Estudio-de-la-enfermedad-de-Glasser-causada-por-haemophilus-parasuis-en-Mexico-con-la-tecnica-EricPCR-como-metodo-de-diagnostico

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA 
DE MEXICO 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
CUAUTITLAN 
ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD DE GLASSER 
CAUSADA POR Haemophilus parasuis EN MEXICO 
CON LA TECNICA ERIC-PCR COMO METODO DE 
DIAGNOSTICO. 
T E s I s 
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE 
QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO 
p R E s E N T A 
VLADIMIR MONTELONGO HERRERA 
ASESORES: DR. SUSANA E. MENDOZA ELVIRA 
DR. ABEL CIPRIAN CARRASCO 
DR. CARLOS PIJOAN AGUADE 
CUAUTITLAN, IZCALLI, ESTADO DE MEXICO 2005 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN 
UNIDAD DE LA ADMINISTRACION ESCOLAR 
DEPARTAMENTO DE EXAMEN ES PROFESIONALES 
DR. JUAN ANTONIO MONTARAZ CRESPO 
DIRECTOR DE LA FES CUAUTITLAN 
PRESENTE 
ATN: Q. Ma. del Calmen García Mijares 
Jefe del Departamento de Exámenes 
Profesionales de la FES Cuautitlán 
Con base en el arto 28 del Reglamento General de Exámenes. nos permitimos comunicar a 
usted que revisamos la TESIS: 
Estudio de la enfermedad de Glasser caUSAda por 
HaemopbiJpS paraspis en MFxi-o cap la t'cpica 
ERIC-PCR como método de Diagnóstico. 
que presenta el pasante: Vladimir Montelon:.:.g~o=--H=-e=-r=-r:.:.e=-r.::a _______ --,-,-__ 
con número de cuenta: 9 5 o 7 3 3 5 _ 4 para obtener el título de : 
Químico Farmacéutico Biólogo 
Considerando que dicho trabajo reúne los requisitos necesarios para ser discutido en el 
EXAMEN PROFESIONAL correspondiente. otorgamos nuestro VOTO APROBATORIO. 
ATENTAMENTE 
"POR MI RAZA HABLARA EL ESPIRITU" 
Cuautitlán Izcalli. Méx. a ~ de __ -"'M.a.a.L.r.:.<.z.l.Jo'--____ de _~2....,Q,,-,Q,,-,5,,-· __ 
PRESIDENTE QFI. Andrea A. Becerril Osnaya_~~~~;;~~~~~~ 
VOCAL MVZ. Gerardo Cruz Jiménez 
SECRETARIO Dra. Susana E . Mendoza Elvira · 
PRIMER SUPLENTE QF'B . Gabriela Escalante Reynoso 
SEGUNDO SUPLENTE QFB . Ladi s l ao Palomar Moral es 
Agradecimientos 
AgradecimienJos: 
A Dios. 
A mi Universidad Nacional Autónoma de México. 
A la Dra. Susana por todas sus enseñanzas, pero sobre lodo por su amistad 
Al Dr. Abel por compartir conmigo sus conocimientos. 
A todos los profesores miembros del jurado por sus valiosas aportaciones y consejos para 
el mejoramiento de este trabajo. 
Al profesor David y señor Gabino por la ayuda técnica brindada. 
A las QFB's OIga [rigoyen, Ruth e. Delgado, Magali Gamboa, Rocío Juárez y Carmen 
Mondragón. 
A todos mis amigos de la FES-e. 
Lidia T., Edith, Erika, Tuti, Agustinflas, ChayilO, Chío, Pepo, Najar, [sra, 
Cheque, Lizeth, Chucho, Jebús, Lalo, Cesarea, JeTl)', Yesenia, Maqueda, 
Liliana, Raquel, Alex, Yuritzi, Charly, Gaddiel, Argel, Tania, 
Alejandra, Ceci, Aurora, Lorena, David, Yuriria. 
Dedicatorias 
Dedicatorias: 
A mis padres Eleazar y Cruzita, los amo y gracias a su cariño y paciencia he podido /legar 
hasta aquí, todo se los debo a ustedes. 
A mis hermanos Eleazar y Raquel por todo su apoyo y comprensión. 
A mis abuelos Juan. Mari y Lola. 
A mis compadres Dr. Luis Enrique y Dr. Rubén, su amistad durante casi veinte años ha 
sido muy valiosa. 
Este trabajo fue realizado en el laboratorio de Virología y Microbiología, 
Coordinadón General de Estudios de Posgrado. Facultad de Estudios Superiores 
Cuautitlán, Campo 1. UNAM. 
Índice 
ÍNDICE. 
RESUMEN w 
1. INTROOUCOÓN. 
1.1 Importancia de las enfermedades respiratorias. 1 
1.1.1 Complejo respiratorio pordno. 1 
1.2 Enfermedad de GJasser. 4 
1.2.1 Etiología. 4 
1.2.2 DistrIbución. 6 
1.2.3 Epidemiología. 6 
1.2.4 Patogenicidad. 8 
1.2.5 Cuadro dínico. 11 
1.2.6 Diagnóstico. 13 
1.2.7 Tratamiento. 16 
1.2.8 Prevención Y control. 18 
1.3 El estudio de la PCR Y las enfermedades respiratorias. 20 
1.3.1 Secuencias ERIC. 22 
1.3.2 Secuencias ARN 16s. 24 
1.4 Justificación e hipótesis. 
1.4.1 JustIflcación. 25 
1.4.2 Hipótesis. 26 
2. OBJETIVOS. 
2.1 Objetivo general. 27 
2.2 Objetivo particulares. 27 
3. MATERIAL Y MÉTODOS. 
3.1 Obtención de una cepa de H8emOphiIus parasuis. 28 
3.2 Estandarización de la extracción de ADN de Haernophilus parasuis por el métxxlo 
fenoI-doroformo. 28 
3.3 Estandarización de la técnica ERIC-PCR. 29 
3.4 Obtención de cepas de Streptococcus suis, Pasteurella multocida, 
BordeteIIa bronchiseptica Y ActInobaciIIus pleuropneumoniae serotipo 2. 31 
3.4.1 Exb'accIón de ADN de cepas bacterianas. 31 
3.5 Prueba de especifiddad. 32 
3.6 Muestreo. 
3.6.1 Muestreo en pulmones. 32 
3.6.2 Muestreo en líquido cefalorraquídeo. 33 
3.6.3 Muestreo en cometes nasales. 34 
3.7 Prueba de ERIC-PCR.coó las muestras obtenidas. 35 
3.8 Estandarización ~1it PCR con los iniciadores Hps-R Y Hps-F. 36 
3.9 Detección de 'HaemophiIus pataSUíscon oIigonucIeótido Hps. 37 
4. RESULTADOS. 38 
5. DISCUSIÓN. 51 
6. CONCLUSIONES. 56 
7. REFERENaAS. 57 
Índice de tablas y figuras 
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS. 
Tabla 1. Bacterias involucradas en procesos respiratorios. 2 
Tabla 2. Agentes tradicionales y actuales. 3 
Tabla 3. Reacdones bioquímicas diferendales bacterias NAD-dependientes aisladas 
de cerdos. 14 
Tabla 4. Porcentaje de resistenda de H. parasuisa diferentes antirnicrobianos. 17 
Tabla 5. Secuencias ERIC. 23 
Tabla 6. Oligonudeótidos empleados. 29 
Tabla 7. Oligonucleótidos Hps. 36 
Tabla 8. Aislamientos de Haemophilus parasuisde pulmones de cerdo. 42 
Tabla 9. Aislamientos de Haemophilus parasuisde Líquido cefalorraquídeo. 43 
Tabla 10. Aislamiento de Haemophilus parasuisde muestras de 
cornetes nasales de cerdos. 44 
Figura 1. Morfología de Haemophilus parasuis. 5 
Figura 2. Enfermedad de Glasser: forma respiratoria. 12 
Figura 3. Muestreo en pulmón. 33 
Figura 4. Muestreo en líqUido cefalorraquídeo. 33 
Figura 5. Muestreo en cornetes nasales de cerdo. 34 
Figura 6. Estandarización de la técnica ERIC-PCR. 38 
Figura 7. Prueba de especificidad de la técnica ERIC-PCR. 39 
Figura 8. Prueba de especificidad de los oIigonucleótidos Hps. 40 
Figura 9. Aislamiento de Haemophilus parasuis. 41 
Figura 10. Perfiles de fragmentos de AON amplificados con ERIC-PCR 
de muestras de pulmón. 45 
Figura 11. Fragmentos de AON amplificados con oligonucleótidos 
Hps-R y Hps-F de muestras de pulmón. 46 
Figura 12. Fragmentos de AON amplificados con oIigonucleótidos 
Hps-R y Hps-F de muestras de líquido cefalorraquídeo. 47 
Figura 13. Perfiles de fragmentos de ADN amplificados con ERIC-PCR 
de muestras de líquido cefalorraquídeo. 48 
Figura 14. Fragmentos de ADN amplificados con oIigonuc1eótidos 
Hps-R Y Hps-F de muestras de cometes nasales. 49 
Figura 15. Perfiles de fragmentos de ADN amplificados con 
ERIC-PCR de muestras de cornetes nasales. SO 
11 
Lista de abreviaturas 
USTA DE ABREVIATURAS. 
ADN - Ácido desoxirribonucleico. 
ARN - Ácido ribonudeico. 
BHI - Infusión cerebro corazón. 
CA - Conversión alimenticia. 
CF - Fijadón de complemento. 
dNTP- Deoxinucleótido trifosfato 
EUSA - Enzimoinmunoensayo. 
ERlC - Consenso Enterobacterial Repetitivo Intergénico. 
ERlC-PCR - Reacdón en cadena de la poIimerasa de secuendas Consenso 
Enterobacterial Repetitivo Intergénico. 
GDP - Gananda Diaria de peso. 
Hps - Haemophilus parasuis. 
Hps-R - Antisentido (oligonucleótido) de Hps. 
Hps-F - Sentido (oligonucleótido) de Hps. 
IHA - Hemaglutinación Indirecta. 
IHC - Inmunohistoquímica. 
LCR - üquido cefalorraquídeo; 
LOS - Upooligosacáridos. 
MEW - Destete precoz medicado. 
mg - Miligramos 
mL - Mililitros 
mM-Milimolar 
NAD -DinucJéotido Nicotinamida Adenina. 
OSCPH - Hibridación en placa de captura de oligonucleótidos 
específiCOS. 
PAGE - Electroforesis en gel de poliacrilamida 
pb - pares de bases. 
PBS - Amortiguador salino de fosfatos. 
PCR - Reacdón en cadena de la poIimerasa. 
PPLO - Organismosv semejantes a pleuropneumoniae. 
PRRS - Síndrome Reproductivo y Respiratorio del cerdo. 
REP - Secuencias repetitivas palindrómicas extragénicas. 
Rep-PCR - Reacción en cadena de la polimerasa de Secuendas 
repetitivas palindrómicas extragénicas. 
rpm - Revoluciones por minuto. 
SEW - Destete precoz. 
SPF - Libre de patógenos específicos. 
tbp- Proteína unida a la caja TATA. 
UFC - Unidades formadoras de colonias. 
J.I9 - Microgramos. 
"L -Microlitros. 
