Estudio-fitoquimico-de-extractos-organicos-y-evaluacion-farmacologica-de-un-extracto-acuoso-de-la-flor-de-tila-Ternstroemia-sylvatica

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA
DE MEXICO
FACULTAD DE QUIMICA
ESTUDIO FITOQlliMICO DE EXTRACTOS
ORGANICOS y EVALUACION FARMACOLOGICA
DE UN EXTRACTO ACUOSO DE LA FLOR DE TILA
(Ternstroemia sylvatica).
T E s I s
QUE PARA OBTENER El TITULO DE:
QUIMICO FARMACEUTICO
P R E S E N
BIOLOGA
T A
SANDRA
MEXICO, O.F.
LUZ ALBA
2005
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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Jurado Asignado:
Profesores
Presidente Rogelio Gregario Pereda Miranda.
Vocal Héctor Ríos Olivares.
Secretario Mariano Martinez Vázquez.
1er supo Miguel Angel Martinez Suárez.
2do supo Isabel del Carmen Rivera Cruz.
Sitio donde se desarrollo el tema:
Sustentante: Sandra Luz Ruiz Alba
Instituto de Química. UNAM Ciudad Universitaria.
Instituto Nacional de Psiquiatría "Ra~mó" de IBA"te Muñiz"
Asesor: Dr. Mariano Martínez Vázquez
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Supervisor técnico: M. en C. Rosa Estrada Reyes --1-.....,.,.""...=-+----
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AGRADECIMIENTOS
DR. MARIANO MARTíNEZ VÁZQUEZ E INSTITUTO DE QUíMICA por la
asesoria incondicional para la realización de esta tesis.
M. EN C. ROSA ESTRADA REYES E INSTITUTO DE PSIQUIATRíA por el apoyo
para realizar este trabajo .
A la Universidad Nacional Autónoma de México y Facultad de Química.
INDICE GENERAL
1.INTRODUCCIÓN 1
2.ANTECEDENTES 4
2.1ANSIEDAD 4
2.2UBICACIÓN TAXONÓMiCA 6
2.3ANTECEDENTES ETNOFARMACOLÓGICOS O ETNOMÉDICOS 7
2.4ANTECEDENTES FARMACOLÓGiCOS 8
2.5ANTECEDENTES QUíMiCOS 9
3.0BJETIVOS 11
4 MATERIALES Y MÉTODOS 12
4.1MATERIALVEGETAL 12
4.20BTENCIÓN DE EXTRACTOS 12
4.3EVALUACIÓN DE LAS ACTIVIDADES FARMACOLÓGICAS DEL EXTRACTO ACUOSO
................................................................................................................................................ 13
4.4ESTUDIO QUiMICO DE Temstroemia sylvatica 17
5 RESULTADOS 25
5.1ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA ; 25
5.2 ESTUDIO FITOQUIMICO 31
6 DISCUSiÓN DE RESULTADOS 35
7 CONCLUSiONES 37
BIBLIOGRAFíA 38
APÉNDiCE 45
íNDICE DE TABLAS
Tabla1. Síntomas Psicológicos y cognitivos que acompañan a la ansiedad 5
Tabla2. Rendimiento de los extractos 13
Tabla3. Resultados de EAT en el modelo de al conducta exploratoria
..... . ... .. . ... ... ..... . .. . .. . .. . ... ... .. . .. . .. . ... .. . .. ... . .. . .. . .. ... . ... ... ..... .... ........ ............. ...26
Tabla4. Efecto del EAT sobre la actividad locomotriz
............................................. . ... .. . ... .. ... . ... ... ... ... ..... . .. . .. . .. . .. . .. . .. . ... ... .. ..27
Tabla5. Potenciación por EAT del efecto hipnótico inducido por pentobarbital
sódico 29
Tabla 6. Determinación de la actividad antioxidante del EAT mediante el radical
DDPH 34
íNDICE DE FIGURAS
Figura1. Modelo de al conducta exploratoria en un ambiente adverso 26
Figura 2. Efecto del EAT sobre la actividad locomotriz 27
Figura 3. Prueba de Hipnosis del EAT.. 30
Figura 4. Actividad antioxidante del EAT 34
Figura 5. Estructura del acetato del ácido ursólico 46
Figura 6. Estructura del ácido ursólico .47
Figura 7. Estructura del Bvsitosterol. 48
Figura8. Estructura del estigmasterol. .49
ABREVIATURAS
AcOEt acetato de etilo
CH2CI2 dicloro metano
"C grados centígrados
CDCb cloroformo deuterado
DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer)
DMSO dimetilsulfoxido
d doblete
s singulete
dd doblete de doblete
Hz Hertz
IR infrarrojo
m multiplete
MeOH metanol
p.f punto de fusión
ppm partes por millón
RMN CH) resonancia magnética nuclear protónica ó de H
RMN C3C) resonancia magnética nuclear de 13C
RMN resonancia margnética nuclear
TMS tetrametil silano
UV ultravioleta
INTRODUCCiÓN
México es uno de los países del nuevo mundo con mayor diversidad de especies vegetales. Su
flora fanerogámica es de aproximadamente 220 familias, 2, 410 géneros y 30, 000 especies 49,
dentro de las cuales 3, 352 especies son mencionadas como medicinales . 47
Por otro lado, las plantas medicinales han sido parte importante de la historia y cultura de los
pueblos indígenas. Su uso y aplicaciones como remedios para diferentes padecimientos
constituyen un conocimiento que aún se transmite en forma oral de generación en generación
como parte de las tradiciones heredadas. 39 Es interesante mencionar que aún en nuestros
tiempos, la mayoría de la población mundial emplea recursos herbolarios para la solución de
sus problemas de salud.
El hecho de que la medicina tradicional haya perdurado hasta hoy, como una alternativa
importante de salud, en un núcleo muy amplio de la población mexicana, se debe a su bajo
costo y facilidad de acceso." La medicina tradicional mexicana , a veces mezclada con la
medicina herbolaria de otros países, bajo conceptos tipo nueva era ( "new age" ), juega un papel
importante en núcleos de población de ingresos altos.
