR DEL TEMA: 
Q.F.B. SERGIO VELÁZQUEZ MONTERO 
 
 
 
SUSTENTANTE: 
ISAURA HERNÁNDEZ RODRÍGUEZ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
Este trabajo es el fruto de un gran esfuerzo y apoyo por parte de muchas 
personas a quienes deseo reconocer. 
 
Doy gracias: 
º A mis padres, por darme todo lo que necesitaba y mucho más, por el esfuerzo 
tan grande que han hecho para que mis hermanos y yo pudiéramos salir 
adelante a pesar de todos los baches que encontramos en el camino. Por su 
confianza y soporte en todas las decisiones que tomé. Por darme el empujón 
que necesitaba cuando sentía que ya no podía seguir. Por las cosas tan 
valiosas que me enseñaron y por criarme como la persona que soy, también 
por toda la ayuda que recibí de ustedes. Por inyectarme toda esa alegría y por 
contagiarme de su buen humor. Me siento bendecida y orgullosa de por 
tenerlos en mi vida. Los amo. 
º A mis hermanos, por crecer, reír y llorar conmigo. Gracias porque confiaron 
en mí para poder ayudarlos con lo poco que sé. Espero haber podido 
inspirarlos, porque ustedes me inspiraron a mí. 
º A César por haber llegado a mi vida y darme esperanza. Te amo. 
º A mis amigos y a mis compañeros de Profeco. 
º A Sergio Velázquez y a los miembros del jurado por compartir sus 
experiencias para poder enriquecer este trabajo. 
º A Dios por darme padres, hermanos, familia, una pareja y amigos, sin quienes 
no hubiera logrado lo que hasta hoy soy y tengo. 
º A la UNAM y a la Facultad de Química. Gracias por haberme dado este 
orgullo de ser una universitaria con corazón azul y piel dorada. 
 
México, Pumas, Universidad… 
Isaura Hernández Rodríguez 
 
 
 
 
1 
 
ÍNDICE 
 
1. RESUMEN 3 
2. INTRODUCCIÓN 4 
3. OBJETIVOS 8 
4. MARCO TEÓRICO 9 
4.1. Proteínas 9 
4.1.1. Definición 9 
4.1.2. Proteínas en los alimentos 9 
4.1.3. Importancia de la determinación de proteínas en alimentos 11 
4.2. Método de Kjeldahl 13 
4.2.1. Fundamento 14 
4.2.2. Evolución del método de Kjeldahl 14 
4.2.3. Proceso del análisis 15 
4.2.3.1. Preparación de la muestra 16 
4.2.3.2. Digestión 17 
4.2.3.3. Neutralización 20 
4.2.3.4. Destilación 21 
4.2.3.5. Titulación 22 
4.2.3.6. Blanco 23 
4.2.3.7. Cálculos 24 
4.2.4. Método analítico 25 
4.3. Validación del método analítico 29 
4.3.1. Definición 29 
4.3.2. Métodos que deben validarse 30 
4.3.3. Protocolo de validación 32 
 
2 
 
4.3.3.1. Materiales 34 
4.3.3.2. Equipos 34 
4.3.3.3. Reactivos 34 
4.3.3.4. Material de referencia 36 
4.3.3.5. Parámetros de desempeño 37 
4.3.3.5.1. Recuperación 37 
4.3.3.5.2. Selectividad o especificidad 38 
4.3.3.5.3. Robustez 40 
4.3.3.5.4. Límite de detección 42 
4.3.3.5.5. Límite de cuantificación 43 
4.3.3.5.6. Intervalo de trabajo 44 
4.3.3.5.7. Linealidad 45 
4.3.3.5.8. Repetibilidad 49 
4.3.3.5.9. Precisión intermedia 50 
4.3.3.5.10. Sesgo 51 
5. RESULTADOS 52 
6. ANÁLISIS DE RESULTADOS 76 
7. CONCLUSIONES 78 
8. BIBLIOGRAFÍA 79 
ANEXO I. 82 
ANEXO II. 83 
ANEXO III. 84 
 
 
 
 
 
3 
 
1. RESUMEN 
Se realizó la validación del método analítico para la determinación del 
contenido de proteínas en alimentos por el método de micro Kjeldahl. 
 
En el presente trabajo se describe la validación de un método volumétrico, 
esto como parte de los requisitos establecidos por la Entidad Mexicana de 
Acreditación (ema) para acreditar un método de análisis desarrollado dentro de un 
laboratorio de ensayo. 
 
El propósito de la determinación de proteínas en el Laboratorio Nacional de 
Protección al Consumidor (LNPC) es la de evaluar el cumplimiento de las 
especificaciones establecidas en normas para distintos productos alimenticios o 
bien comprobar la veracidad de la información ostentada en la etiqueta de los 
mismos. 
 
Se demostró mediante el diseño experimental, con la evaluación 
estadística de los resultados y teniendo como base los criterios de aceptación 
permitidos, que el método analítico es selectivo, lineal, preciso y exacto en el 
intervalo de concentraciones estudiadas, además reproducible. Obteniéndose un 
límite de detección 0.0003 g y un límite de cuantificación 0.0008 g de proteína. 
 
De esta manera se establece que las características de desempeño 
cumplen con los requisitos para la aplicación analítica propuesta siendo confiable 
para ser utilizado en la evaluación de las especificaciones de calidad. 
 
 
 
4 
 
2. INTRODUCCIÓN 
Las normas y proyectos de normas existentes en México tienen como 
finalidad establecer las características y/o especificaciones que deben reunir los 
productos y procesos cuando éstos puedan constituir un riesgo para la seguridad 
de las personas o dañar la salud humana (Ley Federal sobre Metrología y 
Normalización). Uno de los propósitos de los análisis que se realizan en el 
Laboratorio Nacional de Protección al Consumidor es informar sobre las 
características y calidad de diversos artículos de interés para el público mexicano 
y verificar el cumplimiento de diversas normas, caso particular: el contenido de 
proteínas. 
 
Por otra parte, el Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios 
de la Secretaría de Salud tiene por objeto la regulación, control y fomento 
sanitario del proceso, importación y exportación, así como de las actividades, 
servicios y establecimientos relacionados con alimentos, bebidas, productos de 
perfumería, belleza, aseo, tabaco, así como las sustancias relacionadas con su 
proceso. El Reglamento hace referencia a que los productos y sustancias deberán 
sujetarse al mismo y a las normas correspondientes conforme a sus 
características. 
 
La Procuraduría Federal del Consumidor (Profeco) es la institución 
encargada de defender los derechos de los consumidores, prevenir abusos y 
garantizar relaciones de consumo justas. Además la Profeco tiene la función de 
informar sobre las características y calidad de diferentes artículos de interés para 
 
5 
 
el público mexicano y verificar el cumplimiento de diversas normas. Cuando no 
existe norma aplicable al producto evaluado, entonces se verifica la información 
comercial ostentada en laetiqueta del producto en cuestión. 
 
Hoy en día los laboratorios deben demostrar que sus métodos analíticos 
proporcionan resultados fiables y adecuados para la finalidad y propósito 
perseguido, ya que muchas de las decisiones que se toman (por ejemplo: 
repetición del análisis, evaluación de un segundo lote del producto, incautación de 
productos para impedir su comercialización o multas) están basadas en la 
información que estos datos aportan. La validación de las metodologías, junto a 
otras actividades incluidas en el control del aseguramiento de la calidad, permite a 
su vez asegurar la calidad de los resultados analíticos. Una vía para asegurar la 
calidad de los resultados emitidos es la acreditación. 
 
La acreditación es el acto por el cual una entidad de acreditación reconoce 
la competencia técnica y confiabilidad de los organismos de certificación, de los 
laboratorios de prueba, de los laboratorios de calibración y de las unidades de 
verificación para la evaluación de la conformidad. La entidad mexicana de 
acreditación, a.c. (ema), es el órgano que garantiza que los Organismos de 
Evaluación de la Conformidad son confiables y técnicamente competentes. La 
evaluación y acreditación de los laboratorios de ensayo se lleva a cabo con base 
en la norma NMX-EC-17025-IMNC-2006. Requisitos generales para la 
competencia de los laboratorios de ensayo y calibración (Entidad mexicana de 
acreditación: <http://www.ema.org.mx/ema/ema/index>: 2011). 
 
6 
 
Realizando la acreditación se asegura, por tanto, que los resultados 
analíticos son confiables y que el laboratorio que los emite es técnicamente 
competente. 
 
Un método analítico es la descripción de la secuencia de actividades, 
recursos, materiales y parámetros que se deben cumplir para llevar a cabo el 
análisis de un componente específico de la muestra. El proceso de validación 
permite el conocimiento de las características de funcionamiento del método. Por 
tanto la validación debe ser tan amplia como sea necesario para satisfacer las 
necesidades del tipo o campo de aplicación dados (Guía de Validación de 
Métodos Analíticos, 2002:4). 
 
La validación permite establecer por medio de pruebas de laboratorio, una 
serie de datos que demuestren científicamente que el método tiene las 
características de desempeño (especificidad, límite de detección, límite de 
cuantificación, linealidad, etc.) adecuadas para cumplir con los requerimientos de 
las aplicaciones previstas (Guía de Validación de Métodos Analíticos, 2002:4). 
 
El método de Kjeldahl es un método indirecto basado en la determinación 
del nitrógeno contenido en las proteínas. El nitrógeno se encuentra en una gran 
variedad de sustancias de interés en la investigación, en la industria y en la 
agricultura. Entre los ejemplos se incluyen aminoácidos, proteínas, fármacos 
sintéticos, fertilizantes, explosivos, suelos, colorantes y suministros de agua 
potable. Los métodos analíticos para la determinación de nitrógeno, en especial 
 
7 
 
en sustratos orgánicos, son de gran importancia (Técnicas para la determinación 
de nitrógeno de acuerdo al método de Kjeldahl, 1999: 4). 
 
El método de Kjeldahl se basa en una titulación de neutralización, por lo 
que se adapta con facilidad al análisis rutinario de un gran número de muestras. 
Es el método estándar para la determinación de proteínas en cereales, carnes y 
otros materiales biológicos y, como la mayoría de las proteínas contiene 
aproximadamente el mismo porcentaje de nitrógeno, al multiplicar este porcentaje 
por un factor adecuado se obtiene el porcentaje de proteína en una muestra 
(Skoog, 2001: 351). 
 
Éste método está descrito en diferentes referencias oficiales como: normas 
mexicanas (NMX-F-608-NORMEX-2002, Alimentos. Determinación de proteínas 
en alimentos), la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (Método General 
de análisis MGA 0611), Métodos oficiales de Análisis de la Association of Official 
Analytical Chemists- AOAC (Método 2011.11); pero a diferencia del método 
clásico de Kjeldahl, el método micro varía en la cantidad de muestra requerida 
para el análisis. Así mismo, existen otras variaciones para la técnica de micro 
Kjeldahl con respecto a las referencias oficiales, que se deben a las mejoras 
tecnológicas de los equipos e instrumentos empleados, obligando a realizar una 
validación. 
 
