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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS VARIACIÓN GENÉTICA Y FILOGEOGRAFÍA DE HELECHOS ARBORESCENTES (CYATHEACEAE) DEL BOSQUE MESÓFILO DE MONTAÑA DE LA SIERRA MADRE ORIENTAL T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGO P R E S E N T A : SANTIAGO ALEJANDRO RAMÍREZ BARAHONA DIRECTOR DE TESIS: DR. LUIS E. EGUIARTE FRUNS 2009 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 3 PARA PIA 5 La presente investigación se realizó bajo la dirección del Dr. Luis E. Eguiarte Fruns en el Laboratorio de Evolución Molecular y Experimental, Instituto de Ecología, Universidad Nacional Autónoma de México, con apoyo del proyecto Diversificación de angiospermas en México: relojes moleculares, tasas de especiación, biomecánica y espacios ecológicos Conacyt SEP-2004-C01-46475-Q 7 AGRADECIMIENTOS A la Universidad Nacional Autónoma de México Al Dr. Luis E. Eguiarte Fruns A la Dra. Isolda Luna Vega Al M. en C. Othón Alcántara Ayala A mis sinodales, Dra. Erika Aguirre Planter, Dr. Luis E. Eguiarte Fruns, Biól. Jaime Gasca Pineda, Dra. Mercedes Isolda Luna Vega, Dra. Ella Vázquez Domínguez A los colectores de muestras en campo, M. en C. Eria Rebollar Caudillo, Biól. Germán Bonilla Rosso, Biól. Rodrigo González Chauvet, M. en C. Enrique Scheinvar Gottdiener, Alicia Barceinas Cruz Al Herbario de la Facultad de Ciencias, UNAM y en particular a la Dra. Martha Juana Martínez Gordillo por proporcionar muestras de tejido Al proyecto Bosque mesófilo de la Sierra Madre Oriental (RTP-102) y patrones de distribución de algunas especies de plantas vasculares con importancia biológica Conacyt-Semarnat FOSEMARNAT-2004-01-311 A todos los integrantes del Laboratorio de Evolución Molecular y Experimental A mi familia y amigos por todo RESUMEN La familia Cyatheaceae consta de ≈600 especies de helechos arborescentes que se distribuyen en respuesta a los patrones de selvas lluviosas y bosques nublados. En México, las especies de esta familia se encuentran principalmente en manchones de bosque mesófilo de montaña con una distribución limitada y fragmentaria. En este trabajo se describe por primera vez la estructura filogeográfica y los patrones de variación genética en poblaciones de Alsophila firma y Cyathea fulva dentro de la provincia de la Sierra Madre Oriental. Se analizaron secuencias del espaciador intergénico de cpDNA atpB-rbcL de 121 plantas provenientes de seis localidades de bosque mesófilo en los estados de Hidalgo y Veracruz, México. Ambas especies mostraron una diversidad genética reducida (π = 0.0009 y 0.00097; Hd = 0.442 y 0.442) y una diferenciación genética baja (GST = 0.0623 y 0.0955) con flujo génico elevado (Nm = 7.53 y 4.74). Las redes de haplotipos y el análisis filogeográfico de clados anidados mostraron evidencia de expansiones a partir de poblaciones pequeñas. Asimismo, la distribución mismatch para ambas especies se ajustó a un modelo de expansión espacial con tamaños poblacionales constantes. Los resultados sugieren una historia demográfica paralela, donde las poblaciones de ambas especies sufrieron una expansión de rango y formaron poblaciones continuas con niveles elevados de flujo génico como consecuencia de la re-expansión del bosque mesófilo hacia tierras bajas. ABSTRACT Family Cyatheaceae comprises ≈ 600 tree fern species distributed according to cloud and rain forest patterns. In México, tree fern species are found predominantly in cloud forest patches, with a limited and fragmented distribution. In this work, the phylogeographic structure and patterns of genetic variation are described for the first time in populations of Alsophila firma and Cyathea fulva in the Sierra Madre Oriental province. Data analyses were performed with atpB-rbcL chloroplast inter genic spacer sequences obtained for 121 individual plants collected in six cloud forest localities in the states of Hidalgo and Veracruz, México. Both species showed reduced genetic variation (π = 0.0009 y 0.00097; Hd = 0.442 y 0.442) and low genetic differentiation (GST = 0.0623 y 0.0955) with high levels of gene flow (Nm = 7.53 y 4.74). Haplotype networks and nested clade phylogeographic analyses showed evidence of demographic expansion from small populations. In both species, mismatch distributions followed a pattern expected under a model of spatial expansion with constant population size. These results suggest a common demographic history, where populations of both species suffered range expansions and formed continuous populations with high levels of gene flow in response to cloud forest expansion into lowlands. ÍNDICE ÍNDICE DE TABLAS iv ÍNDIDE DE FIGURAS v 1. INTRODUCCIÓN 1 1.1. Genética de poblaciones y filogeografía 1 Variación genética 1 Filogeografía 4 Marcadores moleculares 6 1.2. Familia Cyatheaceae 8 Especies en México 11 Especies de estudio 12 Alsophila firma (Baker) D. S. Conant 12 Cyathea fulva (M. Martens & Galeotti) Fée 14 1.3. Escenario biogeográfico 16 Bosque mesófilo de montaña 16 Aislamiento y fragmentación 20 1.4. Antecedentes 25 2. OBJETIVOS 27 3. MÉTODOS 28 3.1. Área de estudio 28 3.2. Muestreo 31 3.3. Extracción de DNA 32 3.4. Amplificación y secuenciación 33 Exploración de polimorfismos 33 Espaciadores intergénicos de cpDNA 34 3.5. Análisis de datos 36 Exploración de polimorfismos 36 Análisis de secuencias de cpDNA 36 Variación, diferenciación y estructuración genética 37 Filogenia molecular 39 Asociación entre distancias genéticas y distancias geográficas 39 Distribuciones mismatch 40 Redes haplotípicas y análisis filogeográfico de clados anidados 41 4. RESULTADOS 43 Exploración de polimorfismos 43 Variación, diferenciación y estructuración genética 44 Diversidad nucleotídica 44 Diversidad haplotípica 45 Diferenciación y estructuración genética 47 Filogenia molecular 47 Asociación entre distancias genéticas y distancias geográficas 51 Distribuciones mismatch 54 Filogeografía 57 Redes haplotípicas 57 Análisis filogeográfico de clados anidados 60 5. DISCUSIÓN 62 Exploración de polimorfismos 62 Variación genética y filogeografía 63 Diversidad nucleotídica y haplotípica 63 Diferenciación y estructuración genética 66 Filogenia molecular 69 Asociación entre distancias genéticas y distancias geográficas 69 Filogeografía 70 Redes haplotípicas y análisis filogeográfico de clados anidados 71 6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 77 6.1. Conclusiones 77 6.2. Perspectivas 77 REFERENCIAS 79 APÉNDICES 91Apéndice I 91 Apéndice II 92 Apéndice III 96 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Localidades de sitios de colecta, ejemplares de herbario y secuencias obtenidas de Korall et al. (2007) 30 Tabla 2. Secuencias de primers y temperaturas de alineación utilizadas para la amplificación y secuenciación de espaciadores intergénicos cpDNA 35 Tabla 3. Valores de diversidad y diferenciación genética 44 Tabla 4. Cuadro comparativo de estimados de variación genética para especies de helechos arborescentes de la familia Cyatheaceae 64 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Mapa de distribución para la familia Cyatheaceae 9 Figura 2. Escamas peciolares presentes en Cyatheaceae 12 Figura 3. Planta adulta y mapa de distribución en México de Alsophila firma 13 Figura 4. Planta adulta y mapa de distribución en México de Cyathea fulva 15 Figura 5. Mapa de distribución de bosque mesófilo de montaña 19 Figura 6. Localidades de colecta en los estados de Hidalgo y Veracruz, México 29 Figura 7. Reconstrucción filogenética de Neighbor-Joining en Alsophila firma 49 Figura 8. Reconstrucción filogenética de Neighbor-Joining en Cyathea fulva 50 Figura 9. Dendogramas de distancia entre poblaciones de Alsophila firma y Cyathea fulva 52 Figura 10. Pruebas de Mantal realizadas en poblaciones de Alsophila firma y Cyathea fulva 53 Figura 11. Distribución de diferencias pareadas en Alsophila firma y Cyathea fulva 55 Figura 12. Frecuencia relativa de haplotipos de atpB-rbcL para Alsophila firma 57 Figura 13. Frecuencia relativa de haplotipos de atpB-rbcL para Cyathea fulva 58 Figura 14. Red de haplotipos de atpB-rbcL para Alsophila firma 59 Figura 15. Redes de haplotipos de atpB-rbcL para Cyathea fulva 60 Figura 16. Distribución geográfica de haplotipos para Alsophila firma 69 Figura 17. Distribución geográfica de haplotipos para Cyathea fulva 70 1 1. INTRODUCCIÓN 1. 