Estudio-de-la-interaccion-in-vivo-entre-la-profilina-y-la-fosfatidil-inositol-3cinasa-P13K-de-Phaseolus-vulgaris

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OO!J5 J
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MÉXICO
Unidad Académica de los ciclos Profesionales y de posgrado / CCH
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA
"ESTUDIO DE LA INTERACCION IN VIVO ENTRE LA
PROFILINA y LA FOSFATIDIL INOSITOL 3-CINASA
(PI3K) DE Phaseolus vulguris"
T E S 1 S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS
PRESENTA:
Raúl Huertas Ruz
Cuernavaca, Mor. 2005
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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NOMBRE: L)( U€~ .,lO reCSpClonel.
l '" S' QlJ7-
-
El presente trabajo fue realizado en el
Departamento de Biología Molecular de Plantas del
Instituto de Biotecnología de la U.N.A.M. bajo la
dirección del Dr. Federico Sánchez
r
A Quina, mi mujer, mi todo
A mi hija Beatriz, que antes de nacer ya me da alegrías.
A mis padres y a mis hermanos, por su apoyo incondicional a
través de las infinitas conversaciones telefónicas y por su amor
de lejos que yo sentí tan cerca.
A Federico Sánchez, por su apoyo y confianza en mí.
A todos los compañeros de trabajo de mi laboratorio, del grupo
de Carmen Quinto y los del CCG, los que ya se fueron, los que
aún siguen y seguirán después de que me vaya, porque se
convirtieron en mi familia mexicana y compartieron los buenos
y malos momentos conmigo.
INDICE
1. INTRODUCCIÓN
1.1. CITOE5QUELETO
1.1.1 Componentes del citoesqueleto
1.1.2. Los microtúbulos
1.1.3. Los filamentos intermedios
1.1.4. Los microf ilamentos o filamentos de actina
1.1.5. Proteínas de organización del citoesqueleto
1.2. PROFILINA
1.2 .1. Clasificación de las profilinas
1.2.2. Regulación de las profilinas
1.2.3. Estructura de las profilinas
1.2.4. Funciones de las profilinas
1.2.4.1. Organización del Citoesqueleto de actina
1.2.4.2. Transducción de señales
1.2.4.3. Tráfico de membranas
1.2.4.4 . Regulación genética
1.3. F05FATIDIL IN05ITOL 3-CINA5A (PI3K)
1.3.1. Clasificación y estructura de las PI3K
1.3.1.1. Las PI3K de clase I
1.3.1.2. Las PI3K de clase Ir
1.3.1.3. Las PI3K de clase IIr
1.3.2. Funciones de las PI3K clase IrI
1.3.2.1. Tráfico intracelular
1.3.2.2. Transducción de señales
1.3.2.3. Organización del Citoesqueleto
1.3.2.4. Regulación genética
2. JUSTIFICACIÓN
3. OBJETIVO
3.1. Objetivo general
3.2. Objetivos particulares
I
2
2
3
3
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6
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34
34
4. MATERIALES Y MÉTODOS 35
4.1. Técnicas microb iológicas 35
4 .1.1. Cepas bacterianas y plásmidos 35
4.1.2. Medios de cult ivo 35
4.1.3. Ant ibióticos 36
4.1.4. Conservación de cepas bacterianas 36
4.2. Técnicas de biología molecular y bioquímicas 36
4.2.1. Aislamiento de ADN plasmídico: método de lisis alcal ina 36
4.2.2. Determinación de la concentración de ADN 37
4.2.3. Digestión total de ADN con endonucleasas de restr icción 37
4.2.4. Identif icación de fragmentos de restricción mediante electroforesis
en geles de agarosa 38
4.2.4.1. Electroforesis de ADN 38
4.2.4 .2. Revelado de geles y fo tograf ía 38
4.2.4.3 . Est imación del tamaño molecular de fragmentos de restr icción 38
4.2.5. Purif icación de fragmentos de ADN a part ir de ge les de agarosa: Q iaexII 39
4.2.6. Ligación de fragmentos de restr icción en vectores de clonac ión 39
4.2.7. Transformación de célu las de E col; 40
4.2.7.1. Preparación de células competentes de E col; con RbCI 40
4.2.7.2 . Transformación de células competentes de E col; 41
4.2.8. Amplificación de ADN mediante la reacc ión en cadena de la polimerasa (PCR) 41
4 .2.8.1. Generación de la Prof6His 42
4.2.9. 5ecuenciación de ADN 42
4.2.9.1. Purificación de ADN para secuenciación 42
4.2.9.2 Análisis inf or máti co de secuencias de ADN y proteínas 43
4.2.10. Extracción de proteínas de E col; 43
4.2.11. Extracción de proteínas de protoplastos de Arabidopsis 44
4.2.12. Electroforesis de proteínas en gel de poliacr ilamida con 5D5 44
4.2.13. Electrotransferencia e inmunoloca lización (Western blot) 44
4.3. Técnicas con protoplastos 45
4 .3.1. Obtención y purificación de protoplastos 45
Ir
4.3.2. Transformación con Poliet ilenglicol (PEG)
4.3.3. Inhibidores de la PI3K
4.3.4. Colorante de membrana FM 4-64
4.4 . Técn icas de microscopía
4.4.1. Observación de los protoplastos
5. RESULTADOS
5.1. Generación de una PI3K fus ionada al epítope hemaglut inina (HA)
5.2. Generación de una profilina con nuevas capacidades de interccc i ón
5.2.1. Ensayos in vitro con la Prof6His
5.3. Estudios in vivo
5 .3 .1. Obtención de protoplastos de Arabidopsis tha/iana
5.3.2. Caracterización de protoplastos Arabidopsis tha/iana
5.3.3 . Transformación y expresión transitoria en los protoplastos de
Arabidopsis tha/iana
5.3 .3.1. Expresión de la Prof6His y de la PI3K-HA
5.3.4. Estudio de los efectos en el citoesqueleto de act ina
5.3 .5. Estudio de los efectos eh el tráfico intracelular
5.3 .5.1. Estudio de los efectos en el tráfico int race lular en protoplastos
de Phaseo/us vulgaris
5.3.6 Efecto de la wortmanina en el citoesqueleto y en el tráfico intracelular
6. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
7. PERSPECTIVAS
8. REFERENCIAS
III
46
46
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75
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INTRODUCCIÓN
,
1. IN TRODUCCI ON
Los organismos están expuestos continuamente a un conjunto de estím ulos endógenos y del
medio ambiente y sin embargo tienen la capacidad de responder a estas diferentes señale s
gracias a que cuentan con un plan de desarrollo relativamente flexible, que les permite activar
coordinadamente los cambios que ocurren en su morfología, su fisiología y su crecimien too
Para los organismos multicelulares es necesario que exist a un flujo continuo de información
entre las células que lo integran que les permita poder coordinar y regular el desarrollo, así
como concertar el metabolismo del gran número de células que conforman los diferentes
tejidos y órganos. Este intercambio de información también se necesita para controlar el
crecimiento y la diferenciación celular, además de ser imp ortante pa ra responder a las señales
químicas y físicas del medio ambiente. Las células perciben estas señales de las células vecinas
mayormente por medio de receptores de membrana, lo que resulta en una serie de cambios en
sus estados bioquímicos y físicos que son los que típicamente inician las cascadas de
señalización (pawson, 1995). E stas señale s intracelulares pu eden implicar procesos físicos (Ej.
difu sión), cambios químicos (E j. fosforilación) en los intermediarios . A su vez, estos
intermediarios requieren de una intrincada red de in teracciones entre las proteínas que
permiten una correcta integración, amplificación y transducción de las señales. En términos
generales la dinámica de la señalización intracelular está dada por la trayectoria de la señal, la
cual dependerá de la modificación y/o activación secuencial de los compo nentes específicos
de la vía de señalización, mientras que la veloc idad será controlada por la pre senc ia de los
segundos mensajeros. La transferencia de la información entre los diferentes componentes de
las rutas de señalización es mediada por la presencia de dominios compactos queson
altamen te conservados en las proteínas. La pre sencia de un o o má s de estos dominios en la
secuencia de las proteínas permite la inte racción con los componentes de diferentes vías de
señalización propiciando así el entrecruzamiento de las rutas de transducción de señales
(pawson, 2003). En este momento, se tienen evidencias experimentales que demuestran que ,
además de los factores de transcripción y componentes de rutas metabólicas, en mu chos de
los caso s el destin o final de la señalización son las proteínas del citoe squeleto .
- 1 -
1.1 CITOESQUELETO
El citoesqueleto es una red tridimensional de filamentos que contribuye a la integridad de la
célula. Define la forma y arquitectura celular, permite el movimiento y transporte intracelular,
media en los procesos de endocitosis y exocitosis, participa activamente en la mitosis y en la
modulación de receptores de superficie, y por lo tanto favorece la organización funcional y
participa en los procesos de interacciones intercelulares.
1.1.1. Componentes del citoesqueleto
Durante muchos años se había pensado que la principal función del citoesqueleto era la de
determinar la forma celular y que esta función era independiente de otros mecanismos como
son por ejemplo la transducción de señales (janmey, 1998). Sin embargo, hoy día se sabe que
muchos de los procesos celulares son regulados por la dinámica de esta red altamente
compleja, que está formada por los diferentes componentes del citoesqueleto de las células
que son: los microtúbulos, los filamentos intermedios y los microfilarnentos o filamentos de
actina (dos Remedios el al., 2003) (Figura 1).
T
~""",;;~~";::,-;:,,~~,-,,,¡ 25 nm
~
rzTubulina
f~Tubulina
Filamentos intermedios
~ricrofllamento.
.:
~lonomerode actina
,
<";;:;O":l"-"-~:::P"-"-~'<:;[p:"- 70m
~lembranaplasmática __ .'-
Reticulo Eadoplasmico Rugoso ---~::=...:¡¡;-...
Ribosomas_==::;Q~~...
Subunidad filamentosa Tubulina
Figura 1. Representación esquemática del interior de una célula eucariota. Las flechas resaltan los
diferentes componentes de su citoesqueleto.
