Actividad-del-promotor-del-canal-Nax-en-celulas-neuro-2A

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
 FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA 
 
 
 
 
 
 
 
 T E S I S 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 B I Ó L O G O 
 PRESENTA 
 ELVIRA HERNÁNDEZ LAGANA 
 Directora de Tesis: Ma. Del Refugio García Villegas 
 
 
 Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, México. 
 
 
 
Mayo 2009 
ACTIVIDAD DEL PROMOTOR DEL CANAL 
Nax EN CÉLULAS NEURO 2A 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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Este trabajo fue realizado en el Departamento de Fisiología, 
Biofísica y Neurociencias del Centro de Investigación y de 
Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, bajo 
la dirección de la Dra. María del Refugio García Villegas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Este trabajo se presentó en el 
XXVII CONGRESO NACIONAL DE BIOQUÍMICA 
Mérida, Yucatán, del 16 al 21 de noviembre de 2008 
 
 
ACTIVIDAD DEL PROMOTOR DEL CANAL DE SODIO NaX DE RATÓN EN 
CÉLULAS NEURO 2A Y NEURONAS DE GANGLIO DE RAÍZ DORSAL
Uno de los pasos más importantes dentro de las cascadas de regulación genética es la
transcripción la cual ocurre gracias a regiones determinadas en la secuencia genómica
llamadas promotores. El estudio de los promotores puede llevarnos a comprender como es
posible que los genes se expresen en el momento, en el nivel y en el tipo celular
específico, un buen modelo para su estudio son aquellos genes que se expresan
específicamente en algún tipo celular como es el caso de Scn7a que se expresa
preferencialmente en neuronas periféricas de ganglio de raíz dorsal (DRGN).
Scn7a codifica para el canal Nax, un canal de sodio que se activa cuando la concentración
extracelular de dicho ión es ≥ a 150mM, el promotor de Nax no posee caja TATA y tiene
varios sitios de inicio de la transcripción. El promotor basal de Nax dirigiendo la expresión
del gen reportero de la proteína verde fluorescente (EGFP) fue transfectado junto con
pDsRed2-N1 (vector con la proteína roja fluorescente trascrita por el promotor CMV) a
concentración equimolar en células de neuroblastoma Neuro 2a observándose que ambos
vectores presentan una fuerte expresión a las 48 h, sin embargo, al microinyectarlos en
DRGN la expresión de la proteína DsRed2 es mucho menor que la de EGFP por lo tanto
este trabajo estuvo enfocado a probar si la expresión diferencial de las dos proteínas
reporteras se debía a la expresión diferencial de los promotores que las transcriben y a que
las DRGN no se replican mientras que las células Neuro 2A sí lo hacen.
Hernández-Lagana E. * , E., Escamilla, J., García-Villegas M.R., 
Departamento de Fisiología, Biofísica y Neurociencias, Centro de Investigación y Estudios Avanzados del IPN. 
INTRODUCCIÓN
OBJETIVO GENERAL
RESULTADOS
METODOLOGíA
Determinar la actividad del promotor del canal de sodio Nax de ratón en la línea celular
Neuro 2A en crecimiento y diferenciadas con dbAMPc, y en cultivo primario de neuronas de
ganglio de raíz dorsal utilizando 2 genes reporteros EGFP y DsRed2.
�Transfección transitoria de células Neuro 2A
�Transfección transitoria de células Neuro 2A diferenciadas
Fig. 1. Actividad promotora de Nax y de CMV
expresando la proteína EGFP (en verde). Expresión de
la proteína DsRed2 transcrita por CMV (en rojo) como
control de la eficiencia de transfección.
Fig. 2. Actividad promotora de Nax y de CMV
expresando la proteína DsRed2 (en rojo). Expresión
de la proteína EGFP transcrita por CMV (en verde)
como control de la eficiencia de transfección.
Actividad del promotor de Nax y CMV expresando a la 
proteína verde fluorescente (EGFP)
Actividad del promotor de Nax y CMV expresando a la 
proteína roja fluorescente (DsRed2)
pEGFP-1 (EGFP sin promotor), p0.2Nx-EGFP
(EGFP regulada por el promotor basal de Nax)
y pEGFP-C1 (EGFP regulada por CMV).
Expresión de la proteína verde fluorescente
pDsRed2-wcp (DsRed2 sin promotor), p0.2Nx-
DsRed2 (DsRed2 transcrita por el promotor basal
de Nax) y pDsRed2-N1 (DsRed2 transcrita por
CMV).
CONCLUSIONES
�La expresión de DsRed2 es menor que la de
EGFP a las 24 horas independientemente del
promotor que la exprese, por lo tanto la proteína
verde fluorescente es mejor gen reportero para
evaluar la actividad promotora en neuronas que la
proteína roja fluorescente
�Posiblemente el hecho de que DsRed2 tarde
más en expresarse se deba a que es una proteína
tetramérica mientras que la EGFP es
momomérica.
Expresión de la proteína verde fluorescente a 
las 24 h de transfección.
Expresión de la proteína verde fluorescente a 
las 48 h de transfección.
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1500
24 48
Horas posinyección
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.)
0.2Nx
CMV
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Días posinyección
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(u
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.)
0.2Nx
CMV
Actividad del promotor basal de Nax y
de CMV en Neuro 2 (Tomado de
Álvarez-López, L., 2006)
Actividad del promotor basal de Nax y
de CMV en DRGN en cultivo primario
(Tomado de Álvarez-López, L., 2006)
Proyecto Financiado por CONACYT (43128)
•De las células transfectadas con pEGFP-1 (vector vacío) y con
p0.2Nx-EGFP sólo el 10% presentó fluorescencia con respecto a lo
observado en las células control (no diferenciadas) tanto a las 24
como a las 48h; ahora bien, de las células transfectadas con el
vector pEGFP-C1 tan solo el 50% evidenció fluorescencia en
comparación con las células no diferencias.
Expresión de la proteína roja fluorescente 
(control de la eficiencia de transfección)
Expresión de la proteína roja fluorescente
Expresión de la proteína verde fluorescente 
(control de la eficiencia de transfección)
Fig. 4. Actividad promotora de Nax y de CMV
expresando la proteína EGFP (en verde) en Neuro
2A en crecimiento (control) y diferenciadas con
SFB al 1% y dbAMPc.
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30
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Días post-inyección
N
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ro
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as CMV
La mayoría de las DRGN microinyectadas 
no expresan la proteína DsRed2 bajo la 
expresión del promotor CMV. (Tomado de 
Álvarez-López, L., 2006) 
Fig. 5. Actividad promotora de CMV y Nax expresando
a EGFP (en verde) y a DsRed2 (en rojo) en Neuro 2A.
*Se observó que el 20% de las células microinyectadas
expresan las proteínas reporteras, de ellas, el 100%
expresa ambas.
�Microinyección
Transfección transitoria Microinyección
Neuro 2A en 
crecimiento
Neuro 2A diferenciadas
con dbAMPc
Medición de los reporteros
a las 24 y 48 h
B
pEGFP-1 , p0.2Nx-EGFP y pEGFP-C1,
plásmidos con los que se cotransfectó una
cantidad constante de pDsRed2-N1 (DsRed2
transcrita por CMV como control de la
eficiencia de transfección).
+pDsRed2-wcp, +p0.2Nx-DsRed2 y +pDsRed2-
N1, vectores con los que se cotransfectó una
cantidad constante de pEGFP--C1 (vector de
EGFP transcrita por CMV como control de la
eficiencia de transfección).
Actividad del promotor de Nax y CMV expresando a la 
proteína verde fluorescente (EGFP)
*La transfección de las Neuro 2A se llevó a cabo a las 48h de ser diferenciadas con SFB al 1% y dbAMPc 1mM.
�Optimización de las condiciones de diferenciación de células Neuro 2A
Fig. 3. Fotografías de células Neuro 2A en crecimiento y diferenciadas con dbAMPc 1 mM y AR 20 µMen SFB al 10 %
(A) y al 1% (B). Se muestra que la mejor condición de diferenciación es un medio de SFB al 1% y dbAMPc (enmarcadas
en rojo). Con este tratamiento las células se mantienen sanas hasta el décimo día de cultivo además de presentar signos
morfológicos de diferenciación a partir del segundo día de tratamiento como el desarrollo de extensiones y
varicosidades.
Neuronas de Ganglio 
de Raíz Dorsal
Actividad del promotor mínimo de Nax expresando la 
proteína verde fluorescente
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24 h
48 h 
pEGFP-1 p0.2Nx-EGFP pEGFP-C1
Expresión de la proteína roja fluorescente como control de la 
eficiencia de transfección
Vectores con los que se cotransfectó el plásmido pDsRed2-N1
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24 h
48 h
pEGFP-1 p0.2Nx-EGFP pEGFP-C1
Actividad del promotor de Nax expresando la 
proteína roja fluorescente
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24 h
48 h
 pDsRed2-wcp p0.2Nx-DsRed2 pDsRed2-N1
Expresión de la proteína verde fluorescente como control de la 
eficiencia de transfección
Vectores con los que se cotransfectó el plásmido pEGFP-C1
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24 h
48 h 
 
 pDsRed2-wcp p0.2Nx-DsRed2 pDsRed2-N1
Expresión de la proteína verde fluorescente en Neuro 2A 
en crecimiento y diferenciadas. ( 24 h de transfección)
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Neuro 2A en crecimeinto
Neuro 2A diferenciadas
pEGFP-1 p0.2Nx-EGFP pEGFP-C1
Expresión de la proteína verde fluorescente en Neuro 2A
 en crecimiento y diferenciadas (48h de transfección)
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Neuro 2A en c recimiento
Neuro 2A diferenciadas
pEGFP-1 p0.2Nx-EGFP pEGFP-C1
Expresión de la proteína verde fluorescente en DRGN
24h post-inyección
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pEGFP-1 p0.2Nx-EGFP pEGFP-C1
SFB 10% SFB 1%
�Neuro 2A
�DRGN
Fig. 6. Actividad promotora de CMV y Nax
expresando a EGFP (en verde) en neuronas de
DRG.
*Se observó que el promotor de CMV tiene una
actividad transcripcional de aproximadamente 50%
menor a la del promotor basal de Nax (0.2Nx).
�Las células Neuro 2A diferenciadas presentan
un menor expresión de los reporteros con
respecto a las no diferenciadas lo que
posiblemente se deba a que disminuyen su
eficiencia de transfección.
�El promotor de CMV tiene una actividad
transcripcional baja en neuronas de DRG con
respecto al promotor de Nax.
�La mejor condición de diferenciación para las
células Neuro 2A es en un medio con 1% de
SFB y dbAMPc 10 mM.
A B
•La expresión de los reporteros en células diferenciadas es menor
que en las que no lo están, lo que puede deberse a que las células
diferenciadas tengan una menor eficiencia de transfección ó a que
no expresan las proteínas reporteras. Para poder descartar entre
estas dos posibilidades se están realizando experimentos de
microinyección.
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Es para mí un gran honor agradecer a mis padres por su gran esfuerzo y 
entusiasmo en presentarme apoyo en realizar esta gran empresa. También tomo 
unas pequeñas líneas para agradecer a mis amigos y en especial a todos aquellos 
que lean este trabajo que representa un gran esfuerzo de mi parte. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INDICE 
RESUMEN 1 
1. INTRODUCCIÓN 2 
1.1. REGULACIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA 3 
1.1.1. LA TRANSCRIPCIÓN 3 
1.2. Nax Y LOS CANALES DE SODIO DEPENDIENTES DE VOLTAJE 6 
1-2.1. LA REGULACIÓN GENÉTICA DE Nax 11 
1.2.1.1. ANTECEDENTES DIRECTOS 15 
 
