6 1 1-Metabolismo Oxidativo - Ox de piruvato

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Unidad 6. Metabolismo oxidativo
BIOQUIMICA
6.1.1 Generalidades Oxidación de piruvato
Esteban A. Ferro B, PhD 
Facultad de Ciencias Médicas
Universidad Nacional de Asunción
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Unidad 6. Metabolismo oxidativo
Contenido
Generalidades. 
-Etapas del metabolismo oxidativo
-Tipos de reacciones.
2. Oxidación de piruvato
 - Estructura y mecanismo del complejo piruvato deshidrogenasa
 - Regulación
 - Toxicidad de compuestos de As-3
 
 Generalidades 
Glicólisis anaerobia genera una energía total mucho menor por mol de sustrato catabolizado que la respiración celular, ya que el C del producto (lactato), tiene en promedio, el mismo estado de oxidación que en la sustancia de partida (glucosa). 
El ciclo del ácido cítrico o ciclo de los ácidos tricarboxílicos, o ciclo de Krebs es la ruta de oxidación de los intermedios que proceden de todos los combustibles metabólicos, y genera equivalentes de reducción como NADH y FADH2.
La mayor parte del rendimiento energético de la oxidación de sustratos procede de la posterior reoxidación de los transportadores electrónicos reducidos. 
 Generalidades 
Tres etapas en la oxidación metabólica:
Generación de fragmento activado de 2 carbonos: Acetil CoA.
A partir de piruvato se libera CO2 y se genera NADH 
 
Oxidación de fragmento de 2 C mediante el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (C. Krebs).
A partir de acetil-CoA se libera CO2 y se generan transportadores electrónicos reducidos (3 NADH y FADH2) y GTP (por vuelta).
Transporte electrónico mitocondrial y fosforilación oxidativa.
Se reoxidan los equivalentes de reducción aportados como NADH y FADH2 y se genera ATP.
 Glucógeno
 Glucosa
 Piruvato
 Aminoácidos
 2CO2
CO2
 Acidos grasos
Acetil CoA
Ciclo de Krebs
Glicólisis
 NADH + FADH2 
 NAD+ + FAD 
O2 
H2O 
ADP + Pi 
ATP 
Etapa 1
(Sólo deshidrogenaciones)
Etapa 2
Etapa 3
Metabolismo oxidativo
ß-oxidación
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 Generalidades 
Etapa 1 formada por una familia de rutas que actúan por separado sobre:
Hidratos de carbono: piruvato, procedente de la glicólisis, se oxida a acetil-CoA mediante la PDH.
Acidos grasos: acil-CoA, por β-oxidación generan acetil-CoA (AcCoA).
Aminoácidos: luego de la pérdida del grupo amino, diversas vías generan AcCoA, piruvato o intermediarios del C. Krebs a partir de los diferentes “cetoácidos”.
Las células que consumen Glc aeróbicamente son muy dependientes de la funcionalidad del ciclo de Krebs para producir equivalentes de reducción (H+/e-) y satisfacer su demanda energética. 
Tipos de enzimas que catalizan reacciones de oxidación en el metabolismo energético. 
Deshidrogenasas
Oxidan retirando equivalentes de reducción del sustrato (H+/e-) y los transfieren un aceptor que no es oxígeno. Son aceptores NAD+, NADP+ o FAD.
Catalizan la mayor parte de las reacciones de oxidación del catabolismo.
Oxidasas
Son enzimas en las que el aceptor de los equivalentes de reducción es el propio O2.
 