 
 
 
8 
 
3. OBJETIVOS 
 
Objetivo general 
 
 Validar el método analítico para la cuantificación de proteínas en 
alimentos mediante el método de micro Kjeldahl. 
 
 
Objetivos particulares 
 
 Evaluar cada una de las características de desempeño analítico para 
la validación del método. 
 
 Confirmar que el método analítico cumple con los requisitos 
establecidos por la Entidad Mexicana de Acreditación (ema) para 
acreditarlo como método interno para la determinación de proteínas 
en alimentos en el Laboratorio Nacional de Protección al 
Consumidor. 
 
 
 
 
 
 
9 
 
4. MARCO TEÓRICO 
4.1. Proteínas 
4.1.1. Definición 
La palabra proteína deriva del griego proteois que significa: primero. Las 
proteínas son poliamidas, las cuales por hidrólisis dan aminoácidos. 
Por lo común sólo se encuentran veinte aminoácidos en las proteínas de plantas y 
animales, sin embargo estos veinte aminoácidos se pueden combinar en una gran 
variedad de formas, para originar músculos, tendones, piel, uñas, plumas seda, 
hemoglobina, enzimas, anticuerpos y muchas hormonas (Fessenden, 1983: 959). 
 
A nivel estructural las proteínas se componen de Carbono (C), Nitrógeno 
(N), Oxígeno (O), Fósforo (P), Hidrógeno (H), Azufre (S) y otros elementos. 
(Fennema, 1991: 384). 
 
4.1.2. Proteínas en los alimentos 
No existe un alimento que esté constituido por pura proteína, es decir, que 
contenga 100% de proteína. Como se puede apreciar en la tabla 1, incluso los 
alimentos con un alto contenido de proteína, ésta no supera el 45% (Fox, 2009: 
207). 
 
Las proteínas están presentes en la carne, productos lácteos, huevo y 
algunos vegetales. La función principal de las proteínas es aportar el nitrógeno y 
 
10 
 
aminoácidos necesarios para la síntesis de las proteínas corporales y demás 
sustancias nitrogenadas (Fox, 2009: 207). 
 
Tabla 1. Contenido proteico de algunos alimentos (Bourges, 1996). 
Alimentos origen 
animal 
Proteína 
(%) 
Alimentos origen 
vegetal 
Proteína 
(%) 
Otros alimentos 
Proteína 
(%) 
Pollo 18,1 Tortilla de maíz blanco 4,4 Cerveza regular 0,46 
Pavo 20,4 Hojuelas de maíz 8,1 Vino de mesa 0,07 
Borrego 19 Bolillo 10,1 Pulque 0,4 
Res 20,9 Arroz 7,4 Miel de abeja 2,2 
Cerdo 17,7 Amaranto 12,9 Chocolate sin azúcar 13,8 
Conejo 20,4 Frijol 21,8 Chocolate con azúcar 3,8 
Venado 21 Haba 23,6 Gelatina en polvo 9,7 
Acociles 21 Lenteja 22,7 Gelatina preparada 2,8 
Gusanos de maíz 16,7 Frijol de soya 34,1 
 
Jamón de pavo 18,9 Harina de soya 43,3 
 
Longaniza 11,69 Ajonjolí 22,4 
 
Salchicha 7,0 Almendra 21,26 
 
Mojarra 19,2 Cacahuate 23,7 
 
Atún en aceite 24,2 Pistache 19,3 
 
Sardina en tomate 18,7 Pepitas 36,9 
 
Leche entera fresca 3,3 Coco 7,1 
 
Queso Panela 26,5 Granada china 2,2 
 
Queso Manchego 29 Plátano 1,2 
 
Huevo 12,1 Tamarindo 2,8 
 
 
 
Durante el proceso de digestión las proteínas son hidrolizadas por enzimas 
proteolíticas en sus componentes, los aminoácidos, que son absorbidos en el 
intestino delgado. Con éstos aminoácidos nuestro organismo fabrica sus propias 
proteínas, que cumplen importantes funciones, como la enzimática, estructural, 
transportadora, obtención de energía, entre otras. Alrededor de un 10% de la 
 
11 
 
energía total necesaria en la alimentación debe estar en forma de proteínas 
(Barrera, 2010: 15). 
 
Nuestras preferencias por unos u otros alimentos están primordialmente 
basadas en atributos sensoriales como la textura, el color, el sabor y el aspecto. 
Los atributos sensoriales de unalimento son consecuencia del efecto de diversas 
interacciones entre diversos componentes minoritarios y mayoritarios del 
alimento. Generalmente las proteínas tienen una gran influencia sobre los 
atributos sensoriales de los alimentos. Por ejemplo: las características sensoriales 
en productos horneados, la textura y sabor en productos cárnicos, propiedades 
texturales y formación de cuajada de productos lácteos (Fennema, 1991:434). 
 
4.1.3. Importancia de la determinación de proteínas en alimentos 
En México existen referencias normativas que establecen que para que un 
producto pueda denominarse como tal, éste debe cumplir con ciertas 
especificaciones físicas, químicas, biológicas, de empaque, etcétera. Por ejemplo: 
la NOM-155-SCFI-2003 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado-
Denominaciones, especificaciones fisicoquímicas, información comercial y 
métodos de prueba , establece las especificaciones de proteína para diversos 
productos como la leche, leche saborizada, leche evaporada, leche condensada, 
leche en polvo, fórmula láctea, entre otros. 
 
 La Ley Federal sobre metrología y Normalización describe en el artículo 40 
que las Normas Oficiales Mexicanas tienen por objetivo el establecer las 
 
12 
 
características y/o especificaciones, criterios y procedimientos que permitan 
proteger y promover la salud de las personas, animales o vegetales; así como la 
determinación de la información comercial, sanitaria, ecológica, de calidad, 
seguridad e higiene y requisitos que deben cumplir las etiquetas, envases, 
embalaje y la publicidad de los productos para dar información al consumidor o 
usuario. Además indica que las Normas Mexicanas son de aplicación voluntaria, 
salvo en los casos en que los particulares manifiesten que sus productos, 
procesos o servicios son conformes con las mismas. 
 
La Profeco tiene la función de informar sobre las características y calidad 
de diferentes artículos de interés para el público mexicano y verificar el 
cumplimiento de diversas normas. El laboratorio de Profeco ha recibido la 
acreditación como laboratorio de ensayo en diversas pruebas, ésta ha sido 
otorgada por la entidad mexicana de acreditación (ema). 
 
La entidad mexicana de acreditación a.c. (ema) tiene como objeto 
fundamental operar como entidad de acreditación en los términos de la Ley 
Federal sobre Metrología y Normalización. En los capítulos I y II del título cuarto 
de dicha Ley se establecen los lineamientos bajo los cuales las entidades de 
acreditación, como la ema, deben operar. 
 
En el caso en que los materiales, elementos, substancias o ingredientes 
que constituyan o integren el producto no correspondan a la indicación que 
ostenten o el porcentaje de ellos sea inexacto en perjuicio del consumidor, se 
 
13 
 
prohibirá la venta de todo el lote o, en su caso, de toda la producción similar, 
hasta en tanto se corrijan dichas indicaciones. En caso de no ser esto posible, se 
permitirá su venta al precio correspondiente a su verdadera composición, siempre 
y cuando ello no implique riesgos para la salud humana, animal o vegetal o a los 
ecosistemas (artículo 107, Ley Federal sobre metrología y Normalización). 
 
 En otros ramos, la importancia de la determinación de proteínas en 
alimentos es la siguiente (Técnicas para la determinación de nitrógeno de acuerdo 
al método de Kjeldahl, 1999: 3): 
 Monitoreo de procesos 
 Control de calidad y pureza 
 Investigación de propiedades funcionales 
 Determinación de actividad biológica 
 Contenido de alguna proteína en particular 
 Composición de amino ácidos 
 
4.2. Método de Kjeldahl 
 
El método de Kjeldahl es un método indirecto basado en la determinación 
del Nitrógeno contenido en las proteínas. Es el método estándar para la 
determinación de proteínas en cereales, carnes y otros materiales biológicos y, 
como la mayoría de las proteínas contiene aproximadamente el mismo porcentaje 
de nitrógeno, al multiplicar este porcentaje por un factor adecuado se obtiene el 
porcentaje de proteína en una muestra (Skoog, 2001: 351). 
 
14 
 
4.2.1. Fundamento 
Se basa en la hidrólisis del nitrógeno orgánicamente unido a sales de 
amonio (NH4
+) mediante la digestión con ácido sulfúrico concentrado y aplicación 
de calor. La adición del catalizador apropiado incrementa el punto de ebullición de 
la mezcla de digestión, lo que provoca que la reacción se lleve a cabo 
completamente (cuantitativamente). Posteriormente, se adiciona sosa en exceso 
a la muestra digerida, liberando así el amoniaco (NH3) de la sal de amonio. Se 
inyecta vapor a la mezcla de digestión para expulsar el amoniaco. El gas 
amoniaco se colecta en ácido bórico y se titula ya sea por potenciometría o 
mediante el uso de indicadores de pH (Técnicas para la determinación de 
nitrógeno de acuerdo al método de Kjeldahl, 1999: 4). 
 
Como método elemental de análisis, existen muchas oportunidades de 
aplicación del método de Kjeldahl en el análisis de alimentos, análisis ambiental y 
en la industria agrícola (Técnicas para la determinación de nitrógeno de acuerdo 
al método de Kjeldahl, 1999: 4). 
 
4.2.2. Evolución del método de Kjeldahl 
El método fue desarrollado por Johan Kjeldahl, investigador del laboratorio 
de una fábrica de cerveza en Dinamarca. 
 
En un principio, el método constaba de los siguientes pasos: 
a) DIGESTIÓN con H2SO4 con la adición de permanganato de potasio para 
completar la oxidación y conversión del nitrógeno a sulfato de amonio. 
 
15 
 
 
b) NEUTRALIZACIÓN de la digesta diluida, seguida de una destilación en un 
volumen conocido de ácido estandarizado con un contenido de yoduro de 
potasio y yodo. 
 
c) TITULACIÓN del yodo liberado con tiosulfato de sodio estandarizado. 
 
Posteriormente se añadieron catalizadores como: Hg, Cu, Se, Ti, Al para 
lograr una digestión completa. El dióxido de selenio y el sulfato de cobre II en 
proporción 3:1 son muy efectivos en la digestión. El sulfuro o tiosulfato de sodio 
se añaden a la digesta diluida para ayudar a liberar el nitrógeno del mercurio el 
cual tiende a adherir amonio. 
 