2. OBJETIVOS 17 
 
3. MATERIALES Y MÉTODOS 19 
3.1. PLÁSMIDOS USADOS 19 
3.2. PURIFICACIÓN DE DNA PLASMÍDICO 20 
3.2.1. Extracción de DNA plasmídico por lisis alcalina (MINIPREP) 20 
3.2.2. Extracción de DNA plasmídico por columna 20 
3.2.3. Purificación de fragmentos de DNA de gel de agarosa 20 
3.3. DIGESTIÓN DEL DNA PLASMÍDICO 21 
3.3.1. Digestión con enzimas de restricción para la construcción de plásmidos 21 
3.3.2. Digestión con enzimas de restricción para la comprobación de construcciones 21 
3.4. LIGACIÓN DE DNA 21 
3.5. TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS SUPERCOMPETENTES 22 
3.6. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA 22 
3.7. CUANTIFICACIÓN DEL DNA 23 
3.8. CULTIVO DE LAS CÉLULAS NEURO 2A 23 
3.9. TRANSFECCIÓN TRANSITORIA DE CÉLULAS NEURO 2A 23 
3.10. MICROINYECCIÓN DE CÉLULAS NEURO 2A 25 
3.11. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DEL GEN REPORTERO 26 
 
4. RESULTADOS 28 
4.1. CONSTRUCCIÓN DE PLÁSMIDOS PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL 
DEL PROMOTOR DEL CANAL DE SODIO Nax UTILIZANDO COMO GEN REPORTERO A LA 
PROTEÍNA ROJA FLUORESCENTE (DsRed2) 28 
4.1.1. Construcción del vector p-DsRed2-wcp 28 
4.1.2. Clonación del promotor de Nax en el vector pDsRed2-wcp 33 
 
4.1.3. Construcción del vector p0.2Nx-DsRed2 31 
 
4.1.4. Construcción del vector p3.6Nx-DsRed2 33 
4.2. ACTIVIDAD DEL PROMOTOR DE Nax EN CÉLULAS NEURO 2A EN CRECIMIENTO 39 
4.2.1. Nax y CMV dirigiendo la expresión de la proteína verde fluorescente (EGFP) 39 
4.2.2. Nax y CMV dirigiendo la expresión de la proteína roja fluorescente (DsRed2) 44 
4.3. SELECCIÓN DE LAS CONDICIONES DE DIFERENCIACIÓN PARA LAS 
CÉLULAS NEURO 2ª 50 
4.4. ACTIVIDAD DEL PROMOTOR DE Nax EN CÉLULAS NEURO 2A DIFERENCIADAS 55 
4.4.1. Neuro 2A transfectadas y posteriormente diferenciadas 56 
4.4.2. Transfección de células Neuro 2A previamente diferenciadas 59 
4.5. MICROINYECCIÓN DE LAS CÉLULAS NEURO 2A 65 
4.5.1. Microinyección de las células Neuro 2A en crecimiento 65 
4.5.2Microinyección de las células Neuro 2A diferenciadas 69 
5. DISCUSIÓN 71 
6. CONCLUSIONES 81 
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 82 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMEN 
 
El estudio de la transcripción puede llevarnos a comprender cómo es posible que los 
genes se expresen en el momento, en el nivel y en el tipo celular específicos. Un buen 
modelo para este tipo de estudios son los genes que se expresan preferencialmente en 
algún tejido como es el caso de Scn7a que codifica para el canal de sodio Nax, un canal 
que se activa con una concentración extracelular de Na+ ≥ a 150mM y que se expresa 
preferencialmente en neuronas de ganglio de raíz dorsal (DRGN). El promotor del gen de 
Nax de ratón no posee caja TATA, tiene varios sitios de inicio de la transcripción y su 
promotor basal mide aproximadamente 0.2kb (0.2Nx). 0.2Nx dirigiendo la expresión del 
gen reportero de la proteína verde fluorescente (EGFP) fue transfectado junto con 
pDsRed2-N1 (vector con la proteína roja fluorescente trascrita por el promotor CMV) a 
concentración equimolar en células de neuroblastoma Neuro 2A observándose que 
ambos vectores presentan una fuerte expresión a las 48 h, sin embargo, al 
microinyectarlos en DRGN la expresión de la proteína DsRed2 es mucho menor que la de 
EGFP. El presente estudio estuvo enfocado a probar si la expresión diferencial de las dos 
proteínas reporteras se debía al promotor que las transcribe y a que las DRGN no se 
replican y que las Neuro 2A sí lo hacen. Para esto, se transfectaron células Neuro 2A con 
vectores con las proteínas reporteras EGFP y DsRed2 transcritas tanto por 0.2Nx como 
por CMV obteniendo como resultado que EGFP tiene una expresión alta desde las 24 h 
mientras que la proteína DsRed2 se expresa poco a las 24 h independientemente del 
promotor que regule la expresión de cualquiera de las dos proteínas. Además tanto la 
proteína EGFP como DsRed2se transcriben mejor por CMV. Para probar si la expresión 
de las proteínas reporteras es distinta en células diferenciadas (que no se replican) se 
estableció que las mejores condiciones de diferenciación para las células Neuro 2A son 
en un medio con suero fetal bovino al 1% y dbAMPc a 10 mM. Las células diferenciadas 
fueron transfectadas con EGFP regulada tanto por 0.2Nx como por CMV observándose 
que solo se presentó un 10% de la expresión de esta proteína cuando está regulada por 
Nax lo que puede deberse a que las células diferenciadas se transfectan a menor 
eficiencia o a que no expresan las proteínas reporteras. Para poder descartar entre estas 
dos posibilidades se introdujo al DNA a analizar por microinyección en células Neuro 2A 
diferenciadas y no diferenciadas. 
 
Palabras clave: Transcripción, canal de sodio, Nax, promotor, Neuro 2A, microinyección, 
transfección, plásmido, EGFP, replicación, regulación transcripcional. 
 
 
 
1. INTRODUCCIÓN 
Si se examinara la composición de los organismos vivos átomo por átomo, 
molécula por molécula, se observaría que cada uno de estos componentes cumple 
con las leyes físicas y químicas que describen el comportamiento de la materia 
inanimada. Sin embargo, en los organismos vivos todos estos átomos y moléculas 
forman una estructura material sumamente organizada y compleja la cual confiere 
propiedades únicas y comunes en los seres vivientes. 
La primera característica de los seres vivos es que su unidad estructural es 
la célula (Alberts, 2002). Las células en sí tienen una organización específica, 
todas tienen tamaño, formas y funciones características por las cuales pueden ser 
reconocidas. Algunos organismos están formados por una sola y otros, los más 
complejos están formados por varias, lo que implica la necesidad de coordinación 
y comunicación entre ellas. 
La siguiente característica es el crecimiento y el desarrollo. El crecimiento 
hace referencia a que todo ser vivo tiende a incrementar el tamaño y/o su número 
de células, en algunos este proceso perdura durante su vida y en otros solamente 
se da en una etapa específica (Audesirk, 2003). Por otro lado, el desarrollo implica 
todos los cambios morfológicos y cualitativos que ocurren durante la vida del 
organismo. 
El metabolismo es otra de las propiedades específicas de los seres vivos. 
Los organismos necesitan materiales y energía que obtienen a través de una 
suma de reacciones químicas que permiten su crecimiento, conservación y 
reparación. 
La siguiente característica es, la homeostasis. Para mantenerse vivos y 
funcionar correctamente los organismos deben mantener la constancia del medio 
interno de su cuerpo (Lenhinger, 1995). Entre las condiciones que deben regular 
se encuentran: la temperatura, el pH, el contenido de agua, la concentración de 
iones, etc. Gran parte de la energía de un ser vivo se destina a mantener el medio 
interno dentro de límites homeostáticos. 
 
 
 
Los seres vivos son capaces de detectar y responder a cambios físicos y 
químicos del medio ambiente, ya sea interno ó externo, a esta otra característica 
la llamamos irritabilidad. 
Y finalmente hemos llegado a la sexta propiedad de los seres vivos que es 
quizá, la más compleja y distintiva, el hecho de que puedan reproducirse gracias a 
su capacidad de almacenar información genética. La regulación exacta del 
mensaje genético define a las especies, permite distinguirlas entre ellas y asegura 
su continuidad a lo largo de sucesivas generaciones (Lewin, 2000). 
 
1.1. REGULACIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA 
La regulación genética es el complejo sistema de instrucciones que 
determina la expresión de los genes. El control preciso de la información genética 
es justamente aquello que le permite a las células mantener un elevado grado de 
orden dentro de un universo caótico. Los mecanismos de regulación pueden 
llevarse a cabo a diferentes niveles, por ejemplo: la síntesis de RNA (trascripción), 
la síntesis de proteínas (traducción), la replicación, la recombinación y la 
reparación del material genético ente otros (Lenhinger, et al., 1995). 
En este trabajo se hace hincapié en uno de los pasos clave en regulación 
genética, la transcripción, pues es gracias a su control que los genes pueden 
encenderse y apagarse en cierto momento, nivel y sitio. 
 
1.1.1. LA TRANSCRIPCIÓN 
La transcripción es un paso primordial dentro de los mecanismos de 
regulación genética (Hahn, 2004). Miles de genes tienen que ser encendidos y 
apagados de manera absolutamente controlada en forma temporal y espacial para 
producir patrones particulares de expresión en los diferentes tipos celulares de los 
organismos, la iniciación de la transcripción es quien ofrece buena parte de dicho 
control (Barberis y Petrascheck, 2003; Guido, et al. 2003). Este proceso presenta 
 
 
 
diferencias fundamentales si se lleva a cabo en procariontes o en eucariontes, sin 
embargo, los principios básicos sobre su mecanismo están conservados en ambos 
grupos (Struhl, 1999; Lewin, 2000). 
 