Piruvato + CoASH + NAD+  AcCoA + CO2 + NADH + H+
 Complejo Multienzimático Piruvato Deshidrogenasa (PDH)
ΔG⁰’ = - 33,5 kJ/mol
Los complejos multienzimáticos ofrecen alta eficiencia en los procesos que catalizar porque:
Reducen el tiempo de los procesos de difusión de sustratos.
Minimizan la eventual generación de sub-productos.
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Piruvato + CoASH + NAD+  AcCoA + CO2 + NADH, H+
 1. Oxidación del Piruvato
Ruta de entrada principal del carbono de la glucosa al ciclo del ácido cítrico
Es una decarboxilación oxidativa.
Catalizada por el complejo piruvato deshidrogenasa (PDH).
La reacción es IRREVERSIBLE.
Esto determina la imposibilidad de convertir acetil-CoA en glucosa, en los animales.
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 Piruvato deshidrogenasa (PDH)
Es un complejo multienzimático localizado en la matriz mitocondrial y está formado por: 
Tres enzimas:
E1: Piruvato descarboxilasa o piruvato deshidrogenasa (propiamente dicha)
E2: Dihidrolipoamida transacetilasa
E3: Dihidrolipoamida deshidrogenasa
Participan cinco cofactores:
Pirofosfato de tiamina (TPP) - E1
Acido lipoico – E2
Coenzima A – E2 (*)
Flavina adenina dinucleótido- E3
Nicotinamida adenina dinucleótido – E3 (*)
* Cofactores estequiométricos (cosustratos)
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Complejo PDH purificado de E.coli (Fotografía de microscopía electrónica).
Nótese la estructura ordenada en los corpúsculos.
Piruvato deshidrogenasa (PDH)
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E.coli 4600 kDa a) E2: dihidrolipoil transacilasa (24) verde
				b) E1: piruvato deshidrogenasa (24) naranja
				c) E3: dihidrolipoil deshidrogenasa (12) púrpura
Eucariotas: 100.000 kDa. 20 trímeros E2
30 heterotetrámeros E1(α2β2) y 12 dímeros E3 + 12 copias de proteína de unión a E3
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	Cofactor	Tipo	Ubicación	Función
	Pirofosfato de tiamina (TPP)	Catalítico	Unido a E1	Descarboxila piruvato y genera el carbanión hidroxietil-TPP
	Ácido lipoico
(Lipoamida)	Catalítico	Covalentemente unido a un resto de Lys de E2
	Acepta el carbanión hidroxietil-TPP y lo oxida a acetilo
	Coenzima A (CoA)	Estequiométrico (Cosustrato)	Sustrato de E2
	Acepta el grupo acetilo de dihidrolipoamida
	Flavina adenina dinucleótido (FAD)	Catalítico	Unido a E3
	Oxida a dihidrolipoamida
	Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+)	Estequiométrico (Cosustrato)
	Sustrato de E3
	Oxida a FADH2
Cofactores del complejo piruvato deshidrogenasa
Tipo, ubicación y funciones
Secuencia de reacciones
1. Piruvato se descarboxila dando hidroxietil-TPP. El producto queda unido al cofactor de la enzima E1 
2. HETPP es oxidado por el bisulfuro de lipoamida, unida covalentemente a E2 (dihidrolipoilacetiltransferasa)
3. El grupos acetilo es transferido a la CoA-SH por E2, dando AcCoA y dihidrolipoamida
4. El grupo sulfhidrilo de lipoamida es oxidado por E3 (dihidrolipoamida deshidrogenasa), dependiente de FAD, regenerando lipoamida
5. FADH2 asociado a E3 es reoxidado, con la participación de NAD+
Piruvato descrboxilasa
Dihidrolipoil transacilasa
Dihidrolipoil deshidrogenasa
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Mecanismo de reacciones
E1: piruvato descarboxilasa/deshidrogenasa
E2: dihidrolipoamida aciltransferasa
E3: dihidrolipoamida deshidrogenasa
Piruvato
Acetil-CoA
Acetil-dihidrolipoamida
Hidroxietil-TPP
Lipoamida
Piruvato deshidrogenasa
Dihidrolipoil
transacetilasa
Dihidrolipoil
deshidrogenasa
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 Coenzimas de PDH- Tiamina-PP
Contiene dos anillos heterocíclicos:
Una pirimidina sustituída.
Un anillo tiazol.
Ambos anillos participan en la formación del carbanión activo en C2. Este promueve la descarboxilación del piruvato.
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El precursor (Tiamina) se transforma en pirofosfato de tiamina (TPP) a través de una reacción de pirofosforilación dependiente de ATP.
Tiamina es una vitamina hidrosoluble (B1)
	
 Coenzimas de PDH- Tiamina-PPi
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Es la coenzima de todas las descarboxilaciones de los α-cetoácidos.
Piruvato
α- ceto glutarato
Cetoácidos de Val, Leu e Ile.
Transferencia de unidades C2 por transcetolasas en VPP.	
Hidroxietil TPP (PDH)
Hidroxibutiril TPP (α-cetoglutaratoDH)
 E1-Piruvato descarboxilasa /P. deshidrogenasa
Piruvato
Hidroxietil-TPP
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 Coenzimas de PDH- Acido Lipoico
Es el aceptor del intermedio generado por acción de TPP.
Actúa asociado covalentemente a E2
Disulfuro interno del ácido 6,8- ditiooctanoico.
Este grupo (-S-S-) actúa como oxidante
Se une a la enzima mediante un enlace amida entre el grupo COOH del ácido y el ε-amino de una lisina. 
	
Especie reactiva: Lipoamida (lipoil-lisina)
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Ácido lipoico
Lipoamida
Dihidrolipoamida
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“Brazo” lipoil-lisina
(completamente extendido)
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 Coenzimas de PDH- Acido lipoico
Transferencia del resto C-2 (HETPP), equivalente a acetaldehído, del TPP al S del C6 de lipoamida.
Oxidación simultánea del aldehído acoplada a la reducción del disulfuro. 
Transferencia del grupo acilo (acetilo, en PDH) generado a la coenzima A (CoASH). 
	
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 E2-Dihidrolipoamida aciltransferasa
Lipoamida-E2
Acetil-dihidrolipoamida-E2
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 Coenzimas de PDH- Acido Lipoico
Transferencia del grupo acilo unido a la lipoamida (E2) a la coenzima A (CoA).
	
