Estudio-de-la-glutation-reductasa-por-voltamperometria-de-barrido-triangular-de-potencial-con-formacion-de-enlaces-RSHg-en-sistemas-microelectroanaliticos

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
 
ESTUDIO DE LA GLUTATIÓN REDUCTASA POR VOLTAMPEROMETRÍA DE 
BARRIDO TRIANGULAR DE POTENCIAL CON FORMACIÓN DE ENLACES 
RS-Hg EN SISTEMAS MICROELECTROANALÍTICOS 
 
 
 
 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
 
 
 
 
PRESENTA 
Xochiquetzal González Rodríguez 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MÉXICO, D.F. 2007 
 1
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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Jurado asignado: 
 
 Presidente Dr. José Alejandro Baeza Reyes 
 Vocal M en C Luz del Carmen Castellanos Román 
 Secretario Dr. José de Jesús García Valdés 
 1er. Suplente Dra. Martha Patricia Coello Coutiño 
 2o. Suplente Profa. Thalina Alejandra Rodríguez Fernández 
 
 
 
 
Sitio en donde se desarrolló el tema: 
Laboratorio de electroquímica analítica anexo 3F 
 
 
 
 
 
 
 
 
Asesor 
 
 
 
____________________________ 
Dr. José Alejandro Baeza Reyes 
 
 
 
 
 
 
 
 
Sustentante 
 
 
____________________________ 
Xochiquetzal González Rodríguez 
 2
 
Agradecimientos 
Deseo dejar aquí, con palabras, una pequeña una dedicatoria a todos aquellos a quienes aprecio y quiero. 
Carezco sin embargo de elocuencia y lo aquí escrito no puede expresar con exactitud lo que quisiera decir, 
sino ser más bien, tan sólo un pequeño bosquejo de mi sentir, y sin embargo, aquí está, sin un orden de 
importancia particular: 
A mi familia. A mi madre Blanca a quien debo una buena parte de lo bueno que soy, por todo: por todo el 
apoyo, el cariño y el amor que me ha brindado estos años, por estar ahí. A mis hermanas Gab, Lucre y 
Dama por escucharme, aguantarme, darme ánimos, quererme y todo lo demás, a pesar de todo. 
A mi otra familia: mis amigos. 
A “la familia Telerín” y mis compañeros de carrera y de la facultad: Chayo, Gustavo, Chío, José, Salomón, 
Abigail, Dona, Elihú, Toño, Lilian, Rosita, Natyelli, Bety, Israel, Monis, Manuelito, Ángel, Jannú, Roselyn, 
Eduardo, porque sin ellos no sé cómo podría haber terminado cada semestre. Por la compañía, los días de 
estudio, aquellos en los que hicimos prácticas y esos otros en los que no dormimos; las fiestas, los 
intercambios, las reuniones, las risas. Por compartir desvelos, presiones, maestros, clases y laboratorios. 
Porque su compañía hizo más placentera mi estancia en la facultad, deseando muchos años más de 
amistad. 
De nuevo a Gustavo y Rosita por el tiempo que compartimos viviendo juntos en Guadalajara, con todo lo 
que eso implicó. Por aguantarme y por la oportunidad de conocerlos en otras circunstancias. 
A mis otros amigos: Juanma, Octavio, Adrián, Armando, Martín, por el gran cariño que me tienen y que 
tengo por ellos. Por todo el tiempo juntos, por escucharme, por imprimir alegría a mi vida, por quererme, 
apoyarme y aguantarme. Por las salidas al cine y a museos, las reuniones. Por hacer mi vida más feliz y 
placentera y mostrarme otras formas de percibir la vida y muchas otras facetas de la misma. Por darme 
razones para sonreír y ser feliz. Simplemente por ser como son. 
A los que perdí en el camino y ya no están conmigo, vivos, sin embargo, siempre en mi memoria. 
A mi asesor de tesis Dr. Alejandro Baeza por la oportunidad de trabajar en su laboratorio y desarrollar este 
proyecto de tesis. 
A todos los que pasaron por mi vida y sin que me diera cuenta dejaron algo en mí. 
A todos lo que también guardan algún recuerdo de mí. 
A los que me acompañaron en el camino sinuoso y no siempre cierto, de esta etapa crucial de mi vida. 
A todos mis demás amigos que aunque no siempre estuvieron conmigo, siempre tuve presentes: Angélica 
Tenshi, Gelus, Fernando, Abraham, Karen Rangel, Pamela. 
A los compañeros del laboratorio 3F: Karen, Irissol, Eduardo. 
A los que he olvidado mencionar, no haciéndolo con intención. 
A Jannú, el compañero de laboratorio y amigo. Por contagiarme el entusiasmo y la alegría con los que 
procede en todo lo que hace. Por haber podido conocerlo mejor y la esperanza de seguir conociéndolo. Por 
ser como es y todo lo demás que no sé decir. 
A mis profesores de carrera por la formación profesional que recibí; tal vez la mejor que podría haber 
esperado. 
A la UNAM, por todo lo que es y representa, su enorme variedad y riqueza, por la oportunidad que tuve de 
estudiar en ella. Por la forma en que el estudiar en ella influyó sobre mi persona y mi vida. 
En fin, a la vida que ha sido benévola conmigo. 
«Gracias a la vida 
que me ha dado tanto…» 
 
 
 
 
 
 3
 
ORO EN POLVO 
Desde mi adolescencia busqué oro 
en todas las corrientes de la montaña. 
La arena removida alcanzaría 
para urdir un desierto. 
Y nunca hallé el metal. 
Sólo monedas de cobre, 
piedras, huesos pulidos, baratijas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Me voy como llegué. 
No perdí el tiempo. 
La arena que escapó de entre mis manos 
me dio el placer interminable: 
el intento 
 José Emilio Pacheco 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 4
ÍNDICE 
 
Abreviaturas y símbolos………………………………………………………………………………………. 
 
7 
1.0 Introducción 
Planteamiento del problema, objetivo e hipótesis de trabajo……………………………… 
 
 
8 
2.0 Antecedentes 
2.1 Principios de electroquímica………………………………………………………………………. 
2.2 Técnicas electroquímicas a utilizar……………………………………………………………… 
2.2.1 Voltamperometría de barrido lineal (LSV)……………………………………….
2.2.2 Voltamperometría de barrido triangular (CV)…….…………………………… 
2.3 Generalidades del glutatión………………………………………………………………………. 
2.4 Propiedades de la enzima glutatión reductasa…………………………………………….. 
2.5 Principios de cinética enzimática………………………………………………………………… 
2.6 Tipos de ensayos enzimáticos………………………………………………………………………………. 
 
9 
14 
14 
15 
21 
23 
25 
30 
 
3.0 Parte experimental 
3.1 Reactivos………………………………………………………………………………………………… 
3.2 Celda, electrodos y equipos………………………………………………………………………. 
3.3 Estudio de las especies involucradas en la reacción enzimática……………………… 
3.3.1 Programa de perturbación…………………………………………………………… 
3.3.1.1 Voltamperometría de barrido triangular…………………………….
3.3.1.2 Voltamperometría de barrido lineal…………………………………..
 3.4 Ensayos enzimáticos………………………………………………………………………………….
 
 
32 
33 
34 
34 
34 
35 
35 
4.0 Resultados y discusión 
4.1 Electrodo de película de mercurio (EPM)…………………………………………………….. 
4.1.1 Estudio de las especies involucradas en la reacción enzimática……….. 
4.1.1.1 Estudio del GSH…………………………………………………………….. 
4.1.1.2 Estudio del GSSG…………………………………………………………… 
4.1.1.3 Estudio del NADPH………………………………………………………… 
4.1.1.4 Estudio del NAD+…………………………………………………………… 
4.1.2 Ensayos enzimáticos…………………………………………………………………….
4.2 Electrodo de gota de mercurio…………………………………………………………………… 
 4.2.1 Estudio de las especies involucradas en la reacción enzimática……… 
4.2.1.1 Estudio del GSH…………………………………………………………….. 
4.2.1.2 Estudio del GSSG…………………………………………………………… 
 
36 
36 
36 
39 
42 
44 
46 
49 
49 
49 
53 
 5
 4.2.2 Ensayos enzimáticos…………………………………………………………………… 
4.3 Cálculo de los parámetros cinéticos de la enzima GR…………………………………… 
 
54 
58 
5.0 Conclusiones…………………………………………………………………………………………………… 60 
 
6.0 Anexos 
A. Construcción del electrodo de quasi referencia (EQR) de Ag0/AgCl…… 
B. Estudio del GSH con electrodo de disco de grafito……………………………… 
 
 
61 
617.0 Bibliografía……………………………………………………………………………………………………… 
 
63 
 
 6
ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS 
 
Abreviatura o 
símbolo Término 
AE Actividad enzimática 
CV Voltamperometría de barrido triangular 
E Potencial 
e- Electrón 
E° Potencial formal 
E°’ Potencial formal condicional 
EA Electrodo auxiliar 
ECS Electrodo de calomel saturado 
Ef Potencial final 
Ei Potencial de inicio de barrido 
ENH Electrodo normal de hidrógeno 
Ep Potencial de pico 
Epa Potencial de pico anódico 
Epc Potencial de pico catódico 
EPM Electrodo de película de mercurio 
EQR Electrodo de quasi referencia 
ER Electrodo de referencia 
ES Complejo sustrato-enzima 
ET Electrodo de trabajo 
Eλ Potencial de inversión 
ΔEp Diferencia entre potenciales de pico 
FAD Flavin adenin dinucleótido 
GR Enzima glutatión reductasa 
GSH Glutatión reducido 
GSSG Glutatión oxidado 
I Intensidad de corriente 
I/E Curvas de intensidad de corriente-potencial 
Ip Corriente de pico 
Ipa Corriente de pico anódico 
Ipc Corriente de pico catódico 
Km Constante de Michaelis-Menten 
LSV Voltamperometría de barrido lineal 
M Concentración molar 
mM Concentración milimolar 
n Número de electrones 
NAD+ Dinucleótido de adenina β-nicotinamida oxidado 
NADP+ Fosfato de dinucleótido de adenina β-nicotinamida oxidado 
NADPH Fosfato de dinucleótido de adenina β-nicotinamida reducido 
[S] Concentración de sustrato 
T Temperatura 
t Tiempo 
TRIS Tris-hidroximetil amino metano 
UV Ultravioleta 
v Velocidad de barrido; velocidad de una enzima 
Vmax Velocidad máxima de una enzima 
η Sobrepotencial 
 