Actualmente el amoniaco se destila directamente en una solución de ácido 
bórico y es seguido de una titulación con un ácido estándar. Y existen otras 
metodologías que utilizan la colorimetría y la cromatografía iónica para determinar 
el contenido de nitrógeno posterior a la digestión. (Técnicas para la determinación 
de nitrógeno de acuerdo al método de Kjeldahl, 1999: 2) 
 
4.2.3. Proceso del análisis 
El proceso para la determinación de proteínas en alimentos consta de seis 
etapas, que se incluyen en la figura 1. 
 
16 
 
 
Figura 1. Etapas del método de Kjeldahl para la determinación de proteínas en alimentos 
 
4.2.3.1. Preparación de la muestra 
Las muestras que contienen nitrógeno pueden ser de diferentes tipos, 
muchas de ellas requieren ser molidas, homogeneizadas, degasificadas, secadas, 
etcétera, para asegurar resultados de análisis reproducibles. 
 
El peso de las muestras depende del contenido de nitrógeno, lo que 
significa que en caso de que la muestra contenga poco nitrógeno, será necesario 
pesar una cantidad mayor de muestra. Sin embargo, el peso de la muestra no 
debe ser demasiado grande debido a que existe una gran probabilidad de 
formación de espuma. 
 
En general, deberá pesarse de 0,1 a 1,0 g de muestra, hasta un máximo de 
2g. La muestra se pesa en papel libre de nitrógeno (por ejemplo glassine o papel 
PREPARACIÓN DE LA 
MUESTRA 
DIGESTIÓN 
NEUTRALIZACIÓN 
DESTILACIÓN 
TITULACIÓN 
CÁLCULOS 
 
17 
 
Whatman grado B-2) que se digiere junto con la misma. Las muestras líquidas se 
miden con pipeta, desde 1 mL hasta un máximo de 100 mL o se pueden pesar 
directamente en los tubos de digestión (Técnicas para la determinación de 
nitrógeno de acuerdo al método de Kjeldahl, 1999: 5). 
 
Tabla 2. Preparación de muestras (Técnicaspara la determinación de nitrógeno de acuerdo al método 
de Kjeldahl: 2009) 
Tipo de muestra Ejemplo Tratamiento de la muestra 
LÍQUIDOS 
Homogéneas Leche Uso directo 
Con fases separadas 
Mezclas agua/aceite, 
emulsiones 
Homogeneizar en un mezclador o mezclador 
ultrasónico 
Muestras con sedimentos o 
partículas sólidas 
Suelos o aguas de 
alcantarillado 
Homogeneizar en un mezclador o mezclador 
ultrasónico 
Muestras gasificadas Cerveza, bebidas Degasificar 
SÓLIDOS 
Partículas de gran tamaño Suelos, materia prima Moler, tamizar, mezclar las muestras suaves 
Partes completas 
Comida, maíz, vegetales 
completos 
Mezclar 
Muestras grasas Carne 
Congelar previo al análisis para evitar la 
separación de la grasa 
 
4.2.3.2. Digestión 
La fracción de Carbono de la muestra orgánica es oxidada con la ayuda de 
ácido sulfúrico concentrado, catalizador y mediante la aplicación de calor, lo que 
 
18 
 
produce óxido de carbono (CO2) y agua (H2O). Por otra parte, el ácido sulfúrico se 
reduce a óxido de azufre (SO2). Los vapores de ácido sulfúrico inmediatamente se 
neutralizan con una solución concentrada de álcali. 
 
La liberación del nitrógeno unido orgánicamente (R-NH2) cambia a 
amoniaco (NH3). El amoniaco es neutralizado en la solución de ácido sulfúrico, 
formando sulfato de amonio [(NH4)2 SO4]. 
 
 ( ) 
Ecuación (1). Digestión de la muestra 
 
Se debe emplear ácido sulfúrico concentrado, libre de nitrógeno y de grado 
analítico. La cantidad de ácido depende del peso de la materia orgánica contenida 
en la muestra. Al final de la digestión debe quedar un remanente de 10-15 mL de 
ácido sulfúrico. Si el residuo de ácido sulfúrico se evapora, el nitrógeno también 
se evaporará, provocando resultados poco reproducibles. 
 
Tabla 3. Cantidad de ácido sulfúrico requerida para la digestión de muestras (Técnicas para la 
determinación de nitrógeno de acuerdo al método de Kjeldahl, 1999). 
Peso de muestra Cantidad ácido sulfúrico Consumo Residuo 
0,5 g 15-17 mL 4 mL 11-13 mL 
1,0 g 20 mL 8 mL 12 mL 
2,0 g 25 mL 15 mL 10 mL 
 
 
19 
 
El catalizador empleado mejora la digestión. Ayuda a cambiar la energía de 
activación e influye positivamente en la velocidad de reacción. Los catalizadores 
se componen de Hg, Se, Cu ó Ti en combinación con sulfato de sodio ó potasio. 
 
 Actualmente no se usan los catalizadores de mercurio y selenio, debido a 
que son extremadamente venenosos. El selenio sólo se emplea en muestras 
oleosas, aceite mineral ó compuestos heterocíclicos, dado que su digestión es 
muy complicada. 
 
El sulfato de potasio (K2SO4) incrementa el punto de ebullición del ácido 
sulfúrico, sin embargo a temperaturas demasiado elevadas los compuestos 
nitrogenados se descomponen a nitrógeno elemental, provocando la pérdida de 
nitrógeno y por tanto resultados más bajos. 
 
La relación de ácido sulfúrico y sulfato de potasio es muy importante; si hay 
una cantidad de ácido insuficiente al final de la digestión, entonces aumenta la 
cantidad de sulfato de potasio, provocando un aumento en la temperatura y por 
ende una pérdida de nitrógeno, así como una excesiva formación de espuma en 
la solución de digestión. 
 
 Los catalizadores pueden pesarse y hacer la mezcla, por ejemplo 200 mg 
de Sulfato de cobre II (CuSO4) y 10 g de Sulfato de potasio (K2SO4), aunque 
ahora se encuentran disponibles tabletas de catalizador. 
 
 
20 
 
 La digestión culmina cuando todo el carbono se ha combustionado a CO2. 
En general, esto toma de 45 a 60 minutos, aunque en realidad se requieren más 
de 90 minutos considerando el precalentamiento del equipo y el tiempo de 
enfriamiento de las muestras (Técnicas para la determinación de nitrógeno de 
acuerdo al método de Kjeldahl, 1999: 6,7). 
 
Tabla 4. Relación de ácido sulfúrico / catalizador (Técnicas para la determinación de nitrógeno de 
acuerdo al método de Kjeldahl, 1999) 
Cantidad de H2SO4 Cantidad K2SO4 Punto de ebullición Observaciones 
20 mL H2SO4 (98%) ---------------- 330 °C ---------------- 
20 mL H2SO4 (98%) 5 g 350 °C ---------------- 
20 mL H2SO4 (98%) 10 g 370 °C ÓPTIMO 
20 mL H2SO4 (98%) 15 g 390 °C Pérdida de Nitrógeno 
 
4.2.3.3. Neutralización 
Se requiere una solución concentrada de hidróxido de sodio (32% m/v) libre 
de nitrógeno, la cantidad adicionada depende de la cantidad de ácido empleado. 
Por ejemplo, para neutralizar 20 mL de ácido sulfúrico, se requieren 
aproximadamente 60-80 mL de Hidróxido de sodio, esto asegura que se ha 
neutralizado el ácido y que la solución es completamente alcalina. La adición de 
hidróxido de sodio deberá realizarse cuando el tubo con la digesta esté 
completamente frío, pues se trata de una reacción exotérmica. 
 
Un excedente de hidróxido de sodio puede resultar en formación de 
espuma durante la destilación, por otro lado, un déficit de hidróxido de sodio 
 
21 
 
puede resultar en que no se obtenga el amoniaco o resultados muy bajos 
(Técnicas para la determinación de nitrógeno de acuerdo al método de Kjeldahl, 
1999: 8). 
 
Ecuación (2). Neutralización del ácido sulfúrico 
 
( ) 
 Ecuación (3). Obtención de amoniaco 
 
4.2.3.4. Destilación 
Se trata de una destilación por arrastre de vapor. Se inyecta vapor de agua 
en el tubo de digestión y el amoniaco es arrastrado junto con agua hacia donde se 
recibe el destilado. 
 
Existen dos posibilidades para recibir el destilado: 
a) Ácido bórico. El amoniaco forma un complejo con el ácido bórico 
 [ ( ) ] que se titula directamente con un ácido valorado. Una cantidad 
mayor de ácido bórico garantiza que el amoniaco se una completamente en un 
complejo. Pequeñas diferencias en la cantidad de ácido bórico no tienen 
consecuencias. La solución de ácido bórico debe tener una concentración de 
2% (m/v), se requieren aproximadamente 60 mL de ésta solución y de 2 a 3 
gotas de indicador Shiro-Tashiro. 
 
 ( ) [ ( ) ] 
Ecuación (4). Ácido bórico en que se recibe el destilado 
 
22 
 
 
 [ ( ) ] [ ( ) ] 
Ecuación (5). Colección del amoniaco en ácido bórico 
 
b) Ácido sulfúrico. El amoniaco se colecta en ácido sulfúrico, el exceso de ácido 
se valora por retroceso. 
 
El tiempo de destilación es variable, pero para obtener una óptima 
recuperación, se recomiendan 6 minutos. 
 
El ácido bórico empleado tiene como ventaja que no se requiere una 
cantidad exacta, lo que disminuye la probabilidad de que se presenten errores de 
medición. Sin embargo, debe asegurarse un exceso de ácido bórico para evitar 
pérdidas de amoniaco en caso de que haya un excedente de éste último. Para 
estos casos se recomienda que se incremente el volumen de ácido bórico 
empleado o reducir el peso original de la muestra (Técnicas para la determinación 
de nitrógeno de acuerdo al método de Kjeldahl, 1999:9). 
 
4.2.3.5. Titulación 
La titulación es un método para la determinación cuantitativa de una 
sustancia conocida. El amoniaco forma un complejo amoniaco-borato con el ácido 
bórico. El amoniaco se libera del complejo con el uso del ácido fuerte empleado 
para titular (ácido clorhídrico), formando cloruro de amonio y ácido bórico. 
 
 
23 
 
 [ ( ) ] [ ( ) ] 
Ecuación (6). Titulación del amonio 
 
En los casos en que se emplea un sistema automatizado, se usa un 
electrodo de pH con el titulador. Es importante asegurarse que el electrodo se 
encuentra en perfectas condiciones y que además haya sido calibrado. 
 