Modificada de http:/ /www.mie.utoronto.ca/labs/lcdlab/biopic/ fig/ 4.21.jpg
- 2 -
1.1.2. Los microtúbulos
Los microtúbulos (MT) son heterod ímero s constituidos por la proteína globular tubulina (a-
tubulina y p-tubulina), que se encuen tra altamente conservada en todo s los organismos
eucario tas. Constituyen unas estructuras cilíndricas formadas a partir de 13 pro tofilamen tos
lineales, donde cada protofilamento lo forman subunidades alternadas de a - y p-tubulina
(Figura 1). Los MT son estructuras polares, capaces de autoensamblarse, donde es posible
distinguir entre un extremo de crecimiento rápido o extremo "+" y un extremo de
crecimiento lento o extremo "-" . Debe existir pues un equilibrio din ámico entre los proce sos
de polimerización y despolimerización de sus subunidad es. Las subunidades son modificadas
postraduccionalmente, lo que las determina como maduras y al mismo tiempo proporcionan
los lugares de unión para proteínas especificas de unión a MT (MAP), que estabilizan y evitan
su desp olimerización. O tras proteínas del tipo MAP son las proteínas motoras que utilizan la
energía de la hidrólisis de ATP para desplazarse unidireccionalmente a lo largo de los MT,
llevando un a carga especifica como puede ser un a ves icula. Como ejemplos conocido s,
encon tramos a las dineinas y las quinesinas en células de mamíferos, las primeras son proteínas
que desplazan su carga hacia los extremo s "_" de los MT, mien tras las segundas lo hacen hacia
los extremos "+". E stas proteínas motoras son por tan to las responsab les de la org anización
espacial y del movimiento dirigid o de algunos organelos en el citoplasma de las células de
mamíferos .
Los MT realizan muchas funciones esenciales para una gran variedad de funciones celular es,
tales como intervenir en la movilidad celular; en el transporte de organelos; en la polaridad y
mantenimiento de la forma celular; participan en la división celular y durante la interfase se
encuentran concentrados alrededor del núcleo y organizados en un o o má s sitios llamad os
Centros Organizadores de MT (MTOCs).
1.1.3. Los f ilamentos intermedios
Los filamentos int ermedios (FI) están constituidos por monómeros de proteínas filamentosa s,
que pre sentan un a cabeza arnino terminal, una cola carboxilo terminal, y un dominio central a
modo de varilla . Se suelen estructurar formando dím eros enrollados en tre dos hélices
a paralelas que a su vez se enrollan antiparalelamente constituyendo un tetrámero, siend o
estos tetrámeros las unidades fundamentales para el ensamblaje de los FI (Figura 1). La
disposición antiparalela de los dímeros implica que el tetr ámero y, por consiguien te, el
- 3 -
filamento que forma, es una estructura no polarizada, esto es, la misma estructura en ambos
extremos y es simétrica en toda su longitud. En la mayoría de las células, casi todas las
proteínas de los FI se encuentran totalmente polimerizadas, con muy pocas subunidades
tetraméricas libres .
Los FI constituyen pues fibras proteicas resistentes y duraderas que se encuentran en el
citoplasma de la mayoría de las células eucariotas superiores. Esto sugiere que su función
principal es estructural, ya sea en el núcleo o en el cito sol, ya que sirven para reforzar las
células y organizarlas en los tejidos.
1.1.4. Los microfilamentos o filamentos de actina
La actina es una proteína globular, ubicua, que esta altamente regulada en la célula a varios
niveles, tanto transcripcionalmente (Lloyd & Gunning 1993) como post-trasncripcionalmente
(Aktories & Wegner 1992; Howard el a/. 1993). La actina tiene la capacidad de auto
ensamblarse pasando de actina monomérica (actina-G) a actina polimérica (actina-F), y el
equilibrio entre ambas formas de actina se encuentra bajo el control de un grupo de proteínas
que pueden interaccionar tanto con la actina-G como con la actina-F (pollard & Cooper
1986). Todos estos puntos de control son necesarios ya que pequeñas variaciones en el
equilibrio entre actina monomerica y polimérica pueden cambiar dramáticamente el aspecto
celular y función de la actina. El paso de la actina monomérica a polimérica es lo que
constituye la aparición de los filamentos de actina (FA). Los FA son homopolímeros,
formados por la polimerización de actina-G que al pasar a actina-F, forman protofilamentos y
estos a su vez pueden sufrir un enrollamiento a modo de hélice dextrógira (Figura 1).
Así pues, el citoesqueleto de actina se considera como una red altamente compleja y finamente
regulada que participa activamente en los diferentes procesos de las células. Actualmente se
sabe que participa en procesos de movimiento intracelular, tanto de vesículas como de
organelos. A diferencia de las células animales, en las células vegetales la localización de
algunos organelos (retículo endoplásmico (RE) y aparato de Golgi) están bajo el control de los
FA, e incluso se han encontrado proteínas del tipo de las miosinas y de las quinesinas (Hawes
& Satiat-Jeunemaitre 2005; Volkmann el al., 2003), implicadas ambas en procesos de
localización de organelos en las células animales.
En plantas, la actina es importante para la polaridad, crecimiento y elongación celular (Baluska
el al., 2003), participa en la dirección del plano de división celular, y la síntesis de la pared
- 4 -
celular (Baluska el al., 2003), y proporciona los medios para el flujo citoplásmico (Staves el al.,
1995; McCurdy el al., 2001). Ta mbién existen evidencias que sugieren que la aetina tiene un
papel imp ortante en la comunicación célula-célula (Butkevich el al., 2004), en la respuesta al
ataque de patógenos (D anta n-Gonzalez el al. , 2001), en la regulación del turgor de las células
guarda (Eun & Lee 2000) y en los cambios de la forma celular (Staiger, 2000).
1.1.5. Proteínas de organización del citoesqueleto de act ina
En las condiciones adecuadas la actina puede polimerizaren una gran variedad de complejos.
Esta capacidad de polimerización está determinada por la presencia de diferentes dominios en
la estructura de la actin a que le permite inte ractuar directamente con más de 150 proteínas
denominadas proteínas de unión a actina (ABP) o indirectamente con o tras proteína s par a
formar complejos proteicos. E n muchos de los casos, las ABP s son el sitio donde convergen
las cascadas de transducción de señales induciendo, en última instancia, los cambios en la
dinámica de los filamentos de actina. La formación de estos complejos permite muchas
formas de regulación que actuarán depe ndiendo de la composición del complejo y de los tipos
de interacciones entre las distintas proteínas. En estos complejos también pu eden converger
las informaciones provenientes de otras ru tas de señalización que finalizan en la regu lación de
otros procesos celulares.
En este contexto, podemos ver al citoesqueleto de actina como una estructura celular
fascinante por la complejidad de sus funciones y por el dinamismo de su estructura. E l estudio
de las proteínas de unión a actina en diferentes modelos eucariontes ha permitido validar y
extender el conocimiento de cómo estas proteínas funcionan en la organización del
citoesqueleto de actin a a nivel ultra estructural y de composición molecular. Basados en las
diferentes evidencias experimentales, sabemos que las ABPs tienen un a particip ación activa en
la población de la actina no ensamblada y que algunas de ellas regulan tanto en el tiempo
como en el espacio la polimerización de los filamentos. Es te es el caso de la ADF/ cofilina
(Maciver & Hussey 2002) y la profilina (Schluter el al., 1997); además, estas pro teínas tienen la
capacidad de unirse a los extremos del polímero para bloquear el crecimiento de los FA, como
lo hace la gelsolina (Silacci el al., 2004). Estas proteínas acce sorias, también participan como
sitios iniciadores del ensamble de la actin a globular, como lo son la gelso lina (Silacci el al.,
2004), el complejo Arp2 / 3 (May, 2001) y la cofilina (Maciver el al., 2002) así como en la
fragmentación de los FA, este es el caso de la ADF/co ftlina (Maciver el al., 2002) y de la
- 5 -
gelsolina (Silacci el al., 2004). Las ABPs, también particip an en el entrecruzamiento de los FA,
es el caso de la gelsolina (Silacci el al., 2004) y el complejo Arp2/3 (May, 2001). Todos estos
resultado s sugieren que la coordinación prec isa en los cambios de ' la dinámica de los
microfilarnentos se logra a través de la activación y desactivación secuencial de las proteínas de
unión a la actina a través de sus domin ios específicos .
De toda s esta s proteínas ABP, una de las primeras que fue caracterizada y la que centra
nuestra atención por la gran cantidad de func iones en las que aparece implic ada es la profilin a.
1.2. PROFILINA
1.2.1. Clasificación de las profilinas
Las profilinas han sido bien conservadas durante la evol ución y pu eden ser encontradas en
varios reinos. Es tas se pu eden dividir en 4 clases, dep endiendo de su origen: anima les, plantas,
o tros eucario tas (levadura s, hongos y protistas) y virus.
De las profilinas de anima les, las mejores estudiadas son las humanas y las de ratón. En ambos
se han identificado y caracterizado 3 profilinas, El gen de profilin a 1 de mamíferos, P fn1, se
aisló en el timo (Carlsson el al., 1976). Es tudios posteriores demostraron que la profilin a 1 se
expresa en tod as las fases embrionarias y en el estadio adulto, además de expresarse en tod as
las células y tejidos a excepción del mú sculo esqueléti co (Witke el al., 1998). El gen de profilina
2 de mamíferos se expresa durante el desarrollo del sistema nervioso y en todas las neuronas
diferenciadas (Witke el al., 2001). Por último, el gen de la profilina 3 de mamífe ro s es el más
recien teme nte desc rito, y aunque aparentemente tiene capacidad de unirse a la actina, sus
prop iedades bioquímicas aun no están caracterizadas. Los patrones de expresió n encontra dos
lo involucran en procesos reproductivos (Braun el al., 2002) .
Las profilin as de plantas forman par te de una gran familia multigénica con pa trones de
expresión únicos regu lados por el tipo de tejido y pueden ser agrupados en dos clases: una de
expresión con stitu tiva en tejido s vegetativos; y otro que están expresada principalmente en los
tejidos reproductivos, específicos del polen. E n las plantas existe n múl tiples iso formas de
profilina s que se pueden expr esar en tejidos y células individuales, particul arm ente en el polen.