Acetil Coenzima A (AcCoA)
El ácidolipoico queda reducido y unido a E2, como dihidrolipoamida.
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 E2-Dihidrolipoamida aciltransferasa
Dihidrolipoamida-E2
 Acetil- E2
dihidrolipoamida-E2
Acetil-CoA
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 Coenzimas de PDH- Coenzima A
Derivado del ácido pantoténico + ATP + β-mercaptoetilamina. 
	
Participa en la activación y transferencia de grupos acilo (derivados de ácidos carboxílicos). 
Grupo –SH de la β-mercaptoetilamina es el nucleófilo que ataca al C carbonilo del tioéster acetil-lipoamida para generar acetil-CoA, un tioester soluble de alta energía de hidrólisis.
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Ácido pantoténico (Vitamina B5)
Ácido pantoténico, vitamina B5, vitamina W (no sintetizado por animales) 
Compuesto por ácido pantoico (ác. 2,4-dihidroxi-3,3-dimetil-butírico) y -alanina.
Precursor de la coenzima A y del residuo de panteteína en el dominio ACP de ácido graso sintasa.
CoASH
 Coenzimas de PDH- FADH2
El dinucleótido de flavina y adenina (FAD) deriva de la vitamina B2 (riboflavina). 	
Anillo de “isoaloxazina” de la riboflavina es capaz de aceptar dos protones en su estructura. 
Riboflavina se compone por un anillo de “isoaloxazina” unido a “ribitol”. 
	
Enzimas que usan FAD o FMN como cofactor son conocidas como “Flavoproteínas”. 
	
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Síntesis de FAD a partir de la riboflavina. 
	
Riboflavina
(Vitamina B2)
Flavina mono-nucleótido
(FMN)
Flavina adenina dinucleótido
(FAD)
 Coenzimas de PDH- NAD+ 
El dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) deriva de la vitamina B3 (niacina). 
	
Es el cofactor de la mayoría de las deshidrogenasas. 
	
Un ion hidruro (H-) del sustrato reduce al NAD+ a NADH. 
Su forma oxidada acepta 2 equivalentes de reducción, pero solo aloja un protón en su estructura al reducirse.
	.
Ion hidruro
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PRPP
ATP
Síntesis de NAD+ a partir de la niacina/nicotinamida
Nicotinamida adenina dinucleótido
(NAD+)
Nicotinamida adenina dinucleótido fosfasto
(NADP+)
Precursores
(Ácido nicotínico / nicotinamida)
 E3-Dihidrolipoamida deshidrogenasa
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Mecanismo de reacciones
E1: piruvato descarboxilasa/deshidrogenasa
E2: dihidrolipoamida aciltransferasa
E3: dihidrolipoamida deshidrogenasa
Piruvato
Acetil-CoA
Acetil-dihidrolipoamida
Hidroxietil-TPP
Lipoamida
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Regulación de PDH
Inhibida por productos:
- AcCoA – NADH, y por 
- Alta carga energética
Inactivada por fosforilación por proteína quinasas, que fosforilan 3 Ser de E1 y se activa por aumento de [AcCoA]/ [CoASH], [ATP]/[ADP], [NADH]/[NAD+]
Activada por desfosforilación mediada por fosfoproteína fosfatasa activada por Ca2+
PDH
Regulación de PDH
PDH
Piruvato
ATP
Acetil CoA
NADH
PDH
quinasa
Piruvato
PDH
fosfasa
Acetil CoA
Complejo PDH (activo)
Complejo PDH (inactivo)
Regulación covalente de PDH
PDH quinasa (PDK) es activada por los mismos efectores que inhiben al complejo, todos indicadores de alta carga energética (ATP, NADH, AcCoA).
Piruvato inhibe a la PDH quinasa (PDK), favoreciendo la actividad de PDH.
 
Cloroacetato inhibe PDK y se emplea en el tratamiento del déficit de PDH.
PDK es regulada por nutrientes y hormonas.
Insulina reduce la actividad de PDK, activando a PDH.
El ayuno y dieta rica en grasas aumenta la actividad de PDK.
Estos efectos son resultado de la regulación de la transcripción de PDK (PDK4)
Activada por: ATP, NADH, AcCoA, glucocorticoides, dieta rica en grasa, ayuno
Inhibida por: piruvato, dieta rica en hidratos de carbono, insulina (cloroacetato, farmacológicamente)
Activada por: calcio
Piruvato deshidrogenasa fosfatasa
Piruvato deshidrogenasa quinasa
activa
inactiva
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Toxicidad de compuestos de As3+
Ion arsenito
Compuestos orgánicos arsenicales
Dihidro-lipoamida
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 Lewisita: Cl-CH=CH-AsCl2
British Anti-lewisite (BAL) HSCH2-CHSHCH2OH 
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Unidad 6. Metabolismo oxidativo
Fin de la presentación 6.1.1
Generalidades.
Oxidación de piruvato