Variaciones-diarias-en-las-cantidades-de-glia-en-el-acocil-adulto-procambarus-clarkii

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
 
 
VARIACIONES DIARIAS EN LAS CANTIDADES DE 
GLÍA EN EL ACOCIL ADULTO Procambarus clarkii 
 
 
 
 
T E S I S 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 
 
 B I O L O G I A 
 
 
 
 P R E S E N T A : 
 
 
 MARÍA DE LA PAZ RODRÍGUEZ MUÑOZ 
 
 
 
 
 
 
DIRECTOR DE TESIS: 
DRA. ELSA GUADALUPE ESCAMILLA CHIMAL 
 
 
2014 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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HOJA DE DATOS DEL JURADO 
1. Datos del alumno 
Rodríguez 
Muñoz 
María de la Paz 
21 60 43 80 
Universidad Nacional Autónoma de 
México 
Facultad de Ciencias 
Biología 
304272990 
 
2. Datos del tutor 
Dra. 
Elsa Guadalupe 
Escamilla 
Chimal 
 
3. Datos del sinodal 1 
Dra. 
Gertrudis Hortensia 
González 
Gómez 
 
4. Datos del sinodal 2 
Dra. 
María del Carmen 
Miñana 
Solís 
 
5. Datos del sinodal 3 
M en C 
Enrique 
Moreno 
Sáenz 
 
6. Datos del sinodal 4 
M en C 
Marco Antonio 
Martínez 
Ávila 
 
7. Datos del trabajo escrito 
Variaciones diarias en las cantidades 
de glía en el acocil adulto 
Procambarus clarkii 
67 p 
2014 
DEDICATORIA 
Dedico esta tesis de licenciatura a mis padres 
Alejandra Muñoz y Eduardo Rodríguez 
quienes incondicionalmente me han guiado en el camino, 
por sus consejos, motivación, llamadas de atención, 
cuidados y amor, por su entrega a nosotras 
para hacernos personas moral y profesionalmente capaces, 
 además de los sacrificios que han hecho para darnos lo mejor. 
 Es mucha la paciencia que han tenido para ver llegar este momento, 
pero finalmente aquí está, ¡Papás lo logré, los amo! 
 
 
A mi hermana Viridiana que con sus ocurrencias 
ha dado alegría a mis días y espero que estas líneas 
te sirvan de motivación para seguir con tus metas, 
 concluirlas y saber que no esta sola que siempre estaré para ti, 
apoyándote en todo momento, te quiero. 
 
 
A la persona que se gana mi corazón día a día, 
que nunca me deja renunciar, que me motiva para ser mejor 
y que aún en las adversidades se mantiene fuerte para los dos. 
Gracias César López Torres por hacerme parte de tu vida. 
Te adoro. 
 
 
A mis abuelos adorados Paz Trejo y Agustín Rodríguez 
por creer en mi, por su cariño y cuidados que 
me tendrán a pesar de ser un adulto. 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
Gracias a la máxima casa de estudios Universidad Nacional Autónoma de México por abrirme sus 
puertas, permitirme formar parte de la Facultad de Ciencias y brindarme las herramientas para mi 
formación como profesionista. 
Agradezco a mi directora la Dra. Elsa Escamilla Chimal por introducirme en la rama de la 
Cronobiología, hacerme participe de su proyecto, asesoría, comentarios y revisiones. En especial a 
la Dra. María Luisa Fanjul por cobijarme para poder llevar a cabo mi tesis en el Laboratorio de 
Neurofisiología Comparada. Al M. en C. Julio Prieto por el apoyo y enseñanza. 
Gracias a mis sinodales Dra. Gertrudis Hortensia González Gómez, Dra. María del Carmen Miñana 
Solís, Dra. Elsa Guadalupe Escamilla Chimal, M. en C. Enrique Moreno Sáenz y M. en C. Marco 
Antonio Martínez Ávila por el apoyo, revisiones, correcciones y tiempo dedicado. 
 
Agradezco al M. en C. Marco Antonio Martínez Ávila y al Instituto Nacional de Pediatría por el 
préstamo del microscopio confocal, así como asistencia técnica para la obtención de las imágenes 
presentes en este trabajo de tesis. 
 
A la Dra. María del Carmen Miñana Solís y Dra. Diana Aguilar, por todo el apoyo que me han 
brindado, les agradezco enormemente por compartirme los conocimientos para la elaboración de 
esta tesis. 
 
Gracias a Suelem Moreno por el apoyo técnico durante su estancia en la Facultad, espero la hayas 
disfrutado. 
 
Al M. en C. David Salinas Torres por el apoyo y compromiso con lo que demuestra el valor de un 
verdadero académico. Gracias. 
 
A mis amigos Esther Sánchez por no olvidarme, a todos lo que me acompañaron a lo largo de la 
carrera por formar parte de los momentos más importantes en este periodo académico Giovani, 
Melbi, Manuel, Katia, Christian por las aventuras que compartimos en las clases. A mis amigos y 
compañeros del laboratorio Julio, Rosy, Jani, Ale, Mariana, Erick, Fabi, en especial a Rossaura 
Loredo y Sra. Patty por su amistad, apoyo y confianza. ¡A todos siempre les estaré agradecida! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Investigación realizada gracias al Programa 
de Apoyo a Proyectos de Investigación e 
Innovación Tecnológica (PAPIIT) de la 
UNAM IN222211 y a CONACYT 118032. 
Variaciones diarias de la glía en el acocil 
Procambarus clarkii durante la ontogenia. 
Agradezco a PAPIIT-DGAPA- UNAM la 
beca recibida por parte del proyecto. 
ÍNDICE 
1. Resumen………………………………………………………………………………… 4 
2. Introducción…………………………………………………………………………….. 5 
2.1. Ritmos biológicos……………………………………………………………………. 5 
2.1.1. Ritmos circadiano……………………………………………………………….. 7 
2.1.2. Maquinaria molecular del reloj en invertebrados………………………………... 9 
 Control molecular del reloj circadiano…………………………………………… 9 
2.1.2.1. Importancia de la Proteína PERIOD (PER) en invertebrados………………11 
2.2. El Acocil: Modelo de estudio………………………………………………………. 12 
2.2.1. Generalidades…………………………………………………………………... 12 
 Clasificación taxonómica del acocil Procambarus clarkii……………………... 13 
2.2.2. Sistema Nervioso Central………………………………………………………. 14 
2.2.2.1. Tallos oculares............................................................................................... 15 
2.2.2.2. Ganglio cerebroide…………………………………………………………. 17 
2.2.2.2.1. Protocerebro............................................................................................. 17 
2.2.2.2.2. Deutocerebro............................................................................................ 17 
2.2.2.2.3. Tritocerebro.............................................................................................. 18 
 2.3. Ritmos circadianos en el acocil Procambarus clarkii……………………………... 20 
2.4. Neuroglía…………………………………………………………………………… 22 
2.4.1. Proteína Ácida Fibrilar Glial (GFAP)………………………………………….. 26 
2.5. Ritmos biológicos y Glía…………………………………………………………… 27 
3. Justificación…………………………………………………………………………… 29 
4. Hipótesis……………………………………………………………………………….. 29 
5. Objetivos………………………………………………………………………………. 30 
6. Método…………………………………………………………………………………. 31 
6.1. Obtención de Animales…………………………………………………………….. 31 
6.2. Disección experimental de Procambarus………………………………………….. 31 
6.3. Cuantificación de Proteínas………………………………………………………... 31 
6.4. Ensayo de Inmunoabsorción Ligada a Enzima (ELISA) Indirecta para la Proteína 
Ácida Fibrilar Glial (GFAP)……………………………………………………………. 32 
6.5. Inmunofluorescencia……………………………………………………………….. 34 
6.6. Digitalización de Imágenes………………………………………………………… 35 
6.7. Análisis estadístico…………………………………………………………………. 35 
6.7.1. COSINOR……………………………………………………………………... 36 
6.7.2. Análisis de Varianza de una vía (ANOVA)…………………………………… 36 
7. Resultados……………………………………………………………………………... 38 
7.1. Cuantificación de ELISA para GFAP……………………………………………… 38 
7.1.1. Tallo Ocular…………………………………………………………………….39 
7.1.2. Ganglio Cerebroide…………………………………………………………….. 42 
7.2. Inmunofluorescencia……………………………………………………………….. 45 
7.2.1. Tallo ocular…………………………………………………………………….. 45 
7.2.2. Ganglio cerebroide……………………………………………………………... 47 
8. Discusión………………………………………………………………………………. 49 
9. Conclusiones…………………………………………………………………………... 53 
10. Literatura Citada……………………………………………………………………. 54 
 
 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
4 
 
1. RESUMEN 
En la naturaleza existen fenómenos cíclicos ambientales principalmente luminosos y de 
temperatura que influyen en los seres vivos a nivel fisiológico, celular, molecular y 
conductual, que se sincronizan armónicamente con el reloj interno y se expresan en el 
genoma. Actualmente, el estudio de la relación entre la estructura molecular del reloj 
biológico y la expresión de diversas proteínas, resulta de gran importancia, dadas las 
implicaciones fisiológicas y conductuales que muestran en los organismos. 
En el presente trabajo se analizaron las variaciones diarias en la cantidad de glía en la etapa 
adulta del acocil Procambarus clarkii, en seis diferentes horas del día en ciclos de LO 
12:12 y en condiciones de oscuridad constante (OO) en las posibles estructuras marcapasos: 
los tallos oculares y el ganglio cerebroide. 
 Se cuantificó la cantidad de glía mediante GFAP a partir del Ensayo de ELISA. También 
se realizaron cortes histológicos para la detección mediante la técnica de 
Inmunofluorescencia de doble marcaje para la proteína PERIOD y su identificación en 
diferentes regiones de las estructuras ya mencionadas y la co-localización con GFAP. 
Los resultados obtenidos mostraron que la cantidad de glía presenta oscilaciones 
circadianas y bimodales en ambas estructuras. La oscilación de los ritmos detectados bajo 
condiciones constantes expresaron libre corrimiento, mientras que en condiciones de 
sincronización en LO, se propone que la luz podría estar enmascarando el ritmo. La 
detección de las proteínas GFAP y PER por inmunofluorescencia mostraron que las células 
gliales presentan positividad a la proteína PERIOD. Lo anterior podría indicar que existe 
una posible influencia de estas células en la expresión de los ritmos en P. clarkii. 
 