La presenc ia de las múltiples isoformas de profilina del polen del maíz (G ibbon el al., 1997) y
las diferencias que presentan entre ellas a nivel bioquímico permite n pensar que son
funcionalmente únic as y que no realizan en tre sí funcion es redundan tes (Staiger el al., 1993;
Christensen el al. , 1996; Huang el al., 1996; Gibbon el al., 1997).
- 6 -
La mayoría de los eucariotas inferiores como las levaduras tienen un solo gen que codifica una
profilina (Magdo len et al., 1988). Los hon gos y los proti stas también presentan cop ias únicas
(Kwiatkowski & Bruns, 1988; Haugwitz et al., 1991; Haarer et al., 1993). Una in teresante
excepción es la ameba Dicryostelillm discoideum, que pre sen ta 3 genes (\Vitke, 2004), de los cuales
dos ya se hancaracterizad o en detalle (Haugwitz etal., 1991).
En el caso de los virus, solamente el genoma del virus uacania codifica para una proteína que es
similar a una profilina (Machesky etal., 1994).
1.2.2. Regulación de las profilinas
Las pro filinas pueden sufrir regulación de su actividad o expresión a van os niveles, tanto
tran scripcionalmente como post-transcripcionalmen te. A nivel transc ripcional, los transcritos
de alguna profilina pueden sufrir splicing alternativo lo que permite la aparición de productos
alternos. Un ejemplo claro de esto es el trascrito del gen de la profilina 2 de ratón, que puede
generar tanto la profilina 2 como la profilina 2B, una versión de profilina con 32 aminoácidos
men os y con menos capacidad de unir actina (Di Na rdo etal., 2000).
Así mismo, los estudios de expresión diferencial en diferentes organismos de genes que
codifican para las profilinas, han demostrad o que existen varios niveles de regulación por
modificación po stransduccional: uno que involucra la fosforilación de residuos de serina y
o tro que involucra la fosforilación en residuos de tirosina. E n vertebrados, la profilina puede
ser fosfo rilada in vitro por la proteína cinasa C (pKC) (Hansson et al., 1988; Singh et al., 1996) y
por la cinasa pp60c,,,c (De Corte et al., 1997). Sin embargo, las consecuencias funci on ales de la
fosforilación de las profilinas no han sido determinadas. Recientem ente, se demostró que la
profilina de Arabidopsis también puede ser fosforilada en residu os de serina; sin embargo, los
autores no demuestran la importancia de esta modificación postransduccion al en las
propiedades bioquímicas de la proteína (Lirnmon gkon et al., 2004). La complejidad en la
regulación de la profilina se incrementa ya que las iso formas de profilin a generadas en los
diferentes órganos de Pbaseoius vlIlgaris (frijol) son el producto de la fos forilación de los
residuos de Tyr (G uillen et al., 1999). Aunque esta mo dificación no ha sido encontra da en
o tros organismos, es posible que las isoformas generadas en fríjol mimeticen las propiedades
bioquímicas de las diferentes isoformas expresadas en maíz, lo que permite pen sar que cada
una de las iso formas fosforiladas puedan realizar funciones distintas en fríjol.
- 7 -
1.2.3. Estructura de las profilinas
A pesar de que la estructura de la familia de profilinas está bien conservada por la evolución,
las secuencias de aminoácidos presenta una identidad muy baja entre las distintas clases de
profilinas (",30 %), mientras que la homología dentro de una misma clase si es mucho mas
alta (50 a 80 %). Además, dentro de una misma clase, los nivelesde homología de las
secuencias entre distintas especies y entre distintas profilinas de un mismo organismo son
sorprendentemente bajo s. De hecho, parece ser más imp ortante la conservación del plegado
de la profilina que la conservación de la secuencia primaria. La comparación de las estructuras
terciarias de las profilinas, de algunos de los organismos representativos de cada una de las
clases, entre las cuales se encuentran las estructuras de las profilinas de humano (Metzler et al.,
1995; Mahoney et al. , 1997; Mahoney & Almo, 1998), de bovino (Schutt et al., 1993;
Cedergren-Zeppezauer and Schutt, 1994), de Sacharom.ym cereuisiae (Eads et al., 1998), de
.Acantbamoeba castellanii (Vinson et al., 1993; Fedo rov et al., 1994), de ArabidopsiJ thaliana (T horn
et al., 1997) y de polen de abedul (Fedorov et al., 1997), se encuentran depositadas en las bases
de datos de proteínas y han demostrado que todas son muy similares en su estructura con solo
algunas pequeñas diferencias.
El plegado de las profilinas consi ste en un núcleo central de 7 laminas p embebidas por un
lado por dos hélices a, una en el extremo N-terminal y la otra en el extremo C- terminal, y por
otro lado por dos pequeñas hélices consecutivas (Figura 2A). A pesar de este gran parec ido de
las estructuras de las pro filinas, existen algunas diferencias en las profilinas de plantas (Ej.
A rabidopsis) con respec to a las pro filinas hum anas. En la estruc tura tridimensional de las
profilinas de plantas hay tres giros (loops) que son característicamente distintivos . El primer
giro, situado entre la hélice N- terminal y la 10 lamina p, contiene una inserción de 3 a 6
residuos que difiere del resto de las profilina. Los o tros dos giros , entre las lamina s p 4 Y5 Y
entre las laminas p 5 Y 6 son característicamente mas cortos en la profilin a de plantas. La
cadena peptídica de la profilina de A rabidopsis situada entre las laminas p 2 Y 3 presenta una
pequeña estructura secundaria que difiere significativamente de la estructura en otras
profilinas. E stos residuos, que se correspon den con la hélice 3 de las profilinas humanas, no
forman estructura helicoidal en la profilina de A rabidopsis sino que constitu yen un giro (Figura
2B). D os de esas regiones forman un bolsillo hidrofílico adyacente al sitio de unión a actina.
Este bolsillo es único de las profilinas de plantas. En resumen, la mayor diferencia estructural
entre las profilinas de plantas y el resto es la presencia de un bolsillo hidrofílico localizado
- 8 -
cerca de la superficie de unión a actina. Este bolsillo esta bien conservado entre las profilinas
de plantas y es una marca intrínseca de su plegamiento.
A pesar de la baja homología existente entre las distintas profilinas en la estructura primaria,
existen 18 residuos que son idénticos en un 80% de las profilinas secuenciadas. De todos los
aminoácidos de la secuencia de A rabidopsis, solo 6, la Ala19, Ala20, Glu46, Gly62, Gly67 Yla
Thr10S parecen estar implicados intrínsecamente en un plegado tipo profilina.
A
Figura 2. El plegado de las profilinas. A) Modelo tridimensional de la profilina 1 de Arabidopsis en el
que se pueden observar la estructura típica de las profilinas consiste en un núcleo central de 7 laminas
~ (S1 a S7) embebidas por un lado por dos hélices a (H 1 y H4), una en el extremo N-terminal y la otra
en el extremo e -terminal, y por otro lado por dos pequeñas hélices consecutivas. B) Representación
esquemática de la superposición de las estructuras tridimensionales de la profilina humana 1 (azul) y de
Arabidopsis (rojo) donde se aprecian las 3 principales diferencias que existen entre plantas y animales .
Los tres giros aparecen indicados por un círculo verde . S: lamina ~, H: hélice a. Imágen A tomada de
Thom elal., 1997; imagen B generada con el programa Rasmol.
El resto de los aminoácidos que constituyen la estructura pumana de la profilina, se
encuentran también organizados en muchos casos, a igual que en la mayoría de las proteínas,
en módulos que pueden ser dominios o motivos de interacciones moleculares (dos Remedios
el al., 2003). La importancia de estos módulos radica en que tienen la capacidad de unir sitios
expuestos en la estructura de las proteínas, que modifican las propiedades de estas proteínas
después de la transducción, o reconocen una secuencia de aminoácidos estructuralmente
e},.-puesta en algunas proteínas que participan en la localización intracelular. Además, algunos
de estos dominios o motivos tienen la capacidad de reconocer los grupos cargados de los
segundos mensajeros o de otras macromoléculas como los lípidos o azúcares. Estos dominios
son elementos clave para la formación de los diferentes complejos proteicos que funcionan en
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la célula (pawson et al., 2002). La form ación y el desensamblaje espe cífico de estos complejos
moleculare s son parte de casi todos los procesos biológicos. Estos complejos son estabilizados
po r un sinnú mero de interacciones débiles entr e los diferentes dominios presentes en las
proteínas.
Los estudios realizados en las divers as profilinas han dado a con ocer la pres encia, hasta la
fecha , de 4 dominios de interacción con diferentes ligand os, ya sean pro teínas o lípidos. De
este modo en la estructura de la profilina 1 de .Arabidopsis podemos enco ntrar:
I. Dominio de interacción con actina: este dominio es el mayor de tod os
(constituido por unos 14 amin oácidos) y sorprendenteme nte es el menos conservado ,
con siste en las caras de las lamina s p 4, 5 Y 6 Y en la hélice a situada en el C-terminal
(Schutt et al., 1993) (Figura 3A, B). Los residuos de unión a actin a están pob remente
conservados y solamente la Lys88 y la Gly121 se encuentran conservadas en toda s las
profilinas. Sin embargo, existen determinantes en la super ficie de unión con actina : un
parche básico que comprende los residuos de Lys88 y Lys89, una protuberancia
compuesta por los residuo s Ala59 y Pro60 que contactan con la cadena de carbono de
la actina y otro contacto entre la Gly120 de la actina y la altame nte conservada G ly121
de la profilina. Por el contrario, el giro existente en tre las láminas p4 Y5 que contiene la
Glu82, la cual forma un contacto con la Lys113 de la actina, no se encuentra entre las
dos láminas p en la pr oftlina de .Arabidopsis. En la profilina, el parche básico form ado
por la Lys90 y la Arg88 se alinea con el parche acido con stituido por la G lu167 y
Phe374 en el extremo C-terminal de la super ficie de la actina (Figura 3C). La perdida de
la estr icta conservación de la superficie de unión a actina es quizás sorp rendente aunque
a nivel de proteínas existen precedentes. Las estructuras de muchas proteínas de unión
con epítopes comunes muestran que un a región dada puede ser reconocida por muchas
superficies de proteínas diferentes.