El punto de equivalencia para la titulación del amoniaco con ácido 
clorhídrico se encuentra entre pH 4,4 y 4,7; si se emplea un titulador automático, 
el pH que se aplica es 4,65 (Técnicas para la determinación de nitrógeno de 
acuerdo al método de Kjeldahl, 1999: 9). 
 
También se puede hacer una titulación colorimétrica, empleando mezclas 
de indicadores, por ejemplo: IndicadorShiro-Tashiro. 
 
4.2.3.6. Blanco 
En cada análisis se deberá correr un blanco de reactivos. Esto requiere que 
se haga una digestión con los mismos reactivos empleados para el análisis de 
muestras. El blanco analítico ayudará a determinar si los reactivos contienen 
nitrógeno. El valor del blanco (en mililitros) se resta al hacer los cálculos para la 
determinación de proteína en la muestra (Técnicas para la determinación de 
nitrógeno de acuerdo al método de Kjeldahl, 1999: 10). 
 
24 
 
 
Figura 2. Resumen de proceso para la determinación de proteínas por el método de Kjeldahl 
 
4.2.3.7. Cálculos 
El contenido de nitrógeno se calcula a partir del volumen gastado en la 
valoración de la muestra. En la reacción de titulación del amoniaco con ácido 
clorhídrico la relación estequiométrica es 1:1, es decir un mol de ácido clorhídrico 
reacciona con un mol de amoniaco. También se considera el blanco de reactivos 
(Técnicas para la determinación de nitrógeno de acuerdo al método de Kjeldahl, 
1999: 11). En la siguiente ecuación se incluyen todos los datos que se consideran 
en el cálculo: 
 
( ) 
 
 
 
25 
 
En donde: 
V = Volumen de HCl gastado en la muestra (mL) 
Vo = Volumen de HCl gastado en el blanco (mL) 
N = Normalidad de HCl (meq/mL) 
meq N = 0,014 g N/meq N 
m = masa muestra (g) 
1= relación estequiométrica ácido/amoniaco (meq NH3/meq H
+
) 
 
Al multiplicar el porcentaje de nitrógeno por el factor adecuado se obtiene 
el porcentaje de proteína en una muestra. El factor de proteína depende del tipo 
de alimento que se analice, en el anexo I se presenta una tabla de factores de 
proteína. 
 
 
 
En donde: 
F = Factor de proteína (g prot/g N) 
 
4.2.4. Método analítico 
A continuación se describe el procedimiento para la determinación de 
proteína por el método propuesto. 
 
1. El material empleado para el análisis debe estar limpio, seco y haber 
sido sometido a pruebas para comprobar que no contenga residuos de 
detergente. El material en éste caso se refiere a tubos de digestión de 
300 mL de borosilicato, resistentes a temperaturas elevadas. 
 
26 
 
 
 Figura 3. Tubo de digestión (Egli, 2008: 15). 
 
 
2. A cada tubo de digestión se adiciona una tableta de catalizador. 
 
Figura 4. Tabletas de catalizador, empleado para la digestión de las muestras. (Isaura Hernández, 
Fotografía tomada en el Laboratorio Nacional de Protección al Consumidor. Junio-2010). 
 
3. La muestra se pesa en balanza analítica con precisión. La cantidad de 
muestra requerida es de 0,1 a 1,0 g, según se requiera. Después se 
deposita en el tubo de digestión. 
 
4. Se adicionan 20 mL de ácido sulfúrico concentrado a cada tubo, se 
tapan con los tubos de succión de gases, que a su vez van conectados 
hacia el lavador de gases. 
 
Figura 5. Tubo al que se ha adicionado el catalizador, la muestra y ácido sulfúrico- Previo 
a la digestión. (Isaura Hernández, Fotografía tomada en el Laboratorio Nacional de 
Protección al Consumidor. Junio-2010). 
 
27 
 
 
 
 
 
Figura 6. Equipos empleados en la digestión de muestras. A: Lavador de gases; B: Digestor; C: Unidad 
de control. (Egli, 2008: 12,13,14). 
 
5. Se introducen los tubos al digestor, al que se precalentó previamente 
durante 15 minutos a la temperatura de digestión. Las muestras se 
someten a digestión durante 90 minutos. La programación de los 
tiempos de digestión se hace en la unidad de control. 
 
6. Toda vez que terminó la digestión se recomienda permitir que los tubos 
se enfríen por completo. 
 
 
Figura 7.Tubo después del proceso de digestión de la muestra. (Isaura Hernández, Fotografía tomada 
en el Laboratorio Nacional de Protección al Consumidor. Junio-2010). 
 
7. Se hace un lavado de las paredes del tubo con aproximadamente 50 
mL de agua, esto ayuda también a evitar reacciones violentas entre el 
 
28 
 
ácido contenido en el tubo y el hidróxido de sodio que se adiciona 
posteriormente para neutralizarlo. 
 
8. Por otra parte, se registran los datos de las muestras en la unidad de 
destilación, tales como nombre de la muestra, cantidad pesada y el 
factor de proteína. Se calibra el electrodo del destilador con soluciones 
trazables al CENAM. Las soluciones requeridas son de pH=6,86 y 
pH=4,00. 
 
9. Se destilan las muestras, considerando los siguientes parámetros de 
destilación: 60mL de hidróxido de sodio (32% m/v) y 40 mL de agua, 
que se adicionan al tubo de destilación; y 45 mL de ácido bórico (2% 
m/m), que se adicionan a la cámara de titulación. 
 
10. Se imprimen los datos y se registran en la bitácora. 
 
Figura 8. Unidad de destilación automática (Egli, 2008: 14). 
 
 
 
 
29 
 
4.3. Validación del método analítico 
Generalmente, para la medición de un analito en un tipo específico de 
muestra, existen varios métodos analíticos disponibles. Es importante que el 
laboratorio usuario de la metodología evalúe los diferentes métodos y seleccione 
aquel que mejor se adecue a las necesidades y recursos (Guía para la validación 
y verificación de los procedimientos de examen cuantitativos empleados por el 
laboratorio clínico, 2008:13). 
 
4.3.1. Definición 
En términos generales, una validación puede ser considerada como la 
constatación mediante la aportación de evidencia efectiva de que los requisitos 
especificados son adecuados para un uso previsto (Norma NMX-Z-O55-IMN-
2009, 2009: 24). 
 
Es el proceso mediante el cual se demuestra, por estudios de laboratorio, 
que la capacidad del método satisface los requisitos para la aplicación analítica 
deseada (Guía de Validación de Métodos Analíticos, 2002:4). Examina las 
características de desempeño de un método para identificar y establecer cualquier 
limitación que pueda esperarse del mismo cuando se aplique a un tipo 
determinado de muestras (Guía técnica para la trazabilidad e incertidumbre de las 
mediciones analíticas que emplea la técnica de titulación volumétrica, 2008: 21). 
 
 
 
 
30 
 
4.3.2. Métodos que deben validarse 
La acreditación es el acto que da la seguridad y avala que los laboratorios 
(calibración, ensayo y /o clínicos), unidades de verificación (organismos de 
inspección) y organismos de certificación ejecuten las regulaciones, normas o 
estándares correspondientes con precisión para que comprueben, verifiquen o 
certifiquen los productos y servicios que consume la sociedad (Artículo 3, Ley 
Federal sobre Metrología y Normalización, 2009: 2). 
 
Para el caso de los laboratorios de ensayo, la acreditación se sustenta en 
la norma NMX-EC-17025-IMNC-2006 – Requisitos generales para la competencia 
de los laboratorios de ensayo y calibración. Las entidades de acreditación, como 
la ema (entidad mexicana de acreditación), son los órganos que garantizan que 
los Organismos de Evaluación de la Conformidad son confiables y técnicamente 
competentes; es el organismo que evaluará que el laboratorio cumple con los 
criterios de calidad establecidos por la norma 17025. 
 
La norma NMX-EC-17025-IMNC-2006 establece en el punto 5.4.5, que el 
laboratorio debe validar los métodos no normalizados, los métodos que diseña o 
desarrolla, los métodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, así 
como las ampliaciones y modificaciones de los métodos normalizados para 
confirmar que son aptos para el fin establecido. 
 
En el caso de realizar modificaciones a métodos establecidos o ya 
validados por el fabricante o cuando se utilicen métodos desarrollados por el 
 
31 
 
propio laboratorio (internos), éste debe realizar la validación completa del método 
y presentar las evidencias correspondientes, incluyendo el procedimiento que 
utilizó para realizarla (Norma NMX-EC-17025-IMNC-2006, 2006: 16). Cabe 
mencionar que el procedimiento para la determinación de proteínas del que se 
presenta la validación es un método desarrollado porel laboratorio, llamado 
también método interno por lo que corresponde realizar una validación completa. 
 
Tabla 5. Requisitos de validación para acreditación (Guía técnica sobre trazabilidad e incertidumbre en 
las mediciones analíticas que emplea la técnica de titulación volumétrica: 2008) 
SITUACIÓN GRADO DE VALIDACIÓN REQUERIDA 
Desarrollo de un método para un problema en particular Completo 
Existe un método evaluado para aplicarlo en un problema particular Completo 
Un método establecido, realizar una renovación para incorporar innovaciones Parcial o completo 
Un método establecido, extenderlo o adaptarlo a un problema nuevo Parcial o completo 
Cuando el control de calidad indica que un método establecido cambia con el tiempo Parcial o completo 
Establecer un método en un laboratorio diferente Parcial 
Establecer un método con diferente instrumentación Parcial 
Establecer un método con diferente operador Parcial 
 
La entidad mexicana de acreditación (ema), en la Guía sobre trazabilidad e 
incertidumbre en las mediciones analíticas que emplea la técnica de titulación 
volumétrica, establece que los parámetros recomendados para la validación de un 
método de ensayo que incluye mediciones analíticas por titulación volumétrica 
son: 
 
32 
 
Tabla 6. Parámetros de validación para técnicas volumétricas de análisis. 
Parámetro de validación 
Validación 
completa 
Validación 
parcial 
Recuperación X X 
Selectividad X 
Robustez X 
Límite de detección X 
Límite de cuantificación X X 
Intervalo de trabajo X 
 
Linealidad X 
 
Repetibilidad X X 
Precisión intermedia X X 
Sesgo* X X 
Incertidumbre X X 
* En algunos casos es evaluado a partir del % de recuperación. 
 
La validación depende de los cambios realizados, por lo que debe repetirse 
cuando existan cambios mayores. Se consideran cambios mayores, el cambio de 
equipo y mantenimiento mayor de equipo, entre otros. Se consideran cambios 
menores, la modificación del tamaño de muestra, cambio de analista y sustitución 
de reactivos, entre otros (Guía para la validación y la verificación de los 
procedimientos de examen cuantitativos empleados por el laboratorio clínico, 
2008: 14). 
 