"M - Micromolar. 
V - Volts. 
111 
________________________ -!!R.esumen 
RESUMEN. 
la enfermedad de Glasser, es producida por la bacteria Haemophilus 
parasuis. Esta enfermedad esta contemplada como una afección esporádica, 
asociada a situaciones Pos-éstres principalmente en cerdos en la etapa de destete. 
Sin embargo, en granjas con elevado grado de sanidad la enfermedad puede 
producir una elevada morbilidad y mortalidad en todas las etapas de producdón. 
El agente etiológico de la enfermedad fue descrito por primera vez por 
Glasser en 1910, como un bastón pequeño gram negativo. Una de sus principales 
características es su requerimiento de factor V (NAO) para su crecimiento. El cerdo 
es el único hospedero de este agente patógeno. la infección por Haemophilus 
parasuis es particularmente problemática sobre el aparato respiratorio. 
Actualmente se tienen identificados 15 serotipos, de los cuales el 4 Y 5 son los más 
prevalentes en los aislamientos en casos de campo alrededor del mundo. El sitio 
inicial de colonización parece ser el tracto respiratorio alto de los cerdos, 
preferentemente la mucosa nasal, aunque puede ser aislado también del área 
tonsilar y de otros sitos respiratorios. En el cuadro dínico se describen 4 formas: 
la enfermedad de Glasser o poIiserositis fibrinosa, la septicemia, la miositis aguda 
y la enfermedad respiratoria. 
El diagnóstico se basa en los signos dínicos en presenda y ausencia de 
lesiones en la necropsia, y en el cultivo bacteriológico. Actualmente existen tres 
pruebas de PCR para el diagnóstico de Haemophilus parasuis. la primera radica en 
las peculiaridades observadas en los genes tbp de las cepas. la segunda prueba es 
la ERIC-PCR que está basada en la amplificación de secuencias de consenso 
enterobacterial repetitivo intergénico y la tercera prueba de PCR con la cual se 
amplifica un fragmento de 821pb de la región que codifica para el ARN 16s. 
IV 
Resumen 
Se ha mostrado que la ERIC-PCR es eficaz para clasificar diferentes especies 
bacterianas y para discernir entre las cepas de una misma especie, mientras que la 
prueba de PCR que amplifica un fragmento de 821pb detecta al Haemophilus 
parasuis de muestras clínicas y define la prevalenda de las infecdones. 
En el estudio estas dos pruebas fueron estandarizadas en el laboratorio 
como método de diagnóstico de Haemophilus parasuis con el objetivo de evaluar 
la ERIC-PCR para el posterior estudio de la enfermedad de Gliisser. El estudio se 
llevó a cabo con cepas de Haemophilus parasuis aisladas de muestras obtenidas 
de pulmón, cometes nasales y líquido cefalorraquídeo de diferentes cerdos en 
granjas de México. Con la ERIC-PCR utilizando los oligonucleótidos ERICIR y 
ERIC2 se obtuvieron diversos patrones de huellas genómicas, en tanto que con los 
oligonucleótidos Hps se amplificaron fragmentos de 821pb. La prueba de PCR con 
oligonudeótidos Hps detecto de manera espeáfica a la bacteria Haemophilus 
parasuis incluso con muestras contaminadas. La técnica de ERIC- PCR nos 
permitió diferendar entre las cepas aisladas de una misma granja, esto es 
importante ya que con esto se podrá realizar posteriormente estudios sobre la 
epidemiología en granjas de todo el país. 
y 
IntrodlJlXlón 
1. INTRODUCCIÓN. 
1.1 Importancia de las enfermedades respiratorias. 
las enfermedades respiratorias son junto con las enfermedades entéricas, 
un fenómeno que afecta al sector porcino acarreando graves consecuendas 
económicas. Se sabe que las enfermedades respiratorias son las más comunes y 
costosas en cerdos desde el inicio a la finalizadón (Ttelen,1995). 
El conodmiento de los procesos patológicos que afectan la función 
respiratoria de los pordnos se ha incrementado notablemente, y los efectos de las 
enfermedades respiratorias en la redituabilidad de las empresas pordnas son bien 
conocidas. Por esta razón los esfuerzos van encaminados a controlar las 
enfermedades. Existen sistemas de manejo y producción que se han desarrollado y 
puesto en práctica con el objetivo principal de evitar el efecto negativo de 
cualquier infecdón en una pobladón (Iglesias y Trujano, 2000). 
Las enfermedades respiratorias se observan en forma de neumonía y 
pleuritis. La amplia gama de agentes bacterianos y virales que causan estas 
enfermedades pueden actuar como microorganismos primarios o como agentes 
secundarios; sin embargo, algunos de estos agentes etiológicos son de gran 
importancia por sí mismos debido a su prevalenda, impacto económico o 
implicación en programas de erradicadón nadonal (Tteten, 1995). 
1.1.1 Complejo respiratorio porcino. 
El cerdo con excepción de las aves, es la única especie que ha sido objeto 
de transformaaones biológicas, resultado de los avances en la ingeniería genética 
yen la mediana veterinaria (Oprián y Mendoza, 2001a). 
Introducción 
La clave del éxito de la porcicultura moderna radica en aumentar los índices 
de ganancia diaria de peso (GOP) y aumentar la conversión alimenticia (CA). Estos 
parámetros se afectan seriamente por las enfennedades crónicas espedalmente 
las neumónicas. En este aspecto las neumonías juegan un papel Importante, 
debido al tipo de explotación intensiva al que es sometido el ganado pordno 
(Oprián y Mendoza, 2001a). 
El ComplejO respiratorio del cerdo es un proceso dinámico que involucra una 
variedad de agentes. Algunos como el Actinobacillus pleuropneumoniae, 
Mycoplasma hypneumoniae o el virus de Aujeszky, son primarios. Otros como 
Haemophilus Parasuis, Pasteurella multrxida, Bordetella bronchiseptica o 
Streptococcus suis son secundarios y requieren un evento inmunosupresor previo. 
La mejor manera de controlar y prevenir el ComplejO respiratorio, es el manejo 
controlado de la granja con fundamentos de bioseguridad y en segundo lugar, 
mejorar el estatus sanitario de la población mediante el uso de productos 
biológicos espeáficos contra los microorganismos involucrados en cada granja 
(Estrada, 1997). 
Tabla ·1. Bacterias involucradas en procesos respiratorios. 
Patógenos primarios. 
Mycoplasma hyopneumoniae 
Actinobacillus pleuropneumoniae 
Patógenos secundarios. 
Haemophilus parasuis 
Pasteure/Ia multocida 
BorrIeteIIa bronchiseptjca 
St:reptocoa:us suis 
Mycoplasma hyom/nis 
Actinomyces pyogenes 
2 
IntrrxJucdón 
Últimamente la evidenda indica que en los procesos respiratorios de los 
cerdos hay participación de microorganismos que hace algunos años no aparecian 
en la lista; por ejemplo: Haemophilus parasuis (Iglesias y Trujano, 2000). 
Esto quiere decir que con los controles actuales en la producáón, algunas 
enfermedades están perdiendo protagonismo. En la siguiente tabla se muestran 
los microorganismos tradicionales y los microorganismos actuales. 
Tabla 2. Agentes tradionales y actuales. 
Agentes tradicionales Agentes actuales 
Mycoplasma hyopneumoniae 
Actinobacillus 
p!europneumoniae 
VPRRS 
Virus de la influenza porcina 
Pasteurella multocida 
80rdetella bronchiseptica 
Adenovlrus 
Tomado y adaptado de Torres, 2004. 
Haemophilus parasuis 
Streptococcus suis 
Sf:ilphylococrus hyicus 
Actinobacillus suis 
Brachyspira pilosicoli 
VPRRS 
Circovirus porcino. 
3 
Introdua:Jón 
1.2 Enfennedadde Gliisser. 
Definición. 
La enfermedad de Glasser o poliserositis infecdosa porcina, es una 
enfennedad que a lo largo de las décadas se le ha contemplado como una afección 
esporádica, asociada a situaciones pos-estrés, la cual afecta prindpalmente a 
cerdos de 2 semanas a 4 meses de edad en el caso de cerdos convendonales, 
pero en granjas con un elevado grado de sanidad (SPF) o en las que se maneja el 
destete precoz o destete precoz medicado (SEW, MEW) la enfermedad se puede 
convertir en una afección explosiva, produdendo una elevada morbilidad y 
mortalidad en todas las etapas de producdón dentro de la granja. En donde puede 
causar poliserisitis, poliartritis, miositis, septicemia, meningitis y muerte (Oprián y 
Mendoza, 2001b). 
1.2.1 Etiología. 
Haemophilus parasuls fue descrito por Glasser, en 1910, como un bastón 
pequeño gram negativo, sin embargo esta bacteria a lo largo de los años ha 
recibido diversas denominadones. Leche en 1960 la clasifico inidalmente como 
Haemophilus suis y como Haemophilus influenza suis. Al observar su 
independencia del factor X de coaguladón de la sangre (hemina u otras porfirinas) 
se le cambió el nombre a Haemophilus parasuis (Kilian, 1976). Aún no se sabe 
exactamente la posidón taxonómica dentro de la familia pasteurellaceae debido a 
la falta de homología a nivel de AON con otras bacterias del género Haemophilus 
(Morozumi y Nicolet, 1986). 
La caracterización bioquímica primaria del agente etiológico de la 
enfermedad de Glasser sugería era muy similar a Haemophilus suis, el cual 
requiere tanto el factor X como el factor V (Nicotinamida adenina dinucleótido) 
para su credmiento. Sin embargo, más tarde se demostró Haemophilus parasuis 
4 
Introducd6n 
requiere para crecer solamente el factor V (NAO). Una nueva especie, Haemophilus 
parasuis, fue propuesta, usando el prefijo "para" por no requerir del factor X para 
su credmiento (Oliveira y Píjoan, 2003). 
Microscópicamente, Haemophllus parasuis es un pequeño bacilo o 
cocobacilo pleomórfico. Se agrupa solo, en pares e ¡nctuso en cadenas 
fflamentosas, de longitud variable, desde 1 a 7 tJm de largo y 0,2 a 2 tJm de 
ancho, gram negativo, que manifiestan la presenda de cápsula en cultivos In vltro. 
La dependencia del factor V se resuelve mediante la adición directa de NAO 
(O,025%) a los medios de cultivo, en formulaciones que incorporan sangre 
calentada (ágar chocolate) o mediante el satelltismo alrededor de colonias de 
Staphylococcus aureus o S. epidermidis. Al cabo de 24-48 horas a 37°C, en 
atmósfera aerobia o mejor en microaerofilia (en aislamientos primarios, 
fundamentalmente), dan lugar a colonias pequeñas, de 12 tJm de diámetro, 
traslúddas y no hemolíticas (en ágar con 5% de sangre de caballo) (Ferrl et al, 
2000). 
Poseen actividad catalasa, oxidasa y reducen los nitratos a nitritos. Carecen, 
sin embargo, de actividad ureasa; no producen indol ni descarboxilan la omltina, 
IIslna y arginina. Producen áddo de la glucosa1 manosa, maltosa y sacarosa, pero 
son negativos sobre la xilosa, lactosa, manitol, ramnosa y arabinosa (ferrl et al., 
2000). 