11. Dominio de interacción con poli-L-prolina (PLP): el dominio de interaccion
con PLP fue un o de los primeros en caracteri zarse y esta altame nte conservado. A
excepción de las supuestas profilinas de los virus (I:v1achesky et al., 1994; Maho ney et al.,
1999; Metzler et al., 1994), tod as las profilin as unen PLP . E n la estructura de las
proftlinas, las cadenas laterales del Trp3, Tyr6 y Trp3 1, situadas en la hélice a N-
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termina l, forman un parche en conformación aromática con interacciones con los
residuos hidrofóbicos de Tyr133, Ile21 y Leu 139 que se encuentran en la hélice a C-
terminal (Figura 4A, B).
La presencia de un domi nio de in teracción con PLP implica que la profilina pue de
interactuar con proteínas que cuenten en su secuencia un motivo rico en prolinas.
Algunas de las pro teínas reportadas que interaccionan con pro ftlina tienen una región
de 5-10 prolinas consecutivas (Manseau el al., 1996; Chang el al., 1997; Watanabe el al.,
1997; Evangelista el al., 2003) y otras presentan motivos que contienen no más de
cuatro prolinas cons ecu tivas en la que se ha visto que tienen un consensodel tipo
ZPPX (donde Z puede ser Pro, Gly o Ala; y X cualquier aminoácido hidro fób ico)
(Witke el al., 1998).
lB . Los dominios de interacción con fosfoinosítidos : los dominios de interacción
con fosfoinosítidos son dos y se encuentran en diferen tes zonas de la superficie de las
pro filinas (Figura SA, B). Uno se encuentra sob relapando el dominio de interacción con
PLP (Schluter el al., 1997), con stituido por los aminoá cidos Leu12S, Ile/ Leu13S y
Glu136 y el otro situado en uno de los giros característicos de plantas , comprendido por
los aminoácidos Gln74 y Lys90.
Estudios realizados entre las profilinas de plantas y las de animales muestran que la
presencia de diferentes aminoá cidos en estas posiciones son las que determinan el nivel
de interacción con los difere ntes fos foinos ítidos (Lu el al., 1996) y la interacción entre
estos y la proftlina determina el pegado del domi nio de unión a actina de la profilina.
Los fosfoinosítidos con los que puede interaccionar las profilinas son el PI (4,S)P2, el
PI (3,S)P 2, el P I(3,4,S)P3 y el P I(3)P, de los cuales los tres últimos son los de mayor
pegado a la proftlina y por tanto los de mayor capacidad de inhibición actina -profilina
(Lu el al., 1996).
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Figura 3. Interacción de la profilina de Arabidopsis con actina. A) Modelo tridimensional de la
profilina 1 de Arabidopsis en el que se aprecian los aminoácidos implicados en la interacción con actina .
B) Igual que en A, pero representando las regione s de interacción en la estructura de la profilina
involucradas en la interacción con la actina (ro jo). C) Igual que en A, pero representando la superficie
de contacto de la profilina con la actina (ro jo); el resto de la estructura de la profilina aparece
representada en gris. Imágenen .-\ tomada de Thom el al, 1997; las imágene s e y D fueron generadas
con los programa Rasmol y Rastop.
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A B
Figura 4. La profilina interacciona con regiones ricas en prolinas. A) Representación esquemática
de la super ficie de interacción de la pro filina 1 de A rabidopsis con PLP (rojo). B) Representación
esquemática de la superficie de interacción de la profilina 1 humana con PLP. Cada uno de los
aminoácidos altamente conservados se indica en colores. La molécula de PLP aparece sobre la
superficie de interacción. Imágenen A generada con el programa Rasmol y Rastop e imagen B tomada
de Qian el al., 2005.
A B
Figura 5. Las profilinas presentan dos zonas de interacción con fosfoinosítidos. A)
Representación esquemática de la primera superficie de interacción de la profilina 1 de A rabidopsis con
los fosfoinosítidos (azul) y que se sobrelapa parcialmente con la super ficie de interacción con PLP
(ro jo). B) Repre sentación esquemática de la segunda superficie de interacción con fosfoino sítidos
(verde). Ambas imágenenes fueron generadas con los programas Rasmol y Rastop.
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Figura 6. Los dominios de interacción de las profilinas. Repre sentación esquernanca de la
distribución en la superficie de la profilina 1 de .Arabidopsis de los dominios de interacción con la actina
(verde), con PLP (rojo) y con fosfoinosítidos (azul). La superficie de interacción con actina solapa
parcialmente la superficie de interacción con los fosfoinosítidos, mientras que el primer sitio de
interacción con fosfoinosítidos solapa parcialmente el dominio de interacción con PLP. Imágen
generada con los programa Rasmol y Rastop.
1.2.4. Funciones de las prof il inas
Los resultados obtenidos de los análisis de interacción in vitro e in vivo llaman la atención sobre
la heterogeneidad de familias de proteínas con las que interactúa la profilina. Como se vio en
el apartado anterior, la presencia de los múltiples dominios (Figura 6) permite la interacción
con la fosfoproteína estimuladora de la vasodilatación (VASP) o la homóloga a la proteína
enabled de Drosophila (Mena), que participan directamente en la polimerización de la actina,
pero también con receptores de exportación nuclear, con reguladores de la endocitosis, con
moléculas efectoras de Rae y Rho y con putativos factores de transcripción. La uriión de la
profilina a los distintos ligando s proporciona un enlace entre distintas rutas en las que
participan cada uno de ellos, a la dinámica del citoesqueleto. Alternativamente, es posible
pensar que la interacción entre la profilina y sus ligandos puede intervenir en procesos
independientes de actina de modo que la profilina regule a estos ligando s directamente.
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Los experimentos realizados en sistemas heterólogos sugieren que algunas de las iso formas de
profilinas de diferentes rein os son funcion almente iguales. Las profilinas de plantas pueden
complementar los mutantes de Diayostelao» (Karakesisoglou et al., 1996) y de levaduras
(Christensen et al., 1996) que tienen deletado el gen de la profilina endogena. Lo mismo ocur re
cuando se complementan con las profilinas bovinas (Schluter et al., 1998).
E n las plantas, las profilinas parece que realizan muchos de los papele s que realizan en los
animales. Así pues, la profilin a de abedul (Betula uerrucosa} mues tra los mismos efectos en la
polimerización de la actina de animales in vitro que la realizada por las profilina s humanas
(Staiger et al., 1994). Sin embargo, ningun a de las profilinas de Arabidopsis muestran las mismas
tasas de intercambio de ATP de actina in vitro (perelroizen et al., 1996) que pre sentan las
profilinas de mamíferos o de A canthamoeba (perelroizen et al., 1995, Mockrin & Korn, 1980).
1.2.4.1. Organización del citoesqueleto de actina
Los primeros estudios realizad os con profilina sugerían que su principal función era la de
secuestrar los monómero s de actin a en un complej o con una estequiome tría de 1:1 (Carlsson et
al., 1976). Estos estudios reflejaban la capacidad de unirse y secues trar los monómeros de
actina-G, aunque la concentración de profilina in vivo era probablemente insuficiente para
explicar todo el intercambio de actina- G a actina-F en las células . D ebía existir pu es, otras
proteínas asociadas a actina-G que ayudaran en este proceso (McCurdy et al., 2001). Como ya
se mencion ó anteriormente muchas de estas proteínas ya se conocen.
Los estudios realizad os posteriorm ente han demostrado que el principal papel de las profilinas
es la regulación de la polimerización de actina. Las tres principales funciones de las profilinas
en la regulación de la polimerización de actina son:
(i) La profilina se puede uni r y secuestrar los monómeros de actina de modo que disminuye la
conc entración de monómeros de actina libre disponible para la elongación de los filamentos.
(ii) La profilina puede renovar en conjunto los mon ómero s de actin a-ATP, de este modo
puede aum entar 1000 veces de intercambio de nucle ótidos comparado con el intercambio
basado en ausencia de la profilina.
(iii) E l complejo actin a-ATP-profilina puede interaccionar con el extremo de rápido
crecimiento del filamento de actina y liberar el mon ómero de actina-ATP, el cual se a ñadide al
FA. Consecuentemente, el crecimiento de los filamentos de actina depende del intercambio de
la actina-ATP. A lo largo del FA, el ATP es lentamente hidrolizado por la actividad intrínseca
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ATPasa de la actina, de modo que se generara actina -ADP en el extremo de lento crecimiento
del FA. La acUna-ADP se puede liberar lentamente de este extremo por despolimerización o
rápidamente por la acción de proteínas despolimerizadoras de actina (Witke, 2004) (Figura 7).
(jii)
ATP- actin oADP-actin .. Profilin I
o
J
"\oy
o
at
Figura 7. Modelo de acción de la profilina con la actina. Las tres principales funciones de la
profilina en la regulación de la polimerización de la actina . (i) La profilina se une y secuestra los
monomeros de actina, disminuyendo la concentración de monomeros de actina libres que puedan ser
usados en la elongación. (ii) La profilina aumenta el conjunto de actina monomérica-ATP (rojo) ya
que favorece de intercambio de nucleótidos ADP-ATP.(iii) El complejo profilina-ATP -actina
interactua con el extremo de rapido crecimiento del FA y le añade la actina-ATP . A lo largo del
filamento, el ATP es hidrolizado lentamente por la actividad ATPasa intrinseca de la actina, que genera
actina -ADP (naranja) en el extremo de lento crecimiento del FA. E sta actina-ADP es liberada
lentamente del FA o bien rapidamente por la acción despolimerizantes de otras ABPs (no mostradas).
Imagen tomada de Witke, 2004.