4.3.3. Protocolo de validación 
Se refiere a la descripción de las pruebas específicas realizadas para la 
validación. 
 
33 
 
En el caso de medición de Nitrógeno Total Kjeldahl, se debe tener 
trazabilidad de las magnitudes de masa, volumen y cantidad de sustancia, 
teniendo las calibraciones de la balanza y la bureta realizadas por laboratorios 
acreditados, además de llevar a cabo un programa de control de calidad 
estadístico con los materiales de control de referencia certificados y la 
participación en pruebas inter-laboratorio (Guía técnica sobre trazabilidad e 
incertidumbre en las mediciones analíticas que emplea la técnica de titulación 
volumétrica: 2008). 
 
Antes de realizar la validación del método analítico, debe llevarse a cabo la 
verificación de la calibración de los equipos, que es un conjunto de operaciones 
necesarias para asegurar que el equipo de medición cumple con los requisitos 
metrológicos para su uso previsto. 
 
 Los materiales y equipos que deberán verificarse son aquellos cuya 
influencia en la incertidumbre de la medición es significativa. En estos casos, el 
laboratorio debe tener evidencias de la verificación periódica de la calibración de 
sus instrumentos o materiales, de acuerdo a su uso (Proceso de confirmación 
metrológica industrial, 2004: 1). Para el caso particular de éste trabajo, los 
instrumentos y equipos que deben verificarse son: la balanza analítica, los 
matraces volumétricos, las probetas y la bureta. 
. 
A continuación se enlistan los equipos y materiales empleados en la 
validación. 
 
34 
 
4.3.3.1. Materiales 
 Tubos de digestión de 300 mL de borosilicato, marca Büchi. 
 Gradillas para tubos de digestión 
 Tubos de succión de vapores 
 Matraces Erlenmeyer de 250 mL 
 Agitadores magnéticos 
 Parrilla de agitación 
 Matraces volumétricos de 50, 100, 1000 y 2000 mL 
 Jarras de plástico de 5L 
 Probeta de vidrio de 2L 
 
4.3.3.2. Equipos 
 Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad, marca Ohaus, modelo: AP 
210 
 Digestor de proteína de 12 plazas, marca Büchi, modelo: K-435 
 Lavador de gases, marca Büchi, modelo: B-414 
 Unidad de control, marca Büchi, modelo:B-436 
 Unidad de destilación automática, marca Büchi, modelo B-339 
 Bureta digital, marca: Jencons, Modelo: Digitrate 
 
4.3.3.3. Reactivos 
Para la preparación de soluciones se requiere agua destilada y los reactivos 
empelados deben ser de grado analítico. 
 
 
35 
 
 Ácido sulfúrico concentrado 
Se requiere ácido sulfúrico concentrado libre de nitrógeno. Con pureza mayor al 98%. 
 
 Tabletas Kjeldahl 
 Para la validación se usaron las tabletas de digestión que constan de 5,0g de 
sulfato de potasio, 0,15g de sulfato de cobre II y 0,15g de óxido de titanio. Se emplea una 
tableta por cada tubo de digestión. 
 
 Carbonato de sodio- solución saturada con indicador azul de bromotimol 
Se emplea de manera simultánea con el digestor de proteínas para la neutralización de 
los vapores de ácido generadas durante el proceso de digestión. Toda vez que la 
solución ha cambiado de color de azul (pH alcalino) a color verde-rojizo (pH neutro), 
deberá reemplazarse la solución. 
 
 Hidróxido de sodio 32% m/v 
Se usa para la neutralización del ácido sulfúrico, previo a la destilación de la muestra. La 
concentración se especifica en el manual de operación del destilador. 
 
 Ácido bórico 2% m/v 
 La solución de ácido bórico se requiere para la recepción del amoniaco 
proveniente de la destilación de la muestra. El pH aproximado de la solución es 4,6 pero 
esto no significa que si existe una variación en el pH éste requiera ser ajustado. 
 
 Ácido clorhídrico 0,1 N 
 La solución de ácido clorhídrico debe ser valorada con carbonato de sodio grado 
estándar. El carbonato de sodio debe ser un estándar trazable, de pureza mayor al 99%. 
 
 
36 
 
 Indicador Shiro-Tashiro 
El indicador Shiro-Tashiro se prepara combinando dos partes de “a” y una 
parte de “b”. 
a) Rojo de metilo al 0,2 % m/v en una mezcla de 60 mL de alcohol etílico y 40 
mL de agua. 
b) Azul de metileno al 0,2% m/v en agua 
 
4.3.3.4. Material de referencia 
Las sustancias de referencia son importantes en la validación de métodos 
analíticos, ya que constituyen un componente propio del método y una 
herramienta en la evaluación de los parámetros de desempeño, lo que permite 
establecer la confiabilidad de la metodología. 
 
Para la validación realizada se empleó leche entera en polvo, suministrada 
por el Centro Nacional de Metrología, CENAM, mismo que certifica los valores de 
contenido de lactosa, proteína, grasa y cenizas. El valor de referencia para 
proteína es 24,44 ± 0,22 %. Ver anexo II. 
Para la selección y adquisición de las sustancias de referencia se debe 
contar con procedimientos acordes para su manejo y aplicación correctos dentro 
del laboratorio que llevará a cabo las actividades de validación de métodos. Así 
mismo, se debe contar con registros del uso y con la documentación que avale 
una buena práctica en el manejo de dichas sustancias (Guía de validación de 
métodos analíticos: 2002). 
 
 
37 
 
Para cumplir con su propósito, cada sustancia de referencia debe 
almacenarse, manejarse y utilizarse de acuerdo a las especificaciones 
correspondientes. Generalmente deben almacenarse en su contenedor original, 
alejadas del calor y protegidas del calor y de la luz (Guía de validación de métodos 
analíticos: 2002). 
 
Un material de referencia está certificado por un organismo autorizado, que 
proporciona uno o varios valores de propiedades especificadas, con 
incertidumbres y trazabilidades asociadas, empleando procedimientos válidos. La 
documentación mencionada se proporciona enforma de certificado (Guía de 
validación de métodos analíticos: 2002). 
 
4.3.3.5. Parámetros de desempeño. 
4.3.3.5.1. Recuperación 
Definición 
El recobro ó también llamado recuperación es la cantidad del analito determinada 
en el placebo adicionado o muestra adicionada, empleando el método analítico. 
Se expresa como porcentaje de recobro (Guía de validación de métodos 
analíticos: 2002). 
 
Metodología 
Se pesa 0,1g del material de referencia y se determina el contenido de 
proteína por el método propuesto. Se realizan 10 repeticiones haciendo el análisis 
bajo las mismas condiciones. 
 
38 
 
 
Se determina la cantidad recuperada del analito. Se calcula el promedio ( ̅), 
la desviación estándar (S), el coeficiente de variación (CV) (Procedimiento de 
validación de métodos analíticos, Profeco: 2010). 
 
Criterio de aceptación 
El promedio del porcentaje de recobro debe encontrarse dentro del 
intervalo: 98-102% para un método volumétrico. 
 
El coeficiente de variación del porcentaje de recobro (CV) no deberá ser mayor al 
2%. (Guía de validación de métodos analíticos: 2002) 
 
4.3.3.5.2. Selectividad o especificidad 
Definición 
La selectividad o especificidad es la capacidad de un método para 
determinar exactamente el analito de interés en la presencia de otros 
componentes en la matriz bajo condiciones de prueba establecidas. 
 
Partiendo de la experiencia en el análisis de la muestra, se deben establecer las 
posibles sustancias inherentes, y adicionar cantidades conocidas de éstas, solas o 
combinadas a la muestra y evaluar su respuesta al método, bajo las mismas 
condiciones de análisis. (Guía de validación de métodos analíticos: 2002) 
 
 
 
39 
 
Metodología 
El propósito del método es la determinación de proteínas en alimentos. 
Partiendo de la figura 9, en la que se observa la composición general de los 
alimentos y de la premisa que los componentes mayoritarios en ellos son 
carbohidratos, lípidos y proteínas, entonces se considera la adición de sacarosa 
grado estándar –como carbohidratos- y de grasa –como lípidos- a las muestras 
para determinar la especificidad del método. 
 
La selectividad del método se determina en 6 muestras del material de 
referencia- leche en polvo-, 6 muestras de la misma leche con adición de 
sacarosa estándar y 6 muestras más con adición de grasa. Por separado se 
analizan 3 muestras de grasa y 3 de sacarosa para determinar el contenido de 
nitrógeno de las mismas. 
 
Calcular la media aritmética de los datos obtenidos. (Procedimiento de 
validación de métodos analíticos, Profeco: 2010). 
 
Criterio de aceptación 
Comparar los resultados de la muestra de leche sin adición y con adición de 
sacarosa y grasa, mediante pruebas de significancia t de student para 
comparación de medias. (Guía de validación de métodos analíticos: 2002) 
 
 
 
 
 
40 
 
Figura 9. Composición de alimentos, demostrando los nutrientes y los métodos de análisis. (Info 
carne: <www.infocarne.com/cerdo/composicion_alimentos.asp>: 20 de junio de 2010) 
 
 
4.3.3.5.3. Robustez 
Definición 
Es la capacidad del método analítico de mantener su desempeño al 
presentarse variaciones pequeñas pero deliberadas, en los parámetros normales 
de operación del método. 
Se deben establecer aquellos factores instrumentales (temperatura, 
presión, etc.) y/o factores no instrumentales (pH, volumen de solventes para una 
extracción, etc.) relacionados al propio método, que se consideren críticos (Guía 
de validación de métodos analíticos: 2002). 
 
41 
 
 
Los parámetros críticos para la determinación de proteína son: tiempo de 
digestión, neutralización de la muestra, destilación de la muestra y titulación de la 
muestra; los primeros tres puntos son controlables debido a la automatización de 
los equipos empleados. La titulación de la muestra dependerá de las condiciones 
en que ésta se lleve a cabo. 
 
Por una parte, se puede hacer una titulación potenciométrica (condición 
normal de operación), que realiza el equipo automáticamente, la titulación se 
realiza hasta un pH de equivalencia de 4,6. Por otra parte, se puede hacer una 
titulación manual mediante el uso de indicador Shiro-Tashiro y una bureta digital. 
 
Metodología 
Se analizan dos series de 6 muestras del material de referencia cada una, 
bajo las mismas condiciones. Una de las series se titula de manera 
potenciométrica y la otra mediante el uso de indicador. 
Reportar el contenido del analito para las muestras tituladas de manera 
potenciométrica y para las tituladas de mediante el uso de bureta digital e 
indicador, expresadas como % recuperación. (Procedimiento de validación de 
métodos analíticos, Profeco: 2010). 
Calcular la media aritmética de la condición normal de operación ( ̅ ) y de 
cada condición de operación diferente a la condición normal ( ̅ ). Calcular la 
diferencia absoluta de la media aritmética de cada condición respecto a la 
condición normal (|di|). 
 
