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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS FACULTAD DE MEDICINA ESTUDIO MOLECULAR DE LOS ALELOS FUNDADORES DEL GEN FMR1 EN POBLACIONES INDIGENAS Y MESTIZA MEXICANA T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADEMICO DE DOCTORA EN CIENCIAS P R E S E N T A M. en C. XOCHITL ADRIANA FELIX LOPEZ DIRECTOR DE TESIS: DR. FABIO A. SALAMANCA GOMEZ MÉXICO, D.F. ABRIL, 2007 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) con los proyectos número 34451-M y salud-2003-C01-074 y por el Programa de Apoyo a la Investigación Médica, IMSS con los proyectos número FOFOI FP-0038/1248; FP-0038/1247 y FP-0038/763 al Dr. Diego Julio Arenas Aranda. Para obtener el grado de Doctora en Ciencias, el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología me otorgó la beca con el registro número 167240 durante el periodo comprendido de septiembre de 2001 a febrero de 2005. Para obtener el grado de Doctora en Ciencias, la Dirección General de Estudios de Posgrado (DGEP-UNAM) OF. DGEP/SPIAP/PB/2258/2001, me otorgó la beca complementaria durante el periodo comprendido de septiembre de 2001 a julio de 2003. Este trabajo recibió la asesoría de los miembros del Cómite Tutoral integrado por: Dr. Fabio A. Salamanca Gómez Dr. Diego Julio Arenas Aranda Dr. Rogelio Alejandro Alonso Morales El presente trabajo se realizó en la Unidad de Investigación Médica en Genética Humana del Hospital de Pediatría de Centro Médico Nacional Siglo XXI del IMSS, bajo la Dirección de tesis de: Dr. Fabio A. Salamanca Gómez Dr. Diego Julio Arenas Aranda Una parte de este trabajo se realizó en la Unidad de Biología Molecular y Medicina Genómica del INCMNSZ con el apoyo de la Dra. María Teresa Tusié Luna y del Dr. Samuel Canizales Quinteros; en la Universidad Panaméricana con el apoyo de los Drs. Manuel Ramos-Kuri y Francisco Javier Estrada Mena y la parte inicial del análisis estadístico se realizó en el Departamento de Genética Forense del CIBIN, IMSS en la Ciudad de Monterrey Nuevo León con el apoyo del Dr. Ricardo M. Cerda Flores. DEDICATORIAS A mi esposo Hugo Tonatiuh por su invaluable, incondicional e inmenso apoyo para la culminación de este proyecto y sobre todo porque gracias a su amor, comprensión y paciencia, juntos hemos logrado la realización de tener a nuestra familia completa. A mis hijos Faustino, Hugo y Diego porque gracias a su existencia y amor siempre han sido el motor y la fuerza para la continuidad a este proyecto largamente anhelado. A Mercedes Sánchez Mora por contar siempre con su apoyo para la realización de este logro académico y por sus continuas e incansables muestras de generosidad, paciencia, amor y dedicación con la que ha cuidado a nuestros más grandes tesoros “nuestros hijos”. A mis padres Chayito y Javier y a mis hermanos Cuquis, Javier, Raúl y José Rosario, porque la distancia no ha sido un impedimento para que mantengamos una gran cercanía con lazos de amor indestructibles. A mis padres porque ahora conozco el significado real de la frase “por darme la vida” y con ella sus enseñanzas y ejemplos, que han sido los firmes cimientos de los cuales he hecho uso para ésta realización profesional. A mis hermanos porque gracias a las vivencias juntos conozco el valor de la amistad y de la unión familiar. A mis sobrinos, a mis cuñadas Carmina, Inés y Mirna y a mi cuñado Primi. A toda mi familia en Bamoa, Estación Bamoa y Guasave…… tias, tios y primos. A las familias Mendoza Chan y Chan Peñasco, porque no fueron necesarios lazos de sangre para contar con todo el apoyo en los inicios de mi vida profesional, ya que contribuyeron enormemente en la obtención del presente logro. Los lazos de amor y mi gratitud permanecerán por siempre. A todos los integrantes de la familia Ortiz Soto y ramas genealógicas que de ella desprenden, de manera muy especial por las repetidas muestras de amor a mi suegra Teresa Soto y a mi cuñada y comadre Patricia Ortiz. A mis amigos: A todos ustedes que a pesar de la distancia o al distanciamiento ocupan un lugar muy especial en mis afectos. AGRADECIMIENTOS Al Dr. Fabio A. Salamanca Gómez. Mi admiración, respeto y gratitud por darme la oportunidad de formar parte de su grupo de trabajo, por sus enseñanzas e invaluable apoyo. Al Dr. Diego J. Arenas Aranda. Con mi admiración y respeto por el cúmulo de conocimientos transmitidos en el largo camino de mi formación académica. De manera muy especial por su inmenso apoyo, paciencia e interés mostrados en la realización de la presente tesis. Al Dr. Raúl Arguello García. Las palabras no me son suficientes para agradecerle el gran interés mostrado y la enorme calidad en su colaboración para la publicación del artículo que se desprendió de este proyecto de investigación, en la revisión y correcciones de la presente tesis, quien con su experiencia y amplios conocimientos contribuyó enormemente. Por la revisión de esta tesis al Jurado: Dra. Martha Patricia Ostrosky Shejet Dr. Diego Julio Arenas Aranda Dr. Julio Granados Arriola Dra. Rosenda Isabel Peñaloza Espinoza Dr. Gilberto Vargas Alarcón Dr. Fabio A. Salamanca Gómez Dr. Rogelio Alejandro Alonso Morales Al Dr. Cuauhtemoc Reyes. Por su apoyo en los inicios de mi formación académica, porque confió en mí para formar parte de la plantilla de académicos en la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma de Sinaloa. A mis compañeros y amigos en el Laboratorio de la UIMGH del Hospital de Pediatría, CMN Siglo XXI, IMSS. A todos y cada uno de mis compañeros y amigos de la DGCSP-PGR, especialmente a aquellos que me brindaron su amistad e invaluable ayuda en cuestiones metodológicas, compartiendo su experiencia y conocimientos. A aquellos, que me otorgaron las facilidades para contar con las condiciones para realizar a la par de mi trabajo como Perito en Genética Forense la presente tesis doctoral, de manera especial: al M. en C. Alfonso Luna Vásquez, a la QFI Sara Mónica Medina Alegría y al Ing. Miguel Oscar Aguilar Ruíz. ÍNDICE ÍNDICE I ABREVIATURAS UTILIZADAS V RELACIÓN DE FIGURAS VII RESUMEN VIII ABSTRACT X I. INTRODUCCIÓN 1 1.1 Antecedentes 1 1.2 Síndrome del Cromosoma X frágil 3 Definición y Frecuencia 3 Manifestaciones clínicas 3 Diagnóstico 4 Herencia 6 1.3 Estructura molecular del gen FMR1 7 FMRP (Proteína de retraso mental X frágil) 10 Posible función de la FMRP 11 1.4 Polimorfismos asociados al gen FMR1 12 Utilidad de los polimorfismos asociados al gen FMR1 15 1.5 Haplotipos asociados a la enfermedad 17 1.6 Origen de la mutación X frágil 18 1.7 Cromosomas fundadores 18 1.8 Permanencia de la mutación y origen de la enfermedad 181.9 Vías mutacionales 19 1.10 Factores asociados a la expansión de tripletes CGG 20 Longitud del número de repetidos CGG 21 Papel de las interrupciones de AGG y longitud del fragmento de repetidos CGG después de la última interrupción 22 Componente genético 23 1.11 Estructura de la población mexicana incluida en éste estudio 23 Población mestiza 23 Poblaciones indígenas 24 Tzeltales 24 Nahuas 25 Purépechas 25 1.12 Antecedentes directos 27 1.13 Justificación 40 II OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL 43 OBJETIVOS PARTICULARES 43 III MATERIALES Y MÉTODOS 44 3.1 Poblaciones en estudio y origen de las muestras 44 3.2 Extracción de DNA genómico 45 3.3 Análisis de repetidos CGG 45 3.4 Análisis de haplotipos 47 3.5 Nomenclatura de los alelos 49 3.6 Secuenciación del DNA 50 3.7 Marcadores genéticos 50 3.8 Clonación de los productos de PCR 50 Selección e identificación de las clonas positivas 52 3.9 Análisis estadístico de los datos 53 IV RESULTADOS 55 4.1 Distribución de repetidos de CGG en poblaciones indígenas y mestiza mexicana 55 4.2 Distribución de alelos de los marcadores DXS548, FRAXAC1, FMRa y FMRb 62 4.3 Secuenciación de los alelos 4 y 3 del marcador FRAXAC1 64 4.4 Distribución de haplotipos con los marcadores DXS548- FRAXAC1 65 4.5 Asociación de los haplotipos con los marcadores DXS548- FRAXAC1 con repetidos de CGG 67 4.6 Distribución de haplotipos con los marcadores FRAXAC1- FMRa-FMRb 67 4.7 Asociación de los haplotipos con los marcadores FRAXAC1- FMRa-FMRb con repetidos de CGG 68 DISCUSIÓN 71 CONCLUSIONES 87 BIBLIOGRAFÍA 92 ABREVIATURAS UTILIZADAS FMR1 Gen 1 de retraso mental X frágil SNP’s Polimorfismos de un solo nucleótido SXF Síndrome del cromosoma X frágil RT-PCR Reverso Transcriptasa-PCR IQ Coeficiente intelectual FRAXA Sitio frágil A en el cromosoma X STR´s Repeticiones cortas en tandem Kb kilobase TEL Telómero CEN Centrómero FMRP Proteína de retraso mental X frágil mRNAs mensajeros de ácido ribonucléico PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa RNA Ácido ribonucléico DNA Ácido desoxirribonucléico EDTA Ácido etilendiaminotetraacético DMSO Dimetil sulfóxido U Unidad ng Nanogramos µl Microlitros ºC Grado centígrado min Minuto seg Segundo µm Micrómetro pb Pares de bases ml Mililitro mM Milimolar pmol Pico moles BSA Albúmina Suero Bovino PEG Polietilén glicol IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido VNTR´s Repeticiones en tandem de número variable msnm Metros sobre el nivel del mar RELACIÓN DE FIGURAS Figura 1. Patrón de herencia de la mutación completa en el síndrome X frágil Figura 2. Mapa de la localización de los marcadores utilizados en este estudio para definir haplotipos asociados al gen FMR1 Panel