Esta capacidad de regular la polimerización de la actina se ve reflejada en el efecto dual que
realizan las profilinas in vivo. En algunas condiciones las profilinas pueden promover la
polimerización de la actina. Este es el caso de la sobreexpresión de profilina en células
animales (pantaloni & Carlier 1993; Kang el al., 1999; Hopmann & Miller 2003) y en células
vegetales (Ramachandran el al; 2000; \V'ang el al., 2005), donde se ha encontrado un aumento
substancial en la proporción de actina-F aunque los niveles totales de de actina permanecen
inalterados, mientras que en otras condiciones puede producir la despolimerización de los
filamentos de actina, ya que la deleción de los genes de profilina de Dicryoslelium (Staiger el al.,
1999) o bien la inserción de un T-DNA en la profilina 1 de A rabidopsis (McKinney el al., 2001)
resulta en un aumento de la acumulación de actina-F,
- 16 -
1.2.4.2. Transducción de señales
Los primeros estudios realizados en sistemas animales demostraron que la unión de la
profilina al PI(4,5)P2 inhibe la generación de segundos mensajeros (IP} y DAG) debido a que
la profilina tiene mayor afinidad al PI(4,5)P2 que la que tiene la fosfolipasa C (pLC), cuando
ésta no está activada por medio de fosforilación (Sohn et al., 1995). Posiblemente, en células
vegetales la profilina podría tener la misma función ya que existen evidencias in vitro que
demuestran una inhibición de la PLC en presencia de profilina.
Las profilinas de vertebrados pueden ser fosforiladas in vitro en serinas /treoninas por una
proteína cinasa C (Hansson et al., 1988; Singh et al., 1996) y en tirosinas por pp6üe. m (De Corte
et al. , 1997). A su vez, las variaciones en la concentración de la profilina en el polen modifican
el estado de fosforilación de muchas proteínas, existiendo una relación inversa entre la
concentración de profilina y el nivel de fosforilación observado. Pero, ¿cómo puede la
profilina actuar sobre la fosforilación de proteínas? Existen varias hipótesis que podrían
explicarlo:
1) La explicación más sencilla es que la profilina modifica las actividades cinasa o fosfatasa de
algunas proteínas. La profilina podría potencialmente interactuar directamente con estas
proteínas y alterar la habilidad de estas de unirse con sus substratos. Altern ativamente, la
profilina podría interactuar indirectamente, con proteínas cinasa y/o fosfatasas para modular
su actividad. Un ejemplo es que la PI3K de clase I, puede pegarse a la profilina de mamíferos
in vivoy estimular así la actividad de la PI3K (Singh et al., 1996a).
2) La profilina podría facilitar indirectamente la fosforilación de proteínas por medio de la
alteración de las proporciones de actina polimerizada en extractos citosólicos, los cuales
podrían potencialmente afectar la actividad proteína cinasa. Un ejemplo de este caso es la
proteína cinasa dependiente de calcio e independiente de calmodulina (CD PK), que puede
interactuar con la actina-F en células vegetales (putnam-Evans et al., 1990).
3) La profilina podría actuar a través de unir un ligando compartido, de modo que competiría
con las cinasas y fosfatasas por estos cofactores (Machesky et al., 1994; Alvarez-Martinez et al.,
1996, 1997).
Hasta la fecha existen vanos reportes en los que las profilinas parecen implicadas bien
directamente o indirectamente con las rutas de señalización. El reporte más reciente implica a
la profilina 2 de tabaco en la cascada de señales de .las MAPK, ya que en ensayos in vitro, las
MAPK p45Ntf4 YSIPK, cuando son activados por la MAPKK. NtMEK2, puede fosforilar la
- 17 -
profilina 2 (Limmongkon el al., 2004) . Estudios informáticos realizados en e! laboratorio
muestran que en general, las profilinas de plantas presentan e! dominio de reconocimiento
para que las MAPKK las fosforilen en residuos de treonina, así como también presentan e!
motivo de fosforilación para las MAPK. En la profilina de Pbaseolus vulgaris, este motivo de
fosforilación de MAPK coincide con e! residuo encargado de reconocer e! motivo tipo ZPPX
de la PI3K de clase III de Pbaseolus vulgaris (Aparicio-Fabre el al , no publicado).
Algunos componentes de la ruta de las tvIAPK, pueden interactuar con pequeñas proteínas de
unión a GTP de la familia de las Ras o Rho en respuesta a estímulos exte rnos. De las rutas de
señalización, la de Rac-Rho es una de las mejores establecidas que regulan e! citoesque!eto de
actina, como lo resalta la dependencia de Rac1 en e! rizado de la membrana y en la formación
de fibras de estrés inducidas por Rho (Nobes el al , 1995). Existen muchos ligandos de
profilina que son efectores de Rac y Rho aunque aun no se conoce si las profilinas interactúan
directamente con Rae y/o Rho o con algunas otras GTPasa.
Hay otras proteínas en la ruta de Rac que si unen a la profilina, una de ellas es Nap1 y otra es
POP-130, de función desconocida (Witke el al, 1998). Ambas moléculas forman parte de!
complejo hetero tetramérico constituido por WAVE 1 (homologa de WASP en e! síndrome de
Wiskott- Aldrich), la proteína de choque térmico (HSP) C300, Nap1 y POP-130. La proteína
GTP-Rac1 se une a POP-130 y puede disociar de! complejo tetramérico a WAVE1,
permitiendo que ésta active la polimerización de actina. Además, la profilina es un activador de
WASP / \VAVE 1 al unirse a una región rica en prolinas en e! centro de la molécula (Witke el
al., 1998).
Otra clase de pequeñas moléculas de unión a GTPasa, en este caso moléculas de unión a Rho,
interactúan con profilina. Los tres genes de ratón, ho mólogos al gen diaphanous de Drosophila,
(mDia1, mDia2 y mDia3) (\Vallar & Alberts 2003) tienen potente actividad de polimerización
de actina. Normalmente, la proteína diaph anou s se encuentra en una co nformación inactiva
resultado de la aso ciación de su domin io GB D (N- terminal de unión a GTPasa) con e!
dominio DAD (C-terminal autorregulador) . Cuando se une Rho al dominio GBD, se impide la
autoinhibición y se activa la actividad nucleadora de actina.
La molécula diaphanous contiene un dominio FH1 (homologo a forminas, rico en prolinas),
con 13 repeticiones ricas en prolinas, en donde se une la pro filina. Existe una interesante
analogía entre la molécula diaphanous y WASP. WASP está generalmente en conformación
cerrada, autoinhibida y solo cuan do se une a cdc42, aparece e! sitio de unión a Arp2/3 y se
produce la nucleación de actina por e! complejo WASP-Arp2/3 (Kim el al , 2000).
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Interesantemente, la profilina parece cooperar con la activación de \V'ASP, prob ablemente
induciendo una conformación abierta (Yang el al., 2000).
Todas estas observaciones nos permiten prop oner un mod elo en el cual la profilina po dría
actuar como una pro teína que conecta las rutas de señalización con la reorganización del
citoesqueleto de actina.
1.2.4.3. Tráfico de membranas
Los eucariotas unicelulares han proporcionado notables evidencias del papel de las profilinas
en los procesos de endocitosis y tráfico de membranas. En células animales, la profilina parece
estar implicada en el tráfico de membranas, como lo indica la presencia de la profilina 1 en la
formación de vesícula s desde el Golgi y en el reclutamiento de din amin a 2, dependiente de
profilina 1, hacía el Golgi. E ste reclutamiento es necesario para la formación de las vesículas
que parten del Golgi (pearson el al., 2003).
Experimentos proteómicos realizado s en el cerebro de ratón, apo yan el papel de la profilina en
la endocitosis por medio de la form ación de diversas in teracciones. La pro filina 1 forma un
complejo con las pro teínas clatrina y VCP (proteína contenedora de valosina). La clatrina se
reúne para formar vesículas recubiertas mientras que la VCP, homóloga a la pro teína sec18 de
levaduras, esta implicada en el tran sporte de las vesículas (Witke, 2004). La profilina 2
interacciona específicamente con la dinamina 1, con la sinap sina y con Nap1 (pro teína
asociada a nck) (Witke el al., 1998). La dinamina 1 es una GTPasa que se localiza en el cuello
de las vesículas cubiertas nacientes o en formación; las sinapsinas están asociadas con las
vesículas secretoras y Nap es una molécula adaptadora unida a membranas . Todas estas
moléculas están relacionadas con la endocitosis y el reciclado de vesículas en la sinap sis lo que
sugiere que en las neuronas, la profilina 2 puede regular estos procesos . Ex isten datos que
apo yan este hech o ya que la profilina 2 parece regular la acción de la dinamina 1 compitiendo
con sus ligandos conocidos, grb2, anfifisina, y endofilina, de mod o que inhibe la formación del
los complejos endocí ticos (Witke, 2004).
E n las neuronas existe un denso andamio de citoesqueleto que está organizado
estructuralmente por la gefirina que une los recep tores de glicina con los microtúbulos y
posiblemente, con el citoe squeleto de actina. El con jun to de gefirina es esencial para el
agregado de estos receptores a las membranas. Se sabe que tan to la profilina, VASP y Mena se
unen a la gefirina (Reinhard el a/., 1995; Gie semann el al., 2003). Además, al menos en
- 19 -
neuronas, existen o tras 3 pro teínas de andami aje que interactúan con pro filina 1 y profilina 2:
drebrina, aczo nina y delfilina (Mammoto et al., 1998); la debrina puede unirse a actin a y tiene
un papel en la formación de espin as dend ríticas, la aczon ina es un compo nente del
citoesqueleto presináptico y se la ha implicado en el tráfico de vesículas neurotransmisoras y la
delfinina es un a proteína de and amiaje en las células de Purkinje en las cuales une directamente
la subunidad &2 del receptor de glutamato (Miyagi et al., 2002). Todos estos hallazgos implican
que en las neuronas, las profilinas se requieren tan to en los compartimientos presinápti cos
como postsinápti cos.
1.2.4.4. Regulación genética
Debido a su pequeño tamaño, la profilina (15 kDa) y el complejo actina-profilina (57 kDa)
podrí a ser capaz de entrar en el núcle o por difusión . La profilina se puede encontrar tan to en
el núcleo como en el citoplasm a; sin embargo, la mayoría de la profilina está secuestrada en el
citopla sma y solamente una pequeña porción esta libre para poder difund ir o bien existe un
mecanismo de transpo rte que exporta activamente a la actina hacia el citoplasma.