1. Genética de poblaciones y filogeografía Variación genética La objetivo principal de la genética de poblaciones, desde hace más de cincuenta años, ha sido la descripción y explicación de la variación genética dentro y entre poblaciones naturales (Lewontin 1991). Además de ser una herramienta para la determinación de los niveles de variación genética en poblaciones naturales, la genética de poblaciones trata con la determinación experimental y teórica de cómo esa variación cambia en tiempo y espacio (Griffiths et al. 1996). En este sentido, el objetivo principal de la genética de poblaciones es doble, cuantificar y explicar el por qué de la variación observada en las poblaciones naturales. Los estudios de genética de poblaciones se centran en la ley de equilibrio Hardy-Wienberg (EHW), la cual se encuentra fundamentada en cinco hipótesis: 1) poblaciones de organismos sexuales que tienen la misma posibilidad de aparearse (apareamiento azaroso), 2) poblaciones con tamaños efectivos muy grandes (tamaño infinito), 3) falta de flujo genético entre poblaciones, 4) tasas de mutación despreciables y 5) ausencia de presiones de selección. Cuando todas estas condiciones se cumplen, las frecuencias genotípicas y fenotípicas deben mantenerse constantes y se dice que las poblaciones se encuentran en equilibrio. No obstante este equilibrio “ideal”, las poblaciones naturales de una especie por lo general muestran 2 diferencias en la variación genética de una región a otra, debido a la falta de continuidad ambiental y la consecuente estructuración geográfica entre éstas. La dinámica evolutiva de especies en condiciones naturales está mediada principalmente por la estructura de sus poblaciones, es decir, por la distribución de la variación genética entre éstas (Álvarez-Buylla y Garay 1994). Por lo general las especies de amplia distribución poseen niveles más altos de diversidad genética que las especies endémicas y amenazadas (Frankham et al. 2002). La distribución continua es una característica importante que disminuye la diferenciación entre poblaciones debido al frecuente intercambio génico entre éstas (Wright 1951). Por el contrario, la presencia de barreras geográficas puede prevenir el intercambio de genes y provocar una diferenciación inter-poblacional significativa. La fragmentación poblacional por actividades humanas puede incrementar, artificialmente, esta diferenciación (Hao et al. 2006). La cantidad y tipo de variación genética en poblaciones naturales varía entre distintas especies y se encuentra principalmente influenciada por la historia de vida (e.g. sistema reproductivo, patrones de dispersión), caracteres ecológicos (e.g. densidad poblacional, preferencia de hábitat), procesos demográficos (e.g. cuellos de botella, explosiones demográficas) y factores genéticos (Hedrick 2005). Los principales factores que afectan el patrón de variación genética se encuentran ligados fuertemente a la historia demográfica de las poblaciones. Por tanto, identificar situaciones en que diferencias en los patrones de diversidad genética son 3 reconocibles, puede permitir discernir qué factores que juegan, o han jugado, un papel importante en la determinación de la variabilidad genética (Liu et al. 1998). Cuando las poblaciones de una especie se encuentran diferenciadas geográficamente, la principal fuerza responsable de la estructuración de la variación es el intercambio genético entre éstas. Si el intercambio es elevado, las poblaciones tenderán a ser homogéneas, aún cuando existan otras fuerzas productoras de diferenciación en éstas. Cuando el flujo génico es bajo, las fuerzas evolutivas tenderán a producir una diferenciación genética entre las poblaciones. La diferenciación inter-poblacional significativa resultaría, frecuentemente, del limitado flujo génico en condiciones de presión de selección fuerte o distribución discontinua (Slatkin 1985). En este sentido, la estructuración de una población de organismos, y en última instancia el establecimiento de linajes evolutivamente independientes, está fuertemente influenciado por los patrones de intercambio genético (flujo génico) dentro y entre poblaciones (Schaal et al. 1998). La variación en factores que afectan la ecología reproductiva de plantas, como los niveles de auto-fertilización presentes en distintas poblaciones, pueden tener efectos pronunciados en la naturaleza del intercambio genético entre poblaciones (Schaal et al. 1998). La endogamia generalmente resulta en la disminución de la adecuación reproductiva y la depresión de la fecundidad y capacidad vital, y tiende a elevar el riesgo de extinción en poblaciones pequeñas (Frankham et al. 2002). La deriva génica, acentuada por la disminución del tamaño poblacional, puede provocar que varios alelos distintos se fijen en las poblaciones y 4 se observe una variación a nivel poblacional baja y altos niveles de diferenciación entre poblaciones. La presencia o ausencia de una estructuración geográfica de las poblaciones se vuelve interesante cuando se puede estudiar la distribución de variantes génicas dentro de estas poblaciones. En este caso, los patrones de variación poblacional pueden ser utilizados para probar si cambios climáticos (e.g. ciclos de glaciación durante el Pleistoceno) promovieron o inhibieron divergencia, ya que la variación intra-específica refleja tanto eventos recientes como históricos (Templeton et al. 1995). Cuando se tienen poblaciones geográfica y genéticamente estructuradas, y se realiza una reconstrucción de la genealogía de una variante génica dentro de estas poblaciones, se denomina ésta como análisis “filogeográfico” (Avise 2006). Filogeografía La filogeografía es el estudio de los principios y procesos que gobiernan la distribución geográfica de linajes genealógicos, especialmenteaquellos dentro o entre especies cercanamente emparentadas (Avise 2000). En otras palabras, la filogeografía trata con los componentes históricos y filogenéticos de la distribución espacial de linajes de genes. Los estudios filogeográficos son útiles para inferir patrones históricos de distribución de especies. En su acepción más simple y general, mediante la identificación de variantes genealógicas, que son superpuestas en un 5 marco geográfico, se ve reflejada la dinámica espacio-temporal de las especies (Dumolin-Lapegue et al. 1997a). La disciplina filogeográfica se desarrolló por medio de estudios empíricos sobre DNA mitocondrial (mtDNA) en animales. Las propiedades especiales de este material genético permitieron resolver historias genealógicas de organismos coespecíficos. Debido a su herencia uniparental, los árboles de genes mitocondriales, y en su caso de genes dentro del genoma de cloroplasto (cpDNA), constituyen componentes filogenéticos jerárquicos y ramificados (Avise 2000). De esta manera se han podido realizar estudios filogeográficos en distintos grupos de organismos y se ha podido generalizar que la mayoría de las especies consisten de poblaciones geográficamente estructuradas, algunas de las cuales pueden experimentar poco o ningún contacto genético por largos periodos (Avise 2000). La demografía histórica y contemporánea puede afectar la estructura espacial de poblaciones coespecíficas y por tanto influenciar las genealogías génicas intra- específicas. De esta manera, el reto empírico principal de la filogeografía intraespecífica es la descripción de eventos demográficos (históricos y actuales) que probablemente hayan producido un patrón espacial observable de grupos de linajes genealógicos. Asimismo, esta disciplina sirve como herramienta conceptual útil que nos permite valorar el papel que han tenido fenómenos biogeográficos distintos (i.e. dispersalismo y vicarianza) sobre el arreglo espacial de organismos y sus caracteres (Avise 2000). 6 Avise (2000) hace énfasis en cuatro aspectos de congruencia genealógica que son relevantes para interpretaciones filogeográficas; éstos involucran un acuerdo en patrones filogenéticos: 1) entre sitios dentro de un mismo gen; 2) entre múltiples árboles génicos en loci no ligados; 3) entre dos o más especies co-distribuidas con ecología o historias naturales similares; y 4) entre datos genéticos moleculares y evidencia biogeográfica clásica. El primer aspecto se refiere a la presencia de una división filogenética significativa, es decir, la existencia de una estructuración espacial de las variantes génicas. El segundo sirve de confirmación de los árboles génicos como registro de separaciones filogenéticas a nivel poblacional y de especie. El tercer y cuarto aspecto de congruencia implican la presencia de historias biogeográficas de biotas enteras, es decir, muestran la existencia de patrones biogeográficos. Los métodos filogeográficos han brindado herramientas para dilucidar los efectos que han tenido eventos históricos de gran escala (e.g. oscilaciones climático en el Pleistoceno) sobre la distribución y subdivisión de la biota (Trewick et al. 2002). Se ha utilizado un amplio espectro de organismos para estudiar patrones filogeográficos, incluyendo animales (e.g. osos, Taberlet y Bouvet 1994; aves, Avise y Walker 1998; humanos, Lintz et al. 2007) y plantas (e.g. encinos, Dumolin- Lapegue et al. 1997a; árboles mediterráneos, Petit et al. 2003; especies montanas, Schonswetter et al. 2006). Sin embargo existen pocos datos publicados referentes a filogeografía de helechos (e.g. Trewick et al. 2002; Vitalis et al. 2002; Janssen et al. 2008). 7 Marcadores moleculares Para el estudio de la diversidad genética en poblaciones naturales se utilizan, actualmente, una serie de marcadores moleculares específicos o generales de diversas metodologías basadas en la amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mediante el uso de distintos marcadores moleculares se pueden apreciar aspectos particulares en los datos y pueden evaluarse escenarios históricos diferentes. La amplificación y secuenciación de marcadores representa uno de los mejores métodos para el estudio de la diversidad genética, pues brinda la secuencia exacta de los loci analizados. Sin embargo, ésta requiere del diseño de iniciadores específicos y su costo es moderadamente alto. En el presente trabajo se utilizaron espaciadores intergénicos de DNA de cloroplasto (cpDNA) como marcadores moleculares para la reconstrucción filogeográfica. Estos marcadores de cpDNA han sido frecuentemente utilizados para estudiar la variación genética y los patrones filogeográficos intraespecíficos en poblaciones de plantas (Lu et al. 2002). Su herencia uniparental y evolución casi neutral los hacen adecuados para reconstruir los patrones filogeográficos intra-específicos (Ferris et al. 1998). Una consecuencia interesante de la herencia uniparental del genoma de cloroplasto es su modo clonal de evolución, que le confiere un alta utilidad en la reconstrucción de filogenias (Dumolin-Lapegue et al. 1997b). 