Figura 1. Morfología de Haemophi/us ~r6Suis. Microscopio óptico (100x). 
Tomada de Feni et al., 2000. 
5 
lntroducrión 
1.2.2 Distribución. 
Debido que a lo largo de la historia se ha conceptualizado al Haemophilus 
parasuis como un microorganismo que actúa en forma secundaria y debido a su 
naturaleza heterogénica y a la dificultad para manejar las muestras clínicas y lograr 
el prirnoaislamiento, no se sabe a áenáa áerta si es un microorganismo ubicuo o 
no. Gracias a los estudios realizados para diferenciar los serotipos existentes se 
sabe esta distribuido en E.U.A., Alemania, canadá, Australia y Brasil (Qprián y 
Mendoza, 2001b). 
En México también se ha aislado el Haemophilus parasuis pero se han 
realizado hasta el momento muy pocos estudios, solo se puede ena>ntrar una sola 
referencia en cuanto a serotipificación. Este estudio es el realizado por Herrera et 
al (2003) con muestras obtenidas de granjas de los estados de Guanajuato, 
Jalisco, Estado de México, Nvo. León, Oaxaca , Puebla, Veraauz, Sonora y 
Yucatán. 
Las muestras en este trabajo fueron cultivadas en MéxicO y se determinó 
por el tipo de crecimiento que eran de Haemophilus parasuis, posteriormente 
fueron suspendidas en una solución salina con formalina y se enviaron a la 
Universidad de Montreal para su serotipificaáón (Herrera et al, 2003). 
1.2.3 Epidemiología. 
El cerdo es el único hospedero de varios agentes patógenos, incluyendo a 
Haemophilus parasuis. La bacteria se recupera generalmente de las fosas nasales, 
en ocasiones sin cuadro clínico alguno, hasta el punto de representar una de las 
espeáes bacterianas más prevalentes en el caso de lechones de una semana de 
edad, y de los pulmones con neumonía (Moller et al, 1993). 
6 
---------- - -- -
Introducción 
la infección por Haemophilus parasuis es particularmente problemática 
sobre el aparato respiratorio. la presencia de Haemophilus parasuis en las fosas 
nasales, a las que coloniza, no implica la existenda de un proceso morboso y, por 
lo general, tiene lugar en animales protegidos inmunitariamente. En el caso del 
pulmón se comporta, habitualmente, como un invasor secundario, oportunista, que 
produce enfermedad asociado con otros agentes bacterianos (Actinobadllus 
pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae, M. hyorhinis) o víricos (virus de 
la enfermedad de Aujeszky, virus del PRRS, virus influenza, coronavirus porcinos, 
etc.) o coinddiendo con una falta de inmunidad protectora específica, lo que da 
lugar a lesiones pulmonares que recuerdan las de la neumonía enzoótica. 
Ocasionalmente se ha podido demostrar su condidón de agente etiológico 
respiratorio primario, especialmente en casos de bronconeumonía 
fibrinosupurativa. En cualquier caso, parece daro que el tracto respiratorio actúa 
como puerta de entrada del microorganismo, y que en ocasiones se produce la 
infecdón sistemática generalizada y, por tanto, la enfermedad clínica. (Ferri et al, 
2000). 
la mayoría de los estudios epidemiológicos sobre Haemophilus parasuis 
están basados en la infonnación que nos da la serotipificaáón. De los 15 serotipos 
identificados (Kielstein and Rapp~abrielson, 1992), los serotipos 4 y 5 fueron los 
más prevalentes en aislamientos de casos de campo en Japón (Morickoshi et a~ 
1990), Alemania (Kielstein and Rapp~abrielson, 1992), Estados Unidos (Rapp-
Gabrielson and Gabrielson, 1992) y España (Rubies et al., 1999). Los aislamientos 
australianos han sido prindpalmente serotipos 5 y 13 (Raftee and Blackall, 2000). 
En México, de un total de 20 aislamientos, los serotipos encontrados y el 
porcentaje de los mismos indican el serotipo con mayor prevalenda es el serotipo 
4 que fue aislado en 13 muestras dando un porcentaje de 60%, el segundo 
porcentaje más alto fue el del serotipo 12 en 4 muestras y un porcentaje de 20%, 
7 
Introducción 
los serotipos 1, serotipo 13 y una muestra no tipificable tienen un porcentaje del 
5% cada uno (Herrera et al, 2003). 
1.2.4 Patogeniddad. 
El sitio inicial de colonización por Haemophilus parasuis en el tracto 
respiratorio alto de cerdos es todavía controversial. El organismo ha sido 
consistentemente aislado de cavidad nasal y traquea, raramente de pulmones y 
tonsilas cuando se hace una inoculadón Intranasal de cerdos (Oliveira y Pijoan, 
2003). 
Varios autores sugieren que Haemophilus parasuis puede preferendalmente 
colonizar la mucosa nasal de cerdos, pero el organismo puede también ser aislado 
del área tonsilar y de otros sitios respiratorios, como la traquea por ejemplo 
(Oliveira y Pijoan, 2003). 
Los datos disponibles sobre la patogénesis del proceso proceden, por lo 
general, de modelos eXperimentales de infecdón, casi siempre cerdos inoculados 
intranasalmente con cepas virulentas de Haemophilus parasuis. En estas 
condidones, a las 12 horasde la inoculadón se aísla el agente de la cavidad nasal 
y de la tráquea, mientras que a las 36 horas ya se recupera de la sangre. Entre las 
36 y 108 horas posteriores se recupera con carácter sistémico (MoIler et al, 1993). 
Mediante procedimientos inmunohistoquímicos y por miaoscopia electrónica 
se ha comprobado la colonización precoz de la pordón media y caudal de la 
cavidad nasal y de la tráquea, que se asocia con rinitis purulenta, pérdida de alios 
y dilatación de las células de la mucosa nasal y traqueal. Haemophilus parasuis 
coloniza preferentemente la cavidad nasal y la tráquea, pero no las tonsilas (al 
contrario que A. pleuropneumoniae), lo que se reladona con la capacidad para 
aislar este microorganismo de las fosas nasales pero no de las tonsilas o de los 
8 
Introducción 
pulmones sanos, a partir de las muestras de cerdos en el matadero (Moller et al., 
1993). 
La cápsula, fimbrias y otras proteínas de membrana externa (OMP) han sido 
asociadas con la colonización del tracto respiratorio alto por varios miembros de la 
familia Pasteurellaceae, incluyendo el género Haemophilus(Nicolet, 1990). 
La asociación entre expresión capsular, perfiles de proteínas de membrana 
externa, y virulencia de Haemophilus parasuis, es controversia!. Se ha reportado 
la mayoría de las cepas aisladas del tracto respiratorio alto de cerdos sanos son 
encapsuladas, mientras el aislamiento de cepas de sitios sistémicos fueron 
predominantemente no encapsuladas. Sin embargo con cepas encapsuladas de 
Haemophilus parasuis se ha demostrado que el encapsulamiento es 
cualitativamente reduddo después de realizar pases in vitro (Rapp-Gabrielson et 
al., 1992). 
Estudios realizados con perfiles de proteínas de célula-completa sugieren 
una potendal patógenia de cepas de Haemophilus parasuis con la partidpación de 
un grupo mayor de proteínas de alrededor de 37 kDa. Estas fueron clasificadas por 
electroforesis en gel de poliacrilamida como PAGE tipo n, entre tanto los otros 
aislamientos carentes de estas proteínas fueron dasificados como PAGE tipo 1 
(Morozumi y Nicolet, 1986). 
Se ha examinado la producdón de lipooligosacaridos (LOS) por Haemophilus 
parasuis, y se encontró que cepas virulentas y no virulentas comparten patrones 
similares. Haemophilus parasuis produce estructuras pareddas a fimbrias después 
de pasajes in vi\IYJ, pero el aislamiento común de este organismo de la cavidad 
nasal de animales aparentemente sanos plantea el cuestionamiento si el dásico 
concepto de adhesión al sitio de entrada es prerrequisito para la inidación de la 
invasión (Nicolet 1990). 
9 
Introducción 
Los serotipos han sido usados comúnmente como indicadores de virulenda. 
Inoculaciones intraperitoneales a cerdos SPF con los serotipos 1,5, lO, 12, 13 Y 14 
causan muerte o morbilidad en cuatro días, y esas cepas fueron dasificadas como 
altamente virulentas. Los serotipos 2, 4 Y 15 causan poliserositis, pero no muerte, 
y fueron dasificados como moderadamente virulentos. Los restantes serotipos (3, 
6, 7, 8, 9, 11) no producen signos dínicos y fueron considerados no virulentos 
(Klelstein y Rapp-Gabrielson,1992; Amano et al, 1994). 
Un estudio reciente de prevalenda en rebaños de Norte América muestra las 
cepas potendalmente patógenas, de sitios sistémicos, fueron de serotipos 2,4, S, 
12, 13, 14 o no tipificables; los del tracto respiratorio alto de animales sanos son 
genéticamente homogéneos (diferentes de los aislamientos de sitios sistémicos) 
predominando el serotipo 3 o no tipificables (Oliveira et al, 2003). 
Algunos autores creen que alteraciones de la mucosa pueden permitir que 
Haemophilus parasuis invada y gane el acceso a torrente sanguíneo, pero ni la 
microscopia electrónica, y prueba de inmunohistoquímica han asociado a la 
bacteria en áreas de dlia perdida y degeneración celular. Esto sugiere que una 
toxina soluble de HiJemophilus parasuis pueda estar asociada con el daño celular 
observado (Oliveira y Pijoan, 2003). 
Aunque el daño a la mucosa nasal facilita la invasión de H. parasuis, en 
cualquier caso, se desconocen los factores implicados en la infección sistémica, 
aunque resulta muy destacable la vlrulenda de algunas cepas, capaces de produdr 
enfermedad generalizada y muerte en cerdos inoculados intranasalmente con solo 
100 UFC. En animales sometidos a estas condidones, la bacteremia resulta 
evidente en las primeras etapas de la infección (Ferri et al, 2000). 
10 
Introducción 
Actualmente se han referido a la detección de una enzima, neuraminidasa 
(sialidasa), cuya presencia se hace evidente al final de la fase de crecimiento 
logarítmico, que se asada a las células y que no requiere ca++ para su actividad. 
Su función en la biología de Haemophílus parasuís podría estar relacionada con la 
supervivencia intracelular (Lichtensteiger y Vimr., 1997). 
1.2.5 Cuadro clínico. 
En la piara afectada, los signos que se manifiestan incluyen fiebre y apatía, 
segUidos de inapetenda y anorexia. Los primeros signos son tos, disnea, pérdida 
de peso, cojeras y enrojecimientos. Pueden apreciarse, igualmente, 
manifestaciones de dolor al caminar, hinchazón de las articuladones, escalofríos y 
temblores, así como incoordinadón, danosis, redinadón y, por último, puede 
sobrevenir la muerte del animal. Existen visibles secuelas de los procesos agudos, 
tanto en las hembras reproductoras (en forma de abortos y cojeras crónicas) como 
en los verracos o en los animales en crecimiento, en los que puede ser manifiesta 
una menor tasa de engorda (Rapp-Gabrielson, 1996). El cuadro dínico depende de 
la localización de las lesiones inflamatorias. Según esto, se describen cuatro formas 
clínicas: la enfermedad de GIas5er (propiamente dicha o también llamada 
poJiserositis fibrinosa), la septicemia (sin lesiones de poliserositis), la miositis 
aguda (en los músculos maseteros) y la enfermedad respiratoria (Ferri et al, 
2000). 
