Caracterizacion-molecular-de-nuevas-proteinas-antigenicas-de-Leishmania-major-seleccionadas-por-bioinformatica

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE 
MÉXICO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TÉSIS: 
 
Caracterización Molecular de Nuevas Proteínas 
Antigénicas de Leishmania major Seleccionadas por 
Bioinformática. 
 
 
 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: QUÍMICA FARMACEÚTICA 
BIÓLOGA. 
 
 
 
PRESENTA: LAGUNA DEL CARMEN CADENA CARRIÓN 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MÉXICO, D.F. 2008 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
Agradecimientos 
 
 
 
A la M. en C. Alicia B. Cervantes Peredo por sus sugerencias para el 
termino de éste trabajo. 
A la M. en C. Roxana Isela Noriega Navarro por la ayuda que recibí en 
algún momento para mejorar ésta tesis. 
A todas las personas que me apoyaron y entusiasmaron para seguir en 
este trabajo hasta el final. 
 
 
 
Gracias al jurado conformado por: 
 
 
 
Presidente Abel Gutiérrez Ramos 
Vocal Alicia Beatriz Cervantes Peredo 
Secretario José Alejandro Padilla Trejo 
1er Suplente Norma Angélica Castellanos Chávez 
 
2do Suplente José Ignacio Páramo Ramírez 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DEDICATORIAS 
 
 
A mi mamá por su gran paciencia, sus oraciones y sus buenos deseos en 
todos estos años. Gracias mamá porque de ti me proviene la vida. 
 
 
A Orlando, porque ha sido hermano y amigo. 
 
 
A mis compañeras del grupo de danza ZARAH, Vero, Terpsicore, Mayra, 
María Paulina, Atzin y Natalia, que siempre me han motivado para 
continuar. 
 
 
A todos los compañeros que convivieron conmigo en la Facultad, y a los 
que todavía aún conservo su amistad. 
 
 
A Oscar Tejeda por escucharme y leerme pacientemente, gracias por tu 
apoyo y compañía. 
 
 
ÍNDICE 
 ABREVIATURAS 
 
1 
 RESUMEN 
 
3 
1 INTRODUCCIÓN 
 
5 
1.2 Variedades de Leishmaniasis 5 
1.3 Epidemiología 8 
1.4 Características del parásito 12 
1.4.1 Ciclo de vida 13 
1.4.2 Vacuola parasitófora 14 
1.4.3 Transmisor o vector 15 
1.4.4 Efecto de la saliva de la mosca 16 
1.5 Respuesta inmune 16 
1.5.1 Respuesta inmune en ratón 19 
1.6 Proteínas de superficie 20 
1.7 Desarrollo de vacunas 
 
22 
2 JUSTIFICACIÓN 
 
24 
3 HIPÓTESIS 
 
24 
4 OBJETIVOS 
 
26 
4.1.1 Objetivo general 26 
4.1.2 Objetivos particulares 
 
26 
5 MATERIALES Y MÉTODOS 
 
27 
5.1 Análisis bioinformático 28 
5.2 Extracción de ADN genómico (ADNg) de L. major. 29 
5.3 Amplificación del ADNc con oligonucleótidos 
 específicos 
30 
5.4 Ligación 31 
5.5 Transformación y tamizaje de colonias 32 
5.6 Purificación del plásmido (mini-prep) 34 
5.7 Secuenciación del fragmento clonado 34 
5.8 Subclonación en un vector de expresión 35 
5.9 Transformación en una célula de expresión 36 
5.10 Obtención y purificación de la proteína 37 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 RESULTADOS 
 
39 
6.1 Análisis Bioinformático 39 
6.2 Extracción de ADN genómico (ADNg) 40 
6.3 Oligonucleótidos utilizados 41 
6.4 Amplificación del ADNc con oligonucleótidos 
específicos 
41 
6.5 Identificación de clonas con fragmentos amplificados 
por PCR 
42 
 
6.6 Secuenciación del fragmento clonado 44 
6.7 Subclonación de G1-5 46 
 
7 DISCUSIÓN 
 
51 
8 CONCLUSIONES 
 
56 
9 REFERENCIAS 
 
57 
10 ANEXO 
 
62 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
Figura 1 Leishmaniasis Visceral 
Página 
6 
Figura 2 Úlcera de Leishmaniasis Cutánea 6 
Figura 3 Leishmaniasis Cutánea Diseminada 7 
Figura 4 Leishmaniasis Mucocutánea 8 
Figura 5 Distribución mundial de la Leishmanisis 9 
Figura 6 Distribución geográfica en México 11 
Figura 7 Casos de Leishmaniasis de 1990 al 2005 11 
Figura 8 Promastigote 12 
Figura 9 Amastigote 13 
Figura 10 Ciclo de vida 14 
Figura 11 Phlebotomus 15 
Figura 12 Macrófago infectado de amastigote 18 
Figura 13 Gráfica de hidrofobicidad Saf1 28 
Figura 14 Gráfica de hidrofibicidad G1-5 29 
Figura 15 Vector pcRII-TOPO 32 
Figura 16 Transformación y tamizaje 33 
Figura 17 Vector pQE16 36 
Figura 18 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos Saf1 
de L.major. 
36 
Figura 19 Secuencia de nucleótidos y aminoácidos G1-5 
de L.major. 
40 
Figura 20 Secuencia de oligonucleótidos empleados para 
PCR 
41 
Figura 21 Fragmentos obtenidos del PCR de Saf1 42 
Figura 22 Fragmentos obtenidos del PCR de G1-5 42 
Figura 23 Electroforesis de las clonas de Saf1 
amplificadas por PCR 
43 
Figura 24 Electroforesis de las clonas de G1-5 
amplificadas por PCR 
44 
Figura 25 Secuencia de Saf1 45 
Figura 26 Secuencia de G1-5 45 
Figura 27 Digestión del vector pcRII-TOPO Saf1 46 
Figura 28 Digestión del vector pcRII-TOPO G1-5 46 
Figura 29 Electroforesis en gel de poliacrilamida 47 
Figura 30 Digestión de las clonas con BamH1 y BglII 49 
Figura 31 Digestión con BamH1 y BglII (2) 50 
Figura 32 Digestión de las clonas G1-5 y el vector pQE16 50 
 
 
 
1 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
aa Aminoácidos 
ADN Ácido desoxirribonucleico 
ADNg Ácido desoxirribonucleico genómico 
ADNp Ácido desoxirribonucleico plasmídico 
Cat. Catálogo 
CD4+,CD8+ Linfocitos T colaboradores 
C3 Molécula precursora de la vía clasica 
del complemento 
CR1,CR3 Receptores del MHC 
°C Grados centígrados 
dATP 2’-Deoxiadenosina 5’-trifosfato 
dCTP 2’-Deoxicitidina 5’-trifosfato 
ddNTP 2´,3´Dideoxinucleótido 
dGTP 2’-Deoxiguanosina 5’-trifosfato 
DHFR Dihidrofolato reductasa 
dNTP Dinucleótido trifosfato 
dTTP 2’-Deoxitimidina 5’-trifosfato 
g gramos 
hr hora 
HAT Tripanosomiasis africana humana 
HLA Antígenos leucocitarios humanos 
IFN-γ Interferón gama o inmune 
IL Interleucina 
IPTG Isopropil-β-D-tiogalactósido 
kb Kilobase 
kD Kilo Dalton 
LB Luria –Bertani 
LC Leishmaniasis cutánea 
LCM Leishmaniasis mucocutánea 
LPG Lipofosfoglicano 
LV Leishmaniasis visceral 
M Molar 
mg miligramo 
MHC Complejo Mayor de 
Histocompatibilidad 
min minuto 
ml mililitro 
mM milimolar 
μg microgramo 
μl microlitro 
2 
 
NCBI National Center Biotechnology 
Information 
No. Número 
NO Óxido nítrico 
pb pares de bases 
PCR Reacción en cadena de la 
Polimerasa 
PM marcador de peso molecular 
 
PKDL Leishmaniasis Post Kala-azar 
p38MAPK cinasa 
rpm revoluciones por minuto 
RT Transcriptasa reversa 
s segundo 
SDS Dodecil sulfato de sodio 
TB7-1 Moléculas coestimuladores de 
linfocitos T 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
 
RESUMEN. 
 
 Leishmania major es un protozoario de la familia Tripanosomatidae, 
este protozoario es un parásito intracelular que provoca una de las 
Leishmaniasis, la cutánea. La Leishmaniasis en nuestro país afecta a más 
de 16 estados y los más afectados son los del sureste del país, también se 
encuentra distribuida en Medio Oriente, Sur de Europa, Centro y Norte de 
África, así como en algunos países de América Latina. Hasta la fecha no se 
ha encontrado un medicamento eficiente que no tenga efectos secundarios 
severos o vacuna alguna para el control de esta enfermedad. 
 
 
 Este trabajo es parte de una investigación en la que se pretende 
analizar la totalidad de los genes y proteínas disponibles en el proyecto del 
genoma de L. major, con la finalidad de identificar proteínas altamente 
antigénicaspara utilizarlos como nuevos blancos en el desarrollo de 
vacunas que protejan contra la infección de este parásito. Primero se 
analizaron algunas de las secuencias del genoma de L. major y el uso de 
técnicas bioinformáticas se seleccionaron genes que codificaron para 
proteínas membranales o secretoras altamente antigénicas que no han 
sido estudiadas y que además contienen epítopes para células T. A las 
secuencias también se les realizó un perfil de hidrofobicidad para estudiar 
la ubicación de la región del antígeno y su accesibilidad para interaccionar 
con las células T. Posteriormente se extrajo el ADNg de L. major a partir de 
parásitos de un ratón infectado, el cual se tomó como templado para 
amplificar las secuencias de Saf1 y G1-5 utilizando la técnica de PCR, 
seguido de este paso se clonaron los productos empleando el plásmido 
pcRII-TOPO, transformando células químicamente competentes: DH5α-T1. 
A las colonias positivas se les extrajo el plásmido y se secuenciaron los 
fragmentos clonados. Una vez que se verificaron íntegramente las 
secuencias, se llevó a cabo la elaboración de las construcciones genéticas 
4 
 
para producir las proteínas recombinantes para lo cual se clonaron en los 
vector es pQE16, pQE60 y pQE70 y se transformaron para su expresión de 
E. coli cepa M15. Desafortunadamente la secuencia de ADN que codifica 
para G1-5, presenta un comportamiento extraño dificultando la producción 
de la proteína recombinante en el sistema empleado, la dificultad para 
producir la proteína recombinante pudiera explicarse por la formación de 
estructuras secundarias de este gene. 
 