A de la Figura 2. Correspondencia de la nomenclatura de alelos Figura 3. Secuencia del alelo 4 del marcador FRAXAC1 Figura 4. Secuencia del alelo 3 del marcador FRAXAC1 Figura 5. Alelos de FMR1 obtenidos mediante PCR con oligonucleótidos locus específicos Figura 6. Distribución de repetidos CGG y haplotipos con los marcadores DXS548-FRAXAC1 Figura 7. Distribución de repetidos CGG y haplotipos con los marcadores FRAXAC1-FMRa-FMRb RESUMEN En el presente trabajo, se analizó la distribución del número de repetidos de tripletes de CGG localizados en el extremo 5’ del exón 1 del gen FMR1 en muestras de 80 cromosomas X de mestizos residentes de la Cuidad de México y de 33 cromosomas de tres diferentes poblaciones indígenas mexicanas (Purépechas, Nahuas y Tzeltales). La distribución de las frecuencias alélicas y haplotípicas se obtuvo con dos marcadores microsatélites (DXS548 y FRAXAC1) y dos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP’s): FMRa y FMRb. La comparación de las frecuencias genéticas de las poblaciones mestiza e indígenas fueron estadísticamente similares en la mayoría de los casos, razón por la cual se consideraron como una misma población para la comparación con otras poblaciones. En relación al polimorfismo del número de repetidos localizados en el extremo 5’ del gen, en nuestro estudio se encontraron 16 alelos de repetidos de tripletes CGG en un rango de 17-38 en donde los alelos más frecuentes fueron los de 25 (38.0%), 26 (28.3%) y 24 (12.3%) repetidos. Este modelo es diferente de todos los reportadas en otras poblaciones con las que se comparó, pero se encontró una relación cercana con poblaciones Amerindias, Europeas y Africanas, lo cual se esperaba dado el mestizaje histórico del cual la población mestiza mexicana se originó. Los resultados de los haplotipos con los repetidos de AC DXS548-FRAXAC1 fueron restringidos a 9 haplotipos, de los cuales los más frecuentes fueron los haplotipos 7-4 (52.2%), 8-4 (23.8%) y 7-3 (11.5%). El haplotipo 7-4, modal en la población analizada se ha reportado exclusivamente en poblaciones del este de Asia y este es un dato muy interesante debido a que no se trató del haplotipo 7-3, el cual es más frecuente en la mayoría de las poblaciones estudiadas hasta el momento. Así mismo se encontraron solo 7 haplotipos diferentes definidos con los marcadores FRAXAC1-FMRa-FMRb entre los que se incluyen 5 haplotipos nuevos (3TA, 4TA, 3-A, 4-A y 5-A) al compararlos con población Caucásica, de los cuales los haplotipos 4-A (78.7%) y 3-A (13.2%) fueron los más frecuentes en nuestra población. Nuestros datos sugieren una singular pero relativamente baja diversidad genética del locus FMR1 en población mestiza e indígenas mexicanas lo cual podría estar relacionado al reciente origen de la población mestiza y a la baja tasa de mestizaje de las poblaciones indígenas. Los datos de este trabajo sugieren que la población mexicana que incluye mestizos con residencia en la Ciudad de México y algunas poblaciones indígenas tienen un componente genético relativamente común respecto a la expansión de repetidos de trinucleótidos y a los marcadores del tipo microsatélites y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP’s) en el contexto del locus FMR1. Sin embargo, se encontraron diferencias en nuestra población con otras poblaciones de diferentes áreas geográficas respecto al gen loci-específico entre las que se encuentran: a) el modal de repetidos de tripletes de CGG, lo cual refleja consistentemente una mezcla en el origen de los mestizos mexicanos debido a las contribuciones (Amerindios, Europeos y Africanos), b) el repertorio y la distribución de los repetidos de AC de los marcadores DXS458-FRAXAC1 respecto a los haplotipos se encontraron exclusivamente en poblaciones del este de Asia (China, Taiwan y Tailandia) y c) se encontraron diferencias marcadas en cuanto a los modelos de los polimorfismos de un solo nucleótido (FMRa y FMRb) en nuestra población comparado con población Caucásica. ABSTRACT The (CGG)n repeats size distribution in FMR1 gene was studied in healthy individuals: 80 X chromosomes of Mexican-Mestizos from Mexico City and 33 X chromosomes of Mexican-Amerindians from three indigenous communities (Purepechas, Nahuas and Tzeltales), along with alleles and haplotypes defined by two micro satellite polymorphic markers (DXS548 and FRAXAC1), and two single nucleotide polymorphisms (FMRa and FMRb). Genetic frequencies of Mestizo and Amerindian subpopulations were statistically similar in almost all cases and thus were considered as a same population for comparisons with other populations. Sixteen (CGG)n alleles in the 17-38 size range were observed and the mostcommon were 25 (38.0%), 26 (28.3%) and 24 (12.3%) alleles. This pattern differ from most other populations reported but a closer relation to Amerindian, European and African populations was found, as expected from historical admixtures from which Mexican- Mestizos arose. The results of CA repeats at DXS548-FRAXAC1 were restricted to nine haplotypes of which 7-4 (52.2%), 8-4 (23.8%) and 7-3 (11.5%) were predominant. The modal haplotype 7-4 instead of the nearly universal 7-3 had been reported exclusively in Eastern Asian populations. Likewise only 7 different FRAXAC1-FMRa-FMRb haplotypes were observed including five novel (3TA, 4TA, 3-A, 4-A and 5-A) as compared with Caucasians. Of these, 4-A (78.7%) and 3-A (13.2%) were the most common in Mexican population. These data suggest a singular but relatively low genetic diversity at FMR1 in the Mexican populations studied that may be related to the recent origin of Mestizos and the low admixture rate of Amerindians. In summary, the data from this work suggest that the Mestizo population from highlands and at least some Amerindian subpopulations of Mexico have a relatively common genetic background at the level of expansible trinucleotide repeats and flanking micro satellite/SNP loci in the context of the FMR1 locus. However as a single population they differ from populations of other geographic regions in specific gene loci: (a) their modal CGG repeats which consistently reflect a mixed origin of Mexican Mestizos (Amerindian, European and African), (b) the repertory and distribution of AC repeats in DXS548-FRAXAC1 alleles that resemble those found exclusively in Eastern Asian populations (China, Taiwan and Thailand), and (c) the presence of a striking different pattern of point mutations at FMRa and FMRb loci as compared to Caucasian populations. INTRODUCCIÓN Antecedentes Las especies requieren para la supervivencia y adaptación un equilibrio entre las mutaciones que se acumulan en el genoma y su corrección por los sistemas de reparación. Este balance es complejo porque no todas las secuencias del DNA llevan a cabo mutaciones espontáneas con la misma tasa. Los puntos calientes para mutaciones espontáneas se asocian frecuentemente a secuencias de repetidos en el DNA, entre las que se incluyen repeticiones invertidas, palindrómicas, de un solo nucleótido o bien de di, tri y tetra nucleótidos, por lo que el evento de mutagénesis espontánea no es un evento completamente sorpresivo. Sin embargo, la expansión masiva de repeticiones de tripletes asociados con el Síndrome del cromosoma X frágil (SXF), distrofia miotónica y ataxia de Friedreich son completamente inesperados (Sinden 1999). Se han caracterizado 4 grupos de trinucleótidos repetidos relacionados con la expansión del DNA: CGG/GCC, CAG/GTC, CTG/GAC y GAA/CTT. Las secuencias CGG/GCC generalmente se localizan en las regiones no codificadoras de varios genes y están asociadas a sitios frágiles en los cromosomas cuando se expanden. Estos sitios frágiles son sensibles citogenéticamente como un adelgazamiento en regiones específicas de los cromosomas en metafase. Los repetidos CAG/GTC forman parte de la región codificadora y están relacionados con diversas enfermedades neurodegenerativas. Los repetidos CTG/GAC se encuentran en la región 3’ no codificadora del gen relacionado con la distrofia miotónica. Por último, los tripletes GAA/CTT se encuentran en un intrón de un gen implicado en la ataxia de Friedreich (Arenas et al, 1999). Hasta la fecha se conocen 20 enfermedades genéticas asociadas con la expansión de repetidos de trinucleótidos (Wells et al, 2005), éstas se caracterizan por presentar el fenómeno de anticipación, el cual consiste en una manifestación clínica más severa a edades más tempranas. La severidad de los síntomas correlaciona en la mayoría de los casos con la cantidad de repeticiones de tripletes (Wells et al, 2005). En dichas enfermedades se lleva acabo un proceso conocido como mutación dinámica, el cual se manifiesta con características moleculares, que pudieran ser comunes en las distintas patologías. En 1938 Penrose encontró en un estudio de deficientes mentales un exceso de pacientes de sexo masculino, sin embargo, no existía una explicación genética para este hallazgo. En 1969 Lehrke propuso por primera vez que el retraso mental en varones era debido a genes ligados al cromosoma X. Por otra parte Martin y Bell en 1943, publicaron la asociación entre retraso mental y algunas características fenotípicas como son orejas largas, macroorquidismo y cara alargada en varones de familiar afectadas, en donde las mujeres no estaban excluidas del retraso, aunque