 
 
 
 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
5 
 
2. INTRODUCCIÓN 
2.1. Ritmos biológicos 
La apreciación del tiempo desde el origen de la vida hasta nuestros días para todos los seres 
vivos resulta de gran importancia respecto a su reproducción, migración y alimentación, 
entre otras necesidades fisiológicas y conductuales (tasa metabólica, síntesis de hormonas, 
floración, etc.) que suelen estar asociadas a variaciones periódicas ambientales. La 
transición entre el día y la noche y el cambio de estaciones debido a la rotación y traslación 
de la Tierra, son fundamentales en la percepción del tiempo, en términos de duración y 
predicción de fenómenos naturales para la supervivencia (Dunlap, et al., 2004). 
Los ritmos como respuesta adaptativa de los organismos a su entorno físico y vital, 
representan geofísicamente la alternancia frecuente entre periodos de actividad máxima y 
de reposo; y biológicamente reflejan las variaciones en los potenciales de excitabilidad de 
las células, latidos cardiacos, secreción de hormonas, entre otras; que son reguladas por la 
expresión de genes localizados en estructuras moleculares y anatómicas (genes reloj) que 
demuestran el proceso endógeno del ritmo, así como un mecanismo interno de 
temporización (reloj biológico). Lo anterior se respalda con los experimentos de apertura y 
cierre de hojas de Mimosa pudica durante el día y la noche respectivamente, realizados por 
DeMairan en 1729, Duhamel en 1758 y DeCandolle en 1832 (en Pittendrigh, 1981), esto 
llevó a concluir años más tarde la existencia de un zeitgeber (dador de tiempo), es decir, un 
agente externo (luz-oscuridad, temperatura, alimento) o interno (procesos metabólicos 
relacionados principalmente con el alimento) capaz de sincronizar un ritmo (Pittendrigh, 
1981; Gruart, et al., 2002). 
Las características que describen un ritmo son las siguientes (Vega, 1993; Fig. 1): 
Periodo: se define como el intervalo de tiempo que ocurre entre dos sucesos similares 
respecto a un punto de referencia, es decir, la duración de un ciclo completo expresado en 
unidad de tiempo; se denomina con τ (tau) cuando se trata de un ritmo endógeno y con T 
cuando se refiere al periodo del ritmo manifiesto. 
Frecuencia: se refiere al número de veces que se repite un suceso en determinado tiempo. 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
6 
 
Mesor o media: es el promedio de todos los valores de un ciclo. 
Amplitud: es la magnitud de la variación de un suceso en un tiempo determinado, se 
obtiene de la diferencia entre el valor de la cresta y el valle; y se representa con a, en tanto 
que la amplitud del zeitgeber se representa con A. 
Fase: es el valor instantáneo de un ciclo y se simboliza φ (phi). 
Acrofase: es el valor máximo que alcanza un ciclo. 
Batifase: es el valor mínimo de un ciclo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Representación de una curva cosinusoidal en la que se muestran las características de 
un ritmo biológico. 
 
La clasificación de los ritmos, introducida en 1959 por Franz Halberg, está condicionada 
por el ajuste del ritmo a cualquier ciclo geofísico, es decir por el periodo, como los 
circadianos que se repiten con una frecuencia cercana a un día, circamareales con 
frecuencia cercana a la de las mareas, circalunares con frecuencia cercana al ciclo lunar y 
circanuales con frecuencia cercana a un año (Cardinali y Golombek, 1994). 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
7 
 
Otra clasificación de los ritmos es por su frecuencia, entre estos están los ritmos 
circadianos, los ultradianos que ocurren más de una vez durante el día y los infradianos 
que requieren más de un día para repetirse. 
 
2.1.1. Ritmos circadianos 
 
Los ritmos que han sido ampliamente estudiados y causan gran interés son los ritmos 
circadianos, ritmo diario que presenta una periodicidad cercana a las 24 horas, 
generalmente muestran periodos de entre 20 a 28 horas. 
Propiedades que definen un ritmo circadiano: 
 Son endógenos y están determinados genéticamente. 
 Persisten en condiciones constantes. 
 Compensan los cambios de temperatura 
 Pueden ser sincronizados por factores ambientales con un periodo cercano a las 24 
horas. 
El sistema circadiano está constituido por un marcapasos y varios osciladores que logran 
interactuar entre sí y sincronizarse al ambiente gracias a un acoplamiento interno, existen 
dos tipos de osciladores: primario o central, que se caracteriza por ser autosostenible, esto 
es, que no depende de otros para generar un ritmo biológico y cuenta con vías de 
sincronización con factores externos o internos; y secundarios o periféricos, los cuales 
dependen del primario para mantener la amplitud de su oscilación, se sincronizan y acoplan 
entre ellos al transmitir la información hacia los efectores, para expresar la señal fisiológica 
y así producir un ritmo coordinado, ver Figura 2 (Moore-Ede, et al., 1982; Herzog, 2007). 
Debido a que los ritmos circadianos son controlados por osciladores internos, existen 
ciertos criterios que comparten para definir a un oscilador: 1) actividad oscilatoria 
circadiana autónoma en condiciones constantes de oscuridad o luz, 2) sincronización con 
señales externas para ajustar su fase a la de parámetros ambientales como luz o 
temperatura, 3) pérdida del ritmo circadiano después de la ablación de tejidos o grupos 
																																																																						María de la Paz RodríguezMuñoz 
 
8 
 
celulares específicos, 4) reactivación de la ritmicidad después del transplante de células 
específicas y 5) autonomía de la actividad circadiana in vitro del tejido marcapaso aislado 
por un lapso de tiempo razonable (Dunlap, 1999). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 2. Dibujo esquemático de los elementos que componen al Sistema Circadiano (Modificado 
de Moore-Ede, et al., 1982). 
 
Entre los organismos en los que puede observarse este fenómeno se encuentran las plantas 
(con fotopigmentos asociados a células fotorreceptoras; Capel, et al., 2003), crustáceos 
(que poseen un tallo ocular, ganglio cerebroide, ganglio abdominal caudal; Aréchiga, et al., 
1993), moluscos e insectos (a través de un tallo ocular y cerebro; Siwicki, et al., 1989), 
aves (mediante una glándula pineal; Cassone y Menaker, 1984) y mamíferos (por medio de 
un núcleo supraquiasmático; Aguilar-Roblero y Drucker-Colín, 1987), entre otros. 
 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
9 
 
2.1.2. Maquinaria molecular del reloj en invertebrados 
Control molecular del reloj circadiano 
La adaptación a un planeta con características periódicas marcadas, debió fijar procesos 
funcionales orgánicos (fisiológicos y conductuales) que se expresan en el genoma de los 
organismos y son modulados por un mecanismo interno (reloj biológico), capaz de generar 
ritmos sin necesidad de estímulos ambientales, que permite medir el tiempo (geográfico y 
biológico) con gran precisión. El hecho de que existan osciladores autónomos a nivel de 
entradas sensoriales capaces de interactuar con un oscilador central (retroalimentación), 
indica que existe un nivel complejo de regulación en el sistema circadiano (Golombek, 
1997). 
La maquinaria molecular del reloj circadiano se compone de un grupo de genes llamados 
genes reloj cuyos productos proteicos son necesarios para la generación y regulación de los 
ritmos biológicos, principalmente los circadianos. En la mosca de la fruta Drosophila 
melanogaster esta maquinaria es ya conocida y ha sido elemental para entender los 
procesos celulares, bioquímicos y fisiológicos tanto en vertebrados, principalmente 
mamíferos, como en invertebrados, plantas, hongos y protozoos (Harmer, et al., 2001). 
Ocho genes reloj que componen al oscilador circadiano de Drosophila han sido 
identificados: period (per), timeless (tim), clock (clk), cycle (cyc), doble-time (dbt), shaggy 
(sgg), vrille (vri) y cryptochrome (cry), así como sus respectivas proteínas (Helfrich-
Förster, 2003). 
La expresión de estos genes está regulada por dos asas de retroalimentación intracelulares 
(activación/represión transcripcional) la primera integrada por PER/TIM y la segunda por 
CLK/CYC (Fig. 3), ambas presentan dominios bHLH que contiene regiones de unión a 
ADN, específicamente a la secuencia E-box y PAS que facilitan la unión entre proteínas. 
En la primera de las asas, la transcripción de los genes reloj per, tim, vri y Pdp1Ɛ se activa 
por la unión del heteródimero CLK/CYC a una secuencia E-box para codificar sus 
proteínas. Posteriormente, TIM se acumula durante la noche tardía y se une al complejo 
formando el heterodímero PER/TIM para transportarse al núcleo. En la segunda asa, la 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
10 
 
transcripción de vri y Pdp1Ɛ empieza al inicio de la noche. VRI se acumula e inhibe a 
CLK, mientras Pdp1Ɛ aumenta para activar la transcripción de CLK (Hardin, 2005; 
Hernández-Rosas y Santiago-García, 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 3. Control molecular del reloj circadiano (Modificado de Hardin, 2005). 
 