8 Aún cuando el genoma del cloroplasto evoluciona generalmente de manera lenta (Clegg et al. 1991), haciendo de éste un sistema ideal para evaluar relaciones filogenéticas (Chiang et al. 1998), algunos estudios recientes han revelado variación genética entre poblaciones de la misma especie en secuencias específicas de espaciadores no codificantes entre algunos tRNAs de cpDNA (Demesure et al. 1995, 1996). Específicamente, se han utilizado un par de espaciadores intergénicos (i.e. trnL-trnF y atpB-rbcL) para examinar los niveles de variación y la estructura filogeográfica en especies de helechos arborescentes (e.g. Wang et al. 2003b, 2004, Su et al. 2005a, 2005b). Aún cuando el tipo de herencia de cpDNA se desconoce para la familia Cyatheaceae, los escasos estudios realizados con especies de helechos de otros grupos muestran que la herencia de cpDNA se da exclusivamente por vía materna (Gastony y Yatskievych 1992; Vogel et al. 1998; Kuroiwa et al. 1998; Xiang et al. 1999; Guillón y Raquin 2000). Además, la utilidad de marcadores de este tipo en estudios de genética de poblaciones y filogeografía se ha puesto de manifiesto en especies de dicha familia (Wang et al. 2003b, 2004; Su et al. 2004, 2005a, 2005b), en las cuales se han encontrado niveles de variación genética significativos y estructuras filogeográficas marcadas. 9 1. 2. Familia Cyatheaceae La familia Cyatheaceae consta de 500-600 especies de helechos arborescentes que forman una parte conspicua de los bosques tropicales húmedos de montaña alrededor del mundo (Conant et al. 1994; Véliz-Vargas 2006; Ramírez-Barahona et al. en preparación). La familia tiene una distribución pantropical, aunque se pueden encontrar miembros en regiones subtropicales y templadas (Korall et al. 2007), y se conocen 258 especies para el Neotrópico (Ramírez-Barahona et al. en preparación). Casi todos los miembros de esta familia se caracterizan por presentar un tallo aéreo erecto, una base peciolar escamosa y soros dorsales (no marginales) sobre las venas, con un receptáculo usualmente elevado (Kramer y Green 1990). Sin embargo, no existe ningún carácter ubicuo que defina a las especies miembros de la familia. Es un grupo inusual, ya que es la única familia de helechos con un alta diversidad específica y un número cromosómico aparentemente uniforme; se han establecido los números cromosómicos de aproximadamente 10% de las especies y en todos los casos son diploides con 2n = 138 (Conant et al. 1994). La familia también es inusual entre los helechos por la ocurrencia de híbridos diploides fértiles y de estabilización reproductiva de éstos para formar nuevas especies (Conant y Cooper-Driver 1980). La familia Cyatheaceaees el grupo de helechos arborescentes más ampliamente distribuido, con límites latitudinales en el hemisferio norte en el archipiélago japonés (Conant et al. 1994), y en el hemisferio sur en las islas 10 subantárticas de Auckland (Large y Braggins 2004). Existen varios centros de diversidad, entre los que se encuentran las Antillas Mayores, América Central, los Andes, Madagascar, Malasia, incluyendo Indonesia, Filipinas y Nueva Guinea (Lellinger 1989). Los helechos arborescentes se distribuyen en respuesta a los patrones de selvas lluviosas cálidas y bosques nublados (Véliz y Vargas 2006). Desde un punto de vista biogeográfico, las especies de la familia son de gran interés, ya que se ha sugerido que los helechos cyateoides se encontraban distribuidos globalmente durante el Mesozoico medio (200-150 millones de años). Debido a subsecuentes cambios climáticos muchas de sus especies ancestrales se extinguieron y solamente algunas sobrevivieron en zonas montanas tropicales y subtropicales con distribuciones relictuales (Lucansky 1974). Especies en México En México se encuentran 16 especies de Cyatheaceae (Apéndice I) y están representados los cuatro géneros (sensu Lellinger 1987) de la familia (Mickel y Smith 2004). La familia tiene un límite latitudinal al norte en los manchones de bosque mesófilo de Hidalgo, Querétaro de Arteaga y San Luis Potosí (Figura 1), siendo Alsophila firma y Cyathea fulva las únicas especies con un intervalo de distribución tan septentrional. En cuanto a sus límites hacia el sur, todas las especies de la familia presentes en México se extienden hacia América Central y América del Sur (Figura 1), con 11 Fi gu ra 1 . M ap a de d is tr ib uc ió n pa ra la fa m ili a C ya th ea ce ae e n M éx ic o, C en tr oa m ér ic a, L as A nt ill as y n or te d e Su ra m ér ic a, c on é nf as is e n la s 16 e sp ec ie s p re se nt es e n M éx ic o (p un to s r oj os ) ( ve r A pé nd ic e I) , g en er ad o co n el p ro gr am a A rc V ie w G IS 3 .2 (E SR I 1 99 9) . D at os o bt en id os a tr av és d e la s b as es d e da to s d el M is so ur i B ot an ic al G ar de n (w 3T ro pi co s) y d e la R ed M un di al d e In fo rm ac ió n so br e B io di ve rs id ad (R E M IB ) y de c on su lta s d e es pe ci m en es d en tr o de l H er ba ri o N ac io na l d el In st itu to d e B io lo gí a, U N A M (M E X U ). 12 Los helechos arborescentes en México siguen un patrón de distribución montano, encontrándose distribuidos a lo largo de las principales cadenas montañosas del país (e.g. Faja Volcánica Transmexicana, Sierra Madre Oriental, Sierra Madre del Sur). Pueden encontrarse principalmente dentro de manchones de bosque mesófilo de montaña, encinares húmedos y bosques de pino-encino. Generalmente estos helechos crecen en ambientes riparios, especialmente dentro de encinares y bosques de pino-encino, aunque en manchones de bosques mesófilo su distribución es más homogénea, formando parte importante de los estratos arbóreos bajos. Especies de estudio Las especies de la familia Cyatheaceae generalmente pueden distinguirse por la presencia de distintas morfologías de las escamas presentes en el ápice del fuste y las bases peciolares (Figura 2). Alsophila firma (Baker) D. S. Conant (sensu Lellinger 1987) Alsophila es un género de >200 especies alrededor de los trópicos (Mickel y Smith 2004), 35 en el Neotrópico y cuatro en México (Ramírez-Barahona et al. en preparación). Las especies de este género son distintas a otras por la presencia de escamas peciolares con setas aciculares negras. A. firma es una especie de helechos arborescentes de hasta 10.5 m de altura y 30 cm de diámetro, con frondas 13 Figura 2. Escamas peciolares presentes en Cyatheaceae. A) Escamas conformes presentes en especies del género Sphaeropteris; B) Escamas flabeloides (sin setas aciculares terminales) presentes en especies de los géneros Cnemidaria y Cyathea; C) Escamas con setas aciculares terminales presentes en el género Alsophila (esquema de Korall et al. 2006). bipinnadas-pinnatífidas tan largas como 3 m; la especie se caracteriza por la presencia de indusio globoso, espinas negras alargadas en los estípites, venación simple y pínnulas ascendentes con ápices agudos; número cromosómico (2n) de 138. A. firma se distingue de las demás especies de Cyatheaceae en México por tener una lámina reducida a un ápice parecido a una pinna de hasta 40 cm de largo (Mickel & Smith 2004). A. firma se distribuye principalmente en bosques húmedos de montaña, en altitudes de 600–2500 msnm. En México se encuentra en manchones de bosque en 14 Figura 3. Planta adulta y mapa de distribución en México (abajo) de Alsophila firma; lámina (izquierda) y base peciolar con escamas y espinas (derecha); mapa generado con el programa ArcView GIS 3.2 (ESRI 1999) con datos obtenidos a través de las bases de datos del Missouri Botanical Garden (w3Tropicos) y de la Red Mundial de Información sobre Biodiversidad (REMIB) y de consultas del Herbario Nacional del Instituto de Biología, UNAM (MEXU). 15 los estados de Chiapas, Estado de México, Hidalgo, Oaxaca, Puebla, Querétaro de Arteaga, San Luis Potosí y Veracruz; se extiende hacia América Central y América del Sur: Belice, Costa Rica, Ecuador, El Salvador, Guatemala, Honduras, Nicaragua, Panamá y Ecuador (Mickel y Smith 2004) (Figura 3). Cyathea fulva (M. Martens & Galeotti) Fée (sensu Lellinger 1987) Cyathea es un género de alrededor de 100 especies alrededor del trópico (Mickel y Smith 2004), 11 en México (Ramírez-Barahona et al. en preparación). Las especies de este género se distinguen por la presencia de escamas peciolares flabeloides, sin setas aciculares (Mickel y Smith 2004). C. fulva es una especie de helechos arborescentes de hasta 12 m de altura y 10 cm de diámetro, con frondas bipinnadas- pinnatífidas tan largas como 5 m; esta especie se caracteriza por la presencia de indusio globoso efímero, espinas robustas en los estípites, venación rara vez simple (1-bifurcada) y pínnulas sésiles con segmentos obtusos (Mickel y Smith 2004). Cyathea fulva se distribuye principalmente en bosques húmedos de montaña en altitudes de 800–2700 m y hasta 3250 m (Mickel y Smith 2004). En México se encuentra en manchones de bosque en los estados de Chiapas, Guerrero, Hidalgo, Oaxaca, Puebla, San Luis Potosí y Veracruz; en América Central y América de Sur: Colombia, Costa Rica, Ecuador, Guatemala, Honduras, Nicaragua, Panamá y Venezuela (Mickel y Smith 2004) (Figura 4). 