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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MEXICO 
 
Doctorado en Ciencias Biomédicas 
Facultad de Medicina 
 
Papel de la miosina 1g en el tránsito 
vesicular en el linfocito B del ratón. 
 
TESIS DE DOCTORADO 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
DOCTOR EN CIENCIAS BIOMEDICAS 
 
PRESENTA: 
M. en C. ORESTES LÓPEZ ORTEGA 
 
COMITÉ TUTOR: 
Dr. LEOPOLDO SANTOS ARGUMEDO 
DEPARTAMENTO DE BIOMEDICINA MOLECULAR, CINVESTAV-IPN 
FACULTAD DE MEDICINA 
Dra. MARIA GLORIA SOLDEVILA MELGAREJO 
Dr. ENRIQUE ORTEGA SOTO 
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS 
 
 
 
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2 
 
INDICE 
 
Resumen ................................................................................................................ 4 
Abstract .................................................................................................................. 5 
Introducción ........................................................................................................... 7 
Tránsito vesicular ................................................................................................. 7 
Tipos de vesículas ................................................................................................... 9 
Transporte mediado por la clatrina....................................................................... 9 
Transporte mediado por la caveolina ................................................................. 12 
Participación de las balsas de lípidos en el transporte celular ........................... 13 
Función de las balsas de lípidos en células del sistema inmunitario ................. 17 
Participación del citoesqueleto de actina ........................................................... 18 
Miosinas ............................................................................................................. 19 
Miosinas de clase I ................................................................................................. 22 
Miosinas en el sistema inmunológico ............................................................................ 25 
Miosinas en los linfocitos B........................................................................................ 27 
Regulación de las miosinas ....................................................................................... 28 
Microvellosidades............................................................................................... 29 
Dureza celular .................................................................................................... 33 
Justificación ..................................................................................................... 34 
Hipótesis: .......................................................................................................... 35 
Objetivo general: ............................................................................................ 35 
Objetivos Particulares: ................................................................................................ 35 
Material y métodos ........................................................................................ 36 
Resultados ........................................................................................................ 47 
Expresión y distribución de la Myo1g en los linfocitos B. ................................... 47 
Activación de los linfocitos B del ratón deficiente de la Myo1g. ......................... 49 
Caracterización de las subpoblaciones de bazo en el ratón deficiente de la 
Myo1g. ............................................................................................................... 51 
Tránsito vesicular dependiente de clatrina. ........................................................ 51 
3 
 
La deficiencia de la Myo1g modifica la dureza celular en las células B. ............ 55 
Tránsito vesicular dependiente de caveolina. .................................................... 58 
La Myo1g participa en el reciclamiento de CD44 durante la polarización celular.
 ........................................................................................................................... 80 
Secreción de moléculas de los linfocitos B de ratones deficientes de la Myo1g.93 
Análisis funcional de las células B carentes de la Myo1g. ................................. 95 
Participación de la Myo1g en la topología de la membrana plasmática. .......... 110 
Regulación de la Myo1g en linfocitos B. .......................................................... 120 
La Myo1g está asociada con el MHC-II durante su movilización. .................... 130 
La Myo1g participa en la secreción de los exosomas. ..................................... 136 
Expresión de las miosinas de clase I en los linfocitos B del ratón deficiente de la 
Myo1g. ............................................................................................................. 137 
Discusión ........................................................................................................ 138 
Conclusiones ................................................................................................. 153 
Perspectivas .................................................................................................. 153 
Bibliografía ..................................................................................................... 154 
 
 
 
4 
 
Resumen 
 
La miosina 1g (Myo1g) es un miembro de la familia de las miosinas de clase 
I, se asocia con fosfolípidos de la membrana plasmática, así como con la red de 
filamentos de actina. La Myo1g ha sido descrita en células de origen 
hematopoyético, pero sus funciones celulares son desconocidas. 
En esta tesis, se determinó el papel de la Myo1g en diversos procesos 
celulares de los linfocitos B, que incluyen entre otras a la endocitosis, la fagocitosis, 
la adhesión y la migración celular. Al determinar la localización de la proteína, se 
observó una distribución predominantemente membranal en células en reposo, 
mientras que al activar estas células con LPS mas IL-4, la distribución de la Myo1g 
cambia a una distribución punteada en el interior de la célula, pudiendo ser 
vesículas. Este cambio en el patrón de distribución de la proteína motora, parece 
indicar que la Myo1g participa de manera activa en los procesos celulares antes 
mencionados. Se observó que la deficiencia de la Myo1g cambia el fenotipo de las 
células B, por ejemplo, se determinó que las células carentes de la Myo1g emitían 
prolongaciones membranales de menor tamaño, pudiendo afectar la adhesión y la 
migración celular. 
Por otro lado, se observó que la Myo1g se posiciona de manera importante 
en las microvellosidades de los linfocitos B y que su carencia afecta el tamaño de 
estas microestructuras. Las microvellosidades son estructuras inducibles que se 
hipotetiza funcionan como sitios importantes durante los primeros contactos 
celulares, ya que estas proyecciones membranales aglomeran de manera 
importante a moléculas de adhesión como LFA-1 y CD44. Adicionalmente, también 
se detectó la presencia de la Myo1g en las balsas lipídicas. Estos microdominios 
membranales participan de manera crucial en el transportede moléculas de 
adhesión tales como las integrinas, por lo tanto, al detectar la presencia de la Myo1g 
en estos dominios membranales, aunado al déficit en la emisión de prolongaciones 
5 
 
de la membrana, se analizó el reciclamiento de las moléculas de adhesión, 
especialmente de CD44. Los datos encontrados en este trabajo, demuestran que la 
carencia de la Myo1g provoca un retraso en el transporte de CD44 hacia la 
membrana plasmática en los linfocitos B. 
En otro contexto, se observó que la activación celular mediante LPS e IL-4, 
provoca la fosforilación de la Myo1g, posiblemente causando la activación de esta 
proteína motora. Se observó, mediante la transfección de células A20 con una 
mutante que carece del sitio de fosforilación “TEDS”, que las células A20 se 
redondean. 
Por último, se observó el posicionamiento de la Myo1g en el sitio de contacto 
entre fibronectina y las integrinas, este resultado sugiere que la Myo1g puede estar 
participando en contactos intercelulares como la sinapsis inmunológica. 
En conjunto, los datos presentados en esta tesis sugieren que la Myo1g está 
involucrada en la dinámica del citoesqueleto de actina en los linfocitos B, así como 
en el tránsito vesicular. 
 
Abstract 
 
Myosin 1g (Myo1g) is a family member of the class I myosins, is associated 
with the phospholipids of the plasma membrane and the actin filament network. 
Myo1g has been described in cells of hematopoietic origin, but their cellular functions 
are unknown. 
In this thesis, we investigated the role of Myo1g in several B cell processes, 
including endocytosis, phagocytosis, cell adhesion, cell migration, among others. To 
observe the location of this protein, we detect a predominantly membrane 
distribution in resting cells while LPS plus IL-4 activated B-cells the distribution of 
Myo1g changed to a dotted distribution within the cell, these dots may represent 
6 
 
vesicles. This change in the distribution pattern of the motor protein, suggests that 
Myo1g participates actively in the aforementioned cellular processes. It was 
observed that the deficiency of Myo1g changes the phenotype of B cells, for 
example, it was observed that cells lacking Myo1g emitted smaller microvilli and this 
shortened structures may affect adhesion and cell migration. 
Furthermore, it was observed that the Myo1g is substantially positioned in 
the microvilli of B lymphocytes and its deficiency affects the size of these 
microstructures. The microvilli are inducible structures; it has been hypothesized that 
microvilli function as important sites for the first cell to cell contact since these 
projections agglomerate important adhesion molecules such as LFA-1 and CD44. 
Additionally, the presence of Myo1g was also detected in lipid rafts. These 
membrane microdomains insignificantly participate in the transport of adhesion 
molecules such as integrins and adhesion molecules such as CD44. The results 
from this study show that the lack of Myo1g causes a delay in the transport of CD44 
in B lymphocytes 
Moreover, it was observed that cell activation induces the phosphorylation 
of Myo1g, possibly causing the activation of this motor protein. This observation was 
made though the transfection of A20 cells with a mutant of Myo1g lacking the 
phosphorylation site "TEDS". This transfection causes a round phenotype in cells 
that usually have an elongated morphology. 
Finally, Myo1g was found at the site of contact between fibronectin and 
integrins, this suggests that Myo1g may participate in the intercellular contacts such 
as the immunological synapse. 
Overall, the data presented suggest that Myo1g is involved in actin 
cytoskeleton dynamics in B lymphocytes, as well as in vesicle trafficking. 
 
7 
 
Introducción 
 
Tránsito vesicular 
El tránsito vesicular es un mecanismo complejo que involucra a diferentes 
compartimientos membranales. Estos compartimentos difieren en su composición 
lipídica y proteica, lo que les podría dar la especificidad en su contenido y función 
[1]. La selectividad de este transporte es clave para mantener la organización 
funcional de la célula, por ejemplo, las enzimas lisosomales son transportadas 
específicamente del aparato de Golgi hacia los lisosomas y no hacia la membrana 
plasmática o al retículo endoplásmico [1]. 
Hasta el momento se han descrito diversas moléculas involucradas en el 
transporte vesicular, entre las que tenemos a la clatrina, la caveolina, la dinamina, 
las GTPasas, la sinaptotagmina, la actina, la tubulina, las dineinas, las cinesinas y 
las miosinas, aunque también es importante la composición lipídica y la molécula 
transportada, entre otras [1]. 
El tránsito membranal describe una serie de pasos en los cuales se llevan a 
cabo el transporte de las diversas vesículas en la célula. Para organizar el tránsito 
vesicular se necesitan muchas proteínas reguladoras y accesorias en cada paso de 
este fenómeno. El entendimiento de este proceso es muy complejo y su estudio se 
ha realizado en años recientes, aunque muchas preguntas aún permanecen sin 
respuesta [1]. 
El tránsito vesicular puede dividirse en dos vías generales: la vía endocítica 
y la vía secretora. La vía endocítica comienza cuando las moléculas son tomadas 
fuera de la membrana plasmática y transportadas hacia el interior de la célula, por 
otro lado, la vía secretora comienza cuando las proteínas y los lípidos producidos 
por la célula, en el retículo endoplásmico, son movilizadas hacia el exterior de la 
célula (Figura 1). 
8 
 
 
 
Figura 1.- Esquema de la vía endocítica y exocitica llevada a cabo en una célula eucarionte. 
Se observan las diferentes etapas del tránsito vesicular. Tomada de Tokarev A, Alfonso A 
and Segev N, 2009, Overview of Intracellular Compartments and Trafficking 
Pathways, Landes Bioscience and Springer Science. 
 