 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
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2.1.2.1 Importancia de la proteína PERIOD (PER) en invertebrados 
 
PER es una proteína dominio que pertenece a la superfamilia de proteínas bHLH/PAS 
(factores de transcripción), actúa como un represor transcripcional al formar un 
heterodímero con TIM para unirse a secuencias reguladoras de ADN y regular su propia 
expresión a través de un asa de retroalimentación negativa como parte de la maquinaria del 
reloj biológico (Strauss y Dircksen, 2010). En Drosophila, se ha demostrado que PER es 
indispensable para la ritmicidad circadiana debido a que la mutación puede afectar 
cualquier ritmo desde actividad locomotora, eclosión pupal hasta latidos cardiacos 
(Konopka, 1987). 
Siwicki y colaboradores en 1989 encontraron inmunoreactividad a una región de PER 
altamente conservada en insectos, así como ritmos circadianos, particularmente nocturnos, 
en el sistema visual y nervioso de dos gasterópodos marinos Aplysia sp. y Bulla sp., 
principalmente en fibras del nervio óptico, pequeños cuerpos celulares del ganglio central, 
neurópilo de las células retinulares, citoplasma de cuerpos celulares neuronales y el ganglio 
accesorio en la región lateral del cerebro. 
Un año después en 1990, Zerr y colaboradores encontraron fluctuaciones circadianas de 
PER en el sistema visual y SNC de Drosophila (adulto) al utilizar mutantes del gen per 
mediante técnicas inmunohistoquímicas que revelaron la presencia de esta proteína en 
fotorreceptores, supuestas células gliales en distintos ganglios, así como algunas neuronas 
localizadas en regiones laterales del cerebro central. 
En 1998, Árechiga y Rodríguez-Sosa a través de técnicas de inmunotinción, mostraron que 
ciertas estructuras del tallo ocular del acocil Procambarus clarkii tienen positividad a PER 
tales como la lamina ganglionaris, células fotorreceptoras y células no neuronales dentro 
del lóbulo óptico que habían sido identificadas como células gliales (Hámori y Horridge, 
1966). 
 
 
 
 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
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2.2. El Acocil: Modelo de estudio 
2.2.1. Generalidades 
El acocil es un crustáceo decápodo de agua dulce que se localiza principalmente en la zona 
templada de Norteamérica, su distribución nativa es en el noreste de México y al centro-sur 
de Estados Unidos hacia el oeste de Texas y hacia el este de Alabama. Actualmente, los 
acociles se agrupan en 29 géneros y más de 500 especies incluidas en tres familias 
Astacidae, Cambaridae y Parastacidae. Los acociles que se localizan en el noreste de 
México se clasifican en 53 especies, la mayor parte de su biodiversidad corresponde al 
género Procambarus con 43 especies, una de ellas P. clarkii también conocido como acocil 
rojo (Taylor, 2002). 
Procambarus clarkii (Fig. 4) es un organismo bentónico de ecosistemas de agua dulce 
como ríos, arroyos, cuerpos de agua de cavernas, pantanos, lagunas temporales y estuarios. 
Es una especie de hábitos nocturnos y excavador, está adaptado para vivir en áreas 
alternadamente inundadas y secas. De día se oculta en madrigueras o cualquier refugio 
disponible y de noche se alimenta y reproduce. Es considerado politrófico, su alimento 
consta esencialmente de detritos de plantas, macro, microinvertebrados y peces, además de 
ser oportunista y presentar canibalismo (Rodríguez-Almaraz y Muñiz-Martínez, 2008). 
 Ecológicamente, los acociles desempeñan un papel importante como transformadores de 
energía en la red trófica ya sea como consumidores o presas, principalmente de aves y 
mamíferos. Por otra parte, las adaptaciones fisiológicas que han desarrollado los acociles 
para sobrevivir en cualquier ambiente han provocado su propagación fuera de sus límites 
naturales (accidentalmente o introducidos). Lo anterior ha generado no solo la distribución 
propia del acocil sino también de especies nativas, así como la biodiversidad y dinámica de 
las comunidades invadidas; no obstante, debido a su importancia comercial, la introducción 
de algunas especiesde acociles aumenta el valor de su captura a través de la pesca y 
acuicultura debido a que su producción es de aproximadamente el 85% de los decápodos de 
agua dulce (Holdich, 2002). 
Las características primordiales que han hecho de P. clarkii un modelo experimental ideal 
dentro de la fisiología comparada para el estudio de los ritmos biológicos son su 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
13 
 
simplicidad en términos de anatomía, tamaño, fácil manejo en el laboratorio y amplio 
conocimiento de la maquinaría molecular de su reloj (Hardin, 2005) han permitido avances 
en distintas ramas de la biología como son neurofisiología, electrofisiología, ecofisiología 
entre otras. 
Clasificación taxonómica del acocil Procambarus clarkii (Holdich, 2002). 
Reino: Animalia 
Phylum: Arthropoda 
Subphylum: Mandibulata 
Clase: Crustacea (Brünnich, 1772) 
Subclase: Malacostraca (Latreille, 1802) 
Superorden: Eucarida (Calman, 1904) 
Orden: Decapoda (Latreille, 1802) 
Suborden: Pleocyemata (Burkenroad, 1963) 
Infraorden: Astacidea (Latreille, 1802) 
Superfamilia: Astacoidea (Latreille, 1802) 
Familia: Carambidae (Hobbs, 1942) 
 Subfamilia: Carambinae (Hobbs, 1942) 
Género: Procambarus (Ortmann, 1905) 
Especie: P. clarkii (Girard, 1852) 
 
 
 
 
 
 
Fig. 4. Ejemplar de acocil adulto Procambarus clarkii. 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
14 
 
2.2.2. Sistema Nervioso Central 
El sistema nervioso central (SNC) del acocil (Fig. 5) está formado por un sistema nervioso 
ganglionar, compuesto por el ganglio cerebroide, también llamado supraesofágico que 
hacia la región anterior proyecta dos pedúnculos oculares y hacia la posterior o caudal se 
extiende por la cadena ganglionar, presenta tres tipos de neuronas: sensoriales, motoras e 
interneuronas, asociadas a tejido glíal (Sandeman, 1982). Los ganglios se encuentran 
organizados en el neurópilo central que incluye axones, dendritas y grupos periféricos del 
cuerpo celular conectados entre sí por comisuras transversales y conectivos longitudinales 
envueltos por el perineuro, una vaina gruesa constituida por fibras de colágeno y capas 
celulares. El ganglio cerebroide da origen a cinco pares de nervios que corresponden al 
óptico, motor ocular común, antenular, antenal, tegumentario y dos no pareados que están 
relacionados con la red neuronal del esófago (Holdich, 2002). 
A continuación se describen las estructuras que comprenden el SNC del acocil. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 5. Dibujo esquemático de Sistema Nervioso Central de Procambarus clarkii (Modificado 
de Holdich, 2002). 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
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2.2.2.1. Tallos oculares 
El sistema visual del acocil está formado por dos ojos compuestos (tallos oculares) 
constituidos por diferentes unidades fotorreceptoras dentro de la retina llamadas omatidias. 
Estas se encuentran conectadas por la zona fasciculada a cinco neurópilos rodeados de 
neuronas periféricas organizadas dentro del lóbulo óptico: la lámina ganglionaris, tres 
médulas: externa, interna y terminalis, y el cuerpo hemielipsoidal; además del órgano 
neuroendocrino formado por el complejo órgano X glándula sinusal (OX-GS), que está 
constituido por un grupo de entre 150-200 células, encargado del control neuroendocrino y 
de la secreción de neurohormonas peptídicas. En los crustáceos, cada tallo ocular tiene 
movimiento a través de músculos oculomotores (Fig. 6A) (Hanström, 1924; Da Silva, et 
al., 2004; Durán-Lizarraga, et al., 2008). 
Los axones que enlazan la lámina y la médula externa, así como propiamente las médulas 
interna y externa, forman quiasmas. En los neurópilos ópticos de crustáceos, existe una 
zona de proliferación celular localizada en el par de discos ópticos, estas células crecen en 
tres direcciones: 1) hacia y alrededor de la superficie externa del ojo para formar la 
omatidia, 2) a través del ojo para formar la lámina y 3) en 90° para posteriormente dar lugar 
a la médula externa (Sandeman, 1982). 
Cada omatidia está compuesta por tres estructuras (Fig. 6B): 
Córnea. Cutícula formada por células epidérmicas especiales llamadas células 
corneágenas. Estás pueden formar células pigmentarias primarias a los lados de la omatidia. 
Cono cristalino. Se encuentra en el centro de cada omatidia y es producido por un 
grupo de células del cono cristalino y un tallo del cono cristalino. Es una estructura 
transparente y dura que está rodeada por células pigmentadas primarias que contienen el 
pigmento distal. 
Retina. Estructura constituida por ocho células retinulares, unidades fotosensoriales 
que dan lugar a las vías nerviosas sensoriales, dispuestas radialmente a lo largo del eje de la 
omatidia. Al conjunto de microvellosidades (rabdomos) de las células retinulares 
extendidas hacia el eje central de la omatidia se le llama rabdómero. Dentro del citoplasma 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
16 
 
de las células retinulares se encuentra el pigmento proximal. Por encima de la membrana 
basal se localizan un grupo de células llamadas células del pigmento reflector o células del 
tapetum. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. A) Esquema del tallo ocular de P. clarkii. Retina R; lámina ganglionaris LG; 
médula externa ME; glándula sinusoidal GS; médula interna MI; tracto del complejo glándula 
sinusal/órgano x OX-GS; médula terminalis MT; órgano x OX; cuerpo hemielipsoidal HB y 
tracto óptico OT. (Modificado de Escamilla-Chimal, et al., 2001). B) Diagrama de omatidios 
adaptados a diferentes condiciones de iluminación con sus respectivas estructuras (Modificado 
de Holdich, 2002). 
A)  B) 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
17 
 