42 
 
Criterio de aceptación 
|di| ≤ 2% para métodos volumétricos. 
 
Comparar los resultados de % de recuperación de las muestras de leche 
analizadas por titulación potenciométrica y por titulación con uso de indicador 
mediante pruebas de significancia t de student para comparación de medias. 
(Guía de validación de métodos analíticos: 2002) 
 
4.3.3.5.4. Límite de detección 
Definición 
Es la concentración mínima del analito en una muestra, que puede ser detectada, 
pero no necesariamente cuantificada, bajo las condiciones de operación 
establecidas (Guía de validación de métodos analíticos: 2002). 
 
Metodología 
Se determina el límite de detección realizando 6 curvas de calibración con 9 
concentraciones cada una (pesando de 0,0025 a 0,2000 g de leche en polvo), se 
analizan las muestras bajo las mismas condiciones. Medir las respuestas 
analíticas. Para el caso de proteína, la respuesta analítica es el volumen de ácido 
clorhídrico gastado en la titulación, a partir de éste dato se calcula el % de 
proteína. (Procedimiento de validación de métodos analíticos, Profeco: 2010). 
 
Para cada curva de calibración, calcular el valor de la pendiente (m), el 
coeficiente de correlación (r2) y la ordenada al origen (b). Calcular la desviación 
 
43 
 
estándar de la ordenada al origen (Sb), el promedio de la pendiente ( ̅). Calcular 
el límite de detección con la siguiente ecuación: 
 
 
 
 ̅
 
Donde: 
 ̅ = Promedio de la pendiente 
Sb = Desviación estándar de la pendiente 
 
Criterio de aceptación 
r2 ≥ 0,98 (Guía de validación de métodos analíticos: 2002). 
 
4.3.3.5.5. Límite de cuantificación 
Definición 
Es la concentración mínima del analito, que puede ser determinada con precisión 
y exactitud aceptables, bajo las condiciones de operación establecidas (Guía de 
validación de métodos analíticos: 2002). 
 
Metodología 
Se determina el límite de detección realizando 6 curvas de calibración con 9 
concentraciones cada una (pesando de 0,0025 a 0,2000 g de leche en polvo), se 
analizan las muestras bajo las mismas condiciones. Medir las respuestas 
analíticas. Para el caso de proteína, la respuesta analítica es el volumen de ácido 
clorhídrico gastado en la titulación, a partir de éste dato se calcula el % de 
proteína. (Procedimiento de validación de métodos analíticos, Profeco: 2010). 
 
44 
 
Para la curva de calibración, calcular el valor de la pendiente (m), el 
coeficiente de determinación (r2) y la desviación estándar de la ordenada al origen 
(Sb). Calcular el límite de detección con la siguiente ecuación (Guía de validación 
de métodos analíticos: 2002): 
 
 
 
 
Donde: 
 ̅ = Promedio de la pendiente 
Sb = Desviación estándar de la pendiente 
 
Criterio de aceptación 
r2 ≥ 0,98 
 
4.3.3.5.6. Intervalo de trabajo 
Definición 
En análisis cuantitativo, el intervalo de trabajo es obtenido a través de la 
medición de muestras con diferenteconcentración del analito, y seleccionando el 
intervalo de concentración que proporciona un nivel de incertidumbre aceptable 
(Guía técnica sobre trazabilidad e incertidumbre en las mediciones analíticas que 
emplea la técnica de titulación volumétrica: 2008). 
 
Metodología 
El intervalo de trabajo se determina construyendo una curva de calibración 
utilizando 9 concentraciones (1 réplica por concentración) del material de 
 
45 
 
referencia. Se calcula la pendiente y el coeficiente de correlación (Procedimiento 
de validación de métodos analíticos, Profeco: 2010). 
 
Criterio de aceptación 
 
a) Pendiente: valor cercano a 1 
b) Coeficiente de correlación: r ≥ 0.99 
 
4.3.3.5.7. Linealidad 
Definición 
Es la habilidad para asegurar que los resultados obtenidos directamente o por una 
transformación matemática definida, son proporcionales a la concentración del 
analito, dentro de un intervalo determinado (Guía de validación de métodos 
analíticos: 2002). 
 
Metodología 
Analizar la muestra con el método para determinar el contenido del analito. 
Construir una curva de calibración de 8 concentraciones distintas (pesar de 0,01 a 
1,5g de leche estándar), realizar tres réplicas por concentración. Graficar la 
cantidad de proteína adicionada vs la cantidad de proteína recuperada. 
(Procedimiento de validación de métodos analíticos, Profeco: 2010). 
 
 
46 
 
Reportar la relación de cantidad adicionada vs cantidad recuperada. 
Calcular el valor de la pendiente (m), la ordenada al origen (b), el coeficiente de 
correlación (r2) y el coeficiente de variación de regresión (CV y/x). 
 
 
 
 ̅
 
 
En donde: 
S y/x = Desviación estándar de la pendiente 
 ̅ = promedio de la pendiente 
 
Calcular el % de recobro de de cada muestra. Calcular el promedio, la 
desviación estándar y el coeficiente de variación. 
 
Criterio de aceptación 
r2 ≥ 0,98 
 
CV y/x de regresión no debe ser mayor al 2% para un método volumétrico. 
El porcentaje de recobro debe incluirse en el intervalo 98-102% para un 
método volumétrico. El coeficiente de variación debe ser menor al 2%. 
 
Si cumple con éstas condiciones, se aplica una prueba de hipótesis a la 
ordenada y a la pendiente, obtenidas de la regresión, para determinar si la curva 
de calibración parte del origen y si la línea de tendencia es la más adecuada para 
 
47 
 
la descripción lineal. Posteriormente, se calculan los intervalos de confianza, tanto 
para la ordenada, como para la pendiente de la curva obtenida (Alcalá: 2007: 61). 
 
En la prueba de hipótesis a la ordenada y a la pendiente se establecen las 
siguientes hipótesis: 
 
Hipótesis nula: 
Hipótesis alternativa: 
 
Donde es el valor de la ordenada o de la pendiente, según sea el caso. 
 
 Se utiliza para este estudio la “t de student”, con n-2 grados de libertad, con 
un nivel de significancia del 95% (=0.05). 
 
 
 
 √
 
 ( ̅) 
 
Donde: 
b = ordenada al origen 
 = ordenada al origen poblacional ( =0) 
Se = Error típico de estimación 
Sxx = suma de cuadrados de la variable independiente 
n = Número de determinaciones 
 ̅ = media experimental 
 
 Ya que se trata de un ensayo bilateral o de dos colas, donde  es el nivel 
de significancia, que se toma del 5% ( = 0.05), que corresponde a un valor usual 
 
48 
 
de riesgo de cometer un error y que se toma a nivel internacional en el desarrollo 
de la mayoría de las metodologías analíticas; el error típico de estimación se 
calcula de la siguiente forma: 
 
 √
 ( ) 
( ) 
 
Donde: 
 ∑ 
 (∑ 
 
 
)
 
 
 
 
 ∑ 
 (∑ 
 
 
)
 
 
 
 
 ∑ 
 
 
(∑ 
 
 
)(∑ 
 
 
) 
 
Para rechazar la hipótesis nula, se utiliza el siguiente criterio: 
 
 
Para calcular el intervalo de confianza para la ordenada al origen con el mismo 
nivel de significancia se utiliza la ecuación: 
 
 √
 ( ̅) 
 
 
 
49 
 
 
Para calcular el intervalo de confianza para la pendiente con el mismo nivel de 
significancia se utiliza la ecuación: 
 √
 
 
 
 
4.3.3.5.8. Repetibilidad 
Definición 
Es la precisión de un método analítico, expresada como la concordancia obtenida 
entre determinaciones independientes realizadas por un solo analista, usando los 
mismos instrumentos y método (Guía de validación de métodos analíticos: 2002). 
 
Metodología 
Analizar 10 muestras de leche estándar con el método propuesto para 
determinar el contenido del analito. Se deben analizar las muestras bajo las 
mismas condiciones. Determinar la cantidad recuperada de proteína. 
(Procedimiento de validación de métodos analíticos, Profeco: 2010). 
 
Calcular el promedio ( ̅), la desviación estándar (S), el coeficiente de 
variación (CV) y el intervalo de confianza (IC) para la media poblacional IC ( ̅) del 
porcentaje de recobro. 
 ( ̅) ̅ 
 
√ 
 
 
Criterio de aceptación 
 
50 
 
El IC ( ̅) debe incluir el 100% o que el promedio del recobro se incluya en 
el intervalo 98-102%. 
El CV del porcentaje de recobro debe no ser mayor al 2% 
 
4.3.3.5.9. Precisión intermedia 
Definición 
Es la precisión de un método analítico expresada como la concordancia relativa 
obtenida entre determinaciones independientes realizadas en un mismo 
laboratorio, por diferentes analistas en distintos días (Guía de validación de 
métodos analíticos: 2002). 
 
Metodología 
Analizar 10 muestras de leche estándar en dos días diferentes por dos 
analistas diferentes. Utilizar la misma sustancia de referencia y los mismos 
instrumentos y/o equipos. Reportar el contenido de proteína en todas las 
muestras. 
 
Calcular la media aritmética ( ̅), desviación estándar (S) y coeficiente de 
variación (CV) del contenido de proteína empleando todos los resultados 
obtenidos. 
 
Los resultados pueden ser analizados utilizando otros métodos estadísticos 
apropiados que permitan determinar que la precisión es aceptable (Procedimiento 
de validación de métodos analíticos, Profeco: 2010). 
 
51 
 
Criterio de aceptación 
CV ≤ 2% para todos los datos obtenidos (Guía de validación de métodos 
analíticos: 2002). 
 
4.3.3.5.10. Sesgo 
 
Definición 
Valor estimado de un error sistemático. Es la diferencia entre los resultados de 
prueba esperados y el valor de referencia aceptado (Guía de validación de 
métodos analíticos: 2002). 
 
Metodología 
Para determinar el sesgo se realizará el análisis mediante el método 
propuesto de 10 blancos de reactivos y 10 muestras de leche en polvo. Se 
determina el valor promedio del analito proveniente del material de referencia y se 
le resta el valor promedio del blanco (Procedimiento de validación de métodos 
analíticos, Profeco: 2010). 
 
