Exploracion-del-potencial-regenerativo-en-gametofitos-de-helechos

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE MÉXICO
FACULTAD DE CIENCIAS
EXPLORACIÓN DEL POTENCIAL REGENERATIVO EN
GAMETOFITOS DE HELECHOS
T E S I S
PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
BIÓLOGO
P R E S E N T A :
FACULTAD DE
CIENCIAS
FELIPE GÓMEZ NOGUEZ
TUTOR:
M. EN C. ANA CLAUDIA SÁNCHEZ ESPINOSA
COTUTOR:
DRA. BLANCA PÉREZ GARCÍA
2008
Neevia docConverter 5.1
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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1. Datos del alumno
Gómez
Noguez
Felipe
56 76 20 15
Universidad Nacional Autónoma de México
Facultad de Ciencias
Biología
400047278
2. Datos del tutor.
M. en C.
Sánchez
Espinosa
Ana Claudia
3. Datos del sinodal 1
Dr
Chávez
Ávila
Víctor Manuel
4. Datos del sinodal 2
M. en B.
Muñiz
Díaz de León
María Eugenia
5.- Datos del sinodal 3
M. en C.
Velásquez
Montes
Felipe Ernesto
6.- Datos del sinodal 4
Dra.
Pérez
García
Blanca
3. Datos de la tesis.
Exploración del potencial regenerativo en gametofitos de Helechos
84 p.
2008
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i
INDICE GENERAL
Índice General………………………………………………………………………………... i
Agradecimientos……………………………………………………………………………... v
Resumen………………………………………………………………………………………. ix
Abstract………………………………………………………………………………………. x
Auszug………………………………………………………………………………………. xi
Abreviaturas…………………………………………………………………………………. xii
1.- Introducción …………………………………………………………………….……..… 1
2.- Objetivos……………………………………………………………………………..…… 4
2.1.- Objetivo general……………………………………………………………..… 4
2.2.- Objetivos particulares……………………………………………………….... 4
3.- Hipótesis………………………………………………………………………………..… 4
4.- Justificación…………………………………………………………………………….… 5
5.- Marco teórico……………………………………………………………………………. 6
5.1.- Importancia de los bosques mesófilos de montaña (BMM)…………....… 6
5.2.- Helechos arborescentes, su estatus y explotación……………………..… 7
5.3.- Ciclo de vida de los helechos terrestres..………………………………….. 8
5.4.- Esporas de los helechos……………………………………………………... 9
5.5.- Germinación de esporas en condiciones naturales……………………….. 9
5.5.1.-Bancos de esporas………………………………………………..… 10
5.6.- Morfología de Cyatheaceae………………………………………………… 11
5.6.1.- Distribución y hábitat ………………………………………………. 11
5.6.2.- Especies en estudio ………………………………………………. 11
5.6.3.- Descripción de las especies……………………………………….. 12
5.6.3.1.- Alsophila firma (Baker) D.S. Conant ……………………….….. 12
5.6.3.2.- Cyathea divergens Kunze var. tuerckheimii (Maxon) R.M.
Tryon........................................................................................ 12
5.7.- Morfología de Polypodiaceae ………………………………………………… 12
5.7.1.- El Género Phlebodium……………………………………………….. 13
5.7.2.- Distribución y hábitat……………………………………………….. 13
5.7.3.- Potencial medicinal de Phlebodium……………………………….. 13
5.7.4.- Estatus y aprovechamiento…………………………………….…. 14
5.7.5.- Morfología de Phlebodium………………………………………..… 15
5.7.6.- Especie en estudio………………………………………………….. 15
5.7.7.- Descripción de Phlebodium areolatum (Humb. & Bonpl. ex
Willd.) J. Sm. …………..…………………………………….………… 15
5.8.- Cultivo in vitro............................................................................................. 16
5.9.- Cultivo de esporas de helechos en condiciones in vitro .........………….... 20
5.9.1.- Desinfección de esporas…………………………………………… 21
5.9.3.- Medios de cultivo……………………………………………………. 22
5.9.4.- Factores que afectan la germinación……………………………… 23
5.9.5.- Cultivo de gametofitos………………………………………………. 24
5.10.- Estudios sobre el desarrollo del gametofito………………………………… 25
5.11.- Estudios del desarrollo del esporofito………………………………………. 26
5.12.- Apogamia……………………………………………………………………… 27
5.13.- Apogamia inducida…………………………………………………………… 29
5.13.1.- Sustancias que favorecen la apogamia…………………………. 29
5.13.2.- Desarrollo de esporofito apogámico……………………………... 30
6.- Metodología……………………………………………………………………………….. 31
6.1.- Colecta y obtención del material biológico………………………………….. 31
6.1.1.-Alsophila firma (Baker) D.S. Conant ..…………………………….. 31
6.1.2.- Cyathea divergens Kunze var. tuerckheimii (Maxon) R.M. Tryon 31
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ii
6.1.3.- Phlebodium areolatum (Humb. & Bonpl. ex Willd.) J. Sm……….. 31
6.2.- Tratamiento de desinfección y siembra……………………………………..… 32
6.3.- Determinación del pH adecuado para germinación………………………… 33
6.4.- Tratamientos aplicados para la regeneración de gametofitos……………… 33
6.4.1.- Identificación del efecto de la sacarosa…………………………… 34
6.4.2.- Identificación del efecto del 2,4-D…..……………………………… 34
6.5.- Formación de esporofitos ex vitro ……………………………………………. 35
6.6.- Formación de esporofitos in vitro, inducción de apogamia………………… 35
6.6.1.- Efecto de la auxina y/o sacarosa……………………….……..…… 35
6.6.2.- Efecto del Ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC)
en la inducción de esporofitos………………………………….…........... 35
7.- Resultados ………………………………..………………………………………….……. 37
7.1.- Desinfección …………………………………………………………….……… 37