2.2.2.2. Ganglio cerebroide 
El ganglio cerebroide del acocil está constituido por el protocerebro, el deutocerebro y el 
tritocerebro (Fig. 7). Presenta grupos de cuerpos celulares denominados con números: 6, 7, 
8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 y 17 de acuerdo con la clasificación de Sandeman y 
colaboradores (1982, 1992). 
2.2.2.2.1. Protocerebro 
Es el principal responsable de los procesos de la información visual. Está constituido por 
cuatro grupos de cuerpos celulares: anterior (AC, por sus siglas en inglés), anterior ventral 
pareado (VPAC, por sus siglas en inglés), ventral medial pareado (VPMC, por sus siglas en 
inglés) y ventral medial (VUMC, por sus siglas en inglés) (Blaustein, et al., 1988) y está 
dividido en tres zonas: 
Lóbulo óptico: compuesto por la lámina ganglionaris, médula externa, médula interna y la 
médula terminalis. 
Protocerebro lateral: formado por dos neurópilos, la médula terminalis en donde se 
localizan las células neurosecretoras del sistema OX-GS y el cuerpo hemielipsoidal 
(Hanström, 1924). 
Protocerebro medio: organizado por el tracto protocerebral (PT, por sus siglas en inglés), el 
nervio oculomotor (OMNv, por sus siglas en inglés) dos neurópilos mediales anteriores 
(AMPN, por sus siglas en inglés) y dos neurópilos impares posteriores (PMPN, por sus 
siglas en inglés) unidos por el puente protocerebral (PB, por sus siglas en inglés), además 
del cuerpo central (CB, por sus siglas en inglés) (Sandeman, et al., 1992). 
2.2.2.2.2. Deutocerebro 
Es la estructura encargada de integrar y procesar la información olfatoria, presenta tres 
pares de grupos de cuerpos celulares: lateral ventral pareado (VPCL, por sus siglas en 
inglés), lateral (LC, por sus siglas en inglés) y anterior dorsal (DAC, por sus siglas en 
inglés), que envían neuritas en las regiones principales de los neurópilos del deutocerebro 
(Blaustein, et al., 1988). Está formado por los lóbulosolfatorios (OL, por sus siglas en 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
18 
 
inglés), los neurópilos antenulares laterales (LAN, por sus siglas en inglés) y mediales 
(MAN, por sus siglas en inglés), los lóbulos accesorios (AL, por sus siglas en inglés), el 
neurópilo de la comisura deutocerebral (DCN, por sus siglas en inglés) y el neurópilo del 
tracto globular olfatorio (OGT, por sus siglas en inglés) (Holdich, 2002 y Sullivan, et al., 
2009). 
Tres grupos de cuerpos celulares: posterior ventral único (VUPC, por sus siglas en inglés), 
posterior ventral pareado (VPPC, por sus siglas en inglés) y mediales dorsales (DMC, por 
sus siglas en inglés) se encuentran entre el deuto y el tritocerebro y un grupo de cuerpos 
celulares posteriores dorsales (DPC, por sus siglas en inglés) (Blaustein, et al., 1988). 
2.2.2.2.3. Tritocerebro 
El Tritocerebro está compuesto por los neurópilos antenulares (AN, por sus siglas en 
inglés), los neurópilos tegumentarios (TN, por sus siglas en inglés), los ganglios 
comisurales y comisura postesofágica (OES, por sus siglas en inglés), es la región donde se 
unen el ganglio cerebroide con el ganglio subesofágico y la cadena ganglionar (Sandeman, 
et al., 1992 y Sullivan, et al., 2009). Los neurópilos antenulares reciben la información 
aferente primaria del nervio antenular (AiiNv, por sus siglas en inglés) en la parte lateral 
del tritocerebro (Blaustein, et al., 1988). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
19 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Diagrama de la vista dorsal y ventral del cerebro del acocil Procambarus clarkii. 
Se muestran los grupos de cuerpos celulares y regiones principales de los neurópilos y nervios. 
Abreviaciones: Vista dorsal 6, 8, 11, 14, 15 y 17; vista ventral 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 16 y 17 
(Grupos de cuerpos celulares AC, VPAC, LC, DAC, respectivamente), tracto protocerebral 
(PT), nervio oculomotor (OMNv), nervio I de la antena (AiNv), neurópilo protocerebral medio 
anterior (AMPN), puente protocerebral (PB), cuerpo central (CB), neurópilo de la comisura 
deutocerebral (DCN), nervio tegumentario (TNv), neurópilo protocerebral medio posterior 
(PMPN), lóbulo olfatorio (OL), tracto globular olfatorio (OGT), lóbulo accesorio (AL), 
neurópilo antenular (AN), neurópilo antenular lateral (LAN), neurópilos antenulares mediales 
(MAN), neurópilo tegumentario (TN), nervio II de la antena (AiiNv),conectivo esofágico 
(OES) (Modificado de Sandeman, et al., 1992). 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
20 
 
2.3. Los ritmos circadianos en el acocil Procambarus clarkii 
Esta especie muestra gran variedad de ritmos circadianos controlados por funciones 
periódicas del sistema nervioso. Hasta el momento en este organismo se han identificado 
sitios que funcionan como marcapasos putativos circadianos tales como la retina, el lóbulo 
óptico, el ganglio cerebroide y el sexto ganglio abdominal de la cadena ganglionar (Fig. 8). 
Se ha reportado que en este acocil se expresan ritmos de actividad locomotora (Fanjul-
Moles y Prieto-Sagredo, 2003), en la amplitud del electrorretinograma (ERG) (Fanjul-
Moles, et al., 1987), en la presencia de proteínas reloj como PER, TIM, CLK (Escamilla-
Chimal, et al., 2010); en neurohormonas como la serotonina (o 5-hidroxitriptamina 5-HT 
Escamilla-Chimal, et al., 1998, 2001), en la hormona hiperglucemiante de crustáceos 
(CHH, por sus siglas en inglés Durán-Lizarraga, et al., 2008), en la hormona concentradora 
del pigmento rojo (RPCH, por sus siglas en inglés Aréchiga y Rodríguez-Sosa, 2002), por 
mencionar algunos. 
Con respecto a los tallos oculares, varios autores, han demostrado que la ablación de los 
estos altera los ritmos circadianos de actividad locomotora y metabólica; otros estudios 
sugieren que los ritmos del ERG son controlados por mecanismos neurales y 
neuroendocrinos dependientes del ganglio cerebroide y estructuras neurosecretoras del 
lóbulo óptico, específicamente del complejo OX-GS, por consiguiente, la retina presenta 
ritmos en respuesta a la luz y el tallo ocular ritmos de actividad neurosecretora (Aréchiga y 
Rodríguez-Sosa, 2002; Fanjul-Moles y Prieto-Sagredo, 2003). 
Por otro lado, dada la conexión de los tallos oculares con el ganglio cerebroide vía nervios 
ópticos, se sabe que el oscilador circadiano del ganglio cerebroide regula el ritmo de 
sensibilidad a la luz dependiente de los pigmentos distales, puesto que experimentos han 
confirmado la eliminación del ritmo de sensibilidad a la luz mediante la extirpación del 
ganglio cerebroide. También se ha propuesto, que el sexto ganglio abdominal de la cadena 
ganglionar, presenta un ritmo circadiano de actividad eléctrica neuronal y persiste aun 
cuando es extraído del organismo (Aréchiga, et al., 1993). 
Con base en todos los experimentos que se han hecho y a los resultados obtenidos sobre el 
sistema circadiano de P. clarkii, se cree que este sistema es de tipo multioscilatorio ya que 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
21 
 
está constituido funcionalmente por diversos osciladores que podrían presentar ritmos 
simultáneos con diferentes periodos (Strauss y Dircksen, 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 8. Diagrama esquemático del Sistema Circadiano Multioscilatorio y sus analogías 
funcionales en el acocil Procambarus clarkii. Se muestran los marcapasos putativos 
propuestos en el acocil, así como sus funciones, además de los diversos osciladores en la retina, 
el complejo órgano X-glándula sinusal (OX-GS), ganglio cerebroide y fotorreceptor caudal 
(CPR, por sus siglas en inglés). (Modificado de Strauss y Dircksen, 2010). 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
22 
 
2.4. Neuroglía 
El SNC además de neuronas, también incluye a la neuroglia, células que desempeñan un 
papel fundamental en el sistema, debido a que ayudan al desarrollo neuronal a través de 
soporte trófico, proveen mantenimiento y aislamiento celular y neuronal, asimismo, regulan 
el reciclaje de neurotransmisores y el espacio extracelular de las neuronas mediante balance 
iónico (Edwards y Meinertzhagen, 2010). 
En 2001, Da Silva y colaboradores, apoyaron la idea de que las células gliales de crustáceos 
decápodos interactúan metabólicamente con las neuronas mediante el intercambio de 
metabolitos y eliminación de catabolitos. 
Por otra parte, se cree que la glía puede generar potenciales de acción, estudios recientes 
demuestran que un subconjunto de la glía es capaz de disparar estos potenciales. 
Anteriormente, se sabía que las únicas células nerviosas que pueden producir estos 
potenciales son las neuronas, no obstante, Káradóttir y colaboradores en 2008 encontraron 
mediante doble inmunotinción la expresión de proteoglicano NG2+ en algunas células 
gliales de la materia gris y blanca en el sistema nervioso central de mamíferos, a este tipo 
de glía se le conoce como células precursoras de oligodendrocitos (OPC's, por sus siglas en 
inglés), 'polidendrocitos' y 'sinatocitos' o simplemente glía NG2+ (Otis y Sofroniew, 2008). 
La capacidad de estas células gliales NG2+ para generar potenciales de acción es gracias a 
la expresión de canales de voltaje dependientes de Na+ y lo más importante es que recibe 
señales de entrada sináptica excitatoria directamente de las neuronas, lo cual sugiere una 
función intrínseca celular como la transición inicial de las células NG2+ a oligodendrocitos 
mielinizados y al igual que los astrocitos, podrían garantizar la transmisión nodal en axones 
mielinizados (Malatesta, et al., 2003). 
Con base en lo anterior, ciertosestudios demuestran y sugieren que en invertebrados 
superiores (crustáceos), las células gliales también podrían generar potenciales de acción 
dadas las similitudes morfológicas que presentan estás células con las de vertebrados, 
particularmente de mamíferos. En crustáceos, existen tres características importantes 
respecto a la relación glía-neurona, una de ellas fue propuesta por Heuser y Doggenweiler 
en 1966. La primera es que los axones poseen una envoltura de células parecidas a las de 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
23 
 