El estudio científico de la bioactividad de las preparaciones empleadas tradicionalmente por
diversos grupos étnicos se denomina etnofarmacología, un término empleado desde fines de
los setenta."' 37.15.21,12,31,24
Además del enfoque etnofarmacológico, existen otros criterios de selección primaria de plantas
que también han conducido al aislamiento de innumerables compuestos con considerable
actividad terapéutica. Entre estos criterios se encuentran el quimiotaxonómico y el ecológico. El
primero se basa en la similitud del metabolismo secundario entre especies vegetales
filogenéticamente relacionadas y, el segundo, en la observación de los efectos que ocasionan
las interacciones, a veces complejas, entre dos organismos en su ecosistema natural. 9
Desde el punto de vista etnofarmacológico, se conoce que hoy en día numerosas plantas
medicinales se usan en el tratamiento de enfermedades modernas conocidas como
enfermedades de la civilización. Como ejemplo de estas alteraciones nerviosas están la
ansiedad y la depresión . La ansiedad es el desorden mental más común y su frecuencia está en
aumento, sobre todo en las grandes ciudades donde la tensión y el estrés son mayores. Para el
tratamiento de la demencia , insomnio, ansiedad y depres ión se comercializan con gran éxito los
extractos de Ginkgo bi/oba, Piper methysticum, Passiflora incamata, Hypericum perforatum y
Melissa officinalis59
En 1992, Tortoriello y Romero presentaron los resultados de una encuesta (2, 242
participantes), realizada entre 1983 y 1985 por el IMSS-COPLANAR acerca de las plantas
usadas en la medicina tradicional mexicana para el tratamiento de los problemas relacionados
con el sistema nervioso central. En este estudio las especies vegetales se clasificaron en tres
grupos, de acuerdo con su uso:
• Anticonvulsivas . Plantas utilizadas en el tratamiento de epilepsia y convulsiones.
• Sedantes. Especies con propiedades soporíferas.
• Hipnóticas. Plantas útiles en el tratamiento del insomnio.
En total se contabilizaron 81 especies utilizadas de manera tradicional como remedios en el
tratamiento de enfermedades mentales. Las plantas con supuestas propiedades sedantes
tuvieron el mayor número de menciones (63.7%), le siguieron las anticonvulsivas (51.8%) y, por
último, las hipnóticas (27.1%). Las especies con mayor número de menciones con posibles
efectos sedantes son Temstroemia spp., Citrus aurantium,Pasiflora ssp., Valeriana, ssp.,
Casimiroa edulis y Agatache mexicana, entre otras.
El género Temstroemia (Theaceae) está representado por 20 especies distribuidas en América,
de esta solamente dos crecen en el antiplano de México, de las cuales destaca por sus
supuestos atributos medicinales la especie Temstroemia sylvatica Schil and Chan, conocida
comúnmente como tila. A pesar de la gran importancia que tiene la tila como planta medicinal,
sólo existe un informe acerca de la actividad farmacológica de un extracto acuoso de la
especie. 44
2
Este trabajo tiene los objet ivos de evaluar las propiedades antioxidantes, ansiolíticas y sedantes
de un extracto acuoso así como aportar datos de la composición química de T. sylvatica .
3
ANTECEDENTES
Ansiedad
Los trastornos de la ansiedad afectan a un 25% de la población en general y es más común en
gente anciana. 8 Este problema puede ser ocasionado por factores psicosociales, médicos o
psiquiátricos.
Ayuso y Carulla J. 1992 definen la ansiedad como un estado emocional desagradable que esta
acompañado por la excitación fisiológica y los elementos cognitivos de aprensión, culpabilidad y
una sensación de desastre inminente.
Las hipótesis actuales indican que el origen así como el desarrollo de esta enfermedad se debe
a una sobre actividad de los sistemas adrenérgicos o a la desregulación de los sistemas
serotoninérgicos y gabaérgicos en el sistema nervioso central (SNC). 29,26,13
A veces la ansiedad puede ir acompañada por ataques de paruco, asi como con breves
episodios de miedo intenso. A este estado emocional desagradable se asocian a múltiples
sintomas psicológicos y cognitivos, como los que se indican en la Tabla 1.
4
Tabla 1. Síntomas psicológicos y cognitivos que acompañan a la ansiedad. 20
Dolor de espalda
Escalofrío
Vértigo
Despersonalización
Miedo a la muerte
Miedo de perder el controlo volverse desequilibrado
Nausea
Palpitaciones o taquicardia
Sequedad de la boca, asfixia
Sudoración
Parestesias
Temblor
5
UBICACiÓN TAXONÓMICA
Clasificación Ternstroemia sylvatica Schl et Cham
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopside (Die)
Orden Theales
Familia Theaceae
Género Temstroemia
Especie Temstroemia sylvetice
Nombres comunes
Flor de tila, té de tila (México , D. F)
Hierba del cura o trompillo (Veracruz)
Ixquefé (Hidalgo)
Limoncillo de Meztitlán (Hidalgo)
Ministro (norte de Zaragoza , xilitla, S. L. P)
Palo agrio (Hidalgo)
Tepazote
Tilia grande (Estado de México)
Sirimio (purhépecha) (Michoacán)
Descripción de la especie
Temsfroemia sy/vafiea Schl. & Cham. Arbusto o árbol de 1.5 a 5 m de alto; pecíolo de 3 a 10
mm de largo, lámina elíptica , más ancha en la parte media, de cuatro a 8 de largo por 1 a 2 (3)
cm de ancho, ápice acuminado, en ocasiones apiculado, borde entero o casi entero, algo
resoluto, base angostándose hacia el pecíolo, nervio medio bien manifiesto y unos 8 pares de
6
nervios laterales menos evidentes, subcoriácea, haz de un verde más oscuro que el envés;
pedúnculos, por lo general, de menos de 1 cm de largo, bractéolas de la base del cáliz
deltoideo-ovadas, de unos 2 mm de largo, con el borde glandular-denticulado; cáliz unido en la
base, lóbulos subyúgales, imbricados, redondeados, los externos de unos 5 mm de largo por
4.5 mm de ancho, con el borde esparcidamente glandular-denticulado, aunque con frecuencia
este carácter es poco evidente, los internos de unos 6mm de largo por 4 mm de ancho, enteros,
pétalos blancos, suborbiculares, de 6 a 6.5 mm de largo, por un poco menos de ancho, unidos
muy en la base; estambres alrededor de 60; ovario ovoide cónico , bilocular , con 5 óvulos
colgantes en cada lóbulo, de los que algunos son estériles; fruto cónico u ovoide de 1.5 cm de
largo, excluyendo el estilo persistente, por 0.8 a 1cm de ancho; semillas de 1cm de largo por
0.6 cm de ancho, rodeadas por un arilo consistente de pelos carnosos .
Distribución en México
Especie nativa de nuestro país ubicada principalmente en los estados de Hidalgo, Veracruz y
Estado de México.