7.2.- Germinación ……………………………….…………………………………… 37
7.3.- Regeneración de gametofitos……………….………….………….…….…… 38
7.3.1.- Identificación del efecto de la sacarosa………….………..……… 39
7.3.2.- Identificación del efecto del 2,4-D……..…………………………… 41
7.4.- Formación de esporofitos ex vitro ……………………..…………..……….… 42
7.5.- Formación de esporofitos in vitro, inducción de apogamia……………..….. 42
7.5.1.- Efecto del 2,4-D y la sacarosa en la apogamia ………………..…. 42
7.5.2.- Efecto del Ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC)
en la formación de esporofitos ……............…………………………….… 43
7.6.- Estructuras obtenidas en las especies estudiadas………………………. 43
8.- Discusión…………………………………………………………………………….…..… 51
8.1.- Desinfección ………………….………………………………………………… 51
8.2.- Germinación …………………………………………………………..…..…… 52
8.2.1.- Alsophila firma (Baker) D.S. Conant ..…………………………….. 52
8.2.1.1.- Determinación del pH adecuado para germinación…… 53
8.2.2.- Cyathea divergens Kunze var. tuerckheimii (Maxon) R.M. Tryon 54
8.2.3.- Phlebodium areolatum (Humb. & Bonpl. ex Willd.) J. Sm……….. 55
8.3.- Regeneración de gametofitos…………………….………….……………… 56
8.3.1.- Identificación del efecto de la sacarosa…………………………… 59
8.3.2.- Identificación del efecto del 2,4-D……..…………………………… 60
8.4.- Formación de esporofitos ex vitro ……………..……………………………… 61
8.5.- Formación de esporofitos in vitro, inducción de apogamia………………… 61
8.5.1.- Efecto del 2,4-D y la sacarosa en la apogamia ………………..…. 62
8.5.2.- Efecto del Ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) en la formación
de esporofitos ………………………………………..………............… 63
9.- Conclusiones………………………………………………………………………….. 64
10.- Recomendaciones…………………………………………………………………….. 65
11.- Bibliografía …………………………………………………………………………….. 66
12.- Anexos………………………………………………………………………………….. 83
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iii
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1.- Metabolitos secundarios o sustancias obtenidas en especies
cultivadas in vitro ………………………………………………………………… 17 - 18
Cuadro 2.- Especies amenazadas, ornamentales o con uso potencial, cultivadas
 in vitro …………………………………………………………………..............… 18 - 19
Cuadro 3.- Especies de importancia alimneticia o comercial, con reporte de
transferencia de genes mediante técnicas de cultivo de tejidos…………….........… 19
Cuadro 4.- Plantas de maceta producidas en Holanda, principal productor mundial…............. 20
Cuadro 5.- Desinfección en helechos......................................................................... 21 - 22
Cuadro 6.- Especies de helechos con apogamia obligada…….............................27 - 28
Cuadro 7.- Tratamientos de desinfección de esporas usados en las especies
estudiadas……………………………………………………......................…… 32
Cuadro 8.- Determinación del pH adecuado para la germinación de A. firma………….. 33
Cuadro 9.- Tratamientos de regeneración de gametofitos utilizados en
 C. divergens y P. areolatum………………………………………………………….. 34
Cuadro 10.- Tratamientos para la identificar el efecto de la sacarosa en el
desarrollo de gametofitos de P. areolatum………………………………….............….. 34
Cuadro 11.- Tratamientos para determinar el efecto del 2,4-D en el desarrollo
 de gametofitos de P. areolatum…………………………………………….........….. 34
Cuadro 12.-Tratamientos de inducción apogámica por 2,4-D y sacarosa……………...........…. 35
Cuadro 13.- Resultados de los tratamientos de desinfección............……………………………… 37
Cuadro 14.- Resultados de la regeneración…………………………….............……………………. 38
Cuadro 15.- Morfología de los tratamientos de regeneración…………………............…………… 40
Cuadro 16.- Estructuras obtenidas en las tres especies…………………………………............... 43
INDICE DE GRÁFICAS:
Gráfica 1.- Efectos de la sacarosa en gametofitos de P. areolatum………………............……. 41
Gráfica 2.- Efectos del 2,4-D en gametofitos de P. areolatum………………………..............… 42
INDICE DE FIGURAS
Lámina A.- Hábito de las especies estudiadas……………………………………...................….. 44
Lamina B.- Germinación en las especies estudiadas………………………………....................… 45
Lámina C.- Morfologías representativas observadas en los gametofitos y gémulas................... 46
Lámina D.- Regeneración en los gametofitos de C. divergens var. tuerckheimii…...................... 47
Lámina E.- Regeneración en los gametofitos de P. areolatum………………...................…..….. 48
Lámina F.- Regeneración en gametofitos de P. areolatum……………......................……………. 49
Lámina G.- Formación de esporofitos en P. areolatum……………….....................……………… 50
ÍNDICE DEL ANEXO
Anexo I.- Protocolo para desinfección de esporas de helechos………………....................…….. 83
Anexo II.- Composición de los medios nutritivos empleados………………….................……….. 84
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iv
Algunas veces siento que los
indios
Esperamos la llegada de un
hombre
Que todo lo puede,
Que todo lo sabe,
Que nos puede ayudar a
resolver
Todos nuestros problemas.