Schwann, igualmente hay algunas especies que presentan estructuras que parecen ser 
homólogas a los nódulos de Ranvier, debido a esto se cree que las células parecidas a las de 
Schwann incrementan la velocidad de conducción, de manera análoga a la mielina en los 
axones de vertebrados (Fig. 9A). La segunda característica común presente en la glía tanto 
de vertebrados como de invertebrados, es la acumulación de glucógeno dentro de las 
células gliales (Da Silva, 2001). Y la tercera característica compartida en vertebrados e 
invertebrados, es la producción del ácido N- acetil-aspártico-glutámico o glutamato como 
agente químico de señalización entre axones y células gliales periaxonales en sitios no 
sinápticos de las fibras nerviosas del acocil y principal neurotransmisor excitatorio en 
sinapsis musculares de invertebrados (Buttram, et al., 2002). 
Lane y Abbott en 1975, observaron que los ganglios de los crustáceos tienen un perineuro 
que se encuentra bajo el neurilema, así como líneas de vesículas sanguíneas en el cerebro 
(Fig. 9B). Esta capa perineural contiene numerosas mitocondrias, estructuras de Golgi y 
retículo endoplásmico rugoso. Cada célula perineural está conectada a través de uniones 
especializadas como gap, parecidas a desmosomas y ocasionalmente estrechas. Asimismo, 
encontraron que los géneros Procambarus y Cambarus presentan un sistema complejo de 
túbulos anastomosados y canales trans-gliales, estos últimos contienen colinesterasa y 
podrían ser un sitio de liberación de neurotransmisores, igualmente podrían actuar como 
una vía rápida por la que el fluido extracelular puede ser transportado a las neuronas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
24 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Diagramas que muestran la relación glía-neurona en crustáceos. A) Complejo 
vaina-axón. Corte transversal del nervio. Las células gliales forman láminas concéntricas 
alrededor del axón y da lugar a la vaina, su interior está constituido por mesaxones altamente 
organizados, una zona de sujeción radial, análoga a una pila de desmosomas y el núcleo de la 
vaina localizada en la lámina más interna. B) Sistema glio-vascular en crustáceos. Las células 
gliales (g) se encuentran entre las células perineurales y las neuronas (n). Los vasos sanguíneos 
(vs) están cubiertos con células endoteliales (en) las cuales se extienden en canales cerrados 
rodeados por células perineurales (p), (Modificado de Heuser y Doggenweiler, 1966; Radojcic 
y Pentreath, 1979). 
 
En el protocerebro del cangrejo Ucides cordatus exactamente en la zona fasciculada y el 
tracto protocerebral, se han identificado a través de un estudio ultraestructural, dos tipos de 
células gliales: periaxonales electrolucentes y perineuriales electrodensas, lo cual sugiere 
que los procesos de células gliales contienen un material denso homogéneo que madura 
para actuar como una envoltura aislante para las neuronas, en comparación con la vaina de 
mielina en vertebrados (Allodi y Taffarel, 1999; Allodi, et al., 1999). 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
25 
 
De acuerdo con lo que reporta Hoyle en 1986, las funciones de la glía varían según el 
subtipo y localización en el cerebro de los invertebrados. Igualmente, Hámori y Horridge, 
en 1966, y Radojcic y Pentreath en 1979, señalan que las células gliales han sido 
clasificadas con base en ciertos criterios funcionales, morfológicos y respecto a su posición 
dentro del sistema nervioso en artrópodos, crustáceos, anélidos y moluscos.  
La clasificación de las células de la glía en insectos, está determinada por el lugar que 
ocupan en los diferentes compartimentos que se encuentran en el SNC tales como, la 
superficie ganglionar alrededor del cerebro, la corteza, entre las sinapsis en el neurópilo y 
ciertas regiones del lóbulo óptico (Stork, et al., 2008). 
Glía de la Superficie Ganglionar. Forma la capa más externa de la barrera 
hematoencefálica (BBB, por sus siglas en inglés). Está organizada en dos tipos de células 
gliales, según su localización y morfología: 1) perineural, que actúa como una capa glial 
apical de la BBB y 2) subperineural, componente principal de la BBB (Awasaki, et al., 
2008). 
Glía de la Corteza Cerebral. Las células gliales de la corteza cerebral forman una capa que 
envuelve los cuerpos celulares de las neuronas del SNC (Awasaki, et al., 2008), también 
llamadas células satélite en el sistema visual, las cuales forman uniones septadas, 
desmosomas y uniones estrechas ocluyentes que actúan como una segunda capa de la BBB 
(Tix, et al., 1997). 
Glía del Neurópilo. Presenta dos subtipos de glía: 1) fibrosa, constituida por células de 
recubrimiento que aíslan compartimientos neuronales vecinos además responden a lesión 
axonal y 2) células parecidas a astrocitos, asociadas con los axones y sus fascículos, su 
función principal es proveer soporte trófico para supervivencia neuronal y modular las 
conexiones neuronales (Awasaki, et al., 2008; Simon, et al., 2011). 
Glía epitelial de la lámina del lóbulo óptico. Formada por neurópilos gliales que se 
extienden en la parte profunda de la lámina, son característicamente la única clase de 
células con núcleo en el neurópilo distal (Meinertzhagen y O'Neil, 1991). 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
26 
 
Glía de las regiones profundas del lóbulo óptico. Existen diferentes clases de glía en estas 
regiones: 1) en el quiasma óptico, dispuesta en filas entre vainas dorsoventrales sucesivas 
que entrecruzan las fibras interiores y exteriores del quiasma; 2) pequeñas células gliales 
del exterior del quiasma óptico asociadas a los haces de axones; 3) en la corteza de la 
médula (satélite medular) y el complejo lobular (satélite de la placa lobular); y 4) en el 
neurópilo medular (Tix, et al., 1997). 
En 2008, Oland y colaboradores reportaron en Drosophila que la glía del neurópilo 
presenta proyecciones que se extienden en tres direcciones: 1) procesos externos al 
neurópilo para envolver receptores neuronales olfatorios entrantes del tracto 
antenocerebral; 2) por fuera del lóbulo antenal para envolver axones de proyección de las 
neuronas a medida que se extienden hacia los centros de procesamiento de orden superior 
en los cuerpos fungiformes y 3) hacia dentro del neurópilo central para envolver dendritas 
grandes. 
 
2.4.1. Proteína Ácida Fibrilar Glial (GFAP) 
La proteína ácida fibrilar glial (GFAP) es la proteína principal de filamentos intermedios 
gliales diferenciados en astrocitos fibrosos y protoplásmicos en el sistema nervioso central 
de vertebrados, en particular de mamíferos, donde se expresa en astrocitos maduros y 
provee estabilidad celular y estructural, también se presenta en invertebrados; además es 
una proteína altamente conservada en la mayoría de los organismos y es comúnmente 
utilizada como marcador de astrocitos in vivo e in vitro (Eng, 1985; Santos, et al., 2005). 
En el sistema visual de crustáceos decápodos, Da Silva y colaboradores en 2004 
encontraron, mediante técnicas de inmunotinción, positividad a GFAP en células del 
pigmento reflejante y cuerpos celularesen las omatidias, específicamente en la retina, en la 
membrana basal y en la lamina ganglionaris. 
En el sistema nervioso del caracol Megalobulimus abbreviatus se confirmó la presencia de 
GFAP y se determinó su peso molecular (55 kDa aprox.) a través de técnicas de 
inmunoblott e inmunohistoquímica en el ganglio cerebral y la masa subesofágica, y 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
27 
 
presenta mayor la concentración en el ganglio cerebral, principalmente en las regiones 
corticales y medulares del adulto (Santos, et al., 2005) 
Se ha reportado que el cerebro adulto del acocil Cherax destructor, presenta dos zonas de 
proliferación, una medial y otra lateral compuestas en su mayoría por cuerpos neuronales y 
una pequeña cantidad de células gliales, este conjunto de células llamadas grupo 9 y 10 
respectivamente, están localizados entre el lóbulo olfatorio (LO) y el lóbulo accesorio (LA) 
del ganglio supraesofágico y ambos muestran positividad a GFAP, lo anterior se hizo 
mediante técnicas de inmunocitoquímica (Sullivan y Beltz, 2005). 
En 2010, Chaves da Silva y colaboradores, encontraron positividad a GFAP en células 
gliales después de 24 horas de ablación en la región distal del tracto protocerebral del 
cangrejo Ucides cordatus y concluyeron que las células gliales en conjunto con hemocitos 
no sólo fagocitan restos neuronales sino también pueden generar un ambiente favorable 
para eventuales regeneraciones. 
 
 
2.5. Ritmos biológicos y Glía 
 
La función y morfología de las neuronas está asociada a conductas que muestran ritmos 
circadianos tales como actividad locomotora, alimentación, apareamiento, entre otras, que 
pueden variar durante el día. Debido a su capacidad para adaptarse a condiciones 
cambiantes (plasticidad neuronal), también se habla de cambios circadianos respecto a la 
morfología de las neuronas así como ondas de asociación y disociación de sinapsis 
(plasticidad circadiana) que pueden ser controladas por factores internos y externos en 
fotorreceptores e interneuronas visuales en Drosophila. Otros estudios en este organismo 
indican que las células gliales son importantes en cuanto a la plasticidad neuronal 
(regulación en la expresión de genes, morfología y fisiología), además de exhibir sus 
propios ritmos circadianos (Suh y Jackson, 2007; Jackson, 2011; Mehnert y Cantera, 2011). 
En el sistema visual de Musca domestica, Pyza y Gorska-Andrzejak (2004) demostraron 
que en ciclos de luz-oscuridad (LO) existe un ritmo diurno respecto a la morfología 
neuronal (tamaño de axones, núcleo y dendritas), mientras que en condiciones constantes 
(OO) las dendritas presentan ritmo circadiano moderado, también mostraron que 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
28 
 