eran menos las afectadas y con un retraso menos severo. Por esta razón histórica, durante un tiempo se le denominó al síndrome X frágil como síndrome Martin y Bell (Southerland et al, 1977). SINDROME DEL CROMOSOMA X FRAGIL Definición y frecuencia El síndrome X frágil (SXF) es la causa más frecuente de retraso mental hereditario en humanos (Fu et al, 1991; Verkerk et al, 1991), su nombre se deriva del sitio frágil característico en la banda Xq27.3, presente en una proporción de cromosomas en metafase de células en cultivo. Los últimos estudios acerca de la prevalencia del síndrome estiman que está presente en todos los grupos étnicos estudiados y es de 1:4,500 en varones y de 1: 9,000 en mujeres, aunque debido a la inactivación al azar del cromosoma X, la alteración solo será penetrante en aproximadamente la mitad de una parte de las mujeres portadoras (Penrose 1938). Manifestaciones clínicas Las manifestaciones clínicas se aprecian rara vez antes del año de vida y en tal caso solamente se presenta en forma de retraso en el desarrollo psicomotor. Inicialmente no es grave pero si es progresivo, es decir, la capacidad mental va disminuyendo hasta llegar en la vida adulta a grados habitualmente severos o moderados. En cuanto a los rasgos físicos los más característicos son las orejas grandes y despegadas, la cara alargada con mentón prominente y asimetría facial (Curfs et al, 1991). Además de retraso mental de grado variable habitualmente con IQ entre 40 y 60 (Turner et al, 1986), los afectados tienen anomalías del comportamiento como hiperactividad, déficit de atención y problemas con el lenguaje. El 75% de los individuos no pueden estar quietos, presentan aleteos de las manos o bien se las muerden en situaciones de nerviosismo provocados por ambientes ruidosos o multitudes, el lenguaje es repetitivo, presentan risa sin motivo y aproximadamente el 15% de los pacientes tienen un comportamiento autista (Gilberg y Wahlstrom, 1985). Diagnóstico El diagnóstico clínico del Síndrome del cromosoma X frágil en los posibles afectados es difícil debido a la variabilidad fenotípica del síndrome, la cual depende de la edad del individuo afectado. El estudio clínico consiste en la valoración fenótipica del individuo y cuestionar a cerca de los antecedentes familiares para elaborar el árbol genealógico y determinar el tipo de herencia. Para realizar el diagnóstico se pueden utilizar diferentes estrategias, entre las que se encuentran el método citogenético que consiste en la observación al microscopio de una constricción en el brazo largo del cromosoma X después de provocar una condición de estrés replicativo en células en cultivo. Sin embargo, esta prueba no es informativa en un buen número de casos, debido a que no todos los varones afectados lo presentan y los individuos portadores son citogenéticamente normales (Ashley et al, 1993). El otro tipo de prueba es el diagnóstico molecular,en el cual mediante dos técnicas diferentes es posible evaluar la región de repetidos de CGG del gen FMR1. La primera técnica es mediante amplificación directa por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y consiste en utilizar oligonucleótidos específicos que flanquean la región de los repetidos de tripletes CGG (Fu et al, 1991; Rousseau et al, 1992; Brown et al, 1996; Cao et al, 1994; Levinson et al, 1994). Este es un procedimiento rápido pero tiene el inconveniente de que no permite detectar individuos con mutación completa, debido a que más de 100-200 repetidos de CGG son difíciles de amplificar. El otro método diagnóstico es conocido como Southern blot, se basa en la digestión del DNA genómico extraído de leucocitos a partir de sangre periférica con endonucleasas de restricción. Mediante este método no solo es posible conocer si el individuo en estudio es un individuo afectado o bien un portador, sino que además permite conocer el nivel de metilación de la región del promotor del gen FMR1 (Rousseeau et al, 1991; Turner 1997). No obstante este tipo de análisis es más costoso, utiliza isótopos radioactivos y requiere de un mayor tiempo de realización. Una prueba alternativa más en el diagnóstico es la conocida como RT-PCR, que consiste en evaluar la presencia o ausencia del transcrito del gen. Esta prueba es útil debido a que la mayoría de los individuos afectados por el síndrome X frágil no presentan el transcrito, permite evaluar a un individuo sin antecedentes familiares de la enfermedad y se basa en determinar la presencia o ausencia del transcrito, interpretando el resultado de tal manera que si no está presente el transcrito tendremos a un individuo afectado por el síndrome (Pieretti et al, 1991; Perez– Herrera 1999). La prueba diagnóstica descrita más reciente es el ensayo inmunohistoquímico que se basa en la detección directa de la proteína FMRP por un anticuerpo monoclonal y por la visualización indirecta del complejo antígeno-anticuerpo mediante la actividad de la enzima fosfatasa alcalina (Verheij et al, 1993; Siomi et al, 1993; Willemsen et al, 1995). Este tipo de diagnóstico puede ser ampliamente utilizado para detectar pacientes del sexo masculino; pero puede presentar problemas cuando se trata de diagnosticar a mujeres ya que en éstas uno de los dos cromosomas X se inactiva y no podrá sintetizar la proteína. Herencia Debido al patrón de herencia peculiar de la enfermedad, se propuso que esta alteración se heredaba como un rasgo dominante ligado al cromosoma X, con penetrancia incompleta en las mujeres. El riesgo de manifestar la enfermedad en una familia con antecedentes depende del sexo del individuo y de la posición del individuo en cuestión en el árbol genealógico (Ashley et al, 1998; Fu et al, 1991; Heitz et al, 1992; Nolin et al, 1996; Sherman et al, 1984, 1985, 1996; Snow et al, 1993; Yu et al, 1992). Aproximadamente el 80% de los hombres que heredan la mutación relacionada con el Síndrome X frágil, tienen retraso mental de moderado a severo y algunos otros rasgos fenotípicos relacionados con la enfermedad, sin embargo otros hombres son clínicamente sanos y no manifiestan el sitio frágil cromosómico. A éstos se les denomina “hombres transmisores”, ya que si la mutación se transmite a sus hijas sus nietos tendrán un alto riesgo de manifestar la enfermedad. Por otra parte las hijas de los hombres transmisores no están afectadas por la enfermedad pero son portadoras obligadas de la mutación. Se estima que menos del 30% de las mujeres que heredaron la mutación de parte de su madre portadora presentan características faciales similares a los varones afectados y alteraciones mentales que pueden ir desde deficiencias en el aprendizaje con un IQ con valores normales hasta cursar con un retraso mental grave (Tarleton y Saul 1993; Oostra et al, 1993) (Fig. 1). ESTRUCTURA MOLECULAR DEL GEN FMR1 En 1991 se aisló mediante clonación posicional el gen FMR1 responsable de la enfermedad (Verkerk et al, 1991), éste se localiza en la banda q27.3 del cromosoma X en el sitio frágil FRAXA, tiene una longitud de aproximadamente 40 kb con 17 exones (Eichler et al, 1994a). Una característica de este gen es el polimorfismo de repetidos de tripletes CGG interrumpidos por la secuencia AGG principalmente en las posiciones 10 y 20, localizados en la región no codificadora del extremo 5' del exón 1 (Verkerk et al, 1991; Kunst y Warren, 1994; Eichler et al, 1994b). Fig.1 Patrón de herencia de la mutación completa en el síndrome X frágil. La flecha punteada indica que las hijas de un hombre transmisor son portadoras de la premutación y éstas pueden tener en la siguiente generación hijos e hijas con premutación o mutación completa que pueden o no expresar el fenotipo X frágil. Tomada y modificada de Tarleton y Saul (1993). Hombres transmisores Mujeres portadoras Premutación (padre) 50-193 CGG Premutación (madre) 50-193 CGG espermatogéneis ovogénesis Premutación (todas las hijas) 50-193 CGG Fenotipo no expresado Premutación (todos los hijos e hijas) 50-193 CGG Mutación completa (madre) >200 CGG Mutación completa (hijos e hijas) >200 CGG Síndrome X frágil En más del 95% de los casos, el síndrome del cromosoma X frágil se debe a la expansión inestable de los tripletes de CGG (Verker et al, 1991; Oberle et al, 1991; Kremer et al, 1991a; Fu et al, 1991; Kremer et al, 1991b). En algunos pacientes que manifiestan la enfermedad se han identificado otro tipo de mutaciones como deleciones totales (Albright et al, 1994; Birot et al, 1996; Gedeon et al, 1992; Hirst et al, 1995; Rousseau et al, 1991; Quan et al, 1995; Trottier et al, 1994; Wolf et al, 1997) o parciales del gen (de Graaff et al, 1995; Wohrle et al, 1992) y mutaciones puntuales que afectan los dominios funcionales de la proteína (De Boulle et al, 1993; Lugenbeel et al, 1995; Wang et al, 1997). Existen cuatro formas alélicas del gen con respecto a la longitud de repetidos encontrados en la población. Estas se denominan “normal”, intermedio o de “zona gris”, “premutación” y “mutación completa”. El número de repetidos CGG en las personas sanas y afectadas por el síndrome es diferente: en personas no afectadas es de 6-59 y es de más de 200 en los enfermos, donde se le denomina mutación completa. En el grupo de individuos que presentan “premutación” el número de repetidos es de 60-200, a estos individuos se les considera portadores ya que