ANTECEDENTES ETNOFARMACOLÓGICOS O ETNOMÉDICOS
Alfonso Herrera en 1921 menciona el uso de esta especie como antiespasmód ico y con mucha
frecuencia como excipiente . Posteriormente en 1952, la Sociedad Farmacéutica de México la
caracteriza como antiespasmódico. Por otro lado, en 1958 Luis Cabrera informó de los varios
usos que en la medicina tradicional se le daba a esta especie. Así se mencionaba su uso como:
antiespasmódico, eupépt ico, para el alivio de cólicos hepáticos , congestión hepática,
enterocolitis, gastroenteritis hemorroides y como sedante. Maximino Martínez en 1969 la define
como antiespasmódico y antitusigeno. En la actualidad, se recomienda para el tratamiento del
corazón y de los nervios. 5
7
ANTECEDENTES FARMACOLÓGICOS
En 1999 Malina y cols, evalúan el posible efecto ansialítico de la flor de T. sylvatica mediante el
modelo de laberinto en cruz elevado y la prueba de nado forzado . La actividad locomotriz fue
evaluada mediante el modelo de campo abierto. Los resultados de este estudio demostraron
que T. sylvatica no posee actividad ansiolítica.
8
ANTECEDENTES QUíMICOS
Metabolitos secundarios presentes en la familia Theaceae
De Camelia sinensis y C. japonica, dos especies representativas de la familia Theaceae se han
logrado aislar glicós idos f1avonoides como los came liósidos A, By C 50, 51, Y triterpenos del tipo
oleanano como las came liageninas A, B Y C. 32
"'" OH
Cameliósido A Cameliósido B
He
OH
1"""
#
OGlc-Gat
Cameliósido C
R
Cameliagenina A R=H
Cameliagenina B R=OH
Cameliagenina C R=CHO
9
Metabolitos secundarios presentes en el género Ternstroemia
Los estudios realizados de varias especies del género Temstroemia (T. japónica, T.
gymnanthera, T. cherryi, T. merrilliana) indican la presencia recurrente de triterpenos del tipo
ursano, oleanano y lupeol, principalmente. 59, 14. 34
ácido ursólico ácido oleanólico
) .
dihidropriverogenina A ácido betulínico
COOH
10
OBJETIVOS
Objetivo general
• Evaluar las propiedades antioxidantes , ansiolíticas y sedantes de un extracto acuoso de
Temstroemia sylvatica así como realizar un estudio fitoquímico de los extractos orgánicos de
la flor de esta planta medicinal.
Objetivos particulares
• Obtener los extractos acuoso, hexánico, de acetato de etilo y metanol de las flores de
Temstroemia sylvatica.
• Evaluar las propiedades antioxidantes del extracto acuoso de T. sylvatica (EAT) mediante el
modelo del radical 1, 1-difenil-2-picrilhidracilo (DDPH).
• Evaluar las propiedades ansiolíticas de EAT en el modelo de conducta exploratoria en un
ambiente adverso.
• Evaluar las propiedades sedantes de EAT mediante el modelo de hipnosis inducido por
pentobarbital sódico.
• Aislar, mediante técnicas cromatográficas, los metabolitas secundarios presentes en los
extractos de hexano (EHT), de acetato de etilo (EACT) y metanol (EMT) de Temstroemia
sylvatica.
• Identificar los metabolitas secundarios aislados, mediante técnicas espectroscópicas
convencionales (IR, RMN 1HY 13C), así como por espectrometría de masas.
11
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIAL VEGETAL
Las flores y frutos de T. sylvatica se adquirieron en el mercado de Sonora de la Ciudad de
México y fueron identificadas por la Dra. 1. Luna (Facultad de Ciencias, UNAM). Una muestra
del espécimen vegetal se deposito en el Herbario de la Facultad de Ciencias (FC 123). Para la
obtención de los diferentes extractos, el material vegetal se molió, previo secado a temperatura
ambiente.
OBTENCiÓN DE EXTRACTOS
Extracto Acuoso
El extracto acuoso se preparó con 10 g de material vegetal al cual se le adicionó 90 mi de agua
hirviendo, se continuó la ebullición por 10 minutos. Posteriormente, la infusión fría, se filtro ,
eliminándose el residuo vegetal y el filtrado se liofilizó, obteniéndose 2.5 g de extracto acuoso
liofilizado.
Extractos orgánicos
El material vegetal (311 g) se sometió durante 48 horas aextracciones sucesivas y por
separado con hexano, acetato de etilo y metanol (3 x 4L). La eliminación de los disolventes a
presión reducida produjo los extractos correspondientes. El cálculo del rendimiento porcentual
de los extractos fue referido al material vegetal inicial.
12
Rendimiento de extractos
Tabla 2. Rendimiento de los extractos de Temstroemia sylvatica
Material vegetal inicial
Extracto de hexano
Extracto de Acetato de Etilo
Extracto de Metanol
311
2.67
12.00
18.08
0.8585
3.8585
5.8135
Nota: Los rendimientos se obtuvieron en relación al peso seco del material vegetal inicial.
EVALUACiÓN DE LAS ACTIVIDADES FARMACOLÓGICAS DEL EXTRACTO ACUOSO
Animales y Condiciones de laboratorio
Para las evaluaciones farmacológicas se utilizaron ratones macho de la cepa Swiss Webster de
20 a 30 g de peso. Los cuales se mantuvieron bajo un ciclo invertido de luz/oscuridad 12:12 h Y
todos los experimentos se realizaron entre 10:00 y 14:00 horas.
Durante el desarrollo de los experimentos los animales tuvieron libre acceso a alimento yagua.
Se utilizaron lotes de 10 animales para cada dosis.
Todos los procedimientos experimentales fueron realizados de acuerdo a la norma oficial
mexicana referente al cuidado y manejo de animales (NOM-062-200-1999).