El proceso general de transcripción consiste en la síntesis de RNA a partir 
de una cadena molde de DNA la cual es leída por un conjunto de enzimas 
denominado RNA polimerasas que hacen la transferencia de información 
siguiendo las reglas de complementariedad de las bases nitrogenadas, la A del 
DNA empareja con una U del RNA, la G con la C, la C con la G y la T con la A 
(Kadonaga, 2004). El RNA producto de la transcripción recibe el nombre de 
transcrito. En eucariontes existen tres tipos de RNA polimerasas (I, II y III), las 
cuales sintetizan diferentes tipos de RNA. La RNA polimerasa II es la enzima 
encargada de transcribir aquellos genes que codifican proteínas. 
 
La transcripción incluye tres estadios distinguibles en los cuales pueden 
generarse condiciones críticas para establecer la regulación de la expresión de los 
genes (Orphanides, 1996; Alberts, et al., 2002): 1) la iniciación, que es el estadio 
en donde una serie de proteínas denominadas factores de transcripción (FT’s) en 
conjunto con la RNA polimerasa localizan y se unen a un sitio específico del DNA 
llamado promotor que dará pauta a la síntesis del RNA, 2) la elongación, es la 
etapa en donde la RNA polimerasa añade ribonucleótidos en el extremo 3’ de la 
cadena naciente de RNA y 3) la terminación, en donde el complejo de 
transcripción es desensamblado una vez finalizada la elongación. La terminación 
está señalizada por la información contenida en sitios de la secuencia del RNA 
que se está transcribiendo. 
 
El inicio de la transcripción es quizá el estadio más determinante dentro del 
mecanismo de transcripción. La región específica en la secuencia de DNA a la que 
se unen los factores de transcripción y la RNA polimerasa y que determina la 
orientación y el sitio de inicio de la transcripción se denomina promotor o región 
promotora (Conaway, et al. 1991; Orphanides y Reiberg, 2002; ). La importancia 
 
 
 
de este paso radica en la especificidad de los genes para encenderse o apagarse 
en el lugar y tiempo indicados (Hahn, 2004). Cabe mencionar que antes del inicio 
de la transcripción hay una cascada de eventos de gran importancia, entre ellos se 
encuentran cambios en la estructura de la cromatina y la participación de varios 
elementos que incentivan el inicio de la transcripción (Emerson, 2002). 
 
En las regiones promotoras existen varios tipos de elementos o motivos los 
cuales permitirán el reclutamiento de la maquinaria transcripcional. Dentro de 
estos motivos se encuentra la caja TATA (Conaway, et al. 1991), la cual esta 
localizada normalmente de 25 a 30 nt río arriba del sitio de inicio de la trascripción. 
El iniciador (Inr) es otro de los elementos que pueden encontrarse, es muy 
cercano al sitio de inicio de la transcripción y se ha encontrado en una gran 
variedad de promotores eucariontes (Rangarajan y Padmanaban, 1989;Lemon y 
Tjian, 2000). Otro motivo es el llamado downstream core promoter element (DPE), 
que es más comúnmente localizado en promotores que no poseen caja TATA y ha 
sido más estudiado en la mosca Drosophila que en mamíferos (Burke y Kadonaga, 
1997). Las islas CpG son otros de los elementos más comunes en los promotores, 
son secuencias ricas en GC y tienen gran afinidad por factores de transcripción 
como Sp1 y otros relacionados (Bird, 1986; Antequera y Bird, 1993). Cabe 
mencionar que regularmente los promotores con islas CpG tienen múltiples sitios 
de inicio de la transcripción. 
 
Los elementos descritos anteriormente pueden estar o no presentes en una 
región promotora, su combinación, posición y secuencia es lo que le confiere una 
alta especificidad al promotor para iniciar la expresión de un gen (Larsen, et al. 
1995). El análisis de los promotores contribuye a determinar aspectos 
fundamentales sobre como ocurre la transcripción y la regulación de la información 
genética en eucariontes y puede ayudar a entender como es que un gen se 
expresa en el momento, en el nivel y en el tipo celular específicos. Este 
conocimiento básico es parte del comienzo de nuestro entendimiento molecular de 
la vida. 
 
 
 
Un buen modelo para el estudio de los promotores eucariontes son los de 
aquellos genes que tienen una expresión preferencial en algún tejido, como por 
ejemplo, el gen Scn7a, un gen que codifica para un canal de sodio perteneciente a 
la familia de los canales de Na+ dependientes de voltaje denominado Nax, cuya 
actividad promotora fue analizada en el presente trabajo. 
 
1.2. Nax Y LOS CANALES DE SODIO DEPENDIENTES DE VOLTAJE 
 
Los canales de sodio dependientes de voltaje (NaChs) son moléculas 
proteícas que están situadas en la membrana celular de diferentes tipos de células 
tanto excitables como no excitables. Los NaChs son componentes cruciales para 
la modulación de la permeabilidad a Na+ lo que les confiere una participación muy 
importante en un gran número de procesos fisiológicos indispensables para la 
sobrevivencia de los organismos (Caterall, 1984; Aidley y Stanfield, 2001). 
 
Los NaChs están constituidos por una subunidad α que puede estar o no 
asociada con una o dos subunidades β (Goldin, 2001). Las subunidades α 
consisten de cuatro dominios homólogos (I-IV), cada uno contiene seis segmentos 
transmembranales (S1-S6) y una asa que forma el poro. El cuarto segmeto 
transmembranal (S4) está cargado positivamente (Novarovic et al. 2001), y es el 
que actúa como sensor de voltaje, está involucrado en la apertura y cierre del 
canal (ver Figura 1). Las subunidades β (β1, β2, β3 y β4) presentan grandes 
dominios N-terminal extracelulares, un solo segmento transmembranal y un 
dominio citoplasmático más pequeño. 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 1. Estructura típica de 
la subunidad α de un canal 
de sodio dependiente de 
voltaje. La imagen muestra 
los 4 dominios homólogos (I-
IV) y los seis segmentos 
transmembranales de cada 
uno (1-6). Entre los 
segmentos 5 y 6 se observa 
un asa que forma el poro del 
canal. En rojo se muestran 
las cargas positivas del 
segmento 4 el cual actúa 
como sensor de voltaje. 
(Tomado de Noda, 2006) 
 
 
 
En mamíferos la familia de NaChs está compuesta por 10 miembros. Todas 
estas isoformas de canales de sodio son distintas en términos de su expresión 
durante el desarrollo y el tejido en donde se expresan mayoritariamente, además 
demuestran diferencias en sus propiedades eléctricas como conductancia y 
velocidad de activación lo cual les confiere diferencias electrofisiológicas 
significativas (Catterall, et al., 1992 y Lopreato, et al. 2001). 
 
Desde el punto de vista evolutivo, algunas de estas isoformas están más 
cercanas a otras, como puede observarse en el árbol filogenético de la figura 2. 
Los genes para cinco isoformas (Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.7 y Nax) están 
localizados en el cromosoma 2 tanto en ratón como en humano. Los genes para 
las isoformas Nav1.5, Nav1.8 y Nav1.9, están localizadas en el cromosoma 9 de 
ratón y en el cromosoma 3 de humano. Y finalmente los genes para las isoformas 
Nav1.4 y Nav1.6 están localizados en dos cromosomas diferentes y cada uno 
puede considerarse como un tipo separado (Goldin, 2002; Yu y Catterall, 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 2. Árbol filogenético de la familia Nav1, realizado por el método de máxima 
parsimonia. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de 
humano, rata y ratón se realizó con el programa Clustal X, la filogenia se construyó y se 
resumió con el método de máxima parsimonia utilizando el programa MEGA 3.1 (Kumar, 
et.al, 2004). La barra inferior representa 100 sustituciones de aminoácidos y las cifras en los 
nodos representan los valores de Bootstrap de 1000 repeticiones. (Tomado de: Poot-
Hernández, 2007). 
 
 
 
La organización de los genes de canales de sodio corresponden con la 
hipótesis de que cuatro grupos de genes de canales de sodio resultaron a partir de 
las duplicaciones del genoma de los vertebrados que generaron cuatro grupos de 
genes HOX y una duplicación adicional de los cromosomas 2 y 9 en ratón y 2 y 3 
en humano que generó el resto de los canales (Lopreato, et al, 2001; Goldin, 
2001; Novak, et al, 2006). 
 
De los 10 miembros de la familia de canales de sodio dependientes de 
voltaje hay uno que tiene propiedades muy distintas al resto, es el llamado canal 
Nax, este canal está codificado por el gen Scn7a y su región codifícante está 
conformada por 25 exones que suman mas de 100 Kb (Poot-Hernández, 2007), su 
secuencia de aminoácidos tiene solamente un 50% de identidad con respecto a 
los demás NaChs. Las regiones de Nax que presentan variación son precisamente 
las que le confieren características funcionales particulares; en primer lugar hay 
significativamente menor cantidad de cargas positivas en el segmento S4, que 
como se mencionó anteriormente es esencial para sensar el voltaje, en segundo 
lugar el interdominio III-IV el cual está involucrado en la inactivación rápida del 
canal está poco conservado (Noda, 2006). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 3. Comparación de la secuencia de aminoácidos de los 
canales Nav1.2, Nav1.7 y Nax de ratón. En rojo se marcan los 
aminoácidos conservados entre las secuencias. Nav1.7 es el 
canal evolutivamente más cercano a Nax. (Tomado de: Noda, 
2006) 
 
 
 
Estas diferencias fueron las que dieron pauta a realizar estudios que 
pudieran dar a conocer la verdadera forma de activación de este canal y lo que se 
ha observado es que Nax actúa como sensor de los niveles de sodio en los fluidos 
corporales pues se activa cuando la concentración extracelular de dicho ión es 
mayor o igual a 150mM de manera independiente al voltaje (Hiyama, et al, 2002). 
 
Otro de los aspectos peculiares del canal Nax son sus sitios de expresión; 
este canal, se expresa abundantemente en neuronas de ganglio de raíz dorsal 
(DRGN) (Gautron et al, 1992; Akopian, et al., 1997; Watanabe et al, 2000) y en 
subpoblaciones neuronales del cerebro muy específicas como lo son los órganos 
circunventriculares (CVO) (Watanabe, et al. 2006), principalmente en el órgano 
subfornical (SFO) , en el órgano vasculoso de la lámina terminal (OVLT), en la 
eminencia media (ME), la neurohipófisis (NHP) y el área postrema (AP). Además 
se ha visto la expresión de Nax en células de Schwann no mielinizadas, células 
ependimales, pulmón (únicamente en las células alveolares de tipo II) y en 
corazón (Felts, et al., 1997; Watanabe, et al, 2002). 
 