tienen una alta probabilidad de tener individuos afectados en la siguiente generación (Peng y Stephen, 2000). En el grupo de individuos que presenta alelo intermedio o de “zona gris” el rango de repetidos es de 49-59. Cuando el número de repetidos es mayor de 200, ocasiona que éstos y secuencias del promotor del gen FMR1 se hipermetilen, lo que provoca la inhibición de la transcripción (Verkerk et al, 1991). La expansión de los repetidos CGG solamente se ha descrito por vía materna, el tamaño de los repetidos en los individuos afectados depende del número de estos en su madre, es decir si tiene 90 o más repetidos todos sus hijos de sexo masculino tendrán más de 200 y manifestarán el retraso mental asociado a la enfermedad (Meijer et al, 1994). Se ha descrito en algunos pocos casos regresión de repetidos de mutación completa a premutación, ésto solo por vía paterna. FMRP (Proteína de retraso mental X frágil) El tamaño del transcrito del gen es de 4.4 kb (Eichler et al, 1994a), ocurre empalme alternativo en varios exones dando lugar a diferentes RNAs-mensajeros (mRNAs) e isoformas de la proteína (FMRP) (Ashley et al, 1993; Verkerk et al,1993). Entre las distintas isoformas se incluyen algunas que son más cortas en el extremo C-terminal y mediante análisis Western blot se demostró que varias proteínas tienen un peso entre 70 a 80 kDa (Verheij et al, 1993, 1995). El gen FMR1 se expresa en humanos y en ratón (Abitbol et al, 1993; Hinds et al, 1993). La FMRP está presente en muchos tejidos adultos y fetales, principalmente en neuronas (Devys et al, 1993). En fetos humanos de 8 a 9 semanas se observó el mRNA en sistema nervioso, retina y varios tejidos no neuronales, en cerebro fetal de 25 semanas el mRNA está presente en casi todas las estructuras diferenciadas (Abitbol et al, 1993). Se encuentran altos niveles de la expresión de la FMRP en neuronas, en varias regiones cerebrales y en testículos (Devys et al, 1993; Feng et al, 1997a; Bachner et al, 1993). Estudios de inmunolocalización con anticuerpos revelaron que la FMRP se localiza principalmente en el citoplasma (Verheij et al, 1993; Devys et al, 1993). Reportes posteriores indicaron que está asociada a ribosomas traduccionales (Musco et al, 1996; Feng et al, 1997b; Khandjian et al, 1996), si bien después de que termina la traducción se disocian de los ribosomas (Feng et al, 1997b). La asociación de la FMRP con poliribosomas somatodendríticos apoya la hipótesis de que el retraso mental en el síndrome del X frágil puede ser el resultado de anormalidades en la traducción debido a la ausencia de la FMRP (Garber et al, 2006). Posible función de la FMRP La FMRP es una proteína que se encuentra ausente en la mayoría de los individuos con el Síndrome X frágil. Esta es una proteína de unión a RNA que circula entre el núcleo y el citoplasma y se encuentra asociada como un complejo ribonucleoprotéico para la traducción polirribosomal o asociada a ribosomas en el retículo endoplásmico. En neuronas, la FMRP se encuentra en la base de espinas dendríticas y participa en la remodelación de la espina seguida de la actividad sináptica. Debido a lo anterior, la pérdida de la FMRP puede influir directamente en la plasticidad neuronal originando déficit en el conocimiento. En ausencia de FMRP las células pierden el efecto opuesto a la estimulación mGluR que ayuda a incrementar los niveles de la proteína que normalmente es sintetizada por este sistema. Estos niveles de proteína incrementada dan como resultado la morfología anormal de la espina dendrítica observada en humanos y en modelos animales que pierden la proteína FMRP (Kang et al, 1996; Garber et al, 2006). Polimorfismos asociados al gen FMR1 Se han descrito varios polimorfismos localizados alrededor del gen FMR1. Además de la región de repetidos de tripletes CGG, se han caracterizado una serie de marcadores genéticos intragénicos y extragénicos del tipo microsatélites y SNP’s (polimorfismos de un solo nucelótido) (Fig. 2). Dentro de los marcadores microsatélites, los más ampliamente utilizados se encuentran DXS548, FRAXAC1 y FRAXAC2, localizados a 150 kb, 7.1 kb y 12.4 kb de la región de los repetidos de CGG respectivamente. Este tipo de marcadores son dinucleótidos de CA, mientras que entre los SNP’s se encuentran FMRa y FMRb, localizados a 6 kb y 11 kb de la región de los repetidos de CGG respectivamente (Kunst y Warren 1994) (Fig. 2) y los SNP’s más recientes: ATL1, ATL2 y ATL4. No obstante, estos tipos de polimorfismos resultan ser menos informativos que los microsatélites por la menor variabilidad que presentan (Gunter et al, 1998). Intrón 1 Exón 5 Exón 1 Polimorfismo de repetidos CGG Figura 2. Mapa de la localización de los marcadores utilizados en este estudio para definir haplotipos asociados al gen FMR1. En esta figura se presentan los marcadores microsatélites DXS548 y FRAXAC1 (STRs) y polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), FMRa y FMRb, respecto a la distancia con los repetidos de tripletes CGG localizados en el extremo 5’ del exón 1 del gen FMR1. En la parte superior de los marcadores se presenta la nomenclatura de los alelos y entre paréntesis el tamaño en pares de bases de los productos de amplificación como se obtuvieron en este estudio. DXS548 FRAXAC1 FMRb G (-) A (146) T (182) - (181) FMRa 143 kb 7 kb 6 kb 11 kb 1 (117) 2 (115) 3 (113) 4 (111) 5 (109) 6 (107) 7 (105) 8 (103) 9 (101) 1 (112) 2 (110) 3 (108) 4 (106) 5 (104) 6 (102) TELCEN (CGG)nAGG(CGG)nAGG(CGG)n Panel A de la Fig. 2. Correspondencia de la nomenclatura de alelos. Para los marcadores microsatélites DXS548 y FRAXAC1 y de los polimorfismos de un solo nucleótido FMRa y FMRb, se indican los tamaños en pares de bases reportados y deducidos a partir de los trabajos mencionados en las referencias. Locus STR Alelos Referencias DXS548 18 19 20 21 22 23 24 25 26 (CA)n (Alelos reales) T36 T38 T40 T42 T44 T46 T48 T50 T52 Chiurazzi et al. (1999) 190 192 194 196 198 200 202 204 206 Rousseau et al. (1995) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Macpherson et al. (1994) FRAXAC1 13 14 15 16 17 18 19 20 21 (CA)n ( Alelos reales) T26 T28 T30 T32 T34 T36 T38 T40 T42 Chiurazzi et al. (1999) 96 98 100 102 104 106 108 110 112 Rousseau et al. (1995) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Macpherson et al. (1994) I H G F E D C B A Richards et al. (1991) Locus SNP’s Alelos Referencias FMRa T - Alelos reales A B Kunst y Warren (1994) FMRb G A Alelos reales A B Kunst y Warren (1994) Utilidad de los polimorfismos asociados al gen FMR1 Los polimorfismos asociados al gen FMR1 se han utilizado ampliamente en estudios de variabilidad molecular en individuos sanos y afectados para evaluar la distribución de los repetidos de CGG y determinar si existe asociación de éstos con la posición de las interrupciones y con haplotipos específicos. Además de lo anterior, los estudios de haplotipos en distintas poblaciones son útiles para evaluar el componente genético identificado como uno de los factores asociados al fenómeno de expansión de tripletes descrito en la enfermedad, para definir si algún haplotipo está en desequilibrio de ligamiento con individuos sanos o afectados, para determinar la asociación de algún haplotipo con el efecto fundador o protector de la enfermedad, la susceptibilidad en haplotipos de riesgo y finalmente, permiten evaluar la relación genética entre poblaciones o bien la contribución genética entre poblaciones. Las investigaciones acerca del origen del síndrome X frágil involucran el uso de los marcadores genéticos DXS548, FRAXAC1 y FRAXAC2 (Richards et al, 1991; Riggins et al, 1992). El análisis de haplotipos en cromosomas normales y con la mutación en diversas poblaciones, revela que una proporción considerable de los cromosomas X frágil están en desequilibrio de ligamiento con un número reducido de haplotipos (Richards et al, 1992; Oudet et al, 1993a; Buyle et al, 1993; Jacobs et al, 1993; Hirst et al, 1993; Arinami et al, 1993; Haataja et al, 1994; Macpherson et al, 1994; Malmgren et al, 1994; Oudet et al, 1993b; Richards et al, 1994; Zhong et al, 1994; Chakravarti et al, 1992), mientras que en poblaciones más aisladas genéticamente como la Filandesa, el desequilibrio de ligamiento es más pronunciado. Este ocurre en un 75% de los cromosomas X frágil y se presenta en un haplotipo poco común (Haataja et al, 1994; Oudet et al, 1993b). El primer estudio en el que se encontró asociación de haplotipos en individuos sanos y afectados por la enfermedad fue el de Richards en 1992, en dicho estudio usando los marcadores FRAXAC1 y FRAXAC2 se encontraron 3 haplotipos distribuidos en el 15% de la población caucásica normal, en comparación con el 58% en los individuos afectados con el síndrome X frágil. Contrariamente, un haplotipoque se encontraba en el 50% de la población normal estaba presente en solo el 18% de los individuos afectados. Otros investigadores encontraron modelos similares en diferentes poblaciones Europeas estudiadas (Oudet et al, 1993; Zhong et al, 1993; Hirst et al, 1993; Buyle et al, 1993; Jacobs et al, 1993; Haataja et al, 1994; Malmgren et al, 1994; Chiurazzi et al, 1996). Haplotipos asociados a la enfermedad Existe dificultad para comparar los haplotipos y modelos de interrupción AGG en la reconstrucción de linajes filogenéticos en X frágil debido