5 
 
 
1 INTRODUCCIÓN. 
 
 La Leishmaniasis es una parasitósis intracelular del ser humano, esta 
enfermdad se encuentra distribuida en muchas regiones tropicales y subtropicales. 
Hay 21 especies y subespecies de Leishmania que han sido aisladas de humanos 
infectados. Estas especies son responsables de un amplio espectro de 
enfermedades de síntomas clínicos que van desde simples úlceras cutáneas hasta 
formas fatales de Leishmaniasis diseminada y visceral con efectos sobre los datos 
de morbilidad, sin embargo otras subespecies no son mortales (Bensoussan E. y 
cols, 2006). 
 
La Leishmania, pertenece a la familia Tripanosomatidae y es trasmitida por 
la mosca Phlebotomus en el Viejo Mundo y Lutzomya en el Nuevo Mundo. Como 
otras enfermedades tropicales, la Leishmaniasis se relaciona con los cambios 
ambientales y el desarrollo económico, lo que deriva en una mayor exposición a la 
mosca de la arena (St. George S y cols, 2006). Además la coinfección 
Leishmania-VIH ha surgido como un binomio en países como: India, Bangladesh, 
Nepal, Etiopia, Sudán, Brasil, aumentando la aparición de nuevos y convirtiendose 
en una enfermedad emergente mientras que en España, Italia, Francia y Portugal 
ha sido controlada (Cruz, I. y cols, 2006). 
 
 
1.2 Variedades de Leishmaniasis. 
 
Existen cuatro importantes variedades de Leishmaniasis, 1) Leishmaniasis 
Visceral (LV, Figura.1), también llamada Kala-azar o fiebre Dumdum. Es 
provocada principalmente por L. donovani en el Viejo Mundo, en algunas 
ocasiones por L. tropica, L. infantum en la región Mediterránea y por L. chagasi en 
el Nuevo Mundo. La picadura es pequeña e inaparente, los síntomas que se 
presentan son: dos picos diarios de fiebre en el 10 % de los pacientes, 
6 
 
hepatoesplenomegalia, pancitopenia, hipergammaglobulinemia policlonal (Manual 
Merck, 1999). 
 
 
Fig 1. Leishmaniasis visceral, causada principalmente por L.donovani y L.chagasi, ésta 
infección tiende a invadir organos internos. 
(www.atlas.or.kr/.../DSCN05021023756671.jpg) 
 
 
2) La Leishmaniasis Cutánea (LC. Figura 2), conocida con otros nombres 
como: botón de oriente, bulla, aleppo o Delhi, uta, úlcera de los chicleros, es la 
forma comunmente causada por L. major y L. tropica en el Viejo Mundo, por L. 
mexicana, L. braziliensis y L. panamensis en el Nuevo Mundo. Las 
manifestaciones clínicas son; en 1 a 4 semanas aparece una lesión cutánea bien 
demarcada, la cual es una pápula que se úlcera en el centro y muchas veces 
desarrolla un centro elevado hiperpigmentado, es indolora (Manual Merck, 1999). 
 
 
 
Fig 2. Úlcera característica de Leishmaniasis cutánea localizada, causada por L.major y L. 
mexicana. Modificado de Sánchez, S. L, y cols, 2004 
 
 
 
7 
 
3) La Leishmaniasis Cutánea Difusa (LCD. Figura. 3), es causada por L. 
aethiopica (Viejo Mundo), y el complejo de especies L. mexicana en América 
Latina (Herwaldt B.L.1999), representa la forma virulenta de la enfermedad, es 
crónica y progresiva. Sus manifestaciones son lesiones en la piel de tipo no 
ulcerativo diseminado, en las cuales, el parásito se difunde asociado a una severa 
anergia de células específicas. Se ha observado en pacientes del Estado de 
Tabasco, que presentan una propagación lenta en la linfa y los nódulos linfáticos, 
de una manera similar a la Leishmaniasis esporotricoide, los pacientes presentan 
una anergia específica y una respuesta muy pobre al tratamiento antimonial 
(Berzunza, C., y cols, 2000). 
 
Fig. 3 Leishmaniasis cutánea diseminada al cuello, causada por L.major, nótese 5 
lesiones papulares y nodulares en el cuello. Modificado de Murray, H.W., 2005. 
 
 
4) La Leishmaniasis Mucocutánea (LMC. Figura.4) o espundia, es 
principalmente causada por L .viannia braziliensis, la enfermedad comienza con 
una úlcera cutánea primaria en el sitio de la picadura de la mosca (2 a 3 meses), y 
en las etapas tempranas no se puede diferenciar clínicamente de modalidades 
cutáneas mas benignas de la enfermedad LC, puede hacer metástasis en la 
mucosa de nasofaringe y se desarrolla deformando la nariz y el paladar (Handman 
E, 2001). 
 
8 
 
 
Fig. 4 Leishmaniasis mucocutánea, el paciente muestra, la naríz y parte del labio 
superior dañado.Modificado 
de:http://www.colegiosaofrancisco.com.br/alfa/leishmania/leishmaniose.php/ 
 
Existe otro tipo de enfermedad denominado Leishmaniasis Post-Kala azar 
Dérmica (PKDL), es relativamente común, surge como consecuencia de la cura 
terapéutica de la LV, causada por L. donovani. Es una enfermedad variable 
comienza con la propagación de despigmentación progresiva de la piel o pápulas 
discretas en la superficie expuesta a la luz; puede progresar y producir una 
superficie extensa de nódulos discretos alargados que puede parecerse a la 
Leishmaniasis Cutánea diseminada o lepra lepromatosa (Bates, P.A., y Ashford, 
R.W., 2005). 
 
 
 
1.3 Epidemiología. 
 
La Leishmaniasis es una parasitósis ampliamente distribuida en el mundo 
(Figura 5 y Anexo1), se puede encontrar en África Ecuatorial, Occidental y Norte, 
en Asia: Rusia Indostaní y Medio Oriente. 
 
La Leishmania major se encuentra distribuida en el Viejo Mundo, a lo largo 
del norte y sur de la franja del Sahara, extendiéndose hasta el Norte de Kenya, 
atravesando Arabia, sur de Irak, sur de Irán, en los estados de Asia Central: 
Turkmenistán, Uzbekistán, Norte de Afganistán y también en la cordillera que 
atraviesa Baal chistan Paquistaní y en el borde de Rajasthan (India). En estos 
9 
 
países, los parásitos son de zonas áridas y semiáridas, la distribución es 
determinada por los vectores y los hospederos mamíferos (roedores 
principalmente: Rhombomys opimus, Psammomys obesus). 
 
 
Fig. 5. Distribución mundial de las zonas más afectadas por los tres tipos de 
Leishmaniasis. Modificado de http://www.edu.au/.../handman/leishmaniasis.htlm 
 
 
 En África, la infección se encuentra a lo largo de Sudán, Etiopía y Kenia, 
principalmente en los bosques poblados por Acacia seyal. 
 
La Leishmania infantum, es una de las especies más recurrentes en el Viejo 
Mundo, básicamente en el Mediterráneo, en Europa, Norte de África, que se 
extiende a través de Arabia, Turquía, Irán, las Repúblicas de Asia y el Noroeste de 
China. En América, se encuentra L. chagasi,desde el sureste de EUA hasta el 
norte de Argentina y Paraguay, excepto Chile y Uruguay, aunque se han hecho 
estudios moleculares que puede ser indistinguible de L. infantum (Bates, P.A y 
Ashfors R.W, 2005). 
 
10 
 
 
 En nuestro país se ha encontrado que las zonas más afectadas por la 
Leihsmaniasis es en el estado de Chiapas y la cuenca del Río Balsas (Puebla, 
Guerrero y Morelos). En Chiapas entre el 2000 y el 2005 se detectaron 33 nuevos 
casos y apareció un foco adicional en Guerrero. En Chiapas, en los municipios de 
Tuxtla Gutiérrez y Chiapas de Corzo tienen una alta prevalencia de LV ya que en 
el 2000 se registraron 10 casos en edades de 2 meses a 13 años. En este estado 
la LCL muy abundante, sobre todo en lugares de la selva tropical perennifolia 
entre los años de 1990 al 2005 se reportaron 1310 casos de LCL. 
 
 En Tabasco, se han reportado más pacientes con LCL y LCD, esta última 
es la forma progresiva del padecimiento. La alta prevalencia de los casos de 
Leishmaniasis en el estado de Tabasco se establece en los municipios de 
Cunduacán, Cárdenas y Comalcalco (la región de la “Chontalpa”), siendo una 
zona donde se cultiva cacao, representa una problemática para su control, ya que 
la Lutzomya transmisora de L. (L.) mexicana habita en el mismo nicho ecológico 
que los dípteros polinizadores del cacao una de las fuentes de ingresos 
económicos más importantes en la región. También se han reportado casos 
esporádicos de LMC en Tabasco y en Chiapas. 
 
 Estos Estados no son los únicos (Figura 6, 7) en nuestro país donde se ha 
reportado la Lesihmaniasis, sino también Campeche, Quintana Roo, Nayarit que 
reportan casos de LC, Veracruz, Oaxaca que han reportado casos de LMC 
(Becker, I. 2005). 
 