 7
1.0 INTRODUCCIÓN 
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 
Planteamiento del problema 
En la determinación de los parámetros cinéticos de enzimas se usa principalmente la espectrofotometría 
UV y visible. Se han reportado también el uso de técnicas cromatográficas como el HLPC (cromatografía 
de líquidos de alta resolución). (21) 
En el área de la enzimología no se encuentra muy difundido el uso de técnicas electroquímicas para el 
estudio de las cinéticas enzimáticas. Se encuentra reportado el uso de la polarografía clásica para el 
estudio de especies que contienen grupos sulfhidrilos. Algunas ventajas de los métodos electroquímicos 
con respecto a otros, es el mínimo tratamiento que es necesario dar a la muestra, lo cual disminuye el 
tiempo de análisis y la pérdida de analito. Otra ventaja posible es la disminución de interferencias de la 
señal de otras especies, además de la miniaturización de los equipos lo cual disminuye la cantidad de 
reactivos que se utilizan. 
La propuesta de esta tesis es el uso de métodos electroquímicos para estudios enzimáticos, en particular 
para la determinación de los parámetros cinéticos de enzimas. Se ha enfocado especialmente en el 
estudio de la enzima glutatión reductasa y las especies de glutatión, puesto que se ha incrementado en 
los últimos años el interés por éstos, ya que se ha encontrado que son indicadores de estrés oxidativo en 
los organismos, además de que la exposición a ciertos agentes xenobióticos incrementa la actividad de la 
enzima glutatión reductasa. (22)
 
Objetivos 
• Estudiar el comportamiento electroquímico de las especies GSSG, GSH, NADPH y NAD+, por 
voltamperometría de barrido triangular de potencial. 
• Monitorear la evolución de la reacción enzimática catalizada por la enzima glutatión reductasa en 
microceldas electroquímicas. 
• Determinar los parámetros cinéticos de la enzima glutatión reductasa (GR) por métodos 
electroquímicos (voltamperometría de barrido triangular de potencial y voltamperometría de 
barrido lineal) a nivel microescala. 
 
Hipótesis de trabajo 
El producto de la reacción de la enzima glutatión reductasa (GR), el glutatión en su forma reducida (GSH), 
es una especie electroactiva en electrodo de mercurio. Esta característica hace que sea posible monitorear 
la evolución de la reacción catalizada por dicha enzima empleando metodologías electroquímicas, como es 
la voltamperometría de barrido triangular de potencial y de barrido lineal, siguiendo el incremento de la 
concentración del GSH; y de este modo determinar los parámetros cinéticos de la enzima: la velocidad 
máxima (Vmax) y la constante de Michaelis-Menten (Km) 
 8
ANTECEDENTES 
 
2.0 ANTECEDENTES 
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 
2.1 PRINCIPIOS DE ELECTROQUÍMICA 
En una concepción muy general podemos decir que la información de un sistema electroquímico 
se obtiene al aplicar una perturbación eléctrica y observando los cambios en las características 
del sistema. Existen diferentes tipos de perturbaciones de acuerdo a la técnica electroquímica.(1) 
 
De acuerdo a los programas de perturbación, las técnicas electroquímicas se clasifican como 
E=f(t) e I=f(t), es decir, la imposición ya sea de potencial o de intensidad de corriente 
respectivamente; dicha imposición se puede realizar mediante pulsos de potencial (técnicas 
electroquímicas potenciostáticas) o de intensidad de corriente (galvanostáticas), además se 
pueden realizar mediante un barrido de potencial (potenciodinámico) o de intensidad de 
corriente (galvanodinámico)(1): 
TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS
POTENCIOSTÁTICAS GALVANOSTÁTICAS 
POTENCIODINÁMICAS GALVANODINÁMICAS
E= f(t) I=f(t) 
PULSOS DE:
BARRIDO DE:
POTENCIAL INTENSIDAD DE CORRIENTE 
POTENCIAL INTENSIDAD DE CORRIENTE
 
Figura 2.1 Clasificación de las técnicas electroquímicas (1) 
 
Las técnicas empleadas para la parte experimental de la presente tesis fueron la 
voltamperometría de barrido triangular de potencial (CV) y la voltamperometría de barrido lineal 
(LSV), las cuales corresponden a las técnicas electroquímicas potenciodinámicas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 9
ANTECEDENTES 
 
CELDA ELECTROQUÍMICA 
Las mediciones electroquímicas se llevan a cabo en celdas electroquímicas las cuales consisten 
de al menos dos electrodos y un electrolito. Por electrodo se entiende la interfase en la cual hay 
intercambio de transferencia de carga electrónica (movimiento de electrones), y por electrolito 
se entiende un medio a través del cual tiene lugar la transferencia de carga iónica (movimiento 
de iones). En un sentido menos formal, se usa electrodo para designar al conductor electrónico 
y electrolito para indicar el conductor iónico en una celda electroquímica. (2)
Se ha mencionado que el número mínimo de electrodos en la celda electroquímica es dos, sin 
embargo en las celdas usadas para métodos dinámicos, cuando una corriente significativa fluye 
por la celda, se emplean tres electrodos: un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y 
un electrodo auxiliar.(2) 
La siguiente figura ilustra el arreglo general de una celda electroquímica de tres electrodos: 
 
Figura 2.2 Diagrama esquemático de una celda de tres electrodos. 
Muestra los símbolos comúnmente usados para los electrodos (3)
 
 
El electrodo de trabajo (ET), es el electrodo en el cual van a tener lugar los fenómenos 
electroquímicos que serán investigados. Su función es servir como región para las mediciones 
electroquímicas. Las variaciones en las propiedades del ET (potencial, corriente) se relacionan con la 
concentración del analito de interés. Puede estar construido de Au°, Pt°, C°, Hg° o cualquier otro 
material conductor que sea electroquímicamente inerte en el tramo de potencial barrido. Por inerte 
se refiere a que el electrodo no presente reacciones de oxidación o reducción en un intervalo de 
potencial más o menos amplio. Una especificación para el ET es que tenga un área fija, ya que la 
superficie del electrodo determina en parte la intensidad de la corriente medida. (2, 3, 4) 
 
 10
ANTECEDENTES 
Ya que el potencial del ET variará con respecto al programa de perturbación que se le aplique, 
es necesario tener un electrodo cuya composición y potencial sean conocidosy constantes. 
 
Este segundo electrodo es el electrodo de referencia (ER). Su potencial ha de ser lo 
suficientemente constante como para tomarlo como estándar de referencia contra el cual se 
medirán los potenciales del ET. Esto significa que el cambio en su potencial con respecto a la 
corriente, el tiempo u otras variables ha de ser lo suficientemente pequeño como para que las 
mediciones no se vean afectadas. Asimismo no debe sufrir cambios entre uno y otro 
experimento. Debido a que el potencial del electrodo de referencia es constante, cualquier 
cambio medido en el potencial de la celda se deberá a la contribución del electrodo de 
trabajo.(2,4) 
El electrodo de referencia adoptado por convención internacional para expresar los potenciales 
de electrodo relativos para las soluciones acuosas, es el electrodo normal de hidrógeno (ENH) 
que corresponde al sistema electroquímico 
2H+ + 2e- ⇌ H2
en condiciones estándar, es decir: solución de pH=0, saturado de hidrógeno gaseoso a presión 
de 1 atmósfera y electrodo de platino. 
En la práctica el ENH es de difícil utilización, lo cual ha llevado a preferir electrodos de referencia 
basados en otros sistemas electroquímicos más cómodos que el de hidrógeno. Para las 
soluciones acuosas, los dos principales son: el electrodo de referencia de calomel saturado 
(ECS), constituido por el sistema calomel (cloruro mercuroso)/mercurio/ cloruro de potasio 
Hg2Cl2↓ + 2e- ⇌ 2Hg° + 2Cl-
y el electrodo de referencia de cloruro de plata, constituido por el sistema plata/cloruro de 
plata/cloruro de potasio 
AgCl↓ + e- ⇌ Ag↓ + Cl-
Una variante del electrodo de referencia de cloruro de plata, consiste en el alambre de plata 
recubierto de cloruro de plata sin la fase acuosa saturada de cloruro de potasio. Las ventajas de 
estos electrodos de plata/cloruro de plata, es que son pequeños y generalmente no contaminan 
significativamente el medio en el que están inmersos. La desventaja es que sus propiedades 
termodinámicas dependen de las propiedades físicas de la sal de plata, por lo tanto del método 
de deposición de la misma. (5) 
 
 11
ANTECEDENTES 
Las mediciones potenciométricas precisas requieren electrodos de referencia que sean 
altamente reproducibles, pero hay muchas aplicaciones en las cuales esto es menos esencial. 
Por ejemplo, en mediciones polarográficas o voltamperométricas de rutina, es más importante la 
exactitud de la medición de la corriente que medir el potencial con precisión. Para estos 
propósitos es posible emplear un electrodo de quasi-referencia (EQR) apropiado. El potencial de 
este electrodo, aunque desconocido, no cambiará durante las mediciones. Un electrolito soporte 
que contenga haluros, un alambre de plata o una posa de mercurio, adoptan un potencial 
constante razonable que es reproducible con ±10 -20mV. (6) 
El potencial del EQR contra un electrodo de referencia real puede calibrarse reportando los 
potenciales medidos con el EQR con respecto éste. Típicamente, la calibración se lleva a cabo 
simplemente midiendo (p. ej. por voltamperometría) el potencial estándar o formal contra el 
EQR de un par cuyo potencial estándar o formal ya es conocido, contra una referencia real bajo 
las mismas condiciones. Los potenciales entonces pueden ser reportados con referencia al par 
estándar o corregido a una escala común. (6, 7)
Si se hace pasar una corriente a través del electrodo de referencia, en los métodos 
electroquímicos dinámicos, esto puede hacer que el potencial y/o composición del electrodo de 
referencia se altere y, por lo tanto, ya no cumpla su función de servir como estándar de 
referencia. Para evitar este fenómeno, se utiliza un tercer electrodo en la celda electroquímica. 
Dicho tercer electrodo es el contraelectrodo, también conocido como electrodo auxiliar (EA). Se 
emplea para cerrar el circuito y que la corriente pueda pasar a través de la celda. En general no 
se mide o conoce su corriente ni su potencial, asimismo, tampoco se estudian las reacciones que 
ocurren alrededor de él. El electrodo auxiliar puede ser cualquiera conveniente, ya que sus 
propiedades electroquímicas no afectan el comportamiento del electrodo de interés. 
Generalmente, se elige un electrodo que no produzca sustancias por electrólisis que alcancen el 
electrodo de trabajo y cause reacciones interferentes, es decir que sea lo más inerte posible en 
el intervalo de trabajo. (2, 4, 7)
En este arreglo de tres electrodos la diferencia de potencial se aplica entre el electrodo de 
trabajo ET y el contraelectrodo (electrodo auxiliar EA), mientras que el potencial del electrodo 
de trabajo se evalúa contra el electrodo de referencia ER. De este modo la corriente fluye entre 
el ET y el EA, y no entre el ET y el ER, con lo que se evita la polarización del ER y su potencial 
no se ve alterado debido al paso de corriente a través de él. (4, 8) 
 