Recientemente, en células animales se ha encontrado una expo rtina específica del profilina
(Expo rtina 6) que reconoce el complejo actina-pro filina, no a la profilina sola, y la expo rta
fuera del núcle o (Stuven et al., 2003). Es te hallazgo parece indicar que la presencia de la
profilina y la actin a en el núcl eo está finamente regulada. Con esta inform ación se podría
especular sobre el papel que pudieran tener la actina y/o la pro filina en los procesos de
empalme ("splicing"), en el remodelado de la cromatina o bien en la regulación
transcripcional.
E studios posteriores han dado pie a esta idea. La pro filina 1 se ha visto asociada a vanas
estructuras subnucleares como elementos ribosomales y cuerpos de Cajal, y asímismo se ha
visto que esta interacción pu ede interferir con el proces amiento del pre-RNAm (Skare et al.,
2003). Además, existe un reporte en el que la profilina forma un complejo con el factor de
transcripción p42POP y regula su actividad (Lederer et al., 2005). Es te factor actúa como un
represor y la interacción con la profilina disminuye su actividad represora.
Así, en la mayoría de los organismos mul ticelulares parece dem ostrarse que una de las formas
de con trolar los patrones de expresión, aparte de aumentar los complejos de regulación
transc ripcional, es aume ntar el número de genes que codifican profilin as, como ocurre en
- 20 -
Drosopbila o en mamíferos (Cooley et al., 1992), o bien aumentar el numero de iso formas que
se pueden generar a partir de un gen que codifica profilina, como ocurre en Phaseolus vtllgaris
(G uillen et al., 2001). Mientras que el citoesqueleto de actina y la mayoría de las estructuras de
las espinas dendríticas parecen estar preservadas en ausencia de la profilina 2, la homeostasis
de la neurotransmisión sí parece estar seriamente afectada, lo que correlaciona con alteraciones
en la conducta (\Vitke, 2004). Existe pues un papel principal para la profilina 1 en la regulación
del citoesqueleto de actina y en la dinámica de de las neuronas y una importante función para
la profilina 2 en el trafico de membranas (\Vitke, 2004).
Existe una pléto ra de proteínas que pueden interactuar con las profilinas existentes en todos
los reinos (Figura 8). Las proteínas implicadas en estas interacciones abarcan infinidad de
procesos que van desde la transducción de señales hasta la reorganización del citoesqueleto de
actina .
. .
Figura 8. Las conexiones de las profilinas. Las proteínas que se conocen que interaccionan con
pro filina aparecen agrupadas en relaeion con su localización celular o a los complejos en los cuales se
han encontrado . Algunos de los ligando de profilina son compartidos por diversos complejos
(indicadas por lineas intermitentes), lo que suguiere un entrecruzamiento entre plataformas de
señalización que tienen a la profilina como comun denominador. Existen varios enlaces con las
pequeñas GTPasas tales como Rac1, RhoA, cdc42, Ras y Rap que son parte de rutas de señalización en
el citoesqueleto de actina. Las interacciones directas entre las profilinas y sus ligando s aparecen
indicadas por las líneas continuas. Tomada de Witke, 2004.
- 21 -
1.3. FOSFATIDIL INOSITOL 3-CINASA (PI3K)
El fosfatidilinositol (PI) , principal sustrato empleado para la síntesis de tod os los lípido s que
contienen ino sitol en las células eucariotas , con siste en un grupo D-myo- inositol-1-fosfato
(Inositol-1-P) unidos por medio de un grup o fosfato a un diacilglicerol.
De los lípidos que contienen inositol, el PI es el más abundante en las células de mamífero s en
condiciones básales con unos niveles que superan más de 20 vece s al resto de los lípidos que
contienen inositol. Algo parecido ocurre en plantas , donde el PI es un fosfolípido común
constituyente de la membrana plasmática y sólo está superado por los niveles de
fosfatidilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE).
La cabeza de inositol de los PI presenta cinco grupos hidroxilo libres, de los cuales tres de
ellos se ha encontrado que pu eden ser fosforilados en las células eucario tas, en diferentes
combinaciones. Hasta el momento, las posiciones do s y seis de estos lípidos no se con oce que
se puedan esterificar con un fosfato cuando el anillo de inositol está esterificado en forma de
PI. El PI Ysus derivados fosforilados se los llama colectivamente fosfoinosítidos, de los cuales
siete especies han sido documentadas en las células eucariotas y son: fosfatidilinositol (5)
monofosfato [PI(5)P], fosfatidilinosi tol (4) monofo sfato [PI(4)P], fosfatidilinositol (3)
monofosfato [PI(3)P], fosfatidilinositol (4,5) bifosfato [PI(4,5)P2] , fosfatidilinositol (3,5)
bifosfato [PI(3,5)P2], fosfa tidilinositol (3,4) bifosfato [PI(3,4)P 2] y fosfatidilinositol (3,4,5)
trifosfato [PI(3,4,5)P3] (Figura 9).
De los fosfoinosítidos difosforilado s, el PI (4,5)P2 es el más abundante (> 99%), de modo que
solo el 0.2% corresponden al PI (3,4)P2 y PI (3,5)P2, mientras que de los fosfoinosítid os
monofosforilado s el 90% corresponden a PI (4)P , mientras que solamente entre 2-5% son los
PI(5)P y PI (3)P. A su vez, los niveles de PI(4)P y de PI (4,5)P2, se suelen encontrar en
concentraciones parecidas, siendo los niveles del PI(3,4,5)P3 el que variamás entre una s
células y otras, aunque sus niveles pueden compararse a los niveles de PI (3,4)P2 y PI (3,5)P2
(folias & Cantley, 1999; Rameh el al, 1997).
Todos los fosfoinosítidos se encuentran residentes en las membranas y son el sustrato de
cinasa, fosfatasas y lipasas residentes en estas membranas.
En general , las formas fosforiladas del PI apar ecen implicados en procesos de tran sducción de
señales que conducen a la proliferación celular, organización del cito esqueleto y en la
regulación del tráfico de membrana (Fruman el al., 1998; Corvera el al, 1999; Huijbregts el al,
2000; Simonsen el al, 2001).
- 22 -
t : Class III Ptdlns 3-kinase
2: Ptdlns -s-ktnaee
3 . lypc 111I PIPkin
4 Iypc 111 PIPión
Ptdlns(3,S)P2 Ptd lns (3,4)P2
Ptdlns( 3 ,4 ,5)P)
Ptdlns(4,5)P2
Ptd lns3P Ptdlns4P
~ ¡
3 i ~
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Ptdlns5P
Ptdlns
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'~!~o.'I-o Ptdlns
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Figura 9. El metabolismo del PI. Se muestran las diferentes etapas en la síntesis de los
fosfoinosítidos y las cinasas de lípidos implicadas en las diferentes reacciones. De los siete derivados
fosforilados identificados en células animales, el PI (3,4,5)P3 es el unico que nunca se ha observado en
células vegetales . La presencia del PI(5)P en plantas solo esta recientemente demostrada (flechas
discontinuas) (Meijer el al, 2001). Las plantas carecen de las enzimas necesarias para el paso del PI (4)P
a PI (3,4)P2 y del PI (4,5)P2 a PI (3,4,5)P3 (flechas grises), de manera que el PI (4,5)P2 se puede sintetizar
a partir del PI (4)P o PI (5)P por medio de la actividad de algunas fosfatasas . Modificado de Mueller-
Roeber & Pical, 2002 .
1.3.1. Clasificación y estructura de las PI3K
En las células eucariotas se han encontrado 4 especies de PI fosforilado en la posición, 3 de las
cuales son generadas por la actividad de las fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K): el
fosfatidilinositol (3) mo no fosfa to [PI(3)P], fosfatidilinosit ol (3,4) bifosfato [PI(3,4)P2],
fosfati dilinos itol (3,4,5) trifos fato [PI(3,4,S)P3] . Las PI3K se dividen en 4 clases, referi das
como lA, lB, II Y III , basándose en su secuencia, en las características estructurales y en la
espe cificidad de sustrato (Figura 10). Las 4 clases presentan algunos dominios característicos y
comunes, y difieren en otros dominios. Cada tipo de PI3K contiene un dominio C2 y un
dominio catalítico conectado por un dominio helicoidal (el dominio PIK) que es típico de las
cinasas de lípidos pero no de las cinasas de proteínas (Vanhaesebroeck el al., 2001; Golden el
al., 2004). Los dominios C2 de las PI3K están implicados en la unión de fosfolípidos,
independientemente de calcio , y parecen están implicados en reclutar las PI3Ks a las
fracciones membranales de las células (Koyasu, 2003). Además, las clases I y II de PI3K, pero
no las del tipo III, presentan dominios simp les de unión a la pro teína Ras en su extremo
amino terminal (Wymann & Pirola, 1998; Fruman el al., 1998) (Figura 10).
- 23 -
Catalytic Subunit Adl!ptcr Subunjl
lA P I lOu.~.O pJ;511
p8SIl
p55a.g
p50u
*lB p llOy plOl
11 I'IJKC2u.ll.y
111 Pldlns3K pISO
\-l~"l11l ina l myristylation conscnsus site
'n--homoIOb'Y3 (SH 3) dornain
'n--homology 2 (SH 2) dornain
Proline Richdomain
rhoGAr homology domain
Ser/Thr protein kinase domain
Lcucinc-rich repeats
..Tryptophan-Aspartic Deid motifs
o-Ras hinding domain
pH5-binuin¡,: región
*Also interacts with Bv subunits of G-oroteins
CJ Phox-homo logy (I'X) domain
fl!ffJ czdornain
Phosphatidylinosuol kinase (I' IK)dornain
<> Catalyt ic domain
Figura 10. Caracteristicas estructurales de la familia PI3K. Representación esquemática de los
dominios que constituyen las subunidads cataliticas y reguladoras de las distintas clases de PI3K.
Modificado de Golden & Insogna, 2004.
1.3.1.1. Las PI3Kde clase I
La PI3K de clase I tiene la capacidad de usar tanto el PI, PI (4)P Yel PI (4,S)P2 como sustratos.
Es por tanto importante notar que solamente las PI3Ks de tipo I pueden producir PI (3,4,S)P3
in vivo, cuando emplean como sustrato el PI (4,S)P2.
