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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA VARIANTES ALÉLICAS EN LOS GENES NFE2L2 Y NQO1 EN POBLACIÓN MESTIZA Y AMERINDIA MEXICANA TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICA FARMACÉUTICO BIÓLOGA PRESENTA JULIETA LARROSA CALDERÓN DIRECTOR DE TESIS DRA. ANGÉLICA G. MARTÍNEZ HERNÁNDEZ Ciudad Universitaria, Cd. Mx., 2016 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE: Profesor: Francisco Javier Plasencia de la Parra VOCAL: Profesor: María Benita Leonor Fernández Salgado SECRETARIO: Profesor: Angélica Graciela Martínez Hernández 1er. SUPLENTE: Profesor: Perla Deyanira Maldonado Jiménez 2° SUPLENTE: Profesor: Alfonso Rafael Salgado Aguayo SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: LABORATORIO DE INMUNOGENÓMICA Y ENFERMEDADES METABÓLICAS, INSTITUTO NACIONAL DE MEDICINA GENÓMICA ASESOR DEL TEMA: DRA. ANGÉLICA GRACIELA MARTÍNEZ HERNÁNDEZ SUSTENTANTE: JULIETA LARROSA CALDERÓN ÍNDICE 1.- RESUMEN………………………………………………………………………………………1 2.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA...………………..………………….…………….…..2 3.-ANTECEDENTES (MARCO TEÓRICO) 3.1.- Estrés oxidativo……………………………………………………………………….……...3 3.2.- Nrf2-Keap1…………………………………………………………………………...............6 3.3.- Modelos murinos para el estudio de NFE2L2 y NQO1....……………….……………..12 3.4.- Polimorfismos…………………………………………………………..……………….…..14 3.5.- Polimorfismos en NFE2L2……………………………………………..…………….…….15 3.6.- Polimorfismos en NQO1……………………………………………..…………….…...….16 3.7.- Genética de la población mexicana………………………………..………………...…..17 3.8.- Genética de poblaciones……………………………………………..……………………20 4.- HIPÓTESIS Y OBJETIVOS...………………………………………………………………..22 5.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 5.1.- Población en estudio………………………………………………………...……………..23 5.2.- Extracción de ADN……………………………..............................................................23 5.3.- Genotipación….………………………………………………………………….………….24 5.4.- Secuenciación………………………………………………………………….…………...26 5.5.- Análisis estadístico………………………………………………...…..............................28 6.- RESULTADOS………………………………………………………………………..……….29 7.- DISCUSIÓN……………………………………………………….…..……………….……...52 8.-CONCLUSIONES……………………………………………..………...…………………….60 9.- BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………….….61 10.- APENDICE……….…………………………………………………………………….…....70 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1.- Enzimas codificadas por los genes blanco de Nrf2 con funciones antioxidantes…………………………………………………..………………………..…………10 Tabla 2.- Familias y grupos lingüísticos de México………..………..…………………………20 Tabla 3.- Características de la población en estudio………………………………….………31 Tabla 4.- Familias lingüísticas y etnias incluidas en el estudio……………………….………32 Tabla 5.- Frecuencias alélicas y genotípicas de las variantes NQO1 609C>T, NFE2L2 ⁻617C>A y ⁻653A>G, y prueba de equilibrio de Hardy-Weinberg (P) en Mestizos y Amerindios mexicanos...…………………………………………………………………….…...34 Tabla 6.- Equilibrio de Hardy Weinberg (P) para los SNPs NQO1 609C>T y NFE2L2 ⁻653A>G y ⁻617C>A en 26 etnias……………………………………..……...………………....35 Tabla 7.- Frecuencias genotípicas (%) de la población amerindia por etnia………..………………………………………………………………………….……………37 Tabla 8.- Frecuencias genotípicas y alélicas de NQO1 609C>T en otras poblaciones………………………………………………………………………….………….…42 Tabla 9.- Frecuencias genotípicas y alélicas de los SNPs ⁻653A>G y ⁻617C>A en el gen NFE2L2 en distintas poblaciones………………………………………………………….……43 Tabla 10.- Prueba de desequilibrio de ligamiento de los SNPs ⁻653A>G y ⁻617C>A en NFE2L2 en población Mestiza y Amerindia………………………………………..….…….…44 Tabla 11.- Heterocigosidad esperada (He) y observada (Ho) en 26 grupos indígenas para los SNPs NQO1 609C>T y NFE2L2 ⁻653A>G y ⁻617C>A.………………………………..…47 Tabla 12.- Índices de endogamia en etnias con valores >0.15…………………..…………..48 ÍNDICE FIGURAS Figura 1.- Generación de ROS…………………………………………………….…...……...…4 Figura 2.- Estructura del gen NFE2L2………………………………………………...……..…..6 Figura 3.- Dominios estructurales de Nrf2 y Keap1…………………………………………….7 Figura 4.- Modelo cerrojo-bisagra de la regulación de Nrf2 por Keap1……….…………..…9 Figura 5.- Estructura del gen NQO1……………………...…………………………………….11 Figura 6.- Ciclo catalítico de NQO1…………………………..………………………………...12 Figura 7.- Distribución geográfica de las Familias lingüísticas de México……………….…19 Figura 8.- Oligonucleótidos utilizados para amplificar la región del SNP 609C>T en NQO1…………………………………………………………..…………………………………..27 Figura 9.- Oligonucleótidos utilizados para amplificar la región de los SNPs ⁻653A>G y ⁻617C>A en NFE2L2……………………………………………………………………………..27 Figura 10.- Discriminación alélica del SNP -617C>A en NFE2L2……….…….……………29 Figura 11.- Amplificación de los fragmentos de a) NQO1 y b) NFE2L2………………...….30 Figura 12.- Electroferograma del fragmento 609C>T en NQO1…………...……………..…30 Figura 13.- Electroferograma del fragmento de NFE2L2 donde se encuentran los SNPs -653A>G y 617C>A………………………...………………………………………………….....31 Figura 14.- Distribución alélica de NQO1 609C>T en población Amerindia…………….…38 Figura 15.- Distribución alélica de NFE2L2 -653A>G en población Amerindia…...……….39 Figura 16.- Distribución alélica de NFE2L2 -617C>A en población Amerindia…….……...40 Figura 17.- Índices de fijación para NQO1 609C>T por pares de etnias…………………..49 Figura 18.- Índices de fijación para NFE2L2 -653A>G por pares de etnias…………….….50 Figura 19.- Índices de fijación para NFE2L2 -617C>A por pares de etnias…………….….51 1 1.- RESUMEN Introducción. NFE2L2 y NQO1 son genes involucrados en la defensa celular contra moléculas oxidantes como las especies reactivas de oxígeno, por lo que constituyen una vía importante para mantener la homeostasis redox en el organismo. NFE2L2 codifica para el factor de transcripción Nrf2, que promueve la expresión de más de 200 genes de respuesta a estrés oxidativo y detoxificación, entre los que se encuentra NQO1. NQO1, codifica para una enzima reductasa que cataliza la conversión de quinonas en hidroquinonas, las cuales son metabolizadas y excretadas del organismo. Diversos estudios han mostrado que en la región promotora del gen NFE2L2 existen dos polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), ⁻653A>G y ⁻617C>A que reducen la transcripción del gen y, en NQO1, el SNP no sinónimo 609C>T, reduce la actividad de la proteína. Estas 3 variantes se han asociado con un incremento de riesgo a desarrollar enfermedades crónico-degenerativas relacionadas con el estrés oxidativo como cáncer pulmonar y diabetes, por lo que el objetivo de este trabajo fue conocer las frecuencias de los 3 SNPs en población Mestiza y Amerindia de México. Metodología. Se incluyeron un total de 2337 individuos: 471 mestizos (MEZ) y 1866 amerindios (AM). Se genotiparon por discriminación alélica con sondas TaqMan® los SNPs 609C>T en NQO1 y ⁻ 653A>G y ⁻ 617C>A en NFE2L2. Se obtuvieron las frecuencias alélicas y genotípicas y se analizó el equilibrio de Hardy-Weinberg. Los haplotipos de NFE2L2 fueron analizados con los programasPlink® y Haploview®. Como medidas de diversidad genética en la población AM se calcularon la heterocigosidad, el índice de endogamia (FIS) y el índice de fijación (FST) con el programa GenePop®. Resultados y discusión. El alelo ancestral C del SNP 609TC>T (NQO1) mostró una frecuencia del 54% y el de riesgo T de 46% en MEZ, en contraste, en AM la frecuencia del alelo C fue de 48% y del T de 52%. Para NFE2L2 ⁻653AG en MEZ y AM las frecuencias alélicas fueron de 40% y 30% para el alelo A y de 60% y 70% para el alelo G respectivamente. El SNP ⁻617, mostró una frecuencia en MEZ de 77% para el alelo C y de 23% para el alelo A. En AM las frecuencias fueron de 74% (C) y 26% (A). Únicamente se observaron diferencias significativas en las frecuencias genotípicas de NQO1 609C>T y NFE2L2 ⁻653A>G entre MEZ y AM, posiblemente por las diferencias de la estructura genética entre estas poblaciones. Al comparar las frecuencias alélicas de MEZ y AM con otras poblaciones se encontró que los MEZ muestran similitudes con asiáticos, mientras que los AM tuvieron las frecuencias más altas de los alelos T (609C>T) y G (⁻653A>G) en comparación con africanos, asiáticos y europeos. El análisis por etnia mostró una gran heterogeneidad genética, ya que en NQO1 se observó un intervalo del 35% al 61% en la frecuencia del alelo de riesgo (T), mientras que en los SNPs de NFE2L2 los mocho (9% y 12%) presentaron la menor frecuencia. Los mayo y los Nahua de San Luis Potosí mostraron la mayor para ⁻653AG y ⁻617CA (50% y 40%, respectivamente. Los valores de FIS en las etnias chuj, jacalteco, mayo y totonaco sugieren endogamia. De la misma manera, los valores de FST indican que las etnias chuj, kaqchiquel, mayo, mocho y totonaco son las más diferentes. Estas diferencias se pueden atribuir a que son poblaciones pequeñas y con reducido flujo génico. Conclusión. Las frecuencias de las variantes 609C>T en NQO1 y NFE2L2 ⁻653A>G fueron diferentes entre mestizos y amerindios, lo cual posiblemente se deba a su distinta composición genética. En la variante ⁻617C>A las frecuencias entre ambas poblaciones fueron similares. Existe una gran diversidad alélica y genotípica entre las variantes analizadas en las 26 poblaciones indígenas del estudio. Este trabajo sienta las bases para realizar un estudio de asociación entre estas variantes y enfermedades crónico-degenerativas, como la diabetes mellitus 2 que tiene una alta prevalencia en la población mexicana. 2 2.