 12
ANTECEDENTES 
 
La función del electrodo de trabajo no puede combinarse con alguno de los otros electrodos, 
esto es, siempre existe como un electrodo físico separado, pero las funciones de los otros dos 
electrodos a veces pueden combinarse de tal forma que sólo uno de los dos electrodos físicos se 
encuentra en el sistema. Tiene la ventaja de ser muy conveniente, particularmente en la 
geometría de la celda y la instrumentación externa de la misma. Las desventajas son que las 
funciones del ER y el EA pueden ser incompatibles y la estabilidad deseada del ER se verá 
afectada por el paso de la corriente requerida del EA. (2) 
Otro componente importante en las celdas electroquímicas es el electrolito soporte. Se trata de 
una sal iónica inerte que se adiciona al disolvente, generalmente 10 ó 100 veces más 
concentrada que las especies en estudio. Inerte significa que no presente señales de oxidación o 
reducción en el electrodo de trabajo o el de referencia durante el curso de las mediciones 
electroquímicas, ni en el intervalo de trabajo. Tiene tres funciones. La primera de ellas es 
conducir la corriente a través de la celda, ya que su concentración es mucho mayor que las 
otras especies en solución. Esto sirve para completar el circuito de la celda electroquímica y 
mantener en un valor bajo la resistencia de la misma. La segunda función es mantener la fuerza 
iónica constante. La tercera función es suprimir el aporte de la corriente de migración del 
electroanalito. Cuando una especie electroactiva migra por efecto de la diferencia de potencial 
entre el ET y el EA, dicho movimiento de carga se detecta como una intensidad de corriente, lo 
cual se conoce como corriente de migración. La migración de la especie electroactiva se reduce 
por la presencia de un gran exceso de iones que no son electroactivos en el intervalo de trabajo 
ya que estos pueden transmitir la corriente iónica sin que haya conversión electrónica y por lo 
tanto no de mide una intensidad de corriente en los electrodos.(2)
 
En la práctica, para medios acuosos se utilizan como electrolitos soporte cloruro de potasio (KCl) 
y nitrato de potasio (KNO3). Cuando se utiliza electrodo de mercurio se presenta interferencia 
por la presencia del ion Cl-, de ahí que en esos casos se prefiera usar KNO3. (2) 
 
 
 
 
 
 
 
 13
ANTECEDENTES 
 
2.2 TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS A UTILIZAR 
2.2.1 VOLTAMPEROMETRÍA DE BARRIDO LINEAL (LSV) 
Voltamperometría es una técnica electroanalítica en la cual el parámetro controlado es el 
potencial del electrodo de trabajo, el cual se varía con el tiempo, y la corriente que fluye a 
través del electrodo indicador es el parámetro medido. (2) 
Si se elabora el gráfico de la intensidad de la corriente medida en función del potencial aplicado 
I=f(E) las curvas obtenidas se denominan curvas de intensidad de corriente–potencial, I/E. 
En la voltamperometría de barrido lineal LSV (por sus iniciales en inglés Linear Sweep 
Voltammetry), se mide la intensidad de corriente de un sistema en función delbarrido de 
potencial aplicado al mismo. En esta técnica el potencial de trabajo se modifica linealmente 
hasta un valor predeterminado. (2, 8) 
El programa de perturbación que se emplea para la voltamperometría de barrido lineal y la señal 
que se produce se muestran a continuación 
 
Figura 2.3 Programa de perturbación y señal generada para voltamperometría de barrido lineal (4)
 
Las curvas intensidad de corriente–potencial (I/E) para voltamperometría de barrido lineal (LSV) 
presentan picos en los valores de potencial a los cuales las especies electroactivas presentan 
oxidaciones o reducciones. Debido al rápido barrido de potencial, ocurre un agotamiento de la 
especie electroactiva alrededor de la superficie del electrodo y la forma de la curva I= f(E) es de 
un pico. Durante las mediciones en la celda electrolítica el movimiento de las sustancias desde el 
seno de la solución hacia la superficie del electrodo y lejos del mismo, se debe sólo al gradiente 
de concentración, puesto que en esta técnica no se aplica agitación a la solución. (8, 9)
 
 14
ANTECEDENTES 
El potencial del pico es característico de la especie en estudio y su altura es proporcional a la 
concentración de la misma en el seno de la solución. Por otra parte la altura del pico se 
incrementa con la velocidad de barrido de potencial. (8) 
La voltamperometría de barrido lineal se emplea para análisis cuantitativos y cualitativos. Tiene 
un límite de detección razonablemente bajo, aproximadamente de 10-5 M. La sensibilidad se 
puede incrementar aumentando la velocidad del barrido y aplicando un programa diferencial de 
pulsos. (8) 
 
 
2.2.2 VOLTAMPEROMETRÍA DE BARRIDO TRIANGULAR (CV) 
Se trata de una extensión lógica de la voltamperometría de barrido lineal. Al igual que esta última, 
en la voltamperometría de barrido triangular CV (por sus iniciales en inglés Cyclic Voltammetry) 
también se mide la intensidad de corriente que fluye por un sistema en función del potencial, sin 
embargo la diferencia consiste en que el programa de perturbación es un potencial triangular, o 
dicho de otro modo, el barrido de potencial del electrodo de trabajo se efectúa de un lado a otro 
entre dos valores establecidos, a los cuales se les conoce como potenciales de inversión (Eλ). (2, 8)
En la siguiente figura se muestra la forma del programa de perturbación para esta técnica y la señal 
que se genera a partir de aquél. 
 
Figura 2.4 Diagrama de bloques de un instrumento destinado a la voltamperometría de barrido triangular (4) 
 
Las técnicas de barrido rápido en las cuales se revierte la dirección del barrido de potencial se 
conocen como técnicas cíclicas. En estas técnicas se modifica el potencial con el tiempo sobre el 
intervalo de barrido de potencial, desde el primer valor de potencial preestablecido hasta el segundo 
valor predeterminado y entonces se invierte el sentido del barrido regresando hasta el potencial 
inicial (Ei). La velocidad del barrido de avance y regreso generalmente es la misma. (8)
 15
ANTECEDENTES 
Cuando el barrido se realiza incrementado el potencial, se le suele llamar barrido anódico o positivo, 
y cuando se realiza en la dirección contraria se le conoce como barrido catódico o negativo. Para 
registrar un voltamperograma cíclico, se traza la gráfica de la corriente resultante de ambos 
barridos.(8)
La voltamperometría de barrido triangular puede realizarse en un solo ciclo (ciclo simple) o en modo 
multicíclico, dependiendo del electrodo, la reacción en estudio y la información requerida. En muchos 
casos el voltamperograma obtenido para el primer y último barrido no es idéntico. Cuando se traza 
sólo un ciclo se le llama voltamperometría de barrido triangular, mientras que se denomina 
voltamperometría cíclica a la variante multicíclica, cuando se realiza más de un ciclo.(2)
Al igual que la voltamperometría de barrido lineal, la voltamperometría cíclica presenta picos porque 
el barrido de potencial se hace tan rápido que el experimento aísla la zona alrededor del electrodo de 
la disolución global. Se llega al máximo de la señal y después la intensidad de corriente comienza a 
decaer conforme se incrementa el potencial. Este decremento ocurre porque el analito comienza a 
agotarse cerca de la superficie del electrodo y la difusión del seno de la solución es muy lenta como 
para renovar la concentración en los alrededores del electrodo. La sustancia formada en la superficie 
del electrodo en el proceso de reducción puede ser oxidada nuevamente cuando se revierte la 
dirección del barrido. (10, 8) 
El voltamperograma de barrido triangular de un sistema redox reversible es como el que aparece en 
la siguiente figura: (2) 
 
Epa
Ipa
I 
Epc
Ipc
– – +
Figura 2.5 Voltamperograma de un sistema reversible (2) 
En este esquema la oxidación ocurre durante el barrido anódico y el producto oxidado es 
reducido durante el barrido catódico. (8) 
 
 16
ANTECEDENTES 
Los parámetros medidos en voltamperometría de barrido triangular son los potenciales de pico 
anódico y catódico Epa y Epc, y las intensidades de corriente de pico anódico y catódico Ipa y Ipc. Las 
variables independientes son la velocidad de barrido y el intervalo de potencial en el cual se realiza el 
barrido.(2)
 
En un sistema reversible, la diferencia entre los potenciales de pico anódico y catódico está 
expresada por la siguiente ecuación a 25°C (8) 
n
EEE pcpap
059.0
=−= 
Un par redox reversible se puede identificar a partir de su voltamperograma cíclico, midiendo la 
diferencia de potencial de cada uno de sus dos picos. El promedio de los potenciales de los dos picos 
(también llamado potencial de medio pico E1/2) corresponderá al potencial formal de electrodo (E°) 
del par redox. (8) 
2/12
E
EE
E papc =
+
=° 
La altura del pico anódico y catódico es la misma para un sistema reversible. La intensidad de 
corriente de pico de un proceso rápido está determinada por la ecuación de Randles-Ševčik, 
Ip= 2.72x105n3/2D1/2Av1/2C0 
según la cual la corriente de pico Ip depende de la concentración del analito en la solución C0, el 
coeficiente de difusión de la sustancia D, el área del electrodo de trabajo A, el número de electrones 
que participan en el proceso al electrodo n y la velocidad del barrido de potencial v (8, 9). 
El término reversible aplicado en electroquímica a las reacciones redox, significa que dicha reacción 
se produce con facilidad en un sentido o en otro. Consecuentemente se deduce que la reversibilidad 
electroquímica requiere que tanto las especies oxidadas como las reducidas sean químicamente 
estables (si cualquiera de ellas siguiera reaccionando no estaría presente para ser oxidada o reducida 
de una forma repetitiva). Otro requisito para la reversibilidad electroquímica es que la velocidad de 
transferencia de electrones, tanto para la oxidación como para la reducción, sea extremadamente 
rápida. En este sentido pocas reacciones electroquímicas son realmente reversibles. (3) 
 
Las reacciones rápidas y reversibles se conocen también como reacciones nernstianas, ya que 
obedecen a la ecuación de Nernst: 
Red
Oxo
C
C
n
EE ln06.0+= 
 