Las lesiones macroscópicas primarias consisten en la presenda de un 
exudado serofibrinoso o fibrinopurulento en las superficies mucosas, de forma 
localizada o en presencia múltiple, incluyendo el peritoneo, el pericardio y la 
pleura, así como en las superficies articulares, particularmente en el carpo y tarso. 
La presencia de neumonía no es un suceso habitual, incluso aunque el 
microorganismo haya sido aislado de los pulmones. Según algunos autores, las 
diferencias en la capacidad para producir neumonía pueden deberse a las 
diferencias en el modo de infecdón, a las dosis infectantes y al potendal patógeno 
11 
Introducción 
de las cepas implicadas, al menos según se desprende de los datos derivados de 
infecciones experimentales: por ejemplo, tos serotipos 1, 4 Y 5 no se distinguen 
por su capacidad para producir neumonía (Amano et aI., 1994). En tos casos 
septicémicos se observa la presencia de petequias y eqUimosis en el hígado, riñón 
y meninges, detectándose también altos niveles de endotoxinas en el plasma, así 
como trombos de fibrina en muchos órganos. La repllcadón subsiguiente del 
microorganismo en las superficies serosas produce la poliserositis, poliartritis y 
meningitis que se observan en los casos típicos de campo. Con menor frecuencia, 
puede observarse un proceso septicémico agudo que incluye cianosis, edema 
subcutáneo y pulmonar y muerte, todo ello en ausencia de los típicos signos 
inflamatorios de las mucosas (Amano et al{ 1994). 
Las meninges son una de las zonas de inflamación más frecuentes de la 
enfermedad llegando, en ocasiones, a presentarse en el 80% de tos animales 
enfermos. En los casos muy graves puede apreciarse meningitis¡ opacidad de las 
membranas del cerebro (reglón ocdpital) y cerebelo. Habitualmente se produce un 
aumento del líqUido cefalorraquídeo, que presenta un aspecto ~echoso debido a la 
abundancia de glóbulos blancos. OCasionalmente, se ha descrito 
meningoencefalitts trombótíca, con depósitos de fibrina en meninges y vasossanguíneos y, otras veces, edema moderado (Sega les, 1996). 
Figura 2. Enfermedad de Glasser: forma respiratoria. Aspecto pulmonar. 
Tomada de Ferri et al, 2000. 
12 
IntrrxJucción 
1.2.6 Diagnóstico. 
Una de las dificultades para el diagnóstico correcto de Haemophi/us parasuis 
es la carencia de métodos diagnósticos rápidos y sendllos, así como capaces de 
diferenciar los serotipos presentes, cuestión que es sumamente importante ya que 
se ha demostrado pueden existir diferentes serotipos de la bacteria en una misma 
granja, la protección de la mayoría de las bacterinas comerciales es serotipo 
específica y algunos serotipos de las cepas de campo no producen inmunidad 
adecuada para ofrecer una protección real, razón por la cual algunas 
autobacterinas pueden no dar resultados satisfactorios. El diagnóstico de la 
infecdón por Haemophi/us parasuis está basado únicamente en signos clínicos, en 
presencia o ausenda de lesiones en la necropsia, y en el cultivo bacteriológico. 
(Vahle et al, 1997). 
Haemophi/us parasuis depende de una fuente externa de NAO para su 
aislamiento y credmiento, las muestras clínicas rutinariamente se cultivan sobre 
agar sangre con una cepa adyacente de S. aureus, posteriormente en PPLO con 
suplemento de NAO o sobre agar chocolate (Segales, 1996). 
El diagnóstico diferencial incluye otras bacterias no hemolíticas 
dependientes del factor V, tales como Actinobadllus indo/icus, Actinobadllus 
porcinus y Actinobacillus minar, como se muestra en la tabla 3 . la naturaleza 
fastidiosa de Haemophi/us parasuis a menudo perjudica el aislamiento de estos 
organismos de muestras clínicas. El uso de antibióticos (tales como Uncomidn y 
Bacitradna) en el medio de cultivo pueden mejorar la recuperadón de muestras 
clínicas contaminadas. (Pijoan et al, 1983). 
13 
-- -------- - ------
Introducción 
TABLA 3. Reacdones bioquímicas diferendales de bacterias NAD-dependientes 
aisladas de cerdos. 
Otros NAD-<lependientes Pasteurellaceae 
Caracteristicas H. Actinobacillus Actinobacillus Haemophilus Aclinobacillus 
Bioquimicas parasuis p/europlleumoniae millor lUXO/le porcimls 
Ureasa - + + - -
Hemolisis - + - - -
Indol - - - - -
Fermentación de 
Glucosa + + + + +/-
Lactosa - - + - +/-
Suerosa + + + + +/-
Manitol - + - - +/-
Xilosa - + +/- - +/-
L-Arabinosa - - - + +/-
Rafinosa - - + + +/-
Fuentes: Rapp-Gabrielson y Gabrielson 1992; y Moller el al. 1996. 
Aclinoba-
cil/us 
itrdolicus 
-
-
+ 
+ 
+/-
+ 
+/-
+/-
-
+ 
Técnicas alternativas han sido propuestas para el diagnóstico de infea:iones 
por Haemophilus parasuis. El organismo se ha detectado, en muestras dínicas de 
animales infectados experimentalmente, por inmunohistoquímica (IHC), que 
también permite la detección de los organismos no viables en el citoplasma de 
células fagocíticas (Sega les, 1996). 
14 
Introduaión 
Otro método de diagnóstico son los ensayos de hibridación en placa de 
captura de oligonucleótidos espeáficos (OSCPH), es muy sensible detectando < 
100 UFC/ ml en cultivos puros. Sin embargo se presentan reacciones cruzadas con 
aislamientos de Actinobacíl/us indo/icus (casamglia et al, 1999). 
El diagnóstico serológioo de Haemophi/us pa!aSUis es inconsistente e 
inexacto. la detección de anticuerpos oontra Haemophi/us parasuis han sido 
realizados por fijación del complemento (CF) (Nielsen, 1993), pruebas de 
hemaglutinación indirecta (IHA) (Miniats et al, 1991) y por enzimoinmunoensayo 
(ElISA) (Solano-Aguilar et al, 1999). 
También una prueba de PCR promete una mejor sensibilidad al detectar 
Haemophi/us parasuis de muestras clínicas. Esta técnica amplifica las reglón que 
codifica para el ARN 16s. Este ensayo detecta desde 102 UFC/ml, y se cree es 
mucho más sensible que el aislamiento tradicional. (Oliveira et al, 2001). 
Recientemente se ha desarrollado una PCR que permite la detecdón e 
identificación de la espede Haemophi/us parasuis, tanto a partir de muestras 
clínicas como en cepas aisladas en el laboratorio. El fundamento técnico del 
método desarrollado radica en las peculiaridades observadas en los genes tbp de 
las cepas de este microorganismo, respecto de otros patógenos pordnos próximos 
como Actinobadl/us suis y Actinobacil/us p/europneumoniae. El método permite 
discriminar un positivo a Haemophi/us parasuis de un positivo a Actino/Jacll/us 
p/europneumoniae y, lo que es más importante, otras cepas no patógenas de la 
familia Pasteurellacea presentes en el cerdo (Actinobacíl/us minor, Actinobacil/us 
porcinus y Actinobacil/us indo/icus) ofrecen resultados negativos (Ferri et al, 
2000). 
15 
Introducción 
1.2.7 Tratamiento 
El tratamiento es con antibióticos basándose en pruebas de sensibilidad 
(antibiograma), hasta el momento no existe un antibiótico autorizado, que sea 
específico contra el Haemophí/us parasuís. El antibiótico que se vaya a emplear 
debe ser administrado los más temprano posible con respecto a la infección 
buscando la "prevención" (Rosales, 2001). 
En los brotes graves de la enfermedad de Glasser, el uso de antibióticos 
tanto con fines terapéuticos como preventivos, posee un escaso valor, debiéndose 
administrar, parenteralmente, dosis altas ( de los productos más convenientes por 
lo general, penicilina, aunque se han descrito cepas resistentes) al comienzo de la 
infección, cuando empiezan a manifestarse signos dínicos; se debe tratar, además, 
la totalidad del grupo, sin esperar a que manifiesten signos o síntomas. (Trigo el 
al., 1996). 
Se sabe que los antibióticos que pueden ser utilizados para el tratamiento 
en contra de Haemophilus parasuis son penidlina, ampidlina, trimetroprim con 
sulfonamidas y tetraciclinas. También se ha reportado los antibióticos menos 
efectivos contra Haemophi/us parasuis son los aminoglucosidos y sulfonamidas. En 
otros trabajos se han encontrado cepas resistentes a diferentes tipos de 
antibióticos (Oprián y Mendoza, 2001b). En la tabla 4 se muestra el porcentaje de 
resistencia de Haemophí/us parasu/s a diferentes antimicrobianos. 
16 
Introducr:ión 
Tabla 4. Porcentaje de resistenda de H. parasuisa diferentes antimlcrobianos. 
AGENTE ANTIMICROBIANO % DE RESISTENCIA 
Ampidlina 0.0 
Enroftoxacina 0.0 
Cefalotina 0.0 
Ceftiofur 2.1 
Penicilina 2.1 
Sulfaclorpirldazi 2.1 
Gentamidna 4.3 
Epectinomiclna 4.3 
Trimetoprim/sulfa 6.4 
AmlkacIna 6.4 
Eritromlcina 10.6 
Tetracidina 14.9 
Neomicina 21.3 
Apralan 29.8 
aindamicina 40.4 
Tomado de Oprlán y Mendoza 2001b. 
Las medidas profilácticas de administradón de antibióticos en granjas de 
cerdos SPF no han demostrado una gran efidencia al no poder redudr la 
morbilidad y la mortalidad ante un brote de la enfermedad de GIasser, debido a 
que los efectos han sido poco benéficos y de corta duraaón. Por lo que 
posiblemente el sistema más adecuado de control de la enfermedad sea la 
medicación individual y el uso de bacterinas que induyan el serotipo o los 
serotipos involucrados en el brote y presentes en la granja (Ciprián y Mendoza, 
2001b). 
17 
-- - --- - -------------------
Introducción 
1.2.8 Prevendón y conb'ol. 
La eliminación de H. parasuis de la granja puede no ser un objetivo 
deseable, puesto que como consecuenda de la mezda de cerdos de distintas 
edades con otros que albergan H. parasuls durante las últimas etapas de la 
producción, puede darse lugar a un brote de enfermedad con efectos devastadores 
desde el punto de vista económico. Por esta razón, la introducción de nuevos lotes 
con diferentes estados de salud debe ir acompañada de periodos de aislamiento y 
adimatadón sufidentemente largos para que se desarrolle inmunidad protectora, 
por vacunación o por exposldón natural al agente (Solano-AguiJar et al, 1999). 
