Caracterizacion-de-las-proteinas-de-la-soya--un-modelo-didactico-experimental-en-el-area-de-alimentos

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
 
 FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
“CARACTERIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LA SOYA: UN 
MODELO DIDÁCTICO EXPERIMENTAL EN EL ÁREA DE 
ALIMENTOS”. 
 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE 
QUÍMICA DE ALIMENTOS 
P R E S E N T A 
AIDA VIRIDIANA MEJIA HERNANDEZ 
 
MÉXICO, D. F. 2008 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
Jurado designado: 
Presidente M. en C. Francisca Aida Iturbe Chiñas 
Vocal M. en C. María de los Angeles Valdivia López 
Secretario M. en C. Karla Mercedes Díaz Gutierrez 
1er Suplente M. en C. Armando Conca Torres 
2° Suplente Q. A. Juan Carlos Ramírez Orejel 
 
El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio 322 y 323 del Departamento 
de Alimentos y Biotecnología del Edificio “E”, Facultad de Química, UNAM. 
 
Asesora: 
 
 
__________________________ 
M. en C. Francisca Aida Iturbe Chiñas 
 
 
 
Supervisora técnica: 
 
 
_________________________ 
Q.F.B. Bertha Julieta Sandoval Guillén 
 
 
 
Sustentante: 
 
 
__________________________ 
Aida Viridiana Mejía Hernández 
 
 
DEDICADA 
A MIS PADRES 
CONSTANZA HERNANDEZ FLORES Y MIGUEL MEJIA ENCISO 
 
A ustedes que me han visto crecer y que junto conmigo han vivido cada 
una de las etapas de mi vida. Por todo el amor, confianza y cariño que me 
han brindado siempre ya que sin ellos nunca hubiera logrado ser lo que 
soy. 
 
Gracias al gran esfuerzo, sacrificio y apoyo a lo largo de mi vida, en la cual 
cada uno de mis logros y triunfos son de ustedes. 
 
Por el ejemplo que me proporcionaron de lucha y trabajo, tener el carácter 
para alcanzar una de las metas más dífiles y que solo me abre las puertas 
de experiencias aún por superar, pero que gracias a ustedes cuento con 
las herramientas necesarias para afrontarlas. 
 
Ánimos por que aún nos falta camino por recorrer juntos. 
 
 
 
 
 
Siempre agradecida, su hija Aida. 
 
AGRADECIMIENTOS 
Antes que nadie agradezco a Dios por darme la oportunidad de vivir. 
A mi hermano Oscar Antonio por ayudarme y estar en todo momento, por 
toda su compresión y cariño que me ha manifestado, espero siempre 
seguir compartiendo momentos difíciles y felices. 
A mis abuelitas: Lupita por ser el pilar de una familia emprendedora, y 
María por darme un buen padre. 
A todos mis primos, especialmente a Eli, Matías, Rober, Beto, Erick, 
Goyito, Paula, Ericka y Fernando; a mis sobrinos: Irving, Sergio, Dora, 
Brenda, Nico, Víctor, Memo, Chucho, César, Kiko, Sebastiana, Diego y 
Chispa; y a mis tíos especialmente Reme, Guille, Chevo, Petra, Goya y Paz 
por hacer más divertida y placentera mi vida. 
Quiero hacer mención de las enseñanzas de nuestro tío Tito†, nunca 
olvidaremos sus ejemplos de lucha para la vida; gracias por sus consejos y 
cariño, por los hermosos años que vivimos juntos, que descanse en paz. 
A mis amigos y compañeros del laboratorio 321 y 323 del Edificio “E”, de la 
carrera de Química de Alimentos y de la Comunidad (no quiero hacer 
excepciones así que no menciono nombres) de la Facultad de Química, que 
me han brindado su amistad, y que con los que pase momentos muy 
entretenidos e inolvidables. 
 
A mi querida maestra y amiga, la Doctora Ute Bárbara Smith, a quien 
estimo mucho y que me ha confortado al paso de los años en el estudio, 
me enseño que se logra con dedicación y esfuerzo. 
A mi asesora, la Mtra. Fanny por brindarme el apoyo, el tiempo y la 
confianza para la realización de este proyecto. 
A July por brindarme su fina atención y ayuda en este trabajo. 
A las Maestras: María de los Angeles Valdivia y Karla Díaz por sus valiosas 
aportaciones en este proyecto, así como a los maestros Armando Conca y 
Juan Carlos Ramírez. 
A todas esas personas que han pasado por mi camino en esta vida, que me 
ayudaron de alguna manera a culminar esta meta y aunque no veo muy 
seguido siempre están en mi corazón. 
A la Facultad de Química y a la Universidad Nacional Autónoma de 
México, por brindarme la oportunidad de seguir estudiando. 
“POR MI RAZA HABLARÁ EL ESPIRITU” 
 
 
 
ÍNDICE 
 
 Página 
 
 INTRODUCCIÓN 1 
1. ANTECEDENTES 
 1.1. Proteínas 
 1.2. Propiedades funcionales de las proteínas 
 1.2.1. Hidratación 
 1.2.2. Fijación de agua 
 1.2.3. Solubilidad 
 1.2.4. Emulsificación 
 1.2.5. Espumado 
 1.2.6. Gelificación 
 1.3. Métodos más empleados en la determinación 
de proteínas 
 1.3.1. Método de Kjeldahl 
 1.3.2. Método de Biuret 
 1.3.3. Absorción Ultravioleta 
 1.3.4. Método de Lowry 
 1.3.5. Método Turbidimétrico 
 1.3.6. Unión a colorantes 
 1.3.7. Cromatografía de Exclusión Molecular 
 1.3.8. Extracción de Proteínas 
 1.4. Fuentes de proteínas en los alimentos 
 1.5. La soya 
 1.5.1. Composición general 
 1.5.2. Las proteínas como componente principal 
 1.5.3. Propiedades funcionales 
 
3 
10 
11 
12 
14 
18 
21 
24 
 
27 
27 
29 
30 
31 
31 
33 
33 
34 
35 
36 
37 
40 
41 
OBJETIVO GENERAL 
 Objetivos particulares 
44 
44 
2. METODOLOGÍA 
 2.1. Diagrama General de la Investigación 
 2.2. Procedimiento 
 2.2.1. Pre-tratamiento de la muestra 
 2.2.2. Análisis composicional 
 2.2.3. Determinación de Nitrógeno no proteínico 
 2.2.4. Extracción de proteínas 
 2.2.5. Determinación y cuantificación de 
proteínas en diferentes ingredientes y en las 
fracciones solubles 
 
45 
 
47 
47 
48 
48 
 
50 
 
 
 
 
 
 
 
 
 2.2.5.1. Método de Kjeldahl 
 2.2.5.2. Método de Biuret 
 2.2.5.3. Absorción Ultravioleta 
 2.2.5.4. Cromatografía de exclusión molecular 
 2.2.6. Determinación de propiedades funcionales 
 2.2.7. Elaboración de protocolos 
 
 
 
 
 
Página 
 
51 
53 
53 
54 
55 
58 
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 3.1. Pre-tratamiento de la harina de soya 
 3.2. Análisis composicional 
 3.3. Determinación de Nitrógeno no proteínico 
 3.4. Extracción de proteínas 
 3.5. Determinación y cuantificación de proteínas 
en diferentes ingredientes y en las fracciones 
solubles 
 3.5.1. Método de Kjeldahl 
 3.5.2. Método de Biuret 
 3.5.3. Absorción Ultravioleta 
 3.5.4. Cromatografía de exclusión molecular 
 3.6. Evaluación de propiedades funcionales 
 3.6.1. Capacidad de retención de agua 
 3.6.2. Humectabilidad 
 3.6.3. Retención de aceite 
 3.6.4. Capacidad de emulsificación 
 3.6.5. Capacidad de espumado 
 3.6.6. Capacidad de gelificación 
 3.7. Propuesta de protocolo 
 
59 
59 
61 
65 
 
 
66 
66 
68 
72 
76 
81 
82 
83 
84 
86 
87 
89 
93 
CONCLUSIONES 101 
ANEXOS 103 
BIBLIOGRAFÍA 106 
 
 
 
 
 
INTRODUCCION 
 
 1
 
INTRODUCCIÓN 
Un modelo didáctico experimental es un procedimiento sencillo y de fácil manejo 
para comprender lo mejor posible los conceptos, conocimientos, etc., que se 
enseñan o generan en una asignatura de interés personal o educativo, durante la 
práctica. 
 Este trabajo tiene la finalidad de ayudar al estudiante a entender de manera 
clara la información que se le da en una materia o en un laboratorio, en este caso 
análisis de alimentos, especialmente el bloque de proteínas, porque se sabe que su 
estudio es amplio y complejo.Contar con un procedimiento sencillo para la caracterización de las proteínas 
en los alimentos; y explicar su funcionalidad en los sistemas alimenticios con base 
en sus propiedades fisicoquímicas y eventualmente potenciar su uso, facilita su 
estudio. 
Este modelo pretende así mismo resaltar la importancia de las proteínas y 
proporcionar un análisis de los resultados que puede ser generado durante el 
trabajo experimental en un laboratorio de docencia. Puede ser usado como 
material de apoyo para alumnos y profesores que se integren a la docencia en esta 
área; y como un instrumento para la capacitación en el uso de diversas 
metodologías, de manera paralela se podrán encontrar otras aplicaciones de las 
fracciones proteínicas en el área de análisis de alimentos. 
 
INTRODUCCION 
 
 2
 
Se utiliza la soya, al ser una fuente importante de proteínas, la separación de 
las diferentes fracciones proteínicas siguiendo criterios de solubilidad, resulta una 
referencia atractiva para ser tomada como material de estudio, además que ha sido 
muy investigada y utilizada a lo largo del tiempo. 
 