inhibidores metabólicos como el octanol, fluorocitrato e iodoacetato producen arritmia en 
células gliales y neuronas (L1 y L2) del mismo sistema. 
Prosser y colaboradores, llevaron a cabo estudios similares a los de la mosca, en el cerebro 
de mamíferos, analizaron los efectos que producen los inhibidores gliales en el ritmo 
circadiano neuronal del SNC y observaron que mientras el octanol suprime el ritmo, el 
fluorocitrato induce a la ritmicidad ultradiana (Prosser, et al., 1994). 
Con respecto a la glía, en Drosophila, se reportan estudios acerca de la importancia de la 
relación entre la proteína Ebony y las células gliales, dado que se ha demostrado que esta 
proteína es requerida en la glía para la regulación circadiana de la actividad locomotora en 
la mosca de la fruta. La proteína Ebony se localiza en células gliales del lóbulo óptico 
(específicamente en la glía epitelial de la lámina) y cerebro central en adultos, regiones las 
cuales se sabe que contienen neuronas reloj, y exhibe ritmos circadianos abundantes en 
células parecidas a astrocitos que son positivas a Ebony, es decir, la cercanía de estas 
células hacia proyecciones celulares del reloj nos habla de un control rítmico de Ebony 
dependiente de PER/TIM dentro de una población discreta de células gliales (Suh y 
Jackson, 2007). Lo anterior posiblemente sugiere que hay otras proteínas que están 
presentes en las células gliales y que podrían mostrar ritmos al estar relacionadas con la 
expresión de proteínas reloj. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
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3. JUSTIFICACIÓN 
Debido a que la glía desempeña un papel fundamental dentro del SNC como proveedora de 
soporte trófico, aislamiento celular y neuronal, en el reciclaje de neurotransmisores e 
intercambio y eliminación de metabolitos y catabolitos; el estudio de su relación con los 
ritmos circadianos es de gran interés tanto en vertebrados como en invertebrados, 
particularmente en mamíferos e insectos (Prosser, et al., 1994; Jackson, 2011; Mehnert y 
Cantera, 2011). 
Diversos estudios reportan la relación entre la glía y los ritmos a través de un oscilador 
molecular basado en PER, proteína reloj fundamental para el control molecular circadiano 
en Drosophila y mamíferos (Zerr, et al., 1990 y Suh y Jackson, 2007). Sin embargo, otros 
organismos no han sido abordados en el estudio de esta relación. 
Por lo anteriormente mencionado, es relevante explorar si esta relación ocurre en 
crustáceos, específicamente en el acocil. La relevancia radica en que este organismo ha sido 
un modelo experimental de gran importancia para el estudio de las neurociencias y la 
cronobiología. Sus ritmos circadianos así como el funcionamiento del reloj molecular ya se 
han descrito sin embargo, aún faltan más estudios que integren y amplíen la neurofisiología 
y cronobiología de esta especie. 
Por lo anterior, el presente trabajo plantea investigar la presencia de GFAP en los 
marcapasos putativos de P. clarkii así como determinar si esta proteína muestra 
oscilaciones diarias y si la proteína PER, que es un componente importante del reloj 
circadiano, se encuentra localizada en las células gliales, en el lóbulo óptico y el ganglio 
cerebroide del acocil adulto Procambarus clarkii. 
 
4. HIPÓTESIS 
 
Si la GFAP se encuentra en el tallo ocular y el ganglio cerebroide y presenta oscilaciones 
en sus concentraciones diarias y PER co-localiza en las células gliales de estas estructuras, 
entonces la glía podría formar parte del sistema circadiano del acocil adulto P. clarkii al 
modular la actividad neuronal en su sistema nervioso central. 
 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
30 
 
5. OBJETIVOS 
 
Generales 
 
1) Determinar la presencia de ritmos circadianos en la expresión de GFAP en dos de 
las posibles estructuras marcapasos del acocil adulto Procambarus clarkii. 
 
2) Identificar si la proteína PER se encuentra en las células gliales, a través de la co-
localización de esta proteína con GFAP, del tallo ocular y del ganglio cerebroide de 
P. clarkii. 
Particulares 
1) Determinar si la GFAP se expresa en el tallo ocular y el ganglio cerebroide. 
 
2) Cuantificar los niveles de GFAP en diferentes horas del día, en tallo ocular y en 
ganglio cerebroide. 
 
3) Determinar si los cambios de GFAP, en las dos estructuras antes mencionadas, son 
circadianos. 
 
4) Localizar e identificar si hay regiones en las que co-localicen las proteínas GFAP y 
PER. 
 
 
 
 
 
 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
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6. MÉTODO 
 
6.1. Animales 
Se utilizaron 72 acociles adultos de la especie Procambarus clarkii colectados en Delicias, 
Chihuahua, México; sin distinguir entre machos y hembras. Se mantuvieron en condiciones 
de laboratorio, en acuarios, con una temperatura de 20°C + 1 y alimento ad libitum con una 
dieta de camaronina(35%; Purina); se mantuvieron en ciclos de luz-oscuridad (LO) 12:12 
con encendido de luz a las 7:00 h y el apagado a las 19:00 h, durante 15 días. 
6.2. Disección experimental de Procambarus 
Después de 15 días de aclimatación a las condiciones de laboratorio, los animales fueron 
divididos en dos grupos de 36 animales para cada condición, el primer grupo se mantuvo en 
las mismas condiciones iniciales de LO y el segundo grupo en oscuridad constante (OO); 
los animales del grupo LO se anestesiaron (20 min en frío), y disecaron en microscopio 
estereoscópico (Olympus SZ514S) a diferentes ZT (tiempo del sincronizador, por sus siglas 
en inglés: ZT0, ZT4, ZT8, ZT12, ZT16 y ZT20) para extraer los tallos oculares y el ganglio 
cerebroide. Este mismo grupo se dividió en dos grupos: las de 18 animales se usaron para la 
técnica de Ensayo de Inmunoabsorción Ligada a Enzima (ELISA), mientras las de los 18 
animales restantes fueron procesadas con la técnica de Inmunofluorescencia. 
Los 36 animales del segundo grupo pasaron 72 horas en oscuridad constante (OO), 
posteriormente fueron disecados a diferentes CT (tiempo circadiano, por sus siglas en 
inglés: CT0, CT4, CT8, CT12, CT16 y CT20) también fueron divididos en dos grupos de 
18 animales y procesados para las mismas técnicas que los acociles de la condición LO; se 
sacrificaron tres acociles por cada hora para cada condición. 
6.3. Cuantificación de Proteínas 
 
Los tallos oculares y cerebro fueron extraídos por separado y colocados en 50 µL de 
amortiguador de fosfatos (PBS) pH 7.4. Las muestras fueron homogeneizadas manualmente 
con un homogeneizador de plástico y centrifugados en una microcentrífuga refrigerada 
(LABNET) durante 20 min a 12000 x g a 4°C, se desechó el botón y se tomó el 
sobrenadante conservándolo a -70°C (REVCO). 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
32 
 
El método de cuantificación espectrofotométrica de proteínas que se utilizó para calcular la 
cantidad de muestra (tallo ocular y ganglio cerebroide) en microlitros, que se debe colocar 
en cada pozo de la microplaca, para tener 60 µg de proteína total para la técnica de ELISA 
fue el diseñado por Bradford (1976). 
Estandarización de Albúmina 
Se disolvieron 0.5mg de albúmina de suero bovino (BSA SIGMA) en 10 mL de agua 
desionizada y se determinó la absorbancia en un espectrofotómetro (Ultrospec 2000) a 280 
nm. 
En cada pozo de la microplaca de poliestireno (Ultra Cruz) se agregó BSA 0.5mg/ml con 
Cloruro de sodio (NaCl) 0.15M, se ajustó el volumen de cada pozo a 215 µL totales con el 
reactivo de Bradford (Bio-Rad). Para cada dilución de BSA la absorbancia se leyó en un 
lector de placas a 595 nm (Biotek ELx800). 
6.4. Ensayo de Inmunoabsorción Ligada a Enzima (ELISA) Indirecta para la Proteína 
Ácida Fibrilar Glial (GFAP) 
 
La técnica de ELISA indirecta es una técnica inmunológica que nos permite cuantificar la 
GFAP en tallo ocular y ganglio cerebroide del acocil adulto mediante la detección de 
anticuerpo (complejo antígeno-anticuerpo, ver Figura 10). 
Curva de Calibración de ELISA para la Proteína GFAP 
La curva de calibración se preparó con ocho diluciones dobles seriadas en una 
concentración de 0 a 50 ng /100 µL por pozo del péptido control para GFAP (generado en 
cabra, GeneTex) en amortiguador de fosfatos pH 6.5. Se siguió el mismo procedimiento 
que las muestras que a continuación se refiere. 
Procedimiento de las Muestras 
En cada pozo de la microplaca para ELISA (Ultra Cruz) se añadieron e incubaron 60 µg de 
proteína de cada muestra (tallo ocular y ganglio cerebroide) por triplicado, diluido en 
amortiguador de fosfatos pH 6.5, 1 h a 37°C y después 2 hrs a temperatura ambiente (TA), 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
33 
 
finalmente toda la noche a 4°C. Después de un lavado (200 µL PBS-Tween-20 (PBS-T) 
0.05%), se agregó solución de bloqueo (100 µL PBS-T0.05% con 3% de leche descremada 
- Svelty 0% grasa (LDS), filtrada) por 2hrs a TA. Posteriormente se hicieron tres lavados 
(200 µl PBS-T0.05%) se añadió e incubó el anticuerpo primario anti-GFAP (policlonal 
generado en cabra GeneTex, 1:800) diluido en una solución de PBS-T con 0.1% de LDS2 
hrs a TA y después toda la noche a 4°C, para permitir que se llevara a cabo la reacción con 
la muestra adherida al pozo. Posteriormente, después de tres lavados (200 µL PBS-T), 
posteriormente, se incubó con el anticuerpo secundario anti-IgG de cabra conjugado con 
peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés; policlonal generado en burro 
GeneTex, 1:2,500) diluido en una solución de PBS-T con 0.1% de LDS 2 hrs a TA. Por 
último se realizaron tres lavados (200 µl PBS-T), se añadió un sustrato para la enzima (100 
µL TMB 3,3’, 5,5’-tetrametilbenzidina-1StepTM Turbo TMB-ELISA ThermoScientific 
durante 30 min) y la reacción se detuvo con una solución de ácido fosfórico (H3PO42 M), a 
continuación se leyó la densidad óptica en un lector de placas a 450 nm (Biotek ELx800). 
Los controles tuvieron el mismo procedimiento, no obstante, en uno se omitió el péptido 
control para GFAP (GeneTex), en otro se omitió el anticuerpo primario y en el último se 
omitió el anticuerpo secundario. Los datos promedio obtenidos de cada muestra por 
triplicado se utilizaron para interpolar su concentración a la curva de calibración. 
 