Al comparar con el valor verdadero o aceptado del material de referencia, 
da una medición del sesgo del método. (Guía de validación de métodos analíticos: 
2002) 
 
 
 
 
52 
 
5. RESULTADOS 
5.1. Recuperación 
Se determinó el contenido de proteína en 10 muestras independientes del 
material de referencia- leche entera en polvo- bajo las mismas condiciones de 
análisis. Partiendo del valor certificado de 24,44 ± 0,22 % de proteína, el 
porcentaje de recuperación se calcula de la siguiente manera: 
 
 
 
 
 
 
Tabla 7. Resultados % Recuperación. 
Muestra 
Cantidad de 
muestra [g] 
% Proteína 
obtenido 
% Recobro 
1 0,1070 24,404 99,853 
2 0,1049 24,609 100,691 
3 0,1036 24,769 101,346 
4 0,1021 24,443 100,012 
5 0,1022 24,498 100,237 
6 0,1004 24,809 101,510 
7 0,1090 24,616 100,720 
8 0,1054 24,439 99,996 
9 0,1023 24,968 102,160 
10 0,1095 24,555 100,471 
Promedio 24,611 100,700 
Desviación Estándar 0,185 0,757 
Coeficiente de variación 0,752 0,752 
 
 
El promedio del porcentaje de recobroobtenido para las 10 muestras 
analizadas es 100,700%. Éste valor se encuentra dentro del intervalo establecido 
como criterio de aceptación (98-102%). El coeficiente de variación (CV) es igual a 
 
53 
 
0,752%, este valor es menor que el criterio de aceptación que establece que el CV 
no deberá ser mayor al 2% por lo que el resultado se considera aceptable. 
 
Adicional a los datos obtenidos para el porcentaje de recobro, se presenta 
el gráfico realizado como control de calidad analítico dentro del laboratorio. Se 
observa que de los datos obtenidos, todos se encuentran dentro de los límites de 
control superior e inferior (el límite de control superior se obtiene al sumar el 
promedio más tres veces la desviación estándar del % de recobro; el límite de 
control inferior se calcula restando al promedio tres veces la desviación estándar 
del % de recobro) 
 
Gráfico 1. Gráfico de control. Porcentaje de recobro
 
 
 
 
98,0
99,0
100,0
101,0
102,0
103,0
104,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
%
 R
ec
o
b
ro
 
Datos 
% Recobro
Promedio
Límite
advertencia
superior
Límite de
control
superior
Límite de
advertencia
inferior
Límite de
control inferior
 
54 
 
5.2. Selectividad 
El estándar de sacarosa, así como la grasa no presentan proteína que 
pudiese intervenir en el resultado del contenido de proteína de las muestras 
analizadas. 
Tabla 8. Resultados de la determinación de proteína en sacarosa 
Muestra 
Cantidad de 
muestra [g] 
Proteína 
obtenida [%] 
1 0,1179 0,000 
2 0,1010 0,000 
3 0,1048 0,000 
 
Tabla 9. Resultados de la determinación de proteína en grasa 
Muestra 
Cantidad de 
muestra [g] 
Proteína 
obtenida [%] 
1 0,1026 0,000 
2 0,1033 0,000 
3 0,1051 0,000 
 
 
Se comparan los resultados de la muestra de leche sin adición y con 
adición de sacarosa y grasa, mediante pruebas de significancia t de student para 
comparación de medias. 
 
Tabla 10. Resultados de la determinación de proteína en leche estándar. 
Muestra 
Cantidad de 
muestra [g] 
Proteína 
obtenida [%] 
% 
Recuperación 
Promedio de 
% 
recuperación 
Desv. 
Estándar de % 
recuperación 
1 0,1032 24,731 101,19 
101,18 0,82 
2 0,1054 24,741 101,23 
3 0,1142 24,925 101,98 
4 0,1056 24,89 101,84 
5 0,1151 24,717 101,13 
6 0,1035 24,362 99,68 
 
 
55 
 
Tabla 11. Resultados de la determinación de proteína en muestras de leche estándar adicionada con 
sacarosa. 
Muestra 
Cantidad de 
muestra [g] 
Cantidad de 
sacarosa 
adicionada [g] 
Proteína 
obtenida [%] 
% 
Recuperación 
Promedio de 
% 
recuperación 
Desv. 
Estándar de % 
recuperación 
1 0,1022 0,1084 24,762 101,32 
101,28 0,47 
2 0,1076 0,1105 24,883 101,81 
3 0,1150 0,1035 24,606 100,68 
4 0,1002 0,1038 24,878 101,79 
5 0,1057 0,1067 24,651 100,86 
6 0,1001 0,1046 24,735 101,21 
 
Tabla 12. Resultados de la determinación de proteína en muestras de leche estándar adicionada con 
grasa. 
Muestras de leche adicionada con grasa 
Muestra 
Cantidad de 
muestra [g] 
Cantidad de 
grasa 
adicionada [g] 
Proteína 
obtenida [%] 
% 
Recuperación 
Promedio de 
% 
recuperación 
Desv. 
Estándar de % 
recuperación 
1 0,1013 0,1016 24,628 100,77 
101,10 0,27 
2 0,1026 0,1022 24,712 101,11 
3 0,1039 0,1003 24,721 101,15 
4 0,1054 0,1050 24,704 101,08 
5 0,1063 0,1030 24,823 101,57 
6 0,1072 0,1026 24,661 100,90 
 
En la comparación de muestras sin adicionar y las muestras adicionadas 
con sacarosa se obtienen los siguientes datos: 
 
Tabla 13. Comparativo de muestras de leche con y sin adición de sacarosa 
Parámetro 
estadístico 
Leche sin 
adición 
Leche con 
adición de 
sacarosa 
Media (xi) 101,18 101,28 
Desv. St. (Si) 0,82 0,47 
Cantidad de 
muestras (ni) 
6 6 
 
 
56 
 
La hipótesis nula adoptada es que la adición de sacarosa no afecta los 
resultados del contenido de proteína El cálculo de varianza se realiza con la 
fórmula: 
 
[( ) 
 (( ) 
 )]
 
 
Obteniéndose: 
S2= 0,4424 
S= 0,6651 
 
Se calcula t con la siguiente fórmula: 
 
 ̅ ̅ 
 √
 
 
 
 
 
 
Obteniéndose: 
t= 0,2646 
 
De tablas con 5 grados de libertad, el valor crítico de t con 95% de 
significancia es de 2,57. 
 
t calculado es menor que t de tablas, por tanto se acepta la hipótesis nula 
que: "la adición de sacarosa no afecta los resultados del contenido de proteína". 
 
En la comparación de muestras sin adicionar y las muestras adicionadas 
con grasa se obtienen los siguientes datos: 
 
Tabla 14. Comparativo de muestras de leche con y sin adición de grasa 
Parámetro 
estadístico 
Leche sin 
adición 
Leche con 
adición de 
grasa 
 
57 
 
Media (xi) 101,18 101,10 
Desv. St. (Si) 0,82 0,27 
Cantidad de 
muestras (n) 
6 6 
 
La hipótesis nula adoptada es que la adición de grasa no afecta los 
resultados del contenido de proteína. Se calcula la varianza y t de igual manera 
que en el ejemplo anterior. 
 
S2= 0,3706 
S= 0,6087 
t= 0,2270 
 
De tablas con 5 grados de libertad, el valor crítico de t con 95% de 
significancia es de 2,57 
 
t calculado es menor que t de tablas, por tanto se acepta la hipótesis nula 
que: "la adición de grasa no afecta los resultados del contenido de proteína" 
 
Las pruebas de significancia indican que no existe diferencia entre los 
resultados obtenidos para las muestras sin adición y las muestras adicionadas 
con grasa y con sacarosa. Lo que significa que la presencia de otros 
componentes de la muestra no genera interferencia en la determinación de 
proteína. Esto significa que el método se considera selectivo. 
 
5.3. Robustez 
Se analizaron dos series de 6 muestras del material de referencia cada 
una, bajo las mismas condiciones. Una de las series se titula de manera 
potenciométrica y la otra mediante el uso de indicador. 
 
58 
 
 
Tabla 15. Resultados de contenido de proteína en muestras tituladas potenciométricamente 
Muestra 
Cantidad de muestra 
[g] 
Proteína 
obtenida [%] 
% 
Recuperación 
Promedio de 
% 
recuperación 
Desv. 
Estándar de 
% 
recuperación 
1 0,1039 24,641 100,82 
100,668 0,30 
2 0,1012 24,623 100,75 
3 0,1008 24,650 100,86 
4 0,1035 24,600 100,65 
5 0,1022 24,460 100,08 
6 0,1028 24,646 100,84 
 
 
Tabla 16. Resultados de contenido de proteína en muestras tituladas con uso de indicador 
Muestra 
Cantidad de muestra 
[g] 
Proteína 
obtenida [%] 
% 
Recuperación 
Promedio de 
% 
recuperación 
Desv. 
Estándar de 
% 
recuperación 
1 0,1066 24,640 100,82 
100,674 0,64 
2 0,1035 24,526 100,35 
3 0,1029 24,602 100,66 
4 0,1060 24,350 99,63 
5 0,1039 24,800 101,47 
6 0,1057 24,710 101,10 
 
 
Tabla 17. Comparativo de resultados obtenidos con diferentes métodos de titulación 
Parámetro 
estadístico 
Muestras tituladas 
potenciométricamente 
Muestras 
tituladas con 
uso de 
indicador 
Media (xi) 100,67 100,67 
Desv. St. (Si) 0,30 0,64 
Cantidad de 
muestras (n) 
6 6 
 
 
La hipótesis nula adoptada es: que no existe diferencia significativa entre 
las muestras tituladas potenciométricamente y las muestras tituladas con uso de 
indicador. 
 
 
59 
 
S= 0,4976 
t= 0,0190 
 
De tablas con 5 grados de libertad, el valor crítico de t con 95% de 
significancia es de 2,57. 
 
t calculado es menor que t de tablas, por tanto se acepta la hipótesis nula, 
es decir, que no existe diferencia significativa entre las muestras tituladas 
potenciométricamente y las muestras tituladas con uso de indicador, cumpliendo 
con el criterio de aceptación establecido. 
También se calcula la diferencia absoluta de la media aritmética para 
comparación de ambas opciones de titulación. Se representa como % de 
recuperación. 
|di| = |100,668% - 100,674%| = 0,006% 
 
La diferencia es menor al 2%, por lo que cumple con el criterio de 
aceptación establecido, indicando que el método es robusto en lo que respecta a 
la titulación de la muestra. 
 
5.4. Límite de detección 
El límite de detección se calcula conforme a los datos obtenidosa partir de 
las 6 curvas de calibración. 
 