Las vesículas “secretadas” del retículo endoplásmico llegan al aparato de 
Golgi, lugar donde son modificadas y “divididas”. El aparato de Golgi está dividido 
en sub-compartimentos funcionales denominados Cis, medial y trans-Golgi [2]. 
 
9 
 
Tipos de vesículas 
Hasta el momento se han descrito diversas vías de transporte celular, entre 
las que tenemos a las dependientes de la clatrina, de la caveolina o a las vesículas 
desnudas, etc. Para el entendimiento del tránsito vesicular es necesario saber cómo 
se genera una vesícula, para lo cual tomaremos como ejemplo la formación de la 
vesícula recubierta con clatrina. 
 
Transporte mediado por la clatrina 
La generación de una vesícula de transporte conlleva el ensamblaje de una 
cubierta especial en la cara citosólica de la membrana que genera la vesícula. Estas 
cubiertas actúan como un dispositivo que succiona la membrana rica en ciertas 
proteínas y pobre en otras hacia afuera de la membrana, así las proteínas pueden 
ser transportadas de forma específica a otro compartimiento [3]. La mayoría de las 
vesículas de transporte se forman a partir de regiones recubiertas de la membrana, 
por lo que generan vesículas revestidas de una red de proteínas distintas de las que 
recubren la superficie citosólica [4]. Antes de que la vesícula se fusione con la 
membrana receptora, este recubrimiento debe eliminarse para permitir que las dos 
membranas interaccionen directamente [5]. 
Las vesículas revestidas de clatrina (proteína mayoritaria del recubrimiento) 
más un complejo adaptador se generan en la membrana plasmática y en el último 
saco del aparato de Golgi [4]. Las vesículas carentes de clatrina intervienen en el 
transporte de moléculas del retículo endoplásmico hacia el aparato de Golgi y entre 
las distintas cisternas de este último. Las vesículas revestidas de clatrina median el 
transporte selectivo de receptores transmembranales, como el receptor M6P 
(manosa-6-fosfato) desde la red del trans Golgi, o el receptor de LDL (lipoproteína 
de baja densidad) desde la membranaplasmática, ambos con su respectivo ligando, 
quedando en el interior de la vesícula [3, 4]. Las vesículas revestidas de coatómero 
– complejo proteico, formado por una gran diversidad de proteínas, entre las que 
10 
 
tenemos a las proteínas COPI y COPII [6]- , por el contrario, median el transporte 
vesicular no selectivo desde el retículo endoplásmico y las cisternas del Golgi [3]. 
Con relación al sistema inmunológico se ha descrito principalmente que la 
fagocitosis, internalización de receptores Fc [2, 7], BCR [8], receptor de transferrina 
[9] se da vía dependiente de la clatrina. 
La clatrina es una proteína formada por tres cadenas pesadas y tres cadenas 
ligeras formando una estructura denominada trisquelión, este complejo es muy 
conservado [3]. Las cadenas ligeras interactúan con las cadenas pesadas en la 
región amino terminal. La unión de estas cadenas a diferentes complejos o 
trisqueliones forman una estructura muy compleja, parecida a una cesta. La función 
principal de esta proteína es recubrir a los endosomas durante el transporte celular, 
este proceso tiene cuatro etapas: la formación, el ensamblaje, la liberación y el 
desnudamiento. Los trisqueliones unidos a la membrana provocan la invaginaron 
de esta zona dando lugar a la formación del endosoma. Cuando se produce la 
“gemación” de la vesícula, la clatrina se separa de la membrana mediante la acción 
de la dinamina [4, 10]. 
Una vez que esta vesícula se encuentra libre de los endosomas, esta se 
acopla a otros compartimentos membranosos, por ejemplo, a los endosomas 
tardíos. Se ha determinado que la GTPasa ARF participa en el desacople de la 
clatrina además de otras proteínas como la HSP70, pero este proceso aún necesita 
ser estudiado con mayor detalle [4]. 
La clatrina no actúa sola. Como se definió anteriormente, existen moléculas 
adaptadoras, una de estas es la proteína AP2. Esta proteína necesaria para el 
revestimiento de la clatrina a la membrana [4]. Las vesículas recién formadas no 
son iguales entre sí, existen diferencias dependiendo de la molécula receptora y el 
ligando de esta; por ejemplo, se ha demostrado que algunas vesículas participan en 
el tránsito desde el aparato de Golgi hasta los endosomas tardíos, siendo ricas en 
receptores de M6P, mientras que otras participan en la movilización de endosomas 
11 
 
de la membrana plasmática hacia los endosomas tempranos, siendo ricas en 
receptores para LDL [3]. Aunque el recubrimiento proteico es similar, se ha 
demostrado que en cada tipo de vesículas existen diferencias en las proteínas 
adaptadoras, dando selectividad al proceso [3]. 
Existe un modelo de formación de las vesículas, el cual comienza con el 
ensamblaje (en cadena) de subunidades citosólicas de una proteína de cubierta a 
una porción de la membrana donadora, conduciendo a la formación de una vesícula 
cubierta fuera de la membrana [3]. 
El siguiente paso es el incremento de la velocidad de ensamblaje, esto 
sucede cuando la GTPasa ARF se une al complejo de ensamblaje. El cambio 
conformacional en la GTPasa - dado por la unión del GTP - permite que la proteína 
exponga la cola lipídica. Esta se inserta en la bicapa lipídica de la membrana 
donadora. Una vez unida a la membrana, la ARF recluta proteínas para el ensamble 
de la cubierta, resultando en la formación de una vesícula [10]. 
 En el caso de las cubiertas de clatrina, en este paso, se produce la 
interacción específica del grupo adaptador con receptores agrupados en 
determinados lugares de la membrana, formando la capa íntima de la cubierta, 
sobre la cual se ensamblan las subunidades de clatrina [4, 5]. 
Posteriormente, esta vesícula se desprende por la acción de la GTPasa 
dinamina (se cree que actúa como un anillo que estrangula la zona de unión de la 
vesícula a la membrana dejando la vesícula libre) en las cubiertas de clatrina [5]. El 
siguiente paso es la inactivación de la GTPasa ARF al hidrolizarse el GTP unido, 
por acción de una GAP (GTPasa activating protein), esta inactivación produce la 
disociación de las cubiertas [5]. 
Los trisqueliones de clatrina son subsecuentemente liberados de las 
vesículas. Se piensa que esta reacción es catalizada por una proteína chaperona 
citosólica de la familia Hsp70, este fenómeno es dependiente de ATP. Finalmente 
12 
 
las cubiertas proteicas son rápidamente disociadas, dejando la vesícula preparada 
para la fusión con la membrana receptora específica [4]. 
 En los últimos años se ha avanzado mucho en el conocimiento de los 
mecanismos moleculares que median la formación de proteínas de cubierta, pero 
todavía no se ha podido dilucidar el sistema complejo que utiliza una célula 
eucariótica para tomar la decisión correcta en cuanto al destino de la carga que 
transporta una vesícula. 
 
Transporte mediado por la caveolina 
En años recientes se ha demostrado que la vía dependiente de la caveolina 
participa en la endocitosis de las integrinas [11, 12] como LFA-1 [13, 14] y moléculas 
asociadas a las balsas de lípidos [15] como MHC-II [16, 17], CD55, CD59 [18], CD44 
[19], CD25 [20]. 
Este tipo de tránsito dependiente de caveolina se lleva a cabo en vesículas 
denominadas caveolas. Las caveolas fueron identificadas originalmente como 
invaginaciones de la membrana plasmática en las células endoteliales y epiteliales 
con un tamaño de 50-100 nm [21]. Las caveolas, además, se pueden fusionar para 
formar estructuras tipo racimo y túbulos con tamaños significativamente más 
grandes de 100 nm. Las caveolas son abundantes en el endotelio, en células 
musculares, en adipocitos y en células epiteliales del pulmón [22, 23]. 
Las caveolinas son una familia de proteínas integrales de membrana de 21-
25 kDa. Se conocen tres genes de caveolina. Las caveolinas 1 y 2 se expresan 
ubicuamente, mientras que la expresión de caveolina 3 es específica de células 
musculares y astrocitos [22, 23]. 
La caveolina une colesterol directamente, lo que estabiliza la formación de 
complejos de homo-oligómeros. Las balsas de lípidos están muy enriquecidas en 
colesterol, por lo tanto, es muy probable que la caveolina se asocie a estos 
13 
 
microdominios para formar las caveolas a través de su interacción directa con el 
colesterol. Los homo-oligómeros de caveolina podrían interaccionar unos con otros 
dentro de las balsas de lípidos para formar las invaginaciones de los dominios de 
membrana que podemos ver como las caveolas [24]. 
Las caveolas son muy parecidas a las balsas de lípidos, tanto en su 
composición como en sus propiedades bioquímicas. De hecho, las caveolas se 
pueden definir como balsas de lípidos que contienen a la proteína caveolina [22]. 
Se ha visto que los complejos toxina del colera-GM1 se internalizan en la 
célula mediante un proceso de endocitosis mediado por caveolas, siendo además 
un proceso de endocitosis completamente diferente al mediado por las vesículas 
cubiertas de clatrina [25]. La caveolina-1, como se describe anteriormente, une 
colesterol y se piensa que está implicada en transportar colesterol desde el retículo 
endoplásmico a la membrana plasmática [11, 26]. 
La caveolina presenta un dominio de andamiaje, por el que interacciona 
directamente con las proteínas señalizadoras, como las cinasas de la familia Src 
[27], la oxido nítrico sintasa [28], receptores de diversos factores de crecimiento [24]. 
La unión de un ligando, como el factor de crecimiento a su receptor, induce la 
dimerización del receptor, desencadenando una cascada de señalización de las 
MAP cinasas que promueve, en última instancia, la proliferación celular [22]. 
Recientemente, se ha sugerido que las balsas de lípidos podrían ser 
importantes en el transporte dentro de la ruta endocítica tanto de lípidos, como de 
proteínas ancladas por GPI [29]. 
 