Es importante señalar que los lugares de expresión del canal Nax 
mencionados anteriormente fueron descritos en distintas especies (hasta ahora 
todas ellas mamíferos) y que además los niveles de este canal pueden variar 
según la etapa del desarrollo del organismo. Hasta ahora se sabe que el canal Nax 
es la moléculadel SFO que detecta y regula el sodio en los fluidos corporales y 
que está relacionado con la ingesta de sal (Watanabe, et al, 2000), sin embargo, 
se desconoce su función en los otros tipos celulares en donde se expresa. Otra de 
las probables funciones que se le ha atribuido en pulmón por ejemplo, es que 
pueda ayudarle a otros canales de sodio epiteliales (independientes de voltaje) a 
mantener el espacio alveolar libre de agua (O’Brodovich, et al. 1991). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La figura 4 expone el modelo propuesto por Shimizu y cols. en el 2007 
sobre el mecanismo mediante el cual el canal Nax podría estar regulando la 
ingesta de sodio en ratón. Este grupo propone que cuando la concentración de 
Na+ en el plasma llega arriba de 150 mM el canal se abre produciendo un 
incremento en la concentración del Na+ intracelular lo que sobreactiva a la 
Na+/K+ATPasa. Esta sobreactivación produce un requerimiento extra de ATP el 
cual es proporcionado vía glucólisis anaerobia. El lactato que se genera en esta 
vía es liberado al espacio extracelular en donde es captado por neuronas 
circundantes en las cuales se incluyen neuronas GABAérgicas del SFO que son 
posiblemente las encargadas de regular la ingesta de sodio. 
 
Fig. 4. Esquema del modelo propuesto para explicar como es 
que Nax regula la ingesta de sodio en ratón. (Tomado de 
Shimizu, et al. 2007) 
 
 
 
Nax , como en el caso de la mayoría de los miembros de la familia de 
canales de sodio dependientes de voltaje, fue nombrado de diversas maneras 
según el lugar y el organismo en que se aisló por primera vez; en astrocitos de 
rata se denominó NaG (Gautron, et al., 1992); en corazón y útero de humano se 
denominó Nav2.1 (George, et al., 1992); después se describió la isoforma Nav2.3 
en células tumorales atriales de ratón (Felipe, et al., 1994) más tarde lo 
denominaron SCL11 en ganglios de raíz dorsal de rata (Akopian, et al., 1997), 
finalmente todas estas isoformas encontradas pertenecen a ortólogos del mismo 
gen (Scn7A) y corresponden al canal Nax (Catterall, 2000) 
 
1.2.1. LA REGULACIÓN GENÉTICA DE NAx 
 
Como se mencionó anteriormente, la expresión de un gen de manera 
específica en un tipo celular depende de varias acciones bien coordinadas durante 
el inicio de la transcripción y que uno de los elementos indispensables para que 
esto se lleve a cabo es la región reguladora en el DNA denominada promotor. 
 
En 1999 fue estudiado por primera vez el promotor del gen de Nax (Scn7A) 
en rata (Poiraud y cols), se observó que dicho promotor carece de caja TATA y 
posee múltiples sitios de inicio de la transcripción. La ausencia de caja TATA se 
ha observado comúnmente en varios promotores de genes neuronales, sin 
embargo, no es específico de estos; análisis recientes sobre las características de 
los promotores en mamíferos han demostrado que tan solo un 30% de los 
promotores caracterizados hasta ahora presentan este elemento de regulación 
(Hahn, 2004; Fukue, et al., 2005). 
 
Poiraud y colaboradores (1999) también realizaron análisis de distintas 
regiones del promotor de Nax de rata para identificar regiones que le confirieran 
expresión tejido-específica. Por los resultados obtenidos mediante el uso de 
ratones transgénicos, este grupo sugirió que una región de 600 pb (de la base -
375 hasta el final del primer exón) contiene los elementos necesarios para la 
 
 
 
expresión específica en neuronas tanto del sistema nervioso central como las del 
sistema nervioso periférico, además mencionan que la región que va de -6 500 a -
1 050 nt contiene los elementos para la expresión de Nax en glía y por último 
señalan que la porción entre -1 050 y -375 nt es necesaria para expresarse en 
pulmón. 
 
Otro de los datos interesantes obtenidos en el trabajo de Poiraud y cols. en 
1999 fue una serie de motivos de unión a factores de transcripción, entre ellos un 
motivo PEA3, un motivo de unión Hox, un posible motivo E-box, dos motivos 
NRSF/REST y una región rica en GC’s, los autores señalan que existen 
elementos de expresión específica en la región correspondiente al promotor 
mínimo y al primer exón del gen. Cabe mencionar que un promotor mínimo, es la 
secuencia mínima suficiente para iniciar el proceso de transcripción, pues es 
capaz de reclutar la maquinaria básica (RNA polimerasa II y factores generales de 
transcripción) para que dicho proceso se lleve a cabo (Sandelin, et al. 2007). El 
análisis de estas regiones contribuye a dilucidar aspectos fundamentales sobre el 
como ocurre la transcripción en general y de un gen en particular (Barberis y 
Petrascheck, 2003; Fukue, et al., 2005, Sandelin, et al. 2007) 
 
Dos años más tarde, el equipo de Gautron y cols. (2001) también realizaron 
un análisis del promotor de Nax de rata pero usando una estrategia diferente. Por 
transfección transitoria de plásmidos con distintas regiones del promotor de Nax 
dirigiendo la expresión de genes reporteros, este grupo determinó que la región 
del primer exón y 375 pb río arriba de ésta tienen una alta actividad transcripcional 
en células gliales (datos que no corresponden con los resultados de Poiraud y 
cols. en ratones transgénicos) y que además una región que se ubica dentro del 
primer intrón se comporta como elemento de regulación negativa. El equipo de 
Gautron también realizó un análisis de huellas en el DNA de las regiones del 
promotor que unen a factores de transcripción en donde ubican un probable 
motivo E-box y una región rica en GC’s. 
 
 
 
 
Por otra parte, también se han hecho análisis del promotor de Nax de ratón. 
Este promotor fue caracterizado en nuestro laboratorio y al igual que en el 
promotor de rata se observó la ausencia de una caja TATA y de un elemento 
iniciador (Inr) y la presencia de múltiples sitios de inicio de la transcripción 
(Morales-Buendía, 2003; García-Villegas, et al. 2009). 
 
Los sitios de inicio de la transcripción fueron identificados por ensayos de 
RACE (Amplificación rápida de extremos de cDNA por sus siglas en inglés) al 5’ y 
además se reveló la estructura exónica de la región 5’ no traducida (5’ UTR ó 5’ 
RNT) (Fig. 5). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 5.Caracterización del extremo 5´ del canal de sodio Nax. A) Es la secuencia parcial del fragmento 
genómico correspondiente al promotor transcripcional del gene del canal de sodio Nax. Las flechas indican 
los sitios de inicio de la transcripción. Con letras mayúsculas y dentro del recuadro se muestra el exón 1, 
subrayado y en cursivas se observan sitios reconocidos por enzimas de restricción, y subrayado se 
representan los probables motivos de unión a factores de transcripción. B) Estructura del extremo 5´ del gen 
de Nax donde se representa el exón 1 que corresponde a región no traducida, las líneas quebradas 
representan el intrón 1. Se muestra también el sitio de iniciación de la traducción (AUG) localizado en el exón 
2 ( Tomado de Morales-Buendía, 2003). 
 
 
 
Otro de los estudios importantes de nuestro laboratorio fue la 
caracterización funcional del promotor de ratón del canal Nax; para esto, se 
llevaron a cabo eliminaciones seriales de la región 5’ río arriba del inicio de la 
transcripción identificada en el estudio de Morales- Buendía, 2003 y García-
Villegas y cols., 2009 (Fig. 6). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Una vez obtenidos los fragmentos con distintas regiones del promotor se 
clonaron en vectores dirigiendo la expresión del gen reportero luciferasa. Las 
construcciones fueron transfectadas en las líneas neuronales Neuro 2A 
(neuroblastoma de ratón) y NG108-5 (neuroblastoma de rata), y en las líneas no 
neuronales C6 (glioma de rata) y L6 (mioblasto de rata). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 6. Esquema del fragmento genómico y las eliminaciones de secuencias hacia el extremo 5’ delpromotor de Nax. 
Representación esquemática de los diferentes segmentos del promotor Nax clonados en el vector pGL3-Básico que contiene el 
gene reportero de la proteína luciferasa (Luc), los símbolos representan motivos de unión a factores reguladores de la 
transcripción (Tomado de García-Villegas, 2009). 
Fig. 7. Actividad del promotor de Nax medido con el gen reportero luciferasa en las líneas celulares neuronales 
Neuro 2A y NG108-15 y no neuronales C6 y L6. La construcción que corresponde al promotor basal y que presenta la 
mayor actividad transcripcional en todas las líneas celulares está indicada con una flecha negra (Tomado de García-
Villegas, 2009). 
 
 
 
 
Los resultados permitieron determinar la región correspondiente al promotor basal 
de Nax por ser la región mínima necesaria que pudo promover actividad transcripcional 
máxima en las cuatro líneas celulares probadas; dicha región tiene un tamaño de 0.2 kb 
(va del nt -49 al +194) y posee un elemento E-box y un sitio de unión al factor de 
transcripción NGFI-C como se señala en la Figura 6. Adicionalmente, se observó que la 
región promotora de 3.6 kb (hasta ahora la región más grande analizada en nuestro 
laboratorio; de -3413 a +194) no contiene todos los elementos de regulación tejido-
específicos (García-Villegas et al., 2009). 
 
 Otro dato que llama la atención de este trabajo es que a medida que se hacen 
eliminaciones de la región de 3.6 kb del promotor de Nax hay un incremento en la 
expresión del reportero, lo que sugiere la presencia de elementos de regulación negativa 
hacia la región 5’ (Fig.7). 
. 
1.2.1.1. ANTECEDENTES DIRECTOS 
 
La razón de pensar que la región del promotor de Nax de ratón que va del nt -3413 
al nt +194 no tenga todos elementos de regulación tejido-específicos es justamente la 
presencia de actividad transcripcional en las líneas celulares no neuronales (C6 y L6) que 
no expresan el canal Nax endógenamente. Otra interpretación de este resultado es que 
hayan sido las líneas neuronales usadas (Neuro2A y NG108-5) las que no contengan 
algún factor necesario para la expresión específica del promotor, que si se encuentre en 
neuronas verdaderas (postmitóticas que no se replican) (López-Álvarez, 2006). 
 