ANTECEDENTES 
 
 3
1. ANTECEDENTES 
1.1. Proteínas 
Las proteínas son macromoléculas compuestas por carbono (C), hidrógeno (H), 
oxígeno (O) y nitrógeno (N). La mayoría también contienen azufre (S) y fósforo (P). 
Las mismas están formadas por la intersección de varios aminoácidos, unidos 
mediante enlaces peptídicos. Los aminoácidos contienen en su estructura molecular 
al menos un grupo Amino primario (-NH2), un grupo de Ácido Carboxilo (-COOH) y 
una cadena lateral (R) que es característica de cada aminoácido y que influye en 
sus propiedades, en el Cuadro 1-1 se muestra la clasificación química: 
Cuadro 1-1. Clasificación química de los 20 aminoácidos más importantes. 
Aminoácido Abreviatura PM pI Hidrofobicidad Abundancia relativa (%) 
No polares 
Grupo R alifático 
Glicina Gly 75 5.97 -0.4 7.2 
Alanina Ala 89 6.01 1.8 7.8 
Valina Val 117 5.97 4.2 6.6 
Leucina Leu 131 5.98 3.8 9.1 
Isoleucina Ile 131 6.02 4.5 5.3 
Metionina Met 149 5.74 1.9 2.3 
Grupo R aromático 
Fenilalanina Phe 165 5.48 2.8 3.9 
Tirosina Tyr 181 5.66 -1.3 3.2 
Triptófano Trp 204 5.89 -0.9 1.4 
Polares 
Grupo R neutro 
Serina Ser 105 5.68 -0.8 6.8 
Prolina Pro 115 6.48 1.6 5.2 
Treonina Thr 119 5.87 -0.7 5.9 
Cisteína Cys 121 5.07 2.5 1.9 
Asparagina Asn 132 5.41 -3.5 4.3 
Glutamina Gln 146 5.65 -3.5 4.2 
Grupo R carga (+) 
Lisina Lys 146 9.74 -3.9 5.9 
Histidina His 155 7.59 -3.2 2.3 
Arginina Arg 174 10.76 -4.5 5.1 
Grupo R carga (-) 
Aspartato Asp 133 2.77 -3.5 5.3 
Glutamato Glu 147 3.22 -3.5 6.3 
(Lehninger, 2006) 
ANTECEDENTES 
 
 4
La estructura de las proteínas se determina por una serie de conformaciones 
interdependientes, que a continuación se citan: 
• Estructura primaria, que corresponde a la secuencia lineal específica (sin 
ramificaciones) de aminoácidos de una cadena polipeptídica mediante un 
enlace peptídico, la cual es el resultado de la traducción de la información 
genética contenida en la secuencia de nucleótidos del ADN. La importancia 
desde el punto de vista químico de la estructura primaria, radica en la 
secuencia de los grupos laterales de los aminoácidos (cadenas laterales, R) 
dado que es el componente variable de la molécula que proporciona la 
identidad a la cadena. Es tan importante esta secuencia que el cambio en 
solo un aminoácido como resultado de una mutación, puede ser trágico para 
la vida de un organismo. El grado de tolerancia a los cambios depende del 
grado de alteración de la geometría que presente la estructura proteica, así 
como del comportamiento químico que tiene la cadena lateral del 
aminoácido sustituido (polar, no polar, básico o ácido). Cabe resaltar que 
todas las proteínas sin importar su nivel de organización se originan de una 
estructura primaria que posteriormente adopta una conformación 
tridimensional específica. (Voet y Voet, 2006) 
 
• Estructura secundaria, es el plegamiento de la cadena peptídica sobre su 
propio eje para formar una estructura tridimensional específica, provocando 
la aparición de motivos estructurales, los más comunes son la α-hélice y la β-
lámina: 
 
ANTECEDENTES 
 
 5
 α-Hélice: Es la estructura secundaria más común, en la Figura 1, se observa 
cómo forma una estructura geométrica en espiral, muy uniforme, en la que 
cada vuelta está constituida por 3.6 aminoácidos. La hélice se mantiene 
unida mediante puentes de hidrógeno entre el hidrógeno del grupo amino del 
enlace peptídico de un aminoácido y el grupo carboxilo del enlace peptídico 
de otro. Dentro de este grupo se pueden mencionar proteínas como el 
colágeno, la queratina, elastina. 
 
Figura 1. Representación de las alfa-hélice. 
 β-lámina: Se caracteriza por presentarse de forma aplanada y extendida, 
como se observa en la Figura 2, además posee un máximo de enlaces de 
hidrógeno entre los enlaces peptídicos. Esta estructura consta de varias 
cadenas peptídicas que permanecen enfrentadas y se mantienen juntas con 
enlaces de hidrógeno en un arreglo a manera de zig-zag. La estructura 
laminar formada le confiere flexibilidad más no elasticidad. Debido a que 
toda cadena polipeptídica tiene un extremo C-terminal en una dirección y un 
extremo N-terminal en la otra, dos cadenas enlazadas con hidrógeno y una al 
lado de la otra pueden correr en la misma dirección, paralelas, o en 
α-hélice 
ANTECEDENTES 
 
 6
dirección opuesta, antiparalela. Un ejemplo de estas proteínas es la fibroína 
de la seda. (Stryer, 1995) 
 
Figura 2. Formas plegadas (configuración beta o de hoja plegada). 
• Mientras que la estructura secundaria trata fundamentalmente de la 
conformación de los aminoácidos adyacentes de la cadena polipeptídica, la 
Estructura terciaria, describe la conformación definitiva y específica de la 
proteína. Durante el enrollamiento de la cadena peptídica, para dar origen a 
la estructura terciaria, los puentes de hidrógeno y las interacciones iónicas e 
hidrofóbicas entre una parte de la cadena y otra son las fuerzas que 
mantienen los pliegues en posición espacial correcta. Por otra parte, los 
puentes disulfuro (-S-S-) que se forman entre los aminoácidos de cisteína 
pueden acercar partes que se hayan distantes en una proteína, de hecho 
algunos sitios activos de enzimas están constituidos por ellos. Además, en la 
proteína también se forman algunos otros enlaces covalentes para mantener 
su estructura terciaria que por lo general es globular. Con respecto a la 
estructura terciaria de cadenas polipeptídicas largas, cabe destacar la 
presencia de regiones compactas semi-independientes denominadas 
β-lámina 
ANTECEDENTES 
 
 7
dominios, que se caracterizan por poseer una geometría casi esférica 
específica con un interior hidrofóbico y un exterior polar. El carácter 
independiente del dominio es evidente cuando al separarlo de la cadena, su 
estructura primaria es capaz de plegarse sobre sí misma para adoptar la 
conformación nativa. Una proteína puede presentar más de un dominio, a 
menudo interconectados por un segmento polipeptídico carente de 
estructura secundaria regular y alternativamente estar separados por una 
hendidura o una región menos densa en la estructura terciaria de la proteína. 
Los diferentes dominios de una proteína pueden gozar de movimiento 
relativo que está asociado con una función. (Robinson, 1994) 
 
• Estructura cuaternaria, deriva de la conjunción de varias cadenas peptídicas 
que, asociadas conforman un multímero que posee propiedades distintas a la 
de sus monómeros componentes. Dichas subunidades pueden ser idénticas o 
diferentes y se asocian entre sí mediante interacciones no covalentes, como 
pueden ser puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas o puentes 
salinos para formar dímeros, trímeros y tetrámeros. En algunos casos las 
cadenas aisladas son inactivas, pero en otrospueden cumplir la misma 
función que el complejo, aunque con diferente cinética. (Lehninger, 2006) 
En la Figura 3 se muestra un ejemplo de la formación de los diferentes niveles de 
estructura que pueden existir en una proteína, el más conocido es la hemoglobina 
en donde las interacciones hidrofóbicas, los enlaces de hidrógeno y los enlaces 
ANTECEDENTES 
 
 8
iónicos ayudan a mantener las cuatro subunidades juntas para formar una molécula 
funcional, así cada subunidad de hemoglobina se pliega. 
 
 
Figura 3. Los cuatro niveles estructurales de la hemoglobina 
 
ANTECEDENTES 
 
 9
Los aminoácidos son la única fuente aprovechable de nitrógeno para el ser humano, 
además son elementos fundamentales para la síntesis de las proteínas, y son 
precursores de otros compuestos nitrogenados. (Jacques y Pierre, 2000) 
Los aminoácidos se dividen en aminoácidos esenciales y no esenciales. 
Aminoácidos esenciales son aquellos que no pueden ser sintetizados en el 
organismo, y por ende deben incorporarse en la dieta mediante ingesta: 
fenilalanina, leucina, isoleucina, lisina, metionina, treonina, triptofano y valina. 
Durante la infancia y adolescencia: arginina e histidina. 
Aminoácidos no esenciales son aquellos que son sintetizados en el organismo: 
alanina, cisteina, cistina, glicina, hidroxiprolina, prolina, serina, tirosina, ácido 
aspártico, y glutámico. 
Las proteínas no sólo son fuentes de aminoácidos, si no que debido a su naturaleza 
polimérica, su presencia influye en las características reológicas y en la textura del 
alimento, que hacen que éste se a más aceptado por el consumidor. 
(Casanueva, 2001) 
 
 
 
 
ANTECEDENTES 
 
 10
 1.2. PROPIEDADES FUNCIONALES 
La funcionalidad de las proteínas alimentarías se define como aquellas propiedades 
físicas y químicas que derivan del comportamiento de las proteínas en los sistemas 
alimenticios (ver el Cuadro 1-2) durante el procesado, el almacenamiento, la 
preparación y el consumo. (Kinsella, 1976) 
 Entre las propiedades físicas y químicas que gobiernan la funcionalidad de las 
proteínas se incluyen el tamaño, la forma, la composición y secuencia de 
aminoácidos, la carga neta y distribución de las cargas, el cociente 
hidrofobia/hidrofilia, las estructuras, secundaria, terciaria y cuaternaria, el grado 
de flexibilidad-rígidez y la capacidad de interaccionar con, o repeler, otros 
componentes. (Fennema, 1996) 
 Las diversas propiedades funcionales de las proteínas pueden considerarse 
como una manifestación de dos aspectos moleculares de las proteínas: 
 Propiedades hidrodinámicas como la viscosidad (espesamiento), la 
gelificación y la texturización que dependen del tamaño, la forma y la 
flexibilidad molecular. 
 Propiedades relacionadas con la superficie como la humectabilidad, la 
dispersabilidad, la solubilidad, las propiedades espumantes y 
emulsionantes. 
En los alimentos reales, las proteínas interaccionan con otros componentes 
alimenticios, como los lípidos, los azúcares, los polisacáridos y diversos 
componentes minoritarios y esto modifica su comportamiento funcional. 
ANTECEDENTES 
 