Participación de las balsas de lípidos en el transporte celular 
La membrana plasmática se compone principalmente de esfingolípidos,fosfolípidos y colesterol. Estos lípidos tienen diferente grado de compactación lo que 
posiblemente permite la segregación de las diferentes fases en la bicapa de lípidos, 
14 
 
lo que lleva a cabo la formación de microdominios de esfingolípidos que “flotan” en 
la bicapa. De esta forma se acuño el término de balsas de lípidos [30]. 
 El origen de este concepto se comenzó a dilucidar con el descubrimiento la 
formación de agregados de glicoesfingolípidos en el aparato de Golgi antes de ser 
enviados a la región apical de células epiteliales. Además de que la membrana 
apical de las células epiteliales está enriquecida en glicolípidos y colesterol [30]. 
En años recientes se ha acordado que las balsas de lípidos poseen un 
tamaño de entre 10 y 200 nm, son heterogéneas, altamente dinámicas, enriquecidas 
en colesterol y esfingolípidos, y que además permiten compartamentalizar diversos 
procesos celulares [31]. 
El modelo basado en las balsas de lípidos postula que el mecanismo de 
transporte apical está fundamentado en las interacciones lípido-lípido y lípido-
proteína que tienen lugar en microdominios específicos con un contenido elevado 
en glicolípidos y colesterol [31]. 
De esta forma, los glicoesfingolípidos se asocian y forman agrupamientos en 
las membranas de la red del trans-Golgi, donde podrían actuar como plataformas 
para la inclusión de proteínas “carga”, destinadas a ser transportadas a la 
membrana apical, mientras que las proteínas con destino a la membrana basolateral 
serían excluidas. Estos lípidos y proteínas, podrían ensamblarse junto con proteínas 
accesorias en la cara citoplásmica de la región trans del aparato de Golgi, para 
formar un subdominio capaz de formar vesículas que engloben la maquinaria 
necesaria para asegurar una distribución específica a la membrana apical [31]. 
Las proteínas basolaterales, cuyo transporte está basado en interacciones 
proteína-proteína, no son capaces de acceder a estos dominios y son excluidas 
específicamente de las vesículas de transporte apical [31]. 
Todo esto se lleva a cabo en células polarizadas, pero en células no 
polarizadas, como los linfocitos, el tránsito de las moléculas puede llevarse a cabo 
mediante un transporte directo, por ejemplo, la interacción de los linfocitos B 
15 
 
(actuando como células presentadoras de antígeno) y las células T promueve la 
concentración de moléculas especificas hacia el sitio de la interfase entre estas dos 
células (llamado sinapsis inmunológica). Esta interacción promueve un transporte 
específico hacia el sitio de contacto, por ejemplo, la secreción de IL-2 e IFN-γ por 
los linfocitos T CD4+ o la perforina y la granzima por las células T CD8+ está dirigida 
hacia el sitio de la sinapsis inmunológica [32, 33]. 
La membrana apical podría representar un gran microdominio lipídico de 
balsas de lípidos, donde los dominios forman agrupaciones aisladas [34]. El criterio 
principal para determinar si una proteína se asocia específicamente a las balsas de 
lípidos es analizar su resistencia a ser solubilizada por detergentes no iónicos 
suaves como el Tritón X-100. El análisis de las proteínas inmersas en las balsas de 
lípidos con detergentes no iónicos intermedios, como el octil-glucósido, permite 
diferenciar a las proteínas presentes en las balsas de lípidos de proteínas asociadas 
al citoesqueleto, que son siempre insolubles. En primer lugar, es importante 
diferenciar las proteínas que son transportadas unidireccionalmente por las balsas 
de lípidos, es decir, proteínas “carga”, de aquellas que estarían formando parte de 
la maquinaria de transporte mediada por las balsas de lípidos, circulando entre la 
región trans y la membrana plasmática [34]. 
Para identificar las proteínas que formaban parte de la maquinaria de 
transporte, se aislaron vesículas de células MDCK destinadas a la superficie apical 
[35]. El análisis de estas vesículas definió una serie de candidatos posibles que 
podrían formar parte de dicha maquinaria, donde se observó que la caveolina es la 
proteína asociada a las balsas de lípidos mejor caracterizada [35]. 
 Se ha demostrado que las proteínas sintaxina 3 y TIVAMP están asociadas 
a las balsas de lípidos en células MDCK, pareciendo indicar que estas proteínas 
son parte de la maquinaria de transporte de las balsas de lípidos [36]. De igual 
forma, el proteolípido MAL también se asocia específicamente a las balsas de 
lípidos de células epiteliales polarizadas y de linfocitos T [23, 37, 38]. De hecho, 
16 
 
MAL es la única proteína asociada a las balsas de lípidos que se ha demostrado 
que tiene una función esencial como componente de la maquinaria para el 
transporte apical de proteínas secretadas y de membrana en las células epiteliales 
[39-41]. 
El número de proteínas carga descubiertas, que se asocian a las balsas de 
lípidos, se ha incrementado extraordinariamente en los últimos años. En general, 
las proteínas carga tienen tendencia a asociarse a las balsas de lípidos y las 
proteínas que están ancladas a la membrana, en la cara exoplásmica o 
citoplásmica, por cadenas aciladas saturadas [40]. 
Las proteínas ancladas por GPI están unidas a la cara exterior de la 
membrana por el grupo glicosilfosfatidilinositol con dos o mas cadenas de ácidos 
grasos saturados [42], mientras que la familia de tirosina cinasas Src doblemente 
aciladas, se une a la cara citoplásmica de las membranas de las balsas de lípidos 
[43]. Hasta el momento, son pocas las proteínas transmembranales cuya asociación 
a las balsas de lípidos ha sido demostrada bioquímicamente. Las proteínas 
hemaglutinina y neuraminidasa del virus influenza, ampliamente utilizadas como 
modelo de transporte en células polarizadas, son proteínas transmembranales 
asociadas a las balsas de lípidos [43]. 
Se han descrito pocas proteínas secretadas (prolactina y TNF-α) [40, 44, 45], 
que se asocien de forma específica a las balsas de lípidos, durante el proceso de 
exocitosis. 
Es posible que las proteínas solubles que se secretan apicalmente en las 
células epiteliales polarizadas, sean transportadas en el interior de las vesículas de 
balsas de lípidos que, supuestamente, median el transporte a la membrana apical. 
El proceso de aislamiento de balsas de lípidos, con o sin detergentes, podría destruir 
la integridad de estas vesículas, liberando su contenido y, de esta forma, destruir la 
asociación [46]. 
17 
 
Aun así, se ha visto que la tiroglobulina se asocia específicamente a estos 
dominios durante su transporte apical por la vía exocitica [46]. Es posible que la 
interacción de ésta y otras proteínas con las balsas de lípidos se produzca por su 
asociación a un receptor de membrana que esté específicamente incorporado en 
estos microdominios, como ocurre con la proteína carboxipeptidasa E [47]. 
 
Función de las balsas de lípidos en células del sistema 
inmunitario 
Se ha observado que las balsas de lípidos desempeñan una función esencial 
en los procesos de señalización a través de los receptores de membrana, en 
particular, con los receptores de las células del sistema inmunitario. Estos 
receptores inician el reclutamiento de ma 
s subunidades señalizadoras y de ensamblaje, formando un complejo 
supramolecular que regula la transducción de las señales [48]. En esta región 
también residen constitutivamente algunos correceptores como CD8 y CD4, 
subunidades de transducción del tipo tirosina cinasa como Lyn, Lck y Fyn. Por tanto, 
en la mayoría de los procesos y dependiendo del estado de activación celular, es 
en estos dominios donde el complejo multimérico de transducción es ensamblado y 
desde donde se produce la señalización [48]. 
Por otro lado, también se ha visto la participación de estos microdominios en 
la maduración de los linfocitos [49, 50], en la diferenciación de las células mieloides 
y linfoides [51], en la función efectora de las células NK [52], en la activaciónde las 
células cebadas [53], etc. 
En los linfocitos T se ha descrito que algunos de los componentes 
mayoritarios de estos microdominios poseen capacidad coestimuladora. La 
oligomerización de proteínas ancladas por GPI como CD59 o CD48 con anticuerpos 
entrecruzantes, o de uno de los glicolípidos mayoritarios de estos dominios, el 
gangliósido GM1, con la subunidad B de la toxina colérica, promueve un aumento 
18 
 
de la fosforilación en tirosina en presencia de cantidades subóptimas de anticuerpos 
α-CD3 en linfocitos T [54]. En relación a los linfocitos B, se ha visto que estas balsas 
funcionan como plataformas de señalización vía BCR [55] y para la aglomeración 
de moléculas del MHC-II [56]. 
Esta capacidad coestimuladora de los componentes mayoritarios de las 
balsas de lípidos ha aumentado notablemente el interés por conocer la organización 
de las balsas de lípidos en la superficie de la célula. Aunque CD59 y GM1 se 
encuentran en las mismas fracciones insolubles, el análisis de su distribución en la 
superficie celular, su cinética de internalización en respuesta a la oligomerización y 
la ausencia de comodulación de una molécula sobre la otra, revela un agrupamiento 
en dominios diferentes [56]. 
Por otra parte, estos dominios coestimuladores carecen por sí mismos de la 
capacidad para reclutar el TCR en los microdominios y es necesaria la agregación 
del receptor para que este proceso tenga lugar [57]. En los linfocitos T, todo el 
ensamblaje supramolecular que se forma en torno al receptor cuando reconoce un 
antígeno presentado por una APC, ha sido denominado sinapsis inmunológica [52, 
58] mencionada anteriormente. 
 