Tabla 18. Resultados obtenidos para el cálculo de los límites de detección y cuantificación 
Curva 1 
 Concentración Cantidad de Concentración Respuesta 
 
 
60 
 
muestra [g] 
Proteína [g] 
Volumen de 
HCl [mL] 
Pendiente 
Ordenada al 
origen 
r
2
 
1 0,0025 0,0006 0,061 
 
112,771 -0,011 0,9999 
2 0,0052 0,0013 0,139 
 
3 0,0101 0,0025 0,269 
 
4 0,0200 0,0049 0,573 
 
5 0,0402 0,0098 1,031 
 
6 0,0501 0,0122 1,362 
 
7 0,1002 0,0245 2,801 
 
8 0,1503 0,0367 4,111 
 
9 0,2000 0,0489 5,504 
 
 
Curva 2 
 
Concentración 
Cantidad de 
muestra [g] 
Concentración Respuesta 
 
Proteína [g] 
Volumen de 
HCl [mL] 
Pendiente 
Ordenada al 
origen 
r
2
 
1 0,0027 0,0007 0,067 
 
112,454 0,000 0,9999 
2 0,0052 0,0013 0,142 
 
3 0,0100 0,0024 0,286 
 
4 0,0204 0,0050 0,543 
 
5 0,0402 0,0098 1,089 
 
6 0,0503 0,0123 1,389 
 
7 0,1005 0,0246 2,812 
 
8 0,1501 0,0367 4,101 
 
9 0,2003 0,0490 5,500 
 
 Curva 3 
 
Concentración 
Cantidad de 
muestra [g] 
Concentración Respuesta 
 
Proteína [g] 
Volumen de 
HCl [mL] 
Pendiente 
Ordenada al 
origen 
r
2
 
1 0,0025 0,0006 0,069 
 
112,167 0,002 0,9999 
2 0,0052 0,0013 0,139 
 
3 0,0101 0,0025 0,280 
 
4 0,0200 0,0049 0,551 
 
5 0,0402 0,0098 1,082 
 
6 0,0501 0,0122 1,375 
 
7 0,1002 0,0245 2,814 
 
8 0,1503 0,0367 4,094 
 
9 0,2000 0,0489 5,479 
 
 Curva 4 
 
Concentración 
Cantidad de 
muestra [g] 
Concentración Respuesta 
 
Proteína [g] 
Volumen de 
HCl [mL] 
Pendiente 
Ordenada al 
origen 
r
2
 
1 0,0025 0,0006 0,063 
 
111,132 0,007 0,9999 
2 0,0052 0,0013 0,140 
 
3 0,0101 0,0025 0,278 
 
4 0,0200 0,0049 0,546 
 
 
61 
 
5 0,0402 0,0098 1,077 
 
6 0,0501 0,0122 1,386 
 
7 0,1002 0,0245 2,802 
 
8 0,1503 0,0367 4,053 
 
9 0,2000 0,0489 5,429 
 
 Curva 5 
 
Concentración 
Cantidad de 
muestra [g] 
Concentración Respuesta 
 
Proteína [g] 
Volumen de 
HCl [mL] 
Pendiente 
Ordenada al 
origen 
r
2
 
1 0,0025 0,0006 0,061 
 
114,084 -0,013 0,9999 
2 0,0052 0,0013 0,134 
 
3 0,0101 0,0025 0,286 
 
4 0,0200 0,0049 0,571 
 
5 0,0402 0,0098 1,086 
 
6 0,0501 0,0122 1,390 
 
7 0,1002 0,0245 2,712 
 
8 0,1503 0,0367 4,171 
 
9 0,2000 0,0489 5,601 
 
 
 
 Curva 6 
 
Concentración 
Cantidad de 
muestra [g] 
Concentración Respuesta 
 
Proteína [g] 
Volumen de 
HCl [mL] 
Pendiente 
Ordenada al 
origen 
r
2
 
1 0,0025 0,0006 0,070 
 
113,903 -0,013 0,9999 
2 0,0052 0,0013 0,142 
 
3 0,0101 0,0025 0,274 
 
4 0,0200 0,0049 0,539 
 
5 0,0402 0,0098 1,092 
 
6 0,0501 0,0122 1,403 
 
7 0,1002 0,0245 2,697 
 
8 0,1503 0,0367 4,202 
 
9 0,2000 0,0489 5,567 
 
 
 
Tabla 19. Parámetros estadísticos de las seis curvas de calibración 
Parámetro 
estadístico 
Pendiente 
Ordenada al 
origen 
r
2
 
Promedio 112,752 -0,005 1,000 
Desv. Est. 1,109 0,009 0,000 
CV 0,984 -181,382 0,003 
 
Se calcula el límite de detección conforme a la siguiente fórmula: 
 
 
62 
 
 
 
 ̅
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El promedio del coeficiente de correlación es igual a 1,000, que cumple con 
el criterio de aceptación establecido que indica que deberá ser mayor a 0,98. 
 
El límite de detección implica que el método presentará una respuesta a 
partir 0,001g de proteína. 
 
5.5. Límite de cuantificación 
Se emplean los mismos datos que para el caso del límite de detección. El 
límite de cuantificación se calcula conforme a la fórmula siguiente y los datos de la 
tabla 19: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El promedio del coeficiente de correlación es igual a 1,000, que es mayor al 
criterio de aceptación establecido, por lo que se considera aceptable. 
 
Como parte de la evaluación realizada por la ema, se solicita que se 
confirme el límite de cuantificación, para ello se determina la proteína en 5 
 
63 
 
muestras del estándar de leche, pesando la cantidad necesaria para tener la 
proteína determinada por el límite de cuantificación. 
 
Tabla 20. Verificación del límite de cuantificación 
Muestra 
Cantidad de 
muestra [g] 
% Proteína 
obtenido 
Proteína 
equivalente 
[g] 
1 0,0032 24,632 0,0008 
2 0,0034 24,329 0,0008 
3 0,0036 24,486 0,0009 
4 0,0035 24,723 0,0009 
5 0,0033 24,339 0,0008 
 
 
Promedio 0,0008 
 
Desv. St 0,0000 
 
De los datos obtenidos se comprueba que efectivamente el límite de 
cuantificación de proteína en la muestra es 0,0008 g proteína. 
 
5.6. Intervalo de trabajo 
Se analizan 9 concentraciones diferentes del material de referencia, 
obteniéndose los siguientes resultados: 
 
Tabla 21. Resultados del Intervalo de trabajo 
Concentración 
Cantidad de 
estándar [g] 
Proteína 
adicionada 
[g] 
Proteína 
obtenida 
[%] 
Proteína 
obtenida 
[g] 
% 
Recuperación 
1 0,0025 0,0006 24,124 0,0006 98,71 
 
Pendiente 0,9996 
2 0,0058 0,0014 24,155 0,0014 98,83 
 
Ordenada -0,0002 
3 0,0110 0,0027 24,597 0,0027 100,64 
 
r
2
 1,0000 
4 0,0504 0,0123 24,403 0,0123 99,85 
 
5 0,1002 0,0245 24,322 0,0244 99,52 
 
6 0,5003 0,1223 24,210 0,1211 99,06 
 
7 0,8002 0,1956 24,501 0,1961 100,25 
 
8 1,0001 0,2444 24,318 0,2432 99,50 
 
9 1,5000 0,3666 24,459 0,3669 100,08 
 
 
 
 
64 
 
Los criterios de aceptación para el intervalo de trabajo son: una pendiente 
con valor cercano a 1 y un coeficiente de correlación mayor o igual a 0,99; los 
resultados obtenidos para estos criterios son favorables, por lo que los resultados 
se consideran aceptables. El intervalo de trabajo obtenido es de 0,0006g a 0,3666 
g de proteína en la muestra. 
 
5.7. Linealidad 
Se construyeron 3 curvas de calibración, a partir de las cuales se obtienen 
los siguientes resultados. 
Tabla 22. Resultados para la prueba de linealidad 
Curva 1 
 
Concentración 
Cantidad de 
muestra [g] 
Proteína 
equivalente 
[g] 
Proteína 
obtenida 
[%] 
Proteína 
obtenida 
[g] 
% 
Recuperación 
1 0,0110 0,0027 24,897 0,0027 101,87 
 
Pendiente 1,0028 
2 0,0504 0,0123 24,731 0,0125 101,19 
 
Ordenada 0,0006 
3 0,1002 0,0245 24,224 0,0243 99,12 
 
r
2
 0,9999 
4 0,3006 0,0735 24,226 0,0728 99,12 
 
5 0,5003 0,1223 24,904 0,1246 101,90 
 
6 0,8002 0,1956 24,912 0,1993 101,93 
 
7 1,0001 0,2444 24,893 0,2490 101,85 
 
8 1,5000 0,3666 24,313 0,3647 99,48 
 
 
Curva 2 
 
Concentración 
Cantidad de 
muestra [g] 
Proteína 
equivalente 
[g] 
Proteína 
obtenida 
[%] 
Proteína 
obtenida 
[g] 
% 
Recuperación 
1 0,0097 0,0024 24,534 0,0024 100,38 
 
Pendiente 1,0025 
2 0,0500 0,0122 24,780 0,0124 101,39 
 
Ordenada -0,0001 
3 0,1007 0,0246 24,603 0,0248 100,67 
 
r
2
 1,0000 
4 0,3001 0,0733 24,421 0,0733 99,92 
 
5 0,5000 0,1222 24,428 0,1221 99,95 
 
6 0,7999 0,1955 24,426 0,1954 99,94 
 
7 1,0006 0,2445 24,479 0,2449 100,16 
 
8 1,5003 0,3667 24,522 0,3679 100,34 
 
 Curva 3 
 
Concentración 
Cantidad de 
muestra [g] 
Proteína 
equivalente 
[g] 
Proteína 
obtenida 
[%] 
Proteína 
obtenida 
[g] 
% 
Recuperación 
1 0,0110 0,0027 24,697 0,0027 101,05 
 
Pendiente 1,0056 
2 0,0501 0,0122 24,418 0,0122 99,91 
 
Ordenada -0,0001 
3 0,1003 0,0245 24,486 0,0246 100,19 
 
r
2
 1,0000 
 
65 
 
4 0,3003 0,0734 24,490 0,0735 100,20 
 
5 0,5001 0,1222 24,549 0,1228 100,45 
 
6 0,7999 0,1955 24,596 0,1967 100,64 
 
7 1,0002 0,2444 24,513 0,2452 100,30 
 
8 1,5000 0,3666 24,584 0,3688 100,59 
 
 
Tabla 23. Parámetros de las tres curvas de calibración 
 
Promedio Desv. St. C.V. 
Pendiente 1,0036 0,0017 0,1684 
Ordenada 0,0001 0,0004 307,9692 
r
2
 0,9999 0,0001 0,0085 
 
Tabla 24. % de recuperación 
Promedio 100,523 
Desv. St. 0,830 
C. V. 0,826