La inmunidad natural y/o materna constituyen factores oiticos para el 
control de la enfermedad de Glasser. los cerdos expuestos ron anterioridad a 
cepas avirulentas de Haemophllus parasuls desarrollan resistenda a laexposldón 
con cepas virulentas (Nielsen, 1993). La vacunación de \as cerdas gestantes 
proporciona una inmunidad materna en los lechones, que se prolonga por un 
periodo de hasta cuatro semanas frente al mismo serotipo contenido en la 
bacterina (Solano-AguiJar et al,1999). 
Existen informes acerca del control, con éxito, por vacunación con 
bacterinas comerciales o autovacunas; en otras ocasiones, los resultados han 
terminado en un fracaso, probablemente debido a la falta de protecdón cruzada 
para los serotipos implicados en el proceso díniro. En cualquier caso, no se ha 
investigado lo sufidente el papel de la inmunidad materna inducida por bacterias 
en el desarrollo de la infección. Redentemente Rapp-Gabrielson et al (1997), han 
inmunizado madres con una bacterina comercial que incluía los serotipos 4 y 5, de 
modo que los cerdos nacidos resistieron el desafío. Los anticuerpos matemos no 
interferían con la vacunadón a la primera y tercera semanas de edad. La 
protección frente a otras cepas virulentas no siempre resulta evidente en los 
modelos experimentales. Aunque la protección cruzada es un objetivo primario de 
18 
Introducción 
las vacunas comerciales, las autovacunas pueden perder eficacia si están 
presentes más de una cepa o serotipo, o ha tenido lugar recientemente la 
introducción de un nuevo serotipo en la explotación. Todo ello permite conduir 
que se mantiene la duda de que los antígenos protectores puedan ser distintos de 
los factores de virulenda y/o los antígenos específicos de serotipo (Rapp-
Gabrielson et al, 1997). 
Rapp-Gabrielson et al. (1996, 1997), utilizando una bacterina con os 
serotipos 4 y 5, han demostrado la eficada del desafio con diferentes cepas del 
mismo serotipo, así como protección cruzada frente a otros serotipos heterólogos, 
aunque en ningún caso la protección fue completa frente a todos los serotipos, ni 
siquiera frente a los más comunes en América del Norte. 
Esto quiere decir que previo al uso de bacterinas se debe tener presente 
que la mayoría de las granjas tienen más de un serotipo potendalmente causando 
la enfermedad, que no existe seguridad de que la cepa aislada sea una de las 
responsables de la enfermedad, además de que algunos aislamientos son 
deficientes en cuanto a la presenda de factores inmunogéniCOS protectivos 
(Rosales, 2001) 
Los programas de control pueden induir vacunación y tratamientos con 
antibióticos, sin descuidar las prácticas de manejo que tanta inddenda poseen en 
la creadón de situaciones de estrés sobre los animales (Ferri et al, 2000). 
19 
-------------------- - -
/ntroducr:Jón 
1.3 El estudio del PCR y las enfennedades respiratorias. 
La técnica de la Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) es considerada 
hoy en día como una herramienta imprescindible en el laboratorio de Biología 
Molecular e Ingeniería Genética (Luque y Herráez, 2001). 
El objetivo de esta técnica es la amplificación directa de un gen o un 
fragmento de ADN, o indirecta de un ARN (en este caso, a través de su ADN 
complementario, (cADN) , presentes en mezclas de muy diversas fuentes, sin 
necesidad de una pUrificación previa de la muestra integra original. Se puede partir 
de homogeneizados, extractos audos de tej ido, sangre completa, mezclas de 
fragmentos de ADN obtenidos con enzimas de restricción, muestras resultantes de 
la extracción y aislamiento de ADN. Las aplicaciones de la PCR son muy numerosas 
y variadas. Como ejemplos, pueden citarse: clonación acelular de fragmentos de 
ADN, detecdón de secuendas sin purificación previa, secuendaoon de ácidos 
nucleicos, establedmiento de polimorfismos de secuenda, rastreo de mutadones, 
tipificación de ADN para transplantes, diagnóstico de enfermedades genéticas, 
prenatales o no, determinación de secuendas específicas de AON relacionadas con 
situaciones patológicas definidas, resoludón de problemas forenses o 
arqueológicos, estudios evolutivos, detecdón de microorganismos infecciosos, 
detecdón de células tumorales, amplificación de AON para su posterior clonadón 
celular (Luque y Herráez, 2001). 
En microbiología la PCR se puede utilizar para identificar los 
microorganismos causantes de enfermedad y es de suma importancia en medicina 
donde es necesario un diagnóstico rápido. Hoy en día el PCR no se puede 
considerar como substituto de la bacteriología clásica. La PCR es inferior en 
sensibilidad a los métodos clásicos cuando las bacterias tienen crecimiento rápido, 
20 
Introducción 
no obstante tiene muchas ventajas al detectar microorganismos de crecimiento 
lento o cuando la detección se lleva a cabo en muestras contaminadas. Una de las 
ventajas más evidentes de la técnica de PCR es la rapidez de los resultados y de 
que se pueden trabajar muchas muestras. Con la bacteriología tradicional se 
necesitan un mínimo de dos días para alcanzar un diagnóstico certero. Pero en el 
caso del PCR, solamente se necesitan algunas horas. Por lo tanto las bacterias de 
lento crecimiento, o bacterias no cultivables, virus, así como hongos, son los 
mejores candidatos para ser detectados por PCR ( Mendoza y Pijoan, 2001). 
Muchas técnicas basadas en PCR han sido desaitas y se han aplicado en la 
medicina veterinaria. El diagnóstico rutinario de algunos laboratorios se enfoca en 
los siguientes microorganismos: P. multoclda se detecta toxina positiva ONT (+), 
M. hyopneumoniae (nested PCR), S. suis y H. parasuis (rep-PCR) y PRRSv 
(Taqman). Estos son los agentes principalmente implicados en el Complejo de la 
Enfermedad Respiratoria de los Porcinos. Este síndrome es cada vez más 
importante la causa de una baja productividad de los cerdos, caracterizado por un 
crecimiento lento, la baja de eficacia alimentida, anorexia, tos y disnea, donde 
estan involucrados estos microorganismos ( Mendoza y Pijoan, 2001). 
21 
Introducción 
1.3.1 Secuencias ERIC. 
Cuando se realiza un análisis de ADN por métodos genotipicos, se incluyen 
dentro de este tipo de métodos todos aquellos en los que se estudia directamente 
la carga genética bacteriana, tanto la cromosómica como la extracromosómica. 
Aunque las técnicas aplicadas son similares, suele hacerse una primera 
distindón entre los estudios centrados sobre plásmidos y los estudios centrados en 
el ADN cromosómico. En el segundo grupo de técnicas basadas en el análisis de 
fragmentos amplificados por PCR, se utilizan primers que reconocen secuendas 
definidas del DNA (Badiola, 2000). 
En algunas ocasiones se han amplificado genes conoddos, o detenninadas 
zonas intergénicas, que muestran sufidente capacidad de discriminadón 
epidemiológica entre cepas, al someterse a estudio de los fragmentos obtenidos 
por la digestión de los productos ampliflicados con endonudeasas de restricdón 
(Stanley., et a/1995). 
En otras ocasiones se han utilizado oligonucle6tidos que reconocen 
Secuencias Palindrómicas Extragénicas repetitivas REP, altamente conservadas en 
eubacterias. Las regiones de ADN amplificadas con esta metodología corresponden 
a los genes estructurales flanqueados por los primers usados, por lo que puede 
representar solo una forma indirecta de observadón de las variadones de dichos 
genes (Versalovic et al., 1991). 
Estas secuencias REP parecen jugar un importante papel en la transcripción 
o en la estabilidad del mRNA y en la interacdón del ADN con la DNA polimerasa 1 
(Wilson., et a/1990). 
22 
Introducción 
La técnica basada en el reconodmiento de las Secuendas Palindr6micas 
Extragénicas Repetitivas se denomina, genéricamente, REP-PCR "repetitive 
extragenic palindromic PCR". Existiendo dertas variaciones, como la que emplea 
primers que reconocen una subdase de elementos REP presentes en 
enterobacterias y conocidos como ERIC ("enterobacterial repetitive intergenic 
consensus" o ERIC) (ver tabla 5) (Vesalovic et a/1991). 
En 1992 se examinó la disbibudón de las secuendas Consenso 
Enterobacterial Repetitivo Intergénico(ERIC) dentro del genoma de una gran 
número de aislamientos de bacterias gram negativas. Las secuendas ERIC son 
altamente conservadas en el nivel de secuenda de nudeótido, pero su localización 
cromosómica difiere entre especies y cepas. Las secueáas ERIe tienen 126 pb Y 
parecen ser restringidas a regiones transcritas del genoma, cualquiera de las dos 
dentro de regiones intergénicas de operones poIidstronicos o en regiones no 
traducibles arriba o debajO de marcos abiertos de lectura (Brujin, 1992). 
Tabla 5. Secuendas ERIe. 
ERIC 
Consenso 5' -GTGMTCCCCAGGAGcrrACATAAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3' 
~ 
ERICALL S' -GTGAATCCCCAGGAGCTTACATAAGTAAGTGACTGGGGfGAGCG-3 ' 
ERIC1R .--
3' -CAC TIA GGG GTC CTC GAA TGTA-S' 
~ 
ERIC2 5' -AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGCG-3' 
Tomado y adaptado de Versalovic el aL, 1991 
23 
Introducción 
La ERIC -PCR ha mostrado ser eficaz para dasificar bacterias a nivel de 
especie e induso para discernir entre cepas con diferentes grados de virulenda. la 
ERIC-PCR ha resultados ser altamente disaiminatoria, rápida y sendlla de llevar a 
la práctica, por lo que se le considera un método muy válido en estudios 
epidemiológicos ( Hu and Totake, 1997) 
1.3.2 Secuencias ARN 16s 
Recientemente desarrollaron una prueba de PCR que promete una mejor 
sensibilidad al detectar Haemophi/us parasuis de muestras dínicas. Este ensayo 
detecta 102 UFC/mL, y se cree es mucho más sensible que el aislamiento 
tradidonal. Una de las prindpales aplicaciones del método es la definición de la 
prevalencia de infecciones sistémicas en la piaras afectadas (Oliveira et al, 2001) 
(Chang, 2003). 
En esta prueba de PCR se compararon las secuencia genética de la 
subunidad 16s del RNA ribosomal de H. parasuis con 56 secuendas 16s de 
bacterias realcionadas, induyendo las aisladas con mayor frecuencia en tejidos 
procedentes de cerdos. Muestras colectadas por hisopos estériles producen 
resultados en menos de 24 horas. la prueba de PCR es más específica 
produciendo resultados negativos probados cuando se usaron 15 bacterias 
comúnmente aisladas de tejido de cerdo (Oliveira et al., 2001). 
24 
1.4 Justificadón e hipótesis. 
1.4.1lustificaci6n. 