13
Modelo de conducta exploratoria en un ambiente aversivo
Este modelo se utiliza para determinar la ansiedad en los animales de acuerdo al paradigma
propuesto por Crawley y Goodwin en 1980 16, 22, 40 Y se basa en las tendencias naturales que
tienen los roedores de evitar áreas iluminadas y de explorar zonas desconocidas. Esta prueba
utiliza ratones o hámster como sujetos experimentales. La cámara de prueba consiste en una
caja de acrílico con las medidas siguientes 44 x 21 x 21 cm. Un tercio de la caja se encuentra
completamente oscuro, mientras que los otros dos tercios se encuentran iluminados con una
lámpara de luz fluorescente. Entre las dos zonas hay una división de madera con una abertura ,
por la cual el sujeto experimental puede pasar libremente. Al inicio de la prueba se coloca al
sujeto experimental en la zona iluminada y se registra el número de transiciones que realiza de
un compartimiento a otro. Se ha reportado que los ansiolíticos clásicos como las
benzodiacepinas, aumentan en forma dosis dependiente el número de transiciones. 16
Este resultado sugiere que la actividad locomotriz de los ratones no tratados en una cámara de
dos compartimientos se suprime por la zona iluminada y es restaura con el empleo de agentes
ansiolíticos. 16, 22
El extracto acuoso liofilizado se suministro vía intraperitoneal a las dosis de 1.56, 3.12, 6.25,
12.5 Y 25 mg/kg a cinco grupos de animales, respectivamente. Este suministro se realizó 60
minutos antes de iniciar la prueba. Los controles positivos recibieron 1.0 mg/kg de diazepam vía
intraperitoneal 30 minutos antes de la prueba. El número de transiciones (paso de lado oscuro a
lado iluminado de la cámara) se registró en un periodo de 10 minutos. Un incremento en el
número de transiciones entre las dos áreas se considera como un efecto ansiolítico. 16.40
14
Modelo del campo abierto
Este modelo se utiliza para medir la actividad general de lo animales . Una disminución de la
actividad general de los sujetos de prueba comparada con los controles indicaría un efecto
inespecífico de la sustancia en estudio.
Los animales se trataron con el extracto liofilizado en las mismas concentraciones que las
utilizadas en el modelo de conducta exploratoria, 60 minutos antes de iniciar la prueba. Los
controles positivos recibieron 1.0 mg/kg de diazepam vía intraperitoneal 30 minutos antes de la
prueba. Posteriormente, los animales se colocaron en una esquina de la caja y el
comportamiento se registro con una videograbadora durante una sesión de 5 minutos. Se
registró el número de veces que el animal cruza algún cuadrante (cuentas/5 min).
Potenciación del efecto hipnótico inducido por pentobarbital sódico
Este modelo se utilizó para evaluar el posible efecto hipnótico-sedante del extracto acuoso de
T. sylvatica.
El suministro de pentobarbital sódico induce en los animales de prueba, la pérdida de reflejo de
enderezamiento. Tomando en cuenta este efecto, se ha estimado como tiempo de sueño, los
minutos que transcurren entre la pérdida y la recuperación del reflejo de enderezamiento del
animal. 6
Con la finalidad de evaluar los posibles efectos debido a las concentraciones del pentobarbital
de sodio, se realizaron dos experimentos. En el primer experimento, seis grupos de animales se
trataron con una dosis de 42 mglkg de pentobarbital sódico. Posteriormente, se administró el
extracto acuoso a las dosis de 1, 100, 200, 400, 800 Y 1000 mg/kg , respectivamente. El
segundo experimento, se llevó a cabo en las mismas condiciones experimentales, excepto que
30 mg/kg fue la dosis de pentobarbital sódico utilizada.
Cada experimento se realizó por duplicado con una latencia de 60 mino Registrándose el
incremento en el tiempo de sueño producido por el extracto acuoso liofilizado.
15
Análisis estadístico
La diferencia entre los grupos tratados y los grupo control en las pruebas de hipnosis, ansiedad
y actividad locomotriz se analizaron usando un análisis de varianza de una sola vía (Kruskal-
Wallis) 43 (p'S 0.05, p*sO.001), seguido por una prueba pareada de Mann Whitney.
16
ESTUDIO QUíMICO DE Temstroemia sylvatica
Métodos de separación
Para las separaciones cromatográficas se utilizaron columnas abiertas y empacadas con sílice
gel Kieselgel 60 GF250 como fase estacionaria. Se utilizaron 10 g de sílica gel por cada gramo
de muestra.
Para el análisis cromatográfico cualitativo en capa fina se utilizaron cromatofolios de gel de
sílice F250 Merk (20 x 20 cm x 0.25 mm). Para el análisis cromatográfico preparativo se
emplearon cromatoplacas de sílice Gel F254 (20 x 20 cm x2 mm) con indicador de fluorescencia .
La lámpara de UV Spectroline Mod . CX-20 (254 y 365 nm) y una solución de sulfato cérico (12
g de sulfato cérico, 22 mi H2S04, 350 g de hielo) se utilizaron como métodos de detección .
Instrumental
Los puntos de fusión se determinaron en un aparato Fisher- Johns y no están corregidos.
Los espectros de infrarrojo se obtuvieron en un espectrofotómetro Nicolet Magna 750FT-IRSX,
en disolución de CHCI3 o en pastilla de KBr .
Los espectros de resonancia magnética nuclear se determinaron a 200 y 300 MHz para l H, y a
75 MHz para 13C, en espectrómetros analíticos Varian-Gemini 200 y Varian VXR-300, utilizando
disolventes deuterados (COCh. DMSO-ds). Los desplazamientos químicos están dados en ppm
y referidos al tetrametilsilano (TMS) .
17
Análisis cromatográfico de los extractos orgánicos de Ternstroemia sylvatica
Extracto hexánico
El extracto hexánico (2.67 g) se fraccionó mediante una cromatografía en columna abierta
empacada con gel de silice y eluida inicialmente con hexano , posteriormente con mezclas de
hexano-acetato de etilo de polaridad ascendente y finalizando con acetato de etilo . Se reunieron
un total de 104 fracciones de 20 mi cada una. Las cuales se reunieron por su similitud en
cromatografia en capa fina. De las fracciones (1-52), eluidas con hexano 100%, se obtuvieron
50 mg de un materiallipofílico amarillento .
De las fracciones (90-104), eluidas con hexano-acetato de etilo [9:1], se obtuvieron 300 mg de
una mezcla de productos, la cual se purificó mediante cromatografía en capa preparat iva con
hexano-acetato de etilo (8:2). Obteniéndose 28.7 mg de estigmasterol (1) y 4.7 mg de acetato
del ácido ursólico (2).
Las identidades de 1 y 2 se establecieron por comparación de sus datos físicos y
espectroscópicos con aquéllos indicados en la literatura 1:46,30 . 2: 57,11
Extracto de acetato de etilo
Al tratar de disolver el extracto de acetato de etilo (EACT) con dicloro metano, se obtuvo un
precipitado y una solución de color verde, Esta solución se concentró a presión reducida ,
obteniéndose un residuo sólido (1.6 g),el cual fue cromatografíado en una columna abierta
empacada con gel de sílice. De las fracciones eluidas con hexano-acetato de etilo (8:2), se
aislaron 1430 mg de ácido ursólico (3).
El ácido ursólico (3) p.f 272-274°C se identificó mediante la comparación de sus propiedades
fisicas y espectroscópicas con aquéllas publicadas en la literatura." así como por la
preparación de su éster metilico.
18
Éster metílico del ácido ursólico (4) .