 
 
11 
 
 
 
 
 Fig. 6. Distribución geográfica de las diferentes Leishmaniasis en los Estados Unidos 
Mexicanos. Modificado de: 
http://www.panaftosa.org.br/inst/zoonosis/LEIHSMANIASIS/Inf.final_Leish_2005 
 
 
 
Fig. 7. Casos de Leishmaniasis por entidad federativa. Estados Unidos Mexicanos 1990-
2005.Modificado de: 
http:// www.panaftosa.org.br/inst/zoonosis/LEIHSMANIASIS/Inf.final_Leish_2005 
 
 
12 
 
1.4 Características del parásito. 
 
En el género Leihsmania hay dos estadíos principales de desarrollo, el 
promastigote y el amastigote. El promastigote es alargado, mide entre 18 y 20μ, 
tiene su núcleo en un extremo y en el extremo contrario se localiza el blefaroblasto 
de donde nace un flagelo corto, éste no es completo como el de otras formas de 
otros géneros, por eso se llama promastigote o premastigote (Figura 8). 
 
 
Fig. 8. Promastigote y sus organelos más importantes. Modificado de 
http://www.leishmania.org/pagine/leishmaniosi_canina/eziologia-promastigote.asp 
 
El amastigote es ovalado (Figura 9), posee membrana y un gran núcleo 
localizado en un extremo, aunque en ocasiones también se encuentra central, 
tiene una estructura evidente en el frotis: que es el cinetoplasto, de este se forma 
el flagelo. El amastigote es inmóvil, mide aproximadamente de 6 a 7 micras 
(Romero CR., 1999). 
 
13 
 
 
Fig. 9. Amastigote y sus organelos más importante. Modificado de 
http://www.leishmania.org/pagine/leishmaniosi_canina/eziologia- amastigote.asp 
 
 
 
1.4.1 Ciclo de vida. 
 
 El ciclo de vida tiene dos estadíos (Figura 10), en el primer estadío es 
característico por los promastigotes procíclicos los cuales se dividen en el 
estómago medio de la mosca y subsecuentemente pasa a promastigote 
nectomonados. Estas formas son responsables de una migración interior y se 
transforman en promastigotes leptomonados que luego se diferencian a 
promastigotes metacíclicos en las glándulas salivales y estan preparados para la 
transmisión a un hospedero mamífero, en el momento en que la mosca se 
alimenta de sangre y trasmite los promastigotes (Gossage, S.M. y cols 2003), 
pasan al torrente sanguíneo e invaden los macrófagos y ahí es donde pasan al 
estadío de amastigote, se resguardan en una vacuola parasitófora donde 
sobreviven y se multiplican, posterormente estallan al macrófago para entrar en 
otras células (Naula C y cols, 2005). 
 
14 
 
 
Fig. 10. Ciclo de vida de Leishmania spp.Modificado de: 
http://www.answers.com/topic/leishmaniasis 
 
 
 
1.4.2 Vacuola parasitófora. 
 
La Leishmania en el huésped mamífero es localizada en el interior de 
macrófagos en un compartimiento celular que es limitado por una membrana, 
originada del plasma membranal del macrófago, el fagosoma pasa por una 
remodelación vía maduración y fusión con organelos endocíticos resultando la 
formación de una vacuola parasitófora. El tiempo de transformación de los 
promastigotes a amastigotes es de 2 a 5 días dependiendo de la especie de 
Leishmania. La presencia de algunas moléculas en la vacuola parasitófora 
muestra que su membrana puede ser una mezcla de organelos formados por la 
unión de una prolongación de endosoma y lisosoma (Antoine, J.C. y cols 1998). 
 
La formación de la vacuola parasitófora puede ser parcialmente regulada 
por el parásito, por ejemplo, el lipofofosglicano LPG, el mayor componente de la 
15 
 
membrana del promastigote interviene en el primer paso de la biogénesis de la 
vacuola y restringe la fusión del fagosoma recien formado que contiene al 
promastigote con la prolongación del compartimiento endocitado. En el estadío de 
amastigote, la vacuola parasitófora juega un papel importante en la respuesta de 
como parasitar al macrófago, que es un recurso esencial de antígenos ya que 
estimula a las células específicas CD4+ (Antoine, J.C. y cols 1998). 
 
 
 
1.4.3 Transmisor o vector. 
 
La familia Psychodidae (Psicósidos), a la que pertenece los géneros 
Phlebotomus y Lutzomya (Nuevo Mundo), son insectos frágiles conocidos como 
moscas de la arena (Figura. 11), pueden encontrarse durante su etapa larvaria, en 
ambientes húmedos, oscuros o con sombra; en algunos casos son frecuentes 
sobre las ventanas, pues son atraídos hacia la luz en la noche. Las hembras de 
estos géneros, se alimentan de la sangre de vertebrados, incluidos el hombre y 
otros mamíferos (Richard O.W. y Davies R.G., 1983). 
 
Después de haber succionado sangre depositan de 40 a 70 huevos en 
suelos húmedos, ricos en residuos orgánicos de los que se alimentan las larvas al 
eclosionar (Velazco C.O, 1991). 
 
 
Fig. 11. Mosca pilosa Phlebotomus, transmisor del promastigote de 
Leishmania.Modificado de http://www.anaaweb.org/leishmania.html 
 
16 
 
 
1.4.4 Efecto de la saliva de la mosca de la arena. 
 
La saliva de la mosca contiene una actividad farmacológica potente, facilita 
que la mosca tome sangre inadvertidamente y ayude a la transmisión de la 
Leishmania (Hall, L.R, 1995), ya que contiene maxadilán, un potente vasodilatador 
que inhibe la producción de TNF-α y disminuye la producción de óxido nítrico por 
el macrófago infectado (Beker, I. 2006). 
 
Se han hecho estudios inyectando en el cojinete plantar de ratón, saliva con 
Leishmania; lo cual en una forma dramática incrementa el número de parásitos en 
la lesión, comparada con otra que fue provocada sin saliva. La explicación de esta 
observación, es que la saliva facilita la introducción de la Leishmania en el 
macrófago resultando una sobrecarga de parásitos (Hall L.R y Titus R.G, 1995). 
 
 
 
1.5 Respuesta inmune. 
 
 
 La Leishmaniasis es provocada por uno de los parásitos, que aun se 
desconocen muchos de los factores que participan en la determinación del tipo de 
respuesta inmune en personas que padecen las distintas formas clínicas de 
Leishmaniasis; tal vez porque estos protozoarios son altamente adaptables y 
escapan a la respuestas humorales y celulares montadas por el sistema inmune 
del huésped, quizá la solución más simple para evadir la respuesta de 
anticuerpos, sea la adopción de una forma de vida intracelular. Además es uno de 
los parásitos que inducen los dos tipos de respuesta,la TH1 y la TH2; se cree que 
este tipo de respuesta se debe a las siguientes hipótesis: la primera es la 
secuencia de citocinas en fase temprana, donde se ha observado que la presencia 
17 
 
de IL-12 favorece la diferenciación hacia una respuesta TH1 y la segunda es los 
factores de virulencia y el tamaño del inóculo. 
 
 Cuando la Leishmania se introduce al macrófago ocurre, primeramente 
uniéndose a la superficie del mismo, vía glicolípido, la segunda unión involucra a 
los gp63, a los receptores del complemento, con el cual hacen un complejo y se 
unen a CR3, CR1 y C3B en el macrófago, otras uniones posibles son los 
receptores “Toll like” (TLR) que estarían facilitando la infección de la célula 
huésped. 
 
Estando el parásito dentro del macrófago (Figura. 12) ocurre un mecanismo 
para eliminar posiblemente al parásito de Leishmania, por metabolitos tóxicos de 
oxígeno, como el anión superóxido (O-2), peróxido de hidrógeno (H2O2) y óxido 
nítrico (NO). El macrófago activado produce diferentes citocinas como TNFα, IL-6, 
IL-18, IL-12 e IFN-γ. La IL-12 es un adyuvante efectivo y un prerrequisito para la 
respuesta inmune de tipo TH1, ya que produce la interacción CD40 y CD40L. Esta 
última unión activa la célula T para producir IFN-γ, que tiene una función 
leishmanicida. 
 
Se han hecho estudios que han revelado que da los dos tipos de respuesta 
la TH1 y la TH2, para el fenotipo TH1 la IL-12 y la IL-4 para el fenotipo TH2. Sin 
embargo la IL-6, participa hacia la polarización de TH2, es producida por un 
espectro de ondas de células como fibroblastos, células endoteliales, 
membranales, macrófagos, células madres, línea de células tumorales y células 
TH2 CD4+, pero el mayor proveedor de IL-6 son las APCs. Se ha observado que 
eventualmente en la ausencia de cualquier citosina polarizante, la IL-6 dirige la 
diferenciación de las células CD4+ hacia la expresión de TH2. La IL-6 no afecta en 
la expresión en las APCs de las moléculas estimuladoras como la B7-1 y B7-2, las 
cuales tienen y han sido involucradas en la diferenciación de las células TH1 y TH2. 
Otra citosina que produce la respuesta TH2 es la 1L-10, pero su mecanismo no ha 
18 
 
sido esclarecido (Rincón, M. y cols, 1997, Sacks. D, Sher, A. 2002, Awasthi. A, y 
cols. 2004, Becker. I, 2006). 
 