JustiliaJdón 
la actividad porcina en México durante los últimos años ha presentado un 
importante desarrollo como resultado de trabajar cada vez más sistemas intensivos 
de producción, así como a la adopción de nuevas tecnologías provenientes de 
otros países (Quiles, 2001). En esta moderna industria porcina, algunos procesos 
infecdosos de origen bacteriano cursan con inflamadón de las meninges. Debe 
mendonarse especialmente la infecdón por Haemophilus parasuis que es el 
causante de la enfermedad de Glasser. Se considera, en la actualidad, uno de los 
problemas emergentes pordnos de mayor interés económico y áentífico, asodado 
a determinadas prácticas de manejo ligadas a explotadones calificadas como 
"excelentes" desde el punto de vista sanitario, induyendo explotadones SPF (libres 
de patógenos específicos) o, simplemente, de alto estatus sanitario. En este tipo 
de granjas la enfermedad aparece de forma fulminante, con muertes súbitas que, 
en ocasiones, adquieren niveles preocupantes. 
Probablemente, la coinddenda con nuevos síndromes respiratorios en los 
que se implican otras bacterias o virus ha contribuido de modo decisivo al 
incremento de la prevalenda y gravedad de la enfermedad. (Ferri et al, 2000). Por 
eso el estudio de la epidemiología en las piaras es muy importante. Técnicas como 
la ERIC-PCR han mostrado resultados muy útiles porque identifica cepas 
individuales, aún del mismo serotipo. En estos estudios han demostrado que la 
mayoría de los brotes de la enfermedad en granjas son debidos a una sola cepa y 
que existe transmisión de estas cepas entre granjas (Mendoza et al, 1999). Para 
el caso de México se necesita saber si el Haemophilus parasuis tiene el mismo 
comportamiento dentro de las granjas, ya que seria de gran ayuda, para este 
sector, establecer el diagnóstico por ERIC-PCR para el control de la enfermedad 
de Glasser. 
25 
HipÓteSIs 
1.4.2 Hipótesis. 
Si logramos estandarizar la técnica de PCR con los oligonucleótidos ERIC y 
Hps para el diagnóstico de la enfermedad de Glasser entonces podremos estudiar 
el comportamiento de las cepas de Haemophilus parasuis dentro de las granjas. 
26 
Objetivos 
2. OBJETIVOS. 
2.1 OBJETIVO GENERAL. 
Evaluar la técnica de ERIC-PCR mediante la obtendón de muestras de 
campo positivas a Haemophilus ~~is para la detecdón temprana de la 
enfermedad de Glasser y estandarizar la técnica. 
2.2 OBJETIVOS PARnCULARES. 
Aislar Haemophilus ~rasuis de muest:ras de pulmón, líquido cefalorraquídeo 
y cometes nasales de cerdo. 
Establecer el diagnóstico de Haemophilus parasuis mediante la técnica de 
PCR utilizando los oligonucleótidos ERIC l-R y ERIC 2. 
Evaluar la espedficidad de la técnica ERIC -PCR para la detecd6n de 
Haemophilus parasuis utilizando otras cepas bacterianas del tracto respiratorio de 
los cerdos. 
Comparar los inidadores ERIC-IR y ERIC 2 con los oligonucleótidos de 
Hps-R Y Hps-F para el diagnóstico de la enfermedad de Glasser. 
27 
--_.-._- ---- --- --- -
Material Y métrxIos 
3. Material y métodos. 
3.1 Obtendón de una cepa de Haemophilus parasuis. 
La cepa de Haemophilus parasuis se obtuvo del laboratorio de Virología y 
Microbiología, Coordinación General de Estudios de Posgrado FES Cuautitlán, 
Campo 1. Está descrita como una cepa de Haemophilus parasuis serotipo 5 
Nagasaki. 
El cultivo de la cepa se realiza en medio de cultivo agar PPlO con una estria 
de Staphy/ocoa:us aureus Cowan 1 y se incuba 24 horas a 37°C. Posterionnente se 
toman las colonias cercanas a la estria y se siembran en cultivo agar enriquecido 
PPlO con levadura. Una vez obtenida la bacteria se le realizó tinción de Gram y las 
pruebas bioquímicas ureasa, catalasa y oxidasa. 
Parte del credmiento bacteriano se coloca en Skilmilk y se guarda a -70°C 
para preservar1o. La otra parte de este cultivo se cosecha en PBS para la 
extracción de ADN. 
3.2 Estandarizadón de la extracción de ADN de Haemophilus parasuis 
por el método Fenol-CIoroformo. 
Con la cepa obtenida se inició el trabajo experimental empleando la técnica 
referida por Ruiz et al (2001) para la extracdón de ADN para Haemophilus 
parasuis. A esta técnica se realizaron algunas modificadones para utilizarla en el 
presente trabajo. 
28 
-- - - - --- -----
Material Y métodos 
Se cultivo en agar PPLO con levadura y se cosecha en PBS, se coloca 
1.0 mL de PBS en tubos eppendorf de 1.5mL. Se centrifugo en una microcentrifuga 
Beckman Microfuge ETM por 5 minutos a 14,000 rpm. Posteriormente se 
resuspendió el sedimento en 400 ~L de PBS y se colocó el tubo en agua hirviendo 
durante 10 minutos. A continuación se agregaron 250 ~L de fenol isoamil 
cloroformo, se mezcló bien y se centrifugó durante 2 minutos a 14,000 rpm. la 
capa superior se colocó en otro tubo eppendorf de 1.5 mL y se le añadieron 
250 ~L de isoamil cloroformo mezclándolo 40X, después se centrifugó 2 minutos a 
14,000 rpm. Se obtuvo la capa superior en un tubo eppendorf de 0.5 mL y se 
agregó 12 ~L de acetato de sodio y 400 ~L de etanol al 100%, la mezcla se deja 
en hielo 45 minutos. Pasado este tiempo se centrifugó 15 minutos a 14,000 rpm. 
Se decanto el alcohol y se agregaron 70 ~L de etanol al 70% sin resuspender. 
Después se centrifugó 5 minutos a 14,000 rpm. Por último se decanto el alcohol y 
se dejÓ secar. El ADN se resuspende en 50 JJL de agua miliQ y se almacena a 
4°C. 
3.3 Estandarización de la técnica ERlC-PCR. 
En el presente estudio para la identificación de Haemophilus parasuis con la 
prueba de reacdón en cadena de la polimerasa de secuendas consenso 
enterobacterial repetitivo intergénico (ERIC) se utilizaron 2 oligonucleótidos, 
adquiridos de la empresa XXIOr® O.Walek y se presentan en la siguiente tabla. 
Tabla 6. Oligonucleótidos empleados.ERIC-1R 5' - ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCAC-3' 
ERIC-2 5' - AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGCG-3' 
29 
Material y métrx:Jos 
Para la reacción fueron usados 9 IJL de la suspensión de ADN molde, Buffer 
QUIAGEN® a una concentradón final de 1X, 2.5mM de MgCI2, 200IJM de cada 
dNTP, O.4IJM de cada oligonudeótido, 8.51JL de agua miliQ y lU de Taq DNA 
polimerasa. El volumen total de la reacdón fue de 251JL. 
También se realizó una variadón de esta téatica utilizando una soludón Q 
QUIAGEN®, esta solución fue empleada en sustitudón de los 2.5mM de MgCh. De 
esta manera se optimizo la reacción y se obtuvieron mejores resultados. 
Las reacdones fueron corridas en un termocidador Techne modelo Progene™ 
durante 30 dclos con los siguientes pasos: 
• Desnaturalización a 94°C por 0.5 minutos. 
• Alineamiento a 40°C por 2 minutos. 
• Extensión a 72°C por 2 minutos. 
Con una Desnaturalización inidal a 94°C durante 5 minutos y una extensión 
final a 72°C por 7 minutos. 
Alícuotas de 5IJL de la muestra amplificada fueron cargadas sobre un gel de 
agarosa al 2% con 0.5 IJg/mL de Bromuro de etidio corrido a 80v por 60 minutos. 
Los geles fueron visualizados y fotografiados usando el transiluminador GENE 
GENIUS Bioimaging System . 
30 
--------- --
Material Y métodos 
3.4 Obtención de cepas de Streptococcus su/s, Pasteurella multocida, 
Sordetella bronch/septica y Actinobadllus pleuropneumonJae serotipo 2. 
Las cepas de Streptococcus suis, Pasteurella multocida, 80rrJetella 
bronchiseptica y Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 2 se obtuvieron de 
aislamientos de casos dínicos de campo realizados por el laboratorio de Virología 
y Microbiología, Coordinación General de Estudios de Posgrado FESC-l. 
El QJltivo de la cepa de Streptoaxcus suis se llevó a cabo en medio de Agar 
Sangre ya que la bacteria es Beta hemolítica, también se observó al microscopio 
que se trataba de una bacteria en forma de cocos Gram positiva. 
La cepa de Pasteurella multodda fue cultivada en medio Agar BHI y se le 
realizaron las pruebas de Indol, Urea, Nitratos, OF Y Gram. Para 80rdetella 
bronchiseptica se utilizó medio Agar BHI y Agar Sangre. 
Para Actinobacillus pleuropneumoniae se realizó el cultivo en Agar BHI y Agar 
Sangre con una estría de cepa nodriza de 5taphylococcus aureus Cowan 1. Las 
colonias cercanas a la estría se resiembran en BHI con levadura. 
Todas las cepas bacterianas se incubaron por un periodo de 24 horas a una 
temperatura de 37°C. 
3.4.1 Extracción de ADN de cepas bacterianas. 
Después de obtener las cepas de 5treptocoa:us suis, Pasteurella multodda, 
Bordetella bronchiseptica y Actinobacillus p!europneumoniae serotipo 2, se 
realizaron las extracciones de AON de cada una de las bacterias. La extracción de 
ADN se llevo a cabo por el método estandarizado y bajo las mismas condiciones en 
las cuales se realizó la extracción de Haemophilus parasuis. 
31 
Material Y métodos 
3.5 Prueba de especificidad. 
Para esta prueba se utilizaron cada una de las extracdones de las bacterias 
y se preparó la mezcla de reacción para la ERIC-PCR. Para la reacción fueron 
usados 9 IJL de la suspensión de AON molde de cada bacteria, Buffer QUIAGEN® a 
una concentración final de lX, Solución Q QUIAGEN® lX, 200 IJM de cada dNTP, 
0.4 IJM de cada oligonucleótido, 8.5 IJL de agua miliQ y lU de Taq ONA 
polimerasa. Se tomaron alícuotas de 5 IJL de cada uno de los productos 
amplificados y se cargaron en gel de agarosa al 2% con 0.5 rng/mL de bromuro de 
etidio a 80V por 60 minutos. 
3.6 Muestreo. 
Como Haemophílus parasuís se puede aislar de sitios respiratorios y 
sistémicos, el muestreo para el aislamiento de cepas de esta bacteria se llevo a 
cabo de tres sitios de la anatomía del cerdo. los sitios fueron: pulmón, líquido 
cefalorraquídeo y cometes nasales. 
3.6.1 Muestreo en pulmones. 
Se tomaron muestras de 20 pulmones de cerdos que llegaron al laboratorio 
de diferentes granjas de México. los pulmones eran de cerdos con sospecha de 
posible infección por Haemophilus parasuis. Con pinzas y tijeras de disea:ión 
estériles se le realiza un corte profundO al pulmón en la zona donde se localiza la 
parte afectada (fig 3). Posteriormente con el tejido se hace una impronta en el 
medio Agar PPlO, se siembra el agar de forma masiva y se coloca la estría de 
Staphyloccocus aureus Cowan I, las cajas se incuban durante 24 horas a 3JOC. las 
colonias cerca de la estría que realizaron satelitismo son cultivadas en Agar PPlO 
con extracto de levadura. 