16 Figura 4. Planta adulta y mapa de distribución en México (abajo) de Cyathea fulva; lámina (izquierda) y base peciolar con escamas y espinas (derecha); mapa generado con el programa ArcView GIS 3.2 (ESRI 1999) con datos obtenidos a través de las bases de datos del Missouri Botanical Garden (w3Tropicos) y de la Red Mundial de Información sobre Biodiversidad (REMIB) y de dentro del Herbario Nacional del Instituto de Biología, UNAM (MEXU). 17 1.3. Escenario biogeográfico Bosque mesófilo de montaña El bosque mesófilo de montaña corresponde en México al clima húmedo de altura, situado entre los 600 y 3000 de altitud. Dentro de las comunidades que viven en zonas montañosas ocupa sitios más húmedos que los bosques de encinos y pinos, generalmente más cálidos que los del bosque de abetos, pero más frescos que los de bosques tropicales (Rzedowski 1978). Las condiciones climáticas que requiere el bosque mesófilo se presentan en zonas restringidas en México y por consiguiente éste tiene una distribución limitada y fragmentaria (Rzedowski 1978) (Figura 5). El bosque mesófilode montaña, al igual que otros tipos de vegetación montana, han sufrido grandes fluctuaciones en su distribución durante los ciclos glaciales de cambio climático y por esta razón se considera un tipo de vegetación relictual. De esta manera, el bosque mesófilo de montaña y las especies características que habitan en éste se convierten en modelos interesantes debido a su historia evolutiva compleja. Además de la historia de contracción debida a factores climáticos, el bosque mesófilo de montaña presenta grandes índices de deterioro y reducción a lo largo de toda su extensión debido a los altos índices de deforestación y explotación agrícola, y por consiguiente el patrón de distribución fragmentario se ha incrementado (Luna et al. 1989, 1994). El área ocupada por este tipo de vegetación se ha reducido drásticamente en los últimos cincuenta años y se sigue reduciendo rápidamente 18 Fi gu ra 5 . M ap a de d is tr ib uc ió n de b os qu e m es óf ilo d e m on ta ña (v er de o sc ur o) , b os qu es d e co ní fe ra s ( ve rd e cl ar o) y se lv a al ta p er en ni fo lia (g ri s) en M éx ic o y C en tr oa m ér ic a, g en er ad o co n el p ro gr am a A rc V ie w G IS 3 .2 (E SR I 1 99 9) ; d at os d e C O N A B IO (1 99 9) y C C A D -B M (2 00 4) . 19 como producto principalmente del crecimiento de la población humana y de la expansión de las actividades productivas como la agricultura y la ganadería (Luna et al. 1988). Rzedowski (1978) sostiene que este tipo de vegetación cubría menos del 1% del territorio nacional; veinte años más tarde, Challenger (1998) estimó que el bosque mesófilo ocupaba solamente la mitad de su cobertura original. Tomando en cuenta esta tendencia, es altamente probable que el bosque mesófilo tenga una cobertura actual menor al 0.5% del territorio nacional (< 1 millón de hectáreas). El estudio del patrón fragmentario y la obtención de listas florísticas completas de los distintos manchones con este tipo de vegetación en el país, han permitido proponer hipótesis sobre los procesos que han producido los patrones actuales de distribución de la flora y fauna de México (Alcántara y Luna 2001). El patrón de distribución ha determinado que cada uno de los manchones de bosque tengan una composición florística diferente (Luna et al. 1994); este fenómeno debe reflejarse en diferencias entre las poblaciones de especies de plantas características de este tipo de vegetación. La Sierra Madre Oriental (SMOR), que comprende parte de los estados de Coahuila, Guanajuato, Hidalgo, Nuevo León, Puebla, Querétaro de Arteaga, San Luis Potosí, Tamaulipas y Veracruz (Figura 6), es una de las regiones del país con mayor cobertura de bosque mesófilo. El estado de Hidalgo es el tercer estado de la República Mexicana con mayor superficie ocupada por bosque mesófilo de montaña, después de Oaxaca y Chiapas (Ortega y Castillo 1996). Los manchones de bosque mesófilo en el estado de Hidalgo, correspondientes a gran parte de los bosques de la 20 Sierra Madre Oriental, se encuentran en elevaciones de 750-2,400 msnm y son considerados como algunos de los manchones de bosque más extensos y continuos en el país. La situación para los demás estados es diferente, ya que en éstos, los bosques muestran un índice de deterioro muy elevado. Dentro del estado de Veracruz la Sierra Madre Oriental abarca dos áreas (Sosa y Lorea 2004), la primera es la región de la Huasteca Baja Veracruzana y la segunda es la región Totonaca del estado. La mayor parte del bosque mesófilo de montaña se encuentra dentro de la primer región, en la mitad sur del municipio de Ilamatlán, el centro-sur de Huayacocotla, el sur de Texcatepec y la mayor parte del municipio de Zacualpan (Sosa y Lorea 2004). Estos bosques se encuentran regularmente entre los 1,000 y 1,900 msnm, pero los límites superior e inferior son rebasados en algunos lugares, llegando a los 2,100 y 800 msnm respectivamente (Sosa y Lorea 2004). Los manchones de bosque localizados en la parte central del estado (región Totonaca y región Capital) muestran índices de deterioro de más del 90% de su cobertura original (Williams-Linera et al. 2002), dejando estos manchones en lugares poco accesibles para su exploración. En el estado de Puebla los manchones de bosque mesófilo se encuentran en un estado similar de destrucción, aunque realmente no existen estudios acerca de este tipo de vegetación en el estado. El bosque mesófilo de montaña del estado de Querétaro cubre una superficie aproximada de 54 km2, lo que representa menos del 0.5% del territorio total de la entidad (Cartujano et al. 2002). Se distribuye parcialmente en los municipios de 21 Jalpan, Landa de Matamoros, Pinal de Amoles y San Joaquín (Figura 6), en el extremo oriental del estado; los bosques más extensos y continuos están en el extremo oriental del municipio de Landa de Matamoros (Cartujano et al. 2002). En el estado de San Luis Potosí los manchones de bosque mesófilo se encuentran en los municipios de Alaquines y Tamasopo en el centro-sureste de la entidad, y en el municipio de Xilitla en el extremo sur del estado (Figura 6); estos últimos bosques representan el límite latitudinal de distribución de la familia. Aislamiento y fragmentación Las poblaciones de plantas características del bosque mesófilo en México, entre ellas gran parte de las de especies de Cyatheaceae, han estado sujetas a fuertes presiones demográficas. Esto se debe al bajo porcentaje de cobertura de este tipo de vegetación y a la creciente presión humana sobre los manchones de bosque, que se traduce en una destrucción generalizada de este tipo de vegetación. Reunir información de la variación genética entre y dentro de las poblaciones de especies amenazadas ha sido considerado como esencial en el manejo y conservación, porque las investigaciones de genética de poblaciones proveen de las guías necesarias para interpretar el estado presente y futura prognosis de las especies concernientes (Drummond et al. 2000). Las especies de Cyatheaceae, al tener una distribución restringida, tienen poblaciones reducidas que probablemente muestren niveles de variación genética bajos. Por esta razón es de vital importancia la descripción de dicha variación en sus poblaciones. 22 Los factores climáticos, entre los que destacan los ciclos glaciales ocurridos en el Pleistoceno, parecen ser la principal fuerza generadora de aislamiento y diferenciación poblacional histórica en ecosistemas montanos tropicales y subtropicales (Pennington et al. 2004; Jaramillo-Correa et al. 2008). Ante estos cambios climáticos, las poblaciones continuas se colapsaron en varios manchones aislados que fueron expuestos a distintas fuerzas generadoras de diferenciación poblacional. Varios autores (e.g. Pielou 1991; Roy et al. 1996; Knowles 2001; Su et al. 2004, 2005a, 2005b; Carstens y Knowles 2007) sostienen que las glaciaciones del Pleistoceno indudablemente han tenido un efecto significativo sobre muchos taxa al generar cambios en las distribuciones de las especies en respuesta a las fluctuaciones climáticas. Las especies montanas tropicales y subtropicales expandieron sus intervalos de distribución hacia altitudes menores durante los periodos más templados (máximos glaciales), generando distribuciones amplias y contínuas con altos niveles de flujo génico entre poblaciones (Jaramillo-Correa et al. 2008). Posteriormente, estas especies se retrajeron hacia grandes elevaciones hasta encontrarse confinadas a pequeños manchones insulares de altura durante el último calentamiento ocurrido en el Holoceno (Jackson et al. 1996; Jaramillo-Correa et al. 2008). Estos pequeños manchones aislados estarían expuestos a fuerzas estocásticas como la endogamia o laderiva génica, que llevarían a la rápida pérdida de variabilidad genética y potencial extinción de las especies (Jaramillo-Correa et al. 2006). No obstante, estas poblaciones relictuales pueden ser vistas como refugios 23 inter-glaciales, a partir de los cuales dichas especies pudieron expandir su intervalo de distribución durante el siguiente ciclo glacial (Ledig et al. 2000). Bajo este escenario de aislamiento y divergencia poblacional, predicho para ambientes montanos tropicales y subtropicales, la selección adaptativa divergente, la falta de flujo génico y la deriva génica se encuentran entre las fuerzas evolutivas más importantes que afectan la estructura poblacional (Knowles 2000, 2001). A su vez, los modelos de colonización pos-glaciales suponen un alta diversidad genética dentro de los refugios glaciales