Una solución etérea (200 mg) de 3 se trató con diazometano a temperatura ambiente durante
24 horas. Al evaporar el disolvente a presión reducida, se obtuvo un residuo el cual se purificó
mediante una cromatografía en columna empacada con gel de sílice eluida con hexano y
mezclas de hexano-acetato de etilo de polaridad ascendente . Se obtuvieron 13 fracciones de 25
mi cada una. En las fracciones eluidas con hexano-acetato de etilo [9:1] se aislaron 114.5 mg
del éster metílico del ácido ursólico (4), el cual se identificó por comparación de sus
propiedades físicas y espectroscópicas con las informadas en la literatura . 57
Extracto metanólico
Al tratar el extracto metanólico (12 g) con hexano, se obtuvo un precipitado café resinoso (2.32
g) Y una solución, la cual, al ser concentrada a presión reducida produjo un residuo (9.67 g). La
cromatografía de este residuo, mediante una columna empacada con gel de sílice y eluida con
hexano, mezclas de hexano-acetato de etilo de polaridad ascendente, acetato de etilo y
finalmente con metanol , permitió el aislamiento de 7.6 mg de ¡3-sitosterol (5) (hexano-acetato de
etilo, 8:2) y 3.7 mg de ácido ursólico (3) (hexano-acetato de etilo, 3:7).
La identidad del p-sitosterol (5), p.f 140-142°C, se confirmó por comparación de sus datos
físicos y espectroscópicos con los descritos en la literatura. 46 , 1
19
Determinación de f1avonoides y taninos por métodos espectrofotométricos
La determinación de los flavonoides presentes en el extracto acuoso se realizó por el método
espectrofotométrico para cuantificar flavonoides totales expresados en relación a la quercetina.
23 El siguiente diagrama de flujo resume el método utilizado.
Una solución etanólica (20 mi) de la muestra (0.5 g),
se refluja en presencia de 20 mi de H2S04 (10%) .
Filtrar
Filtrar
Lavar con agua fría destilada
Disolver en etanol
y calentar a ebullición
durante 10 minutos
La solución se afora a 100 mi
con etanol al 96% (solución problema)
20
Como patrón se empleó 0.04 g de quercetina, los cuales se disolvieron con etanol al96 % hasta
completar un volumen de 50 mi de esta solución se toma 1 mi se diluye a 100 mi con etanol al
50 %. El blanco consistió de etanol al 96%. La expresión empleada para el cálculo de
f1avonoides totales fue la siguiente:
Am x P x 5 x 100
R
x = - - - - - - - -
Donde:
x= contenido de f1avonoides totales expresados como quecertina (%)
Arr,= absorbancia de la solución muestra (nm)
PR =peso de la sustancia de referencia (g)
AR= absorbancia de la solución de referencia (nm)
Por otro lado, la cuantificación de taninos totales utilizó el método del tungsto-molíbdico-fos-
fórico para cuantificar taninos. 23 El siguiente diagrama de flujo ilustra el procedimiento usado.
Agitar 10 g de muestra con 500 mi de etanol al 50 % 6h
~ Dejar reposar 8 h
I Agitar nuevamente por 30 min
1 Filtrar
I
Se transfieren 3 mi del filtrado a
un matraz aforado de 50 mi
1
Se diluye con agua destilada
hasta enrase solución problema
(Sm).
21
A continuación se prepararon las muestras del reactivo, blanco, patrón y problema de la
siguiente forma:
Reactivo Blanco Patrón Problema
Sm 1.0 mi
Solución de
referencia 3.0ml
de ácido
tánico
Agua 5.0ml 2.0ml 4.0ml
destilada
Reactivo 2.0 mi 2.0 mi 2.0ml
para taninos
Se agita y se deja en reposo 5 min
Solución de
carbonato 1.0 1.0 mi 1.0 mi
de sodio al
20%
Se aforan a 50 mi con agua destilada. Se mezcla bien y se leen cada uno a 700 nm.
Solución de referencia de ácido tánico: se disuelven 25 mg de ácido tánico en 100 mi de
agua destilada . De esta solución se toman 20 mi y se aforan a un volumen de 10 mI.
Reactivo de taninos . Se prepara una solución con 10g de tungstato de sodio dihidratado y 0.2
9 de ácido fosfomolíbdico en 75 mi de agua. A esta solución se le agrega 5 mi de ácido
fosfórico al 85 %, se somete a reflujo durante 2 h. Yse afora a 100 mi con agua destilada .
La expresión para el cálculo de taninos es la siguiente :
x = Am x P x 1000 x 100
Ap x PM (100 -p)
Donde:
X: contenido de taninos en droga (%)
P: masa de la sustancia de referencia ( g)
22
Ap : absorbancia de la solución de referencia (nm)
PM: masa de la droga (g)
p: humedad de la droga (%)
23
Actividad antioxidante
Método del radical 1,1-difenil-2-picrilhidracilo (DDPH).
Para evaluar la actividad antioxidante del extracto acuoso se empleo el método del radical
DDPH. Este método está basado en el hecho que el DDPH al reaccionar con un radical libre se
transforma en la hidracina de a,a-difenil-l3-pricrato. 54
El extracto acuoso liofilizado de Temstroemia sylvatica se evaluó a las concentraciones de 10
ppm, 100ppm y 1000 ppm, a cada concentración se le adicionó una solución de DDPH 100 IlM.
La actividad sobre el radical se determinó por espectrofotometria UVa 515 nm (Tabla 3).
Ecuación para el cálculo de % de actividad del DDPH:
% Actividad= «Acontrol - Amuestra) I Acontrol) x 100
24
RESULTADOS
ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA
Efecto ansiolítico del extracto acuoso de Temstroemia sylvatica evaluado en el Modelo
de la conducta exploratoria en un ambiente adverso
De acuerdo con Crawley y López-Rubalcava 16, 40 un incremento en el número de transiciones
se considera como un efecto ansiolítico. Sin embargo, los resultados obtenidos en el modelo de
la conducta exploratoria en un ambiente adverso (tabla 3; figura 1) indican que la diferencia
entre los grupos tratados con extracto acuoso y el control no fueron estadísticamente diferentes
(*psO.05 y p* s 0.01). Resultado que indica que no existen diferencias significativas entre el
grupo tratado con el extracto acuoso y el grupo control. Excepto, cuando se administró una
dosis de 6.25 mg/kg de extracto acuoso donde se observó un incremento en el número de
transiciones entre los dos compartimientos. Sin embargo, el efecto no es dependiente de la
dosis y, por consiguiente, no puede ser considerado como un efecto ansiolítico verdadero.