Diferentes estudios han reportado que varios promotores de genes que se 
expresan únicamente en neuronas no presentan elementos de regulación neuronal en 
líneas celulares de neuroblastoma, estos datos dieron pauta a probar la actividad del 
promotor de Nax de ratón en cultivos primarios de neuronas de ganglios de raíz dorsal 
(DRGNs), la razón de usar estas células fue el tener un sistema con las condiciones 
fisiológicas más aproximadas a las que se tienen en un organismo completo con células 
de fenotipo neuronal. Lo que se hizo fue lo siguiente: los fragmentos de 0.2 kb (promotor 
basal de Nax) y de 3.6 kb se clonaron dirigiendo la expresión del gen reportero de la 
proteína verde fluorescente (p0.2Nx-EGFP y p3.6Nx-EGFP respectivamente), dichas 
construcciones fueron microinyectadas junto con el vector pDsRed2-N1 (vector con la 
 
 
 
proteína roja fluorescente transcrita a partir del promotor CMV) a concentraciones 
equimolares en células Neuro 2A observándose que ambas proteínas reporteras 
presentan un alto nivel de expresión a las 48 h después de la inyección, sin embargo, al 
ser microinyectadas en neuronas en cultivo primario de DRG la expresión de la proteína 
EGFP es mucho mayor que la de DsRed2 sugiriendo una expresión diferencial de los 
promotores de Nax (p0.2Nx, p3.6Nx) y CMV con respecto a lo observado en células Neuro 
2A. Adicionalmente se observó que el promotor CMV prácticamente no funciona en 
neuronas de DRG (López-Álvarez, 2006). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
1 2 3 4
Días posinyección
F
lu
o
re
sc
en
ci
a 
(u
.a
.)
0.2Nx
CMV
0
10
20
30
40
1 2 3 4
Días post-inyección
N
ú
m
er
o
 d
e 
n
eu
ro
n
as
EGFP
EGFP y DsRed2
DsRed2
0
500
1000
1500
24 48
Horas posinyección
F
lu
o
re
sc
en
ci
a 
(u
. a
.)
0.2Nx
CMV
Fig. 8. Expresión diferencial del promotor basal de Nax (0.2Nx) y del promotor CMV en neuronas 
de DRG. A) Gráfica que muestra la expresión de la proteína EGFP transcrita por 0.2Nx y de DsRed2 
transcrita por CMV en células Neuro 2A coinyectadas con ambos plásmidos a concentración equimolar 
B) Gráfica que representa la expresión de EGFP transcrita por 0.2Nx y de DsRed2 transcrita por CMV en 
DRGN’s coinyectadas con ambos plásmidos a concentración equimolar. C)Gráfica que muestra el 
número total de células microinyectadas que expresaron solamente EGFP, DsRed2 ó ambos reporteros 
en DRGN’s. En verde, células que expresan EGFP, en rojo células que expresan DsRed2 y en naranja 
células que expresan ambas proteínas. (Tomado de López-Álvarez, 2006). 
 
A B 
C 
 
 
 
El presente estudio estuvo enfocado a probar si la expresión diferencial de 
las dos proteínas reporteras EGFP y DsRed2 se debe a diferencias funcionales en 
los promotores Nax y CMV que las transcriben en los dos contextos celulares: en 
neuronas de DRG que son células posmitóticas que no se replican y en células 
Neuro 2A que sí lo hacen. Para respondernos esto se compararon los niveles de 
expresión de las proteínas reporteras EGFP y DsRed2 transfectadas en células 
Neuro 2A transcritas tanto por el promotor basal de Nax (0.2Nx) como por el 
promotor CMV. Para probar si la expresión de las proteínas reporteras se ve 
afectada por el grado de diferenciación (ausencia de replicación), se compararon 
los niveles de expresión de la proteína reportera EGFP transfectada en células 
Neuro 2A diferenciadas (que no se replican) y no diferenciadas (en crecimiento). 
2. OBJETIVOS 
 
OBJETIVO GENERAL. 
 
Determinar la actividad del promotor del canal de sodio Nax de ratón en la línea 
celular Neuro 2A en crecimiento y diferenciada con dbAMPc. 
 
 
OBJETIVOS PARTICULARES. 
 
a) Construir el plásmido con el fragmento correspondiente al promotor basal (0.2 
kb) de Nax transcribiendo al gen reportero de la proteína roja fluorescente (p0.2Nx-
DsRed2). 
 
b) Construir el plásmido con el fragmento de 3.6 kb del promotor de Nax más el 
gen reportero de la proteína roja fluorescente (p3.6Nx-DsRed2). 
 
d) Transfectar transitoriamente los plásmidos en las células de la línea Neuro 2A 
en crecimiento y medir la expresión de las proteínas reporteras. 
 
e) Optimizar las condiciones de diferenciación para la línea celular Neuro 2A. 
 
f) Transfectar transitoriamente los plásmidos en las células de la línea Neuro 2A 
diferenciadas y medir la expresión de las proteínas reporteras. 
 
g) Microinyectar las construcciones en células Neuro 2A en crecimiento y 
diferenciadas. 
 
 
 
 
3. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
3.1. PLÁSMIDOS USADOS 
 
En la Tabla I se describen los plásmidos usados en este trabajo y se explica brevemente 
la utilidad que se les dió. 
 
TABLA I. Descripción de los vectores utilizados en este trabajo. 
 
Plásmido Descripción Utilidad Referencia 
 
pEGFP-1 
Vector con la proteína verde fluorescente sin 
promotor. Confiere resistencia a kanamicina. 
 
Control de fondo 
transcripcional. 
Prasher,, et al. 
(1992). Obtenido de 
Clontech. 
 
 
pEGFP-C1 
Expresa la proteína verde fluorescente 
transcrita por el promotor de citomegalovirus 
humano CMV. Confiere resistencia a 
kanamicina. 
 
Vector de expresión 
y control de 
eficiencia de 
transfección. 
Prasher , et al. 
(1992). Obtenido de 
Clontech. 
 
 
p0.2Nx-EGFP 
Expresa la proteína verde fluorescente 
transcrita por el promotor basal del canal Nax 
de ratón. Confiere resistencia a kanamicina. 
Vector de expresión 
y de obtención del 
promotor basal de 
Nax. 
López-Álvarez, 2006. 
 
 
 
 
p3.6Nx-EGFP 
Expresa la proteína verde fluorescente 
transcrita por la región del promotor de Nax 
de ratón más grande caracterizadahasta el 
momento en nuestro laboratorio. Confiere 
resistencia a kanamicina. 
 
Vector de expresión 
y de obtención del 
promotor de 3.6 kb 
de Nax. 
López-Álvarez, 2006. 
 
 
 
p3.6Nx-Luc 
Expresa el gen reportero de la luciferasa 
transcrito por la región del promotor de Nax 
de ratón más grande caracterizada hasta el 
momento en nuestro laboratorio. Confiere 
resistencia a kanamicina. 
 
Vector de obtención 
del promotor de 3.6 
kb de Nax. 
Morales-Buendía, 
2003. 
 
 
pDsRed2-wcp 
Expresa la proteína roja fluorescente sin 
promotor. Confiere resistencia a kanamicina. 
Vector de clonación y 
de control de fondo 
transcripcional. 
Este trabajo. 
 
 
p0.2Nx-DsRed2 
Expresa la proteína roja fluorescente 
transcrita por el promotor basal del canal Nax 
de ratón. Contiene un cassette de resistencia 
a neomicina y kanamicina. 
 
Vector de expresión. Este trabajo 
 
 
 
pDsRed2-N1 
Expresa la proteína roja fluorescente transcrita 
por el promotor de citomegalovirus humano 
CMV. Contiene un cassette de resistencia a 
neomicina y kanamicina. 
 
Vector de expresión y 
de control de 
eficiencia de 
transfección. 
Matz,, et al. 1999; 
Kozak, 1987. 
Obtenido de Clontech. 
 
 
pBlue Script II SK + 
Vector sin promotores eucarióticos. Confiere 
resistencia a ampicilina. 
Competar la cantidad 
(masa) de DNA 
transfectado. 
Alting-Mees y Short, 
1989. Obtenido de 
Stratagene. 
 
 
 
1 
 
3.2. PURIFICACIÓN DE DNA PLASMÍDICO 
 
3.2.1. Extracción de DNA plasmídico por lisis alcalina (MINIPREP) 
 
Para realizar la extracción de DNA por lisis alcalina se transfirieron colonias bacterianas 
independientes a 5 ml de cultivo Luria-Bertani (LB) con el antibiótico adecuado (al que 
presentara resistencia el plásmido que deseaba seleccionarse) y se creció a 37 °C con 
agitación constante durante toda la noche. Transcurrido este tiempo los 5 ml de cultivo se 
centrifugaron a máxima velocidad durante 1 minuto. Se retiró el sobrenadante y la pastilla 
se resuspendió en 200 µL de solución I fría (glucosa 50 mM, Tris 25 mM pH 8, EDTA 10 
mM pH 8). Una vez disgregada la pastilla se agregaron 400 µL de solución II (NaOH 0.2 
N, SDS 1%) recién preparada, se mezcló por inversión y se mantuvo en hielo durante 4 
minutos, posteriormente se agregaron 300 µL de solución III estéril fría (para 100 ml: 60 
ml de acetato de potasio 5 M, 11.5 ml de ácido acético y 28.5 ml de agua desionizada) 
mezclándolos por inversión. La mezcla se centrifugó a máxima velocidad durante 5 
minutos, el sobrenadante se recuperó y transfirió a un tubo limpio al cual se le agregaron 
480 µL de isopropanol durante 15 minutos. Posteriormente las muestras se centrifugaron 
a máxima velocidad durante 5 minutos. La pastilla se lavó con 1 ml de etanol al 70% y se 
dejó secar al aire por un periodo de 5 minutos para después resuspenderla en 50 µL de 
TE (Tris 10 mM y EDTA 1 mM, pH 8) (Sambrook y Russell, 2001a). 
 
3.2.2. Extracción de DNA plasmídico por columna 
 
Una vez confirmadas las construcciones por restricción se extrajo DNA plasmídico 
siguiendo las instrucciones del fabricante a partir de 50 ml de cultivo o bien a partir de 500 
ml de cultivo con el kit Plasmid Midi (Qiagen) y EndoFree plasmid Maxi kit (Qiagen) 
respectivamente. El DNA que se obtuvo de esta manera fue usado para los experimentos 
de transfección y microinyección. 
 