 11
Para el estudio de las proteínas es necesario de su aislamiento y purificación, ya sea 
para caracterizar su estructura o su función biológica. (Fennema, 1996) 
Cuadro 1-2. Propiedades funcionales de las proteínas alimentarías en los sistemas alimenticios 
Función Mecanismo Alimento Tipo de proteína 
Solubilidad Hidrofilia Bebidas Proteínas de 
suero lácteo 
Viscosidad Fijación de agua, 
tamaño y forma 
hidrodinámica 
Sopas, caldos, 
aderezos para 
ensaladas, 
postres 
Gelatina 
Fijación de 
agua 
Puentes de 
hidrógeno, 
hidratación 
iónica 
Salchichas y pan Proteínas del 
músculo, 
proteínas del 
huevo 
Gelificación Atropamiento e 
inmovilización de 
agua, formación 
de una red 
tridimensional 
Carnes, geles y 
queso 
Proteínas 
musculares, 
del huevo y 
lácteas 
Cohesión-
adhesión 
Interacciones 
hidrofóbicas e 
iónicas y puentes 
de hidrógeno 
Carnes, 
salchichas, 
pastas, productos 
horneados 
Proteínas 
musculares, 
del huevo y del 
lacto-suero 
Elasticidad Interacciones 
hidrofóbicas, 
puentes disulfuro 
Carnes y 
productos 
horneados 
Proteínas 
musculares y 
de cereales 
Emulsión Adsorción y 
formación de 
película en la 
interfase 
Salchichas, sopas 
y aderezos 
Proteínas del 
músculo, la 
leche y los 
huevos 
Formación 
de espuma 
Adsorción en la 
interfase y 
formación de 
película 
Postres y helados Proteínas 
lácteas y del 
huevo 
Fijación de 
grasa 
Interacciones 
hidrofóbicas 
Productos 
horneados pobres 
en grasa, 
buñuelos 
Proteínas 
lácteas, del 
huevo y de los 
cereales
 (Fennema, 1996) 
 
 1.2.1. HIDRATACIÓN 
El agua es un constituyente esencial de los alimentos. Las propiedades reológicas y 
texturales de los alimentos dependen de la interacción del agua con otros 
ANTECEDENTES 
 
 12
constituyentes de los alimentos, especialmente con macromoléculas, como las 
proteínas y los polisacáridos. Muchas propiedades funcionales de las proteínas, 
como la dispersabilidad, la humectabilidad, el hinchamiento, la solubilidad, la 
viscosidad, la capacidad de retención de agua, la gelificación, la coagulación, la 
emulsión y la formación de espuma dependen de las interacciones agua-proteína. 
(Fennema, 1996) 
 
 1.2.2. ABSORCIÓN DE AGUA (También llamada fijación o afinidad de agua) 
La capacidad de absorción de agua de las proteínas considera todos los tipos de 
agua de hidratación además de una fracción de agua remanente, aun asociada con 
la proteína después de la centrifugación. 
 El término agua fija (agua ligada) es usado ampliamente a pesar de no estar 
uniformemente definido. Podría denotar aquella agua que no se congela a una 
temperatura específica, agua que no está disponible como solvente, agua que 
muestra diferentes propiedades físicas o agua que se mueve con la macromolécula 
en una zona de sedimentación. El agua fija es realmente aquella agua en la 
vecindad de una macromolécula cuyas propiedades difieren detectablemente de 
aquellas de la fase de agua masiva en el mismo sistema (Kinsella, 1982) 
 Las proteínas fijan alrededor de 30 a 50 g de agua/100 g de proteínas, y las 
globulares y fibrosas parecen tener una hidratación similar a pesar de las 
diferencias en solubilidades. 
ANTECEDENTES 
 
 13
Varios factores afectan la fijación de agua en las proteínas, a continuación se 
mencionan algunos: 
a. Composición de aminoácidos 
Los grupos laterales (R) de la estructura de los aminoácidos pueden ser no polares 
(sin diferencia de carga entre distintas zonas del grupo), polares pero con cargas 
balanceadas de modo tal que el grupo lateral en conjunto es neutro, o cargados, 
negativa o positivamente. 
Los grupos laterales no polares son insolubles en agua, mientras que los grupos 
laterales polares y cargados son solubles en agua. (Belitz, 1997) 
b. Concentración iónica 
El tipo y la concentración de iones ejercen un considerable efecto sobre la 
absorción de agua, el hinchamiento y la solubilidad de las proteínas. Generalmente, 
se establece una competencia en la interacción entre el agua, la sal y las cadenas 
laterales de los aminoácidos. A bajas concentraciones de sal, la hidratación de las 
proteínas puede verse incrementada, en tanto que a concentraciones salinas 
elevadas, las interacciones agua-sal predominan sobre la proteína-agua y la 
proteína puede “deshidratarse”. (Olivos, 2005) 
c. Temperatura 
La fijación del agua por las proteínas desciende generalmente a medida que se 
eleva la temperatura, debido a la disminución de puentes de hidrógeno. El 
calentamiento provoca la desnaturalización y la agregación, pudiendo esta última 
reducir el área superficial y el número de grupos amino polares disponibles para 
fijar agua. Por otro lado cuando se calientan proteínas con una estructura muy 
compacta, la disociación el desplegamiento ocasionados puedenexponer enlaces 
ANTECEDENTES 
 
 14
peptídicos y cadenas laterales polares previamente ocultos, lo que aumenta la 
fijación de agua. (Fennema, 1996) 
 
 1.2.3. SOLUBILIDAD 
Los datos sobre las características de solubilidad son muy útiles para poder 
determinar las condiciones óptimas de extracción y purificación de las proteínas, a 
partir de fuerzas naturales, así como la separación de fracciones proteínicas. Esto 
se debe al hecho de que el grado de insolubilidad es, probablemente, la medida 
más práctica de la desnaturalización-agregación proteínica y porque las proteínas 
que existen al comienzo en un estado desnaturalizado, parcialmente agregado, 
muestran frecuentemente un descenso de capacidad de gelificación, emulsión o 
formación de espumas. (Cheftel et al, 1989) 
 La solubilidad de una proteína es la manifestación termodinámica del 
equilibrio entre interacciones proteína-proteína y proteína-solvente. En otras 
palabras, la solubilidad está directamente relacionada con la naturaleza 
fisicoquímica de la superficie de la proteína, la cual a su vez es influenciada por el 
patrón de plegamiento de la cadena polipeptídica. La solubilidad depende 
principalmente del pH, la fuerza iónica, el tipo de disolvente y la temperatura. 
(McWatters y Cherry, 1977) 
 La solubilidad de las proteínas en agua es función de una gran cantidad de 
parámetros. Desde el punto de vista termodinámico, la solubilización corresponde a 
la separación de moléculas de disolvente, la separación de moléculas de proteína y 
ANTECEDENTES 
 
 15
la dispersión de estas últimas en el disolvente con la máxima interacción entre la 
proteína y el disolvente. 
De acuerdo con la clasificación de solubilidad del Cuadro 1-3, una proteína debe ser 
capaz de interactuar lo más posible con el disolvente (por puentes de hidrógeno, 
enlaces dipolo-dipolo y enlaces iónicos), para ser soluble. 
Cuadro 1-3. Clasificación de las proteínas basada en la solubilidad 
SOLUBILIDAD NOMBRE EJEMPLOS 
Proteínas solubles en agua a pH 
de 6.6 
ALBÚMINAS Albúmina de suero, albúmina 
de huevo, alfa-lactalbúmina 
Proteínas solubles en soluciones 
salinas diluidas, pH 7 
GLOBULINAS Beta-lactoglobulina 
Glicinina en la soya 
Proteínas solubles en etanol al 
70% 
PROLAMINAS Zeína del maíz y gliadina del 
trigo 
Proteínas insolubles en los 
anteriores y solubles en ácidos 
(pH 2) ó álcalis (pH 12) 
GLUTELINAS Glutenina del trigo 
Oryzenina en el arroz 
Proteínas insolubles ESCLEROPROTEÍNAS Colágeno o la α-queratina 
 (Modificado Bourgeios, 1986) 
 
 
 Influencia del pH 
En valores de pH diferentes al punto isoeléctrico la proteína se carga positiva o 
negativamente y las moléculas de agua pueden interactuar con estas cargas 
contribuyendo a la solubilización. (VanMegan, 1974) 
 Más aún, las cadenas proteínicas con cargas eléctricas del mismo signo tiene 
una tendencia a repelerse y a disociarse o desenvolverse. 
 Si la solubilidad de una proteína dada se grafica en función del pH, se 
obtiene normalmente una curva en forma de V o U, donde el mínimo corresponde 
cercanamente al pI. Este comportamiento indica cuales serían las mejores 
condiciones para disolver un número de proteínas, especialmente de semillas. 
ANTECEDENTES 
 
 16
 Para poder utilizar las proteínas contenidas en las semillas se requiere de su 
extracción por medio de su disolución. La solubilidad y por tanto el rendimiento de 
extracción es mayor a valores alcalinos de pH; de hecho, el número de residuos 
cargados negativamente a valores de pH mayores al pI (asp y glu) es más grande que 
el número de residuos cargados positivamente a pH’s menores de pI (lis, arg e his). 
(Fennema, 1996) 
 La solubilidad y extractabilidad a pH’s alcalinos (o neutros) puede mejorarse 
incrementando la carga eléctrica neta de las proteínas. Es posible hacer reaccionar 
proteínas con moléculas anfipolares que tienen zonas hidrofóbicas e ionizadas, 
como dodecilsulfato de sodio, en cuyo caso los residuos hidrofóbicos de aminoácidos 
se convierten en acarreadores de cargas negativas. 
 Para valores de pH no lejanos al pI, las moléculas de proteína muestran 
mínimas interacciones con agua y sus cargas netas son suficientemente pequeñas 
para permitir a las cadenas polipeptídicas acercarse una a otra. A veces se forman 
agregados y esto puede llevar a la precipitación proteínica. La velocidad de 
precipitación se mejora cuando los diámetros de los agregados nuevamente son 
grandes. (Wijeratne, 2005) 
 Fuerza iónica 
Los iones de sales neutras a molaridades del orden de 0.5-1.0 M pueden 
incrementar la solubilidad de las proteínas. Este efecto se denomina “salting in” 
(solubilización por salado). Los iones reaccionan con las cargas de proteínas y 
disminuyen la atracción electrostática entre cargas opuestas de las moléculas 
ANTECEDENTES 
 
 17
vecinas. Además la solvatación intrínseca de estos iones sirve para incrementar la 
solvatación de las proteínas y por tanto, aumentar su solubilidad. 
 Si la concentración de sales neutras es mayor a 1.0 M, la proteína disminuye 
en solubilidad, lo que puede terminar en precipitación. Este efecto se denomina 
“salting out”, (insolubilización por salado) y resulta de la competencia entre la 
proteína y los iones salinos por las moléculas de agua necesarias para sus 
solvataciones respectivas. Por tal motivo, las interacciones proteína-proteína se 
vuelven más poderosas que las interacciones proteína-agua y esto puede originar 
una agregación seguida de precipitación de las moléculas de proteína. 
(Cheftel et al, 1989) 
 Influencia de la temperatura (a pH y fuerza iónica constantes) 
Como regla, la solubilidad de las proteínas aumenta con la temperatura entre 0 y 
40-50ºC. Arriba de estas temperaturas, el movimiento molecular es lo 
suficientemente fuerte como para romper los enlaces involucrados en la 
estabilización de estructuras secundarias y terciarias. (Natarajan et al, 2005) 
 Esta desnaturalización es frecuentemente seguida por una agregación, en 
cuyo caso la solubilidad de la proteína se torna menor que la de la proteína nativa. 
Sin embargo, la capacidad de la proteína agregada para fijar agua se modifica solo 
levemente, a veces incluso se incrementa, principalmente pro-adsorción de agua en 
los capilares del coagulo o gel resultante. 
Desde el punto de vista práctico y tecnológico, es importante recalcar los siguientes 
aspectos: 
ANTECEDENTES 
 