25
Tabla 3. Resultados de EAT en el modelo de la conducta exploratoria.
Tratamiento Dosis (mg/kg) No de Transiciones (10 min)
control 0.0 15.429 ~ 2.125
diazepam 1.0 24.00 ~ 3.98
Temstroemía sylvatíca 1.56 20.286 ~ 2.561
3.12 19.429 ~ 1.556
6.25 26.571 ~ 3.077
12.5 18.00 ~ 2.309
25.00 18.571 ~ 3.077
( p s 0.05, p*sO.001) con respecto al control
35
30
e
'E 25
o
~
Ul
20CIle
.2
u
~ 15
'":o
-8 10
oz
5
O
Control 1.56 3.12
*
6 .25 12.5 25
Concentración del extracto acuoso (mgJkg)
Figura 1. Modelo de la conducta exploratoria.
26
Efecto del extracto acuoso sobre la actividad locomotriz en el modelo del campo abierto.
Los resultados de la actividad locomotriz (tabla 4; figura 2) indican que no hay diferencias
significativas entre el grupo control y los grupos tratados a las dosis de 1.56, 3.12, 6.25, 12.5 Y
25 mg/kg de EAT (*psO.05 y p* s 0.01).
Tabla 4. Efecto del EAT sobre la actividad locomotriz .
Tratamiento Dosis (mg/kg) No de cuentas (5 min)
control 0.0 87.714 ± 10.120
diazepam 1.0 103.87 ± 13.26
Temstroemia sylvatica 1.56 78.286 ± 6.439
3.12 98.429 ± 11.286
6.25 73.714 ± 6.728
12.5 102.143± 15.212
25.00 86.571 + 11.112
( p·s 0.05, p*SO.001) con respecto al control.
140
120
-1:
E 100
e
l/l 80tIl...
1:
al
~ 60u
al
"ti
40oz
20
O
control 1.56 3.12 6.25 12.5 25
Dosis (mg/kg)
Figura 2. Efecto del EAT sobre la actividad locomotriz .
27
De acuerdo con estos resultados obtenidos tanto en el modelo de la conducta exploratoria en
un ambiente adverso, así como en la prueba de actividad locomotriz, el extracto acuoso no
presenta efectos ansiolíticos.
Potenciación del efectohípnótico inducido por pentobarbital sódico
Esta evaluación se llevó a cabo con las dosis de 42 mg/Kg y 30 mg/Kg de pentobarbital sódico.
Los resultados del primer experimento (tabla 5; figura 3) muestran un incremento dependiente
de la dosis en el tiempo de sueño inducido por el pentobarbital sódico a 42 mg/kg en los
animales pretratados a las dosis de 1.00, 100,200,400 Y 1000 mglkg con EAT.
En el segundo experimento (tabla 5) los grupos fueron tratados con una dosis menor de
pentobarbital sódico 30 mglkg, la cuál no es suficiente para inducir la pérdida de reflejo de
enderezamiento. Sin embargo, cuando se administró en combinación con el extracto acuoso a
las dosis de 200, 400 Y 1000 mglkg se observó hipnosis dependiente de la dosis. La
administración de pentobarbital sódico se realizó 60 minutos antes de la administración de
diferentes dosis del extracto acuoso. El análisis estadístico para ambos grupos indicó que las
diferencias de los promedios en el tratamiento de los grupos fueron estadísticamente
significativos (p*sO.05 y p* s 0.01).
28
Tabla 5. Potenciación por EAT del efecto hipnótico inducido por pentobarbital sódico.
PB 30 0.0
20.22:2.73
PB42
PB 30 51.00 20.2 ± 3.23
PB 4251.00
36.3 z,4.54 *
PB 30 5100 18.38 ± 2.59
39.52: 4.84 *
PB 42 5100
PB 30 5200 32.59 ± 2.17*
54.4 2:3.47 *
PB 425200
PB 30 5400 32.7 ± 4.8 *
68.62: 6.38 *
PB 42 5400
PB 30 5800 26.79 ± 3.3
PB 425800
48.02:2.22
PB 30 51000 39.02 ± 4.67*
PB 4251000
78.4 2:9.41*
(p s 0.05, p*s 0.001) con respecto al control
PB pentobarbital sódico
S extracto acuoso
29
PRUEBA DE HIPNOSIS DEL EXTRACTO ACUOSO DE T.
sylvatica
100.00
*90.00
*80.00
*
:E 70.00
.§.
o 60 .00
oc
CI)
¡ 50.00
CI)
"O
&. 40 .00
E
~ 30.00
20.00
10.00
0.00
PB42
* *
100
*
200
*
400 800
*
1000
Concentración de extracto acuoso (mgJkg)
Figura 3. Prueba de hipnosis del EAT.
30
ESTUDIO FITOQuíMICO
La cromatografía del extracto acuoso permitió el aislamiento de estigmasterol (1) y del acetato
del ácido ursólico (2). La identificación de estos compuestos se realizó por la comparación de
sus datos espectroscópicos y físicos con aquél/os publicados en la literatura. 57
JO
26
27
Ol,OCO
23 2..
1 2
El análisis cromatográfico del extracto de acetato de etilo permitió el aislamiento de 1.430 g de
ácido ursólico (3). El ácido ursólico fue identificado por comparación de su propiedades físicas
y espectroscópicas con aquéllas publicadas en la literatura, 57 así como por la preparación de
su éster metílico.
HO
23 24
3
La cromatografía del extracto metanólico permitió el aislamiento del l3-sitosterol (5) y ácido
ursólico (3). La identidad del p-sitosterol (5) se confirmó por comparación de sus datos físicos y
espectroscópicos con los descritos en la literatura. 46, 1
H
5
" as
29
2.
27
31
Método espectrofotométrico para cuantificar f1avonoides
Los valores de las absorbancias de la solución muestra y de la solución de referencia fueron
1.588 y 1.957, respectivamente. Al sustituir estos valores en la expresión empleada para el
cálculo de f1avonoides totales, se calculó un 16.22 % de contenido de f1avonoides en el EAT.
Am x P x 5 x 100
Rx =- - - - - - - -
Donde:
x= contenido de f1avonoides totales expresados como quecertina (%)
Aro= absorbancia de la solución muestra = 1.588
PR =peso de la sustancia de referencia (9) = 0.04 9
AR = absorbancia de la solución de referencia = 1.957
32
Método espectrofotométrico para cuantificar taninos
Los valores de absorbancias de la solución referencia y la solución de la muestra fueron 0.047 y
0.049, respectivamente. La sustitución de estos valores en la fórmula permitió el cálculo de un
2.39 % de taninos totales en el EA1.