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA En condiciones fisiológicas existe un equilibrio en las células entre especies oxidantes y antioxidantes. Las especies oxidantes, entre las que se encuentran aquellas derivadas del oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) se generan de forma endógena y exógena. Cuando existe un desequilibrio que favorece la acumulación de ROS se genera un ambiente oxidante que puede causar disfunción y/o muerte celular como resultado de la alteración del metabolismo, de la estructura de la membrana lipídica y de las proteínas. Debido a esto, los sistemas antioxidantes de las células son fundamentales para mantener la homeostasis redox y evitar el potencial daño de las ROS. Una de los sistemas antioxidantes más importantes es la vía Nrf2-Keap1. Nrf2 es un factor de transcripción que, en condiciones oxidantes, promueve la transcripción de más de 200 genes involucrados con la defensa antioxidante (entre los que se encuentra NQO1), mientras que en condiciones basales es reprimido por la proteína Keap1. En México existen pocos estudios que determinen las frecuencias alélicas y genotípicas de polimorfismos en genes antioxidantes en población mexicana a pesar de que, diversos estudios muestran que la presencia de variantes o polimorfismos en genes de la vía Nrf2-Keap1 afectan su actividad antioxidante y desintoxicante. Un ejemplo, son los SNPs ⁻617C>A y ⁻653A>G ubicados en la región promotora del gen codificante para Nrf2 (NFE2L2), que son capaces de reducir la actividad transcripcional del gen, mientras que la variante 609C>T en el gen NQO1 produce que la proteína codificada tenga actividad reducida. Adicionalmente, se ha mostrado que estas variantes se asocian con un riesgo para el desarrollo de enfermedades crónico-degenerativas. Dado lo anterior, es importante conocer la distribución de las frecuencias alélicas y genotípicas de estas variantes en genes citoprotectores como NFE2L2 y NQO1 para profundizar en el conocimiento genómico de las poblaciones mexicanas y sentar las bases para futuros estudios de asociación. 3 3.- ANTECEDENTES (MARCO TEÓRICO) 3.1- Estrés oxidativo El término estrés oxidativo (EO) denota un estado de desequilibrio celular provocado por una excesiva formación y/o insuficiente remoción de moléculas oxidantes 1. La oxidación es un proceso químico en el que una especie cede a otra uno o más electrones. A las reacciones que involucran la transferencia de electrones se les denomina de óxido-reducción o redox, ya que para que se lleven a cabo debe haber una especie que se oxide (pierda electrones) y otra que se reduzca (gane electrones) 2. El EO en las células se produce principalmente por especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés), nitrógeno y azufre. Dichas especies pueden ser radicales libres (es decir, tienen un electrón desapareado en el último orbital, lo cual les confiere inestabilidad física y alta reactividad) como el anión superóxido (O·2-), el radical hidroxilo (·OH), el dióxido de nitrógeno (·NO2-), el radical sulfinil (RSO·) y el anión radical disulfuro (RSSR-) o moléculas sin radicales libres como el peróxido de hidrógeno (H2O2), el peroxinitrito (ONOO-) y el óxido nitroso (HNO2) 3. La generación de las ROS puede ser endógena y/o exógena. La producción endógena ocurre principalmente en mitocondrias durante la respiración celular 4, 5 y por la acción de diversas enzimas como la xantin oxidasa, la ciclooxigenasa, la citocromo c oxidasa, la mieloperoxidasa y la óxido nítrico sintetasa endotelial (Figura 1). Dentro de las fuentes exógenas se encuentran el tabaquismo, la radiación (UV, rayos x y rayos γ), contaminantes atmosféricos y diversas sustancias químicas 6. Las ROS son necesarias para el correcto funcionamiento del organismo ya que, actúan como moléculas de señalización que promueven la proliferación y la supervivencia celular. Además, en la respuesta inmune funcionan como mediadores de inflamación y contribuyen al ataque a patógenos por parte de macrófagos y neutrófilos 6. 4 Figura 1.- Generación de ROS. El superóxido (O·2-) se genera a partir de oxígeno molecular (O2) durante la respiración celular en mitocondrias o por acción de la enzima NADPH oxidasa. La superóxido dismutasa (SOD) cataliza la descomposición del superóxido en peróxido de hidrógeno (H2O2), el cual puede ser transformado en radical hidroxilo (·OH) y anión hidroxilo (OH-) mediante la reacción de Fenton. (Figura tomada de Kim GH et al., 2015). La capacidad oxidante de las ROS les permite captar electrones de moléculas circundantes tales como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, lo cual produce serias alteraciones tanto en la estructura como en la función de estas macromoléculas 2. De esta forma, alteraciones en la homeostasis redox generan un estado de EO en las células que puede incrementar el riesgo para desarrollar diversas patologías como el cáncer, la diabetes tipo 2 y enfermedades neurodegenerativas 7. Los ácidos grasos no saturados son uno de los principales blancos de moléculas oxidantes como el superóxido, que inicia reacciones en cadena de peroxidación, cuyo rol está bien establecido en diversas patologías 8. La peroxidación de lipoproteínas de baja densidad contribuye a su transformación en partículas aterogénicas responsables de la placa ateroesclerótica 3. La ateroesclerosis consiste en placas localizadas o ateromas que sobresalen hacia laluz de las arterias reduciendo el flujo sanguíneo. Además, los ateromas son sitios proclives para la formación de trombos (coágulos de sangre) que pueden ocluir el aporte sanguíneo hacia algún órgano. Las ROS también son capaces de alterar la función endotelial al disminuir la producción de óxido nítrico (un potente vasodilatador) lo cual, junto 5 con otros factores como la placa ateroesclerótica, puede contribuir al desarrollo de hipertensión y complicaciones vasculares 9. En las proteínas existen aminoácidos sensibles a oxidación como el triptófano, la tirosina, la histidina y la cisteína 10. Las modificaciones oxidativas en las proteínas pueden resultar en cambios funcionales, fragmentación química o mayor susceptibilidad a ataque proteolítico 11. Por ejemplo, en la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) el EO contribuye a la patología al producir la fosforilación de serinas en los receptores de insulina de las células beta, generando resistencia a la insulina 12. El ácido desoxirribonucleico (ADN) también es susceptible a daño por oxidación 8. Las ROS pueden generar oxidación de las bases nitrogenadas, depurinación y rompimiento de las hebras de ADN. La principal molécula responsable de la oxidación de bases es el hidroxilo, que es capaz de generar más de veinte modificaciones en las mismas. Las más comunes son la transformación de guanina en 8-oxoguanina y 2,6-diamino-4-hidroxi-5-formamidopirimidina, la de adenina en 8-hidroxiadenina, 2-hidroxiadenina y 4-6-diamino-5-formamidopirimidina, la de citosina en 5-hidroxicitosina, 5-hidroxiuracilo y 5,6-dihidroxiuracilo, y la de timina en timina glicol, 5-hidroximetiluracilo y 5-hidroximetilhidantoína 13. El daño ocasionado por el EO en las membranas celulares, el ADN y el funcionamiento mitocondrial son factores que aceleran el proceso de envejecimiento, además de incrementar el riesgo de desarrollar enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y Parkinson 1. Para evitar el daño asociado con la presencia de altos niveles de ROS, la célula ha desarrollado diversos mecanismos de defensa. Estos mecanismos pueden ser enzimáticos (por ejemplo, superóxido dismutasa, catalasa, glutatión peroxidasa, glutatión S-transferasa, hemooxigenasa 1, NADPH quinona óxido reductasa 1, glutamato cistein ligasa, entre otras) y no enzimáticos (glutatión, vitaminas, carotenoides y flavonoides, entre otros) 14. Las moléculas que actúan como sensores para detectar tempranamente un ambiente oxidante, activan rutas que convergen en la regulación de factores de transcripción como AP-1, Nrf2, NF-κB y 6 HSF1 los cuales inducen la expresión de diversos genes incluidos aquellos de acción antioxidante 15. Estos sistemas antioxidantes (enzimáticos y no enzimáticos) son necesarios para la supervivencia celular, ya que mantienen la homeostasis redox minimizando el daño que pueden producir las ROS 8. 3.2.