y una pérdida de diversidad durante la re-colonización a partir de estas poblaciones (Hewitt 2000). Sin embargo, el patrón de diversidad genética observado en poblaciones actuales depende, en última instancia, del intervalo de distribución de las poblaciones de refugio y de los niveles de intercambio genético entre éstas (Thiel-Egenter et al. 2008). Los helechos arborescentes de la familia Cyatheaceae representan un modelo apropiado para la investigación de procesos de diferenciación por dos razones: 1) el linaje es anterior a la última fragmentación del bosque mesófilo de montaña, lo cual permite probar hipótesis de vicarianza bajo el escenario de cambio climático durante el Pleistoceno; 2) los helechos arborescentes en México tienen un alta afinidad a condiciones ecológicas características, sirviendo como una familia modelo para estudiar los patrones de diferenciación del bosque mesófilo de montaña. Las hipótesis de diferenciación y diversificación por oscilaciones climáticas en poblaciones de helechos arborescentes en México, son congruentes con resultados 24 obtenidos en los pocos estudios que existen para la familia (i.e. Wang et al. 2003a, 2003b, 2004; Su et al. 2004, 2005a, 2005b; Janssen et al. 2008). En este sentido, se puede hablar de la existencia de cuatro factores principales que suponen la existencia de aislamiento entre las distintas poblaciones de helechos arborescentes, que pudieron haber generado un aumento en la diferenciación genética entre dichas poblaciones. Primero, las capacidades dispersoras de este tipo de helechos están seriamente limitadas, debido principalmente a la fragilidad en la vitalidad (i.e., sobrevivencia) de sus esporas (Cheng et al. 1990; Given 1993), a condiciones ambientales limitadas para la germinación y maduración de gametófitos (Bernabe et al. 1999; Hiendlmeyer y Randi 2007) y a la dispersión de gran parte de las esporas producidas a distancias cortas (Conant 1976; Peck et al. 1990; Wolf et al. 2001). Además, los niveles de carga genética disminuyen las probabilidades de establecimiento después de un evento de dispersión de esporas (Singh y Roy 1977), ya que el gametofito establecido en una nueva localidad tendrá altas probabilidades de sufrir una fertilización intra-gametofítica (Klekowski 1973). Este tipo de reproducción lleva a generar esporofitos completamente homócigos en una sola generación, los cuales expresarán todos los alelos deletéreos presentes. Estas limitaciones, junto con la fragmentación y aislamiento, se traducen en un flujo génico reducido en estas poblaciones. Segundo, Arens (2001) sostiene que las diferencias observadas en el desempeño de Cyathea caracasana, cercanamente emparentado con C. fulva (sensu 25 Conant et al. 1996) se pueden deber a plasticidad fenotípica o a la adaptación intra- poblacional a diferentes ambientes. Si esto último es cierto, podemos decir que la variación inter-poblacional observada puede verse afectada por presiones de selección distintas en cada uno de los manchones de bosque. Tercero, los tamaños poblacionales de las especies de Cyatheaceae se han ido reduciendo por la fragmentación del bosque mesófilo de montaña en manchones más pequeños y por su alta fidelidad a sitios húmedos y/o riparios. Luna et al. (1999) exploraron, por medio del Análisis de Parsimonia de Endemismos, una hipótesis general de las relaciones históricas del bosque mesófilo de México y encontraron evidencia de que cinco grandes manchones de bosque mesófilo divergieron secuencialmente de un bosque anteriormente continuo, donde cambios climáticos mayores proveyeron los eventos de aislamiento que indujeron a su fragmentación. Lo anterior puede sugerir consecuentemente que las poblaciones de Cyatheaceae han ido perdiendo variación genética por la reducción de sus poblaciones y los consecuentes efectos de la deriva génica. Cuarto, Conant (1990) sostienen que aún cuando el sistema de apareamiento de estos helechos no se conoce a fondo, la condición bisexual y la maduración sincrónica de gametos indican que éstos tienen el potencial de auto-fertilización. Tryon y Tryon (1982) sostienen que en los helechos, la fertilización cruzada requiere que la cercanía de dos gametofitos sea suficiente para que el esperma de uno alcance el huevo del otro, por lo que la densidad poblacional es un factor importante en los niveles de endogamia en las poblaciones. Además, la fertilización depende 26 enteramente de la presencia de agua en el nicho (Cheng et al. 1990) y aún cuando se de una fertilización cruzada entre gametofitos, existe la posibilidad de que éstos provengan de un mismo individuo adulto (auto-fertilización inter-gametofítica) y como consecuencia se esperarían una diferenciación local considerable y baja heterocigosis (Barrington 1993). Estos prerrequisitos aumentan la probabilidad de que se lleve a cabo un proceso de auto-fertilización intra-gametofítica. 1. 4. Antecedentes Los estudios de variación genética y relaciones filogenéticas de especies de la familia Cyatheaceae son escasos y en México no existen estudios enfocados al análisis de la variación genética en éstas. Conant et al. (1994, 1996) analizaron las relaciones filogenéticas de especies de la familia con información de cpDNA; Wang et al. (2003a, 2003b, 2004) realizaron estudios de genética de poblaciones y filogeografía en Alsophila spinulosa utilizando marcadores RAPD y secuencias de atpB-rbcL de cpDNA; Su et al. (2004, 2005a, 2005b) estudiaron la estructura filogeográfica de A. spinulosa utilizando secuencias de atpB-rbcL y trnL-F; Korall et al. (2007) realizaron análisis filogenéticos utilizando marcadores nucleares y de cpDNA; Zhou et al. (2008) aislaron y caracterizaron loci de microsatélites en A. spinulosa; Janssen et al. (2008) analizaron patrones de diversificación en los helechos arborescentes malgaches. Los estudios de variación genética y filogeografía en helechos de otras 27 familias son más abundantes, pero en relación a otros grupos de plantas, éstos siguen siendo relativamente escasos. Estudios sobre la biología reproductiva y ecología de la familia Cyatheaceae para el continente son varios, entre los cuales destacan los siguientes: Bittner y Breckle (1995) establecieron tasas de crecimiento y edad de este tipo de helechos; Conant y Cooper-Driver (1980) describieron el establecimiento de híbridos fértiles en especies de Alsophila y Nephelea; Pérez-García y Riba (1982) determinaron el efecto de la temperatura sobre la germinación de esporas; Conant (1990) estudió la biología reproductiva de varias especies de Alsophila; Arens y Sánchez-Baracaldo (1998) describieron la distribución de plantas en un mosaico sucesional; Bernabé et al. (1999) estudiaron la germinación de esporas, supervivencia y establecimiento de esporofitos; Arens (2001) realizó un estudio sobre el crecimiento de C. caracasana en diferentes microambientes; Mehltreter y García-Franco (2008) estudiaron la fenología foliar y tasas de crecimiento de A. firma.Los estudios de genética de poblaciones en especies mexicanas son variados, entre los cuales destacan algunos trabajos con especies de helechos (Apéndice II) y especies de distribución restringida; Coello et al. (1993) con la planta endémica Lacandonia schismatica (Lacandoniaceae); Ledig et al. (1997) con una especie endémica del género Picea; Delgado et al. (1999) con el pino mexicano Pinus rzedowskii (Pinaceae); Martínez-Palacios et al. (1999) con el agave endémico Agave victoria-reginae; Aguirre-Planter et al. (2000) con especies de Abies (Pinaceae); Ledig et al. (2000) con la especie endémica Picea martinezii; Cuenca et al. (2003) 28 con la especie de pino relictual Pinus nelsonii; González-Astorga et al. (2003) con la cícada Dioon edule (Zamiaceae); Silva-Montellano y Eguiarte (2003) con Agave lechugilla; González-Rodríguez et al. (2004) con el complejo de encinos Quercus affinis – Q. laurina; González-Astorga et al. (2005) con la especie de cícada Dioon angustifolium; Jaramillo-Correa et al. (2006) con Picea chihuahuana; Ledig et al. (2006) con Abies bracteata; Jaramillo-Correa et al. (2008) con especies del género Abies. 1 2. OBJETIVOS Objetivos generales Realizar una primera descripción de la estructura filogeográfica y los patrones de variación genética en poblaciones de dos especies de helechos arborescentes: Alsophila firma y Cyathea fulva (Cyatheaceae), presentes en manchones de bosque mesófilo de montaña en la Sierra Madre Oriental. Objetivos particulares • Establecer la utilidad de distintos espaciadores intergénicos de cpDNA para el estudio de patrones de variación genética y estructuración filogeográfica en las especies de helechos arborescentes mexicanos. • Calcular los niveles de variación genética y establecer el grado de diferenciación entre las distintas poblaciones de A. firma y C. fulva en la Sierra Madre Oriental, utilizando información de marcadores de cpDNA. • Realizar una primera aproximación a la historia y estructura filogeográfica de las poblaciones de las especies analizadas, dentro de la región más septentrional de los intervalos de distribución (i.e., Sierra Madre Oriental) de dichas especies. 2 • Proponer una hipótesis preliminar sobre la relación que guardan los procesos históricos de cambio climático y fragmentación del hábitat con los patrones de variación genética en las poblaciones de los helechos arborescentes estudiados. 1 3. MÉTODOS 3. 