 18
a) Las características de solubilidad son útiles para determinar las condiciones 
óptimas de extracción y purificación de proteínas a partir de fuentes 
naturales. 
b) La solubilidad es un buen índice de las aplicaciones potenciales de su 
desnaturalización proteínica y de su agregación. Hay una relación entre las 
proteínas inicialmente existentes en estado desnaturalizado y parcialmente 
agregado y su capacidad para participar en la gelificación, emulsificación y 
espumado. 
c) La solubilidad se ve marcada e irreversiblemente reducida cuando se 
involucra calentamiento. 
(Zayas, 1997) 
 
 1.2.4. EMULSIFICACIÓN 
La capacidad de las proteínas para actuar como surfactantes y emulsificantes 
depende de su habilidad para adsorberse en una interfase agua-aceite. Esta 
adsorción reduce la tensión superficial, ya que la proteína forma una película 
coadhesiva entre las dos fases. 
 La adsorción de la proteína en la interfase agua-aceite ocurre por un proceso 
de difusión controlada; la velocidad de adsorción depende del tamaño y forma de la 
molécula, de la viscosidad del solvente y de la temperatura. Esta difusión se facilita 
por la homogenización. (Damodaran, 1994) 
ANTECEDENTES 
 
 19
 Las emulsiones son dispersiones de dos líquidos inmiscibles, uno de los cuales 
se encuentra bajo la forma de pequeñas gotitas dispersas en el otro líquido que 
constituye la fase continua dispersante. (Cheftel et al, 1989) 
 Las proteínas se adsorben en la interfase entre las gotitas deaceite disperso 
y la fase acuosa continua, y aportan propiedades físicas y reológicas (espesamiento, 
viscosidad, elasticidad-rigidez) que determinan la resistencia de las gotitas a la 
coalescencia. Así mismo, según el pH, se puede producir la ionización de las 
cadenas laterales de los aminoácidos y esto aporta fuerzas de repulsión 
electrostática que favorecen la estabilidad de la emulsión. (Volkert y Klein, 1979) 
La función de las proteínas como agentes emulsificantes se mide por diferentes 
parámetros: 
1. Estabilidad de una Emulsión (ES), es el mantenimiento de una estructura y 
textura homogéneas del sistema. Esto se debe a la presencia de una capa 
interfacial estable, constituida por una película de proteínas adsorbidas, que 
se oponen físicamente a la coalescencia de las gotitas. 
2. Índice de Actividad Emulsificante (IAE), se expresa como el área de la 
interfase estabilizada por unidad de peso de proteína. 
3. Actividad de Emulsificación (AE), es el área superficial total de la emulsión. 
4. Capacidad de Emulsificación (CE), es la máxima cantidad de lípido 
emulsificado en una dispersión proteínica. 
(Díaz y Maldonado, 2000) 
 
 
ANTECEDENTES 
 
 20
 Factores que influyen en la emulsificación 
Las emulsiones son mezclas termodinámicamente inestables de sustancias 
inmiscibles. Cuando el agua y un lípido se mezclan hay una fuerte repulsión que 
limita su contacto y ocurre una separación de fases. 
 Las proteínas estabilizan emulsiones. Cuando los grupos hidrofóbicos se 
ponen en contacto mínimo con el agua para dar un estado energéticamente 
favorable, se origina una estructuración ordenada de moléculas de agua lo que 
resulta en la formación de pequeñas gotas. (Puppo et al, 2005) 
Se cree que la adsorción de proteínas en la interfase ocurre en tres fases: 
a) La proteína nativa se difunde a la región de contacto donde penetra a la 
interfase y resulta una desnaturalización de superficie. 
b) La proteína adsorbida se rearregla para formar el estado de menor energía 
insertando grupos hidrofóbicos en la fase oleosa. 
c) Se forma una capa de proteína alrededor de los glóbulos de grasa. 
La adsorción de proteínas en las interfases puede variar por factores como la 
flexibilidad conformacional, la hidrofobicidad y la viscoelasticidad de la capa 
interfacial. (Yasumatsu et al, 1972) 
Los cambios de pH y la fuerza iónica pueden afectar las propiedades de 
hidrofobicidad alterando la conformación proteínica. 
 
 Las proteínas como estabilizantes de emulsiones alimenticias. 
Un grupo numeroso de productos alimenticios esta constituido por emulsiones: 
leche, cremas, helados, mantequilla, queso fundido, mayonesas, embutidos, etc., 
donde los constituyentes proteínicos tienen frecuentemente un papel 
preponderante en la estabilización de estos sistemas coloidales. La emulsión natural 
ANTECEDENTES 
 
 21
de la leche esta estabilizada por la membrana de glóbulos grasos que esta formada 
por capas sucesivas adsorbidas de triglicéridos, fosfolípidos, lipoproteínas insolubles 
y proteínas solubles. (McWatters y Cherry, 1977) 
 
 1.2.5. ESPUMADO 
La formación de espuma ocurre cuando las moléculas de agua tienen que rodear 
burbujas de aire. Las moléculas de agua son forzadas al contacto con aire 
relativamente no polar, tienden a ordenarse, lo que resulta en una alta tensión 
superficial y una alta energía en la superficie. Las proteínas decrementan esta 
energía al interactuar con ambos: aire y agua. (Díaz y Maldonado, 2000) 
 Las espumas inicialmente contienen un gran número de celdas pequeñas de 
aire separadas por una capa interfacial adsorbida y de zonas de solución acuosa. 
 Cuando la espuma transcurre, la fase acuosa se drena y las celdas de aire se 
acercan unas a otras. Sin embargo, la presencia de la capa interfacial continua 
dando estabilidad aun después de un drenado considerable. 
 Durante el batido, las regiones hidrofóbicas de las proteínas interactúan con 
el aire y causan el desdoblamiento y exposición de los grupos hidrofóbicos 
escondidos. Esto baja la tensión superficial que permite la creación de más 
burbujas. 
 Las espumas o batidos alimenticios son dispersiones de burbujas de gas en 
una fase continua líquida o semisólida que contiene un surfactante soluble. En 
numerosos casos, el gas es aire o eventualmente gas carbónico y la fase continua 
una solución o suspensión acuosa que contiene proteínas. 
ANTECEDENTES 
 
 22
 Las burbujas de gas de una espuma pueden variar mucho de tamaño, 
oscilando de un diámetro de 1nm a algunos centímetros, a causa de numerosos 
factores tales como la tensión superficial y viscosidad de la fase líquida, el aporte 
de energía, etc. Normalmente, una distribución uniforme de burbujas pequeñas, da 
al alimento suavidad y ligereza, así como un aumento de la dispersión y 
perceptibilidad de aromas. (McWatters y Cherry, 1977) 
Para estabilizar las espumas son tres los factores más importantes que intervienen: 
� Una baja tensión entre fases 
� Una alta viscosidad de la fase líquida 
� La presencia de películas de proteínas adsorbidas resistentes y elásticas 
La proteína espumante ideal debe poseer gran superficie hidrofóbica, buena 
solubilidad y baja carga neta al pH del producto alimenticio. Debe ser también 
fácilmente desnaturalizable. 
 Las sales pueden influenciar en la solubilidad, viscosidad, desdoblamiento y 
agregación de las proteínas, por lo que pueden alterar las propiedades espumantes. 
Esto se debe, probablemente, a un descenso de la viscosidad de la solución 
proteínica. Los iones Ca++ pueden mejorar la estabilidad al formar puentes iónicos 
entre los grupos carboxílicos de la proteína. (Fennema, 1996) 
 La sacarosa, y otros azúcares reducen la expansión de la espuma pero 
mejoran su estabilidad, por que aumentan la viscosidad global de las espumas. Con 
ANTECEDENTES 
 
 23
concentraciones mínimas de lípidos contaminantes se alteran fuertemente las 
propiedades espumantes de las proteínas. 
 
 Estabilidad de la espuma 
Requiere condiciones independientes de las necesarias para la formación de la 
espuma. Tales condiciones se citan a continuación: 
a) La formación de una película proteínica espesa, cohesiva, elástica, continua 
e impermeable al aire, en torno a cada burbuja de gas. 
b) Para la formación de estas películas estables, tiene que asociarse entre si, en 
la interfase, varias capas de proteínas parcialmente desdobladas, mediante 
interacciones hidrofóbicas o posiblemente por interacciones de puentes de 
hidrógeno o electrostáticas. 
c) La proteína debe adsorberse fuertemente en la interfase aire/agua mediante 
interacciones hidrofóbicas, para evitar la deserción de la proteína y por 
tanto, la pérdida de líquido. 
d) Se necesita una flexibilidad y movilidad de las moléculas proteínicas que sea 
suficiente para contrarrestar las fuerzas de deformación y la extensión de la 
interfase. 
e) Las proteínas deben ser capaces de emigrar de una región de tensión 
interfacial baja hacia otra región de tensión interfacial elevada, englobando 
entre ellas las moléculas de agua. 
 (Sorgentini y Wagner, 2002) 
ANTECEDENTES 
 
 24
 1.2.6. GELIFICACIÓN 
Cuando las proteínas desnaturalizadas se agregan para formar una red proteínica 
ordenada, al proceso se le denomina gelificación. 
 La gelificación una propiedad funcional muy importante de algunas proteínas. 
Juega una papel fundamental en la preparación de numerosos alimentos, entre 
ellos, diversos productos lácteos, clara de huevo coagulada, geles de gelatina, 
varios productos de carne o pescado triturados y calentados, geles de proteína de 
soya, proteínas vegetales texturizadas por extrusión o hilado y masas panarias. Se 
utiliza no sólo para formar geles sólidos viscoelásticos, sino también para mejorar la 
absorción de agua, los efectos espesantes, la adhesión y para estabilizar emulsiones 
y espumas. (Puppo et al, 1995)La formación del gel requiere de un tratamiento térmico, con frecuencia 
seguido de un enfriamiento y puede verse favorecida por una ligera acidificación; a 
veces puede ser necesaria la adición de sales, especialmente iones calcio para 
acelerar la gelificación o la fuerza del gel. Sin embargo, algunas proteínas pueden 
formar geles sin ser sometidas a tratamiento térmico, bajo el efecto de una 
hidrólisis enzimática muy limitada, la simple adición de iones calcio o la 
alcalinización seguida de ajuste de pH a valores neutros o al punto isoeléctrico. 
 