 
 
Fig. 10. Representación esquemática de la técnica de ELISA indirecta (Modificado de Goldsby, 
et al., 2004). 
 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
34 
 
6.5. Inmunofluorescencia 
La inmunofluorescencia es una técnica de inmunotinción basada en la capacidad del 
anticuerpo específico marcado con un fluorocromo para unirse con el antígeno y formar el 
complejo antígeno-anticuerpo para lograr un sustrato visible, aplicándolo a una muestra de 
tejido, en este caso particular, tallo ocular y ganglio cerebroide. Se utilizó para determinar 
la co-localización de las proteínas de interés PER y GFAP (doble inmunotinción). 
Se extrajeron los tejidos (tallos oculares y ganglio cerebroide) y se colocaron en fijador 
Bouin’s (solución de Acido pícrico 7.5 mL, formaldehído al 37% 2.5 mL y ácido acético 
0.5 mL) durante 12 h a 4°C, después se deshidrataron (con alcohol al 50, 70, 96 y 100%, 
xilol 10 min) y se incluyeron en paraplast (Oxford Labware) durante 12 hrs en estufa 
(Marca FelisaR), posteriormente se montaron en moldes con paraplast y se dejaron secar por 
24 hrs. Una vez que los moldes con los tejidos se secaron, se pasaron al micrótomo (Leitz 
1512) para hacer los cortes histológicos de 25 micras de grosor, los cortes fueron colocados 
en portaobjetos, se les agregó unas gotas de alcohol y se sumergieron en baño maría (Lab 
Line Instruments, Inc.) con grenetina (J.T. BAKER) se dejaron secar. 
Se eligieron al azar las laminillas, previamente procesadas, para desparafinarlas, se 
colocaron en la estufa (FelisaR) a 59°C de 3 a 5 min, posteriormente se les agregó xilol y se 
continuó con la rehidratación en alcoholes graduales (100, 96, 70, 50% y agua destilada). 
Posteriormente, los cortes fueron delimitados con un marcador (PAP-Pen) para asegurar el 
mantenimiento de los medios de incubación en los tejidos, enseguida se colocaron en 
cámara húmeda, se realizaron tres lavados (PBS-T al 10% por 10 min) y se les agregó una 
solución de bloqueo de proteínas (Suero de cabra diluido en PBS, Blocking Reagent 
Background eraser BIOCARE MEDICAL) 5 gotas por 10 min, para reducir la tinción de 
fondo que se presenta por la inespecificidad de los anticuerpos; se incubaron con el 
anticuerpo primario anti-GFAP (monoclonal generado en ratón GeneTex, 1:200) y 
Drosophila anti-PER (policlonal generado en pollo Alpha Diagnostic, 1:50) diluidos en 
solución de Van Gogh (solución de amortiguadores combinadospatentados, potenciadores 
de tinción, estabilizantes y conservadores pH 6.0 BIOCARE MEDICAL) toda la noche a 
4°C. Las laminillas fueron colocadas en la estufa (2 min, FelisaR) y se realizaron lavados 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
35 
 
(uno con PBS-T al 10% por 5 min y tres inmediatos adicionales), se agregó el anticuerpo 
secundario anti-ratón (generado en cabra conjugado con Cy2 GeneTex, 1:200) y anti-pollo 
(generado en cabra conjugado con Rodamina (TRITC), Alpha Diagnostic1:50) diluidos en 
solución de Van Gogh (BIOCARE MEDICAL) 2h a TA. Después de los lavados (uno con 
PBS-T al 10% por 5 min y tres inmediatos adicionales), se agregó DAPI (4',6-diamidino-2-
fenilindol, 1:1000 con PBS-T al 10% durante 5 min) y se realizó un último lavado (uno con 
PBS-T al 10% por 5 min y tres inmediatos adicionales). Finalmente las laminillas se 
montaron con medio de montaje para fluorescencia (DAKO). Los controles fueron tratados 
de la misma forma, sin embargo, en uno de ellos se omitió el anticuerpo primario, mientras 
que el segundo fue por preadsorción de los anticuerpos primarios para GFAP y PER con 
sus respectivos péptidos controles para GFAP (GeneTex) y Drosophila PER (Alpha 
Diagnostic). 
6.6. Digitalización de Imágenes 
Con la finalidad de identificar reactividad por inmunofluorescencia a GFAP y PER, así 
como la co-localización en las zonas del tallo ocular y ganglio cerebroide, se utilizó un 
microscopio confocal (OLYMPUS lX81) con láser (FV10-MCPSU), los flurocromos 
fueron visualizados con tres filtros: el primero fue Cy2 con excitación 489 nm y emisión 
506 nm, el segundo fue rodamina (TRITC) con excitación 550 nm y emisión 570 nm y el 
tercero fue DAPI con excitación 358 nm y emisión 463 nm; y capturados con objetivo 40x 
mediante un sistema procesador de imágenes (cámara OLYMPUS lX2-UCB FV1000) vía 
una computadora con el programa de captura OLYMPUS FLUOVIEW (versión 4.0). 
Posteriormente las imágenes fueron analizadas con los programas Image J (versión 1.47) 
para Windows y Corel Photo Paint 9. 
6.7. Análisis estadístico 
Posteriormente los resultados obtenidos de la técnica de ELISA fueron analizados con el 
programa de COSINOR (Menna-Barreto, et al., 1993) para determinar la presencia de 
ritmos de la proteína GFAP en el tallo ocular y ganglio cerebroide del acocil adulto y 
ANOVA de una vía con las pruebas post hoc Bonferroni  y  Scheffé para corroborar la 
significancia del ritmo. 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
36 
 
6.7.1. COSINOR 
Es un sistema de análisis matemático que permite determinar por el método de mínimos 
cuadrados la función cosenoidal ideal (Fig. 11) de un ritmo biológico al obtener el intervalo 
de confianza de sus principales parámetros como son el mesor, la amplitud, el periodo y la 
acrofase (ver Fig. 6). El análisis estadístico de Cosinor permite realizar pruebas objetivas 
bajo la hipótesis de que la amplitud del ritmo difiere de cero al utilizar diferentes longitudes 
de periodos. Se probaron distintos periodos para analizar si los ritmos observados tanto en 
el tallo ocular como en el ganglio cerebroide efectivamente eran circadianos. 
 
 
 
 
Figura 11. Se muestra la ecuación que define la función coseno tomando en cuenta que M es el 
valor medio de la curva, es decir, el Mesor; A es la amplitud de la curva; P es el periodo y t0 
es la acrofase (Tomado de Molinero, 2006). 
 
 
6.7.2. Análisis de Varianza de una vía (ANOVA) 
Es una prueba estadística que sirve para comparar diversos grupos en una variable 
cuantitativa, es una generalización del contraste de igualdad de medias para dos muestras 
independientes. Se utiliza para contrastar la igualdad de medias de tres o más poblaciones 
independientes y con distribución normal. Supuestas k poblaciones independientes, las 
hipótesis del contraste son: 
 
1) H0: µ1= µ2=… =µk Las medias poblacionales son iguales 
2) H1: Al menos dos medias poblacionales son distintas 
 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
37 
 
Suponiendo que la hipótesis nula es cierta, el estadístico utilizado en el análisis de varianza 
sigue una distribución F de Fisher-Snedecor con k-1 y n-k grados de libertad, al ser k el 
número de muestras y n el número total de observaciones que participan en el estudio. 
 
El estadístico F del ANOVA de una vía se basa en el cumplimiento de 2 supuestos 
fundamentales: normalidad y homocedasticidad. Esta prueba utiliza contrastes llamados 
comparaciones múltiples post-hoc o a posteriori para saber que media difiere de qué otra y 
permiten controlar la tasa de error al efectuar diversos contrastes con las mismas medias. 
Las pruebas post-hoc aplicadas para este estudio fueron Scheffé y Bonferroni (Bakieva, et 
al., 2012). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
38 
 
7. RESULTADOS 
 
7.1. Cuantificación de ELISA para GFAP 
 
Se realizó un ensayo de ELISA indirecta para medir las cantidades de GFAP en el tallo 
ocular y el ganglio cerebroide del acocil adulto Procambarus clarkii. Los resultados 
obtenidos de dicho ensayo se ajustaron a la curva de calibración estándar (Péptido Control 
de GFAP). El cual mostró un comportamiento lineal en el rango de concentraciones de 0, 
0.3, 0.7, 1.5, 3.1, 6.2, 12.5, 25 y 50 ng/100µL (coeficiente de correlación R2= 0.97; 
pendiente 0.0081) como se observa en la Figura 12. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Curva de calibración estándar de ELISA para GFAP. Diluciones de GFAP. Se 
presenta la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación. La línea continua representa la 
curva de calibración del péptido control de la proteína GFAP y la línea punteada muestra el 
ajuste de los datos a la recta. Los datos son el promedio ± el error estándar (e.e.). Lectura a 450 
nm. 
y=0.0081x + 0.0496 
R2=0.976
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
39 
 