1. Área de estudio Bosque mesófilo de montaña de la Sierra Madre Oriental (SMOR). El bosque mesófilo (sensu Rzedowski 1978) se encuentra en los estados de Hidalgo, Querétaro de Arteaga, Puebla, San Luis Potosí, Tamaulipas y Veracruz. Sin embargo, los helechos arborescentes de la familia Cyatheaceae solamente se presentan en manchones de bosque en la parte más sureña de la provincia, lo que excluye del estudio los bosques del estado de Tamaulipas y la parte central de San Luis Potosí. Utilizando como referencia datos de registro de herbario existentes en el Herbario Nacional del Instituto de Biología, UNAM (MEXU) y en el Herbario de la Facultad de Ciencias, UNAM (FCME), así como registros de la base de datos del Missouri Botanical Garden (w3 Tropicos), se definieron los sitios de colecta de helechos arborescentes. Se recolectaron muestras de helechos arborescentes en el estado de Hidalgo en los manchones de bosque mesófilo de Tenango de Doria (El Damo), Tlanchinol (Lontla y Tlanchinol) y Zacualtipán de Ángeles (Tlahuelompa); en Veracruz en el bosque del municipio de Huayacocotla (Helechales) y en la región centro (región Capital) del estado, en el municipio de Coatepec (Tecajetes) (Figura 6 y Tabla 1); esta última localidad se encuentra fuera de la provincia Sierra Madre Orientalense. En todas las localidades se colectaron helechos arborescentes de las especies presentes (Tabla 1), que posteriormente fueron identificadas y analizadas. 2 Figura 6. Localidades de colecta en los estados de Hidalgo y Veracruz, México para dos especies de helechos arborescentes Alsophila firma y Cyathea fulva; P1 = Tlanchinol, P2 = Lontla, P3 = Tecajetes, P4 = El Damo, P5 = Helechales, P6 = Tlahuelompa. 3 Tabla 1. Localidades de sitios de colecta, ejemplares de herbario (FCME) y secuencias obtenidas de Korall et al. (2007) para helechos arborescentes. 1= Alsophila firma, 2= Cyathea fulva, 3= Cyathea sp; *= localidades muestreadas para fines de exploración de polimorfismos; ♦= localidades de colecta fuera de la Sierra Madre Oriental; °= localidades con coordenadas geográficas aproximadas; FCME = Herbario de la Facultad de Ciencias, UNAM. Localidad Ubicación (municipio, estado) Longitud Latitud Altitud (msnm) Especies Colecta P1 Tlanchinol * Tlanchinol, Hidalgo 98° 38.052’O 20° 58.957’N 1,374 1, 2 P2 Lontla * Tlanchinol, Hidalgo 98° 38.566’O 21° 01.668’N 1,535 1, 2 P3 Tecajetes *♦ Coatepec, Veracruz 96° 58.894’O 19° 28.354’N 1,300 1, 3 P4 El Damo Tenango de Doria, Hidalgo 98° 12.812’O 20° 19.442´N 1,657 1, 2 P5 Helechales Huayacocotla, Veracruz 98° 28.177’O 20° 35.676’N 2,190 1, 2 P6 Tlahuelompa Zacualtipán de Ángeles, Hidalgo 98° 36.948’O 20° 37.921’N 1,950 1, 2 Herbario (FCME) H1 Villa Juárez ° Xicotepec, Puebla [97° 57.00’O] [20° 17.00’N] - 2 H2 Atoyac ° Atoyac de Álvarez, Guerrero [100° 22.00’O] [17° 18.00’N] - 2 Secuencias obtenidas de Korall et al. (2007) G1 Honduras ° Honduras [86° 50.00’O] [14° 35.00’N] - 1 G2 Costa Rica ° Costa Rica [83° 55.00’O] [9° 50.00’N] - 3 G3 Puerto Rico ° Puerto Rico [66° 30.00’O] [18° 13.00’N] - 3 4 Inicialmente, se muestrearon helechos en tres localidades de bosque mesófilo con el propósito de explorar la presencia de polimorfismos en distintos marcadores y establecer su utilidad en el estudio de los niveles de variación genética y estructura filogeográfica de dichas especies (Tabla 1). De estas tres localidades, dos se localizan en el municipio de Tlanchinol, Hidalgo y una en el municipio de Coatepec, Veracruz. Posteriormente, se colectaron organismos en tres localidades en los estados de Hidalgo y Veracruz (Tabla 1). 3. 2. Muestreo El muestreo se llevó a cabo de manera aleatoria, técnica similar utilizada por Su et al. (2004, 2005a, 2005b) y Wang et al. (2003b, 2004), que consiste en la recolección de plantas elegidas arbitrariamente evitando la colecta de clonas. En las dos primeras localidades (Lontla y Tlanchinol) se colectaron organismos de Alsophila firma y Cyathea fulva, mientras que en la tercera localidad (Tecajetes) se colectaron solamente organismos de A. firma y de una tercera especie de Cyathea (aff. bicrenata) (Tabla 1), debido a la ausencia de organismos de C. fulva. En la cuarta localidad (El Damo) se colectaron organismos de ambas especies, aunque se contó con una sola planta de C. fulva. En la quinta localidad de colecta (Helechales) se colectaron plantas de C. fulva y solamente una para A. firma. En la sexta localidad (Tlahuelompa) se colectaron ambas especies, aunque éstas son escasas y solamente se colectó una planta para A. firma (Tabla 1). 5 Para las muestras de cada planta se tomaron preferentemente fragmentos de hojas (pínnulas) jóvenes y saludables de organismos reproductivos; adicionalmente se tomaron muestras de escamas peciolares para cada una de las plantas muestreadas para facilitar su identificación. En el caso de no tener acceso al ápice del fuste, se realizó una identificación visual en campo. Las muestras de tejido foliar se conservaron en bolsas de plástico con silica gel o colocándolas directamente en nitrógeno líquido (-70 °C) para su posterior procesamiento (Chiang et al. 1998; Su et al. 2004, 2005a 2005b; Wang et al. 2003b, 2004). Las muestras de tejido se conservaron a -80 °C hasta ser procesadas. Adicionalmente, se recolectaronejemplares de cada especie, que fueron depositados dentro de la colección del Herbario de la Facultad de Ciencias, UNAM (FCME) (S. Ramírez-Barahona 12, 22) y en el Herbario Nacional del Instituto de Biología, UNAM (MEXU). 3. 3. Extracción de DNA La extracción de DNA total de tejido foliar se realizó siguiendo el protocolo CTAB (bromuro de cetiltrimetil amonio) mini-prep de Vázquez-Lobo 1996 (Apéndice III). El protocolo de extracción fue modificado para incorporar múltiples extracciones con CTAB, varios lavados con cloroformo-octanol y digestión con proteinasa K (pasos no reportados). Por otra parte, se varió la cantidad de tejido foliar (lámina) utilizado en las extracciones y se removieron en gran parte cóstulas, soros, esporas y 6 receptáculos de las muestras. Adicionalmente, se extrajo DNA de ejemplares de herbario depositados en el Herbario de la Facultad de Ciencias, UNAM (FCME). Estos ejemplares en su mayoría corresponden a colectas en los estados de Guerrero, Puebla y Veracruz. La concentración de DNA se estimó a través de una electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer TAE teñido con bromuro de etidio y visualizado con luz ultravioleta, cuantificando mediante la comparación de intensidad de banda con un marcador de peso molecular de 100 pb (Nucleic Acid Markers, 100 bp DNA Ladder, Invitrogen). Inicialmente se extrajo DNA de todos los organismos de cada especie en todas las localidades de colecta. Sin embargo, la calidad de DNA no fue adecuada para amplificar en todas las muestras y algunos ejemplares colectados fueron mal identificados, tratándose de helechos afines a otros grupos (i.e. aff. Diplazium). En el caso de las extracciones de material de herbario, la concentración de DNA no pudo ser corroborada mediante electroforesis, debido a las bajas concentraciones de material extraído. Para estas muestras de DNA se procedió directamente con la amplificación. 3.4. Amplificación y secuenciación Exploración de polimorfismos Para facilitar la exploración y detección de polimorfismos en los marcadores de cpDNA se estableció un panel exploratorio de dos grupos de cinco organismos por 7 localidad para cada una de las especies; se seleccionaron muestras con concentraciones equivalentes. Para esto se siguió el protocolo reportado por Pelgas et al. (2004), donde se mezclaron porciones iguales de DNA de los organismos seleccionados para someterlos a reacciones de amplificación utilizando primers específicos para las tres regiones de cpDNA (Tabla 2). Adicionalmente, cada una de las muestras de DNA de los organismos seleccionados fue sometida a reacciones de amplificación por separado. Espaciadores intergénicos de cpDNA Se obtuvieron secuencias para tres regiones del genoma de cloroplasto que incluyen los espaciadores intergénicos atpB-rbcL, trnG-trnR y trnL-trnF; estas tres regiones se encuentran dentro de la región larga LSC (Large Single Copy) del genoma de cloroplasto. Los primers para la amplificación de atpB-rbcL se obtuvieron de Korall et al. (2007), para trnG-trnR de Nagalingum et al. (2007) y Korall et al. (2007), y para trnL-trnF de Taberlet et al. (1991) (Tabla 2). Todas las amplificaciones fueron efectuadas en un volumen de reacción de 30 μL, utilizando amortiguador 1 X (500 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3), 2.0 mM MgCl2, 5% BSA (Albúmina Sérica Bovina), 0.2% triton X-100, 50 μM de cada dNTP, ≈10 ng DNA, 1.5U Taq polimerasa y 0.2 μM de cada primer. Para la amplificación del trnL-trnF se utilizaron 100 μM de cada dNTP y 0.4 μM de cada primer. 