3.2.3. Purificación de fragmentos de DNA de gel de agarosa 
 
Para extraer el DNA de los geles de agarosa se cortó la banda que correspondía al DNA 
de interés y se utilizó el kit SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) para purificarlo 
de acuerdo al protocolo del fabricante. Para poder observar el DNA se utilizó una lámpara 
2 
 
UV modelo UVGL-25 Mineralight lamp multiband UV-254/365 NM para evitar el daño al 
DNA por irradiación con luz UV y la aparición de mutaciones. 
 
3.3. DIGESTIÓN DEL DNA PLASMÍDICO 
 
3.3.1. Digestión con enzimas de restricción para la construcción de plásmidos 
 
Para poder realizar la construcción de los vectores utilizados en los experimentos de 
transfección y microinyección fue necesario el uso de enzimas de restricción pues con 
ellas obtuvimos, insertamos y eliminamos los fragmentos de DNA de interés. De manera 
general se usaron de 3 a 5 unidades de enzima por µg de DNA, 1x del buffer 10x 
recomendado para cada enzima, 1x de BSA 10x y agua desionizada estéril. Esta reacción 
se dejó incubando por un periodo de 1.5 a 24 horas a la temperatura especificada para 
cada enzima. 
 
3.3.2. Digestión con enzimas de restricción para la comprobación de las 
construcciones 
 
Después de haber purificado el DNA plasmídico de interés se sometió a una reacción de 
restricción que permitiera verificar si efectivamente se trataba de la construcción 
esperada. La reacción consistió de 3 a 5 unidades de enzima por µg de DNA, 1x del buffer 
de corte 10x, 1x de BSA 10x y agua desionizada estéril, la mezcla se dejó durante 
aproximadamente 2 horas incubando a la temperatura adecuada para la actividad de la 
enzima. 
 
3.4. LIGACIÓN DE DNA 
 
Para llevar a cabo la ligación del DNA se usó la enzima T4 DNA ligasa (Invitrogen). Esta 
enzima se dejó incubando con el DNA de interés (50 ng) y buffer 1x a una temperatura 
de 16 ºC durante toda la noche. En este trabajo hubo básicamente tres tipos de reacción 
de ligación: una en donde se requería recircularizar un vector al que se le eliminó una 
región, otra donde se colocó el vector y el inserto a una proporción molar 1:5 y una última 
que se usó como control en donde únicamente se colocó el vector sin el inserto. 
 
3 
 
Es importante mencionar que en algunos casos los cortes con enzimas de restricción 
dejaron extremos cohesivos por lo que fue necesario repararlos con la enzima Klenow 
(Roche), de tal modo que después de haber digerido el DNA de interés se agregaron a la 
mezcla dNTP's (dATP, dGTP. dTTP y dCTP) en proporciones equimolares a una 
concentración final de 300 nM y 3 unidades de la enzima Klenow, aforando la reacción a 
30 µl e incubando la mezcla durante 45 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, 
se corrió el total de la mezcla en una electroforesis en gel y se cortó el fragmento de DNA 
de interés del gel. 
 
3.5. TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS SUPERCOMPETENTES 
 
Para la transformación de bacterias supercompetentes se descongeló una alícuota de 
bacterias en un baño de hielo-agua. De esta alícuota se tomaron 100 µl y se mezclaron 
con 1 µl del DNA plasmídico de interés (10 µl en el caso de transformar con la reacción de 
ligación) se dejó 30 minutos en el baño de hielo-agua para posteriormente incubarla por 
un tiempo exacto de 1 minuto y 45 segundos a 42 °C, inmediatamente la mezcla se 
colocó en un baño de hielo-agua por 2 minutos y se agregaron 900 µl de medio LB y se 
incubaron durante 1 hora a 37 °C para que se recuperaran. Transcurrido este tiempo se 
tomaron de 100 a 200 µl para sembrarlos en cajas petri con agar LB y el antibiótico de 
selección. Una vez sembradas las cajas se incubaron a 37 °C durante toda la noche 
 
 
3.6. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA 
 
Las electroforesis en gel de agarosa se usaron tanto para analizar si las construcciones 
se llevaron a cabo adecuadamente como para obtener fragmentos específicos de DNA. 
La técnica consistió en colocar geles de agarosa al 0.8% y al 1.2% en una cámara de 
electroforesis con buffer TAE 1X (40mM de Tris-acetato u 1mM de EDTA a pH 8) y 
bromuro de etidio (EtBR) 0.5 µg/ml. Como marcador de peso molecular se utilizaron las 
escaleras de 1 kb y de 100 pb (Gibco BRL). Una vez terminada la electroforesis el gel se 
expuso a un transiluminador de luz UV para observar el DNA y se obtuvo su registro 
fotográfico con una cámara digital marca GENECAM modelo 97. 
 
 
4 
 
3.7. CUANTIFICACIÓN DEL DNA 
 
La cuantificación del DNA se llevó a cabo por fluorometría con el fluorómetro Versa Fluor 
(BIO RAD) añadiendo al DNA a cuantificarel colorante Hoechst 33258 (Fluorescent DNA 
Quantitation Kit). 
 
 
3.8. CULTIVO DE CÉLULAS NEURO 2A 
 
La línea celular Neuro 2A (neuroblastoma de ratón que expresa endógenamente el RNA 
mensajero del canal Nax) se mantuvo en crecimiento en cajas de 10 cm de diámetro con 
medio Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) enriquecido con Suero Fetal Bovino 
(SFB) al 10%, HEPES al 1% y penicilina-streptomicina (pen/str) al 1%, en una atmósfera 
húmeda con 5% de CO2 y a 37 ºC. 
 
Para seleccionar la mejor condición de diferenciación de las células Neuro 2A se probaron 
los siguientes reactivos: Dibutiril Adenosina-3',5'-Monofosfato Dibutiril Cíclico 1mM 
(dbAMPc, SIGMA D-0627) el cuál es un análogo permeable del AMPc y ácido retinoíco 
20 µM (AR, SIGMA All trans). 
 
 
3.9. TRANSFECCIÓN TRANSITORIA DE CÉLULAS NEURO 2A. 
 
El día previo a la transfección se tripsinó una caja confluente de 10 cm de diámetro con 
células Neuro 2A, una porción de éstas células se ocupó para sembrar una caja de 12 
pozos o bien de 24 pozos de tal forma que al día siguiente las células estuvieran 
aproximadamente al 70% de confluencia y listas para ser transfectadas. Las células se 
mantuvieron en medio DMEM enriquecido con SFB al 10%, HEPES y Pen-strep al 1X. La 
transfección se llevó a cabo usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) la cual se combinó 
con medio Optimem sin suero (Gibco) y con el DNA plasmídico a analizar en condiciones 
de esterilidad. La proporción de los componentes de la mezcla de transfección fue la 
siguiente: por cada 1.25 µg de DNA se agregaron 2.5 µl de lipofectamina 2000 y 100 µl de 
Optimem. Las células Neuro 2A transfectadas se incubaron a 37ºC en una atmósfera 
húmeda con 5% de CO2. 
5 
 
Los plásmidos que expresan la proteína verde fluorescente (pEGFP-1, p0.2Nx-EGFP y p 
EGFP-C1) se cotransfectaron con una cantidad constante (150 ng) del plásmido 
pDsRed2-N1 como control de la eficiencia de transfección mientras que todos los 
plásmidos que expresan la proteína roja fluorescente (pDsRed2-wcp, p0.2Nx-DsRed2 y 
pDsRed2-N1) fueron cotransfectados con una cantidad constante (150 ng) del vector 
pEGFP-C1 también como control de la eficiencia de transfección (véase Tabla II). 
 
Para la transfección de células diferenciadas también se usó lipofectamina 2000 
(Invitrogen) la diferencia en este caso consistió en agregar los reactivos para la inducción 
de la diferenciación de las células Neuro 2A . Se manejaron dos estrategias : la primera 
consistió en que a las 4 horas de haber transfectado las células se disgregaron con 
tripsina para separar el cultivo en dos, una porción se siguió como control mientras que la 
otra se sometió al tratamiento de diferenciación seleccionado. La segunda estrategia 
consistió en diferenciar previamente las células durante 48 h para después transfectarlas. 
 
 
TABLA II. Tamaño y proporción molar de los plásmidos transfectados. 
 
Plásmido 
 
Tamaño (pb) 
 
Proporción Molar 
 
Vector 
cotransfectado 
(150 ng) 
 
pEGFP-1 4151 0.88 pDsRed2-N1 
p0.2Nx-EGFP 4403 0.93 pDsRed2-N1 
pEGFP-C1 4731 1 pDsRed2-N1 
pDsRed2-wcp 4105 0.87 pEGFP-C1 
p0.2Nx-DsRed2 4357 0.92 pEGFP-C1 
pDsRed2-N1 4689 0.99 pEGFP-C1 
*El vector pBlue Script II SK + se agregó a la mezcla de transfección para hacer equivalente la 
cantidad en masa de DNA en los casos necesarios. 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
3.10. MICROINYECCIÓN DE CÉLULAS NEURO 2A 
 
Una vez purificado el DNA plasmídico con el kit EndoFree plasmid Maxi kit (Qiagen) se 
procedió a filtrarlo con filtros de 0.2 µm (Corning) para evitar cualquier tipo de partícula 
que pudiera obstruir la micropipeta de inyección. 
 
Las micropipetas fueron elaboradas con capilares de borosilicato (Eppendorf) previamente 
lavados (con HCl 0.5N por 24 hr, enjuagados con agua desionizada, etanol al 70% por 24 
hr, y secados en el horno) y estirados en un estirador vertical de micropipetas (Sutter P30) 
de tal modo que el poro de la pipeta presentara una resistencia eléctrica de 10 – 12 MΩ. 
 
Las células se sembraron un día antes de ser microinyectadas dentro de cilindros de 
clonación de 4 mm de diámetro en cajas de 35 mm de diámetro con medio al 10% de 
SFB. Se procuró que la densidad de las células dentro de los cilindros de clonación el día 
de la microinyección fuera de aproximadamente el 70% de la superficie. 
 
Al momento de la microinyección se cambió el medio normal de crecimiento de las células 
Neuro 2A (10% SFB) a un medio sin SFB para evitar que la punta de la micropipeta se 
obstruyera, es importante mencionar que en ninguna circunstancia se mantuvieron a las 
células más de 30 minutos en estas condiciones. 
 