Participación del citoesqueleto de actina 
El citoesqueleto de actina es otro elemento que participa en el tránsito 
vesicular. El reclutamiento del TCR en los microdominios es dependiente de un 
citoesqueleto de actina funcional, puesto que puede ser bloqueado con el inhibidor 
de la polimerización de actina, la citocalasina D [57]. La coestimulación con 
anticuerpos frente a la proteína anclada por GPI (CD48) incrementa a su vez la 
asociación al citoesqueleto de actina [59]. 
La reorganización del citoesqueleto y su acoplamiento al complejo del TCR 
estimulado, está regulada por Rho GTPasas como Rac1, CDC42 o RhoA, o por 
proteínas intercambiadoras de GTP de la familia Rho como Vav1. La proteína 
19 
 
adaptadora Cbl-b no sólo regula negativamente la fosforilación de Vav1 y la 
redistribución de la actina promovida por la estimulación del TCR [60], sino también 
la segregación del receptor en las balsas de lípidos, lo que indica la existencia de 
una relación directa entre ambos sucesos [57]. 
Otras proteínas involucradas en la movilización de las balsas son las 
miosinas, se ha visto que al inhibir su función se ve alterada la movilización de estos 
microdominios o de proteínas reclutadas, como CD3 en el caso de los linfocitos T 
[61]. Pero este proceso no está regulado por miosinas de clase II, ya que al usar un 
inhibidor especifico de estas miosinas, no se observó la inhibición de este proceso, 
por lo tanto, se piensa que podrían ser otras proteínas motoras, como las miosinas 
de clase I, (por ejemplo la Myo1c la cual al ser inhibida con tecnología de RNA de 
interferencia se observó un desbalance en la movilización de las balsas de lípidos) 
[62]. 
 
Miosinas 
Las miosinas son una familia de proteínas que se caracterizan por su 
capacidad de unión a la actina filamentosa; estas proteínas poseen actividad de 
ATPasa, la cual les permite acoplar la hidrólisis del ATP con cambios 
conformacionales. Estos cambios permiten su desplazamiento a lo largo de los 
microfilamentos del citoesqueleto, al tener esta función, se les denominan proteínas 
motoras [63-65]. 
De manera general, las miosinas son proteínas multiméricas formadas por 
una o varias cadenas pesadas. La región del amino terminal de estas cadenas forma 
una cabeza globular a la cual se asocian dos o más cadenas ligeras. Los dominios 
carboxilo terminal de las cadenas pesadas son alfa hélices enrolladas entre ellas 
formando un bastón de diversas longitudes, al que se ha llamado “cola” o “cauda”. 
La molécula de miosina contiene dos regiones flexibles; hay una “bisagra” entre la 
20 
 
región de la cola y la cabeza globular de la molécula y una pequeña porción lineal 
muy cerca de la bisagra (Figura 2) [66]. 
 
Figura 2.- Diagrama esquemático de una miosina.- En la región amino terminal de las 2 cadenas pesadas se 
muestra la cabeza globular y las cadenas ligeras asociadas a ella. Las primeras se entrelazan para formar una 
doble hélice y tienen dos regiones flexibles o de bisagra. Tomada de (64). 
 
La cabeza es el dominio más conservado de las moléculas de miosina y es 
la región con afinidad para la actina y el ATP, por lo tanto, la cabeza de las miosinas 
es la parte involucrada en la conversión de la energía química del ATP en energía 
mecánica, transducida en movimiento por el filamento de actina [67]. 
Entre la cabeza y la cola se encuentra el dominio llamado cuello, formado a 
su vez por un número variable de dominios entre los que se encuentra el conocido 
como motivo IQ caracterizado por una secuencia de aproximadamente 14 
aminoácidos con la repetición IQxxxRGxxxRxxY (I- isoleucina; Q-glutamina). A esta 
región se asocian diversos tipos de cadenas ligeras, con funciones ya sean 
21 
 
estructurales o reguladoras. Entre éstas se encuentra la proteína calmodulina. El 
dominio de la cola posee la mayor diversidad de entre todas las clases de miosinas. 
Sirve para anclar a la molécula y para interaccionar con: 1) otras proteínas, 2) 
membranas o vesículas, 3) moléculas cargadas eléctricamente o 4) para formar 
filamentos en el músculo [67]. 
Hasta el momento se han descrito 37 clases de miosinas, entre las que 
tenemos a las miosinas de clase I [68-70]. En la figura tres se observan diferentes 
clases de miosinas presentes en los leucocitos, esquematizando sus diferentes 
dominios. 
 
22 
 
 
Figura 3.- Esquema general de las miosinas presentes en los leucocitos, se observan los 
dominios principales de las miosinas, entre los que tenemos al dominio TH1, el dominio motor, y 
algunos otros dominios que presentan esta familia de proteínas como el dominio ¨coil-coil¨, el dominio 
SH3, el dominio FERM, dominios PH entre otros. Tomada de (76) 
 
Miosinas de clase I 
 
Las miosinas de clase I constan de una sola cadena pesada con el dominio 
motor ubicado en el extremo amino-terminal de la molécula; en la región del cuello 
existen varios dominios IQ y en la región de la cola encontramos siempre un dominio 
23 
 
TH1, que se caracteriza por una secuencia rica en aminoácidos básicos. Esta clase 
de proteínas puede ser subdividida en dos grupos: las miosinas de cola corta y las 
de cola larga; estas últimas poseen adicionalmente un dominio TH2 (con una 
secuencia rica en prolinas) y la región TH3 que corresponde a un dominio SH3 
(dominio de homología a Src, que permite interacción con dominios ricos en prolina) 
[61, 70]. 
Las miosinas de clase I se relacionan con varios procesos como la 
endocitosis, la secreción, la adhesión, la motilidad celular [71], el mantenimiento de 
la tensión membranal en linfocitos [72, 73] y el tránsito vesicular [74-78]. En 
Dictyostelium se ha demostrado que estas miosinas pueden actuar en conjunto o 
tener funciones superpuestas. Por ejemplo, procesos como la macropinocitosis y la 
fagocitosis se ven alterados en células que no expresan a las miosinas de clase I 
[79], otra función que se ha visto asociada es la migración defectuosa de los 
neutrófilos carentes de la miosina 1f, lo que favorece la infección con patógenos 
tales como Listeria monocytogenes [70], por otro lado, se ha visto la participación 
de la miosina 1c durante el proceso de la sinapsis inmunológica en los linfocitos B 
[80]. 
Existen ocho miosinas de clase I, que vandesde la miosina 1a hasta la 
miosina 1h en mamíferos [67]. La miosina 1g (Myo1g) es la más expresada en 
linfocitos T, se localiza principalmente en la membrana plasmática gracias a su 
dominio PH-like (homologo a pleckstrina) [81], presente en el dominio del tallo, 
donde se ha visto su participación en el mantenimiento de la tensión membranal 
[73]. 
Se ha demostrado que la Myo1g se une al fosfatidilinositol 3,4 bifosfato [81] 
y a fosfatidilinositol 3,4,5 trifosfato [82], teniendo posibles funciones en el anclaje a 
la membrana o en el transporte vesicular, ya que los endosomas tienen una 
concentración rica de estos fosfolípidos en su composición [83-87]. Por ejemplo, se 
ha detectado la presencia de la Myo1g en la región de las balsas de lípidos en los 
24 
 
endosomas tardíos de las células BHK [88], en la región de las balsas de lípidos en 
los neutrófilos [89], en los linfocitos B humanos y en la línea celular Raji [90], además 
de los endosomas que contienen balsas de lípidos en los linfocitos T humanos [91], 
en los lisosomas en células epiteliales de cáncer de glándula mamaria (MCF7a) 
[92], en los exosomas secretados de los linfocitos T estimulados con PHA e IL-2 
[93, 94] y de exosomas de timo humano [95]. 
También se ha demostrado la presencia de la Myo1g en viriones de VIH 
liberados de células THP-1, previamente estimuladas con LPS [96], en los 
exosomas secretados de esta misma línea celular estimulada con LPS [97], y de 
macrófagos murinos (J774) infectados con Leishmania mexicana [98]; por otro lado, 
también ha sido detectada en las microvesículas de neutrófilos humanos [99], en 
exosomas de linfocitos B estimulados, en posible asociación con MHC-II [100], pero 
también en exosomas de células B infectadas con EBV y el virus asociado al 
sarcoma de Kaposi [101], en exosomas de cáncer pulmonar [102], exosomas de 
cáncer colon-rectal [103], y de exosomas procedentes de tejido urinario [104]. 
La presencia de la Myo1g en todos estos tipos de vesículas sugiere un papel 
estructural importante para diversos tipos celulares, aunque aún no se conoce un 
papel exacto de la proteína en este proceso. 
Otros ejemplos de miosinas de clase I involucradas en el tránsito vesicular 
son la Myo1a, la Myo1d, la Myo1c, la Myo1e, la Myo1b. La Myo1d está implicada 
en el tránsito de diferentes poblaciones de vesículas en las neuronas [105] y en los 
endosomas tempranos en células MDCK [69]; la Myo1e en la secreción de las 
vesículas en los oocitos de Xenopus laevis [78]; la Myo1c en el transporte de Glut4 
en los adipocitos [75, 77] y de la Myo1b en el transporte de los endosomas 
multivesiculares [71]. Recientemente se ha demostrado la participación de la Myo1c 
en la movilización de VEFGR en el interior de la célula, afectando la migración y 
proliferación de las células endoteliales [106], por otro lado, se ha demostrado que 
la Myo1a participa activamente en el transporte de las moléculas hacia las 
25 
 
microvellosidades en las células epiteliales [107], moléculas como la maltasa y la 
sacarosa isomaltasa y de la molécula CFTR en enterocitos de intestino delgado de 
ratón [108]. 
 