 17
ANTECEDENTES 
Una reacción al electrodo se considera reversible desde el punto de vista electroquímico si la 
reacción es rápida, esto es, si el intercambio de electrones entre el electrodo y la especie 
electroactiva durante la reacción electroquímica es rápido. 
En un sistema no reversible la velocidad de intercambio de electrones entre el electrodo y la especie 
electroactiva es lento, por lo cual los potenciales de los picos anódico y catódico se encuentran más 
separados en comparación con los sistemas reversibles. Con el incremento de la irreversibilidad los 
picos se apartan más y finalmente uno de ellos desaparece, indicando que la reacción inversa no 
tiene lugar. (11, 25)
Para sistemas no reversibles el potencial de pico de un proceso de reducción estádesplazado 
hacia potenciales más negativos con respecto al potencial formal, mientras que el pico de una 
oxidación está desplazado hacia potenciales más positivos. 
Para estos sistemas es necesario aplicar un potencial mayor que el potencial formal del par 
redox para que ocurra la reacción correspondiente con una intensidad de corriente determinada. 
Dicho potencial extra se llama sobrepotencial, η.(24)
η= Ep -E0 
Entonces, bajo condiciones electroquímicas, un proceso al electrodo es reversible cuando el 
sobrepotencial es igual a cero. 
Debido a que el sobrepotencial de un sistema redox no reversible puede presentarse sólo en la 
reducción o sólo en la oxidación, o bien, que ambos procesos presenten un sobrepotencial de 
diferente magnitud, sólo para un sistema reversible el potencial de medio pico, E1/2, está centrado 
en Eº, esto es (26) 
°=
+
= E
EE
E papc
22/1
 
Los términos rápido y lento de la reacciones al electrodo son caracterizaciones relativas y no 
absolutas; las definiciones y criterios no dependen únicamente del sistema químico en cuestión, sino 
también del tipo de técnica electroquímica usada para el estudio de la reacciones, la velocidad de la 
misma y de las condiciones experimentales, tales como el medio de reacción en el cual se realiza el 
análisis. 
 
En el caso de un sistema lento el pico anódico y catódico están más separados que para un sistema 
rápido. Con un sistema extremadamente lento, incluso totalmente irreversible, el voltamperograma 
no hace aparecer uno de los dos picos, indicando que la reacción inversa no tiene lugar. (11)
 
La figura 2.6 muestra el efecto de la irreversibilidad sobre los voltamperogramas. 
 
 18
ANTECEDENTES 
 
 n
0.059
=Δ pE
Ipa
 Epc 
Epa
Ipc
Figura 2.6 Diferentes aspectos del los voltamperogramas cíclicos según la rapidez del sistema. 
(a)Caso de un sistema rápido, (b) sistema quasi rápido, (c) sistema muy lento, 
(d) reacción totalmente irreversible (11) 
 
La voltamperometría de barrido triangular es entonces útil para analizar los mecanismos de las 
reacciones al electrodo. También es capaz de detectar intermediarios inestables de la reacción al 
electrodo. Esto la hace una técnica muy versátil y útil, e ideal para estudiar mecanismos de 
reacciones de óxido-reducción, porque, mientras una voltamperometría de barrido lineal 
muestra sólo uno de los procesos (oxidación o reducción de la especie electroactiva), esta 
técnica permite observar si es reversible la conversión del intermediario producido en el barrido 
de regreso. (8, 2) 
 
 19
ANTECEDENTES 
El interés principal de la voltamperometría cíclica reside en la posibilidad de efectuar, a partir de 
una sustancia electroactiva, un análisis de los procesos electroquímicos de esta sustancia, en los 
dos sentidos de la reacción (oxidación y reducción). Adicionando el factor de la velocidad de 
barrido de potencial (el efecto de la cinética de reacción puede ser observada en los valores de 
más elevados de esta velocidad), este análisis aporta información cuantitativa sobre la 
reversibilidad de las reacciones y la rapidez de los sistemas. Esta característica hace que se 
considere este método como el más apropiado para el estudio de los procesos de reacción en 
electroquímica. (11) 
 
La voltamperometría de barrido lineal (LSV) y la voltamperometría de barrido triangular (CV) se 
han empleado para estudiar mecanismos de los procesos al electrodo. Es una herramienta 
poderosa para la determinación de potenciales formales de pares redox. Se ha encontrado uso 
particular en investigaciones de mecanismos de oxidación y reducción de compuestos orgánicos. 
A partir de la intensidad de corriente de oxidación y reducción y de los potenciales de pico, se 
puede obtener información sobre la reversibilidad o irreversibilidad del sistema y de las 
reacciones que acompañan al proceso en el electrodo. (9) 
 
Si la forma de uno de los picos en el voltamperograma es inusual, probablemente la reacción 
electroquímica esté complicada por un proceso en la superficie. La CV es especialmente sensible 
a los fenómenos de adsorción y es una herramienta útil para caracterizarlos. Así, la localización 
de Ep con respecto a Eo depende de la fuerza relativa de adsorción de la especie oxidada y la 
reducida. Si la fuerza de adsorción de ambos es igual, el Ep es igual al Eo. Si el oxidante se 
adsorbe con mayor fuerza, la señal se desplaza hacia potenciales negativos con respecto a la 
posición donde ocurriría la señal reversible; en cambio si el reductor se adsorbe con más fuerza, 
la señal aparece a potenciales más positivos que Eo. (7, 25) 
 20
ANTECEDENTES 
 
 
2.3 GENERALIDADES DEL GLUTATIÓN 
 
El tripéptido glutatión (GSH) (γ-L-Glu-L-Cys-Gly) es el compuesto tiolado no proteico intracelular 
más abundante en células de mamíferos. Su concentración dentro de las células generalmente 
es de 1-5 mM. Las características más interesantes del glutatión es la unión γ-glutamil y la 
presencia de un grupo SH libre. Este último puede ser oxidado para formar un puente disulfuro 
uniendo a dos moléculas de glutatión. (12)
 E°’ (pH 7)= -0.25 
V 
++ +⎯→⎯++ NADP2GSHHNADPHGSSG GR
 
El GSH también está presente se presenta en su forma oxidada como un dímero unido por un 
puente disulfuro GSSG, la forma oxidada del GSH. 
La inactivación de proteínas (P) que tienen grupos SH libres a través de la formación oxidativa 
de disulfuros mixtos: 
P–SH + P’–SH + ½ O2 ⇌ P–S–S–P’ + H2O 
se invierte mediante intercambio de disulfuros con el GSH 
 
La reacción redox expuesta anteriormente para el glutatión ha hecho que se enfoque la atención 
en éste como un agente reductor, cuya principal función es mantener reducidos los grupos SH 
de las proteínas. 
De forma más importante, el GSH tiene funciones como antioxidante con un papel crucial como 
removedor de radicales libres tóxicos y detoxificación de xenobióticos. Forma conjugados con los 
agentes xenobióticos, catalizado por enzima glutatión S transferasa, lo cual los prepara para su 
eliminación. Otras funciones incluyen mantener el potencial redox tiol dentro de las células por 
la reducción de grupos tioles de proteínas, transporte y almacenamiento y como cofactor en 
ciertas reacciones de isomerización. El GSH actúa como coenzima en muchas reducciones 
catalizadas enzimáticamente y juega un papel importante en el transporte de aminoácidos en 
 21
ANTECEDENTES 
ciertas células. Datos de investigaciones recientes sugieren que el GSH también tiene un papel 
en la transducción de señales, proliferación celular, regulación en la expresión de genes y 
apoptosis. Además, el GSH también aparece jugando un papel en varios procesos celulares 
como metabolismo de DNA y RNA, síntesis de proteínas, activación de ciertas enzimas y 
respuesta inmune. (13, 14, 15)
 
Varias enfermedades humanas están asociadas con deficiencias en el metabolismo de glutatión. 
Una de las más notables es la deficiencia de la enzima glutatión sintetasa, que se caracteriza por 
acidosis grave, hemólisis y daños al sistema nervioso central. (20)
 
 
 
 
Glutamato 
L-Cisteinil-glicina 
γ-Glutamiltransferasa 
Cisteína 
Cys-Gly dipeptidasa 
Glicina 
Tiol transferasa 
Glicina 
GSH 
Sintetasa 
Glutamato 
Glutatión S-transferasa 
γ-glutamilcisteína
Cisteína 
GSH Peroxidasa γ-Glutamiltransferasa GSH Reductasa
Glutamato 
R S-Alanilglicina
Cys-Gly dipeptidasa
Glicina ROS producidos por ETC
R S-Alanina 
Acetil-CoA 
Cisteína-S-conjugado
N-acetiltransferasa 
R-S-Mercapturonato
Figura 2.7 Representación esquemática de las diferentes vías involucradas en el metabolismo del GSH. 
(14) 
 
Los niveles de glutatión en su forma reducida se mantienen por la acción de la flavoproteína 
glutatión reductasa (GR). 
 
 22
ANTECEDENTES 
 
 
2.4 PROPIEDADES DE LA ENZIMA GLUTATIÓN REDUCTASA 
La glutatión reductasa es una enzima casi ubicua que catalizala reducción dependiente de 
NADPH del disulfuro de glutatión (GSSG) a glutatión reducido (GSH) (13) 
 
Figura 2.8 Reacción de la enzima glutatión reductasa 
 
Este proceso normalmente produce una relación GSH:GSSG mayor a 100:1, lo cual permite que 
el GSH funcione como un agente reductor intracelular. La glutatión reductasa es miembro de 
una familia de disulfuro oxidorreductasas que catalizan una variedad de diferentes reacciones de 
óxido-reducción.(13)
Esta enzima contiene el grupo prostético transferidor de electrones flavin adenin dinucleótido 
(FAD). La reacción de la glutatión reductasa involucra la transferencia simultánea de 2 
electrones, así que, en este caso, el FAD nunca asume su forma radical. La glutatión reductasa 
experimenta un pequeño cambio estructural durante su ciclo catalítico. Es una enzima disulfuro 
oxidorreductasa, una familia de proteínas homólogas cuyos miembros son al menos diméricos, 
dependientes de NAD(P)H, contienen FAD que, en muchos casos, tiene un grupo disulfuro redox 
activo. (13)
La glutatión reductasa de los eritrocitos humanos es un dímero de subunidades idénticas de 478 
residuos unidos covalentemente por un enlace disulfuro. En ausencia de GSSG, la enzima E 
cataliza el primer paso de una reacción de dos pasos: (13) 
 