- Nrf2-Keap 1 La vía de señalización Nrf2-Keap 1 (del inglés, nuclear factor erythtrhoid 2-related factor y Kelch-like ECH-associated protein 1) es uno de los sistemas de defensa celular más importantes para combatir tanto el EO, como diversas sustancias tóxicas, entre las que se encuentran: fenoles, quinonas, tiocarbamatos, metales pesados, polienos y peróxidos 16. En condiciones basales, Keap 1 inhibe a Nrf2 al retenerlo en el citoplasma y marcarlo para su degradación vía proteosoma. Ante situaciones de estrés oxidativo o químico, Keap 1 cambia de conformación, lo cual interrumpe su interacción con Nrf2, el cual se estabiliza y se acumula en el citoplasma. Esto permite su translocación al núcleo dónde activa la transcripción de sus genes blanco, mediante su unión a elementos de respuesta antioxidante situados en la región promotora de los mismos 15, 16. Figura 2. Estructura del gen NFE2L2. Cuenta con 5 exones (E1-E5) y 4 intrones (I1-I4), se muestran los SNPs ⁻653A>G y ⁻617C>A en la región promotora. El gen que codifica a Nrf2, NFE2L2 se encuentra en el cromosoma 2q31.2, tiene un tamaño de 34.8 kb (Figura 2). La proteína Nrf2 es un factor de transcripción básico tipo “zipper” de leucina perteneciente a la familia Cap´n Collar de proteínas reguladoras, que también incluye a las proteínas Nrf1, Nrf3, Bach1 y Bach2 17. Nrf2 consta de 605 aminoácidos organizados en 6 dominios funcionales Neh 1-6 (Figura 3-A). La interacción con Keap 1 sucede a través del dominio Neh2, específicamente 7 con los motivos DLG (baja afinidad) y ETGE (alta afinidad). Entre estos dos motivos se encuentra una región hidrofílica con 7 residuos de lisina (representada como 7K en la figura 3-A) que son blanco de ubiquitinación e indispensables para la regulación de Nrf2 mediada por degradación. Los dominios Neh4 y Neh5 actúan sinérgicamente entre ellos para permitir la unión del co-activador transcripcional CBP (del inglés, CREB binding protein). En la región C-terminal se encuentra el dominio Neh3 que, al igual que Neh4 y Neh5, facilita el reclutamiento de co- activadores transcripcionales como la proteína CHD6 (del inglés, Chromo- ATPase/Helicase DNA binding protein 6). El dominio Neh1 constituye el dominio básico de reconocimiento y unión a ADN, así como de heterodimerización con las proteínas small Maf (del inglés, muscle aponeurotic fibrosarcoma) mediante la región de “zipper” de leucina. Neh6 funciona como un degrón (es decir, indica el lugar de inicio de la degradación) independiente de Keap1 e interactúa con la proteína β-Trcp (del inglés, β-transducin repeats-containing protein) 12, 16, 18-22. Figura 3. Dominios estructurales de Nrf2 y Keap 1. (A) Nrf2 cuenta con 605 aminoácidos que conforman 6 dominios estructurales: Neh1-Neh6. Neh2 de unión a Keap 1, Neh4 y 5 de unión a CBP, Neh6 de unión a TrCP, Neh1 de unión a ADN e interacción con las proteínas small Maf y Neh3 de unión a CHD6. (B) Keap 1 consta de 624 aminoácidos divididos en 5 dominios; los dominios terminales NTR y CTR, el dominio BTB necesario para su dimerización y unión a Cul3 junto con la región adyacente del dominio IVR y, finalmente, el dominio DGR de unión a Nrf2. (Figura tomada de Bhakkiyalakshmi E. et al., 2015). 8 Por otro lado, Keap 1 es una proteína rica en residuos de cisteína constituida por 624 aminoácidos organizados en 5 dominios (Figura 3-B). El dominio DGR (del inglés, double glycine repeat) consiste en 6 repeticiones tipo Kelch que forman una estructura de hélice enrollada. Este dominio, junto con la región carboxilo terminal (CTR; del inglés, carboxyl-terminal region) interactúa con el dominio Neh2 de Nrf2. Los otros 3 dominios son el NTR (del inglés, amino terminal region) cuya función se desconoce, el IVR (del inglés, Intervening region) y el BTB (del inglés, Broad complex, Tramtrack and Bric-a-brac). El BTB aunado a una sección de IVR permite la dimerización de Keap1 y la unión a la proteína Cullin 3 (Cul3). La reactividad hacia las ROS de los residuos de cisteína en Keap 1 está dada por la presencia de aminoácidos adyacentes cargados positivamente, cuya carga disminuye el pKa del tiol de la cisteína vecina estabilizando al anión tiolato y, manteniendo por tanto, a las cisteínas en estado reactivo. Los residuos de cisteína localizados en las posiciones 273 y 288 son necesarios para suprimir la activación de Nrf2 en condiciones basales, ya que si no están presentes se reduce su poli-ubiquitinación 23, 24. Adicionalmente, el residuo de cisteína ubicado en la posición 151 en el dominio BTB es importante en la interacción Keap1-Cul3-Rbx1 25. En el citoplasma, Nrf2 es reprimido por un homodímero de Keap 1 que actúa como proteína adaptadora para el complejo Cul3-Rbx1 (del inglés, E3 ubiquitin ligase Cullin3-RING box1). Dicho complejo produce la ubiquitinación de Nrf2 que conduce a su degradación en el proteosoma 26S. El modelo propuesto para explicar la regulación de Nrf2 por Keap 1 se ha denominadocerrojo-bisagra. En ausencia de EO, un homodímero de Keap 1 se une a una molécula de Nrf2 mediante los sitios de unión ETGE y DLG, localizados en el dominio Neh2 de Nrf2. La afinidad de Keap 1 por cada uno de estos sitios, difiere en al menos dos órdenes de magnitud. Dada esta condición, la unión de Keap 1 con el dominio DLG funciona como el cerrojo, ya que genera una conformación que facilita la ubiquitinación por parte del complejo Cul3-Rbx1 de los residuos de lisina en Nrf2 que resulta en su degradación (Figura 4-A). En presencia de EO se producen modificaciones en los residuos de cisteína de Keap 1, lo que desestabiliza la interacción de Keap 1 con el dominio DLG pero 9 no con el dominio ETGE, el cual funciona como una bisagra al permitir un cambio conformacional en el complejo Nrf2-Keap 1. Este cambio conformacional impide la ubiquitinación de Nrf2 y por lo tanto su degradación (Figura 4-B) 26. Figura 4. Modelo cerrojo-bisagra de la regulación de Nrf2 por Keap 1. (A) en condiciones basales el homodímero de Keap 1 interacciona con Nrf2 a través de sus dominios DLG (cerrojo) y ETGE (bisagra). Esta unión permite la ubiquitinación de los residuos de lisina entre estos dos dominios y la degradación de Nrf2. (B) en condiciones de EO se produce un cambio conformacional en Keap 1 que rompe la interacción con el dominio DLG de Nrf2, pero no con el dominio ETGE. El cambio estructural produce que Nrf2 no pueda ser ubiquitinado, y por consiguiente no se degrade, por lo que se estabiliza y acumula en el citoplasma, para después ser traslocado al núcleo, donde forma un heterodímero con una proteína small Maf. El complejo Nrf2-small Maf se une a la región conocida como elemento de respuesta antioxidante (ARE, por sus siglas en inglés) y promueve la transcripción de sus genes blanco. (Figura tomada de Suzuki et al., 2013). La estabilización proteica de Nrf2 causa su translocación y acumulación nuclear, dónde forma un heterodímero con una de las 3 proteínas small Maf (MafF, MafG y MafK). La secuencia del ADN a la cual se une el heterodímero Nrf2-Maf en el promotor de sus genes blanco se conoce como elemento de respuesta oxidante o de respuesta electrófila (por sus siglas en inglés, ARE/EpRE). La secuencia consenso de ARE es 5ʹ- A/GTGAC/GNNNGCA/G-3ʹ, donde “N” se refiere a la presencia de cualquier nucleótido 27. La unión de Nrf2-Maf a los sitios ARE promueve la transcripción del gen por la RNA polimerasa II 28. A la fecha se han reportado más de 200 genes blanco de Nrf2, dentro de los cuales se pueden encontrar enzimas con diferentes funciones celulares como: 10 detoxificantes, antioxidantes, relacionadas con la síntesis del glutatión y moléculas de multi-resistencia a drogas 29-31 (Tabla 1). Recientemente se ha descrito la capacidad de Nrf2 para regular genes involucrados en proliferación celular y diversos procesos metabólicos. Es importante señalar la existencia de una secuencia ARE en el promotor de Nrf2, por lo que se ha propuesto que esta proteína es capaz de activar su propia transcripción generando una retroalimentación positiva 32. Tabla 1. Enzimas codificadas por los genes blanco de Nrf2 con funciones antioxidantes. Enzima Función NADPH quinona oxido reductasa 1 (NQO1) Detoxificación de quinonas, mantiene reducida a la vitamina Hemooxigenasa 1 (HMOX-1), cadena ligera (FTL) y cadena pesada (FTH) de la ferritina Metabolismo del Hierro (evita la reacción de Fenton que produce peróxido de hidrógeno). Subunidades reguladora (GCLM) y catalítica (GCLC) de la glutamato cisteín ligasa, glutatión reductasa(GSR) y transportador cistina/glutamato(XCT) Síntesis y regeneración del glutatión Glutatión S-transferasas (GSTA1-GSTA3, GSTA5, GSTM1-GSTM3 y GSTP1) y glutatión peroxidasa 2 (GPX2) Utilización del glutatión Superóxido dismutasa (SOD) Cataliza la conversión de superóxido en oxígeno y peróxido de hidrógeno. Tiorredoxina (TXN), tiorredoxina reductasa 1 (TXNRD1) y peroxirredoxina 1 (PRDX1) Producción, regeneración y utilización de tiorredoxina. Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (G6PD), isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1) y enzima málica 1 (ME1) Producción de NADPH (regeneración de glutatión y tiorredoxina) Uno de los genes blanco más estudiados de Nrf2 es NQO1 (NADPH quinona oxidorreductasa 1), cuya proteína pertenece a la familia de flavoproteínas con función reductora. La familia cuenta con 2 miembros en mamíferos: NQO1 que utiliza NADPH (del inglés, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) como 11 donador de electrones y NQO2 que utiliza NRH (del inglés, dihydronicotinamide riboside), ambos son regulados por Nrf2 33. Figura 5. Estructura del gen NQO1. Cuenta con 6 exones (E1-E6) y 5 intrones (I1-I5), se muestra el SNP 609C>T. El gen NQO1 se localiza en el cromosoma 16q22.1, consta de 6 exones y 5 intrones, y abarca 17.2 kb (Figura 5). La proteína NQO1 es una enzima citosólica de fase II que tiene una masa molecular de 31 kDa. NQO1 cataliza la conversión de quinonas en hidroquinonas mediante una reducción de 2 electrones utilizando como donador de los mismos NADPH o NADH. Posteriormente, las hidroquinonas resultantes son metabolizadas mediante reacciones de conjugación, como la glucoronidación para ser finalmente excretadas del cuerpo. La acción de NQO1 previene la reducción de 1 electrón de las quinonas llevada a cabo por otras enzimas como la citocromo reductasa P450 que lleva a la formación de semi-quinonas radicales. A su vez, las semi-quinonas pueden reaccionar con oxígeno formando radicales libres, por lo que la acción de NQO1 protege a las células del EO. (Figura 6). Los sustratos de NQO1 pueden ser de fuente endógena como la vitamina E y la ubiquinona o exógena como algunos derivados de la dieta, colorantes, humo de cigarro y contaminación 34. Adicionalmente, NQO1 mantiene a los antioxidantes endógenos ubiquinona y vitamina E en sus formas activas (reducidas), impide directamente la acción del superóxido y protege contra bencenos pro-carcinogénicos 34. Otra función de NQO1 es el proteger de la degradación proteosomal a las proteínas supresoras de tumor p53 y p73. A través de esta función, NQO1 podría estar desempeñando un papel importante en la protección celular contra el desarrollo tumoral 35. 