La eliminación del parásito parece depender de la activación de la célula 
hospedera, se ha observado que la producción de citocinas activadoras de 
macrófago se correlaciona con la curación y las citocinas que desactivan al 
macrófago se correlacionan con la afección. Tal vez por esa razon se piensa que 
el mecanismo por el cual se activa una respuesta TH1 o TH2 es de vital importancia 
para dirigir la reacción inmunitaria hacia la protección y curación o susceptibilidad 
y patogenia (Hernández, R.J y Becker, I. 2006) 
 
 
 
Fig. 12. Micrografía, mostrando un macrófago infectado con amastigotes de Leishmania 
spp, tomado de una lesión en humano, contiene núcleo y el cinetoplasto sombreado, 
teñido con Giemsa. Modificado de: http://www.med-chem.com/Para/Prob...htm 
 
Sin embargo la forma en que la Leishmania evade la respuesta inmune 
para sobrevivir dentro del macrófago, es utilizando algunos mecanismos que aquí 
se enlistan: 
 
▪ Suprimen la funciones necesarias del macrófago para eliminar el parásito. 
▪Baja la regulación de la expresión CD80 (o B7-1, presentes en macrófagos 
y células dendríticas). 
▪Secuestran la presentación de antígenos por la molécula MHC de clase II, 
poniendo a la célula T en un estado de anergia. 
▪Baja la regulación del IFN-γ y la respuesta inmune TH1, y se promueve la 
progresión de la enfermedad. 
19 
 
▪Baja la regulación de las células T colaboradoras CD4+, inducidas por la 
fosforilación p38MAPKcinasa y la expresión de iNOS2 (Awasthi, A., y cols, 
2004). 
▪La proteasa de superficie gp63 y LPG (lipofosfoglicano), son moléculas que 
evaden la respuesta inmune y contribuyen a bloquear el estallido oxidativo a 
través de la proteín-cinasa C y la reducción de la translocación de la 
membrana, el parásito también promueve la supervivencia dentro del 
macrófago, previniendo la apoptosis (Zambrano-Villa y cols, 2002). 
 
 
La saliva de la mosca también juega un papel importante ya que contribuye 
inhibiendo substancialmente la producción de óxido nítrico (NO), dentro del 
macrófago en respuesta al IFN-γ o puede disminuir la producción de NO hasta un 
50%, y con esto impide la actividad leishmanicida. Datos de laboratorio han 
demostrado que esta secreción también inhabilita la presentación de antígeno por 
el macrófago a las células T específicas, el mecanismo por el cual esto ocurre no 
ha sido aclarado, pero una de las hipótesis es que la saliva de la mosca inhibe la 
presentación de antígeno a través de la regulación de MHC II (Hall L.R y Titus 
R.G, 1995). 
 
 
 1.5.1 Respuesta inmune en ratón 
 
Ante la infección experimental en ratón, provocada por una dosis baja de 
parásitos de Leishmania la evolución de la lesión ocurre en tres fases distintas: 
 
 En la fase inicial o de silencio, los macrófagos fagocitan los promastigotes 
de L. major la cual inactiva la célula infectada, seguida por una proliferación del 
parásito; en la segunda fase hay lesiones clínicamente evidentes, coincide con un 
flujo de células inflamatorias, incluyendo neutrófilos, macrófagos y eosinófilos. La 
20 
 
inmunidad se inicia por infiltración de células dendríticas como células T y B, y se 
da la lesión. 
 
 Las células dendríticas llegan activadas, toman amastigotes de L. major 
presentes en la lesión de la piel y migran hacia los nódulos linfáticos, donde 
presentan los antígenos de Leishmania a las células T nuevas. Las diferencias 
entre las vías de macrófagos y las de células dendríticas al interaccionar con el 
parásito son: primero la célula dendrítica toma al amastigote de L. major, el 
parásito va a una forma de vida intracelular; segundo: el macrófago eficientemente 
fagocita ambas formas, la capacidad fagocítica de la célula dendrítica es limitada 
con respecto a la eficiencia y capacidad del macrófago; tercero: en el macrófago 
la IL-12 induce la diferenciación de nuevas células TH1/TC1; ambos tipos de 
células presentan antígeno de Leishmania vía MHC I, sólo las células dendríticas 
estimulan las células T CD8+ específicas contra L. major (Woelbing, F. y cols, 
2006). 
 
En la repuesta inmune en el ratón, se ha encontrado que la edad puede 
influenciar en el curso de la infección con Leishmania spp, y las hormonas tanto de 
machos como de hembras pueden mediar la resistencia y susceptibilidad a la 
infección. Los machos de las cepas BALB/c y DBA/2 son más susceptibles que las 
hembras a la infección sistémica con L. major; pero se ha encontrado que la 
hembra es resistente a la infección por L. mexicana y ha sido demostrado 
mediante el control de un solo gene designado Scl-2, que ha sido mapeado en el 
cromosoma 4 del ratón. Esta región presenta una homología con una región del 
brazo corto del cromosoma 9 en el brazo del humano. Tanto el gene Scl-2 en el 
ratón y la región del brazo corto en el humano codifican a las cinasas Jak1 y Jak2 
que tienen una función en la señalización del IFN-γ e IL-4, factores importantes en 
la repuesta del sistema inmune, incluyendo la activación de macrófagos para el 
control intracelular de los parásitos. Las bases moleculares que modulan la acción 
de Scl-2 no es clara, aún es un problema sin resolver, como la expresión de la 
21 
 
resistencia del alelo es influenciada por la presencia o ausencia de las hormonas 
sexuales (Craig, W.R. y cols, 2001). 
 
1.6 Proteínas de superficie del parásito. 
 
La proteína de superficie de la membrana de Leishmania, se subdivide en 2 
grupos, el primero tiene un alto número de copias por célula y la mayoría son 
componentes estructurales, el segundo presenta un bajo número de copias de 
enzimas, transportadoresy bombas iónicas. 
 
Los componentes de la superficie del estado de promastigote son 3: 1) El 
lipofosfoglicano (LPG), contiene componentes estructurales unidos 
covalentemente, le confiere protección al parásito contra enzimas hidrolíticas en el 
intestino de la mosca como del fagolisosoma del macrófago, inhibe vías de 
transducción que disparan respuestas microbicidas y es un eficiente captador de 
radicales tóxicos de oxígeno. 2) El glicosilfosfatidilinositol (GPIs), se encuentra en 
ambos estadíos, forma el glicocalix y da protección a los amastigotes. 3) gp63 o 
proteasa de superficie de promastigote (PSP), es una metaloproteasa, potencia el 
ciclo de vida, y ayuda en la introducción del parásito en la membrana peritrófica 
del macrófago (Bates, P.A y Ashford, R.W. 2005). Además de que gp63 se 
encuentra distribuida en la membrana y en el flagelo del promastigote. En el 
paquete flagelar del amastigote, que es el sitio de endocitosis y exocitosis de 
Leishmania (Hsiao CH y cols. 2008). 
 
Existen otras proteínas que son parecidas a las glicoproteínas denominadas 
amastinas que se asocian con el estado de amastigote; son altamente 
conservadas en los residuos de treonina junto con el dominio que posiblemente 
puede ser ortoglicosilado; y tienen la característica de aceptar la adición de una 
molécula de azúcar que puede prevenir, por ejemplo, la degradación de la 
amastina por abundantes proteasas del fagolisosoma o mejor presentar la señal 
del dominio funcional o incrementar la solubilidad (Rochette, A, y cols 2005). Se ha 
22 
 
predicho que todos los miembros de los genes de la familia de amastinas poseen 
dominios extracelulares, con secuencias de aminoácidos altamente conservadas 
que están presentes en toda la Leishmania y amastinas homólogas de 
Tripanosoma (Rafati, S. y cols, 2006). 
 
El gene que codifica para la proteína altamente antigénica, con un peso 
molecular de 29.3 kD, compuesta por cuatro segmentos transmembranales, está 
formada principalmente por regiones de aminoácidos hidrofóbicos, presenta una 
señal de anclaje en el extremo amino, está ubicada en la superficie de la 
membrana celular del parásito, presenta varios nanómeros y decámeros 
distribuidos a lo largo de la secuencia, los cuales se dedujo que activan las células 
T con alta, mediana y baja afinidad, por lo que se identificó como una proteína 
altamente antigénica. Estas secuencias de aa. pueden ser procesadas por el 
proteosoma de las células presentadoras de antígeno y presentadas en su 
superficie unida a las moléculas MHC-I humanas, estos epítopes se encuentran 
flanqueados por regiones de aminoácidos hidrofílicos facilitando el acceso de los 
linfocitos T. 
 
 
 
1.7 Desarrollo de vacunas. 
 
 Históricamente la Leishmaniasis, principalmente la cutánea ha sido centro 
de experimentación de vacunas tentativas, probablemente por que se sabe que 
desde la antigüedad, individuos que han padecido infecciones en la piel por la 
picadura de la mosca y han sanado, lo que les ha conferido una protección para 
infecciones futuras, por ejemplo los beduinos y algunas sociedades tribales 
Kurdistanis tradicionalmente exponen los glúteos de sus bebés a picaduras de la 
mosca para protegerlos de lesiones faciales. Otra antigua técnica practicada en el 
23 
 
Medio Oriente ha sido el uso de una espina para transferir el material infectado de 
las lesiones a individuos no infectados. 
 
 El uso de vacunas ha tenido muchos problemas, incluyendo el desarrollo de 
grandes lesiones de piel incontroladas, exacerbación de soriasis y otras 
enfermedades de la piel y aún inmunosupresión como lo determinado por 
respuesta bajas a la vacuna triple de difteria, pertusis y tétanos. 
 
 Se han formulado vacunas comunes, vacunas mortales, atenuadas, 
sintéticas y recombinantes, vacunas con expresión de inmunógenos de bacterias y 
virus, vacunas de péptidos sintéticos, antígenos no proteícos, vacunas de ADN 
desnudos; pero todos estos intentos han tenido dificultades para dar protección, 
incluso algunos hasta podrían dar una respuesta de exacerbar la enfermedad. En 
las vacunas mortales dieron una respuesta tipo TH1, con la producción del IFN-γ y 
la ausencia de IL-4, pero solo tuvo una eficacia del 35 por ciento, en el caso de 
organismos atenuados dan una mejor protección pero tienen la desventaja en la 
producción a gran escala y distribución. Un antígeno que se ha utilizado desde el 
inicio de estos intentos es el gp63, es un receptor del parásito para el macrófago, 
pero al parecer da más protección contra L. amazonensis que para L. major y 
desafortunadamente en los modelos animales la respuesta celular T para gp63 ha 
sido muy variable. 
 