Las PI3Ks de la clase I incluyen a 4 miembros, los cuales están a su vez divididos en dos
subclases: IA y IB, basándose en la diferencia en sus mecanismos de activación . Las PI3K de
la clase lA son heterodimérícas, comprenden una subunidad reguladora y una subunidad
catalítica, y son activadas río abajo por receptores implicados en la señalización del tipo de las
- 24 -
tirosina cinasa (PTK) (Fruman et a/., 1998). La clase lA tiene 3 tipos de subunidades catalí ticas:
las p l l O« y p11 0~ se expresan en tod os los tejidos y organismos, mientras que las p1100 se
expresan principalmente en leucocitos . La clase lA también presenta 5 diferentes sub unidades
reguladoras: las p85 ex, p 55ex y p50ex se derivan de un solo gen por mecanismos de splicing
alternativo , mientras que las p85~ y p55 y si están codificadas por distintos genes. De todas las
subunidades regulador as, la p85ex es la más expresada. Las subunidades p85 ex y p85~ contienen
dos dominios de homología a Src2 (SH 2) que están conectados entre si por un dominio inter-
SH2 con estructura coiled-coil. El dominio inte r-SH2 interactúa constitutivamente con el
dominio N-terminal de la sub unidad catalítica asociad a p110 para mantener la estabilidad de
esta pllO en la célula (Wymann & Pirola, 1998). Los dos dominios SH2 son particularmente
importantes para la función de la subunidad p85 porque éstos son los que reclu tan a la
subunidad pl10 hacia las proteínas fosforil adas en tirosinas en la membrana plasmática. La
interacc ión de los dominios SH2 con los residuos de tirosi na de varias proteínas adaptado ras,
tales como los miembro s de la familia de receptores de la insulina (IRS), activa n la actividad
cinasa p11 0, la cual está norm almente inhibida por el complejo p85-p11 0 (Vanhaesebroeck et
a/., 2001; Wymann & Pirola, 1998). La subunidad pll O también contiene un domin io de unión
a la forma activada de Ras (GTP-Ras), lo que sugiere que hay una ru ta de activación alternativa
para esta subunidad.
Tanto la p85 ex como la p85 ~, pre sentan un dominio SH 3 y una región rica en prolina en su
dominio N-terminal. Ademá s, presentan un dominio de homología a Bcr (EH).
A pesar que los dominios BH pueden unir tanto Cdc42 como Rac1 , no se ha visto que
ninguno de ellos tenga actividad GAP (dominio de activaci ón por GTP). Las subunidades p50
y p55 no contienen el dominio SH3 y el dominio BH . N otablemente, Drosophila melanogaster y
Caenorhabditis elegans tienen una subunidad regulador a que pres enta características estruc turales
con las subunidades p50 y p55 de manúfero s (Katso et a/., 2001; Okkenha ug &
Vanhaesebro eck, 200 1).
Aparentemente, las grandes subunidades reguladoras, p85ex y p85~ , han evo lucionado tarde
para proporcionar a los manúferos distintas funciones. E l dominio N-termina l de p85ex y p85~
podrían func ionar como dominios conectores que le permiten a las subunidades p8 5 aso ciarse
con otras proteínas , como es el caso de la pro filina y de gelsolina (Singh et a/., 1996), en
procesos de reo rganización del citoe squeleto (O kkenhaug & Vanhaesebroeck, 2001).
La única enzima del tipo lB es la p11 0y, está presen te solamente en manúferos y se
preferentemente en leucocitos (Vanhaesebroe ck et a/., 2001). E sta enzima es estructuralmente
- 25 -
parecida a los miembros de p l l O de la clase lA, pero carece del dominio de unión a p85. E n
vez de esta unión a p85, p l l0y interacciona con otro tipo de subunidad regu ladora, la pl0l , y
se activa a través de receptor~s acoplados a pro teínas G (G PCRs) (Vanhaesebroeck el al.,
2001). Los ligando de los GPCR así como las quimocinas activan a las proteínas trimericas G,
lo que resulta en la disociación de las subunidad G(J( de las subunidades G~y. Es te complejo de
subunidades G~y es capaz enton ces de interaccion ar y activar a pll 0y.
1.3.1.2.Las PI3K de clase II
Las PI3K de la clase II contienen 3 miembros: PI3K-C2(J( y PI3K-C2~ se expresan
ubicuamente, mientras que PI3K-C2y se expresa primariamente en hepatocitos
(Vanhaesebroeck el al., 2001; Katso el al., 2001). Las PI3 K de la clase II tienen 2 dominios
distin tivos en su extremo C-terminal, un dominio con homología a ph ox (PX) y otro dominio
C2. El dominio PX es capaz de unir tanto PI (3)P como PI(3,4)P2 y recluta a las PI3K de tipo
U a las membranas. La funci ón de dominio C2 aun no se con oce. Todas las P I3K de clase U
son capaces de fosforilar PI y PI (4)P in oitro para generar PI (3)P y PI (3,4)P2 respectivamente,
pero su actividad in vivo aun no se ha clarificado. Las PI3K de la clase U son activadas por los
receptores de! factor de crecimien to, receptores de quimocinas y de integrinas
(Vanhaesebroeck el al., 2001).
A diferencia de las PI3K del tipo lA e IB, no se han identifica do mo léculas adaptadoras y se
con oce muy poco sobre lo que ocurre a nivel molecular después de su activación. Su
localización celular es controversia!: mientras que alguno s estudios sugíeren que la mayoría de
las PI3K de tipo U están en e! núcleo, otros reportes la localizan en e! aparato de Golgi y
vesículas cub iertas de clatrina (Wymann & Pirola, 1998; Katso el al., 2001).
1.3.1.3 . Las PI3K de clase III
La bú squeda en la levadura S. cerevisae permitió identificar más de 40 genes implicados en la
perdid a de la capacidad de mandar proteínas hacia la vacuo la y por tan to pro teínas implicadas
en la llegada de vesículas a la vacuo la (VPS) (Klionsky & Emr 1990). Es tas vesículas son las
encargadas de la clasificación ("so rting") y tráfico de proteínas hacia la vacuola (Stack and Emr
el al., 1994). De las proteínas identificadas, algunas resultaron ser fosfatidilin ositol cinasa (p I-
K). Una de estas PI-K, la proteína Vps 34p es una PI3K de clase IU.
- 26 -
La proteína Vps34p es la principal representante de la clase IIl. Se han encontrado ortólogos
en mamíferos (Brown el al., 1995), Dicryoslelium (Zhou el al., 1995), Drosophila (Linassier el al.,
1997) y en plantas (Hong & Yerma el al., 1994; Welters el al., 1994; Aparicio-Fabre el al., no
publicado). La localización de los homólogos de la Vps34p en otros eucariotas y estudios
filogen éticos ha puesto a las PI3K tipo III como ancestro del resto de las clases de PI3K.
El único producto que puede ser generado in oitro e in vivo por la Vps34p es el PI(3)P, ya que
es incapaz de emplear ningún otro fosfoinosítido a partir del PI (Stack & Emr, 1994).
En levaduras, Vps34p forma un heterodímero con la proteína cinasa en serina/ treonina
VpslSp (Herman el al., 1991; Stack el al., 1993). Aunque no se sabe muy bien como se activa
VpslSp, es claro que la actividad proteína cinasa es un requisito para la formación del
complejo VpslSp-Vps34p. Este complejo coloca a la proteína Vps34p en el correcto
compartimiento membranal y además estimula que la actividad cinasa de lípidos aumente más
de 10 veces (Stack el al., 1995). Asimismo, la PI3K de los mamíferos de la clase III también se
ha visto que forma un heteradímero con la cinasa en serina /treonina plS0. A igual que le
ocurre a Vps34p, la proteína plS0 requiere estar activada para localizar a la PI3K en la
membrana.
1.3.2. Funciones de las PI3K clase III
Aparte del papel fundamental que las PI3K de clase III desmpeñan en la mayoría de los
procesos de trafico intracelular, poco después de su descubrimiento, a las PI3K de clase III se
les intento asignar algún papel en los procesos de transducción de señales, estos es, debido al
papel que realizan otros fosfoinosítidos como segundos mensajeros y a procesos de
reorganización del citoesqueleto de actina debido fundamentalmente a su localización
membranal ya los precedentes existentes de la interacción de la profilina con las PI3K de clase
I (Singh el al., 1995; Okkenhaug & Vanhaesebroeck, 2001).
1.3.2.1. Tráfico intracelular
La mayoría de los estudios realizados hasta el momento muestran que el principal papel y
mejor caracterizado de las PI3K de clase III es el tráfico intracelular (Figura 11). Su
localización preferencial en las membranas intracelulares y la generación del PI(3)P, producto
reconocido por muchas proteínas implicadas en procesos de trafico celular, las ha implicado
en los procesos de clasificación de proteínas/lípidos hacia la vacuola (\V'urmser el al., 1999),
- 27 -
fusión de endosomas (Wurmser et al., 1999), tran sporte de proteínas hacia los lisosomas (Stein
et al. , 2003), procesos de autofagia (Kihara et al., 2000; Wurmser & Emr 2002), en la formación
del fagosoma (Vieira et al., 2001), formación de vesículas en los endosomas/ cuerpos
multivesiculares (Futter et al., 2001; Odorizzi et al., 2003), tran spor te retrogrado desde el
end osoma al aparato de Golgi (Burda et al., 2002), tran sporte de membranas desde el espacio
perinuclear hacia la periferia celular (Roggo et al., 2002) y transporte desde los endosomas
hacia el citosol de la nucle ocápsida de algunos virus (Le-Blanc et at., 2005).
El estudio de la ruta de secreción de proteínas en las levaduras mutantes de Vp s34p (Wurmse r
et al., 1999) reflejó que mientras que la proteína invertasa era transportada con normalidad a la
vacuola, la proteína carboxipeptidasa Y (CYP) no era capaz de localizar se en és ta. Es to indica
que la Vp s34p está implicada directamente en el clasificado de proteínas desde los endosomas
hacia el compartimiento vacuolar en levadu ras, ya que solame nte algunas proteínas se perdían
en el camino a la vacuola. En una población donde Vps34p no está presen te, la mayoría de las
células exhibe una morfología de la vacuola normal mientras que algunas pro teínas se
encuentran deslocalizadas en su superficie vesicular. Así pues , la perdida de Vp s34p sólo
afectaría un a disminución parcial de la actividad normal en la vacuola .