al número limitado de alelos de premutación estudiados (Kunst y Warren 1994; Hirst et al, 1994). Por otra parte la comparación de estudios cruzados con otros datos de desequilibrio de ligamiento no han sido posibles por considerar solo un marcador microsatélite en la región (Snow et al, 1994; Hirst et al, 1994). Por su parte en el trabajo de Macpherson et al (1994) utilizando los marcadores microsatélites DXS548, FRAXAC1 y FRAXAC2, se encontraron dos grupos de haplotipos en desequilibrio de ligamiento con la mutación X frágil en caucásicos: el primer grupo estaba representado solamente por el haplotipo 2-1-3, en este grupo se encontró que el 14% de los cromosomas X frágil estaba integrado por alelos de tripletes CGG en el límite superior normal, en el segundo grupo se encontró que aproximadamente en el 30% de los casos con X frágil con haplotipos 6-4-4 y 6-4-5 no había correlación con alelos de tripletes CGG de longitud normal. ORIGEN DE LA MUTACIÓN X FRÁGIL Cromosomas fundadores Los alelos con un número de repetidos de tripletes CGG dentro del rango de premutación son altamente inestables y aumentan su número de una generación a otra cuando se transmiten por vía materna. Sin embargo, no se ha descrito un aumento en el número de repetidos desde alelos normales a rangos de premutación o mutación completa. En base a esto, se ha sugerido que en esta enfermedad no hay mutaciones nuevas y que existe un número limitado de “cromosomas fundadores”, que por causas que se ignoran han favorecido la expansión de repetidos desde valores normales a premutación o mutación completa. Esto ha sido apoyado por diversos trabajos en donde se han utilizado marcadores genéticos que flanquean la región de repetidos del gen FMR1 (Richards et al, 1992; Oudet et al, 1993; Buyle et al, 1993; Jacobs et al, 1993; Hirst et al, 1993; Arinami et al, 1993; Haataja et al, 1994; Macpherson et al, 1994; Malmgren et al, 1994; Oudet et al, 1993; Richards et al, 1994; Zhong et al, 1994; Chakravarti et al, 1992). Permanencia de la mutación y origen de la enfermedad Para explicar la permanencia de la mutación y el origen de la enfermedad, Morton y Macpherson propusieron un modelo multialélico (Morton y Macpherson 1992), en base a datos de desequilibrio de ligamiento además del hecho de que no hay transición de alelo normal (5-50 repetidos) a alelo inestable o de premutación (59-200 repetidos) en árboles genealógicos de familias con X frágil (Fu et al, 1991; Show et al, 1993). Este modelo postula que la transición de alelo normal a alelo completamente expandido (>200) ocurre inicialmente a través de la progresión entre cuatro estados alélicos definidos. Inicialmente un alelo normal puede predisponer con poca frecuencia a una pequeña inestabilidad menor a 40 repetidos de longitud, estos alelos pueden mantenerse en la población por más de 90 generaciones o 2000 años (Chakravarti 1992) antes de pasar a alelo inestable (Z) o alelo de premutación. Sin embargo, el paso de alelo inestable a alelo completamente mutado ocurre más rápidamente, requiriendo una transmisión germinal femenina. Vías mutacionales El hecho de que existen diferentes haplotipos en pacientes con el Síndrome X frágil, sugiere que puede haber diferentes haplotipos de riesgo en la población y por consiguiente diferentes vías mutacionales en el origen de la enfermedad. En el caso del haplotipo 2-1-3, éste se encuentra presente en el 14% de los pacientes con X frágil y tiene una frecuencia considerable en alelos intermedios (S) en la población normal. Contrario a lo anterior, los haplotipos 6-4-5 y 6-4-4 así como muchos otros haplotipos encontrados en equilibrio en la población general y en pacientes X frágil, pueden estar sujetos a un recurrente evento mutacional de “salto de rana,” (alelos normales que sufren un aumento en el número de repetidos CGG lo que hace que progresen relativamente rápido a la inestabilidad y a la hiperexpansión, asociados con la enfermedad) (Macpherson et al, 1994; Chakravarti 1992). Aunque tales eventos mutacionales pueden explicar la disparidad en la distribución de alelos en el límite superior normal entre haplotipos X frágil, así como también la considerable diversidad de haplotipos asociados con la enfermedad, las bases moleculares de estas diferentes vías mutacionales es desconocida. FACTORES ASOCIADOS A LA EXPANSION DE TRIPLETES CGG Hasta el año 1994 se consideraba que el número de repetidos de CGG era el único factor que provocaba la inestabilidad y favorecía la expansión de los repetidos en los cromosomas fundadores. Por medio del análisis de las secuencias de los repetidos del gen FMR1 en diferentes poblaciones humanas, se ha sugerido que la secuencia ancestral relacionada con el síndrome X frágil fue una secuencia pura de 24 o más repetidos de CGG carente de las interrupciones AGG (Kunst y Warren 1994; Snow et al, 1994; Hirst et al, 1994). Actualmente se han asociado algunas otras características estructurales al fenómeno de expansión además del número de repetidos, como son la posición y el número de interrupciones, la longitud de repetidos de CGG en el extremo 3’ a partir de la última interrupción de AGG y el componente genético en las distintas poblaciones. Longitud del número de repetidos CGG La predisposición de los alelos de premutación a la longevidad en la población, permite sugerir que los haplotipos que están en desequilibrio de ligamiento con la mutación X frágil pueden estar compuestos por un grupo de alelos con fragmento grande de repetidos. Aunque un grupo específico de haplotipos está integrado por alelos normales en el límite superior (Richards et al, 1992; Buyle et al, 1993; Jacobs et al, 1993), la mayoría de los haplotipos asociados a X frágil no presentan un incremento significativo en la longitud de repetidos entre el grupo de alelos normales (Richards et al, 1992; Oudet et al, 1993; Arinami et al, 1993; Macpherson et al, 1994; Richards et al, 1994). Estos hallazgos sugirieron la influencia de otros factores que flanquean los repetidos de tripletes CGG o bien intrínsecos a ellos, son importantes para determinar la predisposición de alelos a la inestabilidad y a la enfermedad (Richards et al, 1992; Macpherson et al, 1994; Zhong et al, 1994; Zhong et al, 1994a). Papel de las interrupciones de AGG y longitud fragmento de repetidos de tripletes CGG después de la última interrupción Varios grupos han investigado la posibilidad de que las interrupciones pueden determinar la inestabilidad y la susceptibilidad a la enfermedad (Kunst y Warren 1994; Eichler et al, 1994b; Hirst et al, 1994; Snow et al, 1994). Los resultados de estos análisis revelaron que el fragmento más grande de repetidos CGG sin interrupciones determinan la inestabilidad del locus FMR1 con transmisión intergeneracional inestable de alelos de longitud mayor de 34-37 repetidos de CGG puros sin interrupciones de AGG (Eichler et al, 1994b). Debido a que se ha observado que los fragmentos largos de repetidos sin interrupciones de AGG son un indicador de la estabilidad alélica de repetidos CGG, seespecula que el número de interrupciones AGG contenidas dentro de los repetidos pueden determinar la longevidad de alelos de predisposición dentro de una población (Eichler et al, 1994b). Existen datos que proveen las bases moleculares de la existencia de dos vías mutacionales distintas en el origen de la mutación de X frágil y sugiere la influencia de haplotipos específicos tanto en el mantenimiento de la estabilidad como en la pérdida de interrupciones AGG. Debido a la ausencia de alelos normales con longitud >40 repetidos de CGG en los haplotipos 6-4-5 y 6-4-4, se especula que originalmente pudo ocurrir un evento mutacional recurrente en el que los alelos en estos haplotipos tuvieran un “salto de rana” que provocara la inestabilidad y la hiperexpansión (Macperson et al, 1994). Componente genético Dependiendo de la homogeneidad genética de la población en estudio, el 50% de los cromosomas X frágil tienen componente genético común (Haataja et al, 1994; Malmgren et al, 1994; Oudet et al, 1993) y el resto están en equilibrio con haplotipos comunes en la población o bien ocurren variantes haplotípicas poco comunes (Macpherson et al, 1994; Zhong et al, 1994). Debido a estas observaciones se sugiere que los eventos mutacionales recurrentes pueden efectuarse ocasionalmente en haplotipos sin riesgo de desarrollar la enfermedad, dando como resultado la formación de linaje X frágil de novo (Macpherson et al, 1994). ESTRUCTURA DE LA POBLACION MEXICANA INCLUIDA EN ESTE ESTUDIO Población mestiza La población mestiza mexicana representa la población más grande de habla hispana en México y se encuentra constituida por una mezcla de Europeos y Africanos con nativos de América (Serrano 1995). Actualmente la proporción de la población indígena mexicana respecto a la población total es del 10%, lo anterior considerando el lenguaje como criterio de selección. Esta proporción muestra una tendencia a la disminución (Censo 2000, Fernandez y Serrano 1996). Poblaciones indígenas Tzeltales Los tzeltales o zendales son un grupo de origen maya, sin embargo la carencia en su zona de vestigios de grandes centros ceremoniales con excepción de Toniná cerca de Ocosingo, permite suponer que ocurrió un aislamiento que los marginó del desarrollo alcanzado por los mayas. Son