Miosinas en el sistema inmunológico 
Hasta la fecha se han descrito diversas miosinas participantes en funciones 
inmunológicas. En relación a las miosinas de clase I, la Myo1f tiene un papel 
importante en la migración de los neutrófilos. Los neutrófilos carentes de esta 
miosina mostraron una reducción en la migración, debido a una movilización 
disminuida de las integrinas hacia el pseudópodo, además de que la pérdida de esta 
miosina los hacía más susceptibles a la infección por L. monocytogenes [70], por 
otro lado, se ha visto que existe interacción entre la Myo1c y la proteína NEMO en 
los adipocitos 3T3-L1, durante el tratamiento con insulina [109]. 
Las miosinas de clase II han sido estudiadas ampliamente, por ejemplo, se 
ha determinado la participación de la miosina no convencional de clase II, MyoIIA, 
en la migración de linfocitos T y B [110], segregación de receptores y el 
mantenimiento de la sinapsis inmunológica [111]. También se ha determinado que 
esta miosina participa en la desgranulación de las células NK, esto se demostró 
tratando células con RNA de interferencia específico para esta miosina, las células 
transfectadas con el RNA de interferencia son capaces de establecer el contacto 
con la célula blanco, pero la célula NK no desgranula, provocando una disminución 
en la actividad citolítica de estas células [112, 113]. 
Las miosinas de clase II también contribuyen en la movilización de moléculas 
hacia el sitio de la sinapsis inmunológica, por ejemplo, MyoIIA participa en la 
maduración de esta estructura, la inhibición de esta miosina por siRNA en linfocitos 
T muestra que estas células incrementan la emisión de prolongaciones de 
membrana (“spreading”), sin embargo, estas células no son capaces de ensamblar 
26 
 
el SMAC central y periférico, adicionalmente, estas células exhiben un decremento 
en la fosforilación de la cinasa SRC y Cas-L [96, 111]. 
Otra función de la MyoIIA es el tráfico del complejo del MHC-II-CD74 en la 
superficie de los linfocitos B [114]. También se ha demostrado que la MyoIIA 
participa en la migración de los linfocitos B bajo el estímulo de CXCL13 [115]. 
En el caso de la migración de los linfocitos T se ha visto que las células 
presentan cúmulos o “clusters” de MyoIIA, que son originados en un polo de la 
célula, estos cúmulos de MyoIIA se mueven del urópodo hacia el pseudópodo de 
las células T, sugiriendo un papel de posicionamiento de las integrinas durante la 
migración linfocitaria mediada por quimiocinas [116]; recientemente se ha visto que 
esta miosina también interacciona con receptores de quimiocinas como CXCR4 y 
con las moléculas de adhesión [111]. 
Por otro lado, también se ha visto la participación de la MyoIIA en la formación 
y el mantenimiento de la sinapsis inmunológica. La participación de esta miosina se 
evaluó, usando beblistatina, un inhibidor especifico de esta miosina, los linfocitos T 
tratados muestran una disminución en la formación de conjugados entre los 
linfocitos T y las células presentadoras de antígeno [110]. 
Se ha demostrado que las plaquetas que pierden la función de MyoIIA tienen 
una disminución en la desgranulación y en la adhesión hacia proteínas de matriz 
extracelular [117]. Por último, se ha demostrado que la MyoIIA, se asocia al receptor 
scavenger P2X7, para la fagocitosis de células apoptóticas mediada por los 
monocitos [118]. 
En relación a las miosinas de clase V se ha visto la participación de la MyoVa 
en la migración de las células Jurkat, debido a la movilización o al posicionamiento 
de esta miosina en el polo migratorio [119]. Otra miosina involucrada en la migración 
es la MyoIXb, esto se observó cuantificando la cantidad de monocitos reclutados al 
peritoneo de ratones carentes en esta proteína mediante un estímulo inflamatorio 
[120]. Otra función de la MyoVa es la movilización de los fagosomas en los 
27 
 
macrófagos peritoneales de ratones; mutaciones en esta miosina determinan que la 
movilización de estas vesículas es más rápida en comparación con las vesículas en 
los macrófagos de los ratones silvestres [121]. Por otro lado, se ha demostrado que 
la MyoVIIa está involucrada en la fagocitosis de E. coli en las células dendríticas, 
las mutaciones en esta miosina muestran una incipiente formación de la copa 
fagocítica en los macrófagos [122]. 
 
Miosinas en los linfocitos B 
Hasta la fecha se han descrito algunas funciones celulares de las miosinas 
en los linfocitos B, como en la movilización del BCR hacia los lisosomas por la 
MyoIIA y la disminución en la expresión de esta proteína afecta la presentación 
antigénica [123]. 
Una de las funciones principales de los linfocitos B activados es la 
presentación antigénica a los linfocitos T, para recibir coestimulación (víacitocinas 
y otras moléculas). Esta presentación antigénica es llevada a cabo en la sinapsis 
inmunológica, donde se movilizan diversas proteínas como MHC-II [124] y 
moléculas de adhesión [125]. 
Dentro de esta interfase se describen tres zonas, denominadas complejo de 
activación supramolecular (SMAC) [126], estas regiones son definidas por la 
distribución de proteínas en estas regiones en la sinapsis inmunológica, por 
ejemplo, se determinó la presencia de TCR, MHC [126, 127], CD28 [128] y otras 
moléculas coestimuladoras [129], entre otras, en el SMAC central; otra región es la 
SMAC periférico, en esta zona se concentran moléculas de adhesión como LFA-1 
[127] e ICAM-1 [130], y el SMAC distal, el cual aglomera moléculas como CD45, 
otra molécula movilizada hacia la sinapsis inmunológica es CD44, pero aún no se 
conoce exactamente su localización [131]. 
Recientemente, se evaluó la participación de la Myo18a en el mantenimiento 
de la difusión lateral del BCR, esto se debe a la unión de esta miosina con ezrina, 
28 
 
que mantiene al BCR restringido en zonas específicas, esta unión permite una 
adecuada señalización después de la estimulación del BCR [132]. Por otro lado, en 
el año 2005, se demostró que la Myo1e es un blanco de la tirosina cinasa de Bruton 
(BTK) [133]. 
Datos de nuestro laboratorio demuestran la participación de la MyoIIA y de la 
Myo1c en el “spreading” de los linfocitos B [134], y la participación de esta última en 
el mantenimiento de la sinapsis inmunológica entre los linfocitos B y los linfocitos T 
[80]. 
 
Regulación de las miosinas 
La mayor parte del conocimiento de la regulación de las miosinas deriva del 
estudio de las miosinas de clase II y clase V en vertebrados o de las miosinas de 
clase I en organismos como Acanthamoeba y Dictyostelium. Es relativamente 
conocido que la regulación de estas moléculas es dependiente de calcio y de las 
fosforilaciones en diversas regiones de la proteína; de hecho, se conoce que las 
miosinas de clase II no convencionales y las miosinas de clase V son reguladas 
mediante calcio y fosforilaciones, mientras que las miosinas de clase II 
convencionales o musculares son reguladas solamente por la concentración de 
calcio [135, 136]. 
Las fosforilaciones llevadas a cabo en las miosinas, se llevan a cabo en una 
región denominada sitio TEDS [137]. En este sitio existen residuos conservados 
(glutamato o aspartato), lo cual provoca la activación constitutiva de la proteína, sin 
embargo, modificaciones en este sitio (serina o treonina), provocan la regulación de 
la proteína [138]. 
En relación a las miosinas de clase I se sabe mediante modelos de 
Acanthamoeba y Dictyostelium, son reguladas por la fosforilación de la cadena 
pesada, siendo esta fosforilación dependiente de calcio, esta modificación conlleva 
a la activación de la ATPasa [135, 136]. En Acanthamoeba, la fosforilación de la 
29 
 