12 Figura 6. Ciclo catalítico de NQO1. La proteína NQO1 reduce quinonas a hidroquinonas utilizando NAD(P)H como donador de electrones. Esta reacción evita que se formen radicales semi-quinonas mediante el ciclo redox, así como su posterior reacción con oxígeno, que resulta en la formación de moléculas oxidantes (peróxido de hidrógeno y peroxinitrito). (Figura tomada de Hong Zhu et al., 2012). 3.3.- Modelos murinos para el estudio de Nrf2 y NQO1 Diversos estudios en modelos animales y celulares muestran la importancia de Nrf2 y NQO1 en la defensa celular contra el EO. La deleción germinal (knock out) del gen codificante para Nrf2 en ratones (nfe2l2-/-) produce una disminución en la expresión de enzimas antioxidantes y en la concentración de glutatión intracelular 36 así como una disminución en la respuesta celular contra el EO 37. Se ha observado que los ratones nfe2l2-/- son más sensibles a la hepatotoxicidad inducida por acetaminofén 38, arsénico 39 y 1-bromopropano 40, y que presentan un daño significativamente mayor en el ADN comparados con los silvestres cuando son expuestos a agentes genotóxicos, como las nano partículas de titanio 31. La inducción farmacológica de nrf2 en ratones es capaz de proteger contra hepatotoxicidad inducida por cadmio 41 y etanol 42. En un modelo murino con diabetes inducida por estreptozotocina se encontró que los ratones KO para nrf2 tienen mayores niveles de glucosa, triglicéridos y ácidos grasos en sangre que los silvestres 43. Considerando que los ratones nfe2l2-/- muestran una mayor sensibilidad al daño mediadopor ROS en células beta comparados con los animales normales, la ruta Nrf2-Keap1 parece ser crucial para la defensa de las células beta 13 pancreáticas 44. De forma similar, en un modelo murino para síndrome de Parkinson con neurotoxicidad inducida por 6-hidroxidopamina se encontró que la activación de Nrf2 protege contra neurotoxicidad y daño oxidativo 45. Un estudio con exposición al humo de cigarro evidenció que, tras 8 semanas de exposición, los ratones nulos para nrf2 presentan enfisema pulmonar el cual se exacerba a las 16 semanas, mientras que los ratones silvestres no muestran anormalidades patológicas durante el mismo tiempo de exposición 46. Con relación a NQO1, diversos estudios han evidenciado que los ratones nulos para nqo1 muestran una mayor sensibilidad a la toxicidad de la menadionina (2-metil- 1,4-naftoquinona) comparados con los ratones normales 47. También se ha observado que los ratones nqo1-/- tratados con estreptozotocina muestran un decremento significativo de insulina en plasma y un incremento en la apoptosis de las células beta comparados con los ratones silvestres, lo cual puede ser indicativo de la relación de esta vía con la DM2 48 y el papel de protección de nqo1 en las células beta. Por otro lado, ratones doble knock out (DKO) para nqo1-/- y nqo2-/- expuestos a benzopireno y dimetil-antraceno (contaminantes atmosféricos que inducen tumores en piel) desarrollan un mayor número de tumores que los ratones silvestres y presentan un retraso en la activación de las proteínas supresoras de tumor p53, p63 y p19 en respuesta a la presencia de los carcinógenos, lo que indica una mayor sensibilidad en los ratones DKO a desarrollar tumores inducidos por benzopireno 49. Finalmente, el uso de un inductor farmacológico de nqo1 (β-Lapachone) permitió identificar su efecto protector contra el daño renal por isquemia y daño nefrótico inducido por el anticancerígeno cis-platino. Al administrar cis-platino a los ratones, estos mostraron daño tubular y aumento de EO, mientras que si se administraba β- Lapachone antes del cis-platino, se observaba una mejora significativa de la disfunción renal y una disminución del daño tubular, el EO y la apoptosis 50, 51. 14 3.4.- Polimorfismos Las variantes génicas consisten en cambios en la secuencia del ADN y son denominadas polimorfismos cuando tienen una frecuencia mayor al 1% en la población 52. Las variantes cuya frecuencia se encuentra entre el 0.1% y 1.0 % se consideran de baja frecuencia y aquellas con una frecuencia menor a 0.1% son raras 53. Los polimorfismos pueden contribuir al riesgo a desarrollar enfermedades multifactoriales pero habitualmente no tienen efectos fenotípicos indeseables, mientras que las mutaciones tienen una frecuencia menor al 1% y suelen tener efectos contrarios a la salud, como las más de 80 mutaciones causales de fibrosis quística que se han identificado en el gen CFTR 54. Los polimorfismos se pueden clasificar con base en su contenido de nucleótidos en: polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs, por sus siglas en inglés), inserciones y deleciones (indels) que pueden ser pequeñas (1-2 pb) o grandes (>8 kb), microsatélites (de 2-5 pb), minisatélites (6-30 pb) y variantes de número de copias (de 1 kb hasta más de 50 kb). Los polimorfismos más comunes son los SNPs de los cuales se estima existen al menos 11 millones en el genoma humano, es decir, 1 cada 100-300 pb 55, 56. La variabilidad genética inter-individual se debe principalmente a la presencia de los SNPs. Estos polimorfismos se localizan en regiones tanto intergénicas, como intragénicas y cuando son capaces de producir un cambio en la función biológica se denominan SNPs funcionales. El efecto de un SNP depende de la región donde se localice; los SNPs que ocurren en regiones codificantes (exones) se clasifican en sinónimos (no producen un cambio de aminoácido) y no sinónimos (producen un cambio de aminoácido en la proteína) 57. A pesar de no producir un cambio en la secuencia de la proteína, algunos SNPs sinónimos pueden tener un papel funcional, ya que pueden afectar la cinética de la traducción de la proteína y con esto su estructura 58. Si un SNP se localiza en regiones promotoras puede modificar, destruir o crear sitios de unión y reconocimiento para factores de transcripción, alterando los niveles de expresión génica y llevando a una sobre o subexpresión de los mismos. Esto debido a que la expresión génica depende de la interacción de 15 factores y co-factores de transcripción con elementos reguladores encontrados en las regiones promotoras de los genes. SNPs en la región 5’ del ARN mensajero (ARNm) pueden afectar su estabilidad y traducción, mientras que los SNPs que suceden en sitios involucrados en la maduración de ARNm pueden modificar, crear o destruir estas secuencias consenso alterando los procesos de corte y empalme, lo cual puede resultar en proteínas no funcionales por inclusión o exclusión de exones y/o retención de intrones 59. Por otro lado, los SNPs que suceden dentro de miRNAS o en la región 3’-UTR del ARNm pueden afectar la complementariedad entre ambos produciendo un cambio en la expresión génica 60. La capacidad que presentan las variantes génicas para alterar la función proteica, conlleva que pueden causar o contribuir al desarrollo de una enfermedad. Los estudios de asociación se realizan con la finalidad de identificar variantes génicas involucradas con el riesgo a desarrollar enfermedades. En dichos estudios, que usualmente tienen un diseño de caso-control pero también los hay basados en familias, se comparan las frecuencias alélicas y/o genotípicas de un locus de interés entre una población control y una que padezca la enfermedad a estudiar. Cuando se encuentran diferencias estadísticamente significativas en las frecuencias alélicas y/o genotípicas entre casos y controles, se dice que el alelo y/o genotipo están asociados con un incremento o disminución de riesgo a padecer la enfermedad 61. 3.5.- Polimorfismos en NFE2L2 NFE2L2 cuenta con 3 isoformas proteicas producidas por corte y empalme alternativo y más de 583 variantes en su secuencia, entre las cuales se han reportado 59 SNPs en exones (26 no sinónimos) y una variación de repetidos del triplete (CGC4-5) 62. Dentro de los SNPs reportados para NFE2L2, el ⁻653A>G (rs35652124) y el ⁻617C>A (rs6721961) localizados en la región promotora del gen presentan un efecto funcional. Estudios in vitro utilizando construcciones plasmídicas demostraron que ambos polimorfismos reducen la actividad del promotor de 16 NFE2L2 63. El SNP -617C>A se localiza dentro de la región ARE de NFE2L2 y se ha propuesto que disminuye su expresión al disminuir la afinidad de unión a la secuencia ARE. Los mismos autores reportan que los individuos con al menos un alelo del SNP ⁻617C>A tienen mayor riesgo a desarrollar daño agudo en pulmón (daño mediado por EO) 63. Por otro lado, en un estudio con linfocitos humanos inmortalizados se encontró que células homocigotas AA para el SNP ⁻617C>A exhiben una disminución significativa (aproximadamente 40%) de ARNm de Nrf2 comparadas con las heterocigotas (CA) y las homocigotas (CC) revelando una disminución de la expresión de Nrf2. En este mismo estudio se demostró que, tanto el alelo A como el genotipo homocigoto (AA), se asocian con un mayor riesgo a desarrollar cáncer de pulmón en población japonesa 26. En niños con lupus eritematoso sistémico se encontró que únicamente el genotipo heterocigoto del SNP -653A>G se asoció con un mayor riesgo a desarrollar nefritis lúpica en niñas 64. Recientemente, se reportó que los individuos portadores del genotipo AA (⁻617C>A) tienen menores niveles de actividad de las enzimas antioxidantes catalasa, superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa en plasma y que el genotipo AA confieremayor riesgo a desarrollar DM2 comparado con el genotipo CC 65. 