 Características de la formación y de la estructura de los geles 
La formación de redes proteínicas se considera el resultado de un balance entre las 
interacciones proteína-proteína y proteína-disolvente (agua) y entre las fuerzas 
ANTECEDENTES 
 
 25
atractivas y repulsivas entre las cadenas polipeptídicas adyacentes. Entre las 
fuerzas atractivas implicadas se encuentran las interacciones hidrofóbicas 
(potenciadas por las temperaturas elevadas) y las electrostáticas (como los puentes 
de Ca2+ y otros cationes divalentes), los puentes de hidrógeno (potenciados por el 
enfriamiento) y los enlaces disulfuro. Su contribución relativa depende de la 
naturaleza de la proteína, de las condiciones ambientales y de la etapa de proceso 
de gelificación. Las repulsiones electrostáticas (especialmente a valores de pH 
alejados del punto isoeléctrico) y las interacciones proteína-agua tienden a 
mantener separadas las cadenas polipeptídicas. Las elevadas concentraciones de 
proteína facilitan la atracción intermolecular (de las proteínas) y la gelificación, 
por que incrementan los contactos intermoleculares. A concentraciones proteínicas 
altas, la gelificación puede tener lugar incluso en condiciones ambientales no 
favorables a la agregación (sin calentamiento, a valores de pH alejados del punto 
isoeléctrico, etc.). (Yufei Hua et al, 2005) 
 El establecimiento de enlaces cruzados covalentes (puentes disulfuro) suele 
conducir a la formación de geles irreversibles, por calentamiento, como ocurre con 
los de ovalbúmina y β lactoglobulina. En cambio, los geles de gelatina, que están 
estabilizados principalmente por puentes de hidrógeno, funden cuando se calientan 
(a unos 30°C), pudiendo repetirse numerosas veces el ciclo de gelificación-fusión. 
Si se parte de una disolución de proteína en agua, las primeras etapas en la 
formación de geles por calentamiento suelen ser las siguientes: 
ANTECEDENTES 
 
 26
a) Disociación reversible de la estructura cuaternaria en subunidades o 
monómeros, (también puede darse, como etapa inicial de la 
desnaturalización, una disociación irreversible de polímeros nativos). 
b) Desnaturalización irreversible de las estructuras secundaria y terciaria (el 
desplegamiento es generalmente solo parcial). 
Se ha sugerido la siguiente clasificación de las proteínas y los geles formados bajo la 
acción del calor: 
 Que precipitan bajo la acción del calor a concentraciones bajas y que dan 
geles opacos, a concentraciones elevadas como la ovalbúmina; 
 Que a concentraciones elevadas dan geles claros y termoreversibles como la 
gelatina. 
(Fennema, 1996) 
 
 
 
 
 
 
 
ANTECEDENTES 
 
 27
 1.3. MÉTODOS MÁS EMPLEADOS EN LA DETERMINACIÓN DE PROTEINAS 
Las proteínas constituyen el principal componente de sustancias nitrogenadas, 
ocupando una posición de suma importancia en las producciones agroalimentarias 
por que condicionan las propiedades funcionales de numerosos productos; además 
desempeñan un papel específico en el campo nutricional. Por lo tanto, su 
determinación es una necesidad imperiosa para numerosos usuarios aunque, 
paradójicamente, se cuantifica de forma indirecta y aproximada. 
(Jacques y Pierre, 2000) 
 
 1.3.1. Método Kjeldahl 
El método Kjeldahl determina el nitrógeno total tanto orgánico (nitrógeno amino y 
amido) como nitrógeno no proteico (urea, aminoácidos, etc.) contenido en una 
muestra. Es el que más se utiliza e incluso se toma como referencia o comparación 
cuando se usan otras técnicas; con este procedimiento se mide el nitrógeno total de 
un alimento sin hacer distinción entre aquel que proviene de las proteínas y el no 
proteínico; esto puede dar lugar a errores en el cálculo e interpretación. 
 El método se basa en la determinación de la cantidad de nitrógeno orgánico 
contenido en productos alimentarios, compromete dos pasos consecutivos: 
a) La descomposición de la materia orgánica bajo calentamiento en presencia 
de ácido sulfúrico concentrado. 
b) El registro de la cantidad de amoniaco obtenida de la muestra 
ANTECEDENTES 
 
 28
 Durante el proceso de descomposición ocurre la deshidratación y 
carbonización de la materia orgánica combinada con la oxidación de carbono a 
dióxido de carbono. El nitrógeno orgánico es transformado a amoniaco que se 
retiene en la disolución como sulfato de amonio. La recuperación del nitrógeno y 
velocidad del proceso pueden ser incrementados adicionando sales que abaten la 
temperatura de descomposición (sulfato de potasio) o por la adición de oxidantes 
(peróxido de hidrógeno, tetracloruro, persulfatos o ácido crómico) y por la adición 
de un catalizador. (Nollet, 1996) 
El método de Kjeldahl consta de las siguientes etapas: 
a) Digestión Proteína + H2SO4 CO2 + (NH4)2SO4 + SO2 
b) Destilación (NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + NH3 + H2O 
(recibiendo en HCl) NH3 + HCl(exceso medido) NH4Cl + HCl 
(recibiendo en H3BO3) NH3 + H3BO3 NH4H2BO3 
c) Titulación 
(si se recibió en HCl) NH4Cl + HCl + NaOH NH4Cl + NaCl + H2O 
(si se recibió en H3BO3) NH4H2BO3 + HCl H3BO3 + NH4Cl 
En la mezcla de digestión se incluye sulfato sódico para aumentar el punto de 
ebullición y un catalizador para acelerar la reacción, tal como sulfato de cobre. El 
amoniaco en el destilado se retiene o bien por un ácido normalizado y se valora por 
retroceso, o en ácido bórico y valora directamente. El método Kjeldahl no 
ANTECEDENTES 
 
 29
determina, sin embargo, todas las formas de nitrógeno a menos que se modifiquen 
adecuadamente; esto incluye nitratos y nitritos. (Pearson, 1993) 
Para convertir el nitrógeno a proteína se emplea el factor de 6.25 el cual proviene 
de la consideración de que la mayoría de las proteínas tienen una cantidad 
aproximada de 16% de nitrógeno, en el Cuadro 1-4, se muestran ejemplos en los que 
el factor de conversión es diferente. 
25.6
16
Pr100
==
gNitrógeno
oteínagfactor 
Cuadro 1-4. Factores de conversión de nitrógeno a proteína para algunos alimentos 
Alimento % N en proteína Factor 
Huevo o carne 16.0 6.25 
Leche 15.7 6.38 
Trigo 18.76 5.33 
Maíz 17.70 5.65 
Avena 18.66 5.36 
Soya 18.12 5.71 
Arroz 19.34 5.17 
 (Nielsen, 2003) 
 
 1.3.2. Método de Biuret 
El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la 
formación de un complejo estable entre proteínas y cobre (II). El complejo presenta 
un color violeta característico, que se puede observar a 310 nm o 540-560 nm, el 
cual se da por la coordinación de un átomo de cobre con cuatro átomos de 
nitrógeno. El complejo se basa en la desprotonación de los grupos amida para 
formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado 
entre el metal y los pares de electrones libres de los átomos de oxigeno y de 
nitrógeno del péptido (ver Figura 5). 
ANTECEDENTES 
 
 30
 Después de la adición del reactivo de cobre se requiere de tiempo para 
desarrollar una coloración de Biuret estable; es necesario considerar la posible 
influencia de aminoácidos libres que forman buffer en configuración tris y 
amoniaco. (Nollet, 1996) 
N
NH
H
O
O
R
R
N
N H
H
O
O
R
R
2+Cu
 
Figura 4. Estructura del complejo entre el cobre y los enlaces peptídicos 
 
 
 1.3.3. Absorción en el Ultravioleta (280 nm) 
La mayoría de las proteínas muestranuna absorción a 280 nm, la cual se atribuye al 
grupo fenólico de la tirosina y al grupo indólico del triptofano. La cuantificación de 
proteínas basada en la absorción en la región de UV, tiene la ventaja de que no es 
necesario utilizar reactivos y la muestra no se daña o destruye durante la 
determinación. Se toma en cuenta la absorción del disolvente, ya que este puede 
absorber en la misma región. Este método sufre interferencias de compuestos que 
contengan anillos de purina y pirimida. Se realiza una comparación con una 
proteína estándar, de la que se debe conocer su composición. (Nollet, 1996) 
ANTECEDENTES 
 
 31
1.3.4. Método de Lowry 
El método de Lowry combina la reacción de Biuret con la reducción del reactivo de 
Folin-Ciocalteu (ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico) por la oxidación de tirosina, 
triptofano, cisteína, cistina de las cadenas polipeptídicas (Nielsen, 1988). El 
proceso de oxido-reducción se acompaña de la formación de un color azul 
característico. Los quelatos de cobre en la estructura del péptido facilitan la 
transferencia de electrones de los grupos funcionales amino al cromóforo ácido. 
Este método es útil para determinar pequeñas cantidades de proteína en una 
disolución. El desarrollo de color es dependiente en gran cantidad del pH, que se 
debe mantener entre 10 y 10.5. (Nollet, 1996) 
 
Figura 5. Esquema general de las reacciones que se llevan a cabo en el método de Lowry 
 
 
1.3.5. Método Turbidimétrico 
La turbidez producida cuando una proteína se mezcla con alguno de los 
precipitantes comunes (ácido tricloroacético 3-10%, ácido sulfosalicílico y 
ANTECEDENTES 
 
 32
ferrocianuro de potasio en ácido acético) para proteínas en bajas concentraciones 
se puede utilizar como un índice de la concentración de proteínas. 
 Las técnicas turbidimétricas son rápidas y convenientes, si embargo las 
principales desventajas (ver el Cuadro 1-5) que presentan es que las proteínas 
difieren en la velocidad de precipitación y así como no permiten diferenciar entre 
proteínas y compuestos insolubles en ácidos como ácidos nucleicos. (Layne, 1957) 
Cuadro 1-5. Ventajas y desventajas de los métodos más empleados para determinar proteína. 
Método Ventajas Desventajas 
 
 
 
 
Método de Kjeldahl 
 Es apropiado para varios 
tipos de productos 
 Su alta confiabilidad y 
disponibilidad 
 Esta incluido en los métodos 
aprobados por las 
organizaciones 
internacionales 
 Llega haber interferencia de 
compuestos nitrogenados no 
proteicos 
 Durante la digestión se 
produce demasiado humo 
 Uso de catalizadores caros o 
tóxicos 
 Baja sensibilidad 
 Tarda demasiado tiempo 
 
 
 