32 
Material y métodos 
FIgura 3. Muestreo en pulmón. 
3.6.2 Muestreo en liquido cefalorraquídeo. 
las muestras de Líquido cefalorraquídeo llegaron al laboratorio procedentes 
de dos granjas de los estados de Sonora y Puebla. Las muestras llegaron en tubos 
y se procedió a tomar un inoculo de cada uno de los 25 tubos como se muestra en 
la figura 4. El inoculo fue colocado en medio Agar PPLO el cual fue sembrado de 
forma masiva, con la respectiva estría de 5taphylococcus aureus Cowan 1 y se 
incubaron a 37°C durante 24 horas. Las colonias cerca de la estría que realizan 
satelitismo son cultivadas en Agar PPLO con extracto de levadura. 
Figura 4. Muestreo en Uquído cefalorraqufc!eo. 
33 
Material y métodos 
3.6.3 Muestreo en cometes nasales. 
El muestreo de cornetes nasales de cerdo se llevo a cabo en el Centro de 
Enseñanza e Investigación en Producción Porcina de la Facultad de Veterinaria de 
la UNAM en Jilotepec Estado de México. se muestrearon 37 cerdos de las áreas de 
maternidad y destete, también se tomo muestra de cerdos pelones mexicanos que 
es una raza mexicana que por el bajo consumo de su carne está en peligro de 
extinción. El muestreo se realizó inmovilizando al animal y tomando exudados de 
las fosas nasales con hisopos estériles, los cuales se colocaron en tubos con caldo 
PPLO como medio de transporte (flg. S). Los tubos con las muestras fueron 
transportados en una caja con refrigerantes. A la llegada al laboratorio se procediÓ 
a colocar improntas de las muestras de cornetes nasales con los hisopos en cajas 
petri con Agar PPLO, se sembraron de forma masiva y se les coloco la estría de S. 
aureus. 
Figura 5. Muestreo en cometes nasales de cerdo. 
34 
Material Y métodos 
3.7 Prueba de ERlC-PCR con las muestras obtenidas. 
Con las extracdones que fueron hechas a las cepas aisladas de pulmones se 
llevo a cabo la ERIC-PCR, de cada extracción se tornaron 9 ~L de la suspensión 
con AON. La mezcla de reacción, la amplificación y el corrimiento de las muestras 
en gel se realizaron de la fonna ya antes descrita para esta técnica. 
En el caso de las muestras de líquido cefalorraquídeo se tomo de cada una 
de ellas un inoculo de 50 ~L, el cual fue centrifugado a 14,000 rpm durante 5 
minutos, el botón fue resuspendido en PBS y se realizó la extracción con el método 
Fenol-doroformo. De estas extracciones se tomaron 9 ~L de la suspensión con 
ADN para la mezcla de reacdón para la amplificación por el método ERIC-PCR. 
Para las muestras de cometes nasales, también se realizó una extracción 
directa de los hisopos. Los hisopos se colocaron en un tubo Eppendorf con PBS y 
se centrifugaron a 14,000 rpm durante 5 minutos, el botón se resuspendió 
nuevamente en PBS y a continuación se procedió a realizar la extracción con 
Fenol-cloroformo. Las muestras fueron amplificadas siguiendo la metodología de 
ERIC-PCR. 
35 
Material Y métodos 
3.8 Estandarizadón de la PCR con los iniciadores Hps R Y Hps F. 
En el presente trabajo también se utilizó una prueba de PCR desarrollada 
por Oliveira et al., 2001, para amplificar la región que codifica para la subunidad 
16s del RNA ribosomal de Haemophilus parasuis y comparar los resultados con los 
obtenidos mediante el método de fRIC-PCR. los oligonucleótidos utilizados fueron 
adquiridos de la empresa XXID~ D.Walek y se presentan en la siguiente tabla. 
Tabla 7. Oligonudeótidos Hps. 
Hps-R S' - GGC TIC GTC ACC ere TGT-3'Hps-F S' -GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT-3' 
Para la reacción fueron usados 3 ~L de la suspensión de ADN molde de 
Haemophilus parasuis, Buffer QUIAGEN® a una concentradón final de 1X, saludón 
Q QUIAGEN®, 200 ~M de cada dNTP, 0.4 ~M de cada oligonudeótido, 14.5 ~l de 
agua miliQ y 1U de Taq DNA poIimerasa. El volumen total de la reacdón fue de 
25 ~L 
la reacdón fue corrida en un termocidador Techne Progene™ durante 30 
dclos con los siguientes pasos: 
• Desnaturalización a 94°C por 0.5 minutos. 
• Alineamiento a 59°C por 0.5 minutos. 
• Extensión a 72°C por 2 minutos. 
36 
Material y métodos 
Con una Desnaturalización inidal a 94°C durante 5 minutos y una extensión 
final a 72°C por 5 minutos. 
Se tomaron alícuotas de 5 IJl de la muestra amplificada fueron cargadas sobre 
un gel de agarosa al 2% con 0.5 IJgfml de Bromuro de etidio corrido a 80V por 
60 minutos. los · geles realizados con esta técnica fueron visualizados y 
fotografiados usando el transiluminador GENE GENIUS Bioimaging System . 
3.9 Detección de Haemophilus parasuiscon oligonudeótidos Hps. 
Las extracciones de ADN hechas tanto a las cepas de Haemophilus parasuis 
aisladas de 3 sitios diferentes (pulmón, lCR y cometes nasales) como las 
extracciones realizadas directamente de las alícuotas de lCR Y de los hisopos 
nasales, fueron sometidas a la amplificación por PCR con los oligonudeótidos Hps-
R Y Hps-F con la técnica descrita anteriormente en el apartado 3.11. 
37 
Resultados 
4. RESULTADOS. 
La extracción de ADN de la cepa de Haemophi/us parasuis serotipo 5 de 
Nagasaki fue utilizada con éxito para estandarizar la técnica de ERIC-PCR. El ADN 
molde de esta cepa nos sirvió como control positivo para todas las pruebas de 
PCR realizadas durante el estudio. En la figura 6 se muestran los resultados de 
amplificación cuando se utilizan diferentes concentraciones de MgCI2, pero se 
obtiene una mejor definición de los fragmentos amplificados cuando se agrega en 
lugar del magnesio una solución con el nombre "Q solution" proporcionada por el 
proveedor QUIAGEN. Esta solución fue empleada para todas las mezclas de 
reacción preparadas para PCR. La reproducibilidad de la técnica ERIC-PCR fue 
buena, debido a que primero se realizó la estandarización de la extracción de ADN 
y que las concentraciones de los reactivos fueron las adecuadas para llevar a cabo 
las reacciones. 
Figura 6. Estandarización de la técnica ERIC-PCR. M, marcador MXHI; a, producto de 
amplificación de H. parasuis con 2.Sj.JM de MgCI2; b, control negativo; e, producto de amplificación 
de H. parasuis con S.Oj.JM de MgCl2; d, producto de amplificación de H. parasuis con solución Q 
QUIAGEN® lx. 
38 
Resultados 
Los oligonucleótidos ERIC iR y ERIC2 no muestran especificidad para la 
detección del Haemophi/us parasuis, es decir que no solo amplifica muestras de 
ADN molde de esta bacteria Gram negativa sino que también lo hacen con las 
muestras de otras cepas representativas del tracto respiratorio del cerdo. Sin 
embargo muestras obtenidas de los productos de amplificación de cada una de las 
cepas bacterianas expuestas si mostraron un bandeo selectivo (fig 7). 
Figura 7. Prueba de especificidad de la técnica ERIC-PCR. M, marcador MXIII; Hps Control 
positivo producto de amplificación de H. parasuis; App, producto de amplificación de A. 
pleurpneumoniae; Bb, producto de amplificación B. bronchiseptica; Pm, producto de amplificación 
de P. multocida; Ss, producto de amplificación de S. suiS; (-), control negativo. 
39 
Resultados 
En cambio cuando se corrieron la~ muestras amplificadas de PCR con los 
oligonuclótidos Hps si se obtuvo una sola banda de aproximadamente 821 pb para 
Haemophi/us parasuis (fig. 8). Ninguna de las muestras de ADN de las cepas de A. 
p/europneumoniae, P. mu/tocida y S.suis fueron amplificadas con esta prueba de 
PCR. 
Figura 8. Prueba de especificidad de los oligonucleótidos Hps-Ry Hps-F. M, marcador 
MXIII; App, producto de amplificación de A. pleurpneumoniae; Pm, producto de amplificación de 
P. multocida; Ss, producto de amplificación de S. suis, Hps, control positivo producto de 
amplificación de H. parasuis, (-), control negativo 
40 
Resultados 
Con respecto al muestreo, se logró el aislamiento de 3 cepas de 
Haemoph/lus parasuls de los 20 pulmones muestreados (Tabla 8). En la figura 9 se 
muestra una cepa de Haemophilus parasuis aislada de pulmón. La identifICación 
primaria de las cepas se realizó con la prueba de Gram y las pruebas bioquímicas 
de ureasa, catalasa y oxidasa. Los resultados de estas pruebas nos indicaron que 
se tenia a la bacteria pura. las cepas eran cocobacilos Gram (-), sin actividad de 
ureasa, y positivas a la prueba de cata lasa y oxidasa. Posteriormente a la 
identificación se completo la extracción de AON de las 3 cepas y con estas se llevo 
a cabo la ERlC-PCR. 
Figura 9 . Aislamiento de Haemoph/lus 
{JiIrasuls. Crecimiento en medio Agar PPLO 
con estría de S. aureus Cowan 1. 
41 
Resultados 
T bl 8 A· l . t d}f, . d a a . IS amlen os e aemopJ 1 liS paraSUIS e pu mones d d e cer o. 
No. Granja Cerdo Aislamiento de 
muestra Haemophilus 
parasuis. 
1 Los amigos C.d. Obregón. Cerdo 3 -
2 Los amigos C.d. Obregón Cerdo 5 -
3 Los amigos C.d. Obregón Cerdo 6 -
4 Puebla Cerdo con 12 + 
semanas sin medicar. 
5 AMTEC Occidente. Lechón 36 días. -
6 AMTEC Occidente. Lechón 36 días. -
7 Granja Rosita. Cerdo 78 días. -
8 Alfredo Franco. Cerdo 45d. -
9 Alfredo Franco. Cerdo 37d. -
10 Alfredo Franco. Cerdo 53d. -
11 Alfredo Franco. Cerdo 61d. + 
12 Grupo Soles Sonora. Lechón lo -
13 Grupo Soles Sonora. Lechón 4. + 
14 Melchor Ocampo. Lechón 8 semanas. -
15 Zapotlanejo Jalisco Lechón 1 9 semanas. -
16 Zapotlanejo Jalisco Lechón 2 10 -
semanas. 
17 Zapotlanejo Jalisco Lechón 3 9 semanas -
18 Jilotepec Cerdo 12ME -
19 Jilotepec Destete 19 -
20 Jilotepec Destete 22 -
En el caso de las muestras de líquido cefalorraquídeo no se obtuvo ningún 
aislamiento de la bacteria Haemophilus parasuis (Tabla 9). Sin embargo se sabía 
que aunque no se logré el aislamiento de la bacteria, esta puede estar presente y 
se puede comprobar con otras técnicas como por ejemplo la Inmunofluorescencia 
Directa. De esta manera se procedió a las extracciones de ADN directamente de 
las muestras de LCR, las cuales se completaron de manera exitosa y con estas se 
consiguió identificar 4 muestras positivas con los métodos de PCR. 