3.6.- Polimorfismos en NQO1 De los SNPs identificados en el gen NQO1, el más estudiado por su alta prevalencia y consecuencia funcional es el 609C>T (rs1800566) que consiste en un cambio de C por T en la posición 609 de la secuencia codificante, resultando en una sustitución de prolina por serina en el codón 187 de la proteína 66-68. Un segundo SNP, el C465T que resulta en un cambio de arginina por triptófano en el residuo 139, disminuye la actividad de la proteína y muestra una disminución de estabilidad del ARNm; sin embargo, su frecuencia es baja y no existen muchos reportes 69. Con relación a 609C>T (rs1800566), la proteína producida a partir de esta variante presenta actividad parcial debido a que es incapaz de unirse correctamente a su 17 cofactor FAD 70. Además, esta proteína muestra una reducción en su vida media debido a que puede unirse al dominio Hsp70 de la ubiquitin ligasa E3 que cataliza su ubiquitinación, y la marca para su degradación a través de proteosoma. De esta forma, los individuos heterocigotos (CT) muestran niveles reducidos de proteína y de actividad de NQO1, con respecto a los homocigotos para el alelo ancestral (CC) mientras que los homocigotos TT no exhiben actividad alguna 71-73. Estudios de asociación han reportado que pacientes con DM2 con el alelo T (609C>T) exhiben mayor prevalencia de placa ateroesclerótica que los que no portan ese alelo 74. De forma similar, en población de Mongolia se mostró que los individuos con el alelo T tienen mayor riesgo a desarrollar cáncer de colon y, una frecuencia significativamente mayor del genotipo TT comparados con los controles 75. En carcinoma hepatocelular en chinos, se observó una asociación del genotipo TT con el riesgo a desarrollar la enfermedad 76. También se ha reportado que los griegos portadores del genotipo TT exhiben un incremento en el riesgo a desarrollar esclerosis múltiple 77. Por el contrario, en población española no se ha observado una correlación entre la variante 609C>T y esclerosis múltiple 78. En población mexicana los estudios son escasos y se ha reportado que el alelo T está asociado con hipertrigliceridemia y niveles bajos de colesterol HDL (del inglés, high density lipoprotein) en individuos con síndrome metabólico 79. 3.7.- Genética de la población mexicana La constitución genética de una población está dada por sus ancestros, historia de mestizaje, fenómenos de selección, mutaciones, migraciones e interacciones con el medio ambiente. En el caso de México, la ancestría más antigua es la de los pobladores originales de América que llegaron tras cruzar el estrecho de Bering desde Asia hace no más de 23 000 años 80. Durante la conquista hubo un mestizaje de los nativos americanos con individuos europeos y africanos. El componente europeo es principalmente español de las regiones de Andalucía, Castilla y Extremadura. En tanto que el componente africano se incorporó por el auge del comercio de esclavos que fueron traídos en barco desde la costa occidental de 18 África hasta las costas de México, principalmente Veracruz 81. La población mexicana actual cuenta con un genoma complejo resultado de la mezcla de dichos componentes pudiéndose dividir en dos grupos: mestizos y amerindios. El Instituto Nacional de Antropología toma como criterios para que un individuo sea considerado mestizo que haya nacido en México, tenga un apellido de origen español y ancestros de origen mexicano de 3 generaciones 81, 82. En el Proyecto de Diversidad Genómica de Poblaciones Mexicanas (PDGM) del INMEGEN se analizaron 1814 marcadores informativos de ancestría con lo que se determinó que los mestizos tienen en promedio 53% de componente amerindio, 42% de europeo y 5% de africano 82. Sin embargo, individualmente los componentes varían mucho, y hay una clara relación con la localización geográfica. En general, en el norte del país se encuentran individuos con mayor ancestría europea, mientras que en el sur es más común encontrar un mayor porcentaje de ancestría amerindia 83. Los amerindios constituyen aproximadamente el 10% (INEGI) de la población total de México, con un gradiente de norte a sur, es decir, la mayoría reside en los estados de Chiapas, Oaxaca, Veracruz, Yucatán y Puebla. El Instituto Nacional de Lenguas Indígenas (INALI) cataloga la diversidad de los pueblos indígenas en 11 familias lingüísticas, considerando una familia lingüística como un conjunto de lenguas cuyas semejanzas estructurales y léxicas se deben a un origen histórico común (Figura 7). En las 11 familias se distribuyen las 68 agrupaciones lingüísticas a las que se define como un conjunto de variantes lingüísticas comprendidas bajo el nombre dado históricamente a un pueblo indígena (Tabla 2) y que se utiliza como sinónimo de etnia 84 . 19 Figura 7. Distribución geográfica de las Familias lingüísticas de México 84. 20 Tabla 2. Familias y grupos lingüísticos de México 84. Familia Lingüística Grupo lingüístico Algíca Kickapoo. Yuto-Nahua Cora, Guarijío, Huichol, Mayo, Náhuatl, Pápago, Pima, Tarahumara, Tepehuano del Norte, Tepehuano del Sur, Yaqui. Cochimí-Yumana Cucapá, Kiliwa, Kumiai, Ku’ahl, Paipai. Oto-Mangue Amuzgo, Cuicateco, Chatino, Chichimeco Jonaz, Chinanteco, Chocholteca, Ixcateco, Matlatzinca, Mazahua, Mazateco, Mixteco, Otomí, Pame, Popoloca, Tlahuica, Tlapaneco, Triqui, Zapoteco. Tarasca Tarasco Maya Akateko, Awateko, Chontal de Tabasco, Chuj, Cho’l, Huasteco, Ixil, Jacalteco, Kaqchiquel, K’iche’, Lacandón, Mam, Maya, Qato’k, Q’anjob’al, Q’eqchí’, Teko, Tojolabal, Tseltal, Tsotsil. Mixe-Zoque Ayapaneco, Mixe, Oluteco, Popoluca de la Sierra, Sayulteco, Texistepequeño, Zoque. Seri Seri Huave Huave Chontal de Oaxaca Chontal de Oaxaca Totonaco-Tepehua Tepehua, Totonaco. 3.8.- Genética de poblaciones La genética de poblaciones es la que se encarga de estudiar cómo se distribuyen las variantes genéticas en distintas poblaciones, los cambios que sufren a través de las generaciones y los factores que determinan dicho comportamiento. Los factores que determinan estas variaciones son genéticos (mutaciones y reproducción) y ambientales (migración, temperatura, nutrición, entre otros). Para estudiar las 21 frecuencias alélicas y genotípicas en las poblaciones se utiliza un modelo matemático llamado principio de Hardy-Weinberg (HW). Este modelo se basa en el supuesto de una población ideal en la que no hay endogamia (reproducción entre individuos con ascendencia común), no hay fenómenos de selección, la población es grande, los emparejamientos entre sus miembros son al azar, no hay inmigración de individuos con frecuencias alélicas muy distintas a las existentes y la tasa de mutación es inapreciable, por lo que las frecuencias alélicas permanecen constantes a lo largo del tiempo. Cuando las frecuencias alélicas de un locus en estudio se encuentran en desequilibrio de HW se sugiere que hay una o más fuerzas actuando sobre los alelos (selección, deriva génica, mutación y/o migración) o que en la población hay endogamia o apareamientos no aleatorios. Sin embargo, también debe considerarse que las frecuencias alélicas pueden verse afectadas por lo que se denomina tamaño efectivo de la población (número de individuos que se aparean por generación). El estudio de marcadores genéticos es una de las vías que utiliza la genética de poblaciones. Este análisis se basa en la caracterización de regiones variables o polimórficas del material genético de cada individuo y conocer como la frecuencia de estos polimorfismos varía en las distintas poblaciones, evaluando las diferencias de frecuencias entre las distintas poblaciones y/o grupos étnicos 85. Además de las diferencias genéticas entre mestizosy amerindios, se ha reportado estratificación genética entre etnias y patrones de distribución geográficos de subestructuras poblacionales, como lo muestra un estudio en donde se analizaron aproximadamente un millón de SNPs en individuos pertenecientes a 20 poblaciones indígenas y mestizos mexicanos, el cual sugiere que para hacer estudios médicos y genéticos en mexicanos, es crítico contar con información de los patrones de ancestría de la población 86. 22 4.- HIPÓTESIS Y OBEJTIVOS Hipótesis 1.- Por la composición genética de los mestizos mexicanos, es probable que los SNPS 609C>T, ⁻653A>G y ⁻617C>A muestren frecuencias alélicas y genotípicas distintas a las de amerindios, pero intermedias entre estos y europeos. 2.- Las frecuencias alélicas y genotípicas para los SNPs 609C>T, ⁻653A>G y ⁻617C>A de los distintos grupos indígenas serán diferentes entre sí. Objetivo general Conocer las frecuencias de 3 variantes genéticas localizadas en los genes antioxidantes NQO1 y NFE2L2 en población Mestiza y Amerindia de México. Objetivos particulares Determinar las frecuencias alélicas y genotípicas de las variantes genéticas 609C>T (NQO1), ⁻653A>G y ⁻617C>A (NFE2L2). Conocer la distribución de las variantes génicas estudiadas en los diferentes grupos indígenas mexicanos. Contrastar las frecuencias de las variantes analizadas en Amerindios con los Mestizos. Comparar las frecuencias de las variantes 609C>T, ⁻653A>G y ⁻617C>A encontradas en Amerindios y Mestizos con las reportadas en otras poblaciones del mundo. 23 5.-PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 5.1.