8 La amplificación de las tres regiones de cpDNA se llevó a cabo siguiendo perfiles de termociclación modificados a partir del protocolo reportado por Su et al. (2005b); éstos constaban de 3 minutos iniciales a 94 °C, seguido de 25-30 ciclos de 45 segundos a 94 °C, 60 segundos a temperatura de alineación (Tabla 2) y 90 segundos a 72 °C, con 7 minutos adicionales a 72 °C. Para la amplificación de la región atpB-rbcL en ejemplares de herbario se aumento el número de ciclos a 34 debido a la presencia de cantidades mínimas de DNA extraído. Tabla 2. Secuencias de primers y temperaturas de alineación utilizadas para la amplificación y secuenciación de espaciadores intergénicos cpDNA en dos especies de helechos arborescentes Alsophila firma y Cyathea fulva. Región Primer Secuencia (5´-3´) Tm (°C) atpB-rbcL RBCL26R GCT TTA GTC TCC GTT TGT GGT GAC AT 54 ATPB703R CCA ATG ATC TGA GTA ATS TAT CC trnG-trnR TRNG1F GCG GGT ATA GTT TAG TGG TAA 55 TRNG63R GCG GGA ATC GAA CCC GCA TCA TRNG353F TTG CTT MTA YGA CTC GGT G TRNR22R CTA TCC ATT AGA CGA TGG ACG trnL-trnF TRNLC CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG 53 TRNFF ATT TGA ACT GGT GAC ACG AG Los productos de PCR fueron examinados mediante una electroforesis en gel de agarosa (1% en TAE) teñido con bromuro de etidio (7.0 μl / 100 ml buffer), 9 visualizado con luz ultravioleta y fotografiado (Kodak EDAS 240). Aquellos productos de PCR con un solo fragmento de tamaño esperado fueron retenidos para su secuenciación. Estos productos fueron secuenciados en la Universidad de Washington (High-Throughput Genomic Unit). La calidad y presencia de errores en cada una de las secuencias fue verificada manualmente mediante el análisis de los cromatogramas correspondientes. 3.5. Análisis de datos Exploración de polimorfismos La presencia de polimorfismos fue verificada al observar “picos” dobles en los cromatogramas de las reacciones de secuenciación [producidos por SNPs (single nucleotide polymorphism) o cambios de marco de lectura (causados por indels)] (Pelgas et al. 2004). Estos polimorfismos fueron confirmados mediante duplicaciones y comparaciones con secuencias por separado de los organismos seleccionados (Jaramillo-Correa et al. 2008). En caso de confirmar polimorfismos dentro de la secuencia, se procedió con la secuenciación individual para cada uno de los organismos muestreados. Análisis de secuencias de cpDNA Las secuencias del espaciador intergénico atpB-rbcL fueron alineadas utilizando el programa BioEdit 5.0.6 (Hall 1999) y la presencia de sitios variables fue corroborada 10 mediante la inspección manual de los cromatogramas correspondientes. Las secuencias fueron limitadas en los extremos para evitar la presencia de sitios variables debido a artefactos de secuenciación. Se estimaron los niveles de variación, diferenciación genética y estructura filogeográfica con los datos obtenidos de secuencias de cpDNA. Los presentes análisis se realizaron de manera paralela para cada una de las especies. Variación genética Para el análisis de variación se estimaron índices de diversidad nucleotídica y haplotípica con el programa DnaSP v. 4.50.3 (DNA Sequence Polymorphism, Rozas et al. 2008). La diversidad nucleotídica π fue calculada con la fórmula (ecuación 10.5, Nei 1987), n n-1 Σ xi xj πij donde xi representa la frecuencia de la secuencia i y πij la proporción de diferencias nucleotídicas entre la secuencia i y la j. El estimador de Waterson θ-W , que se utiliza como un estimador de la variación genética global en una población, fue calculado con la fórmula (ecuación 10.3, Nei 1987), 11 pn A donde A = 1 + ½ +…+ (n-1)-1 y pn = sn / mT, donde sn y mT son el número de sitios polimórficos por secuencia y el número total de nucleótidos examinados, respectivamente. La diversidad haplotípica fue calculada con la fórmula (ecuación 8.1, Nei 1987), con corrección para muestras pequeñas, 2n (1 − Σ p2i) (2n − 1) donde xi es la frecuencia del haplotipo i. La varianza de Hd fue calculada como (ecuación 8.12, Nei 1987), 2 2n (2n-1) {2(2n-2) [Σxi3 - (Σxi2)2] + Σxi2 - (Σxi2)2} Diferenciación y estructuración El índice GST (diferenciación) estima la diferenciación genética relativa a la población total y fue calculado utilizandoel programa DnaSP v. 4.50.3 (Rozas et al. 2008) con la fórmula (ecuación 9, Nei 1973), DST HT 12 donde DST = 2σ 2x y HT = 2x (1-x), donde x y σ 2x son la media y la varianza de la frecuencia de un alelo entre subpoblaciones. Paralelamente, se realizó otro análisis de variación con el programa DnaSP, pero esta vez tomando en cuenta la presencia de indels como estados de carácter informativos. Esto debido a que en este nivel de análisis, el polimorfismo de DNA debido a sustituciones e indels puede ser estudiado sin distinción (Nei 1987). En este análisis se calculó la diversidad haplotípica (Hdi), diversidad nucleotídica (πi), estimador de Waterson (θ−Wi), índices de diferenciación (GSTi) y flujo génico (Nmi). Por último, se realizó una prueba de Tajima (D) para comprobar el carácter neutral de este marcador. Filogenia molecular Adicionalmente se realizó una reconstrucción filogenética utilizando el algoritmo Neighbour-Joining (NJ) con el programa MEGA 4.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis, Tamura et al. 2007), realizando 1,000 réplicas de bootstrap; para ésta se utilizó el modelo de sustitución de dos parámetros de Kimura (1980). Se hicieron reconstrucciones individuales para cada especie, utilizando los grupos externos correspondientes y una reconstrucción conjunta para ambas especies. Los grupos externos utilizados en la reconstrucción fueron secuencias de atpB-rbcL obtenidas para una tercera especie colectada (Cyathea aff. bicrenata) en la localidad de Tecajetes (Tabla 1) y secuencias obtenidas por Korall et al. (2007) para Alsophila 13 bryophila (Puerto Rico), A. cuspidata (Costa Rica), A. salvinii (Honduras), A. tryoniana (Honduras), C. caracasana (Costa Rica), C. divergens (Costa Rica), C. schiedeana (Honduras) y Lophosoria quadripinnata (Ecuador). Asociación entre distancia genética y distancia geográfica Asimismo, se elaboraron matrices de distancia (dn) entre poblaciones a partir del número de sitios nucleotídicos distintos entre secuencias con la fórmula, dXY - dX + dY 2 donde dX y d X es la distancia promedio dentro de las poblaciones X y Y, y d XY es la distancia promedio entre poblaciones. A partir de estas matrices se generaron dendogramas individuales de distancia entre poblaciones con el algoritmo Neighbor-Joining para las poblaciones de cada una de las especies. La correlación entre distancias genéticas (dn) y distancias geográficas entre poblaciones fue analizada mediante una prueba estadística de Mantel (1967). Ésta es una prueba estadística de correlación entre dos matrices de datos. La prueba calcula la correlación entre las matrices y después lleva a cabo permutaciones con los datos de dichas matrices. El valor de significancia de la prueba indica la proporción de matrices permutadas que tienen un valor de correlación mayor al valor de la correlación de las matrices originales (estadístico de prueba). Bajo la hipótesis nula 14 de no correlación entre matrices, se espera que la permutación tenga la misma probabilidad de producir valores que sean menores o mayores al estadístico de prueba. La prueba de Mantel se llevó a cabo con el programa Arlequin 3.11 (Excoffier et al. 2007). Asimismo, se analizó la correlación entre la diferenciación genética (GST) y las distancias geográficas entre las poblaciones. Distribuciones mismatch Una distribución mismatch es la distribución del número observado de diferencias entre pares de haplotipos. La distribución de estas diferencias usualmente es multimodal en muestras de poblaciones en equilibrio demográfico, pero generalmente son unimodales en poblaciones que pasaron por una expansión demográfica reciente (Slatkin y Hudson 1991) o por una expansión de rango con altos niveles de migración (Ray et al. 2003). De esta manera, es posible obtener información sobre los tamaños poblacionales pasados de una especie (Rogers 1995). Slatkin y Hudson (1991) sostienen que una población estable tiene una distribución estable Q(i), la cual se describe por la fórmula (ecuación 1, Slatkin y Hudson 1991), 1 1+ θ (θ / 1+ θ) i donde i es el número de sitios polimórficos entre cada par de secuencias y θ = 2Nυ, siendo N el tamaño de la población haploide y υ la tasa de mutación por generación. 15 Las distribuciones mismatch fueron evaluadas estadísticamente bajo dos modelos: 1) expansión demográfica súbita y 2) expansión de rango. Las pruebas de significancia fueron realizadas con el programa Arlequin 3.11 (Excoffier et al. 2007). Redes haplotípicas y análisis filogeográfico de clados anidados Las redes de haplotipos para ambas especies se elaboraron con el programa TCS 1.21 (Clement et al. 2000) con la opción de indels como quinto estado de carácter. Este programa utiliza parsimonia estadística para generar un algoritmo que estima el número máximo de diferencias entre haplotipos justificadas por un límite establecido de probabilidad de parsimonia (0.95). El algoritmo calcula la probabilidad de parsimonia para los haplotipos diferenciados por un paso y si ésta es mayor al límite establecido, conecta y forma redes con estos haplotipos. Posteriormente, el algoritmo calcula la probabilidad para los haplotipos diferenciados por dos pasos y si es mayor al límite conecta las redes de un paso por medio de estos haplotipos. El algoritmo continúa evaluando la probabilidad para haplotipos diferenciados por más pasos hasta que el límite establecido de parsimonia es superado. Las redes de haplotipos generalmente presentan relaciones ambiguas entre haplotipos que están dadas por la presencia de horquillas entre éstas. La presencia de horquillas dentro de las redes fue corregida manualmente con los criterios siguientes, propuestos por Crandall y Templeton (1993), 16 1) es más probable que los haplotipos raros se encuentran en nodos terminales y los haplotipos más frecuentes en nodos interiores, 2) es más probable que una variante de copia única (singleton) se encuentre conectada con haplotipos de la misma población que con haplotipos de distintas poblaciones. Una vez corregidas, las redes obtenidas fueron sometidas a un Análisis Filogeográfico de Clados Anidados (NCPA) para evaluar la existencia de grupos de haplotipos y establecer si existe una relación entre la distribución de haplotipos dentro de las poblaciones y la ubicación geográfica de éstas. Asimismo, se llevó a cabo un Análisis de Distancias Geográficas de Árboles de Haplotipos Anidados (NHTAGD) con el programa GeoDis (Posada et al. 2000). Paralelamente, se llevo a cabo el mismo análisis de manera manual siguiendo la clave de inferencia para el NHTAGD de Posada et al. (2000). 