Las mezcla de microinyección consistió en el DNA plasmídico (un vector con el gen de la 
proteína EGFP y otro con el gen de la proteína DsRed2 a concentración equimolar) y 
Dextran Fluoresceína 1% (SIGMA), éste último reactivo permitió visualizar la inyección de 
la solución de DNA para garantizar que se introdujera a la célula pues emite fluorescencia 
en presencia de un filtro de 510 nm de emisión. La concentración total de DNA en las 
distintas soluciones de inyección fue de 285-300 ng/µL dependiendo de los tamaños de 
los plásmidos. 
 
Las condiciones usadas para microinyectar las células Neuro 2A fueron las siguientes: 
una presión de inyección de 75 hPa, un tiempo de inyección de 0.2 a 0.5 s y una presión 
constante de 25 a 50 hPa en el microinyector (Femtojet - Eppendorf). El micromanipulador 
usado fue el Inject Man NI2 (Eppendorf). 
 
7 
 
 
Se procuró en lo posible que la inyección del DNA se hiciera intranuclearmente. En la 
siguiente figura se esquematiza de modo general la manera de posicionar el capilar en la 
célula para realizar la microinyección (Fig. 9). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3.11. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DEL GEN REPORTERO. 
 
El análisis de la expresión de los genes reporteros de la proteína EGFP y de la proteína 
DsRed2 se hizo por microscopía de fluorescencia. El filtro de excitación para la proteína 
verde fluorescente fue de EX470/40 y el de emisión EM525/50, en el caso de la proteína 
roja fluorescente se utilizaron los filtros EX546/12 y EM575-640. 
 
Después de realizar la transfección ó la microinyección se dejaron transcurrir 24 h para 
hacer el primer registro del número de células que expresaban los genes reporteros; el 
segundo registro se realizó a las 48 h. 
 
Para el caso de las células que se transfectaron por cada experimento se tomaron 10 
fotografías de distintos campos con el objetivo 10X con una cámara digital (AxioCam 
MRM REV.2 - Zeiss) instalada en un microscopio (AxioVert 25 -Zeiss), a partir de estas 
fotografías se hizo un conteo manual del número de células que expresaban tanto el gen 
Fig. 9. Esquema de microinyección intranuclear. 
(Tomado de manual de usuario del equipo Inject Man 
NI2 (Eppendorf).) 
8 
 
reportero de análisis como el usado para medir la eficiencia de transfección. Para los 
plásmidos con la proteína EGFP se realizaron 3 experimentos de transfección 
independientes (30 fotografías) mientras que para los plásmidos con la proteína DsRed2 
se realizaron dos experimentos independientes (20 fotografías). El número de células 
presente en los distintos campos se promedió y se obtuvo el error estándar. 
 
En el caso de las células microinyectadas el conteo de células fluorescentes se realizó a 
lo largo de toda el área de microinyección y se obtuvieron fotografías de todas las células 
que expresaron cualquiera de los dos reporteros. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4. RESULTADOS 
 
4.1. CONSTRUCCIÓN DE PLÀSMIDOS PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD 
TRANSCRIPCIONAL DEL PROMOTOR DEL CANAL DE SODIO Nax UTILIZANDO 
COMO GEN REPORTERO A LA PROTEÍNA ROJA FLUORESCENTE (DsRed2). 
 
Resultados anteriores del laboratorio indican que hay una diferencia en la actividad 
transcripcionaldel promotor de Nax comparado con el promotor de CMV (citomegalovirus). 
Esta diferencia en la funcionalidad de los promotores es evidente al comparar su actividad 
en la línea celular de neuroblastoma de ratón Neuro 2A con la actividad observada en 
neuronas de ganglio de raíz dorsal (DRGN) en cultivo primario. Aparentemente mientras 
que en las células Neuro 2A ambos promotores funcionan, en DRGN el promotor de Nax 
parece ser mas fuerte que el promotor CMV a pesar de que este último es uno de los 
promotores funcionales más fuertes y promiscuos en eucariontes. 
 
Cabe mencionar que la actividad transcripcional del promotor de Nax en los estudios 
anteriores había sido evaluada por la expresión del gen reportero de la proteína verde 
fluorescente (EGFP), mientras que la actividad transcripcional de CMV se estudió usando 
como reportero al gen de la proteína roja fluorescente (DsRed2). Por lo tanto, para tratar 
de averiguar si los datos obtenidos de la expresión diferencial de los promotores eran 
reales, en este trabajo se propuso que ahora la actividad transcripcional tanto del 
promotor de Nax como del promotor CMV se evaluara con los dos genes reporteros, la 
EGFP y la DsRed2. Con esta estrategia se evaluaría si la diferencia observada en la 
actividad de transcripción del promotor de Nax y del promotor CMV se debe a un efecto 
indirecto del gen reportero que se utilice o depende realmente del promotor. Para cumplir 
con este objetivo inicialmente se construyeron los plásmidos requeridos. 
 
4.1.1. Construcción del vector pDsRed2-wcp 
 
pDsRed-N1 es un vector que contiene el gen que codifica para la proteína roja 
fluorescente DsRed2 bajo la regulación del promotor CMV, a partir de este plásmido se 
construyó el vector pDsRed2-wcp que contiene a la proteína roja fluorescente DsRed2 
pero sin promotor. Para poder construir pDsRed2-wcp se realizó una doble restricción con 
las enzimas Ase I y Nhe I del plásmido pDsRed2-N1 que cortan en los sitios 8 y 592 
1 
 
respectivamente (ver Fig. 10), la digestión se realizó durante 1.5 h a una temperatura de 
37 °C; esta restricción se llevó a cabo con la intención de eliminar al promotor de CMV del 
vector dejando al gen de la proteína roja fluorescente en un vector donde posteriormente 
se pudieran clonar otros promotores como el del canal Nax. 
 
Los cortes de las enzimas Ase I y Nhe I dejan extremos cohesivos no compatibles por lo 
que estos extremos fueron reparados con la enzima Klenow (Roche) la cual deja 
extremos romos que posteriormente fueron religados con la T4 DNA ligasa a una 
temperatura de 16 ºC durante toda la noche y de este modo se obtuvo la construcción 
pDsRed2-wcp con un tamaño de 4105 pb. El producto de ésta ligación se usó para 
transformar bacterias supercompetentes DH5α, a partir de ellas se sembraron dos cajas 
petri con medio Luria-Bertani (LB) y 25 µg/ml de kanamicina y se dejaron a 37 ºC 
durante toda la noche. De estas cajas se seleccionaron 6 clonas independientes y se 
dejaron crecer en 5 ml de medio LB con 25 µg/ml de kanamicina a 37 ºC y agitación 
constante durante toda la noche para poder extraer su DNA plasmídico por lisis alcalina 
de acuerdo al protocolo del Manual de Sambrook y Russel. 
 
Para confirmar que la construcción se había llevado a cabo exitosamente el DNA 
plasmídico fue digerido con la enzima Nco I, esta enzima tiene 5 sitios de corte en el 
vector pDsRed2-N1 (Fig. 10, A) y 4 sitios de corte en el vector pDsRed2-wcp (nueva 
construcción, Fig. 11, A), de tal forma que si pDsRed-N1 había perdido al promotor de 
CMV los fragmentos esperados serían de los siguientes tamaños: 420, 703, 1345 y 
1637pb , estos resultados se muestran en la figura. 11, B. El vector con el promotor CMV 
presenta un fragmento de 1904 pb y otro de 317 pb ausentes en el vector sin promotor 
(Fig. 11, B). 
 
2 
 
pDsRed-wcp.
4105 bp
DsRed2
Kan
NcoI (94)
NcoI (514)
NcoI (1859)
NcoI (2562)
pDsRed2-N1
4689 bp
CMV
Kan
DsRed2
AseI (8)
NheI (592)
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 10. Eliminación del promotor CMV del plásmido pDsRed2-N1. A) Esquema del vector pDsRed2-
N1 donde se señalan los sitios de corte de las enzimas Ase I y Nhe I usados para eliminar al promotor de 
CMV. B) Electroforesis en gel de agarosa al 0.8%. Productos de la digestión del vector pDsRed2-N1 con 
las enzimas Ase I y Nhe I. Se señala una banda de 584pb que corresponde al promotor de CMV y una 
banda de 4105 pb que corresponde al resto del plásmido. 
A B 
Fig. 11. Construcción del vector pDsRed2-wcp. A) Esquema del plásmido pDsRed2-wcp donde se 
señalan los cuatro sitios de corte de Nco I en dicho vector. B) Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% con 
los productos de la digestión de la construcción pDsRed2-wcp y del vector original pDsRed2-N1 con la 
enzima Nco I; los asteriscos blancos en los carriles pDsRed2-wcp señalan bandas correspondientes a DNA 
parcialmente digerido. Los asteriscos negros señalan bandas presentes en el vector pDsRed2-N1 y 
ausentes en el vector pDsRed2-wcp. 
 
A B 
3 
 
4.1.2. Clonación del promotor de Nax en el vector pDsRed2-wcp 
 
Una vez obtenido el vector pDsRed2-wcp se procedió a clonar en él al promotor del canal 
de sodio Nax de manera que dirigiera la expresión del gen reportero DsRed2. La primera 
región clonada fue la correspondiente al promotor mínimo de Nax (0.2Nx) y 
posteriormente se realizó la clonación de la región más grande del promotor de Nax que 
se ha caracterizado hasta entonces en nuestro laboratorio (3.6Nx). El hecho de probar la 
funcionalidad de ambos fragmentos del promotor de Nax nos permitiría analizar de 
manera más amplia la actividad transcripcional de dicho promotor. 
 
4.1.3. Construcción del vector p0.2Nx-DsRed2 
 
El vector p0.2Nx-DsRed2 contiene al gen reportero de la proteína roja fluorescente 
(DsRed2) regulado por el promotor basal de Nax (0.2Nx). Para obtener el plásmido 
p0.2Nx-DsRed2 primero tuvo que aislarse el fragmento de 265 pb correspondiente al 
promotor basal de Nax (0.2 Nx) a partir del vector p0.2Nx-EGFP (Fig.12, A). Este 
fragmento se obtuvo digiriendo con las enzimas Bgl II y Hind III durante 2 h a 37 °C, una 
vez transcurrido el tiempo de digestión la mezcla se corrió en un gel de agarosa al 1.2% 
para purificar del gel la banda de 265 pb. (Fig.12, B). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
p0.2Nx-EGFP
4403 bp
0.2 kb Nax
Kan/Neo
EGFP
EcoRI (300)
BglII (28)
HindIII (293)
Fig. 12. Obtención del promotor basal de Nax (0.2Nx) del vector p0.2Nx-EGFP. A) Esquema del 
vector p0.2Nx-EGFP que muestra los sitios de restricción de las enzimas Bgl II y Hind III que fueron 
usadas para cortar al promotor mínimo del plásmido p0.2Nx-EGFP . B) Electroforesis en gel de agarosa al 
1.2%. Se observa una banda de 265 pb correspondiente a 0.2Nx obtenida a partir de la digestión del 
vector p0.2Nx-EGFP con Bgl II y Hind III. 
A B 
4 
 
Una vez obtenido el fragmento de 265 pb del promotor (0.2 Nx) se procedió a digerir el 
vector pDsRed2-wcp con las enzimas Bgl II y Hind III mismas que se usaron para extraer 
el promotor de Nax. Una vez digerido el vector pDsRed2-wcp se corrió en un gel de 
agarosa al 0.8% del cual se extrajo el fragmento de DNA de 4092 pb (pDsRed2-wcp al ser 
digerido perdió 13 pb). 
 