 Otro ejemplo son los péptidos sintéticos, como el PSA-2 induce una fuerte 
respuesta de tipo TH1/TH2 y no da protección. En algunos casos se ha utilizado 
adyuvantes para potenciar la respuesta inmune, sin embargo el adyuvante más 
efectivo causa una fuerte inflamación. De todos los preparados antes 
mencionados que están en investigación no han dado un resultado favorable de 
protección contra la Leishmaniasis (Handman, E. y cols, 2001), por lo que en esta 
tesis se analizó una pequeña parte del genoma de L. major para buscar nuevas 
proteínas antigénicas que eventualmente puedan utilizarse en ensayos de 
protección contra este parásito. 
 
24 
 
 
 
2. JUSTIFICACIÓN. 
 
La Leihsmaniasis es considerada una de las parasitósis más importantes en 
el mundo, en nuestro país es una enfermedad emergente que en los últimos años 
se ha convertido en un problema que trasciende a nivel económico y social; no se 
ha encontrado vacuna alguna para su control o algún tratamiento que elimine al 
parásito sin ocasionar efectos secundarios. 
 
El genoma de L. major permite investigar las proteínas antigénicas, las 
cuales tienen secuencias de aminoácidos capaces de generar una respuesta 
inmune de tipo TH1. En este proyecto identificamos dos nuevas proteínas 
antigénicas transmembranales secretoras de L. major denominadas Saf 1 y G1-5, 
las cuales contienen epítopes para células T citotóxicas aumentando las 
posibilidades de inducir protección inmunológica contra la Leihsmaniasis. 
 
25 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 HIPÓTESIS. 
 
El conocer completamente la secuenciación del genoma de L. major y el 
análisis con herramientas bioinformáticas de las mismas, nos permitirá identificar 
nuevas proteínas antigénicas, las cuales pueden ser utilizadas como nuevos 
blancos terapéuticos para la elaboración de vacunas experimentales que eliminen 
a la Leishmania. 
 
26 
 
 
4 OBJETIVOS. 
 
 
4.1 Objetivo general: 
 
Identificar con el uso de herramientas bioinformáticas nuevas proteínas 
antigénicas de L. major que contengan epítopos para las células T (que induzcan 
una respuesta celular citotóxica de tipo TH1). Así como también realizar su 
clonación y caracterización molecular. 
 
4.2 Objetivos particulares: 
 
* Analizar genes que no han sido estudiados de Leishmania major que 
codifiquen proteínas antigénicas transmembranales secretoras que aún no han 
sido identificados, por medio de análisis bioinformáticos. 
 
* Clonar los genes seleccionados de proteínas transmembranales y 
secretoras. 
 
* Secuenciar los fragmentos clonados. 
 
* Realizar las construcciones genéticas para producir las proteínas 
recombinantes en bacterias. 
 
 
 * Obtención de la (s) proteína (s) recombinante (s). 
 
 
27 
 
 
5 MATERIALES Y MÉTODOS. 
 
El proceso de esta investigación bioinformática y experimental se hizo 
siguiendo el diagrama de flujo siguiente: 
 
 
 
 
28 
 
 
5.1 Análisis bioinformático. 
 
 Para el análisis bioinformático se analizaron varios cientos de genes y 
proteínas del genoma de L. major con la finalidad de encontrar genes que 
codifiquen para proteínas de la membrana y secretoras, basándose en secuencias 
altamente antigénicas que contengan epítopespara células T, capaces de inducir 
una respuesta inmune citotóxica; por lo que se empleó el programa HLA Peptide 
Binding Predictions (Figuras 13 y 14) en el sitio http://us.expasy.org/tools/protscales.html. 
 
De las secuencias nucleotídicas seleccionadas, que pudieran codificar para 
este tipo de proteínas, además se analizó su hidropatía empleando el programa 
Kyte and Dolittle, que se encuentra en el sitio antes mencionado. 
 
 
Fig. 13. Gráfica de hidrofobicidad de la proteína Saf1, en los aminoácidos de 40 y 
60, y (a escala de -2 y 2) se encuentra la secuencia epítope de interés. 
 
 
29 
 
 
Fig. 14. Gráfica de hidrofobicidad de la proteína G1-5, en la posición entre 150 y 
200, y la escala de 2 y 3 se encuentra la secuencia epítope de interés. 
 
 
 
5.2 Extracción de ADN genómico (ADNg) de L. major. 
 
 El ADNg de L. major que se utilizó como templado para la amplificación de 
los genes se obtuvo de promastigotes de L. major, los cuales fueron inoculados 
con anterioridad en ratones BALB/c. Se extrajo el ADNg empleando el equipo de 
extracción de ADNt (QIAGEN, Cat. No. 69504), siguiendo las indicaciones del 
fabricante. El ADN fue eluido en un amortiguador de alta concentración de sal que 
es eliminada por una precipitación con isopropanol. El procedimiento de extracción 
se basa en optimizar el sistema de amortiguador para una lisis cuidadosa de 
células y de ácidos nucleicos, seguida de la unión del ADNg a una resina de 
intercambio aniónico en condiciones apropiadas de baja concentración de sal y de 
pH. El ARN, proteínas y las impurezas de bajo peso molecular son retiradas 
mediante un lavado salino. 
 
 
30 
 
5.3 Amplificación del ADNc con oligonucleotidos específicos por la 
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 
 
 La Reacción en Cadena de la Polimerasa conocida como PCR por sus 
siglas en inglés, es una técnica de biología molecular (Mullis K., 1987) cuyo 
objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular. 
 
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas 
para replicar hebras de ADN, y usa ciclos de varias temperaturas para separar las 
hebras de ADN recién formadas entre sí después de cada fase de replicación y a 
continuación, deja que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a 
duplicarlas. 
 
Las hebras iniciales del ADNc que codifica para las proteínas antigénicas se 
obtuvieron siguiendo el método de PCR, empleando el equipo para la reacción 
(Invitrogen, Cat.No.46-0100). El método utiliza como templado el ADNg de la 
secuencia correspondiente. Como iniciadores para este PCR se sintetizaron los 
oligonucleótidos específicos de los extremos 5´ (sentido) o amino terminal y 3´ 
(antisentido) o carboxilo terminal; diseñados a partir de las secuencias 
nucleotídicas correspondientes de cada secuencia. 
 
 La mezcla de reacción para la amplificación de la PCR fue: amortiguador 
10X 5μl, oligonucleótido 2μl de cada uno, dNTP 0.5μl, templado 2μl, MgSO4 1μl, 
Taq polimerasa (Invitrogene, Cat. No. 986022T) 1μl agua estéril 36.5μl, se obtuvo 
un volumen final de 50μl. Se utilizó un termociclador gene Amp PCR System 
modelo 9700 (Appliedm Byosystem), la temperatura para la desnaturalización fue 
de 94oC por 4min y 94oC por 30s, los oligonucleótidos sintéticos hibridaron al ADN 
a 60oC por 30s, la extensión de la Taq polimerasa a 72oC por 30s y 72oC en 1min. 
 
 
31 
 
 Los productos de PCR se analizaron por medio de electroforesis en gel de 
agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio, iluminados con luz UV para observar 
la presencia de las bandas correspondientes a los ADN amplificados. 
 
 El equipo empleado para todos los análisis electroforéticos fue una cámara 
de electroforesis (Owl Scientific Inc; B1A), un transluminador de UV (UVP, Inc) y 
una cámara fotográfica acoplados al programa computacional KDSID 2.0 (Kodak 
Digital Science Electrophoresis Documentation and Análisis System 120). 
 
 
5.4 Ligación. 
 
 Los fragmentos amplificados por PCR, se ligaron al vector de clonación 
pcRII-TOPO (Invitrogen, Cat. No.K4510-20), el cual es altamente eficiente en la 
inserción directa de los productos de PCR dentro del plásmido, obteniendo de esta 
manera un ADN recombinante. 
 
En el último paso de la reacción de PCR (extensión final), la polimerasa 
tiene una actividad terminal de transferasa que agrega una cola de 
deoxiadenosina (dATP) a los extremos 3´ de los productos de PCR. El vector 
linearizado tiene residuos sobresalientes de deoxitimidina (dTTP) en el extremo 3´. 
Esto permite que los rellenos de PCR se liguen eficientemente con el vector. Este 
vector cuenta con el operón lac Z y confiere resistencia a ampicilina y kanamicina, 
secuencias empleadas en pasos posteriores (Figura 15). 
 
32 
 
 
Fig. 15. Vector pCRII-TOPO. 
 Modificada de http//www.invitrogene.com/content/sfs/manuals/topota_man.pdf 
 
 
 La reacción de ligación se llevó a cabo siguiendo las indicaciones del 
protocolo enunciado en el equipo empleando 1µl del producto de PCR. 
 
 
5.5 Transformación y tamizaje de colonias. 
 
La transformación es el proceso por el cual las células introducen moléculas 
de ADN de sus alrededores, (Figura. 16). Existen diferentes métodos para la 
introducción de plásmidos en bacterias. El método utilizado en este trabajo fue la 
introducción del ADN recombinante en células químicamente competentes. E. coli 
DH5α-T1, por choque térmico, acondicionadas en el laboratorio (Anexo II). 
 
Para la transformación, de las células competentes se tomó un vial con 50μl 
de las células DH5α-T1, al cual se le adicionaron 2μl de la reacción de ligación, 
mezclando cuidadosamente con la yema del dedo. Se incubó en hielo por 30min; 
 
33 
 
posteriormente se le dió un choque térmico por 30s a 42°C (Thermolyne Type 
17600) y rápidamente se colocó en hielo. En un ambiente estéril, se adicionaron 
250μL del medio enriquecido SOC (Anexo II). Se incubó el vial a 37°C en agitación 
constante por 1hr (Heidolph Instruments, UNIMAX 1010). En una caja petri, con 
medio LB sólido (Anexo II) y ampicilina (Sigma, R.A.) a una concentración de 
100μg/m, se le adicionó una mezcla de IPTG, Xgal (Anexo II) y agua estéril a un 
volumen de 50µl bajo un ambiente estéril, una vez absorbida la mezcla, se 
plaquearon las células transformadas. Las cajas fueron invertidas e incubadas a 
37°C toda la noche. 
 