1 4. RESULTADOS Exploración de polimorfismos Por un lado, se obtuvieron secuencias de 1,000 pares de bases (bp) para marcador el trnG-trnR en Alsophila firma, Cyathea fulva y C. bicrenata. Para cada una de estas especies no se observaron secuencias con sitios polimórficos ni cambios en el marco de lectura, haciendo de éste un marcador aparentemente monomórfico para cada una de las especies analizadas. Por otro lado, en el análisis de detección de polimorfismos para el marcador atpB-rbcL se observó la presencia de múltiples sitios con polimorfismos y cambios de marco de lectura. Para este marcador se obtuvieron inicialmente 17 secuencias acotadas a 605 bp en A. firma, provenientes de seis organismos de Tlanchinol, seis de Lontla y cinco de Tecajetes [además de contar con una secuencia para un organismo de Honduras obtenida por Korall et al. (2007)]; para C. fulva se obtuvieron, inicialmente, 15 secuencias acotadas a 604 bp, provenientes de siete individuos de Tlanchinol y ocho de Lontla. Las secuencias de este marcador presentaban una región poli-A con una longitud de 14-19 bp para A. firma y de 18-19 bp para C. fulva; esta región microsatélitefue tomada en cuenta junto con el resto del espaciador para generar estimados de diversidad nucleotídica y construir las redes haplotípicas para ambas especies. 2 El análisis de detección de polimorfismos no se realizó para el marcador trnL-trnF debido a que la secuenciación no fue completa y solamente se obtuvieron secuencias para los extremos del espaciador. Esto se debe a que este espaciador intergénico contiene varias regiones microsatélite que impiden que la reacción de secuenciación continúe más allá de esta región (Korall et al. 2007; Janssen et al. 2008). Variación, diferenciación y estructuración genética Dado que el marcador atpB-rbcL fue polimórfico, se procedió con la secuenciación de todos los organismos para todas las localidades de colecta. El número de secuencias obtenidas fue menor al número de organismos colectados debido a amplificaciones y secuenciaciones defectuosas en varios casos. Sin embargo, se obtuvieron tamaños de muestra similares para todos los sitios de colecta en ambas especies; exceptuando algunas localidades con cinco o menos plantas colectadas. En total se obtuvieron 63 secuencias para Alsophila firma, 54 para Cyathea fulva y 3 para C. bicrenata con una longitud final de 615 bp para todas las especies. Diversidad nucleotídica Las especies de helechos analizadas (A. firma y C. fulva) mostraron índices de diversidad nucleotídica (π ) a nivel especie de 0.0009 ± 0.00018 y de 0.00097 ± 0.00024 (Tabla 3). Los niveles de diversidad nucleotídica observados en las distintas 3 poblaciones fue variable en ambas especies, sin que se hayan presentado poblaciones completamente monomórficas. Las poblaciones de A. firma tuvieron un mínimo de diversidad de 0.00046 (Lontla) y un máximo de 0.00101 (Tlanchinol); en poblaciones de C. fulva se obtuvieron valores mínimos de 0.00017 (Lontla) y máximos de 0.0015 (Helechales). Asimismo, se obtuvieron valores de θ−W (estimador de Watterson) de 0.00281 ± 0.00121 para A. firma y de 0.00328 ± 0.00138 para C. fulva. Las pruebas de neutralidad (Tajima) realizadas arrojaron valores de -1.77483 (0.10>P>0.05) y -1.94647 (P<0.05), respectivamente (Tabla 3). Diversidad haplotípica La diversidad haplotípica (Hd) dentro de las poblaciones en ambas especies fue variable (Tabla 3), sin que se hayan encontrado poblaciones monomórficas. Las poblaciones de A. firma mostraron un mínimo de diversidad haplotípica de 0.2807 (Lontla) y un máximo de 0.5385 (El Damo), con una diversidad global de 0.442 ± 0.069. En el caso de C. fulva la diversidad mínima fue de 0.10 (Lontla) y la máxima de 0.7091 (Helechales), con una diversidad global de 0.442 ± 0.079. Estos estimados de diversidad de haplotipos no consideran la variabilidad producto de la presencia de múltiples sitios indel debidos a diferencias de longitud en la región homopolímera (poli-A). Tomando en cuenta estas diferencias, la diversidad haplotípica en ambas especies se elevó considerablemente (Tabla 3), teniendo valores globales de 0.7435 y 0.7271 para A. firma y C. fulva, respectivamente. 4 Tabla 3. Valores de diversidad y diferenciación genética de poblaciones de dos especies de helechos arborescentes (Alsophila firma y Cyathea fulva) calculados a partir de datos de secuencias (615 bp) del espaciador intergénicos atpB-rbcL de cpDNA. n: número de secuencias; h: número de haplotipos; hi: número de haplotipos considerando indels; Hd: diversidad haplotípica ± desviación estándar; Hdi: diversidad haplotípica considerando indels; π : diversidad nucleotídica ± desviación estándar; θ−W : estimador de Waterson ± desviación estándar; D = estimado de la prueba de neutralidad de Tajima. Especie Localidad n h Hd hi Ηdi π θ−W D Alsophila firma Tlanchinol 16 5 0.45 7 0.75 0.00101 Lontla 19 2 0.2807 8 0.81287 0.00046 Tecajetes 12 3 0.31818 3 0.31818 0.00083 El Damo 13 2 0.53846 4 0.80769 0.00089 Helechales 1 1 - 1 - - Tlahuelompa 1 1 - 1 - - TOTAL 63 8 0.442 ± 0.069 16 0.7435 0.0009 ± 0.00018 0.00281 ± 0.00121 -1.77483 (0.10>P>0.05) Cyathea fulva Tlanchinol 15 4 0.37143 5 0.70476 0.0011 Lontla 20 2 0.10 3 0.57368 0.00017 Tecajetes - - - - - - El Damo 1 1 - 1 - - Helechales 11 4 0.70909 5 0.76364 0.0015 Tlahuelompa 5 2 0.60 3 0.80 0.00099 TOTAL 54 8 0.442 ± 0.079 13 0.7475 0.00097 ± 0.00024 0.00328 ± 0.00138 -1.94647 (P<0.05) 5 Diferenciación y estructuración genética Los análisis de diferenciación genética y flujo génico mostraron que las poblaciones de helechos de ambas especies se encuentran poco diferenciadas y tienen flujo génico considerable entre ellas. Los valores de estructuración genética GST fueron de 0.0623 para A. firma y 0.0955 para C. fulva, con niveles de flujo génico (Nm) de 7.53 y 4.74, respectivamente. Al tomar en cuenta la presencia de sitios indel, los estimados de estructuración genética fueron de 0.0543 para A. firma y 0.0748 para C. fulva, con índices de flujo génico de 9.26 y 6.18, respectivamente. Filogenia molecular La reconstrucción filogenética elaborada con el algoritmo Neighbor-Joining muestra una clara agrupación de haplotipos por especie (Figuras 7 y 8). En el caso de C. fulva, se puede observar la presencia de varios grupos conformados por secuencias de distintas localidades. Para esta especie es importante señalar que los grupos externos utilizados (i.e. C. caracasana, C. divergens y C. schiedeana) se ubican dentro del grupo principal de secuencias, mientras que las secuencias correspondientes a plantas colectadas de C. bicrenata se encuentran claramente separadas de estos últimos (Figura 7). En el caso de A. firma, también puede observarse la presencia de grupos compuestos de secuencias de distintas localidades. En este caso, las secuencias de los grupos externos utilizados (i.e. A. bryophila, A. cuspidata y A. tryoniana) quedan 6 Figura 7. Reconstrucción filogenética de Neighbor-Joining (NJ) para secuencias del espaciador intergénico atpB-rbcL de cpDNA en Cyathea fulva elaborada con el programa MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007); valores de bootstrap obtenidos a partir de 1,000 réplicas. 7 Figura 8. Reconstrucción filogenética de Neighbor-Joining (NJ) para secuencias del espaciador intergénico atpB-rbcL de cpDNA en Alsophila firma elaborada con el programa MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007); valores de bootstrap obtenidos a partir de 1,000 réplicas. 8 por fuera del grupo principal y la secuencia basal para la especie corresponde al organismo hondureño secuenciado por Korall et al. (2007) (Figura 8). Para C. fulva se identificaron cuatro grupos principales de secuencias en la reconstrucción filogenética; una secuencia de Tlanchinol queda en la base del grupo (grupo 1), seguido de un grupo compuesto de tres haplotipos (grupo 2). Se observa un grupo principal de secuencias (grupo 3), dentro del cual se ubican las correspondientes a los grupos externos utilizados (i.e. C. caracasana, C. divergens y C. shiedeana). A partir de este grupo se desprende un grupo conformado por una secuencia de Hidalgo y las correspondientes a Guerrero y Puebla (grupo 4). Para A. firma se identificaron cinco grupos principales de secuencias. La secuencia del organismo hondureño se encuentra en la base del árbol (grupo 1), seguido de una secuencia de la localidad de Tecajetes (grupo 2) y un grupo conformado por dos secuencias exclusivas a la localidad de Tlanchinol (grupo 3). A este grupo le sigue una secuencia única de Tecajetes y un grupo principal conformado por secuencias de todas las localidades de colecta (grupo 4). Por último, se observa un grupo terminal compuesto por secuencias exclusivas a las poblaciones hidalguenses (grupo 5). Asociación entre distancia genética y distancia geográfica A partir del cálculo de distancias genéticas (número de
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