Myo1c, incrementa de 15 a 20 veces la actividad motora de la proteína [138], esto 
se descubrió en diversos trabajos donde observan que las fosforilaciones en 
residuos de serina y treonina son necesarias para la motilidad de Acanthamoeba, 
aunado al incremento en la presencia de las miosinas fosforiladas en pseudopodos 
y en las copas fagocíticas, en relación a las miosinas no fosforiladas. Por otro lado, 
se ha demostrado que esta fosforilación altera la conformación de la proteína 
cuando se asocia a la actina filamentosa, incrementando el rango de liberación de 
Pi de la ATPasa [135, 136]. 
En vertebrados se ha descrito, que la Myo1a en presencia de calcio se 
disocia parcialmente de la cadena ligera provocando un incremento en la actividad 
de la ATPasa [139]; con respecto a la Myo1c, se ha observado que la presencia de 
calcio intracelular conlleva a cambios conformacionales en la proteína [140], estos 
cambios provocan la unión entre la Myo1c y vesículas en células del oído interno 
[141]. Estos datos llevan a pensar que la presencia del calcio puede ser responsable 
de los cambios conformacionales en la cadena pesada de la proteína, regulando su 
función, por ejemplo, se ha determinado que la presencia de calcio regula el tamaño 
del “paso” de las miosinas [142, 143]. Por otro lado, se ha visto que la Myo1c y la 
Myo1e se fosforilan en respuesta a insulina en adipocitos [144, 145] y a LPS en 
macrófagos [146], respectivamente. Por último, se ha observado que las 
fosforilaciones en la Myo1c en respuesta a insulina, provoca que la miosina se una 
a la proteína de andamiaje 14-3-3 [144, 145]. 
Microvellosidades 
Las microvellosidades son microestructuras celulares localizadas en las 
membranas de las células diferenciadas, normalmente en las células epiteliales 
[147]. Son estructuras con forma filiforme, miden de uno a dos µm de altura y unos 
100 nm de grosor. Generalmente están fuertemente empaquetadas creando lo que 
se denomina ribete en cepillo [147]. 
30 
 
Existe una gran cantidad de células que contienen microvellosidades entre 
las que destacan los enterocitos en el sistema digestivo, el epitelio de los tubos 
contorneados del riñón o el epitelio del epidídimo, pero también aparecen 
microvellosidades en células sensoriales especializadas como las del epitelio 
olfatorio o las del órgano de Corti. La formación de las microvellosidades depende 
de una actividad exocitica que aportan las membranas y las proteínas de superficie 
[147]. 
Las microvellosidades intestinales están formadas principalmente por 5 
proteínas: la actina, la fimbrina, la vilina, la Myo1A y la espectrina. Su estructura se 
mantiene gracias a un entramado de unos 30 a 40 filamentos de actina internos 
dispuestos en haces paralelos al eje longitudinal y orientados con su extremo más 
(extremo de crecimiento) hacia la zona apical de la microvellosidad [147]. Estos 
filamentos están unidos entre sí por la fimbrina y la vilina, y mediante la Myo1A se 
unen lateralmente a la membrana celular. El esqueleto de actina de cada 
microvellosidad continúa basalmente hacia el citoplasma donde se entrelaza con 
otros microfilamentos de otras mirovellosidades formando una red. Esta red se 
denomina red terminal y se extiende por la zona cortical apical citoplasmática. La 
red terminal está formada en gran medida por espectrina [147]. 
A pesar de que las microvellosidades individuales son estables e inmóviles, 
su citoesqueleto sufre una continua adición y eliminación de proteínas en sus 
filamentos, así como de los otros elementos del armazón proteico, 
estableciéndose una especie de balance [148]. Se estima que el citoesqueleto 
de una microvellosidad se renueva completamente cada 20 minutos. Un aumento 
anormal de la concentración de calcio, como en situaciones de estrés, provoca 
el paso de la actina de filamento a soluble y por tanto la desaparición de la 
microvellosidad. Del mismo modo, las microvellosidades desaparecen en las 
células que van a dividirse. La red citoplasmática es también muy plástica y 
moldeable [148]. 
31 
 
Entre las funciones de estas microestructuras se encuentran: el intercambio 
de sustancias entre los tejidos y el medio extracelular en el epitelio digestivo, esto 
permite el aumento de la superficie de la membrana plasmática y por lo tanto, el 
contenido y segregación de moléculas como receptores, transportadores, 
canales, etc [148]. Tradicionalmente se ha propuesto como la principal misión de 
las microvellosidades el aumento de la superficie de membrana celular en 
enterocitos o células secretoras de los epitelios. Pueden incrementar la superficie 
de membrana un 30% respecto a una superficie plana [149]. 
Por otro lado, el denso empaquetamiento de las microvellosidades les 
permite también actuar como una barrera física de protección frente a parásitos, 
por ejemplo, en el epitelio digestivo [149]. 
A las microvellosidades también se les atribuyen otras funciones, por 
ejemplo, la generación de vesículas extracelulares.Se ha comprobado que la 
superficie de las microvellosidades es capaz de liberar pequeñas vesículas. En 
este contexto, es el propio citoesqueleto el que arrastra porciones de membrana 
hasta la parte apical de la microvellosidad, formando las vesículas. Estas 
vesículas tienen enzimas en sus membranas y están enriquecidas en fosfatasa 
alcalina y otras enzimas [149]. 
En este contexto, los ratones deficientes de la miosina 1a presentan una 
arquitectura diferente en las microvellosidades con respecto a los ratones silvestres, 
además la falta de la Myo1a afecta la secreción de diversas enzimas digestivas en 
la región apical de estas estructuras, por ejemplo, la maltasa [149]. 
Con respecto a las células del sistema inmunológico, estas estructuras fueron 
descritas en 2004, en este estudio describen la presencia de estas microestructuras 
en los linfocitos y mencionan que la longitud y la densidad de estas estructuras van 
de 0.3 a 0.4 μm y de 2 a 4 microvellosidades/μm2, respectivamente. Además 
describen un arreglo similar al de otras células, con un núcleo de actina y uniones 
mediante proteínas accesorias [150]. 
32 
 
Por otro lado, también se describe que estas estructuras son sensibles a 
latrunculina A; los autores describen que en dos minutos de tratamiento con el 
agente, estas estructuras desaparecen, hipotetizando un continuo ensamble y 
desensamble, otro componente importante para la formación de las 
microvellosidades son las balsas lipídicas, esto se demostró cuando al tratar 
linfocitos B con β-metil ciclodextrina, el número de microvellosidades disminuyo, 
esto indica que las balsas lipídicas son importantes para la formación y/o 
mantenimiento, por otro lado, también se ha visto la participación de GTPasas y 
proteínas de la familia ERM en la formación de las microvellosidades, por ejemplo, 
se demostró que el bloqueo de Rac1 mantiene estas estructuras “estables”, 
mientras que una mutante constitutivamente activa de Rac1 provoca la disociación 
de las estructuras [150]. Además la fosforilación en un residuo de treonina 
conservado de las proteínas de la familia ERM contribuye a la formación de las 
microvellosidades en linfocitos [150]. 
Estas microvellosidades son inducibles en linfocitos B con factores como IL-
4, LPS, entrecruzamiento de CD40. Se ha demostrado que estas estructuras existen 
una gran cantidad de moléculas importantes durante el contacto célula-célula y la 
activación de los linfocitos, por ejemplo, ICAM-1, moléculas del MHC-II, LFA-1, 
CD86, selectinas y receptores de quimiocinas [151]. 
Por esta razón, a estas estructuras se les ha relacionado con los contactos 
celulares dinámicos entre células. Esto se determinó en linfocitos circulantes 
sanguíneos, que después de la estimulación dada por quimiocinas, uno de los 
primeros eventos morfológicos que se observan es la reabsorción de las 
microvellosidades, facilitando la migración celular [150]. Por otro lado, al inicio de 
este facilitamiento, se da la movilización de moléculas en estas estructuras, tales 
como la L-selectina a la punta o CXCR4 a lo largo de estas estructuras [150]. 
 
33 
 
Dureza celular 
Durante la migración, las células del sistema inmunológico están sujetas a 
diversas presiones mecánicas [73]; por lo tanto, las células responden a estos 
estímulos mecánicos mediante la modulación de la dureza celular [73]. Esta dureza 
celular está regulada por las interacciones entre el citoesqueleto de actina y la 
membrana plasmática [73]. Este proceso está involucrado en diversos procesos 
celulares como el “spreading” celular [152], la adhesión celular [153], el tránsito 
vesicular [153] y el desarrollo de prolongaciones de membrana, semejantes a 
microvellosidades [154], filopodias [155] y pseudopodos [156]. 
Las características propias de la membrana lipídica, muestran que esta es de 
característica no elástica y no puede soportar grandes presiones [157]; por lo tanto, 
la célula responde con la adición y la remoción de zonas de membrana plasmática 
a través de la exocitosis y la endocitosis, este comportamiento modifica la tensión 
membranal [157]. Los linfocitos B son células especializadas en la secreción de 
anticuerpos, la fagocitosis y la exocitosis de diversas moléculas, todos estos 
procesos involucran de manera importante un intercambio de membrana entre los 
compartimentos intracelulares y la membrana plasmática, para poder llevar a cabo 
este proceso, es necesaria la participación de diversas proteínas, lípidos, etc [61]. 
Para permitir esta movilización de membranas, se necesita la presencia de 
proteínas que liguen el citoesqueleto de actina con la membrana plasmática, en este 
contexto las miosinas surgen como los candidatos naturales para realizar esta 
función [73]. De hecho, los cambios en la dureza celular modifican de manera 
importante el comportamiento celular, Olety y cols ó Gerard y cols reportaron que la 
carencia de miosinas de clase I provoca deficiencias en la interacción entre el 
citoesqueleto de actina y la membrana plasmática [72, 73], provocando defectos en 
la migración celular, mientras que incrementos en la dureza celular guían a la 
inhibición de la formación del polo líder en neutrófilos conllevando a un decremento 
en las actividades migratorias [158]. Esta fuerza también se opone al desarrollo de 
prolongaciones de la membrana, en el caso de células migratorias un incremento 
34 
 
en la tensión membranal puede inhibir la extensión de los lamelipodios en 
fibroblastos o la inhibición en la formación de prolongaciones durante el “spreading” 
celular en fibroblastos [152]. 
En otro contexto funcional, las células que tienen cambios en la dureza 
celular tienen modificaciones en la endocitosis, esto fue determinado por estudios 
en los cuales observan que la sobreexpresión de la miosina 1B en Entamoeba 
histolytica produce un decremento en la fagocitosis, esto fue atribuido a un 
incremento en la tensión membranal [79]. Por último, la emisión de prolongaciones 
de membrana semejantes a pseudopodos, filopodios y microvellosidades, está 
gobernada por la interacción entre el citoesqueleto de actina cortical y la membrana 
plasmática; por ejemplo, se ha visto que una menor tensión de membrana produce 
proyecciones de menor tamaño[152]. 
 