 Las colonias que lograron crecer en el medio de cultivo, resistentes a 
ampicilina y que conservaron su coloración blanca, son posibles candidatas a 
tener el inserto deseado, se eligieron algunas y se inocularon en 5ml de medio 
líquido LB (Anexo II) y con ampicilina a una concentración de 100μg/ml. Se 
incubaron a 37°C en agitación constante durante toda la noche, para la 
purificación posterior de los plásmidos. 
 
 
Fig. 16. Transformación y tamizaje de colonias. 
 Modificada de: boneslab.bio.ntnu.no/bi211_kap8.htm 
 
 
 
 
 
 
 
34 
 
5.6 Purificación del plásmido (por el método de miniprep). 
 
 Para el aislamiento de pequeñas cantidades de ADN plasmídico a partir de 
bacterias (Purificación de ADN plasmídico: miniprep), se utilizó el equipo plasmid 
Mini (MARLIGEN BIOSCENCEINC, Cat. No.11453-024), el cual se basa en una 
modificación al procedimiento de lisis alcalina. El método utiliza dodecil sulfato de 
sodio (SDS) en presencia de NaOH para desnaturalizar las proteínas bacterianas 
y el ADN cromosómico y del plásmido. La mezcla se neutraliza con acetato de 
potasio con lo cual precipitan las proteínas y el ADN cromosómico, mientras que el 
ADN del plásmido se realinea y es adsorbido selectivamente en una resina de 
intercambio iónico bajo condiciones adecuadas de pH y baja concentración salina. 
El ARN, proteínas e impurezas de bajo peso molecular son eliminados por lavado 
pasando a través de la columna un medio salino que contiene isopropanol. 
Finalmente el ADN plasmídico se eluyecon un amortiguador Tris, EDTA; se 
concentra y desala por precipitación con isopropanol. 
 
 La purificación de los plásmidos se llevó a cabo siguiendo los pasos del 
protocolo enunciados en el instructivo del equipo. Las colonias fueron identificadas 
con fragmentos amplificados del ADNp por PCR, bajo las mismas condiciones 
térmicas y con los oligonucleótidos específicos antes mencionados y fueron 
analizados por electroforesis en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio. 
 
 
5.7 Secuenciación del fragmento clonado. 
 
 Para la secuenciación de los fragmentos clonados de ADN, se siguió el 
método automático de secuenciación que se basa en la síntesis enzimática de 
ADN, terminando la cadena específicamente con 2´,3´dideoxinucleótidos 
(ddNTPs) como análogos de los nucleótidos trifosfato (dNTP). 
 
 
35 
 
El fragmento clonado se llevó a secuenciar a la unidad de Biología 
Molecular del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM, donde se empleó un 
secuenciador automático ABI PRISM 310 (Applied Biosystems, Genetic Analyzer 
de Pekín-Elmer), acoplado a una computadora Macintosh que colectó y analizó los 
datos. Los iniciadores empleados para la extensión del ADN fue el oligonucleótido 
del promotor del plásmido M13, los cuales flaquean los fragmentos de los ADN 
insertados en los vectores. 
 
Las secuencias obtenidas se compararon con la reportada en la literatura, 
empleando un programa especializado de simulación software llamado Biology 
Workbench. http://worbench.sdsc.edu/ 
 
 
5.8 Subclonación en un vector de expresión. 
 
 Una vez verificada la secuencia de la proteína G1-5, se realizó la digestión 
con Eco R1 con el fin de aislar el inserto para subclonarlo en el vector de 
expresión pQE16 (QIAGEN Cat.No.33903). Posteriormente el inserto se purificó 
empleando las indicaciones del equipo (Roche Cat.No.1696505). 
 
 Las características de los vectores pQE QIAexpress, entre otras, es que 
contiene un sitio promotor operador del fago T5 reconocido por la RNA polimerasa 
de E. coli y dos secuencias del operador lac las cuales incrementan la unión del 
represor lac y le confieren una eficiente regulación del promotor T5, múltiples sitios 
de clonación y codones de término y marcos de lectura abiertos para las 
construcciones de expresión de proteínas, un gene β-lactamasa (bla) que le 
confiere resistencia a ampicilina que es necesaria para la expresión de la proteína 
(Figura 17). 
 
36 
 
 
Fig. 17. Vector de expresión pQE16, se observa con sus sitios de inserción y las enzimas 
que pueden ser utilizadas (Tomado de QIAexpresessionist TM August 2002). 
 
 
Se utilizó la enzima de restricción BamHI (Invitrogen Cat.No. 15213-010) 
para linealizar el vector de expresión. 
 
La ligación de G1-5 con el vector de expresión pQE16 se hizo con la 
enzima T4 ADN ligasa (Invitrogen. Cat.No.15628-019), siguiendo las 
especificaciones que el protocolo indica. 
 
 
5.9 Transformación en una célula de expresión (E. coli). 
 
El nuevo ADN plasmídico de la proteína G1-5, se introdujo en células de 
expresión. E. coli M15, acondicionadas en el laboratorio (Anexo II). 
 
Para la transformación de las células de expresión se tomó un vial con 50μl 
de las células M15, al cual se le adicionaron 2μl de la reacción de ligación, 
mezclando cuidadosamente con la yema del dedo. Se incubó en hielo por 30min; 
posteriormente se le dio un choque térmico por 30s a 42°C (Thermolyne Type 
17600) y rápidamente se colocó en hielo. En un ambiente estéril, se adicionaron 
250μl del medio rico SOC (Anexo II). Se incubó el vial a 37°C en agitación 
constante por 1hr (Incubadora con agitación: Heidolph Instruments, UNIMAX 
1010). En una caja petri con medio LB sólido (Anexo II), kanamicina y ampicilina 
 
37 
 
(Sigma, R.A.) a una concentración de 50 y 100μg/ml respectivamente; se le 
adicionó una mezcla de IPTG, Xgal (Anexo II) y agua estéril a un volumen de 50ml 
bajo un ambiente estéril, una vez absorbida la mezcla, se plaquearon las células 
transformadas. Las cajas fueron invertidas e incubadas a 37°C toda la noche. 
 
 Las colonias que lograron crecer en el medio de cultivo, resistentes a 
kanamicina, ampicilina y conservaron su coloración blanca, son posibles 
candidatas a tener el inserto deseado, se eligieron algunas y se inocularon en 5ml 
de medio LB líquido con los mismos antibióticos y a la misma concentración. Se 
incubaron a 37°C en agitación constante durante toda la noche, para la obtención 
de la proteína. 
 
 
5.10 Obtención y purificación de la proteína. 
 
 Del proceso de transformación se seleccionaron colonias y se cultivaron en 
minipreps, a 1ml de cultivo de cada colonia seleccionada se le indujo con IPTG 
1mM, se incubó por 2hrs y se colectó, centrifugó, se añadieron 200μl de 
amortiguador B (Anexo II) y resuspendió en vórtex suavemente hasta que la 
solución fue translúcida. Se centrifugó el lisado por 10min a 13 000rpm, se 
removió el detrito celular, se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo. A éste 
sobrenadante se añadió una resina a base de níquel (Ni-NTA Agarosa QIAGEN. 
Cat.No.D-40724), al 50%, cada tubo se mezcló por 30min a temperatura ambiente 
de forma suave. Se centrifugó por 30s a 13 000rpm y se transfirieron 10μl a un 
tubo nuevo, para utilizarlo como control de la proteína que no se unió a la resina, y 
se descartó el resto del sobrenadante. 
 
Se lavó la resina 2 veces con 2500μl de amortiguador C (Anexo II), se 
centrifugó por 10s a 13 000rpm y se removió el sobrenadante. 
 
38 
 
Se eluyó la proteína contenida en la resina con 25μl de amortiguador E 
(Anexo II) se centrifugó 10s a 13 000rpm, se repitió dos veces más obteniendo un 
volumen final de 75μl. 
 
 A esta elusión se añadió amortiguador de carga 2X, se desnaturalizó por 
6min en el termoblock a 100oC, se fraccionó en un gel de poliacrilamida al 12% 
(The QIAexpressionistTM, Protocolo19, 2003). 
 
 
 
 
 
39 
 
 
6 RESULTADOS. 
 
 
6.1 Análisis bioinformática. 
 
 El genoma de L. major contiene aproximadamente 8 500 genes, después 
del análisis de varios genes por medio del análisis bioinformático se encontraron 
aproximadamente 15 genes del genoma de L. major, con secuencias altamente 
antigénicas de los cuales únicamente dos Saf1 y G1-5 fueron seleccionadas por 
su análisis de hidropatía y su histocompatibilidad y cuyas secuencias se usaron 
en el desarrollo de esta tesis. 
 
 La primera secuencia encontrada se denominó Saf 1 por Cell wall Surface 
anchor family protein, la cual contiene 307 pb y las secuencias epítopes en 
GFLMLVGHFI y VMGEILFCV, que se encuentran fuera de la membrana y dan 
una respuesta inmune de tipo TH1 (Figura 18). 
 
 
Fig. 18. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la secuencia Saf 1 de L. major. Se 
muestran las secuencias epítopes en negritas. 
 
 La segunda secuencia encontrada se denominó G1-5 (Figura. 19), que 
contiene 781 pares de bases (pb). 
 
 
40 
 
 
 
Fig. 19. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la secuencia G 1-5 de L. major. Se 
muestra el epítope en negritas. 
 
 Esta secuencia contiene el epítope (FVLGVLLLC) que se utilizó para clonar. 
 
 
 
6.2 Extracción de ADN genómico (ADNg). 
 
 A partir de cultivos in vitro del estadío de promastigotes de L. major se 
extrajo el ADN total, el cual se utilizó como templado para la amplificación por 
PCR. Adicionalmente se extrajo ARN total de los promastigotes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
41 
 
6.3 Oligonucleótidos utilizados. 
 
 Para la realización de la amplificación se diseñaron los oligonucleótidos 
específicos para Saf1 y G1-5 en sentido y antisentido, respectivamente (Figura 
20). 
 
Fig. 20. Secuencia de los oligonucleótidos empleados en el PCR. 
 