Una segunda actividad en la que se implicó a la Vps34p (Wurmser et al., 1999), es par ticipar en
los primeros proc esos de clasificación de pro teínas vacuo lares desde su salida del Golgi,
quizás en el empacado de estas proteínas en vesículas transpo rtadoras adecuadas. E n ambo s
casos, el ensamblaje de la vacuola se puede llevar a cab o en ausencia de Vps34p pero las
funciones vacuolares se verían comprometidas ya que muchas proteínas no se encontrarían en
el lugar adecuado. De esta forma la ruta secretora en levaduras está severamente inhibida en
los mutantes de levadura.
E n las células eucariotas, la ruta secretora es la encargada de la mod ificación y en trega de las
proteínas a una amplia var iedad de compartimentos intracelulares y extracelulares. La entrada a
esta ruta está mediada por la presencia de una secuencia señal N-terminal y por la
translocación a través de la membrana del retícul o endo plásmico (RE). Las prot eínas
destinadas a la secreción son entregadas desde el RE hacia el Golgi encerradas en vesículas de
transporte. Este flujo intracelular de proteínas desde el RE a la superficie celular ocurr e por
medio de un mecanismo intrínseco; las proteínas que carecen de una marca que determine una
dirección intracelular son transportadas a la superficie celular. Sin embargo , las proteínas
residentes del RE , Golgi o lisosomas u otros compartimen tos se caracterizan por la presencia
de marcas o señales de retención que les aseguran una localización subcelular. De esta forma ,
- 28 -
deben existir mecanismos que le permitan a la célula reconocer y distinguir estas marcas y de
esta form a colocar a las proteínas en un compartimien to intracelular adecuado.
Muchas de las características de la ru ta secretora están conservadas en todos los eucariotas,
desde levaduras a mamíferos. E n particular, el transpo rte de proteínas hacia la superficie de las
levadurasconlleva el paso por el RE hacia el Golgi. Todas las proteínas transitan en sus etapas
tempranas a través de la misma ru ta secretora, y es ya en el G olgi donde unas pro teínasson
destinadas a la secreción y otras a sus destinos intracelulares . Es por ello que la mayor parte de
los estudios en los que se ha visto implicada la PI3I<:. de la clase III estén relacion ados con el
tráfico de proteínas desde el G olgi tanto en plantas (Burda et al., 2002) como en animales
(Futter et al., 2001; O do rizzi et al., 2003) por medio del empleo de construcciones en
antisentido de PI3I<:., como por medio del empleo de inhibidores específicos de está, la
wortmanina y el LY294002 (Matsuoka et al., 1995). Gracias a estos estudios se ha demostrado
que la PI3I<:. tipo III es esencial para el crecimiento normal de la planta ya que la expresión en
antisen tido de la PI3I<:. permi te producir plantas trans formadas de segunda generación
fenotipicamente mu y afectadas (Welters et al., 1994); además existe una inducción y represión
específica de las PI3I<:. durante la formación de los nódulos y que esta formación correlaciona
directamente con el grado de proli feración de las membranas celulares (Hong & Yer ma, 1994)
y con la producción de auxinas (Es trada et al., no publicado), y está producción de auxinas es tá
implic ada a su vez con la producción de especies reactivas de oxígeno (Liu et al. , 2005). La
ausencia de la actividad Vps 34p en levadura, además de los fenómenos ya mostrad os de
alteración de la morfología y acidificación de la vacuola (como efecto secundario de la falta de
llegada de componentes), han mostrado más papeles en diferen tes procesos como son el
crecimiento sensible a temperatura (Wurmser et al., 1999), en el control del estrés osmótico
producidos por salinidad (Günther et al., 2005) asimismo, afecta a los pr ocesos de adhesión y
virulencia (Bruckmann et al., 2000).
- 29 -
( • _ 1
~
Prevacuolar
compartment
Figura 11. La PI3K de clase III en el tráfico intracelular. Vista esquemática de muchas de la rutas
en las que esta implicada la PI3K de clase 111, el trafico intracelular, y sus posibles papeles en el núcleo,
entre otros. Modificado de Bassham & Raikhel, 2000.
1.3.2.2. Transducción de señales
Inicialmente se llego a pensar que el PI (3)P generado por las PI3K podría actuar como
segundo mensajero , sin embargo, aun hasta la fecha, no se ha enco ntrado que el P I(3)P sea un
buen sustrato para la PLC (Serunian elal., 1989).
Actualmente, no existen reportes que implique directamente a la PI3K de clase III en procesos
de trans ducción de señales, aunque si existen reportes que la implican indirectamente, por
medio de su coop eración con la PI3K de clase 1, en procesos de internalización de receptores.
Esta bien caracterizado que el proceso de internalización de alguno s receptores (Ej. Receptor
EGF), es un mecanismo muy importante para la regulación de la señal que transmiten. En este
proceso la PI3K de clase I parece ser la implicada en el proceso de formación de la vesículas
que engloban al receptor, mientras que la PI3K de clase III interviene en su tran sporte hacia el
endosoma (Futter el al., 2001).
- 30 -
1.3.2.3 . Organización del Citoesqueleto
E n el caso del posible papel de la PI3K de clase III con el citoesqueleto de actina, existen
varios reportes que parecen implicarla tanto directa como indirectamente.
En Phaseolus vulgaris se ha observado la interacción direc ta en tre la profilina y la PI3K de clase
III (Aparicio-Fabre el al, no publicado).
E xisten evidencias indirectas en células CHO (células de ovario de hamster Chino) en donde
se ha observado que tanto la PI3K de clase I como la PI3K de clase III in tervienen en la
formación del ondulado de las membranas y en el tráfico vesicular, proce sos ambo s que
requieren de la reorganización de la actin a (Siddhanta el al, 1998). O tro ejemplo que la implica
indirectamente, y demuestra nuevamente la cooperación entre ambas clases es la formación de
fagosomas, durante la fagocitosis de algunos parásitos intracelul ares, en donde la PI3 K de
clase I interviene en el nacimiento del fagosoma mientras que la actividad PI3K de clase III es
necesaria para el proceso de intern alización y maduración (Vieira el al, 200 1).
Otros reportes han relacionado a Vps34p en procesos de formación del septo de separación y
de fusión en levaduras, pr oces os ambo s que requieren del remodelado del citoe squeleto de
actina (Wang el al., 2003; Takagi el al., 2003).
1.3.2.4. Regulación genética
Desde 1990 esta bien establecido que las células de mamíferos, además del conjunto de
fosfoinosítidos asociados a la membrana plasmática y al citoesqu eleto, presentan un conjunto
de fosfoinosítidos nucl eares . Parece claro además, que algunos fosfoinosítidos como el
PI (4,5)P2 generado en el núcle o pu ede ser un sustrato de la PLC nucl ear o bien ser fosforilado
en la posición 3 generando PI(3,4,5)P2 . E s también conocido, que el PI(4,5)P2 juega un papel
en la localización y regulación de ciertas proteínas nucleares organizadas en complejos (ej. E l
complejo BAX, que está implicado en la regulación de la estructura de la cromatina). Sin
embargo, hasta hace relativamente poco no se había encontrado ninguna actividad nuclear
asociad a a los fosfoinos ítidos en el núcleo de células vegetales (Bunney el al, 2000). Es to
cambió cuand o se detectaron actividades tipo PI3K y PI4K, lo que ha permitido pensar que el
PI (3)P Yel PI (4)P puede ser sintetizado en el núcleo. La mayor part e de la actividad PI4K se
localiza en la membrana nuclear mientras que la actividad PI3K se asocia más a localizaciones
subnucleares. La PI3K de soya es catalíticamente activa en el núcle o y aparece íntimamente
asociada con sitios activos de transcripción del núcleo y del nucleolo (Bunney el al, 2000).
- 31 -
Esto sugiere que la PI3K, al menos en células vegetales pueda tener un papel en procesos
transcripcionales.
Otros reportes más recientes apoyan la teoría de que la PI3K de clase III está implicada en
procesos de regulación genética, directa o indirec tamente. La ausencia de Vps34p en la
levadura Saccharomy ces cereuisiae produce un acortamiento de los telómeros de diferente tamaño
al producido por un mutante deficiente en la actividad telomerasa. E ste mutan te de Vps34p
también parece aumentar el tamaño del espacio nuclear, pudiendo en ultima instancia interferir
con el tamaño de los poros nucleares (Rog el al., 2005).
La forma en la que la PI3K de clase III parece estar implicada en todos estos procesos es por
medio de su producto, el PI (3)P, el cual es capa z de formar micro-dominios en la superficie de
las membranas intracelulares modificando su conformación. El PI (3)P puede actuar como
ligando en interacciones específicas con otras proteínas, lo que puede facilitar la localización
de proteínas a localiz aciones celulares definidas para realizar su funci ón. Existen varios tipos
de dominios de reconocimiento específico a fosfoin osítidos : dominios de homologia con
plecstrina (PH), dominio de homología a Ph ox (PX) y dominio FYVE.
Los dominios PH se encuentran principalmente en proteínas de mamí feros implicadas en la
señalización intracelular y en la organización del citoesqueleto y es capaz de int eractuar con el
PI (3,4)P2, PI(3,S)P2 YPI (3,4,S)P2, sin embargo existen pocas referencias sobre proteínas que
lo contengan en plantas (Droback el al., 2002).
Los dominios PX unen PI(3)P y PI (3,4)P2 Y se ha encontrado en proteínas implicadas en
respuestas oxidativas, como es el caso de los neutrófilos. E n plantas hasta el momento no se
han caracterizado proteínas con dominios PX, aunque los análisis informáticos del genoma de
A rabidopsis indican que sí existen (Drobak & Heras 2002).
Los dominios FYVE, así llamados por las 4 primeras proteínas en las que se enc ontraron
(Fabl, YOTB jZK632.12, Vac1 y EEA1) presentan alta especificidad hacia el PI (3)P y se los
ha implicado con proceso s de tráfico intracelular tanto en animales como en plantas, donde
incluso se los ha localizado dentro del núcleo y asociado a procesos de regulación genética
(Drobak & Heras