-Población de estudio Este estudio forma parte del proyecto titulado “Diversidad genómica y variantes raras que contribuyen al desarrollo de enfermedades crónico-degenerativas en los grupos indígenas del territorio mexicano”, aprobado por el Comité de Ética del Instituto Nacional de Medicina Genómica (INMEGEN) (Anexo I) y llevado a cabo de acuerdo con la declaración de Helsinki. Se incluyeron un total de 2350 individuos voluntarios no relacionados. 471 fueron mestizos de la Cuidad de México y 1866 amerindios pertenecientes a 55 etnias distribuidas en distintas regiones del país. Los criterios de inclusión para los individuos mestizos fueron: haber nacido en la Ciudad de México, no ser indígena y que sus padres y abuelos fueran mexicanos. En el caso de los indígenas se incluyeron a todos los individuos que se reconocieran como tales, que hubieran nacido en la comunidad correspondiente al grupo étnico, que hablaran la lengua nativa y que sus padres y abuelos pertenecieran al mismo grupo indígena. Todos los individuos firmaron una carta de consentimiento informado (Anexo II). Se eliminaron a todos los individuos cuya muestra biológica no tuviera la calidad requerida para ser utilizada en el estudio. 5.2.- Extracción de ADN El material genético utilizado pertenece al banco de ADN del Laboratorio de Inmunogenómica y Enfermedades Metabólicas del INMEGEN, se encuentra bajo resguardo de la Dra. Lorena Orozco y se generó a partir de septiembre del 2011 para el proyecto “Diversidad genómica y variantes raras que contribuyen al desarrollo de las enfermedades crónico-degenerativas en los grupos indígenas del territorio mexicano”. La extracción de ADN se realizó a partir de sangre total con el kit QIAamp® DNA Blood Maxi kit (QIAgen™) siguiendo las indicaciones del fabricante. Para determinar 24 la concentración y pureza del ADN se utilizó un NanoDrop® (Thermo Scientific™). La integridad se evaluó por electroforesis en geles de agarosa al 1%. Para la electroforesis se utilizó una matriz (gel de agarosa o poliacrilamida) tamponada que se sometió a un campo eléctrico. En el gel, el ADN se separa de acuerdo a su tamaño y carga neta. Los ácidos nucleicos migran hacían el polo positivo debido a que los grupos fosfato de la molécula tienen carga negativa a pH neutro 87. El ADN es mezclado con un buffer de carga que contiene glicerol, para proporcionar densidad a la muestra y un colorante, que permite visualizar el recorrido de la muestra en el gel. Los ácido nucleicos pueden visualizarse mediante tinción con colorantes como el SYBR Green®, que es un compuesto orgánico que se asocia a la molécula de ADN formando un complejo que emite fluorescencia a 520 nanómetros. 5.3 Genotipado La genotipación de los SNPs 609C>T (rs1800566) en NQO1, ⁻653A>G (rs35652124) y ⁻617C>A (rs6721961) en NFE2L2 se realizó mediante discriminación alélica utilizando sondas TaqMan® (Applied Biosystems™). Brevemente, la discriminación alélica es una reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), en la que se amplifica el fragmento de interés flanqueado por dos oligonucleótidos o cebadores. Uno de los cebadores es complementario a una cadena de ADN en uno de los extremos de la secuencia diana, y el otro, es complementario a la otra cadena en el otro extremo de la secuencia diana. Para llevar a cabo la reacción de PCR se necesitan los cuatro desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP, por sus siglas en inglés), la enzima ADN polimerasa, iones divalentes como Mg2+, dos cebadores, un amortiguador de pH y agua como medio de reacción. La enzima ADN polimerasa sintetiza el nuevo ADN a partir de un molde utilizando los dNTPs como sustrato. Los cebadores delimitan el fragmento a amplificar y permiten que se inicie la reacción. El magnesio es el cofactor de la enzima y el amortiguador es necesario para mantener un pH óptimo para la reacción. 25 La discriminación alélica consiste en amplificar la región donde se encuentra el polimorfismo en presencia de dos sondas marcadas con fluorocromos distintos (VIC y FAM), una específica para cada alelo. Las sondas están diseñadas de manera tal que en el extremo 5´ se encuentra el fluorocromo, y en el extremo 3´ se localiza un silenciador o quencher, el cual que impide la emisión de fluorescencia mientras ambos (fluorocromo y silenciador) se encuentren unidos a la sonda. En la reacción de PCR la sonda se une a su secuencia complementaria (que se encuentra en medio de la región a amplificar). La enzima polimerasa sintetiza la hebra complementaria al molde partiendo del cebador hasta que se encuentra con el extremo 5’ de la sonda y, con su actividad exonucleasa 5’-3’, hidroliza al fluorocromo separándolo de la sonda y emitiendo la fluorescencia. VIC y FAM emiten fluorescencia a distintas longitudes de onda (551 y 517 nanómetros, respectivamente) gracias a lo cual se puede realizar la discriminación alélica (identificar los genotipos de las muestras). Los individuos homocigotos para cualquiera de los alelos, sólo presentarán la fluorescencia de una de las sondas (correspondiente a un sólo fluorocromo) mientras que, los heterocigotos presentarás las dos y los controles sin DNA no emitirán fluorescencia (Figura 10). La reacción de PCR se lleva a cabo en 3 etapas que conforman un ciclo: iniciación, alineamiento y elongación. En la iniciación se desnaturaliza el ADN a 95 °C, es decir, se rompen los puentes de hidrógeno permitiendo que las hebras se separen. Posteriormente, en el alineamiento, los cebadores hibridan con su secuencia complementaria y se inicia la polimerización. Durante la fase de elongación la polimerasa sintetiza la nueva hebra a partir del molde. Finalmente, se lleva a cabo la fase de terminación a 70-74 °C para asegurar una completa amplificación. El producto de la PCR se mantiene a 4°C hasta su utilización. Para cada reacción de PCR se utilizaron 25 ng de ADN 100 ng/µl, 2.5 µl de TaqMan® Universal Master Mix (2x) (AB™), 0.08 µl de sonda TaqMan® (10x) y agua para un volumen final de 5 µl. La amplificación se realizó en el equipo GeneAmp® PCR system 9700 con las siguientes condiciones de termociclado: 50 °C por 2 minutos, 95°C por 10 minutos y 45 ciclos(92 °C por 15 segundos, 60°C por 1 minuto). Las muestras se mantuvieron a 4 °C hasta su lectura. La discriminación alélica se realizó en el equipo 26 de PCR en tiempo real, ABI Prism 7900HT (AB™) utilizando el software Sequence Detection System 2.3 7900HT (AB™). El 10% de las muestras se genotiparon por duplicado para validación de la reproducibilidad del ensayo. 5.4.- Secuenciación El 2% de las muestras fueron secuenciadas para validar los genotipos obtenidos por discriminación alélica con sondas TaqMan®. La secuenciación capilar tiene como fundamento la secuenciación Sanger y se utilizan análogos químicos de los dNTPs conocidos como dideoxi nucleótidos (ddA, ddC, ddG y ddT). Estos difieren con los dNTPs en que carecen del grupo hidroxilo 3’ terminal en su desoxirribosa, el cual es necesario para que la enzima polimerasa adicione nuevos nucleótidos en una reacción de síntesis. Si un dideoxi nucleótido se incorpora a una cadena creciente de ADN, la polimerasa no podrá continuar quedando interrumpida la cadena. El procedimiento consiste en llevar a cabo una reacción de PCR utilizando un molde de ADN, un oligonucleótido, la ADN polimerasa, dNTPs, ddNTPs marcados cada uno con un fluorocromo distinto y un amortiguador. La ADN polimerasa lleva a cabo la síntesis de ADN a partir del molde incorporando los nucleótidos al azar. De manera que las cadenas se alargan mientras se incorporen dNTPs pero si se adiciona un ddNTP se interrumpe la síntesis. El resultado es la formación de productos de distintas longitudes terminados en ddNTPs marcados en el extremo 3’. Estos productos se separan por tamaño mediante electroforesis y el nucleótido responsable de la terminación de la cadena se identifica por el fluorocromo con que está marcado. El equipo traduce la emisión de fluorescencia en la secuencia correspondiente. La amplificación de los fragmentos de interés se realizó utilizando los oligonucleótidos NQO1sec609F y NQO1sec609R (Figura 8) para el gen NQO1 y Nrf2p400F y Nrf2p400R (Figura 9) para el gen NFE2L2. Los SNPs ⁻653A>G y ⁻617C>A en NFE2L2 se encuentran próximos, por lo que los cebadores se diseñaron de manera tal que la secuencia diana abarcara ambos. Todas las reacciones de PCR contenían 1µl de ADN (100 ng/µl), 2.5 µl de Buffer II (10x), 2 µl 27 de MgCl2 (10x), 2µl de dNTPs (10x), 1 µl de cada oligonucleótido, 0.13 µl de ADN polimerasa AmpliTaq Gold® (Applied Byosistems™) y agua para un volumen final de 25 µl. Las condiciones de termociclado fueron: 94 °C por 10 minutos, 30 ciclos (94 °C por 1 min, 60°C por 1 minuto y 72°C por 30 segundos), 72 °C 10 minutos y se conservó a 4 °C hasta su utilización (GeneAmp® PCR system 9700). Figura 8.- Oligonucleótidos utilizados para amplificar la región del SNP 609C>T en NQO1. Figura 9.- Oligonucleótidos utilizados para amplificar la región de los SNPs ⁻653A>G y ⁻617C>A en NFE2L2. 28 El tamaño de los fragmentos amplificados se verificó en un gel de agarosa al 2% utilizando 5 µl del producto de PCR por 3 µl de CyberGreen® y 2 µl de buffer de carga. La corrida se realizó a 90 V durante 40 minutos. Una vez verificado el tamaño del fragmento, el producto de PCR se purificó utilizando el kit de QIAgen™, QIAquick Purification® y se comprobó la pureza con un NanoDrop (Thermo Scientific™). Los productos de PCR purificados se secuenciaron en el equipo 3730XL DNA Analyzer (Applied Byosistems™) en la Unidad de Secuenciación del INMEGEN. Las secuencias fueron analizadas con el software DNA Baser®. 