Teniendo listos tanto el vector como el inserto se mezclaron en proporción molar vector: 
inserto de 1:5 y se ligaron con la enzima T4 DNA ligasa a 16 ºC durante toda la noche. 
Cabe mencionar que paralelamente se hizo una reacción de ligación control a la cual no 
se colocó el inserto. Los productos de ligación se usaron para transformar bacterias DH5α 
supercompetentes que se sembraron en cajas petri con medio LB y kanamicina (25 
µg/ml) y se dejaron a 37 ºC durante toda la noche. En las caja con 200 µL de la reacción 
control (sin inserto) crecieron 3 colonias mientras que en la caja con 200 µL de la 
reacción de ligacióncrecieron 143 colonias de las cuales fueron seleccionadas 6 para 
crecerlas en 5ml de LB con kanamicina para extraer el DNA plasmídico por lisis alcalina. 
 
Después de haber purificado el DNA se verificó por digestión con enzimas de restricción 
que la construcción se hubiera llevado a cabo exitosamente; las enzimas usadas fueron 
Nhe I, cuyo sitio de corte cae en la región correspondiente al promotor mínimo de Nax 
(0.2Nx) y Stu I que tiene dos sitios de corte de los cuales uno cae en la región codificante 
para la proteína roja fluorescente (Fig. 13, A).; esperando entonces, que al realizar la 
electroforesis de los productos de la digestión se observaran 3 bandas con los siguientes 
tamaños: 2425, 1423 y 509 pb como se observa en la figura (Fig. 13, B.). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
 
 
p0.2Nx-DsRed2.
4357 bp
DsRed2
Kan
0.2Nx
BglII (26)
HindIII (291)
SalI (308)
NheI (271)
StuI (780)
StuI (2203)
SmaI (278)
SmaI (327)
 
 
 
 
 
 
 
4.1.4. Construcción del vector p3.6Nx-DsRed2 
 
Habiendo terminado la clonación del fragmento de 265 pb del promotor de Nax (0.2Nx) en 
el vector pDsRed-wcp se procedió a clonar el fragmento más grande del promotor Nax 
(3.6 Kb). Al probar la actividad de ambas regiones del promotor de Nax podríamos obtener 
una visión más amplia de su funcionalidad tanto en la línea celular de neuroblastoma de 
ratón (Neuro 2A) como en las neuronas de ganglio de raíz dorsal (DRGN). 
 
 
 
 
 
B 
Fig.13. Construcción del vector p0.2Nx-DsRed2. A) Esquema del vector p0.2Nx-DsRed2 en donde se 
señalan los sitios de restricción de las enzimas Nhe I cuyo sitio de corte cae dentro de la región 
correspondiente a 0.2Nx y de Stu I con dos sitios de corte de los cuales uno cae en la región 
correspondiente a DsRed2. B) Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% con los productos de la digestión 
del vector p0.2Nx-DsRed2 con las enzimas Nhe I y Stu I. El carril “p0.2Nx-DsRed2 s/c” contiene la banda 
correspondiente alvector p0.2Nx-DsRed2 sin cortar. 
A 
6 
 
 
Para llevar a cabo la construcción del plásmido p3.6Nx-DsRed2 tuvieron que probarse 
diversas estrategias, sin embargo, ninguna de ellas fue exitosa. 
 
La primera estrategia para construir el vector p3.6Nx-DsRed2 fue muy parecida a la que 
se usó para construir p0.2Nx-DsRed2, este nuevo plásmido contendría a la proteína roja 
fluorescente regulada bajo la región promotora de Nax de 3.6 kb (3.6Nx). El fragmento de 
3635 pb (3.6Nx) se obtuvo del plásmido p3.6Nx-EGFP (Fig. 14, A) cortando con las 
enzimas Sal I y Sma I (Fig. 14, A); esta digestión se llevó a cabo cortando primero con la 
enzima Sal I durante 2 h y a una temperatura de 37 ºC, posteriormente el DNA fue 
precipitado para poder hacer un cambio de buffer y comenzar a digerir con la enzima 
Sma I durante 2 h a temperatura ambiente (25ºC). El producto de restricción se corrió en 
un gel de agarosa al 0.8% del cual se extrajo el fragmento de 3635pb (promotor de Nax) 
(Fig. 14, B). 
 
 
p3.6Nx-EGFP
7767 bp
3.6 kb Nax
Kan/Neo
EGFP
EcoRV (81)
BstEII (2308)
SalI (58)
SmaI (3693)
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 14. Obtención de 3.6Nx del vector p3.6Nx- EGFP . A) Esquema del vector p3.6Nx-EGFP. Se 
señalan los sitios de corte de las enzimas Sal I y Sma I las cuales se usaron para obtener el promotor de 
Nax. B) Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% se observa una banda de 3635 pb correspondiente al 
promotor de Nax obtenida de la digestión del vector p3.6Nx-EGFP con las enzimas Sal I y Sma I. 
A B 
7 
 
El siguiente paso fue digerir el vector pDsRed2-wcp con las mismas enzimas con las que 
se extrajo la región de 3635pb correspondiente al promotor de Nax (Sal I y Sma I). Los 
productos de restricción se corrieron en un gel de agarosa al 0.8% para purificar de ahí al 
vector pDsRed2-wcp. Cabe mencionar que al cortar pDsRed2-wcp con las enzimas Sal I y 
Sma I, se pierde un pequeño fragmento de 19pb. 
 
Habiendo purificado tanto el vector como el inserto, se procedió a ligarlos en proporción 
molar vector: inserto 1:5 con la enzima T4 DNA ligasa a 16ºC durante toda la noche, 
además, también se incluyó una reacción de ligación control en donde no se colocó 
inserto. Después de haber transformado bacterias supercompetentes DH5α con los 
productos de la ligación y sembrarlas en cajas petri con medio LB y kanamicina 25 µg/ml 
no se obtuvo el resultado esperado pues ninguna de las cajas sembradas presentó 
crecimiento de colonias bacterianas. 
 
Observando estos resultados se optó por seguir una segunda estrategia donde se 
definiera si las bacterias no habían crecido debido a que la nueva construcción (p3.6Nx-
DsRed2) tenía un tamaño de casi 8.0 Kb lo cual pudo haber complicado la transformación, 
por lo tanto se decidió transformar bacterias XL10 Gold, las cuales, al igual que las 
bacterias de la cepa DH5α no presentan resistencia al antibiótico kanamicina, sin 
embargo, las XL10 Gold tienen la capacidad de aceptar plásmidos de 10 Kb o más 
(Stratagen). 
 
Al transformar las bacterias XL10 Gold con los productos de ligación se realizó también un 
segundo intento en transformar bacterias DH5α, se sembraron en cajas con LB y 
kanamicina (25 µg/ml) y se dejaron a 37 ºC toda la noche. En la caja con bacterias DH5α 
nuevamente no hubo presencia de colonias, mientras que en la caja con bacterias XL10 
se presentaron 176 colonias de las cuales 14 fueron analizadas. Antes de proceder a 
purificar el DNA plasmídico se decidió analizarlas con la técnica de “craking” en la cual las 
colonias bacterianas se lisan por separado y posteriormente el lisado completo se aplica a 
un gel de agarosa para hacer una electroforesis, de este modo puede observarse cuál de 
esas colonias cuenta con la construcción esperada (p3.6Nx-DsRed2). 
 
 
 
8 
 
Después de verificar las bandas resultantes de la electroforesis del lisado se observó que 
ninguna de ellas contenía DNA plasmídico (Fig. 15) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Con los resultados anteriores tuvo que probarse una tercera estrategia para obtener la 
construcción p3.6Nx-DsRed2. Esta vez, el fragmento de 3.6 Kb se aisló de otro vector, el 
vector p3.6Nx-Luc el cual contiene el gen reportero para la luciferasa; las enzimas de 
restricción que se usaron para esto fueron las mismas que para extraerlo de p3.6Nx-
EGFP (Sal I y Sma I) , sin embargo, después de la restricción se agregó el vector 
pDsRed2-wcp linearizado con Sal I y Sma I y se dejó ligando durante toda la noche a 
16 º C. Al siguiente día se transformaron bacterias DH5α supercompetentes de las cuales 
se sembraron tres cajas diferentes; una caja con 100 µl del control (bacterias 
transformadas con una reacción de ligación que únicamente contiene a la ligasa y al 
vector sin el incerto), una caja con 100 µl y otra con 200 µl de la reacción de ligación. 
 
 
 
 
Fig. 15. Electroforesis en gel 
de agarosa de un lisado 
bacteriano (Craking). Se 
muestran 14 carriles 
correspondientes a 14 colonias 
distintas candidatas a poseer la 
construcción p3.6Nx-DsRed2. 1 
señala las bandas 
correspondientes a ácidos 
nucleicos que no entraron al gel; 
2, señala las bandas 
correspondientes al cromosoma 
bacteriano, 3, señalan las 
bandas de RNA, y los asteriscos 
señalan el lugar donde se 
esperaba el DNA plasmídico de 
la construcción p3.6Nx-DsRed2 
* 
* 
* 
9 
 
En la caja control crecieron 3 colonias, en la caja con 100 µL de la ligación crecieron 2 
colonias al igual que en la caja con 200 µL. Estos resultados, a pesar de no ser los 
esperados ofrecían la posibilidad de que en alguna de las clonas positivas estuviera la 
construcción. Para determinar esto se extrajo el DNA plasmídico de cada una de las 
colonias y se analizó con la enzima de restricción Stu I, después la restricción se corrió en 
un gel de agarosa en el cual se observó que en ninguno de los casos se presentó el 
patrón de bandas esperado,