La expresión para el cálculo de taninos es la siguiente:
x = Am x P x 1000 x 100
Ap x PM (100- p)
Donde:
X: contenido de taninos en droga (%)
P: masa de la sustancia de referencia ( g) =0.025 g
Aro: absorbancia de la muestra =0.047
Ap : absorbancia de la solución de referencia = 0.049
PM: masa de la droga =10 g
p: humedad de la droga (%)
33
Actividad antioxidante
Modelo del radical DDPH
MUESTRA CONCENTRACION As15nm % de reducción del DDPH
(promedio + ES)
DPPH 100 uM 0.683
Extracto acuoso 10 ppm 0.575 15.902
de T. sylvatica 100 ppm 0.089 86.927
1000 oom 0.022 96.780..
Tabla 6. Determinaci ón de actividad antioxidante del EAT mediante el radical DDPH.
Los resultados de la actividad antioxidante del EAT liofilizado indican una relación dependiente
de la concentración ( figura 4 ), de tal forma que a una concentración de 1000 ppm el % de
reducción del DPPH es del 96.7%, lo cual indica que este extracto posee un buen perfil como
agente anti-oxidante.
120
::1:
Do 100el
O
a¡ 80
"el
e
-O 60u
&>
::;,
40"el
l!
CD 20"el
~o
O
10 100 1000
Concentación del extracto acuoso (ppm)
Figura 4. Actividad antioxidante del EAT.
34
DISCUSiÓN DE RESULTADOS
Las evaluaciones del EAT en el modelo de la conducta exploratoria indicaron que bajo estas
condiciones experimentales el EAT no posee efecto ansiolítico. Resultado que apoya al estudio
realizado por Molina et al., 44en el cual se señala que en el modelo de laberinto elevado en cruz,
el extracto tampoco mostró efecto ansiolítico. Así mismo, nuestros resultados demostraron que
el EAT no afecta la actividad locomotriz de los animales de prueba. Estos hallazgos constituyen
una sólida evidencia que señala que el EAT no presenta actividad ansiolitica, como
popularmente se supone.
Sin embargo, los resultados del efecto sedante o hipnótico evaluado en el modelo de
potenciación de sueño inducido por pentobarbital sódico, demostraron que a la dosis de 42
mg/Kg de pentobarbital como inductor de sueño, las diferentes administraciones del EAT
incrementaron, de forma dependiente de la dosis, el efecto hipnótico. Sin embargo, dado que
esta dosis de pentobarbital sódico por si misma induce a la pérdida de reflejo de
enderezamiento, se decidió realizar el mismo experimento, con 30 mglkg de pentobarbital,
dosis a la cual no se presentan efectos hipnóticos. Los resultados de este último experimento
fueron similares a los obtenidos con la dosis de 42 mg/Kg. Estos hallazgos claramente señalan
que el extracto acuoso posee efectos sedantes o hipnóticos.
Por otro lado, las propiedades antioxidantes del extracto acuoso fueron evaluadas mediante la
prueba del radical DDPH (1,1-difenil-2-picrildidracil). Los resultados indican que este extracto
posee una fuerte actividad antioxidante dependiente de la dosis. Se ha publicado que radicales
libres provenientes de estructuras fenólicas o enólicas, reaccionan de manera preferencial con
el DDPH, de tal manera que los metabolitos secundarios que presentan una buena actividad
antioxidante son: polifenoles, f1avonoides, taninos, entre otros. 10
Adicionalmente, se ha publicado que algunos f1avonoides naturales se unen a receptores
benzodiazepinicos, lo que les da propiedades ansioliticas y sedantes." Por lo tanto,
posiblemente las actividades sedante y antioxidante se deban a la presencia de flavonoides en
el extracto.
35
Sin embargo, el aislamiento y la cuantificación de los principios activos del extracto acuoso
están más allá de los objetivos de este trabajo . No obstante, se realizó la cuantificación por
métodos calorimétricos tanto de taninos como de flavonoides totales del extracto acuoso. Los
resultados indicaron un 16.22 % de flavonoides totales y solamente un 2.39 % de taninos
presentes en el extracto. Este resultado podría explicar los efectos sedante y antioxidante del
extracto acuoso.
Por otro lado, la presencia del ácido ursól ico como el meta bolito secundario más abundante en
T. sylvatica (0.46 %) esta de acuerdo con estudios previos de éste género, los cuales señalan la
presencia recurrente de triterpenos de los tipos ursólico, oleanano y lupano. 59,14,34 También se
lograron aislar pequeñas cantidades de estigmasterol (0.092 %) Yel ñ-sitosterol (0.0024%).
Adicionalmente, a las bien conocidas propiedades antinflamatoriasy antineoplásicas del ácido
ursólico, 52.53 en el año 2001 Chung y colaboradores publicaron la actividad inhibitoria de este
triterpeno sobre la acetilcolinesterasa, lo cual sugiere su utilización en el tratamiento de la
enfermedad de Alzhe imer. 18 Así mismo , se ha informado que el ácido asíatico (2a, 3a, 23-
trihidroxi-12-urs-en-28-oico), triterpeno estructuralmente relacionado al ácido ursólico ha sido
patentado para el tratamiento de demencia y como anticonvulsivo. 36
Los efectos que presentan estos ursanos posiblemente se expliquen por el hecho de que la
degeneración neuronal que presentan ciertas áreas cerebrales de los pacientes con Alzheimer
van acompañadas por marcadores de activación microglial, inflamación y daño oxidativo, así
como la presencia de nitrotirosina; por lo tanto los compuestos con actividad antioxidante y
antiinflamatoria como el ácido ursólico pueden prevenir degeneración neuronal en pacientes
con Alzheimer. 2 Sin embargo, hasta el momento no se ha publicado la posible acción sedante
del ácido ursólico .
36
CONCLUSIONES
• Los resultados de las evaluaciones farmacológicas llevadas a cabo en el modelo de
conducta exploratoria en un ambiente adverso mostraron que el EAT no posee actividad
ansiolítica; sin embargo mediante el modelo de potenciación del efecto hipnótico inducido
por pentobarbital sódico se observó que el extracto acuoso de T. sylvatica posee efecto
sedante.
• La evaluación antioxidante EAT mediante el modelo del radical DDPH demostró que el
extracto acuoso posee actividad antioxidante, propiedad que puede atribuirse a la presencia
de los taninos y f1avonoidesdeterminados también en este trabajo.
• Las determinaciones cuantitativas por métodos colorimétricos demostraron que el EAT es
rico en compuestos f1avonoides y, por el contrario, la presencia de taninos es escasa. Esta
riqueza de f1avonoidespodría explicar los efectos sedantes de esta especie.