7.1.1. Tallo Ocular 
En el tallo ocular, existe un ritmo diario en el contenido de GFAP, en la condición de LO 
12:12, se encontró que la acrofase de la concentración [1.43 ng/µL] se presentó en ZT8, 
con un segunda acrofase en ZT0 [1.17ng/µL], mientras que la batifase [0.81 ng/µL] se 
presentó en ZT16 (Fig. 13). El análisis de Cosinor mostró una oscilación significativa 
(P<0.05) con un periodo de 11:23 y 25 horas (porcentaje de ritmicidad =10.37 y 7.36%, 
respectivamente, ver Tabla 1) lo cual indica la presencia de un ritmo bimodal de GFAP en 
esta estructura, igualmente el análisis de ANOVA con la prueba post hoc de Bonferroni 
reveló diferencias significativas (P<0.025) entre la acrofase y batifase antes mencionadas 
(ver Tabla 2). En el acocil adulto bajo condiciones de sincronización este ritmo presenta 
las acrofases durante el día.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13. Cronograma del tallo ocular en condición LO 12:12. Se observa un ritmo 
bimodal de la proteína GFAP. La barra superior representa la condición experimental de 
fotoperiodo (la zona blanca de la barra indica la fotofase y la oscura la escotofase). Los datos 
graficados son el promedio ± e.e. Los resultados obtenidos por los análisis de Cosinor y 
ANOVA con una prueba post hoc de Bonferroni mostraron diferencias significativas (P<0.05) 
entre ZT8 y ZT16 (las flechas rojas muestran las ZT significativas, ver Tabla 1) (n=9 para cada 
hora). 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
40 
 
Bajo la condición de OO durante 72 horas, se observó la persistencia de un ritmo en la 
concentración de GFAP, en CT8 se presentó la batifase [0.70 ng/µL] al contrariode la 
condición LO. Se observó un incremento en CT16 y llegó a la acrofase [1.56 ng/µL] en 
CT20 (Fig. 14). El ritmo observado bajo condiciones constantes, se ajusta a una curva con 
periodo circadiano, confirmado por el análisis de Cosinor que es significativo (P<0.05) 
para la oscilación de GFAP con un periodo de 24.00 horas (ver Tabla 1). Se observó un 
porcentaje del ritmo de 27.50%, la amplitud de 0.34 y el mesor de 1.04, asimismo el 
análisis de ANOVA con la prueba post hoc de Scheffé mostró diferencias significativas 
(P<0.01) que corresponden a la batifase y la acrofase ya mencionadas (ver Tabla 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14. Cronograma del tallo ocular en condición de OO durante 72 horas. Se muestra 
el ritmo circadiano de la proteína GFAP. La barra superior indica la condición de oscuridad 
constante. Los datos graficados son el promedio ± e.e. Los resultados obtenidos por los análisis 
de Cosinor y ANOVA con la prueba post hoc de Scheffé mostraron diferencias significativas 
(P < 0.05 y P < 0.01) entre la acrofase en CT20 y la batifase en CT8 (n=9 para cada hora). 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
41 
 
En la Tabla 1 se muestran los resultados de los análisis de Cosinor de la concentración de 
GFAP (ng/µL) para las dos condiciones experimentales (LO 12:12 y 72 horas en OO) en el 
tallo ocular de P. clarkii. 
 
En la Tabla 2 se muestran los resultados del análisis de varianza (ANOVA) con las pruebas 
post hoc Bonferroni y Scheffé que confirman los resultados obtenidos por el análisis de 
Cosinor en el tallo ocular de P. clarkii para las condiciones LO 12:12 y 72 horas en OO 
respectivamente. 
 
 
Tabla 1. Análisis de Cosinor de los cronogramas de la concentración de la proteína GFAP en el tallo 
ocular del acocil adulto. 
 
GFAP 
 
 
PERIODO 
(h) 
 
MESOR
 
AMPLITUD
 
ACROFASE
(h) 
 
PR (%) 
 
 P 
 
 
LO 12:12 
 
24 
25 
11.23 
 
 
1.06 
1.05 
1.06 
 
0.13 
0.21 
0.25 
 
11.05 
6.18 
7.04 
 
2.85 
7.36 
10.31 
 
0.284 
0.036* 
0.009* 
72 horas en OO 24 1.04 0.34 1.25 27.50 0.001* 
El asterisco indica resultados significativos (P<0.05) en ambas condiciones experimentales. 
PR representa el porcentaje del ritmo. 
Tabla 2. Análisis de varianza (ANOVA) de la concentración de GFAP en el tallo ocular del acocil 
adulto. 
 
GFAP 
 
 
F 
 
Sig. 
 
Prueba Post hoc 
 
LO 12:12 3.001 0.015* 
Bonferroni 
ZT8 vs. ZT16 (P<0.025) 
 
 
72 horas en OO 
 
10.901 
 
0.001* 
 
Scheffé 
CT20 vs. CT0, CT4, CT8 y CT12 (P<0.01) 
CT8 vs. CT16 (P<0.01) 
El asterisco indica resultados significativos (P<0.05) en ambas condiciones experimentales. 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
42 
 
7.1.2. Ganglio Cerebroide 
En la condición LO 12:12 para el ganglio cerebroide, las concentraciones de GFAP 
durante las ZT de muestreo no fueron significativamente diferentes (Fig. 15), de acuerdo 
con el análisis de Cosinor que se muestra en la tabla 3 y el análisis de ANOVA con las 
pruebas post hoc de Scheffé y Bonferroni, no se obtuvieron oscilaciones ni diferencias 
significativas para la proteína GFAP, ver Tabla 4. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15. Cronograma del ganglio cerebroide en condición LO 12:12. No se observan 
oscilaciones de la proteína GFAP. La barra superior representa la condición experimental de 
fotoperiodo (la zona blanca de la barra indica la fotofase y la oscura la escotofase). Los datos 
graficados son el promedio ± e.e. (n=9 para cada hora). 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
43 
 
En los resultados del ganglio cerebroide bajo condiciones constantes, se observó la 
persistencia de los cambios rítmicos en la concentración de GFAP y se encontró que las 
batifases se presentaron en CT0 [0.68ng/µL] y CT12 [0.70ng/µL], con un aumento en CT8 
[1.12 ng/µL], alcanzando la acrofase [1.49 ng/µL] en CT20 (Fig. 16). Cosinor confirmó el 
ajuste de GFAP como un ritmo bimodal que es significativo (P<0.05) en un periodo de 12 y 
22.36 horas (PR=24 y 7.92%), con un mesor de 1.02 y amplitud de 0.36 y 0.20, 
respectivamente (ver Tabla 3), del mismo modo el análisis de ANOVA y la prueba post 
hoc de Scheffé mostró diferencias significativas (P<0.01) entre la acrofase y la batifase 
antes mencionadas (ver Tabla 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 16. Cronograma del ganglio cerebroide en condición de OO durante 72 horas. Se 
muestra un ritmo bimodal en la proteína GFAP. La barra superior representa la condición en 
oscuridad constante. Los datos graficados son el promedio ± e.e. Los resultados obtenidos por 
los análisis de Cosinor mostraron un ritmo y el ANOVA con la prueba post hoc de Scheffé 
mostraron diferencias significativas (P<0.05) entre la acrofase en CT20 y las batifases en CT0 
y CT12 (las flechas rojas muestran las CT significativas, ver Tabla 3) (n=9 para cada hora). 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
44 
 
En la Tabla 3 se muestran los resultados de los análisis de Cosinor de la concentración de 
GFAP para las dos condiciones experimentales, LO 12:12 y 72 horas en OO en el ganglio 
cerebroide de P. clarkii. 
 
En la Tabla 4 se muestran los resultados del análisis de varianza (ANOVA) con las pruebas 
post hoc Bonferroni y Scheffé que confirman los resultados obtenidos por el análisis de 
Cosinor en el ganglio cerebroide de P. clarkii para las condiciones LO 12:12 y 72 horas en 
OO respectivamente. 
 
Los resultados indican que existen variaciones circadianas y bimodales de la proteína 
GFAP en el tallo ocular, mientras que en ganglio cerebroide estás variaciones solo se 
presentan en condiciones constantes del acocil adulto P. clarkii. La manifestación de estos 
Tabla 3. Análisis de Cosinor de los cronogramas de la concentración de GFAP en el ganglio 
cerebroide del acocil adulto. 
 
GFAP 
 
 
PERIODO 
(h) 
 
MESOR
 
AMPLITUD
 
ACROFASE
(h) 
 
PR (%) 
 
 P 
 
LO 12:12 
 
24 
 
 
0.78 
 
 
0.08 
 
 
12.32 
 
 
1.82 
 
 
0.449 
 
 
72 horas en OO 
24 
22.36 
12 
1.02 
1.02 
1.02 
0.13 
0.20 
0.36 
2.29 
7.34 
1.49 
3.22 
7.92 
24 
0.241 
0.028* 
0.001*
El asterisco indica resultados significativos (P<0.05) para la condición en oscuridad constante. 
PR representa el porcentaje del ritmo. 
Tabla 4. Análisis de varianza (ANOVA) de la concentración de GFAP en el ganglio cerebroide del 
acocil adulto. 
 
GFAP 
 
F 
 
Sig. 
 
Prueba Post hoc 
 
LO 12:12 0.532 0.751 
 
72 horas en OO 6.684 0.001* 
Scheffé 
CT20 vs. CT0 y CT12 (P<0.01) 
El asterisco indica resultados significativos (P<0.05) para la condición en oscuridad constante. 
																																																																						María de la Paz Rodríguez Muñoz 
 
45 
 
cambios ocurre en oscuridad constante. En general, parece que bajo condiciones de 
sincronización la luz produce un efecto de enmascaramiento en los cambios rítmicos de 
ambas estructuras, ya que en los tallos oculares, ocurre un cambio de tipo bimodal durante 
LO a un ritmo circadiano en oscuridad constante, mientras que en el ganglio cerebroide en 
LO no se presenta ritmo y en condiciones de oscuridad constante se manifiesta un ritmo 
bimodal. 
 
7.2. Inmunofluorescencia 
Los datos obtenidos con inmunofluorescencia y microscopia confocal mostraron 
inmunopositividad a GFAP y co-localización con PER en tallo ocular y ganglio cerebroide 
en el acocil adulto, las diferencias en la intensidad de inmunotinción no fueron 
cuantificadas. 
 
7.2.1. Tallo Ocular 
El lóbulo óptico, que forma parte del tallo ocular del acocil, está compuesto por cuatro 
neurópilos, la lamina ganglionaris (LG), la médula externa, la médula interna y la médula 
terminalis. El primer neurópilo,