el grupo indígena más numeroso de Chiapas y el octavo en relación con los demás grupos indígenas del país. De acuerdo al censo de población de 1970, había en esta fecha 99,412 habitantes tzeltales de los cuales el 43% eran bilingües y el 57% monolingües. Los tzeltales ocupan una extensa área del estado de Chiapas, aproximadamente dos terceras partes de los miembros de este grupo viven en la región conocida como los altos y la otra tercera parte en el norte de la entidad, la zona alta tiene una altura promedio cercana a los 2000 msnm (metros sobre el nivel del mar), los terrenos son poco propicios para la agricultura y la ganadería y muchas veces se encuentran en un franco proceso de erosión, los ríos que atraviesan la zona son pocos y de escaso caudal, los principales son el Amarillo y el Yaxamal, el clima es frío con frecuentes neblinas y abundantes lluvias en la mayor parte del año. La zona norte es de terrenos más bajos y planos tiene un clima que va de lo templado a lo caluroso, es también abundante en lluvias y cuenta con ríos de cierta importancia, los terrenos son fértiles en buena parte y la vegetación exuberante en algunos lugares con bosques de maderas tropicales, la fauna es abundante en especies. Náhuas Los nahuas, también llamados mexicas, son el grupo indígena más numeroso de México. Se registraron alrededor de 700,000 individuos en 1930 y aumentó su número a 800, 000 de acuerdo al Censo de 1970. Aproximadamente 250,000 de ellos no hablan español, su habitat es muy variable, ya que están distribuidos por el cinturón central de México. En 1325 fundaron lo que ahora es la ciudad de México y crearon un amplio imperio, que se extendía al norte cerca de la frontera actual con los Estados Unidos y al sur llegaba a Centroamérica. El clima y las condiciones de vida son variables y se dedican principalmente a la agricultura (Lisker 1981). Purépechas Este grupo indígena, es originario de las regiones lacustre y montañosa del centro de Michoacán, se llama así “p’urhepecha” y cada uno de sus integrantes es un “p’urhé” o “p’ure” que significa gente o persona. Desde la conquista y hasta hace unos cuantos años, este pueblo era conocido como tarasco, nombre que le fue impuesto por los conquistadores. El área de localización se extiende a lo largo de 6 000 Km2 de los 60 000 que tiene el estado de Michoacán, en la región norcentral de la entidad, se ubica entre los 1 600 y 2 6000 msnm. Esta población se concentra sobre todo en 22 municipios, sin embargo se distribuyan en 95 de los 113 municipios del estado. Las localidades indígenas se caracterizan por tener un asentamiento de tipo compacto; hay municipios y poblados que tienen anexos, es decir, localidades periféricas con unas cuantas viviendas, por lo que en tal caso se pueda hablar de asentamientos mixtos. La población mestiza vive sobre todo en los centros urbanos que rodean el área. Actualmente la mayoría de las localidades Purépechas están unidas por carreteras, caminos y brechas, con excepción del municipio de Charapan, cuyo acceso es deficiente. La población Purépecha actual deriva de una mezcla de grupos chichimecas, nahuas y pretarascos que habitaron las riberas e islas del lago de Pátzcuaro a finales del siglo XII. En cuanto a su cultura material, este grupo destacó por el empleo de instrumentos agrícolas de cobre, hecho excepcional en el área mesoamericana. El idioma p’urhé no tiene parentesco lingüístico cercano con ninguna de las lenguas originales que se hablan en México. Se reconocen tres variantes dialécticas: la de la región lacustre, central y serrana. De acuerdo a la registro de los censos se puede apreciar una sensible disminución de los hablantes de la lengua p’urhé, sin embargo a partir de 1980 se inició un movimiento de apoyo a través de la lengua purhé y el Trabajo del Centro de Investigaciones de la Cultura p’urhépecha, para el fortalecimiento de esta lengua. Antecedentes directos La información relacionada con el locus FMR1 en individuos sanos y afectados es un tema estudiado en muchas poblaciones del mundo. En lo que respecta a población mexicana, los estudios realizados son pocos y principalmente se han obtenido de población mestiza de Jalisco y se ha centrado solamente al polimorfismo de repetidos de tripletes de CGG. En nuestro grupo de trabajo, así como en nuestro país y en otros grupos en el mundo, se han realizado algunos trabajos previos relacionados con este tema de estudio, los cuales se describen a continuación. Díaz-Gallardo y cols. (1995). En el primer reporte relacionado con el locus FMR1 en población mexicana, incluyeron en su estudio a individuos de población mestiza del estado de Jalisco, entre los cuales se encontraban 18 individuos afectados con el síndrome X frágil, pertenecientes a 10 familias mexicanas con 40 miembros de primer y segundo grado y como grupo control 76 individuos sin antecedentes de retraso mental. Mediante las técnicas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y Southern blot determinaron el número de repetidos CGG y el status de metilación del gen FMR1 en alelos normales, con premutación y con mutación completa. El rango de alelos de repetidos CGG fue de 26-43 con un valor modal de (34+4) y aunque encontraron algunas variaciones, cuando compararon sus resultados con diferentes poblaciones,éstos no mostraron diferencias estadísticamente significativas. De acuerdo con los resultados obtenidos, el gen FMR1 puede contener hasta 43 repetidos de CGG sin riesgo de que los individuos de la siguiente generación presenten expansión de repetidos o metilación anormal de las islas de CpG. Por otra parte, los individuos que poseen un fragmento de 54-200 repetidos de CGG tienen un riesgo considerable de que sus descendientes hereden la mutación completa (>200 repetidos) como es el caso de las mujeres portadoras, o bien que se presente la mutación en una generación posterior para el caso de hijas de hombres transmisores, lo cual pudiera asociarse con un modelo anormal de metilación de las islas CpG y de los repetidos de CGG cuya consecuencia sería la inactivación del gen FMR1. De acuerdo a los resultados de los estudios citogenéticos en familias, la mitad de los varones afectados y ninguna de las mujeres portadoras o afectadas presentaron el sitio frágil. Este alto porcentaje de individuos no diagnosticados por la prueba enfatizó la necesidad de contar con un método alternativo para el análisis molecular en pacientes con X frágil e individuos sanos, cuyo objetivo fue determinar la presencia o ausencia de alelos de premutación y por lo tanto el riesgo de tener individuos afectados, con la finalidad de proveer un consejo genético más adecuado en las familias en estudio. Los modelos de bandeo obtenidos mediante Southern blot en muchos de los individuos incluidos en su estudio mostraron mosaicismo, como el caso de dos individuos que presentaron dos grupos celulares con diferentes fragmentos y que en ambos casos se descartó que tuvieran un cromosoma X extra, aunado a esto encontraron en un tercer individuo múltiples líneas celulares con distintos números de repetidos de CGG. Estas observaciones apoyaron la existencia del fenómeno de inestabilidad genética en estado post-cigótico característico del padecimiento. Por otra parte sus resultados en gemelos monocigóticos discordantes están de acuerdo con las observaciones y la propuesta de la participación de la metilación en la patología del síndrome. En ambos gemelos se observaron bandas con más de 200 repetidos de CGG característicos de la mutación completa, lo cual les permitió asumir que se generó la hipermetilación de este fragmento y la inactivación del gen FMR1, sin embargo el resultado es que solamente uno de los gemelos manifestó el retraso mental. El fenotipo clínico del síndrome X frágil en individuos heterocigotos, depende del número de repetidos de CGG y del nivel de metilación del gen FMR1. Por lo tanto es común observar que mujeres con más de 200 repetidos de CGG no presenten retraso mental, lo cual se explica porque el cromosoma X con el alelo normal es el preferencialmente activo. González-del Angel y cols (2000). En este trabajo se determinó el número de repetidos de tripletes de CGG y GCC, dentro de los genes FMR1 y FFMR2 en una muestra de niños mexicanos con retraso mental de causas desconocidas (MRUC) que llegaron a la consulta al Departamento de Genética del Instituto Nacional de Pediatría de la Ciudad de México. El propósito del estudio fue determinar si los locus FRAXA o FRAXE eran los responsables de la etiología del retraso mental en los pacientes incluidos, de ahí la importancia de que se hiciera el análisis molecular en ambos genes. El criterio de inclusión de los individuos para su estudio consistió en considerar el retraso mental de causas desconocidas (idiopático), en este sentido realizaron exámenes físicos y pruebas de laboratorio como cariotipos, pruebas de bandas G, tamiz metabólico y estudio cerebral, lo cual les permitió descartar a todos aquellos pacientes que cursaran con Síndromes clínicos, aberraciones cromosómicas, desórdenes metabólicos y anormalidades cerebrales. De acuerdo a lo anterior, seleccionaron 62 individuos mexicanos no relacionados con retraso mental de etiología desconocida. Dentro de los casos índice se encontraron 53 varones y 9 mujeres en un rango de