5.5.-Análisis estadístico Para obtener las frecuencias alélicas y genotípicas, el equilibrio de Hardy Weinberg, heterocigosidad esperada y observada, y los coeficientes de fijación y endogamia se utilizó el software Genepop® 88, 89. La prueba de desequilibrio de ligamiento se realizó con los programas estadísticos Plink 90 y Haploview 91. Las frecuencias alélicas de cada polimorfismo se graficaron utilizando los softwares QGIS 92 y R 93 y, se crearon mapas de distribución geográfica. En todos los casos se consideraron diferencias significativas cuando P<0.05. 29 6.- RESULTADOS Todos las muestras de ADN de MEZ y AM fueron genotipificadas mediante discriminación alélica con sondas TaqMan® para los SNPs NQO1 609C>T y NFE2L2 ⁻653A>G y ⁻617C>A (Figura 10). El 10% de las muestras se genotipificó por duplicado obteniendo un 98% de reproducibilidad. Para la validación de los genotipos obtenidos mediante sondas TaqMan®, se seleccionaron aleatoriamente 50 individuos para NQO1 609C>T y 50 individuos para NFE2L2 ⁻653A>G y ⁻617C>A. Se amplificaron las regiones donde se encuentran los SNPs (los dos SNPs en NFE2L2 se encuentran próximos por lo que se amplificaron en el mismo fragmento) (Figura 11), se purificaron los amplificados y se obtuvo la secuencia mediante secuenciación capilar (Figuras 12 y 13). El análisis de las secuencias reveló que en el 96% de los casos el genotipo coincidió con lo observado por TaqMan®. Esto puede atribuirse entre otras cosas a contaminación de las muestras en la placa o errores de hibridación de la sonda. Figura 10. Discriminación alélica de -617C>A en NFE2L2. Las muestras homocigotas CC exhiben fluorescencia sólo del alelo Y (azul), al igual que las homocigotas AA sola muestran para el alelo X (rojo). Las heterocigotas se muestran en verde y los controles sin ADN no presentan fluorescencia (cuadros negros). 30 Figura 11.- Amplificación de los fragmentos de a) NQO1 y b) NFE2L2. Los carriles 1-5 son muestras y C- es el control negativo. Figura 12. Electroferograma del fragmento 609C>T en NQO1. Se muestra la hebra no codificante. a) individuo homocigoto CC b) individuo heterocigoto CT. c) individuo homocigoto TT. Homocigoto GG (CC) Heterocigoto GA (CT) Homocigoto AA (TT) a) b) c) AM2065 AM0203 700 500 400 300 200 pb AM2065 AM0203 AM1005 AM1088 AM1229 C - 700 500 400 300 200 pb C - AM2065 AM0203 AM1005 AM1088 AM1229 510 pb 511 pb a) NQO1 b) NFE2L2 31 Figura 13. Electroferograma del fragmento de NFE2L2 donde se encuentran los SNPs -653A>G y -617C>A. Se muestra la hebra no codificante. a) individuo homocigoto CC (- 617C>A) y GG (-653A>G) b) individuo homocigoto CC para -617C>A y heterocigoto para - 653A>G, c) individuo heterocigoto para ambos SNPs. a) Población de estudio Se incluyeron un total de 2337 individuos: 471 mestizos (MEZ) y 1866 amerindios (AM). Todos los MEZ nacieron en la Ciudad de México y su edad promedio fue de 40.5 ± 8.5 años. El 65% fueron mujeres y el 35% hombres. La población AM tuvo una edad promedio de 51.1 ± 15.9 años y el 68% fueron mujeres y el 32% fueron hombres (Tabla 3). Tabla 3. Características de la población en estudio POBLACIÓN N MUJERES HOMBRES EDAD (años) MESTIZOS 471 307 (65%) 164 (35%) 40.5 ±8.5 AMERINDIOS 1866 1275 (68%) 591 (32%) 51.1±15.9 Edad = promedio ± desviación estándar Homocigoto GG (CC) Homocigoto CC (GG) Homocigoto GG (CC) Heterocigoto CT (GA) Heterocigoto GT (CA) Heterocigoto CT (GA) a) b) c) -653A>G -617C>A 32 La población AM estuvo constituida por 55 grupos étnicos (Tabla 4) que se captaron en 21 entidades federativas de México (Baja California, Chiapas, Chihuahua, Ciudad de México, Durango, Estado de México, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Michoacán, Morelos, Nayarit, Oaxaca, Puebla, Quintana Roo, San Luis Potosí, Sonora, Tabasco, Tlaxcala, Veracruz y Yucatán). Para el análisis de las frecuencias por etnia se incluyeron únicamente aquellas con 10 o más individuos. De la etnia nahua se obtuvieron muestras de diferentes localidades por lo que en el análisis se presentan de acuerdo a su región geográfica: Ciudadde México (CDMX), Morelos (MOR), Puebla (PUE) y San Luis Potosí (SLP). Tabla 4. Familias lingüísticas y etnias incluidas en el estudio *Todos los individuos de la tabla se incluyeron en los resultados de la población amerindia, pero para los resultados por etnia únicamente se incluyeron aquellas con 10 o más individuos. Familia lingüística N Etnia (n) Chontal de Oaxaca 2 Chontal de Oaxaca (2) Cochimí-Yumana 6 Cucapá (1), Kiliwa (1), Kuáhl (2), Kumiai (2) y Paipai (1) Huave 3 Huave (3) Maya 582 Cho´l (3), Chontal de Tabasco (2), Chuj (17), Huasteco (79), Ixil (1), Kanjobal (29), Kaqchiquel (38), Lacandon (1), Mame (46), Maya (251), Mocho (16), Poptijacalteco (40), Q´eqchí (1), Tojolabal (45), Tseltal (5) y Tsotsil (8). Mixe-Zoque 134 Mixe (89), Popoluca de la Sierra (36) y Zoque (9) Oto-Mangue 603 Amuzgo (1), Chatino (1), Chichimeco (1), Chinanteco (84), Chocholteco (5), Cuicateco (2), Ixcateco(1), Matlatzinca (5), Mazahua (2), Mazateco (61), Mixteco (135), Otomí (222), Pame (10), Popoloca (2), Tlahuica (5), Tlapaneco (1), Triqui (2) y Zapoteco (63) Seri 22 Seri (22) Tarasca 2 Purépecha (2) Tepehua-Totonaco 99 Tepehua (1) y Totonaco (98) Yuto-Nahua 405 Cora (1), Huichol (1), Mayo (30), Náhuatl (242), Pima (1), Tarahumara (93) y Yaqui (37) 33 b) Frecuencias alélicas y genotípicas en MEZ y AM Las distribuciones genotípicas de MEZ y AM se encontraron en equilibrio de HW en todas las variantes analizadas excepto en la población AM para NFE2L2 ⁻653A>G (P= 0.04) (Tabla 5). Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las frecuencias genotípicas de MEZ y AM en NQO1 609C>T (P= 0.002) y NFE2L2 ⁻653A>G (P= 1.9 x 10-8). Las frecuencias de NFE2L2 ⁻617C>A (P= 0.05) no mostraron diferencias entre ambas poblaciones. En MEZ el alelo ancestral C del SNP 609C>T (NQO1) mostró una frecuencia del 54% y el de riesgo T de 46%. La distribución de los genotipos fue: 29% de homocigotos CC y 21% de homocigotos TT. En contraste, en AM la frecuencia del alelo C fue de 48% y del T de 52% y la proporción de homocigotos CC fue del 23% y la de homocigotos TT del 27%. Los heterocigotos presentaron una frecuencia similar en ambas poblaciones (50% en MEZ y 49% en AM) (Tabla 5). En relación a la variante ⁻653A>G (NFE2L2) se observó que en los MEZ la frecuencia del alelo G es de 61% y en AM de 70%. Los AM presentaron una mayor frecuencia de homocigotos GG (50%) que los MEZ (37%). En tanto que los MEZ, tuvieron una mayor proporción de heterocigotos AG (48%) y homocigotos AA (15%) comparados con los AM (heterocigotos AG 40%; y homocigotos AA 10%) (Tabla 5). En la variante ⁻617C>A (NFE2L2) las frecuencias alélicas y genotípicas fueron similares en ambas poblaciones. El alelo ancestral C fue el alelo de mayor frecuencia (77% en MEZ y 74% en AM). En los genotipos, la mayor proporción se observó en los homocigotos CC con 59% en MEZ y 55% en AM, seguida de los heterocigotos CA (36% y 38%, respectivamente). La menor frecuencia se encontró en los homocigotos AA con 5% en MEZ y 7% en AM (Tabla 5). 34 Tabla 5. Frecuencias alélicas y genotípicas de las variantes NQO1 609C>T, NFE2L2 -617C>A y NFE2L2 -653A>G y prueba de equilibrio de Hardy Weinberg en Mestizos y Amerindios mexicanos Gen Polimorfismo Genotipo/ Alelo Mestizos Equilibrio de HW (P) Amerindios Equilibrio de HW (P) N= 471 N= 1866 % (n) % (n) NQO1 609C>T CC 28.7 (135) 0.85 23.5 (438) 0.58 CT 50.3 (237) 49.2 (919) TT 21.0 (99) 27.3 (509) C 53.8 (507) 48.1 (1795) T 46.2 (435) 51.9 (1937) NFE2L2 -653A>G AA 15.5 (73) 1.00 9.8 (184) 0.04 AG 48.0 (226) 39.8 (742) GG 36.5 (172) 50.4 (940) A 39.5 (372)) 29.7 (1110) G 60.5 (570) 70.3 (2622) NFE2L2 -617C>A CC 58.8 (277) 0.70 54.7 (1020) 0.76 CA 36.3 (171) 38.3 (716) AA 4.9 (23) 7.0 (130) C 77.0 (725) 73.9 (2756) A 23.0 (217) 26.1 (976) 35 Tabla 6. Equilibrio de Hardy-Weinberg (P) para los SNPs NQO1 609C>T y NFE2L2 -653A>G y -617C>A en 26 etnias Población NQO1 NFE2L2 Total 609C>T -653A>G -617C>A Chinanteco 0.67 1.00 0.80 0.97 Chuj 0.59 0.62 0.34 0.65 Huasteco 0.25 0.04 0.13 0.04 Kanjobal 0.15 0.60 0.60 0.44 Kaqchiquel 0.33 0.27 0.49 0.40 Mame 1.00 0.25 0.63 0.71 Maya 0.70 0.65 0.16 0.51 Mayo 0.45 0.29 0.68 0.56 Mazateco 0.79 1.00 0.74 0.98 Mixe 1.00 1.00 0.57 0.98 Mixteco 0.86 1.00 0.17 0.55 Mocho 0.64 1.00 1.00 0.99 Nahua CDMX 0.82 0.46 0.78 0.87 Nahua MOR 0.34 1.00 1.00 0.91 Nahua PUE 0.79 0.36 0.34 0.58 Nahua SLP 0.13 0.76 1.00 0.59 Otomí 0.50 0.76 0.74 0.87 Pame 1.00 1.00 1.00 1.00 Popoluca de la Sierra 0.14 1.00 0.59 0.55 Jacalteco 1.00 0.30 0.21 0.48 Seri 1.00 0.62 1.00 0.99 Tarahumara 0.82 0.22 0.18 0.34 Tojolabal 1.00 0.17 1.00 0.73 Totonaco 0.54 0.04 0.08 0.05 Yaqui 0.52 1.00 0.73 0.92 Zapoteco 0.60 0.51 0.49 0.71 En la población AM todas las etnias se encontraron en equilibrio de HW excepto los huastecos y los totonacos para la variante ⁻653A>G en NFE2L2 (P= 0.04) (Tabla 6). Lo que podría ser indicativo de que en estas poblaciones existe algún fenómeno actuando sobre esta variante como: selección, deriva génica, endogamia, entre otros. 