 
6.4 Amplificación de los ADNc con oligonucleótidos específicos (PCR). 
 
La amplificación del ADNc con oligonucleótidos específicos, se verificó por 
electroforesis en gel de agarosa al 2%, observándose las bandascorrespondientes a la secuencia de Saf1 de aproximadamente 312pb y la de G1-5 
de aproximadamente 865pb (Figura 21 y 22). 
 
42 
 
 
Fig. 21. Fragmentos obtenidos del PCR con oligonucleótidos específicos. En el carril PM: 
marcador de peso molecular de ADN (Invitrogen, Cat.No.15628-019), carril 2 secuencia 
amplificada Saf1. 
 
 
 
 
Fig. 22. Fragmento obtenido del PCR con oligonucleótidos específicos. En el carril PM: 
marcador de peso molecular de ADN, carril 1 y 2 ADNc amplificado de G1-5. 
 
 
6.5 Identificación de clonas con fragmentos amplificados por PCR. 
 
 Los fragmentos de ADN amplificado mediante el PCR se introdujeron para 
su clonación en el vector pCRII-TOPO, y luego se utilizó para la transformación de 
células químicamente competentes. Algunas colonias obtenidas en la 
transformación se seleccionaron y posteriormente se purificó el ADN plasmídico. 
 
43 
 
 Al fin de comprobar que los plásmidos contienen los insertos esperados 
para las proteínas Saf1 y G1-5, se amplificaron por PCR empleando los 
oligonucleótidos específicos a los fragmentos deseados. En la figura 23, se 
muestra la electroforesis de los fragmentos amplificados en el PCR de las colonias 
tamizadas para Saf1, en un gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio. Como se 
observa en el gel, cinco muestras contienen el fragmento deseado, pero sólo una 
de ellas se envió a secuenciar (carril 2). 
 
 
Fig. 23. Electroforesis de las clonas amplificadas por PCR de la secuencia Saf1 se puede 
observar que contienen el fragmento deseado y se secuenció el número 2. 
 
 
En la figura 24, se muestra la electroforesis de los fragmentos amplificados 
en el PCR de las colonias tamizadas para G1-5, en un gel de agarosa al 2% con 
bromuro de etidio. Como se observa en el gel, cuatro muestras contienen el 
fragmento deseado y en sólo dos de ellas (carriles 5 y 6) no se encuentra; por lo 
que la clona seleccionada para la secuenciación fue la número 3. 
 
 
44 
 
 
Fig. 24. Electroforesis para identificar las clonas amplificadas por PCR de la secuencia 
G1-5. Se puede observar que la número 3 es la que se encuentra aproximadamente entre 
600pb y 700pb. 
 
 
 
 
6.6 Secuenciación del fragmento clonado. 
 
 Los plásmidos purificados, de las clonas seleccionadas, se utilizaron para 
preparar las reacciones de secuenciación. Se prepararon las reacciones, los 
iniciadores empleados para la extensión del ADN fueron los cebadores del 
promotor del plásmido M13, los cuales flanquean los fragmentos del ADN 
insertado en el vector (Figura 15), secuencias que delimitan a Saf1 y a G1-5. 
 
Las secuencias nucleotídicas de las clonas seleccionadas resultaron 
complementarias a las secuencias encontradas en el análisis bioinformático tanto 
para Saf1 como para G1-5 del ADNc (Figuras 25 y 26). 
 
 
45 
 
 
 
 
Fig. 25. Secuencia de Saf1, se observa subrayados los oligonucleótidos y en 
negritas las secuencias epítopes de los aminoácidos FLMLVGH y VMGFILFC. 
 
 
 
 
 
 
Fig. 26. Secuencia de G1-5, se observa subrayado los oligonucleótidos y en 
negritas las secuencias epítopes de los aminoácidos FVLGVLLLC. 
 
 
 De acuerdo al análisis de las secuencias obtenidas a partir de los 
fragmentos clonados de Saf1 y G1-5, pudimos estar seguros que se trataba de los 
 
46 
 
segmentos deseados; por lo cual, se llevó a cabo la subclonación de estas 
secuencias en vectores de expresión pQE16 y transformados en células de 
expresión (E.coli M15). 
 
 
6.7 Subclonación de G1-5. 
 
 En las figuras 27 y 28, podemos observar el corte de los segmentos de 
Saf1 y G1-5 respectivamente, con la finalidad de aislar dichas secuencias del 
vector pCRII TOPO y subclonarlas en el vector de expresión pQE16. 
 
 
Fig. 27. Digestión del primer vector pCRII-TOPO, para extraer la secuencia Saf1. 
Carril 3, fraccionamiento del vector y del inserto. 
 
 
 
Fig. 28. Digestión del primer vector pCRII-TOPO, para extraer la secuencia G1-5. 
Carril 1, fraccionamiento del vector y del inserto. 
 
47 
 
 
 La secuencia de Saf1 no pudo ser subclonada debido a que se tuvieron 
problemas en su conservación en glicerol a una temperatura de -70oC, después de 
un tiempo de preservada a esta temperatura se degradó y sólo se pudo identificar 
a G1-5. De G1-5 se obtuvieron 20 muestras de la transformación y se eligió sólo 
una para identificar a la proteína en el gel de poliacrilamida. 
 
 En la figura 29 se muestra la expresión de la dihidrofolato reductasa 
(DHFR), que se utilizó como un control en la expresión. A esta muestra se le 
realizó dos ensayos, en el carril 1 sin inducir con IPTG y en el carril 2 inducida con 
50μl de IPTG, donde se puede ver una mancha que corresponde al control DHFR, 
entre la anhidrasa carbónica y el inhibidor de tripsina. Los carriles 5,6, y 7 son las 
expresiones que se obtuvieron, como se puede ver tienen un grado de expresión 
muy baja. 
 
 
 
Fig. 29. PM marcador de peso molecular, carriles 1 y 2 son controles, el 1 es el ensayo 
con el control DHFR sin el inductor y en el 2 muestra al control DHFR con el inductor de 
IPTG mostrando la expresión de DHFR, los carriles 3,4,5,6,7 muestras de la proteína 
purificada. 
 
 
 
 
 
48 
 
 Desafortunadamente todos los intentos para producir la proteína antigénica 
G1-5 de manera recombinante como subclona en diversos vectores como son 
pQE70, pQE60 y pQE16, fallaron. Basados en otros análisis de la secuencia del 
gene G1-5, podemos notar que esta secuencia tiende a mostrar un 
comportamiento extraño y que a veces es difícil de cortarse con las enzimas de 
restricción que se usaron, otras veces se realizaron los cortes y se obtuvieron los 
insertos esperados, y en posteriores ocasiones nuevamente no se pudieron cortar 
los plásmidos para liberar los insertos. Resultados adicionales de la secuenciación 
de este ADN sugieren que las secuencias pudieran adquirir estructuras 
secundarias. Lo cual nos explique el comportamiento errático para realizar los 
cortes con las enzimas de restricción y las dificultades encontradas y poder 
producir esta proteína G1-5 de manera recombinante en el sistema de E.coli 
usado, en donde la proteína control sí funcionó. 
 
En la figura 30 y siguientes son digestiones que se realizaron a clonas de 
G1-5, el carril 1 contiene al control DHFR, las clonas presentan dos patrones, se 
observan que en los pozos 5, 6, 7, 8, 13, 14 y 15, su desplazamiento es parecido 
al control. Los carriles 2, 4, 9, 12 y 16 se comportan de forma similar, existe un 
fraccionamiento de las bandas. Todas las clonas se digirieron con BamH1 y BglII, 
las cuales pertenecen a una misma transformación, sin embargo al hacerles doble 
digestión, unas fraccionan y otras no. Este ensayo se hizo para comprobar el 
procedimiento y en comparación con las clonas en estudio, el control DHFR sí se 
expresa y algunas clonas se tamizaron en varios fragmentos. 
 
49 
 
 
Fig. 30. En ésta figura se les hizo doble digestión a las clonas con BamH1 y BglII. Todas 
las clonas pertenecen a una misma transformación, se les hizo doble restricción unas 
fraccionan y otras no. 
 
En la figura 31, los carriles 2, 3, 4, 9, 10, 11 y 16 se observa que la banda 
es abundante, las clonas 11, 13 y 15, presentan una menor cantidad. Los números 
de estos pozos, correspondes a las clonas digeridas de la figura 31. 
 
 
 
 
50 
 
 
Fig. 31. En esta figura se observan un tamiz diferente al anterior, en los carriles 2, 3, 4, 9, 
10, 12, 16 se digirieron bajo las mismas condiciones. 
 
 En la figura 32 se hizo doble digestión con las enzimas BamH1 y HindIII, lo 
que se observa es la diferencia entre el vector y los insertos es mínima. 
 
 
Fig. 32. Digestión a las clonas de G1-5 con BamH1 y HindIII. M es marcador de peso 
molecular, en el carril 8 sólo es el vector pQE 16 y en los carriles 2, 3, 4, 9, 10,12, 15, 16 
se ve los dos fragmentos de la incisión. 
 
51 
 
 
7 DISCUSIÓN. 
 
En esta tesis se utilizóla aplicación de herramientas bioinformáticas para la 
identificación de nuevas proteínas antigénicas del genoma de L. major, las cuales 
pueden ser utilizadas eventualmente como blancos terapéuticos nuevos para 
inducir respuesta inmune que proteja contra infecciones de Leishmania. 
 
En el análisis se identificaron alrededor de 15 secuencias de las cuales se 
seleccionaron dos, llamadas Saf1 y G1-5 por sus características antigénicas 
(Figuras 18 y 19), para ser investigadas en esta tesis. 
 
Por los análisis realizados a Saf1 y a G1-5 identificamos que estas 
proteínas contienen epítopes para células T, los cuales además se encuentran en 
regiones hidrofílicas de las moléculas, aumentando la posibilidad de interacción 
con el receptor de los linfocitos T. Estos epítopes de células T, son capaces de 
inducir una respuesta inmune celular citotóxica tipo TH1 (Figuras 13 y 14), la cual 
se considera que media la respuesta inmune más adecuada para eliminar a la 
Leishmania (Awasthi, A.y cols.2004). 
 