42 
Resultados 
T bl 9 A" I d }f, hl a a . IS amientos e aemop, i us parasuis d e líquido cefalorraquídeo. 
No. Granja Cerdo Aislamiento de 
muestra Haemophi/us 
parasuis. 
1 Sonora C7 8 semanas Gpo.38 -
2 Sonora LCR #3 -
3 Sonora C8 7 semanas Gpo. 39 -
4 Sonora LCR #6 -
5 Sonora C8 8 semanas Gpo.39 -
6 Sonora C9 7 semanas Gpo.39 -
7 Sonora C9 7 semanas Gpo.39 -
8 Sonora C3 78 días -
9 Sonora C5 -
10 Sonora C3 -
11 Sonora C4 78 días -
12 Sonora C1 36 días -
13 Sonora C2 26 días -
14 Tehuacan Puebla LCR-7b -
15 Tehuacan Puebla LCR-7a -
16 Tehuacan Puebla LCR-5 -
17 Tehuacan Puebla LCR-5b -
18 Tehuacan Puebla LCR-9a -
19 Tehuacan Puebla LCR-9b -
20 Tehuacan Puebla LCR-3b -
21 Tehuacan, Puebla LCR-7a -
22 Tehuacan Puebla LCR-9b -
23 Tehuacan Puebla LCR-7b -
24 Tehuacan Puebla LCR-3a -
25 Tehuacan, Puebla LCR-1a -
Del muestreo de cornetes nasales solo se consiguió un aislamiento (Tabla 
10). La cepa se identificó de la misma forma que las 3 cepas aisladas de pulmón. A 
cada uno de los hisopos con los que se muestreo los cornetes nasales de los 
cerdos se les trato para obtener la extracción de ADN resultando eficiente la 
metodología empleada ya que se obtuvieron productos de PCR de 7 muestras. 
43 
Resultados 
Tabla 10. Aislamiento de Huemophilus parasuis de muestras de cornetes nasales de 
cerdos 
No. Granja Cerdo Aislamiento de 
muestra Haemophi/us 
parasuis 
1 Jilotepec $-1 -
2 Jiloteoec $-2 -
3 Jilotepec $-3 -
4 Jiloteoec $-4 -
5 Jiloteoec $-5 -
6 Jilotepec $-6 + 
7 Jiloteoec $-7 -
8 Jilotepec $-8 -
9 Jiloteoec $-9 -
10 Jiloteoec$-10 -
11 Jiloteoec Destete 1-1 -
12 Jiloteoec Destete 1-3 -
13 Jilotepec Destete 1-4 -
14 Jiloteoec Destete 1-5 -
15 Jilotepec Destete 1-6 -
16 Jiloteoec Destete 1-7 -
17 Jiloteoec Destete 1-8 -
18 Jiloteoec Destete 1-9 -
19 Jilotepec Destete 1-10 -
20 Jiloteoec M574 -1 -
21 Jilotepec M571-2 -
22 Jiloteoec M504-1 -
23 Jiloteoec M504-2 -
24 Jilotepec M504-3 -
25 Jiloteoec M508-1 -
26 Jiloteoec 74ME -
27 Jiloteoec 10M -
28 Jiloteoec 72M -
29 Jiloteoec 71M -
30 Jiloteoec 12ME -
31 Jiloteoec 11M -
32 Jilotepec 75ME -
33 Jiloteoec 73M -
34 Jiloteoec 70M -
35 Jilotepec 8P -
36 Jiloteoec E2 -
37 Jiloteoec 9PE -
44 
Resultados 
De las 3 muestras de ADN obtenidas de cepas de Haemophi/us parasuis 
aisladas de pulmón se obtuvieron 2 perfiles de huellas de ADN diferentes (fig.l0). 
La cepa de Haemophi/us parasuis aislada del pulmón de la granja Franco produjo 
múltiples fragmentos, dos de ellos entre las 750 pb Y dos más por debajo de los 
250 pb. Las cepas obtenidas de Puebla y Sonora muestran patrones muy similares 
entre ambas, incluso muy parecidos al patrón mostrado por el control positivo de 
Haemophi/us parasuis serotipo 5 de Nagasaki. 
Figura 10. Perfiles de fragmentos de ADN amplificados con ERIC-PCR de muestras de pulmón. 1, 
marcador MXIII; 2, control (+) producto de amplificación de H. parasuis serotipo 5 Nagasaki; 3, 
control (-); 4, producto de amplificación de H. parasuis aislado del pulmón 13; 5, producto de 
amplificación de H. parasuis aislado del pulmón 11; 6, producto de amplificación de H. parasuis 
aislado del pulmón 4. 
45 
- -------------
Resultados 
Las 3 cepas aisladas de pulmón con sospecha de infección por Haemophilus 
parasuís fueron positivas a la prueba de PCR con oligonucleótidos Hps. En la figura 
11 se pueden observar los fragmentos de amplificación de aproximadamente 821 
pb que corresponden a la región que codifica para la subunidad pequeña 165 del 
ARN ribosomal. 
2642pb 
750pb 
500pb 
250pb 
Figura 11. Fragmentos de ADN amplificados con oligonucleótidos Hps-R y Hps-F de muestras de 
pulmón. M, marcador MXIIl¡ 1, control (+) producto de amplificación de H. parasuÍ$ serotipo 5 
Nagasakl¡ 2, producto de amplifICación de H. parasuis aislado del pulmón 13; 3, producto de 
amplifICación de H. parasuis aislado del pulmón 11; 4, producto de amplificación de H. parasuis 
aislado del pulmón 4; 5, control (-). 
46 
--------------
Resultados 
Debido a que no se logro aislar ninguna cepa de Haemophi/us parasuis de 
las muestras de líquido cefalorraquídeo, las 25 muestras de la extracción directa de 
ADN fueron sometidas a PCR para amplificar la región que codifica para la 
subunidad 16s del RNA ribosomal. De un total de 25 muestras de ADN obtenidas 
del LCR cuatro dieron positivo a Haemophi/us parasuis lo cual indica la presencia 
de esta bacteria incluso cuando no se llega obtener el aislamiento (fig 12). 
2642pb 
7S0pb 
SOOpb 
2S0pb 
M 1 234567 
Figura 12. Fragmentos de ADN amplificados con oligonucleótidos Hps-R y Hps-F de muestras de 
líquido cefalorraquídeo. M, marcador MXIII; 1, control (+) producto de amplificación de H. parasuis 
serotipo 5 Nagasaki; 2, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído directamente de 
LCR No 7; 3, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído directamente de LCR No 
13; 4, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído directamente de LCR No 14; 5, 
producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído directamente de LCR No 14; 6, producto 
de amplificación de ADN de H. parasuisextraído directamente de LCR No 20; 7, control (-). 
47 
Resultados 
Con las 4 muestras positivas a Haemophilus parasuis con los 
oligonucleótidos Hps-R y Hps-F se realizó la técnica de ERIC-PCR (fig. 13). Se 
obtuvieron 2 perfiles de fragmentos diferentes. Dos fragmentos por debajo de los 
250 pb se obtuvieron de los productos de amplificación de las muestras de LCR 7, 
14 Y 20. La muestra de LCR 13 presentó un patrón de huellas genómicas diferente 
con fragmentos superiores a las 250 pb. 
Figura 13. Perfiles de fragmentos de ADN amplificados con ERIC-PCR de muestras de líquido 
cefalorraquídeo. M, marcador MXIII; 1, control (+) producto de amplificación de H. parasuis 
serotipo 5 Nagasaki; 2, producto de amplifICaCión de ADN de H. parasuis extraído directamente de 
LCR No 7; 3, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído directamente de LCR No 
13; 4, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído directamente de LCR No 14; S, 
producto de amplificación de ADN de H. parasuisextraído directamente de LCR No 14; 6, producto 
de amplificación de ADN de H. parasuisextraído directamente de LCR No 20; 7, control (-). 
48 
- - - - - - - ------------ -
Resultados 
En consecuencia a que solo se logró el aislamiento de una cepa de 
Haemophi/us parasuis de cornetes nasales de cerdo, a todas las extracciones de 
las 37 muestras se les realizó la prueba de PCR con oligonucleótidos Hps. En la 
Figura 14 se puede observar 8 muestras fueron positivas a Haemophi/us parasuis 
ya que se amplificó el fragmento correspondiente a 821 pb. 
} M 1 2 ~ 4 5 6 7 8 9 10 11 . ' • • ! • 
... - - --
11 .. 
... 
M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 
• • -l. 
11 •• 
I • 
Figura 14. Fragmentos de ADN amplificados con oligonucleótidos Hps-R y Hps-F de muestras de 
cornetes nasales. M, marcador MXIII; 1, control (+) producto de amplificación de H. parasuis 
serotipo 5 Nagasaki; ; 2, control (-); 5, producto de amplifICación de ADN de H. parasuisextraíclo 
directamente de la muestra 3; 6, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído 
directamente de la muestra 4; 8, producto de amplificación de ADN del aislamiento de H. parasuis 
de la muestra 6; 9, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído directamente de la 
muestra 7; 10, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído directamente de la 
muestra 8; 11, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído directamente de la 
muestra 9; 13, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído directamente de la 
muestra 11; 14, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído directamente de la 
muestra 12; 3,4,7,12,15,16,17,18,19,20,21,22 correspondientes a las muestras que no 
amplificaron. 
49 
Resultados 
El ADN de las muestras 3, 6, 8, 9, 11 Y 12 (extraído directamente de 
hisopos de cornetes nasales) incluyendo también el ADN de la muestra 7 el cual es 
de la cepa aislada, produjeron múltiples fragmentos de amplificación (fig 15). Los 
patrones de huellas genómicas son similares entre las muestras 6, 9, 11 Y 12. En 
el caso de la muestra 7 presenta fragmentos por arriba de las 750 pb lo que 
indica una diferencia entre los otros productos de amplificación. La muestra 3 solo 
produjo una sola banda entre las 250 y 500 pb por lo que hace no tenga relación 
con los fragmentos obtenidos en la otras muestras. 
Figura 15. Perfiles de fragmentos de ADN amplificados con ERIC-PCR de muestras de cornetes 
nasales. M, marcador MXIII; 1, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído 
directamente de la muestra 8 ; 2, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído 
directamente de muestra 3; 3, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído 
directamente de la muestra 6; 4, producto de amplificación de ADN del asilamiento de H. parasuis 
de la muestra 7; S, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído directamente de la 
muestra 9; 6, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído directamente de la 
muestra 11; 7, producto de amplificación de ADN de H. parasuis extraído directamente de la 
muestra 12. 
50 
5. Discusión. 
Este estudio se desarrolló como primera aplicación práctica de ERIC-PCR 
para evaluar la variabilidad de aislamientos de Haemophilus parasuis en México. 
Una de las finalidades del trabajo fue estandarizar la técnica de ERIC-PCR para ser 
reproducida en futuros estudios sobre la afección de piaras