 23
ANTECEDENTES 
 Primer paso: E + NADPH + H+ ⇌ EH2 + NADP+ 
donde E representa la glutatión reductasa completamente oxidada y EH2 es un intermediario 
estable reducido de dos electrones. Con la subsiguiente adición de GSSG, EH2 reacciona para 
formar productos y completar el ciclo catalítico. (13) 
 
Segundo paso: EH2 + GSSG ⇌ E + 2GSH 
 
Así, en la primera etapa de la reacción de la glutatión reductasa, el NADPH reduce el disulfuro 
redox-activo de la enzima y en la segunda etapa este disulfuro reducido reduce el GSSG a 2 
GSH. (13) 
 
 
 24
ANTECEDENTES 
 
2.5 PRINCIPIOS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA 
En el mecanismo enzimático más simple, la enzima y su sustrato forman un complejo reversible 
enzima-sustrato (ES) conocido como complejo de Michaelis, el cual puede descomponerse 
irreversiblemente para formar producto y regenerar la enzima. La velocidad de formación de 
producto se expresa por la ecuación de Michaelis-Menten, la cual se deriva de asumir que la 
concentración del complejo de Michaelis es constante, esto es, se encuentra en un estado 
estacionario. 
k1 k2 
E + S ⇌ ES → E + P 
 
La ecuación de velocidad para el sistema unireactivo sencillo puede reordenarse para obtener la 
ecuación más conocida de Henri-Michaelis-Menten: (16) 
][
][
max SK
S
V
v
m +
= 
 
En esta ecuación Vmax representa la velocidad máxima que se observaría si toda la enzima se 
presentara como el complejo ES, [S] es la concentración de sustrato y Km es la constante de 
Michaelis. La representación gráfica de la ecuación anterior es una hipérbola rectangular con límites 
de Vmax y Km. 
 
 
v
Figura 2.9 Velocidad de reacción v graficada en función de la concentración de sustrato [S] 
para una reacción que obedece la cinética de Michaelis-Menten (13)
 
 
 
 25
ANTECEDENTES 
La ecuación de Henri-Michaelis-Menten nos da la velocidad instantánea o velocidad inicial respecto 
de Vmax para una concentración de sustrato dada. La ecuación es válida sólo si v se mide en un 
tiempo lo suficientemente corto para que [S] permanezca prácticamente constante. Esto requiere 
que no reaccione más de un 5% del sustrato a lo largo del ensayo. (16)
La ecuación de Henri-Michaelis-Menten tiene dos parámetros: Vmax, la máxima velocidad de reacción, 
lo que ocurre cuando la concentración de sustrato está saturado, y Km, la constante de Michaelis, la 
cual tiene el valor de la concentración de sustrato a la mitad de la velocidad máxima de reacción. El 
valor numérico de Km es de interés, entre otras varias razones, porque: (a) la Km establece el valor 
aproximado para el nivel intracelular de sustrato. Es poco probable que este nivel sea 
significativamente mayor o menor que Km. (b) puesto que Km es constante para una enzima dada, su 
valor numérico proporciona un medio de comparación de las enzimas en los diferentes organismos o 
de los diferentes tejidos del mismo organismo, o del mismo tejido en las diferentes etapas del 
desarrollo.(16) 
Físicamente, modelos más realistas de mecanismos de reacción que el modelo de Michaelis-Menten 
asumen la reacción enzimática como reversible y tienen uno o más intermediarios. La forma 
funcional de las ecuaciones que describen la velocidad de reacción para estos modelos es 
independiente del número de intermediarios así que los modelos no pueden diferenciarse usando 
sólo mediciones cinéticas en estado estacionario. (16) 
 
MÉTODOS DE REPRESENTACIÓN DE LOS DATOS DE CINÉTICAS ENZIMÁTICAS 
Como la curva de v frente a [S] es una hipérbola, es bastante difícil determinar Vmax y, por lo 
tanto, la [S] que da 1/2Vmax (es decir Km). Para facilitar la determinación de las constantes 
cinéticas los datos se representan generalmente en una de las formas lineales descritas a 
continuación. (16)
 
REPRESENTACIÓN INVERSA DE LINEWEAVER-BURK 
Es muy útil transformar la ecuación de Michaelis-Menten en una forma lineal, analizando los 
datos gráficamente y detectando desviaciones del comportamiento ideal. Uno de los métodos 
mejor conocidos es la gráfica de dobles recíprocos o gráfica de Lineweaver-Burk. Esta 
representación se basa en la reestructuración de la ecuación de Henri-Michaelis-Menten en una 
forma lineal (y=mx+b): 
][
11
SV
K
V max
m
max
+=
v
 
 
 
 26
ANTECEDENTES 
Así, si se representa 1/v en función de 1/[S], la pendiente es Km/Vmax y la intersección con el eje 
de y es 1/Vmax como se puede observar en la figura 2.10.(16)
 
 
pendiente=Km/Vmax
Figura 2.10 Gráfica de Lineweaver-Burk 
 
La representación inversa de Lineweaver-Burk es la representación más ampliamente usada 
como diagnóstico primario. Sin embargo, el uso de esta representación ha sido criticado por dos 
motivos: primero tiene la desventaja de comprimir los datos a altas concentraciones de sustrato 
en una región pequeña y enfatizar los puntos de concentraciones más bajas. Así habrá 
relativamente pocos puntos en el extremo final de la escala 1/[S] y son estos puntos los más 
importantes en el ajuste visual subjetivo de la recta. La segunda y más importante crítica es que 
pequeños errores de la determinación de v aumentan cuando se toman los inversos. Los errores 
en la determinación de v son más importantes a bajas concentraciones de sustrato. Uno o dos 
puntos erróneos a valores altos de 1/v-1/[S] pueden introducir un error significativo en la 
pendiente de la recta. Tiene la ventaja de que los valores de v para un valor dado de [S] son 
fáciles de leer a partir de él. (16, 17)
 
La representación inversa de Lineweaver-Burk no es la única transformación lineal de la 
ecuación básica de velocidad (o de unión al ligando). Bajo algunas circunstancias una de las 
representaciones lineales descritas a continuación, puede ser más adecuada o puede dar datos 
más fidedignos de las constantes cinéticas. Existen además las representaciones de Hanes-
Woolf, la de Wolf-Augustinsson-Hofstee y la de Eadie-Scatchard. Estas dos últimas, tienen 
además la ventaja de llamar la atención sobre los puntos que se desvían significativamente de la 
relación teórica porque las dos variables de la representación varían en igual dirección al 
cometer un error en v. (16) 
 
 
 27
ANTECEDENTES 
 
REPRESENTACIÓN DE HANES-WOOLF 
La ecuación de Lineweaver-Burk puede reestructurarse para dar la ecuación lineal para la 
representación de Hanes-Woolf: 
max
m
max V
K
S
V
S
+= ][1][
v
 
 
Así, una representación de [S]/v en función de [S] es una recta con una pendiente de 1/Vmax. La 
intersección con el eje [S]/v da Km/Vmax. Cuando [S]/v=0, la intersección con el eje [S] da –Km. 
(16) 
 
 
[S]/v
Km/Vmax
– Km 
pendiente=1/Vmax
[S] 
 
Figura2.11. Gráfica de Hanes-Woolf 
 
REPRESENTACIÓN DE WOLF-AUGUSTINSSON-HOFSTEE 
Otra forma lineal se obtiene mediante la reestructuración de la ecuación básica de la velocidad 
como se muestra a continuación: 
maxm VS
K +−=
][
vv 
La representación de v frente a v/[S] es una recta con pendiente de –Km. La intersección con el 
eje v da Vmax. Cuando v=0, la intersección con el eje v/[S] da Vmax/Km. (16) 
 28
ANTECEDENTES 
 
pendiente= -Km
Vmax/Km
Figura 2.12 Gráfica de Wolf-Augustinsson-Hofstee 
 
 
REPRESENTACIÓN DE EADIE-SCATCHARD. 
Si la ecuación de Henri-Micahelis-Menten se reestructurara para tener una representación de 
v/[S], en función de v se obtiene: 
m
max
m K
V
KS
+−= vv 1
][
 
Así, una representación de v/[S] en función de v es una línea recta con una pendiente de –1/Km 
y una intersección de Vmax/Km en el eje de v/[S]. (16) 
 
 
Vmax/Km 
v/[S] 
pendiente= -1/Km
Figura 2.12 Gráfica de Eadie-Scatchard 
v 
 
La gráfica de Eadie no comprime los valores altos, pero los valores de v contra [S] son más 
difíciles de determinar rápidamente a partir de ella. La gráfica de Eadie se considera más exacta 
y generalmente superior. (17)
 
 
 
 29
ANTECEDENTES 
EXPRESIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 
Para expresar la actividad de una enzima en términos absolutos es necesario asegurar que el 
ensayo usado esté midiendo realmente la velocidad inicial y que es proporcional a la 
concentración de enzima. Bajo estas condiciones el cociente de velocidad/concentración de 
enzima será una constante que puede ser usada para expresar la actividad de una enzima 
cuantitativamente. (17) 
 
 
UNIDADES Y ACTIVIDAD ESPECÍFICA 
La actividad de una enzima puede ser expresada en cualesquiera unidades convenientes, como 
cambio de absorbencia por unidad de tiempo por mg de enzima (proteína), pero es preferible 
tener una unidad estandarizada para facilitar las comparaciones. La cantidad más usada es la 
Unidad, a veces referida como Unidad Internacional o Unidad Enzimática. Una Unidad de 
actividad enzimática se define como la conversión catalítica de 1 μmol de sustrato (o la 
formación de 1 μmol de producto) en 1 min. La actividad específica de la preparación de una 
enzima es el número de Unidades por mg de proteína. (17)
 
 
 
2.6 TIPOS DE ENSAYOS ENZIMÁTICOS 
La actividad de una enzima puede ser medida determinando la velocidad de formación de 
producto o el consumo de sustrato durante una reacción catalizada enzimáticamente. Para 
muchas enzimas hay disponibles varios procedimientos alternativos de ensayo y la elección de 
alguno de ellos puede hacerse en consideración de la conveniencia, costo, la disponibilidad de 
equipos y reactivos apropiados, y el nivel de sensibilidad requerida. (17)
Tipos de ensayos 
Ensayos continuos directos 
Un ensayo directo consiste en medir cualquier propiedad de la mezcla de la reacción enzimática 
que esté relacionada directamente con la concentración del sustrato o el producto, tal como 
cambios en la absorbencia, fluorescencia, pH, rotación óptica, conductividad, viscosidad o 
volumen de la misma. Estos tipos de ensayos son siempre preferidos, ya que ellos permiten la 
observación directa del progreso de la reacción, lo cual simplifica la estimación de velocidades 
iniciales y permite la detección de cualquier comportamiento anómalo.(17) 
 
 
 30
ANTECEDENTES 
Ensayos indirectos 
Estos involucran algún tratamiento adicional a la mezcla de reacción, para generar un producto 
capaz de ser medido o incrementar la sensibilidad o conveniencia del ensayo. 
 