Justificación 
 
 Las miosinas de clase I participan en diversos pasos del tránsito vesicular. 
En los linfocitos B solamente hay tres miembros de esta familia ( 
Myo1c, Myo1e y Myo1g), con funciones conocidas en el caso de la Myo1c, y con 
funciones pobremente estudiadas en el caso de la Myo1e y de la Myo1g. De la 
Myo1g se desconoce sus funciones particulares y específicamente la participación 
en el tránsito vesicular, pero existen indicios, como la localización de esta molécula 
en lisosomas y otros compartimentos membranosos en diversos tipos celulares que 
muestran su probable participación en este importante proceso. Con base en estos 
antecedentes, en el presente estudio se propone analizar la participación de Myo1g 
en el tránsito vesicular de los linfocitos B. 
 
35 
 
Hipótesis: 
 
La miosina 1g participa activamente en el tránsito vesicular en los linfocitos 
B. 
 
Objetivo general: 
 
Caracterizar la función de la Myo1g en el tránsito vesicular en los linfocitos B. 
 
Objetivos Particulares: 
 
1. Analizar la participación de la Myo1g en la endocitosis y el reciclamiento 
de receptores de superficie mediado por vesículas de caveolina y 
clatrina en los linfocitos B. 
 
2. Analizar el papel de la Myo1g en la secreción de moléculas movilizadas 
en mecanismos dependientes de caveolina y clatrina. 
 
3. Determinar una posible asociación de la Myo1g con proteínas 
involucradas en la movilización de vesículas dependientes de clatrina y 
caveolina. 
 
36 
 
Material y métodos 
 
Ratones. 
Ratones hembras de fenotipo silvestre (C57BL/6J) o deficientes de la Myo1g 
(Myo1g-/-, con fondogenético C57BL/6J) de 6-8 semanas fueron usados en todos 
los experimentos. Estos ratones fueron producidos en la unidad de producción del 
bioterio del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados, todos los protocolos 
fueron aprobados por el comité de ética del Centro de Investigación y de Estudios 
Avanzados. 
 
Enriquecimiento y activación de los linfocitos B. 
Cinco millones de células mononucleares de bazo de ratones silvestres o 
deficientes de la Myo1g fueron colocadas en placas de cultivo previamente 
sensibilizadas con el anticuerpo NIM-R1 (α-Thy1.1) por una hora a 37°C. Las células 
adheridas a las placas fueron desechadas, mientras que las células no adheridas 
fueron lavadas con PBS y se activaron o no con LPS (50 μg/mL) y con 10 U/mL de 
IL-4 durante 48 horas. El porcentaje de enriquecimiento fue cuantificado, obteniendo 
porcentajes de linfocitos B mayores de 90%, en conjunto este procedimiento se 
denomina “panning”. 
 
Caracterización de subpoblaciones de linfocitos B en bazo de 
ratón. 
Células B enriquecidas por “panning”, fueron teñidas con una mezcla de 
anticuerpos que incluyen α-B220, α-CD21, α-CD23 y α-CD24 durante 20 minutos 
en hielo, para posteriormente lavarlas tres veces con PBS 1x y analizadas en el 
37 
 
citometro de flujo. Los porcentajes de células fueron obtenidos mediante el 
programa de análisis Flowjo. 
 
Ensayos de internalización de transferrina. 
Un millón de linfocitos B activados o en reposo, enriquecidos por selección 
negativa mediante el anticuerpo α-Thy1.1 (panning), fueron colocados con 10 μg de 
transferrina acoplada a FITC por una hora en hielo para permitir la interacción entre 
la transferrina y el receptor. Terminando la incubación, las células fueron colocadas 
por diferentes tiempos a 37°C, seguido de 6 lavados con PBS. Las células fueron 
fijadas con PFA al 4% y su fluorescencia fue determinada en el citómetro de flujo. 
 
Inducción de “capping” en linfocitos B primarios. 
Un millón de linfocitos B activados o en reposo, enriquecidos por panning, 
fueron marcadas con anticuerpo primario correspondiente para cada experimento, 
durante 15 minutos en hielo, posteriormente las células fueron lavadas una vez con 
PBS. Las células se colocaron en 100 μL de medio RPMI suplementado y se les 
adiciono el anticuerpo secundario acoplado a FITC o Cy3, para después incubar por 
una hora a 37°C. Al término de la incubación, las células fueron fijadas con un mL 
de paraformaldehido al 4% en PBS y fueron colocadas en cubreobjetos previamente 
sensibilizados con poli-l-lisina (0.01%) y se observaron al microscopio confocal. 
 
Tinción de moléculas de superficie en los linfocitos B. 
Un millón de linfocitos B activados o en reposo, enriquecidos por panning, 
fueron marcados con el anticuerpo α-CD44 biotinilado, α-MHC-II biotinilado, la 
subunidad B de la toxina de cólera biotinilada o α-IgM o α-LFA-1-FITC o α-MHC-I-
PE por 15 minutos. Al término de la incubación las células fueron lavadas 2 veces 
con PBS y se les coloco estreptavidina-APC por 20 minutos en el caso de 
38 
 
anticuerpos biotinilados. Terminado el tiempo de incubación las células fueron 
lavadas dos veces con PBS 1x. Las células fueron fijadas con PFA al 1% en PBS y 
su fluorescencia fue determinada en el citómetro de flujo CYAN. 
 
Cuantificación de la dureza celular. 
Células B enriquecidas, activadas o en reposo, fueron puestas en 
cubreobjetos previamente tratados con poli-l-lisina, permitiendo la adhesión durante 
una hora a 37°C en una cámara húmeda. Después de terminada la incubación, las 
células fueron analizadas en un microscopio de fuerza atómica. Para determinar la 
región, las células fueron observadas mediante una imagen 2D, denominada modo 
de contacto, posteriormente ya elegida la región, a las células se les aplico la fuerza 
necesaria conocida para deformar a la célula. Posteriormente, se obtuvieron curvas 
de fuerza contra distancia. Estas curvas son prácticamente lineales y el incremento 
en la pendiente significa el incremento en la dureza celular [159]. Los datos 
obtenidos fueron analizados mediante el software Mathlab. El microscopio fue 
equipado con el software PROSCAN 1.7, los “cantilevers” usados fueron calibrados 
con una constante nominal de 30 mN/m y un radio de 53 nm [160]. Todas las 
mediciones se realizaron a 29 °C. 
 
Purificación magnética de vesículas en células B. 
Perlas magnéticas fueron puestas en contacto con diez millones de células 
B, en reposo o activadas, durante una hora a 37°C, seguido de dos lavados con 
PBS. Posteriormente las células fueron lisadas mecánicamente mediante el paso 
de las células a través de una aguja con un calibre de 23 G por 25 veces en PBS 
1x más inhibidor de proteasas. Células intactas, restos celulares y núcleos fueron 
removidos por centrifugación a 500 g durante cinco minutos. El sobrenadante 
resultante, que contiene proteínas y vesículas, fue separado en la fracción 
39 
 
“magnética” o “no magnética”, mediante el paso del sobrenadante en una columna 
de separación acoplada a un iman. Las fracciones obtenidas fueron cuantificadas y 
cargadas en geles SDS-PAGE. 
 
Inducción de la formación de proyecciones membranales en 
linfocitos B por entrecruzamiento de CD44. 
Se utilizaron cubreobjetos que fueron previamente desengrasados con una 
mezcla 1:1 de alcohol acetona, por una hora a temperatura ambiente; 
posteriormente, los cubreobjetos se lavaron con agua corriente y luego con agua 
bidestilada. Finalmente, los cubreobjetos fueron sumergidos en etanol al 70% y 
secados a temperatura ambiente toda la noche. Estos cubreobjetos fueron 
sensibilizados con el anticuerpo NIM-R8 (CD44), con el anticuerpo α-LFA-1 (clona 
M18/2) o anticuerpo α-B220 (clona RA3 6B2) a una concentración de 20 μg/mL en 
PBS durante toda la noche a 37°C, para posteriormente lavarlos con medio RPMI 
sin suplementar. Posteriormente, 50 μL de los linfocitos B (2 x 106) se transfirieron 
a los cubreobjetos, las células se incubaron por dos horas a 37°C, permitiendo la 
formación de las proyecciones de la membrana. A continuación, las células fueron 
marcadas con faloidina rodaminada (1 µg/µl) durante 20 minutos, para 
posteriormente lavarlas dos veces con PBS 1x; finalmente las células fueron 
observadas al microscopio confocal. 
 
Purificación de microvellosidades de los linfocitos B. 
Para el análisis de las microvellosidades de los linfocitos B, se partió de 1 x 
109 células B enriquecidas por “panning”, que fueron resuspendidas en dos mL de 
PBS conteniendo 20% de SFB. Esta suspensión celular fue incubada durante 15 
minutos a 37 °C, para la estabilización de estas estructuras. Posteriormente las 
células fueron pasadas cuidadosamente 5 veces por una aguja de tamaño 27G y 
40 
 
se transfirieron a tubos para posteriormente centrifugarlas a 2500 RPM durante 5 
minutos a 4 °C. La pastilla obtenida se separó del sobrenadante, que se apartó en 
un tubo nuevo. La pastilla que contiene las células fue lavada 4 veces con PBS. El 
sobrenadante fue centrifugado a 16000g durante 40 minutos a 4 °C, posteriormente 
se realizaron dos lavados con PBS. Las dos fracciones fueron lisadas con buffer 
RIPA más inhibidores de proteasas durante una hora en hielo. Posteriormente se 
cuantifico la proteína y se cargó en geles SDS-PAGE. 
 