El método utilizado para la clonación de los genes que codifican para Saf1 y 
G1-5, fue a partir de ADN genómico y ARN total extraído del parásito en la etapa 
de promastigote, de los cuales se amplificó exclusivamente las secuencias 
esperadas, indicando que no hay otras secuencias relacionadas que se 
amplifiquen con estos oligonucleótidos en el genoma de L. major. 
 
Adicionalmente el análisis por BLAST, mostró que estas secuencias son 
específicas de Leishmania. Por lo que pueden utilizarse con mayor seguridad 
como inmunógenos, descartando la inducción de reacciones cruzadas o 
autoinmunidad por estas proteínas antigénicas, como ocurre en enfermedades 
52 
 
autoimnunes de diabetes mellitus tipo 1, esclerosis múltiple, encéfalomielitis 
autoimnune experimental, neuritis periférica (Abbas, K. A, 2000). 
 
 En la extracción de ADN genómico no hubieron dificultades, se obtuvo 
empleando un equipo de extracción de ADN total siguiendo las indicaciones del 
fabricante (QIAGEN, Cat.No.69504) y se utilizó como templado para la 
amplificación por PCR (Figuras 21 y 22). En éste último paso hubieron dificultades 
en la amplificación y se hicieron varios ensayos con diferentes pares de 
oligonucleótidos hasta que se obtuvo la amplificación, para Saf1 y para G1-5 y el 
que logró amplificar es el mostrado en la figura 21 para Saf1 y 22 para G1-5. 
 
 Los genes seleccionados se amplificaron con oligonucleótidos específicos 
por PCR y en la clonación se utilizó el vector pcRII-TOPO, porque este vector 
tiene residuos sobresalientes de dTTP en el extremo 3´, y permite que los rellenos 
de PCR se liguen eficientemente con el vector, el cual cuenta con el gen lacZ del 
operon LAC y confiere resistencia a ampicilina y a kanamicina. Este sistema nos 
permitió seleccionar las colonias que contienen el inserto diferenciándolas de las 
que tienen una coloración azul (Manual de instrucción Invitrogene, 2004). Éste 
método funcionó adecuadamente, permitiendo la clonación, amplificación y 
manipulación de las secuencias de ADN y realizar las construcciones genéticas 
para producir las proteínas recombinantes. 
 
 Los fragmentos amplificados se pueden ver en la figura 23 para Saf1, en 
este gel no se utilizó marcador de peso molecular, las muestras de la figura 
pertenecen a una misma colonia transformada con el vector pcRII-TOPO. Se eligió 
el producto del carril 2. 
 
 La amplificación de G1-5 corresponde a la figura 24, donde se obtuvieron 4 
muestras, se eligió la número 3, cualquiera de ellas se aproximaba al peso entre 
781 y 865pb. 
 
53 
 
 La secuencia de Saf1 no pudo ser subclonada debido a que hubo 
dificultades en su conservación a una temperatura de -70° C por fallas del 
congelador. La célula transformada con el plásmido después de un tiempo ya no lo 
contenía y a partir de esta situación se continúo con G1-5. 
 
 Debido a un problema durante la secuenciación de G1-5 se encontró que 
forma estructuras secundarias que ocultan los sitios de restricción, dificultando la 
expresión y producción de esta secuencia de manera recombinante. Tal vez estas 
formas caprichosas son las responsables de entorpecer la expresión de la 
proteína en los ensayos (Figura 29). 
 
 Como se puede ver en las figuras de la 30 a la 32, las cuales son 
digestiones para verificar la presencia del inserto en el vector pQE16. En la figura 
31 presenta el inserto, se muestra diferente, se observan dos manchas muy 
definidas y separadas, una corresponde al inserto y la otra al vector. En la figura 
32 se observan las bandas de menor intensidad, y si hacemos una comparación 
de la figura 31 y la 32, hay una diferencia muy marcada, por ejemplo en el carril 
4,5 y 11, se comportan diferentes. Tal vez seria conveniente seguir ensayando con 
las muestras 6 y 7 ya que parecen ser constantes en las tres figuras. 
 
 
 Se ha hecho esta investigación para aportar un conocimiento que ayude a 
controlar esta parasitosis que afecta a nivel mundial, como se mencionó en el 
capitulo de epidemiología que existen varias zonas afectadas en nuestro país 
(Becker, I. 2005). 
 
Los resultados aquí expuestos es una forma de búsqueda de epítopes que 
solamente de la respuesta inmune de tipo TH1, que se ha investigado es la mejor 
respuesta en defensa a este padecimiento pero la dificultad es encontrar los 
antígenos apropiados. En la respuesta inmune se menciona, cómo la Leishmania 
es capaz de evadir esta respuesta de defensa en el humano (Zambrano-Villa y 
54 
 
cols, 2002). Cabe mencionar que se han hecho medicamentos, vacunas utilizando 
diversas modalidades de antígenos para dar protección en contra de este 
protozoario con diferentes antígenos y se ha estudiado el funcionamiento de las 
proteínas de membrana como son gp63, antígenos no proteícos, péptidos 
sintéticos, ADN desnudos, pero no han tenido resultado favorable de protección 
(Hadman, E. y cols, 2001). Además en la Leishmanisis, provocada en ratones 
BALB/c, al disminuir la IL-6, se activan ambas respuestas la TH1 y la TH2, esto se 
ha observado en vacunas contra la Leishmanisis administradas en ratones 
(Rogers, K, A. y cols, 2002). 
 
Ha habido interés en el estudio de proteínas transmembranales parecidas a 
las glicoproteínas, se cree que su función puede ser de transporte de iones 
específicos, metales, nutrientes, metabolitos que atraviesan la barrera membranal. 
Las amastinas de T. cruzi y de Leishmania sp tienen una organización estructural 
similar a las glicoproteínas, pero se caracterizan porque contienen 11 aa 
altamente conservados en un dominio extracelular, lo cual es único en este tipo de 
proteínas. (Rochette, A y cols. 2005). 
 
Cheng, J. y colaboradores en 1999, emplearon una secuencia codificante 
de una amastina de T. cruzi como referencia y a L. major como prueba. Buscaron 
en el banco de genes y en una base de datos (dbEST), hicieron un BLAST y 
tamizaron en una hibridación in situ de una colonia, la homología que obtuvieron 
fue de un 23.5% entre la secuencia de aa de L. major y la de T. cruzi, aunque sí 
pudieron clonar a todo el gene que codifica para la amastina. 
 
 En los últimos Li, J. F y colaboradores, 2007 que han trabajado con 
secuencias similares a G1-5 en L. donovani, denominadas amastinas, utilizaron 
vectores de expresión pcDNA3.1 (+) y la línea de linfocitos T (NIH3T3), para poder 
producir exitosamente de manera recombinante esta proteína de la Leishmania 
que requiere de sistemas biológicos más complejos. 
55 
 
 
 
 La metodología empleada para la búsqueda de nuevas proteínas 
antigénicas usadas en este trabajo sugiere que pueden aplicarse a la totalidad de 
los genomas para encontrar proteínas que contengan epítopes reconocidos por 
las células T que nos permitan seleccionar el tipo de respuesta inmune más 
apropiada, como en este trabajo se seleccionaron proteínas antigénicas que 
contienen los epítopos para células TH1 las cualesson capaces de inducir una 
respuesta de tipo celular citotóxica, que es la respuesta más apropiado para 
eliminar a la Leishmania. 
 
 Seria interesante probar con otros tipos de sistemas de expresiones como 
células de insectos, levaduras o células de mamíferos que pueden ser requeridos 
para obtener una alta producción de proteínas. 
 
 Otros sistemas pueden ser las células de insectos en conjunción con 
vectores de baculovirus que han sido usados ampliamente, estos sistemas se 
basan en la capacidad del baculovirus para infectar y multiplicarse en células 
cultivadas de insecto. El virus más usado para esta metodología es el virus 
Polihedrosis nuclear autographa californica (AcNPV), es un virus lítico que infecta 
a lepidópteros. La forma en que se hace, es tomando un gene extraño, se clona 
dentro del vector de transferencia y luego es transfectado a lo largo del ADN del 
baculovirus de doble hebra dentro de las células del insecto. Este procedimiento 
puede expresar una amplia variedad de proteínas incluyendo proteínas 
plasmáticas y proteínas secretadas (Manual QIAGEN, 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
56 
 
 
8. CONCLUSIONES. 
 
• Se analizaron genes que no han sido estudiados de L. major por medio de 
técnicas bioinformática. 
• Se identificaron dos secuencias codificantes para estas proteínas de 
superficie Saf1 y G1-5. Las cuales contienen epítopes para células T que 
son capaces de inducir una respuesta TH1. 
• Se clonaron las secuencias de Saf1 y G1-5 en pcRII-TOPO. 
• Se secuenciaron los fragmentos clonados y se verificaron mediante un 
BLAST. 
• Se subclonó la secuencia G1-5 en el vector de expresión pQE16, pQE60 y 
pQE70 para tratar de expresar la secuencia G1-5 recombinante en células 
E. coli M15. 
• El método utilizado para la identificación de nuevas proteínas antigénicas 
de L. major, a través del análisis de las secuencias de aminoácidos 
disponibles en el proyecto del genoma de L. major, sí funcionó ya que nos 
permitió identificar a la proteína antigénica, a la cual la denominamos G1-5. 
• La presencia de epítopes para las células de respuesta inmune tipo TH1 en 
estas proteínas antigénicas, las hace interesantes para probar su capacidad 
protectora contra la Leishmaniasis en un modelo experimental como puede 
ser el ratón. 
• Desafortunadamente no se pudo producir las proteínas Saf1 y G1-5 de 
manera recombinante; el empleo de otros sistemas para hacer proteínas 
recombinantes podría resolver los problemas que se tuvieron y producir los 
antígenos encontrados de manera recombínate. 
 
 
 
57 
 
 
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