edad de los 13 meses a 17 años. El estudio citogenético se realizó en 6 pacientes, uno de los cuales se utilizó como control positivo para FRAXA (sitio frágil en la banda Xq27.3 del cromosoma X), cuatro de estos pacientes eran caso índice y uno era hermanos de un caso índice. El análisis molecular se realizó mediante reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) utilizando 7-deaza-2’dGTP:dGTP, los productos de amplificación se sometieron a electroforésis en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio, dicha técnica permitió la amplificación de alelos normales, pero no en alelos con mutación completa. De acuerdo a los resultado obtenidos, aquellos pacientes varones que mostraron amplificación por PCR y una banda da 5.2-kb EcoR1 por Southern blot se consideraron negativos a la expansión de repetidos de CGG, mientras que aquellos pacientes que no mostraron producto de amplificación y presentaron una banda de 5.7-8.0-kb por Southern blot se consideró que presentaban la mutación completa. Las mujeres portadoras se distinguieron por una banda de 5.2-kb derivada del cromosoma normal y una banda de 5.2-5.7-kb derivada de la presencia del cromosoma X premutado. En función del análisis de árboles genealógicos en las familias incluidas, únicamente 20 pacientes presentaron antecedentes de retraso mental, de los cuales solamente dos presentaron un patrón de herencia ligada al cromosoma X. En cuanto a los signos y síntomas de la enfermedad, ninguno de los pacientes cursó con macrocefalia y de aquellos pacientes masculinos ninguno presentó macroorquidismo, algunos manifestaron grado se hiperactividad, problemas de atención, comportamiento obsesivo y/o dificultades en el lenguaje. En lo que respecta al diagnóstico de la enfermedad por PCR mediante la determinación del número de repetidos presentes en el gen FMR1 (FRAXA), el producto de amplificación se encontró presente en 51/53 pacientes varones. Después de este análisis se realizó la prueba confirmativa mediante Southern-blot en todas las muestras de varones que presentaron productos de amplificación, así como en las muestras de las 9 mujeres incluidas en el estudio, los resultados mostraron la presencia de una banda de 5.2-kb, lo cual indicó la presencia del alelo normal. En los dos casos índice en los que no se obtuvo el producto de amplificación por PCR incluyendo el control positivo para FRAXA, se sugiere la presencia de la expansión de repetidos de CGG, el diagnóstico fue confirmado en todos los casos por Southern- blot, con bandas de 6.8-kb en el paciente A, 7.6-kb en el paciente B y 8.0-kb en el control positivo. Pérez-Herrera (1999). En este estudio se determinó el polimorfismo de los repetidos del gen FMR1 en individuos no afectados pertenecientes a la población mestiza mexicana a partir de muestras de individuos originarios de la Ciudad de México y se implementó el diagnóstico molecular en pacientes con historia clínica compatible con el síndrome X frágil. En el estudio se incluyeron 30 mujeres y 25 hombres, analizando un total de 85 cromosomas X. En cuanto a la metodología para la determinación del número de repetidos de CGG, inicialmente se utilizó la técnica de PCR radiactiva, empleando un análogo de GTP (7-deaza-2’GTP) que impide la formación de estructuras secundarias, sin embargo los inconvenientes de esta metodología es que requería la utilización de radioisótopos para la detección del amplificado, ya que el análogo de GTP no permite la tinción de la molécula de DNAcon bromuro de etidio, además el número de repetidos de CGG amplificados es limitado al rango de alelo normal. Debido a lo anterior, posteriormente utilizó la técnica de PCR no radiactiva con la enzima hipertermoestable Pfu DNA polimerasa, que permitía utilizar temperaturas de desnaturalización mucho más altas lo cual impide la formación de estructuras secundarias, es posible obtener amplificados con un poco menos de 100 repetidos y al evidenciar la presencia del producto de amplificación con bromuro de etidio se reducen los costos. En la población analizada se encontraron 12 alelos diferentes con un número de repetidos que varía de 16 a 33 copias, en donde los alelos más frecuentes fueron los de 28 repetidos (28.75%), seguido del de 27 repetidos (20%) y 33 repetidos (10%), los demás alelos tuvieron una representación menor del 7%. Al comprar sus resultados con los reportados en otras poblaciones, encontró que el número de repetidos y las frecuencias de los alelos fue similar a los de poblaciones Caucásicas, Asiáticas, Australianos y Japoneses, en donde el rango varía de 6-54 repetidos de CGG. El polimorfismo del número de repetidos de CGG encontrado en la población mexicana incluida en su estudio está dentro de los rangos encontrados en individuos sanos de otras poblaciones y el alelo más frecuente fue el de 28 repetidos, similar a lo encontrado en población Japonesa. El diagnóstico del síndrome X frágil se realizó mediante la técnica de RT-PCR (Reverso Transcriptasa-PCR) evaluando la presencia o ausencia del transcrito del gen FMR1 a partir del RNA total de pacientes con retraso mental. En dicho estudio se analizaron 18 pacientes de sexo masculino que se clasificaron en 3 grupos de acuerdo a los antecedentes clínicos. El resultado del análisis mostró que únicamente uno de los individuos fue positivo al diagnóstico, mientras que los 17 restantes presentaron el transcrito del gen FMR1. En cuanto a este grupo de pacientes se refiere, manifestaron características clínicas que sugerían el fenotipo del síndrome X frágil y algunos presentaban antecedentes familiares de retraso mental, de acuerdo a lo anterior se consideró la posibilidad de que presentaran la enfermedad por otro tipo de mutaciones que se han descrito en el gen FMR1 como mutaciones puntuales, pequeñas deleciones o bien que la causa del fenotipo se debiera a la presencia de mutaciones en otros genes que también se manifiestan con retraso mental, probablemente en el sitio frágil FRAXE, el cual se ha asociado con alteraciones fenotípicas y coeficiente intelectual subnormal similar a X frágil. Aunque la muestra poblacional de su estudio es baja la incidencia del síndrome X frágil en la población estudiada fue del 5% (1/18 pacientes). Estos resultados sugirieron que quizá la incidencia del síndrome X frágil en la población mexicana incluida es su estudio sea baja, o que al igual que en otras poblaciones exista un subdiagnóstico de la enfermedad como consecuencia del bajo porcentaje de individuos que acuden a la clínica para ser diagnosticados. Ocampo-Sanchéz (2002). En este estudio se analizó la estructura molecular de los repetidos de CGG del gen FMR1 en una muestra de población mexicana, que incluía 62 individuos varones y 34 mujeres, los cuales fueron individuos sanos no emparentados entre sí y con padres y abuelos nacidos en México. En su estudio se encontraron 28 alelos diferentes con un rango desde 6 hasta 54 repetidos, los alelos más frecuentes fueron los de 29 (10%), 30 (10%) y 35 (7%). Los datos obtenidos se encuentran dentro de los rangos de los alelos más frecuentes a nivel mundial y es de resaltar que también son los más frecuentes en poblaciones Caucásicas, Asiáticas, Negros e Hispanos. La presencia del alelo de 35 repetidos en la población estudiada sugirió que existe una cierta similitud con la población Japonesa. Rosales-Reynoso y cols. (2005). En este trabajo, se determinaron las frecuencias alélicas de los repetidos de CGG y status de metilación de las islas CpG y del gen FMR1 en una muestra de la población mexicana que incluía individuos mestizos del estado de Jalisco. Esta muestra estaba conformada por 129 individuos no relacionados entre si, e incluyó 83 individuos sanos (38 varones y 45 mujeres) y 46 pacientes varones con retraso mental. La comparación de los resultados de la longitud de los alelos de repetidos de CGG en los 46 varones con retraso mental y en los 83 individuos sanos se analizó de manera independiente. En lo que respecta a los individuos afectados, 43 de ellos presentaron alelos entre el rango de 20-34. En la muestra de los 83 individuos sanos encontraron alelos con un rango de 16-40 repetidos de CGG, la comparación estadística entre los dos grupos no presento diferencia significativa, como consecuencia de esto ambos grupos se consideraron como uno solo. De acuerdo a esto, se encontraron 23 alelos diferentes en un total de 174 cromosomas analizados con un rango de alelos de 16-76 repetidos de CGG, siendo los alelos más frecuentes los de 32 (27.58), 30 (25.28) y 34 (10.34) repetidos de CGG. Los individuos que portaron alelos con premutación presentaron retraso mental moderado pero no mostraron otras características del síndrome X frágil y el status de metilación de las islas CpG en el gen FMR1 fue negativo en todos ellos. La metodología que utilizaron les permitió realizar la amplificación del fragmento de repetidos de CGG mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para alelos normales y de premutación, pero no así para alelos con mutación completa. Para determinar el status de metilación del gen, realizaron una segunda reacción de PCR que consistío en realizar una modificación al DNA con un tratamiento con bisulfito de sodio previo a la reacción de PCR, debido a que permite la conversión de residuos de citosina