 
Absorción a 280nm 
 Rápida y no destructiva 
 No se necesitan reactivos 
 Alta sensibilidad 
 Baja dependencia de la 
respuesta de la señal a la 
composición del aminoácido 
 Baja interferencia de ácidos 
nucleicos y nucleótidos 
 La interferencia de otros 
compuestos que absorban en 
UV 
 Se necesita usar muestras 
limpias y lámparas 
relativamente nuevas 
 
 
 
 
Método de Biuret 
 No hay interferencia de 
aminoácidos libres 
 Pequeña influencia de la 
composición del aminoácido 
en el desarrollo de color 
 La operación es simple y se 
puede manejar numero 
grande de muestras 
 Interferencia de amoniaco, 
buffer, detergentes 
 Baja sensibilidad 
 
 
 
 
Método de Lowry 
 Alta sensibilidad 
 Fácil de operar 
 Fácil de manejar un gran 
numero de muestras 
 Dependencia del color con la 
composición del aminoácido 
 Interfieren un buen numero 
de compuestos 
 Inestabilidad del reactivo 
Folin-Ciocalteau a pH 
alcalino 
 La curva estándar no es 
lineal para altas 
concentraciones de proteínas 
(Nollet, 1996) 
 
ANTECEDENTES 
 
 33
1.3.6. Unión de colorantes 
Controlando el pH y la fuerza iónica del medio los grupos funcionales ácidos y 
básicos de las proteínas pueden interactuar con grupos orgánicos de carga opuesta. 
 Al realizarse la unión se presenta coloración o bien un cambio de ésta. 
Comúnmente se usan colorantes sulfonados los cuales reaccionan a pH ácido con el 
grupo ε-amino de la lisina y el grupo guanidina de la arginina, el imidazol de la 
histidina y un número limitado de α-amino terminales. (Nollet, 1996) 
 
1.3.7. Cromatografía de Exclusión Molecular 
La cromatografía es una técnica que permite la separación de moléculas diferentes 
presentes en una misma muestra. Está basada en la circulación de una fase móvil 
(que arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a través de una fase 
estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan los 
distintos compuestos presentes en la mezcla resultará su separación. La 
cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada filtración en gel 
o de tamiz molecular) es una de las técnicas más sencillas de las empleadas en la 
separación de proteínas y ácidos nucleicos. (Harris, 2001). 
 
 
 
 
 
ANTECEDENTES 
 
 34
 1.4. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS. (Método de Osborne y Mendel). 
 El método se fundamenta en la relación estructura-solubilidad de las proteínas. Por 
ejemplo, se sabe que la zeína que es soluble en un alcohol fuerte o en disoluciones 
alcalinas diluidas, pero es insoluble en agua o en soluciones neutras inorgánicas. Las 
glutelinas por ejemplo es insoluble en agua, en soluciones salinas y en alcohol, y 
bastante soluble en sosa y potasa. 
 Es importante notar que la mayoría de nitrógeno proveniente de proteínas es 
soluble en alcohol y en disoluciones alcalinas. Las globulinas, albúminas y prolinas 
son solubles en disoluciones alcalinas diluidas. (Osborne y Mendel, 1914) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ANTECEDENTES 
 
 35
 1.5. FUENTES DE PROTEINAS EN LOS ALIMENTOS 
Las proteínas se encuentran ampliamente distribuidas (ver el Cuadro 1-6) tanto en 
alimentos de origen animal (carnes, pescados, leche, productos lácteos y huevos), 
como en alimentos de origen vegetal (leguminosas: soya, lentejas, chícharo, 
garbanzo, etc; cereales: arroz, avena, maíz, trigo, etc; y frutos secos: nueces, 
almendras y otros). (Robinson, 1994) 
Cuadro 1-6. Contenido aproximado de proteína en alimentos. 
ALIMENTO g Proteína / 100 g producto 
Soya 34 
Queso curado 32 
Bacalao 32 
Salami 26 
Atún 24 
Queso Roquefort 23 
Sardinas enlatadas 22 
Chorizo cocido 22 
Carne magra de vacuno 21 
Hígado 21 
Camarones 20 
Almendras 20 
Garbanzos 19 
(Casanueva, 2001). 
 
Cabe destacar que la soya entre los alimentos referidos en el Cuadro 1-6 tiene un 
contenido de proteína mayor, tomando en cuenta alimentos de origen animal ricos 
en proteínas; y de origen vegetal como los garbanzos, que también forman parte de 
las leguminosas, que contienen un 19% de proteína. 
 
 
 
 
 
ANTECEDENTES 
 
 36
1.6. LA SOYA 
Las proteínas de la soya son las más recomendables de entre las leguminosas, por 
sus propiedades nutritivas y saludables; y que junto con las algas y levaduras, posee 
mayor contenido en proteínas (el doble o triple que las carnes y pescados). 
 
 
 
 La soya originaria de China, es una planta herbácea anual, de primavera-
verano, cuyo ciclo vegetativo oscila de tres a siete meses, su tallo es rígido y 
erecto, adquiere alturas variables, de 0.4 a 1.5 metros. Las hojas y las vainas son 
jóvenes, variando de color, de rubio a pardo más o menos grisáceo. 
 La semilla generalmente es esférica, del tamaño de un garbanzo y de color 
amarillo. Algunas variedades presentan una mancha negra que corresponde al hilo 
de la semilla. Su tamaño es mediano (100 semillas pesan de 5 a 40 gramos, aunque 
en las variedades comerciales oscila de 10 a 20 gramos). La semilla es rica en 
proteínas y en aceites. En algunas variedades mejoradas presenta alrededor del 40-
42% de proteína y del 20-22% en aceite, respecto a su peso seco. En la proteína de 
soya hay un buen balance de aminoácidos esenciales, destacando lisina y leucina. 
(infoagro, 2008) 
 Basándose en comprobacionescientíficas, el Organismo de EEUU para el 
Control de Alimentos y Medicamentos (Food and Drug Administration), ha resuelto 
ANTECEDENTES 
 
 37
permitir a las empresas de alimentos que contengan un mínimo de 6.25 gramos de 
proteína de soya por ración de consumo, que incluyan en el envoltorio del producto 
la siguiente alegación: "25 gramos de proteína de soya al día, incluida en una dieta 
baja en grasas saturadas y colesterol, pueden reducir el riesgo de sufrir trastornos 
cardiacos". (Smith y Circle, 1980) 
 A nivel mundial la producción de soya se encuentra principalmente localizada 
en EEUU y en el Sur de América. Resulta menor la participación de China quien es 
un activo importador. 
 Muchas investigaciones y estudios alrededor del mundo han aportado 
evidencia de los beneficios que brinda el consumo de la soya, debido a los 
componentes que la forman, ya que tienen un efecto positivo sobre el organismo; 
además la soya es una alternativa para dietas que presentan restricciones respecto 
a la grasa animal y en las cantidades adecuadas para vegetarianos. 
 
1.6.1. COMPOSICIÓN GENERAL DE LA SOYA 
La soya es una excelente fuente de proteínas de buena calidad, que puede 
compararse satisfactoriamente con otros alimentos proteínicos, superando incluso 
el aporte proteínico de las carnes. 100 gramos de soya = 38 gramos de proteína y 
100 gramos de carne de ternera = 20 gramos de proteína. 
En la soya se encuentran ocho aminoácidos esenciales para la nutrición humana 
como se muestra en el Cuadro 1-7. 
ANTECEDENTES 
 
 38
Cuadro 1-7. Composición de aminoácidos esenciales en la soya (aa mg/100g proteínas). 
Aminoácido Semilla entera Harina de soya 
Fenilalanina 87 88 
Isoleucina 35 51 
Leucina 79 77 
Lisina 62 68 
Metionina 21 16 
Treonina 41 43 
Triptófano NA 12 
Valina 37 54 
(Smith y Circle, 1980) 
 
 La soya es rica en grasas (18%), que en su mayor parte son ácidos grasos 
poliinsaturados y por su naturaleza no contiene colesterol. Destaca la presencia de 
dos ácidos grasos: linolénico (omega-3; la grasa característica del pescado azul) y 
linoleico (omega-6), ambos fundamentales y beneficiosos para la salud de vasos 
sanguíneos y corazón. Contiene además lecitina; un tipo de grasa que se emplea 
como complemento dietético, lubricante natural y aditivo emulsionante (E-322) en 
chocolates, repostería, margarinas, etc. 
 La soya tiene alrededor de un 15% de carbohidratos: sacarosa 4.5%, rafinosa 
1.1%, estaquiosa 3.7% y otros. Sin embargo, tan sólo un 2% es absorbido por el 
organismo humano. Por su bajo nivel de glucosa 0.005%, se sugiere que podría ser 
un alimento particularmente importante para diabéticos, obesos, para adelgazar o 
mantenimiento de peso. (Smith y Circle, 1980) 
 La soya es la fuente natural más rica en fibra. La cáscara se procesa y utiliza 
en pan, cereales y galletas integrales. Su elevado aporte de fibra contribuye a 
prevenir o aliviar el estreñimiento, a hacer más lento el paso de los azúcares hacia 
la sangre (positivo para la diabetes) y a reducir los niveles de colesterol, efecto que 
ANTECEDENTES 
 
 39
también comparten las grasas insaturadas que contiene la soya. 100 gramos de soya 
= 15 gramos de fibra. 
 En comparación con el resto de las leguminosas, aporta mayor cantidad de 
minerales como calcio, hierro, zinc, magnesio, potasio y fósforo, y cantidades 
apreciables de vitamina E, folatos y otras vitaminas del grupo B. Asimismo, cabe 
destacar la presencia de isoflavonas; antioxidantes de probados beneficios para la 
salud. 
 La porción seca (sólida) de la semilla proporciona una enorme cantidad de 
productos comestibles. Las harinas y sémolas de soya se utilizan en la industria 
repostera. Contribuyen a acondicionar y blanquear la masa. Sus excelentes 
cualidades para retener la humedad ayudan también a retardar la bajada de la 
masa. 
 