• Del extracto hexánico se lograron aislar estigmasterol y el acetato del ácido ursólico,
mientras que del extracto de acetato de etilo se aisló el ácido ursólico, el cual también se
aisló del extracto metanólico junto con el 13- sitosterol.
37
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44
APÉNDICE
45
CONSTANTES FíSICAS Y ESPECTROSCÓPICAS DE LOS METABOLlTOS AISLADOS
30
23 2-1
Fig. 5. Estructura del acetato del ácido ursólico
p.f 220-222°C
IR 3420(OH), 1690(COOH), 1730 carbonilo del acetato, 2940 CH alifático , 1460 (CH2) , 1370
(CH3) cm-l.
RMN'H (300 MHz, CDCI3»): 5.2 (t, 1H, J=7.2Hz, H-12), 4.5(m, 1H, H-3), 3.59(s, 3H,COOCH3),
2.2(d, 1H, J=10.8 Hz, H-18), 1.06,0.94,0.85,0.74 (s, 3H)
C13(75 MHz, CDCI3) : 178.06 (C-28), 170.99(COOCH3), 138.19(C-13), 125.48(C-12), 80.94(C-
3), 55.32(C-5), 52.90(C-18) , 48.11(C-17), 47.51(C-9), 42.00(C-14), 39.53(C-8), 39.06(C-19,5),
38.89(C-20), 38.32(C-1), 37.69(C-4), 36.89(C-10), 36.37(C-22) , 32.91(C-7), 30.66(C-21),
28.08(C-23,15), 24.24 (C-16), 23.58(C-2), 23.32(C-27,11) , 21.29(COCH3-C-3), 21.17(C-30),
18.22(C-6), 17.06(C-24), 16.92(C-29), 16.73(C-26), 15.49(C-25).
46
HO
23 24
Fig.6. Estructura del ácido ursólico
p.f 272-274°C
IR 3440(OH), 1790-1690(COOH), 2940 CH alifático, 1460 (CH2), 1370 (CH3) cm-l.
RMN'H (200 MHz, DMSO) d: 5.12(t, 1H, H-12), 4.3(d, 1H, J=5.08 Hz, H-3), 3.0(m, 2H, H-2),
2.2(d, 1H, J=11.18 Hz, H-18), 0.73,0.82, 1.03(s,3H), 0.90 (d, 3H)
l3C_NMR (CDCI3, 100.63 MHz) o:.176.0 (C-28), 138.0 (C-13) , 125.8 (C-12), 79.0 (C-3), 55.3 (C-
18), 52.7 (C-5), 47.9 (C-17), 47.6 (C-9), 42.0 (c-149, 39.6 (C-4) , 39.1 (C-8), 38.7 (C-1), 37.0 (C-
22),36.7 (C-10) , 33.0 (C-7), 30.6 (C-19), 30.4(C-20), 29.4(C-15), 27.3 (C-21), 24.2 (C-279, 23.7
(C-11), 23.5 (C-2), 23.4 (C-30, 23), 23.3 (C-16), 21.1 (C-29), 18.3 (C-6), 17.0 (C-24, 24) y 155
(C-26).
E.M.LE mIz: 456 (M+, C3D H48 0 3. 20), 438 (M+ H20 ), 411(M+ COOH), 208(8), 248(20),
203(100) , 133(40), 199(35), 105(20), 91(20), 81(25), 69 (25), 55(30) , 43(40) , 41 (30).
47
H
16
Fig 7. Estructura del p-sitosterol
p.f 140-142 Oc
IR v máx COCh (cm") 3604 (OH), 295.7, 2869.9, 1465.8 (-CH2) 1379 (-CH3) , 1093.6, 1022.2,
9528.
RMN1 H (d=ppm) COCh. 300 MHz: 5.15(t, 1H, J=8Hz, H-6), 3.6 (m, 1H, H-3), 1.63(s, 3H, H-
19), 0.55(s, 3H, H-18).
RMN13C 75 MHz COCI3 ppm: 37.316 (C-1), 31.711(C-2), 71.817 (C-3), 42.367 (C-4), 140.806
(C-5), 121.692 (C-6), 31.973 (C-7), 31.973 (C-8), 50.229 (C-9) , 36.544 (C-10), 21.128(C-11),
39.849 (C-12), 42.367 (C-13), 56.823 (C-14), 24.316 (C-15) , 28.247 (C-16), 56.154 (C-17),
12.00 (C-18), 19.396 (C-19), 36.166(C-20), 18.799 (C-21), 34.026 (C-22) , 26.252 (C-23), 45.934
(C-24), 29.280 (C-25), 19.803 (C-26), 19.803 (C-27), 23.151 (C-28), 11.867 (C-29).
EM I E (miz) 414[ Mf (C29 Hso O), 400(12), 399(20), 396(27), 381(18), 329(17), 303(20),
273(18),250(20),213(25),103(19),161(22),119(30).
48
H
26
25
27
29
Fig 8. Estructura del estigmasterol
p.f 1531540 C
IR v máx COCb (cm") 3604 (OH), 295.7, 2869.9, 1465.8 (-CH2) 1379 (-CH3) , 1093.6, 1022.2,
9528.
RMN1 H (d=ppm) COCb, 300 MHz: 5.16(dd, 1H, J=15.18Hz, J=6.6HZ, H-22), 5.15(t, 1H,
J=8Hz, H-6), 5.02(dd, 1H, J=15.18Hz, J= 8.53Hz, H-23), 3.6 (m, 1H, , H-3), 1.63(s, 3H, H-19),
1.03(d, 3H, J=6.6Hz, H-21), 0.55(s, 3H, H-18).
C13 ( 75 MHz, COCI3) d: 139.56 (C-5), 138.16 (C-22), 129.46(C-23), 117.46(C-6), 71.08(C-3),
55.92(C-14), 51.25(C-29), 49.46(C-9), 40.81(C-20), 40.25(C-25), 39.46(C-4), 37.97(C-12),
37.13(C-1), 31.87(C-8), 31.46 (C-7), 29.63(C-2), 28.51(C-16), 25.4(C-28), 23.02(C-15), 21.54(C-
11), 21.38(C-21), 21.1(C-27), 18.99(C-26), 13.05(C-18), 12.25(C-19), 12.05(C-29), 55.12(C-17),
43.29(C-13), 34.23(C-10)
49
	Portada
	Índice General
	Introducción
	Antecedentes
	Objetivos
	Materiales y Métodos
	Resultados
	Discusión de Resultados
	Conclusiones
	Bibliografía
	Apéndice