Ensayos indirectos discontinuos 
Estos ensayos, los cuales también han sido llamados ensayos de muestreo, involucran detener la 
reacción a un tiempo fijado (por ejemplo, por la adición rápida de un ácido o una base para 
inactivar la enzima) y tratar la mezcla de reacción para separar el producto de análisis o para 
producir un cambio en las propiedades de uno de los sustratos o productos que serán medidos. 
En los ensayos discontinuos es importante asegurarse que el procedimiento usado para detener 
la reacción sea instantáneo. (17)
 
Ensayos indirectos continuos 
Este tipo de ensayo involucra adicionar un reactivo que reaccione con uno de los productos de la 
reacción enzimática, de tal forma que los cambios en su concentración estén asociados 
directamente con el producto, así la reacción se puede seguir continuamente mientras ocurre. 
En estos ensayos el progreso de las curvas se determina en un solo ensayo y se introduce 
menos error que por un método discontinuo. Es preciso que la reacción de detección sea más 
rápida que la reacción enzimática, así como que no afecte la actividad de la enzima ni reaccione 
con algún otro componente del sistema. (17) 
 
 
Ensayos acoplados 
Consisten en usar una o más enzimas adicionales (frecuentemente llamadas enzimas acopladas) 
para catalizar la transformación de uno de los productos de la reacción enzimática en estudio, 
en un compuesto que pueda ser detectado directamente. Algunos de estos ensayos involucran 
la reducción de NAD(P)+ o la oxidación de la correspondiente coenzima reducida, puesto que 
este proceso se puede determinar por espectrofotometría o fluorometría. Para este tipo de 
ensayos es importante que la(s) enzima(s) acoplada(s) no se vuelva(n) limitante(s) de la 
velocidad, de tal forma que la velocidad medida se asocie siempre a la enzima en estudio. (17)
 
 31
PARTE EXPERIMENTAL 
 
 
3.0 PARTE EXPERIMENTAL 
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 
3.1 REACTIVOS 
• Solución amortiguadora de pH TRIS 10 mM a pH 8.0, con KNO3 0.1F como electrolito 
soporte. 
• β-NADPH (β-nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido, sal tetrasódica) Fluka 
BioChemika pureza ≥90.0% (HPLC) lote 1122582 41106141. 
• Glutatión forma reducida (GSH): SIGMA pureza 98-100% lote 24H0735. 
• Glutatión forma oxidada (GSSG): SIGMA pureza aprox. 98% lote 20K7420. 
• β-NAD+ (β-nicotinamida adenina dinucleótido): SIGMA grado III: de levadura, pureza 98% 
lote 100H7110. 
• Enzima glutatión reductasa (GR) de levadura de pan: SIGMA 1.95 mL; 1.6 mg proteína/mL 
(Biuret); 160 unidades/mg proteína. Suspensión en 3.6 M (NH4)2SO4, pH 7.0, conteniendo 0.1 
mM de ditiotreitol. Lote 123K74151 
• Solución acetato de mercurio [(CH3COO-)2 Hg] 0.1 F en H2SO4 0.1F 
• Solución de HCl 0.2 F 
• Mercurio metálico 
Todas las soluciones empleadas se prepararon con agua destilada obtenida en el laboratorio 3F 
de conductividad 1-2 μS/cm. 
 32
PARTE EXPERIMENTAL 
 
 
3.2 CELDA, ELECTRODOS Y EQUIPOS 
El estudio de las especies involucradas en la reacción enzimática así como el monitoreo de la 
misma, se realizó en una celda con un sistema de tres electrodos. Para dicho estudio se 
ensayaron dos celdas electroquímicas cuyo diseño se muestra en la siguiente figura. 
 
 
 
 
 
 
 
 
EA 
EQR 
ET 
EA 
ET 
EQR 
 Celda 1 Celda 2 
Figura 3.1 Esquema de las celdas diseñadas 
 
En la primera celda se utilizó como electrodo de trabajo (ET) un electrodo de película de 
mercurio (EPM) sobre disco de cobre. Este electrodo se construyó sumergiendo un disco de 
cobre en una solución de acetato de mercurio II ([CH3COO-]2Hg) 0.1 F en H2SO4 0.1 F durante 
10 segundos, con lo cual se deposita una película de mercurio metálico sobre la superficie del 
disco de cobre. Una vez retirado el disco de la solución, la superficie se limpió con un papel 
absorbente para eliminar el exceso de solución. Asimismo, después de trazar cada 
voltamperograma, la superficie del EPM se limpió con papel absorbente. 
Antes de la deposición de la película de mercurio, el disco de cobre se pulía con alúmina con el 
objeto de tener una superficie lisa. Al término de los experimentos del día, se retiraba la capa de 
mercurio puliendo nuevamente con alúmina la superficie del disco. 
En la segundacelda el ET fue una gota de mercurio colocada en una cámara de plástico, usando 
un alambre de acero inoxidable como transductor de la señal detectada por el ET. La gota de 
mercurio se cambió cada vez que se realizó una curva de calibración o bien cada vez que se 
efectuó un ensayo enzimático. 
En ambas celdas electroquímicas se utilizó como electrodo de quasi referencia (EQR) Ag/AgCl y 
como electrodo auxiliar (EA) una mina de grafito. 
 33
PARTE EXPERIMENTAL 
 
El equipo utilizado para la imposición del barrido de potencial y la medición de la corriente 
generada fue un potenciostato Radiometer Copenhagen PGP210, conectado a una computadora 
y dirigido por el programa Voltamaster ®. Con este último se obtuvieron los registros de las 
curvas intensidad de corriente–potencial I=f(E). Este programa permite realizar los programas 
de perturbación sin que intervenga el usuario. 
El medio de reacción utilizado para ambos electrodos de trabajo fue una solución buffer de TRIS 
10 mM a pH 8.0, con KNO3 0.1 F como electrolito soporte. 
La capacidad máxima aproximada de ambas celdas es de 1 mL. El volumen utilizado para los 
experimentos fue de alrededor de 0.3 mL 
 
 
 
3.3 ESTUDIO DE LAS ESPECIES INVOLUCRADAS EN LA 
REACCIÓN ENZIMÁTICA 
Se probaron las técnicas de voltamperometría de barrido triangular de potencial y 
voltamperometría de barrido lineal, para estudiar las especies involucradas en la reacción 
catalizada por la enzima glutatión reductasa (GR), antes de realizar los ensayos enzimáticos, con 
el fin de encontrar una señal de oxidación o reducción relacionada directamente con la 
concentración de alguna de las especies de la reacción, con la cual fuera posible monitorear la 
evolución de dicha reacción. 
 
3.3.1 PROGRAMA DE PERTURBACIÓN 
3.3.1.1 VOLTAMPEROMETRÍA DE BARRIDO TRIANGULAR 
 
Para el programa de perturbación se establecieron las siguientes condiciones de trabajo 
iniciales: 
Ei (potencial de inicio de barrido) = –500 mV 
Eλ (potencial de inversión) = 50 mV 
v (velocidad de barrido) = 8.33 mV/s (500 mV/min) 
Número de ciclos = 1 
 
A este programa de perturbación se hicieron modificaciones según lo requiriera el sistema 
estudiado. Se trazaron los voltamperogramas correspondientes I=f(E) de cada una de las 
especies de la reacción enzimática (GSH, GSSG, NADPH y NAD+) por separado. 
 34
PARTE EXPERIMENTAL 
 
3.3.1.2 VOLTAMPEROMETRÍA DE BARRIDO LINEAL 
Para el caso de la voltamperometría de barrido lineal se emplearon básicamente las mismas 
condiciones que para la técnica anterior, excepto que en este caso se trazó el registro 
correspondiente sólo al barrido anódico, es decir que se trazó el barrido del potencial inicial al 
potencial final (el cual en voltamperometría de barrido triangular corresponde al potencial de 
inversión). 
De esta forma las condiciones de trabajo para esta técnica electroquímica fueron: 
 
Ei (potencial de inicio de barrido) = –500 mV 
Ef (potencial final de barrido) = 50 mV 
v (velocidad de barrido) = 8.33 mV/s (500 mV/min) 
 
Para estos experimentos al igual que para la voltamperometría de barrido triangular, se trazaron 
los voltamperogramas correspondientes I=f(E) de las especies implicadas en la reacción 
enzimática. 
 
 
3.4 ENSAYOS ENZIMÁTICOS 
Para estos experimentos se realizó solamente voltamperometría de barrido lineal en dirección 
anódica para mayor rapidez, de este modo se consigue detectar el inicio de la reacción enzimática, 
en donde la velocidad de la misma es proporcional a la concentración del analito detectado. 
El tiempo de reacción se comenzó a contar desde el momento de la adición de la enzima GR a la 
mezcla de reacción (buffer de TRIS, NADPH y GSSG) y se monitoreó con ayuda de un cronómetro. 
Se midió el tiempo de la aparición de la señal de oxidación del GSH. 
Se efectuaron varios ensayos enzimáticos bajo las mismas condiciones de trabajo, en los cuales se 
modificó la concentración de sustrato GSSG en el medio, manteniendo constante la cantidad de 
enzima GR agregada. 
Se realizaron curvas de calibración de GSH por medio de adiciones de estándar. Se hicieron adiciones 
de 10μL de una solución de GSH 20 mM. 
El diseño de la segunda celda electroquímica, que fue usada para llevar a cabo las reacciones 
enzimáticas, no permitió adaptar un sistema para controlar la temperatura de la reacción, por lo cual 
lo que se hizo fue monitorear la temperatura ambiental durante el transcurso de cada uno de los 
ensayos enzimáticos, asumiendo que este valor era equiparable a la temperatura de la solución 
dentro de la celda. El promedio de la temperatura trabajada fue de 22 ± 0.5 °C. 
 35
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
4.0 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 
4.1. ELECTRODO DE PELÍCULA DE MERCURIO (EPM) 
4.1.1 E S T U D I O D E L A S E S P E C I E S I N V O L U C R A D A S E N 
 LA REACCIÓN ENZIMÁTICA 
Antes de realizar los ensayos enzimáticos con la GR, se comenzó por estudiar el comportamiento 
electroquímico de las sustancias involucradas en la reacción que cataliza dicha enzima: 
 