36 El análisis de las frecuencias alélicas por etnia mostró que existe una gran variabilidad. En NQO1 609C>T la menor frecuencia del alelo de riesgo T se observó en los chuj y en los popoluca de la sierra (ambos 35%). Mientras que la mayor frecuencia la presentaron los mazatecos (61%) (Figura 14). Los alelos de riesgo para ⁻653A>G y ⁻617C>A se encontraron en menor frecuencia en los mocho (12% y 9%, respectivamente), mientras que las más altas se observaron en chuj, yaqui y nahua SLP (Figuras 15 y 16). Al analizar los genotipos se observa que para NQO1 609C>T, todas las etnias tienen al heterocigoto como genotipo mayor excepto los nahua de SLP que tienen mayor frecuencia del homocigoto TT. Respecto a los homocigotos, 9 etnias tienen mayor frecuencia del CC, 14 etnias al TT y 4 tienen una proporción igual de ambos homocigotos. Interesantemente los chuj y los popoluca de la sierra presentaron una frecuencia baja del homocigoto TT (6% ambos) comparados con las demás poblaciones (Tabla 7). En ⁻653A>G NFE2L2 hay 20 etnias con el homocigoto GG como genotipo de mayor frecuencia, los chuj tienen una proporción igual de homocigotos GG y heterocigotos y 6 etnias presentan mayor frecuencia del heterocigoto (Tabla 7). En cuanto a ⁻617C>A, en 23 etnias se observó una mayor frecuencia del homocigoto ancestral (CC). Los yaqui presentaron una proporción similar del homocigoto CC y el heterocigoto, mientras que los mixtecos y los nahua SLP tienen una mayor frecuencia del heterocigoto (Tabla 7). En las etnias mocho y pame no se observó ningún individuo homocigoto AA para ninguno de los dos SNPs en NFE2L2, lo cual puede deberse a la baja frecuencia de estos SNPs y al tamaño reducido de muestra de estas dos etnias (16 y 10, respectivamente) (Tabla 7). 37 Tabla 7. Frecuencias genotípicas (%) de la población amerindia por etnia Población n NQO1 NFE2L2 609C>T -653A>G -617C>A CC CT TT GG GA AA CC CA AA Chinanteco 84 29.8 47.6 22.6 46.4 44.1 9.5 46.4 45.3 8.3 Chuj 17 35.3 58.8 5.9 41.2 41.2 17.6 47.1 35.3 17.6 Huasteco 79 19.9 41.8 39.2 48.1 49.4 2.5 51.9 45.6 2.5 Kanjobal 29 17.2 65.5 17.2 62.1 31 6.9 62.1 31 6.9 Kaqchiquel 38 18.4 60.5 21.1 71 23.7 5.3 76.3 21.1 2.6 Mame 46 23.9 52.2 23.9 60.9 30.4 8.7 67.4 28.3 4.3 Maya 251 19.1 51 29.9 51.4 39.8 8.8 57.8 38.6 3.6 Mayo 30 36.7 40 23.3 30 40 30 46.7 40 13.3 Mazateco 61 16.4 45.9 37.7 49.2 42.6 8.2 54.1 41 4.9 Mixe 89 21.3 50.6 28.1 55.1 38.2 6.7 58.4 34.8 6.8 Mixteco 135 22.2 48.9 28.9 42.2 47.4 10.4 43.7 48.9 7.4 Mocho 16 25 43.7 31.3 75 25 0 81.2 18.8 0 Nahua CDMX 82 32.9 47.6 19.5 46.3 40.3 13.4 51.242.7 6.1 Nahua Mor 44 11.4 56.8 31.8 72.7 25 2.3 72.7 25 2.3 Nahua Pue 52 28.8 48.1 23.1 46.1 38.5 15.4 51.9 36.5 11.6 Náhuatl SLP 46 23.9 37.9 39.1 37 45.6 17.4 37 47.8 15.2 Otomí 222 28.8 47.3 23.9 46.4 42.8 10.8 50.9 40.1 9 Pame 10 20 50 30 70 30 0 70 30 0 Popoluca Sierra 36 36.1 58.3 5.6 61.1 33.3 5.6 66.6 27.8 5.6 Poptijacalteco 40 30 50 20 45 37.5 17.5 60 30 10 Seri 22 22.7 54.5 22.7 45.5 50 4.5 50 45.5 4.5 Tarahumara 93 12.9 44.1 43 58.1 39.8 2.1 63.4 35.5 1.1 Tojolabal 45 17.8 48.9 33.3 51.1 33.3 15.6 53.3 40 6.7 Totonaco 98 21.4 54.1 24.5 56.1 31.6 12.3 56.1 32.7 11.2 Yaqui 37 21.6 56.8 21.6 35.1 48.7 16.2 43.24 43.24 13.5 Zapoteco 63 33.3 52.4 14.3 57.2 34.9 7.9 58.7 33.3 8 3 8 F ig u ra 1 4 . D is trib u c ió n a lé lic a d e N Q O 1 6 0 9 C > T e n p o b la c ió n A m e rin d ia . E -"" g o ~ o Ir) " o o Ir) o Ir) '" o Región geográfica Noroeste D Noreste • Centro Occidente Sureste Yaqui Mayo Nahuatl_Mor rs1800566 Nahuatl_SLP Chinanteco e T. Poptijacalteco Kaqchikel 3 9 F ig u ra 1 5 . D is trib u c ió n a lé lic a d e N F E 2 L 2 ⁻6 5 3 A > G e n p o b la c ió n A m e rin d ia . Seri E ~ g ~ r. 'c ;. o '" " ~ :;¡ N o Región geográfica O Noroest O ~oreste • Centro Occidente Sureste Yaqui Mayo Tarahumara rs3565214 Pame Huasteco A. G Chuj Maya Poptijaca lteco Kaqchikel 4 0 F ig u ra 1 6 . D is trib u c ió n a lé lic a d e N F E 2 L 2 -6 1 7 C > A e n p o b la c ió n A m e rin d ia . E '" o o o ~ o '" " o o '" o '" N o Región geográfica D Noroeste D Noreste • Centro Occidente [3 Sureste Yaqui Mayo Nahuatt_CDMX Nahuatl_Pue rs6121961 e A. 41 c) Frecuencias alélicas y genotípicas a nivel mundial Al comparar las frecuencias alélicas y genotípicas de los 3 SNPs con las de otras poblaciones del mundo, se observó que, en NQO1 609C>T los MEZ y AM tienen la mayor frecuencia del alelo de riesgo T, en relación a las otras poblaciones. En contraste, los checos (16%), los africanos (4%), los yoruba de Nigeria (18%) y los rusos (18%) presentan la menor frecuencia de T. De la misma manera, ambas poblaciones estudiadas tienen las frecuencias más altas a nivel mundial del heterocigoto (CT), seguidos de los chinos y los japoneses (45% y 46% respectivamente) (Tabla 8). Respecto al SNP ⁻653A>G en el gen NFE2L2, los MEZ (40%) y AM (30%) presentaron las frecuencias más bajas a nivel mundial del alelo ancestral A. Es interesante resaltar, que la población indígena es la única en la que el homocigoto GG es el de mayor frecuencia. Mientras que en MEZ el genotipo más frecuente es el heterocigoto, lo cual es similar a lo observado en americanos, colombianos, americanos de Los Ángeles de ancestría mexicana, chinos y japoneses. El homocigoto AA es el más frecuente en africanos, yoruba de Nigeria y europeos, lo cual difiere de lo observado en nuestros resultados (Tabla 9). Finalmente, en el SNP ⁻617C>A en NFE2L2, se observó que las poblaciones yoruba de Nigeria, africana y sueca (93%, 92% y 92% respectivamente) presentan las frecuencias más elevadas del alelo ancestral (C), mientras que los chinos, japoneses y AM (los tres, 74%) son las poblaciones que presentan la menor frecuencia. En todas las poblaciones el genotipo de mayor frecuencia es el homocigoto CC (50%-85%) (Tabla 9). 42 Tabla 8. Frecuencias genotípicas y alélicas de NQO1 609C>T en otras poblaciones. Población N CC CT TT C T Referencia % (n) % (n) % (n) % (n) % (n) Africanos 482 92.5 (446) 6.6 (32) 0.8 (4) 95.9(924) 4.1 (40) 1000 G Americanos 347 44. 7 (155) 44.1 (153) 11.2 (39) 66.7 (463) 33.3 (231) 1000 G Ancestría mexicana en Los Ángeles 64 40.6 (26) 43.8 (28) 15.6 (10) 62.5 (80) 37.5 (48) 1000 G Árabes 504 58.5 (295) 35.1 (177) 6.3 (32) 76.1 (767) 23.9 (241) Siraj K, 2008. Brasileños 336 56.5 (190) 39.0 (131) 4.5 (15) 76.0 (511) 24.0 (161) De Aguiar Gonçañves BA, 20012. Checos 265 70.6 (187) 26.8 (71) 2.6 (7) 84.0 (445) 16.0 (85) Mohelnikova- Duchovna B, 2011. Chinos 526 36.3 (191) 44.7 (235) 19.0 (100) 58.7 (617) 41.3 (435) Liu F,2013. Colombianos (Medellín) 94 51.1 (48) 41.5 (39) 7.4 (7) 71.8 (135) 28.2 (53) 1000 G Españoles 310 62.9 (195) 33.5 (104) 3.5 (11) 79.7 (494) 20.3 (126) Agúndez JA, 2014. Españoles Ibéricos 107 59.8 (64) 36.4 (39) 3.7 (4) 78.0 (167) 22.0 (47) 1000 G Estadounidenses 882 67.7 (597) 28.8 (254) 3.5 (31) 82.1 (1448) 17.9 (316) Ren C, 2010. Europeos 503 62.6 (315) 32.6 (164) 4.8 (24) 78.9 (794) 21.1 (212) 1000 G Franceses 532 64.8 (345) 30.3 (161) 4.9 (26) 80.0 (851) 20.0 (213) Bonaventure A, 2012. Griegos 380 61.8 (235) 36.3 (138) 1.8 (7) 80.0 (608) 20.0 (152) Stavropoulou C, 2011. Holandeses 1454 65.3 (949) 31.6 (460) 3.1 (45) 81.1 (2358) 18.9 (550) Freriksen JJ, 2014. Ingleses 936 69.0 (646) 28.4 (266) 2.6 (24) 83.2 (1558) 16.8 (314) Mitrou PN, 2007. Iraníes 492 67.7 (333) 27.0 (133) 5.3 (26) 81.2 (799) 18.8 (185) Steinbrecher A, 2010. Japoneses 1052 39.2 (412) 46.5 (489) 14.4 (151) 62.4 (1313) 37.6 (791) Hamachi T, 2013. Japoneses (Tokio) 104 38.5 (40) 53.8 (56) 7.7 (8) 65.4 (136) 34.6 (72) 1000 G Rusos 177 67.2 (119) 29.4 (52) 3.4 (6) 81.9 (290) 18.1 (64) Gra OA, 2008. Turcos 286 53.8 (154) 42.7 (122) 3.5 (10) 75.2 (430) 24.8 (142) Sirma S, 2004. Yoruba de Nigeria 108 66.7 (72) 29.6 (32) 3.7 (4) 81.5 (176) 18.5 (40) 1000 G 43 Tabla 9. Frecuencias genotípicas y alélicas de los SNPs -653A>G y -617C>A en el gen NFE2L2 en distintas poblaciones. Población N AA AG GG A G CC CA AA C A Referencia % (n) % (n) % (n) % (n) % (n) % (n) % (n) % (n) % (n) % (n) Africanos 246 67.9 (167) 31.7 (78) 0.4 (1) 83.7 (140) 16.3 (36) 85.0 (209) 15.0 (37) 0 92.5 (455) 7.5 (37) 1000 G Americanos 181 30.9 (56) 52.0 (94) 17.1 (31) 56.9 (206) 43.1 (156) 75.7 (137) 21.0 (38) 3.3 (6) 86.2 (312) 13.8 (50) 1000 G Ancestría mexicana en Los Ángeles 66 30.3 (20) 48.5 (32) 21.2 (14) 54.5 (72) 46.5 (60) 66.7 (44) 27.3 (18) 6.0 (4) 80.3 (106) 19.7 (26) 1000 G Chinos 314 21.0 (66) 57.3 (180) 21.7 (68) 49.7 (312) 50.3 (316) 49.7 (156) 41.7 (131) 8.6 (27) 70.5 (443) 29.5 (185) Yu B, 2013. Chinos 1295 - - - - - 53.6 (694) 40.5 (525) 5.9 (76) 73.9 (1913) 26.1 (677) Wang X, 2015. Colombianos 60 21.7 (13) 61.7 (37) 16.6 (10) 52.5 (63) 47.5 (57) 78.3 (47) 20.0 (12) 1.7 (1) 88.3 (106) 11.7 (14) 1000 G Españoles ibéricos 14 57.1 (8) 35.7 (5) 7.2 (1) 75.0 (21) 25.0 (7) 71.4 (10) 28.6 (4) 0 85.7 (24) 14.3 (4) 1000 G Estadounidenses 255 - - - - - 74.9 (186) 25.1 (69) 0 86.5 (441) 13.5 (69) Sampath V, 2015. Europeos 379 48.3 (183) 43.0 (163) 8.7 (33) 69.8 (529) 30.2 (229) 77.8 (295) 20.8 (79) 1.4 (5) 88.2 (669) 11.8 (89) 1000 G Italianos 168 56.5 (95) 37.0 (62) 6.5 (11) 75.0 (252) 25.0 (84) 73.2 (123) 24.4 (41) 2.4 (4) 85.4 (287) 14.6 (49) LoGerfo A, 2014. Japoneses 1167 - - - - - 53.7 (627) 40.9 (477) 5.4 (63) 74.2 (1731) 25.8 (603) Suzuki T, 2013. Japoneses 464 21.1 (98) 44.0 (204) 34.9 (162) 43.1 (400) 56.9 (528) 55.2 (256) 34.7 (161) 10.1 (47) 72.5 (673) 27.5 (255) Shimoyama Y, 2014. Japoneses 89 16.8 (15) 42.7 (38) 40.5 (36) 38.2 (68) 61.8 (110) 61.8 (55) 31.5 (28) 6.7 (6) 77.5 (138) 22.5 (40) 1000 G Mexicanos 379 20.1 (76) 45.6 (173) 34.3 (130) 57.1 (433) 42.9 (325) 59.6 (226) 35.9 (136) 4.5 (17) 77.6 (588) 22.4 (170) Córdova EJ, 2010. Polacos 365 - - - - - 77.5 (283) 20.3 (74) 2.2 (8) 87.7 (640) 12.3 (90) Reszka E, 2014. Suecos 184 44.6 (82) 48.3 (89) 7.1 (13) 68.8 (253) 31.2 (115) 84.8 (156) 14.7 (27) 0.5 (1) 92.1 (339) 7.9 (29) Von Otter M, 2010. Yoruba (Nigeria) 88 60.2 (53) 38.6 (34) 0.2 (1) 79.5 (140) 20.5 (36) 85.2 (75) 14.8 (13) 0 92.6 (163) 7.4 (13) 1000 G 44 d) Análisis de haplotipos
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