 Durante su procesado, la semilla de soya se limpia, se rompe y se 
descascarilla y se prensa en copos. Esto rompe las células para permitir una 
extracción eficiente del aceite. 
 Después de extraer el aceite de soya, el resto de los copos se puede procesar 
en una serie de productos de soya comestibles, o utilizarse para fabricar alimento 
proteínico para piensos animales. (ASA-IM, 2008) 
 
ANTECEDENTES 
 
 40
 1.6.2. LAS PROTEINAS COMO COMPONENTE PRINCIPAL 
Las proteínas son aproximadamente el 40% del peso seco de la soya. La mayor parte 
de la proteína de soya es clasificada como globulinas. El rango del tamaño 
molecular de las proteínas de soya ha sido demostrado por un patrón de 
centrifugado en el cual se han determinado cuatro fracciones principales. Las 
fracciones se han designado 2s, 7s, 11s, y 15s basadas en sus respectivos tiempos de 
sedimentación. El análisis de las cuatro fracciones ha demostrado que las fracciones 
2s y 7s son heterogéneas, pero las fracciones 11s y 15s son proteínas puras. 
 La fracción 2s que constituye el 20% del total de la proteína, contiene los 
inhibidores de tripsina, citocromo-c, y otras proteínas no identificadas. La fracción 
7s siendo un tercio de las proteínas, incluye cuatro hemaglutinas, cuatro 
lipoxigenasas, beta-amilasa y globulina 7s. La globulina 7s es una glucoproteína y es 
aproximadamente el 50% de la fracción 7s. La fracción 11s cuenta como un tercio 
adicional de la proteína de soya y es considerada como una fracción pura. La 
proteína 11s ha sido designada como glicina. (Wijeratne, 2005) 
 La mayor porción de proteína de soya puede ser extraída con agua. Si no se 
le añade ácido o base al agua para la extracción, el pH será usualmente entre 6.4-
6.6, y en este intervalo de pH, aproximadamente el 85% de la proteína de soya es 
extraída. La adición de álcali incrementa adicionalmente la solubilidad en un 5 o 
10%. Sin embargo, la ventaja de incrementar la solubilidad disminuye abruptamente 
y alcanza su mínimo a un pH de 4.2-4.6, la cual es la región isoeléctrica para la 
proteína de soya. En el momento en que hay una mayor reducción del pH, el 
precipitado de la proteína se solubiliza. Estos patrones de solubilidad forman la 
base para la preparación de los productos de proteína de soya, tales como los 
ANTECEDENTES 
 
 41
concentrados y aislados. Tanto las globulinas 7s como las 11s, en extractos acuosos 
de pasta de soya desengrasada, ocurren como una unión de polímeros disulfuros. La 
polimerización más profunda ocurre durante la precipitación isoeléctrica de los 
aislados, resultando en la insolubilidad de la proteína isoeléctrica. El incremento de 
la solubilidad es alcanzado por la neutralización de la proteína isoeléctrica antes 
del secado, para producir los llamados proteinatos. (Chun Liu et al, 2007) 
 Las variables de proceso, como pH, fuerza iónica y temperatura utilizada en 
las preparaciones de productos de proteína de soya tienen un efecto profundo en 
las estructuras terciarias y cuaternarias de las globulinas de la soya y por lo tanto, 
afecta las propiedades funcionales. 
 
 1.6.3. PROPIEDADES FUNCIONALES DE LA SOYA 
Es relativamente sencillo fabricar un alimento que contenga proteínas, 
carbohidratos, lípidos, vitaminas, minerales, etc., esto puede hacerse combinando 
todos los constituyentes en las concentraciones adecuadas; el mayor problema en 
estos desarrollos es elaborar el producto con características adecuadas de textura, 
sabor, apariencia y aroma. Al mezclar los componentes es preciso considerar que el 
alimento debe cumplir ciertas condiciones que sean atractivas para el consumidor y 
que despierten su interés; además de presentar algunas características que 
permitan procesarlo o prepararlo con un mínimo de problemas. Por esto, es 
necesario tener mucho cuidado al seleccionar una proteína, ya que ésta tiene que 
presentar ciertas propiedades funcionales que la hagan adecuada para el alimento 
deseado. 
ANTECEDENTES 
 
 42
 Existen muchos trabajos de investigación que muestran dichas propiedadesen las proteínas de la soya; sin embargo, generalmente se emplean estos polímeros 
en sistemas modelo y no en un alimento complejo en el que no se tiene un control 
total de todas las variables. Por esta razón, para determinar la funcionalidad de una 
proteína, es mejor utilizarla en el alimento directamente y observar su 
comportamiento; esto provoca interacciones con los otros constituyentes, tales 
como lípidos, carbohidratos, otras proteínas, etc. En el Cuadro 1-8, se encuentran 
ejemplos claros de las propiedades funcionales de las proteínas de la soya: como 
harina, concentrado y aislado, que son los productos más utilizados en la industria 
alimentaria. 
Cuadro 1-8. Propiedades funcionales de las proteínas de la soya en algunos sistemas de 
alimentos. 
PROPIEDAD FUNCIONAL FORMA DE LA PROTEÍNA SISTEMA UTILIZADO 
Emulsificación 
 Formación H, C, A Salchichas, embutidos, salami, panes, 
pasteles y sopas 
 Estabilización H, C, A Productos batidos como crema, chantilly, 
postres congelados, embutidos en general 
Absorción de grasa 
 Promoción H, C, A Salchichas, embutidos y hamburguesas 
 Prevención H, A Donas y bolillos 
Absorción de agua 
 Absorción H, C Pasteles, panes y pastas 
 Retención H, C Pan y pasteles 
Textura 
 Viscosidad H, C, A Sopas y salsas 
 Gelificación A Sustitutos de carne molida 
Formación de fibras A Sustitutos de carne 
Formación de masas H, C, A Productos de panificación 
Formación de películas A Salchichas y salami 
Adhesión C, A Embutidos, carnes frías y productos 
cárnicos 
Cohesión H, A Productos horneados, macarrones, y 
sustitutos de carne 
Elasticidad A Productos horneados y sustitutos de carne 
Control del color 
 Blanqueado H Pan 
 Oscurecimiento H Pan y derivados 
Aeración A Productos batidos y confituras 
 H= harina; C= concentrado; A= aislado. (Smith y Circle, 1980) 
 
ANTECEDENTES 
 
 43
 El mayor potencial de la proteína de soya está en el área del mejoramiento 
nutricional de los alimentos. Las proteínas animales son escasas y caras, la 
creciente población del mundo requiere satisfacer sus demandas de proteína por lo 
que un producto alterno es la única respuesta. La proteína de soya satisface esta 
exigencia. 
 Mientras tanto, las proteínas que contiene la soya están encontrando nuevos 
usos en combinación con proteínas animales para proporcionar diversas ventajas 
que ni la proteína animal ni la proteína vegetal pueden proporcionar por sí solas. 
 Como ingredientes funcionales en productos alimenticios, las proteínas de 
soya actúan como retenedores de humedad, agentes estabilizantes y aglutinantes. 
Disminuyen el efecto de reducción en el tamaño de las tortitas de carne durante la 
cocción. Otros productos pueden incrementar el contenido proteínico para una 
mejor nutrición. Actúan como agentes espesantes o gelatinizantes añadiendo 
consistencia a muchos productos alimenticios. (Wijeratne, 2005) 
 Las proteínas de soya también aumentan la vida de anaquel de los productos 
que la contienen, mejoran su apariencia, limitan la absorción de grasa en productos 
fritos, ayudan a controlar la textura y la viscosidad. Con las proteínas de soya se 
producen alimentos de alta calidad reduciendo los costos de procesamiento. 
 
 
OBJETIVOS 
 44
OBJETIVO GENERAL 
 PROPONER UN PROTOCOLO QUE LE PERMITA AL ESTUDIANTE ADQUIRIR 
CONOCIMIENTO SOBRE LAS PROPIEDADES QUÍMICAS Y FUNCIONALES DE LAS 
PROTEÍNAS. 
 
 OBJETIVOS PARTICULARES 
A) Conocer diferentes fuentes de nitrógeno para obtener el contenido de 
proteína verdadera en la harina de soya desengrasada. 
B) Aprender diversos métodos analíticos en la cuantificación de proteínas en 
solución, utilizando fuentes de proteínas conocidas para estimar el peso 
molecular y la cantidad de aminoácidos aromáticos presentes en la 
muestra. 
C) Determinar las propiedades funcionales de las proteínas de la harina de 
soya desengrasada (solubilidad, capacidad de retención de agua y de 
aceite, humectabilidad, capacidad de espumado, capacidad de 
emulsificación y capacidad de gelificación), relacionadas con sus 
propiedades fisicoquímicas. 
METODOLOGÍA 
 45
2. METODOLOGÍA 
2.1. A continuación se muestra el diagrama general de la experimentación a seguir.
 
 
 
 
Pre-tratamiento de la muestra: 
 Homogeneización y extracción de la grasa. 
 AOAC 920.39C, 2000. 
 
Harina de soya 
desengrasada 
 Análisis composicional. 
 Balance de nitrógeno proteínico. 
Extracción de fracciones 
proteínicas por solubilidad. 
(Osborne y Mendel, 1914) 
HARINA DE SOYA 
COMERCIAL
METODOLOGÍA 
 46
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cuantificación y caracterización de 
proteínas en cada fracción 
 Métodos empleados: 
 Kjeldahl (AOAC 920.87, 2000) 
 Biuret (Nielsen, 2003) 
 Absorción UV (Nielsen, 2003) 
 Cromatografía de Exclusión 
Molecular (Harris, 2001) 
Fracciones mayoritarias 
Determinación de 
propiedades funcionales 
Capacidad de retención de 
agua y aceite 
(Robertson et al, 2000) 
Humectabilidad 
(Díaz y Maldonado, 2000) 
Capacidad de gelificación 
(Avanza y Añón, 2001) 
Capacidad de emulsificación 
(Fennema, 1993) 
Capacidad de espumado 
(Ahmedna et al, 1999) 
METODOLOGÍA 
 47
2.2. PROCEDIMIENTO 
 
 
 2.2.1. Pre-tratamiento de la muestra 
Se utilizó harina de soya comercial Nutri-marel´s, envasado por: Productos Realeza 
S. de R. L. de C. V. Contenido neto: 500g. 
� Homogeneización de la muestra 
La muestra se molió en una pequeña licuadora, y se pasó por la malla Nº. 40. 
� Extracción de la grasa 
La harina de soya se desengrasó una vez por el método de Soxhlet de acuerdo a la 
técnica de la AOAC 920.39C, 2000. Se usó como disolvente éter etílico durante 6 
horas de extracción; después la harina se dejó a temperatura ambiente para 
evaporar el exceso de disolvente, por aproximadamente 24 horas. 
 