++ +⎯→⎯++ NADP2GSHHNADPHGSSG GR 
 
4.1.1.1 ESTUDIO DEL GSH 
Para esta parte de los experimentos se empleó la primera celda diseñada, en la cual el ET fue 
un electrodo de película de mercurio (EPM) sobre disco de cobre. 
Se comenzó por trazar el voltamperograma de barrido triangular en sentido anódico de 150 μL 
de una solución amortiguadora de pH de TRIS 10 mM a pH 8.0 con KNO3 0.1 F como electrolito 
soporte, para obtener el dominio de electroactividad. El voltamperograma correspondiente se 
muestra a continuación 
 
I (μA) 
E (mV) 
Figura 4.1. Dominio de electroactividad de una solución buffer de TRIS 10 mV a pH 8, KNO3 0.1F 
ET: electrodo de película de mercurio (EPM); EQR: Ag/AgCl; EA: grafito 
Ei= –450 mV; Eλ= 50 mV; velocidad de barrido= 500 mV/min 
 
 
 
 36
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
En el dominio de electroactividad se presenta una señal de reducción intensa en el barrido 
catódico. Esta señal se debe a la reducción correspondiente a la oxidación del mercurio del 
electrodo de trabajo en la barrera anódica. 
Posteriormente, se adicionaron alícuotas de 10 μL de una solución de GSH 0.1M y se trazó el 
correspondiente voltamperograma de cada adición. Se obtuvieron registros como los siguientes: 
 
Figura 4.2. Voltamperogramas de adiciones de 10μL de GSH 0.1M 
ET : EPM ; EQR: Ag/AgCl ; EA : grafito 
Ei= –450 mV; Eλ= 50 mV; velocidad de barrido= 500 mV/min 
 
 
Se observa que ante la presencia de GSH en el medio aparece una señal de oxidación bien 
definida cuyo potencial se desplaza hacia valores más positivos conforme se incrementa la 
concentración de esta especie. Se puede percibir también que la señal de reducción del 
mercurio del electrodo de trabajo disminuye de intensidad de corriente con el aumento en la 
concentración de glutatión reducido en el medio, como se presenta en el inserto de la figura 4.2. 
 
 
 
 
 
== dominio de 
electroactividad 
== 1ª adición 
== 2ª adición 
== 3ª adición 
== 4ª adición 
== 5ª adición 
== 6ª adición 
== 7ª adición 
== 8ª adición 
I (μA) 
I de la señal de reducción a -195 mV
-60
-40
-20
0
0 10 20CGSH (mM)
I (μA)
E (mV)
 37
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Debido al fenómeno de desplazamiento del potencial de oxidación del GSH, éste se graficó en 
función de la concentración de dicha especie. Se obtuvieron gráficas como la que aparece a 
continuación: 
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
0 5 10 15 20 25 30
E 
(m
V)
CGSH (mM)[GSH] (mM) 
 
Figura 4.3. Gráfica del potencial de las señales de oxidación de GSH 
en función de su correspondiente concentración. 
 
El potencial de la señal de oxidación se desplaza hacia valores más positivos presentando un 
comportamiento asintótico, lo cual es un indicativo de un proceso de adsorción sobre la 
superficie del electrodode trabajo. Esto se debe a que la reacción que ocurre en el electrodo es: 
2(GSH)sol + Hg° [Hg(GS)2]ads + 2H+ + 2e- (18, 23)
así que la forma asintótica del desplazamiento del potencial se debe a la saturación de la 
superficie del electrodo. 
Asimismo se trazó la gráfica de la intensidad de corriente de la señal de oxidación del GSH en 
función de su concentración. 
y = 3.6087x + 12.811
R2 = 0.9912
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30
[GSH] (mM)
I (
μ
A
)
 
Figura 4.4. Gráfica de la intensidad de corriente de la señal de oxidación de GSH 
en función de su concentración 
 
 38
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
En esta gráfica se puede observar que, aunque se presenta un proceso de adsorción del analito 
al electrodo, la relación entre la intensidad de corriente medida de la señal y la concentración 
del analito sigue un comportamiento lineal, por lo cual se puede cuantificar el GSH utilizando 
como parámetro la intensidad de corriente de la señal de oxidación asociada a esta especie. 
El desplazamiento del valor de potencial de la señal de oxidación asociada al GSH es un 
indicativo de un proceso de adsorción en el electrodo. 
 
 
 
 
4.1.1.2 ESTUDIO DEL GSSG 
Los siguientes experimentos consistieron en trazar voltamperogramas de la especie oxidada del 
glutatión. Se utilizó un volumen de 150 μL de medio de reacción y se hizo una adición de GSSG 
0.1 M para tener una concentración final en la celda de 30 mM de esta especie. 
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
-600 -500 -400 -300 -200 -100 0 100
E (mV)
I (μA)
dominio de
electroactividad
GSSG 30 mM
 
Figura 4.5 Voltamperograma de GSSG 30 mM 
ET: EPM; EQR: Ag/AgCl; EA: grafito 
Ei= –500 mV; Eλ= 20 mV; velocidad de barrido= 500 mV/min 
 
Se observa que ante la adición de GSSG al medio de reacción, no se presenta la señal de 
reducción del Hg del electrodo, como ocurrió en el caso de los estudios del GSH. 
 
 
 
 
 
 39
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
En vista de que el GSSG presenta señales de oxidación y reducción, se probó hacer adiciones de 
GSH en presencia de el glutatión oxidado con objeto de investigar si se presentaban las señales 
de ambas especies y para determinar si había interferencia en la detección de los picos de 
oxidación del GSH por el GSSG en el medio de reacción. Se agregaron alícuotas de 10 μL de una 
solución de GSH 0.1 M y se obtuvo lo siguiente: 
 
 
I (μA) 
== GSSG 30 mM 
== 10 μL GSH 0.1M 
== 20 μL GSH 0.1M 
== 30 μL GSH 0.1M 
E (mV) 
Figura 4.6. Voltamperograma de adiciones de 10 μL de GSH 0.1M en presencia de GSSG 30 mM 
ET : EPM ; EQR : Ag/AgCl ; EA : grafito 
Ei= –500 mV; Eλ= 50 mV; velocidad de barrido= 500 mV/min 
 
Al adicionar GSH sólo aparecen las señales de oxidación asociadas a éste y ya no se presentan 
las señales debidas al GSSG. 
 
Adicionalmente se realizó voltamperometría de barrido triangular en sentido catódico de GSSG 
30 mM. Los voltamperogramas obtenidos se muestran en la figura 4.7. 
 40
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
-600 -500 -400 -300 -200 -100 0 100
E (mV)
I (μA)
dominio de
electroactividad
GSSG 30 mM
 
Figura 4.7 Voltamperograma de barrido triangular de GSSG 30 mM 
ET: EPM; ER: Ag/AgCl ; EA: grafito 
Barrido catódico. Ei= 50 mV; Eλ= –500 mV; velocidad de barrido= 500 mV/min 
 
 
En este caso también se adicionaron alícuotas de 10 μL de GSH 0.1 M y se trazó el 
correspondiente voltamperograma de cada una. 
 
== GSSG 30 mM 
== 10 μL GSH 0.1M 
== 20 μL GSH 0.1M 
== 30 μL GSH 0.1M 
I (μA) 
E (mV)
Figura 4.8. Voltamperograma de adiciones de 10 μL de GSH 0.1M en presencia de GSSG 30 mM 
ET : EPM ; EQR : Ag/AgCl ; EA : grafito 
Ei= 50 mV; Eλ= -500 mV; velocidad de barrido= 500 mV/min 
 
En este caso se observa que al realizar barrido catódico de potencial, el resultado de los 
voltamperogramas obtenidos al adicionar GSH al medio en presencia de GSSG, son muy parecidos a 
aquellos que se trazaron en barrido anódico, por lo cual se decidió realizar los experimentos 
subsecuentes de las otras especies de la reacción enzimática por medio de barrido anódico del 
potencial. 
 41
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
4.1.1.3 ESTUDIO DEL NADPH 
Posteriormente se trazaron voltamperogramas del cofactor de la enzima GR, el NADPH, para 
determinar si es una especie electroactiva y si las señales que presentara pudieran interferir con 
la señal de oxidación asociada al GSH. A 150 μL de medio de reacción se adicionaron alícuotas 
de 10 μL de una solución de NADPH 13 mM y se trazó el respectivo voltamperograma de cada 
una. Los registros obtenidos se muestran a continuación: 
 
== dominio de electroactividad
== 1ª adición de NADPH 
== 2ª adición 
== 3ª adición 
== 4ª adición 
== 5ª adición 
== 6ª adición 
I (μA) 
E (mV)
Figura 4.9. Voltamperogramas de adiciones de 10 μL de NADPH 13 mM 
ET : EPM ; EQR : Ag/AgCl ; EA : grafito 
Ei= –1000 mV; Eλ= 50 mV; velocidad de barrido= 500 mV/min 
 
En la figura se observa que el NADPH presenta señales de oxidación y reducción que 
incrementan su intensidad de corriente con la concentración de esta sustancia, aunque no se 
encuentran bien definidas, en particular las señales oxidación. La señal de reducción presenta 
un desplazamiento en su potencial hacia valores más positivos. Se encuentra reportado que el 
NADPH no es una especie electroactiva en electrodo de Hg, sin embargo hay que considerar que 
además de la película de mercurio se tiene también una aleación entre el Hg y el disco de Cu 
sobre el cual está depositado aquél, lo cual podría contribuir para que el NADPH presentara 
señales al emplear este electrodo. 
 
 
 
 
 
 42
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
Al igual que en el estudio del glutatión oxidado, se probó hacer adiciones de GSH en presencia 
del NADPH, puesto que este último presenta señales de oxidación que pudieran interferir con las 
del GSH. Se añadieron alícuotas de 10 μL de GSH 0.1M y se observó lo siguiente: 
 
== dominio de electroactividad
== NADPH 3.7 mM 
== 10 μL GSH 0.1 M 
== 20 μL GSH 0.1 M 
== 30 μL GSH 0.1 M 
I (μA) 
E (mV) 
Figura 4.10 Voltamperogramas de adiciones de 10 μL de GSH 0.1 M en presencia de NADPH 3.7 mM 
ET : EPM ; EQR : Ag/AgCl ; EA : grafito 
Ei= –500 mV; Eλ= 50 mV; velocidad de barrido= 500 mV/min 
 
Al agregar GSH ya no se presentan las señales de oxidación ni las de reducción del NADPH, y 
sólo aparece el pico de oxidación asociado al glutatión reducido. 
 