Análisis de adhesión de linfocitos B a diferentes substratos. 
Medio millón de linfocitos B activados o en reposo, enriquecidos por 
“panning”, fueron colocados en placas de 96 pozos previamente sensibilizados con 
diferentes substratos (NIM-R8, α-LFA-1, fibronectina y poli-l-lisina), por una hora a 
37 °C. La placa se lavó dos veces con PBS para desechar las células no adheridas, 
posteriormente, las células fueron fijadas con PFA al 4% por 15 minutos y lavadas 
tres veces con PBS, posteriormente las células fueron teñidas con el colorante 
cristal violeta por 10 minutos y lavadas extensivamente con PBS,por último las 
células fueron lisadas con PBS+SDS al 1% por 30 minutos y colocadas en el lector 
de ELISA con una longitud de onda de 495nm para determinar la absorbancia dada 
por el colorante retenido por las células adheridas. 
 
Ensayos de migración in vitro. 
Un millón de linfocitos B fueron suspendidos en 0.5 ml de RPMI 
suplementado con 10% de SFB, y puestos inmediatamente en cubreobjetos 
previamente sensibilizados con 2.5 µg/ml de fibronectina, las células fueron 
incubadas por 30 minutos a 37°C. Pasado el tiempo, los cubreobjetos fueron 
lavados dos veces con PBS 1X. Posteriormente, los cubreobjetos fueron colocados 
en la cámara de Zigmond. En uno de los “surcos” de la cámara se colocaron 100 µl 
41 
 
de medio RPMI solo y en el otro “surco” se colocaron 100 μl de RPMI más cinco μg 
de CXCL13 para permitir el gradiente de la quimiocina. Imágenes digitales fueron 
tomadas cada 30 segundos durante tres horas. Las imágenes fueron analizadas 
con el “plugin manual tracking” del programa Image J, posteriormente las 
trayectorias fueron analizadas con el programa chemotaxis Tool. 
 
 Ensayos de migración in vivo. 
Células mononucleares de los bazos de ratones silvestres o deficientes de la 
Myo1g fueron marcadas con 0.1 μM (concentración baja) o 0.6 μM (concentración 
alta) de CFSE (Invitrogen). Estas células fueron mezcladas en diferentes 
proporciones (50:50, 25:75 y 75:25) e inyectadas en una cantidad de 15 millones de 
células en la vena de la cola de los ratones “recipientes”. El ratón “recipiente” fue 
sacrificado dos horas después de la transferencia adoptiva. Los bazos, los ganglios 
inguinales, los pulmones, los hígados y la sangre fueron extraídos para 
posteriormente marcar a los linfocitos B con α-B220 (Biolegend). Las células fueron 
leídas en el citómetro Cyan para determinar la presencia de los linfocitos B 
marcados. 
 
Ensayos de migración en cámara de “Transwell”. 
Cuatrocientas mil células B activadas o en reposo marcadas con CFSE 
fueron puestas en la cámara superior de las cámaras “transwell” recubiertas o no 
con células endoteliales de pulmón de ratón (MLEC), - estas células han sido 
usadas ampliamente en ensayos de transmigración [161], estas células tienen una 
morfología “en adoquin”, adecuada para las células endoteliales y expresan altas 
cantidades de VE-caderina y VEFGR2 [162]-. Las cámaras recubiertas con células 
endoteliales fueron tratadas previamente con TNF-α una noche previa, esto se 
realizó para permitir la disrupción de la barrera endotelial y la expresión de la E-
42 
 
selectina. Posteriormente las células fueron incubadas durante 4 horas a 37°c, 
permitiendo la migración hacia el compartimento inferior. Pasada la incubación las 
células de ambos compartimentos fueron recuperadas y teñidas con el α-B220-PB 
y la fluorescencia fue adquirida en el citómetro de flujo. Por otro lado, los filtros 
fueron recuperados y observados al microscopio confocal. 
 
Ensayos de fagocitosis. 
 Células B enriquecidas del bazo o células B de la cavidad peritoneal fueron 
incubadas con perlas fluorescentes de diferentes tamaños que van de 0.2 μM a 2 
μM o con Staphylococcus aureus previamente marcado con FITC, con una 
proporción de 10:1 en 500 μL de medio RPMI suplementado por 30 minutos para 
las perlas fluorescentes y por 3h para las bacterias a 37 °C en 5% de CO2. Las 
células fueron lavadas con PBS y la fluorescencia exterior fue “apagada” con 0.5 ml 
de azul tripano por un minuto. Después de la incubación las células fueron lavadas 
6 veces con PBS y fijadas para analizarlas en el citómetro de flujo. 
 
Purificación de las balsas de lípidos. 
 Cien millones de linfocitos B fueron lisados con buffer TNE (10 mM de 
tris/HCl, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA más 2.5 mg/mL de PMSF, leupeptina y 
aprotinina) conteniendo 1% de Triton-X100; el lisado fue incubado a 4°C durante 30 
minutos. Posteriormente, este lisado fue transferido a un homogeneizador de vidrio 
Wheaton inmerso en hielo, donde se mezcló en diez ocasiones, desplazando el 
pistilo con suavidad para evitar la formación de burbujas. Posteriormente, para la 
eliminación del DNA y detritos celulares, este homogeneizado fue centrifugado por 
10 minutos a 900 g, manteniendo la temperatura a 4 °C en todo momento. 
 El extracto celular obtenido fue fraccionado en un gradiente discontinuo de 
sacarosa. Para esto, se mezcló un ml de lisado con un ml de sacarosa al 85% en 
43 
 
TNE, procurando homogeneizar perfectamente con una pipeta. La mezcla se 
transfirió a un tubo de 14 x 95 mm para centrifuga Beckman y fue cubierta con dos 
capas de sacarosa en solución, que se añadió gota a gota con una pipeta Pasteur, 
para formar el gradiente; la primera de 6 ml de sacarosa al 35% en TNE y la segunda 
de 3.5 ml de sacarosa al 5% en TNE. Estas muestras fueron centrifugadas a 200 
000 g durante 20 horas a 4 °C. Al término de la centrifugación, se colectaron 
fracciones de un ml de la parte superior del gradiente hasta el final del gradiente y 
se guardaron a – 70 °C para su posterior análisis por Western Blot. 
 
Ensayos de secreción. 
Un millón de linfocitos B enriquecidos por panning, fueron colocados en 
medio RPMI suplementado con 2% de SFB. Las células fueron activadas o 
mantenidas en reposo, durante 48 horas para permitir la secreción de la hormona 
prolactina y de la citocina TNF-α. En algunos casos las células fueron tratadas con 
brefeldina A seis horas antes de terminar la incubación, para poder cuantificar la 
producción intracelular de estas moléculas. Después de la incubación, una fracción 
de las células fue cosechada y esta fracción fue lisada con buffer RIPA, se cuantifico 
la cantidad de proteína, se colocaron 80 μg de proteína en geles SDS-PAGE y se 
realizó la inmunodetección contra prolactina, por otro lado, la otra fracción celular 
fue teñida para determinar la presencia de TNF-α intracelular. Por otro lado, el 
sobrenadante de cultivo fue evaluado mediante la técnica de ELISA para detectar 
la cantidad de prolactina y TNF-α en el medio. 
 
Análisis de la topografía celular. 
Células B enriquecidas fueron activadas o no con LPS + IL4 durante 48 horas, 
posteriormente fueron fijadas con PFA 4% y adheridas a cubreobjetos previamente 
sensibilizados con poli-l-lisina y analizados en el microscopio de fuerza atómica. 
44 
 
Primero las células fueron observadas en modo contacto, posteriormente se les 
aplico un barrido con la punta del “cantilever”, mostrando la topografía membranal. 
Los datos obtenidos fueron analizados con el programa WSXM. 
 
Microscopia electrónica de barrido. 
Linfocitos B enriquecidos, fueron activados o no con LPS + IL4 durante 48 
horas, posteriormente las células fueron fijadas con una solución de glutaraldehido 
al 2%, y posteriormente fueron deshidratadas con concentraciones crecientes de 
etanol. Siguiendo con el procedimiento, las células fueron secadas y recubiertas con 
oro, para posteriormente ser analizadas en el microscopio electrónico. 
 
Inmunoprecipitación. 
Células B en reposo, activadas o con inducción de la polarización de CD44, 
fueron lisadas con buffer RIPA. El sobrenadante fue pre-aclarado con 20 μl de perlas 
de agarosa acopladas a proteína G durante toda la noche. Al día siguiente, esta 
mezcla fue centrifugada a 14000 RPM durante 15 minutos y se recolectó el 
sobrenadante, desechándose el botón. Posteriormente, al sobrenadante se le 
adicionaron los anticuerpos α-Myo1g o NIM-R8, usando IgG de conejo o IgG de rata 
como controles de isotipo respectivamente. La reacción fue incubada por 4 horas a 
4°C en agitación constante. Los complejos fueron precipitados usando las perlas de 
agarosa acopladas a proteína G durante toda la noche a 4°C. Los complejos 
obtenidos fueron lavados tres veces con buffer RIPA y posteriormente se les agregó 
el buffer de muestra. 
 
 
 
45 
 
Ensayos de “rasurado” celular. 
Células de bazo fueron