 2.2.2. Análisis composicional 
Para caracterizar la harina de soya desengrasada se llevaron a cabo las siguientes 
determinaciones por triplicado: 
 Humedad: Secado en estufa al vacío (AOAC 925.09, 2000). 
 Cenizas: Método en seco, a 550ºC (AOAC 923.03, 2000). 
 Grasa cruda: Método de Soxhlet, con éter etílico (AOAC 920.39C, 2000). 
 Proteína: Método de Kjeldahl. FC= 5.71 (AOAC 920.87, 2000). 
 Carbohidratos totales: Por diferencia. 
METODOLOGÍA 
 48
 2.2.3. Determinación del contenido de nitrógeno no proteínico 
Con el propósito de determinar el contenido de nitrógeno no proteínico en la harina 
de soya desengrasada, ésta se mezcló con patrones de referencia, es decir con una 
fuente de nitrógeno no proteínica y una proteínica. 
Se determinó el contenido de nitrógeno por el método de Kjeldahl (AOAC 920.87, 
2000) utilizando las siguientes muestras: 
 la harina de soya desengrasada, 
 la harina de soya desengrasada adicionada con urea (NH2CONH2), (1:1) y, 
 la harina de soya desengrasada adicionada con caseína, (1:1). 
Se solubilizaron cada una de las muestras, colocando 1-5 g en 25 mL de ácido 
tricloroacético al 15%, se agitaron por una hora a temperatura ambiente, y se 
centrifugaron a 4 000 rpm, en una centrifuga DAMON/IEC DIVISION 22CT323 para 
recuperar el precipitado, se secó en estufa de vacío a 50ºC y se almacenó en un 
desecador. Se registró el peso del precipitado seco. 
(Jacques y Pierre, 2000) 
Se determinó el contenido de nitrógeno de cada uno de los precipitados secos, 
utilizando el método de Kjeldahl. 
 
2.2.4. Extracción de proteínas (Osborne y Mendel, 1914) 
La extracción se realizó mediante el proceso continuo de Osborne y Mendel, el cual 
se basa en las diferencias de solubilidad separando las fracciones proteínicas: 
� Albúminas 
Se pesaron 100 g de la harina desengrasada en un vaso de precipitados de 1000 mL, 
se agitó con 250 mL de agua destilada por una hora en refrigeración (≈ 4°C), se 
METODOLOGÍA 
 49
centrifugó a 10 000 rpm por 20 min. Serecolectó el sobrenadante y se lavó con 200 
mL de agua siguiendo el mismo procedimiento. Se unieron los sobrenadantes y se 
dializaron (membrana de celulosa de 33 mm de diámetro, SIGMA-ALDRICH D9652-
100RFT con 15 cm de largo) contra agua por 24 hrs. Se cambió tres veces el agua, 
por último las proteínas se liofilizaron. 
� Globulinas 
Al residuo anterior se le agregó 250 mL de solución salina (NaCl 0.5 M) y se agitó por 
una hora en refrigeración, se centrifugó a 10,000 rpm por 20 min, se separó el 
sobrenadante y se lavó con 200 mL de solución salina siguiendo el mismo 
procedimiento. Se unieron los sobrenadantes y se dializaron contra agua, 
finalmente las proteínas se liofilizaron. 
 
Las siguientes extracciones se realizaron para corroborar que son escasas en la 
muestra. 
� Prolaminas 
Se le agregó 100 mL de solución alcohólica (etanol al 70%- acetato de sodio 0.5%) al 
residuo anterior, se agitó por una hora en refrigeración. Se centrifugó a 10,000 rpm 
por 20 min, y se colectó el sobrenadante y se lavó con 100 mL de solución 
alcohólica 2 veces más siguiendo el mismo procedimiento. Se unieron los 
sobrenadantes y se dializaron contra agua por 24 hrs. Se cambió tres veces el agua, 
finalmente las proteínas se liofilizaron. 
� Glutelinas 
Al residuo anterior se le agregó solución de etanol al 70%- acetato de sodio 0.5%- 
mercaptoetanol 0.1 M y se agitó por una hora en refrigeración. Se separó el 
sobrenadante y se lavó el residuo 2 veces más con 100 mL de la solución anterior 
METODOLOGÍA 
 50
preparada. Se juntaron los sobrenadantes, se dializaron contra agua y se 
liofilizaron. 
 
Para la liofilización, las muestras se congelaron a -40ºC y se secaron en una 
liofilizadora LABCONCO FREEZE 1823274 la cual elimina el agua presente en la 
solución proteínica por medio de sublimación utilizando alto vacío que proporciona 
una bomba. Este proceso permite concentrar los componentes existentes en la 
muestra. 
 
2.2.5. Determinación y cuantificación de proteína en diferentes ingredientes 
y en las fracciones solubles 
El objetivo de cuantificar el contenido de proteína en diferentes ingredientes 
proteínicos, por diversos métodos es comprobar si existe relación en su 
concentración, para así estimar el peso molecular por el método de Biuret y la 
cantidad de aminoácidos aromáticos por el método de Absorción UV en las 
fracciones solubles de la muestra. 
Se determinó el contenido de proteína de los siguientes ingredientes proteínicos 
utilizando los métodos Kjeldahl, Biuret y Absorción UV: 
 Tirosina (SIGMA CHEMICAL CO), 
 Extracto de levadura (HIGH PURITY) y, 
 Albúmina de huevo (HIGH PURITY). 
Se realizaron los cálculos de concentración de proteínas solubles utilizando como 
proteína patrón Albúmina Sérica Bovina (ASB, ALBUMIN FRAKTION V, MERCK). 
METODOLOGÍA 
 51
Considerando que el contenido de nitrógeno representa la pureza de las 
preparaciones, se expresó el contenido de proteínas obtenido por el método de 
Biuret y Absorción UV por gramo de Nitrógeno (g proteína/g N) para cada proteína 
patrón, se graficó la cantidad de g proteína/g N en función del PM y en función del 
contenido de aminoácidos aromáticos respectivamente para cada ingrediente 
proteínico. 
Se determinó el contenido de proteína de las fracciones solubles extraídas de la 
muestra, y haciendo uso de las proteínas de referencia se estimaron: el peso 
molecular y la cantidad de aminoácidos aromáticos de las fracciones proteínicas de 
la harina de soya desengrasada. 
2.2.5.1. Determinación de Nitrógeno total (proteína cruda) 
 Método de Kjeldahl (AOAC 920.87, 2000). 
 DIGESTIÓN: Se realizó en parrilla (bloque de calentamiento) usando cobre como 
catalizador y unidad de destilación con vapor. EQUIPO BÜCHI 
 Se pesó de 0.1-0.2 g de muestra, se agregó aproximadamente 0.15 g de sulfato 
de cobre pentahidratado, con 2.5 g de sulfato de potasio o sulfato de sodio y 5 
mL de ácido sulfúrico concentrado en un tubo de Kjeldahl. 
 Se encendió el aparato y se precalentó a la temperatura de 360°C. Se colocaron 
los tubos en el portatubos del equipo Kjeldahl y se colocaron en el bloque de 
calentamiento. Se pusó la unidad de evacuación de gases con las juntas 
colocadas sobre los tubos de digestión. Se accionó la trampa de succión de gases 
antes de que se produjeran estos. Se calentó hasta la total destrucción o 
METODOLOGÍA 
 52
digestión de la materia orgánica, es decir hasta que el líquido quedó 
transparente, con una coloración azul verdosa. 
 Una vez finalizada la digestión, sin retirar la unidad de evacuación de gases, se 
sacó el portatubos de la parrilla para enfriar. 
 Después del enfriamiento, y terminada la digestión se apagó el equipo. 
 En un matraz Erlenmeyer de 250 mL se adicionaron 50 mL de ácido bórico 4% con 
indicadores (fenolftaleína 0.035 mg%, rojo de metilo 6.6 mg%, verde de 
bromocresol 3.3 mg%). 
 DESTILACIÓN: Se conectó el aparato de destilación TECATOR (EQUIPO KJELTEC 
SYSTEM 1002 DISTILLING UNIT) y se esperó unos instantes para que se generará 
vapor. Se colocó el tubo de digestión con la muestra diluida y las sales disueltas 
en un volumen no mayor de 10 mL de agua destilada, en el aparato de 
destilación cuidando de introducir la alargadera hasta el fondo de la solución. Se 
jaló la palanca para adicionar sosa al 36% (hasta 40 mL aproximadamente). Se 
colocó la palanca de vapor en posición “ON” hasta alcanzar un volumen de 
destilado en el matraz Erlenmeyer de 100-150 mL, se lavó la alargadera con 
agua destilada, se recogió el agua de lavado sobre el destilado. Una vez 
finalizada la destilación, se regresó la palanca de vapor a la posición original. 
 TITULACIÓN: Se tituló el borato de amonio con una solución de HCl 0.1N. Se 
calculó el % de Proteína considerando el Factor de conversión señalado. 
METODOLOGÍA 
 53
2.2.5.2. Método de Biuret (Nielsen, 2003) 
Se colocó 1 mL de la solución de proteína adecuadamente diluida en tubos de 
ensaye perfectamente etiquetados y se adicionaron 4 mL del reactivo de Biuret 
(Sulfato de cobre 0.15 %, tartrato de sodio y potasio 0.6 % y NaOH 0.3 %). 
Se mezcló y se dejó en reposo 30 min. a temperatura ambiente. 
Se determinó la absorbancia del color violeta producido a 540 nm en el 
espectrofotómetro PERKIN ELMER LAMBDA 25 UV/Vis 2221329 contra un blanco 
preparado de la misma manera con 1 mL de la solución en que se encontraba 
diluida la muestra. 
La concentración de proteína se obtuvó por referencia a una curva de calibración 
preparada con albúmina sérica bovina con concentraciones de 1 a 10 mg/mL. 
 
2.2.5.3. Absorción en el ultravioleta (280 nm) (Nielsen, 2003) 
Se colocó la solución problema debidamente diluida en una celda de cuarzo del 
espectrofotómetro PERKIN ELMER LAMBDA 25 UV/Vis 2221329, de 1 cm de paso, y se 
determinó la absorbancia a 280 nm, usando como blanco la solución en que se 
encuentra preparada la muestra. La absorbancia debe ser proporcional a la 
concentración de proteína se obtuvó por referencia a una curva de calibración 
preparada con albúmina sérica bovina en concentraciones de 50 a 500 μg/mL. 
 
METODOLOGÍA 
 54
2.2.5.4. Cromatografía de Exclusión Molecular (Harris, 2001) 
Este método se realizó para corroborar los datos obtenidos por el método de Biuret, 
de los pesos moleculares de las proteínas de la muestra. 
Se determinó por medio de HPLC. Las condiciones fueron las siguientes: 
 Cromatógrafo: BECKMAN 110 A 
 Detector: UV WATERS 2487 DUAL λ ABSORBANCE 280 nm 
 Columna o Fase estacionaria: Biosep- SEC-S2000 
 Fase móvil: Buffer de fosfatos 0.1 M pH= 6.8 
 Flujo: 0.5 mL/ min 
 Loop: 20 µL 
Se encendió el equipo, se lavó la columna con agua destilada, se estabilizó con 
buffer de fosfatos y después de un tiempo se inyectó la mezcla de los marcadores 
estándar BIO RAD que se describen en el Cuadro 2-1, para conocer el tiempo de 
retención y realizar la curva estándar.