 43
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
4.1.1.4 ESTUDIO DEL NAD+
Se hicieron pruebas con el NAD+, utilizándolo como el par oxidado del NADPH en vez de NADP+, 
ya que no se contaba con esta sustancia. Por otra parte, los potenciales de óxido-reducción 
reportados en la literatura del NAD+ y el NADP+ son muy similares y dado que sólo difieren en 
un grupo fosfato se esperaba un comportamiento electroquímico parecido. 
-50
0
50
100
150
200
250
-600 -500 -400 -300 -200 -100 0 100
E (mV)
I (μA)
dominio de
electroactividad
NAD+ 14.3 mM
 
Figura 4.11 Voltamperograma de barrido triangular de NAD+ 14.3 mM 
ET : EPM ; EQR : Ag/AgCl ; EA : grafito 
Ei= –500 mV; Eλ= 50 mV; velocidad de barrido= 500 mV/min 
 
 
Se puede advertir que la forma del voltamperograma obtenido para el NAD+ es muy similar al 
correspondiente al NADPH, además el valor del potencial de la señal de reducción de ambas 
especies es cercano. Esto puede justificar el emplear NAD+ como par oxidado del NADPH. 
Para esta especie también se añadieron alícuotas de 20 μL de GSH 0.1M y se trazaron los 
voltamperogramas correspondientes de cada adición. 
 44
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
-30
0
30
60
90
120
150
180
-500 -400 -300 -200 -100 0 100
E (mV)
I (
μ
A
)
_ NAD+ 14.3 mM 
– 1ª adición de GSH 
-- 2ª adición de GSH 
 
Figuran 4.12 Voltamperograma de NAD+ 14.3 mM con adiciones de 20 μL de GSH 0.1M 
ET: EPM; EQR: Ag/AgCl; EA: grafito 
Ei= –500 mV; Eλ= 20 mV; velocidad de barrido= 500 mV/min 
 
En este caso se percibe, al igual quelos estudios realizados con GSSG y NADPH, que ante la adición 
de GSH al medio de reacción, sólo se presenta el pico de oxidación asociado al GSH. 
En estos estudios preliminares se observa que la reacción de oxidación del GSH se ve más favorecida 
que las reacciones de reducción y oxidación de las demás especies estudiadas (GSSG, NAD+ y 
NADPH). 
La adsorción que se presenta durante la oxidación del GSH sobre EPM hace que el electrodo tenga 
mayor afinidad por esta especie, por lo cual todas las demás sustancias que mostraron ser 
electroactivas, no interfieren en la detección de dicho analito, esto es, que en el voltamperograma 
sólo aparece la señal debida a la especie reducida del glutatión y no las señales de alguna de las 
demás sustancias, incluso a concentraciones bajas de GSH. 
Está reportado también que el GSH se adsorbe de manera espontánea sobre la superficie de diversos 
metales sin que sea necesario aplicar una diferencia de potencial. Esto podría explicar que al agregar 
esta especie al medio sólo se presente la señal de oxidación asociada al GSH, puesto que antes de 
comenzar el barrido ya se encuentra adsorbido sobre el ET, impidiendo o dificultando la reacción 
electroquímica de todas las demás especies implicadas en la reacción enzimática. 
Ante estos resultados se percibe más conveniente monitorear la formación de GSH, que es el 
producto de la enzima glutatión reductasa (GR), para seguir la evolución de la reacción enzimática, 
en vez de cuantificar el consumo de GSSG o de NADPH o bien, la producción de NAD+. Además, la 
formación del producto de la reacción está relacionada de forma directa con la actividad de la enzima 
y la intensidad de corriente de oxidación de GSH es directamente proporcional a la concentración de 
éste en un amplio intervalo de concentraciones. 
 45
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
 
4.1.2 ENSAYOS ENZIMÁTICOS 
Posteriormente al estudio de las sustancias presentes en la reacción enzimática, se procedió a 
realizar ensayos adicionando GR. 
 
Se trazó el dominio de electroactividad del medio de reacción (150 μL de solución 
amortiguadora de pH de TRIS 10 mM a pH 8, con KNO3 0.1F); en seguida se agregaron 10 μL 
de GSSG 50 mM y 40 μL de NADPH 24 mM, trazando el voltamperograma correspondiente 
después de la adición de cada sustancia. En la siguiente figura se muestran los registros 
obtenidos: 
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
-500 -400 -300 -200 -100 0 100
E (mV)
I (μA)
dominio de
electroactividad
GSSG
NADPH
 
Figura 4.13 Voltamperogramas de GSSG y NADPH 
ET: EPM; EQR: Ag/AgCl; EA: grafito 
Ei= –450 mV; Eλ= 50 mV; velocidad de barrido= 500 mV/min 
 
En el medio de reacción que contenía GSSG y NADPH se observa una señal de oxidación 
correspondiente a la mezcla de ambas especies y una señal de reducción correspondiente a la 
reducción del NADPH. 
 
 
 
 
 
 46
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
 
A continuación se añadieron 10 μL de enzima GR. Se trazaron voltamperogramas a 10, 20, 30 y 
40 minutos después de adicionada la enzima, los cuales aparecen en la siguiente figura: 
 
I (μA) 
== dominio de electroactividad 
== GSSG + NADPH 
== 10 min 
== 20 min 
== 30 min 
== 40 min 
E (mV)
Figura 4.14 Voltamperogramas de ensayo enzimático con glutatión reductasa 
a 10, 20, 30 y 40 minutos de la adición de la enzima 
ET: EPM; ER: Ag/AgCl; EA: grafito 
Ei= –450 mV; Eλ= 50 mV; velocidad de barrido= 500 mV/min 
No se observa una diferencia significativa entre los voltamperogramas antes y después de la 
adición de la enzima a la mezcla que contenía GSSG y NADPH; además no se percibe la señal de 
oxidación asociada a la presencia de GSH en el medio. 
Se observa un ligero incremento de la señal de reducción en el voltamperograma y que el valor 
de potencial de la misma se desplaza hacia valores positivos, lo cual puede deberse a la 
producción de NADPP+ por la reacción enzimática. Se esperaría que la señal de reducción 
tendiera a disminuir por el consumo de NADPH, pero como al mismo tiempo se está generando 
NADP+, cuyo potencial de reducción, de acuerdo con los estudios del NAD+, aparece alrededor 
del mismo valor de potencial que para el NADPH, esto explica que no disminuya la señal; 
aunado también a que el NADPH se añadió en exceso al medio de reacción. 
 
 
 
 47
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Con objeto de establecer si la presencia de la enzima interfería sobre la aparición de la señal del 
GSH se hicieron 2 adiciones de 10 μL cada una de una solución de GSH 40 mM a la mezcla de 
reacción del ensayo enzimático y se observó lo siguiente: 
-40
-20
0
20
40
60
80
-500 -400 -300 -200 -100 0 100
E (mV)
I (μA)
Serie1
Serie2
Serie3
 
mezcla de reacción enzimática 
10 μL de GSH 40 mM 
20 μL de GSH 40 mM 
Figura 4.15 Voltamperogramas de adiciones de 10 μL de GSH 40 mM 
ET: EPM; EQR: Ag/AgCl; EA: grafito 
Ei= –450 mV; Eλ= 50 mV; velocidad de barrido= 500 mV/min 
 
Al agregar GSH, el voltamperograma obtenido se modifica sensiblemente con respecto al 
voltamperograma de la mezcla de reacción enzimática, de tal forma que, al parecer, el electrodo de 
trabajo sí detecta la presencia de este analito aún habiendo enzima en el medio. 
Se repitió el experimento modificando la cantidad de enzima agregada y la velocidad del barrido (no 
se exponen los resultados de las modificaciones), empero, los resultados obtenidos fueron muy 
similares a los que se muestran anteriormente, es decir no se detectó la señal de oxidación del GSH 
en los voltamperogramas. 
La ausencia del pico de oxidación del GSH durante la reacción enzimática pudiera deberse a alguna 
interacción entre las especies que no se observó en los ensayos previos, dado que se presenta sólo 
cuando la enzima se encuentra activa llevando a cabo la reacción que cataliza. 
Con las adiciones de GSH a la mezcla de reacción enzimática, se muestra que el ET detecta la 
presencia de esta especie aún habiendo enzima en el medio, sin embargo es posible que lo detecte 
sólo cuando se agrega de forma libre al medio mientras que no detecte el GSH generado in situ por 
la enzima. 
En vista de la falta de resultados satisfactorios en los ensayos enzimáticos al emplear EPM, se 
cambió el electrodo de trabajo por gota de mercurio. 
 48
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
4.2 ELECTRODO DE GOTA DE MERCURIO 
Para todos los experimentos realizados en esta parte del trabajo experimental se utilizó como ET 
una gota de mercurio, como EQR Ag/AgCl y como EA una mina de grafito. 
Asimismo para todos los experimentos el medio de reacción empleado fue solución 
amortiguadora de pH de TRIS 10 mM a pH 8.0 con KNO3 0.1F como electrolito soporte. 
 
4.2.1 E STUDIO DE LAS E SPEC IE S INVOLUCRADAS EN 
 LA REACC IÓN ENZ IMÁT ICA 
Con electrodo de trabajo de gota de mercurio se siguió básicamente el mismo orden de los 
estudios que al emplear EPM, así que se comenzó por estudiar las especies de la reacción 
enzimática. 
 
4.2.1.1 ESTUDIO DEL GSH 
La siguiente figura muestra el dominio de electroactividad de 190 μL de medio de reacción. 
 
I (μA) 
E (mV)
Figura 4.16 Dominio de electroactividad. 190 μL de buffer de TRIS 10 mM a pH 8.0, KNO3 0.1F 
ET: gota de mercurio; EQR: Ag/AgCl; EA: grafito 
Ei= –700 mV; Eλ= –50 mV; velocidad de barrido= 500 mV/min 
 
 
 
 
 
 
 49
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
 
A continuación se agregaron alícuotas de 10 μL de GSH 20 mM al medio de reacción y trazó el 
correspondiente voltamperograma de cada adición. 
 
I (μA) 
== dominio de 
electroactividad 
== 1ª adición 
de GSH 
== 2ª adición 
== 3ª adición 
== 4ª adición 
== 5ª adición 
== 6ª adición 
== 7ª adición 
E (mV)
Figura 4.17 Voltamperometría de barrido triangular de adiciones de 10 μL de GSH 20 mM. 
ET: gota de Hg; EQR: Ag/AgCl; EA: grafito 
Ei= –700 mV; Eλ= 50 mV; velocidad de barrido= 500 mV/min 
 
Se advierte que la señal de oxidación asociada al GSH incrementa su intensidad de corriente 
conforme aumenta la concentración