desmetilados a uracilo evitando la formación de estructuras secundarias de fragmentos de alto contenido de CG. Estos autores encontraron que la distribución del número de repetidos presentes en el gen FMR1, difiere significativamente de los reportados por otras poblaciones como la Caucásica, China, Africana, Indonesa, Brasileña, Chilena e indígena Mixteca. Para todas las poblaciones reportadas el número modal de los repetidos de CGG es 29 o 30, mientras que los alelos más frecuentes en la población mexicana incluida en su estudio fueron los de 32, 30 y 34 repetidos de CGG. Esta distribución trimodal es también diferente de los modelos reportados para otras poblaciones. El alelo de 32 repetidos de CGG que fue el más frecuente en su población, se encontró presente en solamente el 4.9% de la población Caucásica y en las poblaciones Chilena e Indonesa en solo en 1.6%, mientras que otras poblaciones no estuvo presente. Por otra parte la población mexicana incluida en su estudio, presentó un baja frecuencia de alelos con menos de 29 repetidos de CGG, mientras que predominan alelos >34 repetidos con una frecuencia de 10.5%, tales modelos son similares a los encontrados en poblaciones Indonesa, Africana y China pero diferente a la población Caucásica. De acuerdo a las marcadas diferencias observadas entre mestizos mexicanos y otras poblaciones del mundo e incluso la población indígena Mixteca respecto a la distribución de las frecuencias alélicas del gen FMR1, este grupo sugiere que probablemente tiene muchas explicaciones, sin embargo el singular mestizaje étnico sea una causa fundamental. En conclusión, en su estudio encontraron que el modelo de la distribución alélica del gen FMR1 de la población mexicana es diferente de las otras poblacionesanalizadas y de igual manera la distribución de los alelos de 32,30 y 34 repetidos de CGG. Kunst y Cols. (1996). En este reporte se realizó un estudio para determinar la estabilidad de alelos normales del gen FMR1 en 345 cromosomas pertenecientes a 9 poblaciones del mundo de origen Asiático, Africano y Americano. En dicho estudio, se determinaron la longitud de los repetidos de CGG, la posición de las interrupciones de AGG mediante la secuenciación de los repetidos y los haplotipos asociados al gen utilizando los marcadores genéticos FRAXAC1, FMRa y FMRb. Dentro de las poblaciones de América incluyeron: 28 individuos de población Mataco del norte de Argentina, 34 de población Navajo del suroeste de Estados Unidos y 38 individuos pertenecientes a la población Mixteca. Los resultados de los haplotipos de las poblacionales incluidas en su estudio, se compararon con los previamente reportados en 110 cromosomas de individuos Caucásicos descritos por Kunst y Warren 1994. En cuanto a la distribución de las frecuencias alélicas del marcador FRAXAC1, éstas fueron diferentes a la población Caucásica en todas las poblaciones analizadas. En lo que respecta a las poblaciones de América, todos los individuos presentaron los alelos C (3) y D (4), lo cual refleja el origen común de estas poblaciones. El alelo D fue el más frecuente en poblaciones de origen Asiático, en contraste con el alelo C que fue el más frecuente en Caucásicos. El alelo A (1) del marcador FRAXAC1, asociado con cromosomas X frágil de población Caucásica, no se encontró en poblaciones de origen Asiático y Americano. En cuanto a los marcadores FMRa y FMRb solamente el alelo A (T y G) para ambos marcadores se encontró en individuos no Caucásicos. En las poblaciones americanas estudiadas no existen los alelos que predisponen a la expansión de los repetidos de CGG (alelos con >24 repetidos de CGG sin interrupciones), todos los alelos estudiados contenían tres interrupciones de AGG, posiblemente debido a que los alelos de predisposición se perdieron durante la migración de los pobladores a América, mientras que los alelos encontrados han permanecido estables por un periodo de tiempo superior a los 7,000 años. En Caucásicos el haplotipo 3 (ABB=1-A) se encontró en el 56% de los cromosomas de individuos con alelos >24 de repetidos de CGG sin interrupciones y en el 25% de cromosomas con X frágil. Estos datos les permitieron sugerir que quizá en el futuro, una mayor proporción de cromosomas X frágil puedan originarse del haplotipo 3. La ausencia de haplotipos 3 en poblaciones de origen no Caucásico, apoya la reciente evolución de éste haplotipo y sugiere que el desequilibrio entre cromosomas normales y con X frágil con este haplotipo es único de población Caucásica. De acuerdo a sus resultados, encontraron que la posición de las interrupciones de AGG dentro de los repetidos de CGG es altamente polimórfica, que la variación de dichas interrupciones correlaciona con la edad y/o historia genética de la población. Además de lo anterior, sus datos confirman que las interrupciones estabilizan la región de los repetidos de CGG en el síndrome X frágil. Por lo anterior sus datos indican que la pérdida de interrupciones apoyan la sugerencia inicial de que éste tipo de alelos predisponen a la expansión de tripletes en el gen FMR1 por éste mecanismo. JUSTIFICACIÓN En base a lo expuesto anteriormente, aún cuando existen varios estudios sobre los polimorfismos del gen FMR1 en individuos sanos y afectados de poblaciones mexicanas, la información es escasa, ya que ésta principalmente se ha obtenido de población mestiza de Jalisco y se ha centrado únicamente en el polimorfismo de repetidos de tripletes de CGG (Díaz-Gallardo et al, 1995; Rosales-Reynoso et al, 2005). El único trabajo mencionado anteriormente, en el cual se incluyó una muestra de población indígena Mixteca, se utilizaron los marcadores genéticos FRAXAC1, FMRa y FMRb para definir haplotipos (Kunst et al, 1996). No obstante la información que se obtuvo no es suficiente, debido a que la muestra analizada representa una baja proporción de la población mexicana en general, no se incluyeron individuos mestizos y además de lo anterior, el hecho de que actualmente las investigaciones sobre el origen del síndrome X frágil en la gran mayoría de las poblaciones utilizan los polimorfismos de los microsatélites DXS548 y FRAXAC1. Aun cuando es conocido que en el síndrome del cromosoma X frágil no se han reportado mutaciones de novo y estudios previos demostraron que surgió a partir de un grupo de cromosomas fundadores, que por causas que se desconocen favorecen a la expansión de repetidos de CGG. Se han asociado algunas características moleculares a la expansión como el número de repetidos, la posición y el número de las interrupciones de AGG, la longitud del fragmento de repetidos después de la última interrupción y el componente genético de la población en particular. En lo que a éste último se refiere, es el factor asociado con la expansión más ampliamente estudiado actualmente y del cual existen datos que proveen las bases moleculares que sugieren la influencia de haplotipos específicos. En dichos estudios se han encontrado haplotipos en desequilibrio de ligamiento con individuos sanos o afectados, asociación con el efecto fundador o protector de la enfermedad, susceptibilidad en haplotipos de riesgo y finalmente la relación genética o la contribución genética entre poblaciones. La ausencia de los alelos que predisponen a la expansión de los repetidos en las poblaciones americanas analizadas previamente, se puede explicar por el pequeño tamaño de la muestra o por la reducida variabilidad genética. La aportación de nuestros resultados con mayor número de poblaciones es importante, porque permite analizar la relación genética o bien la contribución genética entre poblaciones, las diferencias en la diversidad genética entre poblaciones indígenas y mestiza, o con otras poblaciones de distintas áreas geográficas No obstante, en ninguno de los estudios anteriormente descritos se ha evaluado el componente genético de la población mexicana definiendo los haplotipos mediante los marcadores genéticos DXS548, FRAXAC1, FMRa y FMRb. Considerando lo antes mencionado, el presente trabajo es el primero en su género en el cual utilizando individuos de poblaciones indígenas y mestiza mexicana de la Ciudad de México, en el que se han evaluado los polimorfismos asociados al gen FMR1 utilizando marcadores genéticos intragénicos (SNP’s) y extragénicos (microsatélites de CA). Dedido a lo anterior, el presente trabajo sienta las bases del componente genético de población mexicana, para que en estudios posteriores se evalúen haplotipos de protección, de susceptibilidad o riesgo al síndrome X frágil y haplotipos que pudieran estar asociados con el mecanismo involucrado en la estabilización de los repetidos CGG como un factor que contribuya a controlar la aparición del síndrome del cromosoma X frágil. OBJETIVO GENERAL Determinar los haplotipos asociados al gen FMR1 en diversas poblaciones indígenas y mestiza mexicana. OBJETIVOS PARTICULARES a) Determinar el número de repetidos CGG localizados en la región no traducible en el exón 1 del gen FMR1, mediante amplificación en cadena de la polimerasa, utilizando un oligonucleótido marcado con fluorescencia en el extremo 5’. b) Identificar los diferentes alelos de los marcadores DXS548, FRAXAC1, FMRa y FMRb, mediante amplificación en cadena de la polimerasa con oligonucleótidos
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