Sin embargo, ese hombre que
todo lo puede
Y que todo lo sabe nunca
llegará: porque vive en nosotros, se
encuentra en nosotros, camina en
nosotros; aún duerme, pero ya está
despertando
Natalio Hernández Xocoyotzin
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v
Quiero agradecer a:
Mis padres sin cuyo apoyo cariño y amor no hubiera realizado nada en mi vida
Mi abuelita quien siempre me motiva a superarme en todos los aspectos de mi vida
Mis hermanos Fernando, Miriam, Pablo y Carmen por los consejos de toda la vida y para
toda la vida
Mi familia; en especial a mis padrinos (Chano y Redí), mis tíos (Sergio, Emma, Bernardo,
José), mis primos Iván, Adrián, el Serch, Nany, Adry, Pepe, Mariana, Tato (qed) Rafa y
los Trigueros, Angélica y los Ruvalcaba, Raquel y los Gómez, a mis sobrinos itza y mi
familia toda.
A Bety, por ser mi reflejo que me pone en realidad.
A tod@s mis amigas y amigos de generación y de otras generaciones de la Facultad de
Ciencias:Zayil, César, Bety, Montse, el padrino, Marina, Natalia, Octavio, Alejandra,
panzas,caprichos …mejor a cada quien en su versión pdf se la dedico, porque me da
pena dejar a alguien fuera…
A todos mis maestros que dentro del aula y afuera de ella me han guiado; Marta Juana,
Susana, Aurora, Sonia, Estela, Anabel, Guillermina, Othón, Alejandro, Claudia, Blanca,
Aniceto, Adolfo, Anita, Gabriel, Víctor, Barbara, Maru, y a tod@s aquell@s que están,
estuvieron y ahora no están conmigo.
A la banda veneno guías en la búsqueda de un país mejor: Nata, Lache, Esteban, Paco,
Isra, Almodóvar, Apenas, Mireya, Elías, Elena.
A la otra banda de hermanos locos con los que he rolado a buscar otras realidades por los
rincones olvidados de la patria Miaugono, Homir, Sayra, Aidee, Mónica, los Camacho y a
toda la banda combativa: Chac, Pedro, Alexis...
Al personal del herbario metropolitano “Dr. Ramón Riba y Nava Esparza” de la UAMI y al
personal del laboratorio de biología de pteridofitas por las enseñanzas que me dejan y el
apoyo técnico otorgado en dos años de trabajo.
.
A mis compañer@s del Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Jardín Botánico
por su tiempo y vivencias compartidas que son de gran importancia en mi formación como
persona y como científico.
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vi
Especial agradecimiento a:
El personal del Herbario Metropolitano “Dr Ramón Riba y Nava Esparza” de la
Universidad Autónoma Metropolitana, unidad Iztapalapa (UAM-I), en especial a la Dra.
Blanca Pérez García, al M. en C. Aniceto Mendoza Ruiz por el enorme apoyo y las
facilidades para realizar parte del presente trabajo en el laboratorio AS-102 (Pteridofitas);
también por la asesoría sobre la biología de Pteridofitas en general.
El personal del laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Jardín Botánico IB-UNAM;
en especial al Dr. Víctor Chávez Ávila y a la M. en C. Ana Claudia Sánchez Espinosa,
por brindarme la oportunidad de demostrar que no solo las angiospermas se encuentran
en peligro y permitirme realizar este trabajo, pionero en su laboratorio, sobre helechos.
También a la técnica académica Biól. Bárbara Estrada Galván, quien en todo momento
tuvo la disposición de apoyar la presente investigación con asesorías, material y
protocolos histoquímicos, cuando fueron necesarios.
El personal Académico de la Facultad de Ciencias en especial a la M. en C. María
Eugenia Muñiz y el M. en C. Felipe Ernesto Velázquez Montes por sus valiosos
comentarios y revisiones, al Biól. Othón Alcántara Ayala y al Biól. Enrique Ortiz Bermúdez
por las facilidades y asesoría en el traslado y la colecta de ejemplares silvestres.
La Dirección General de Asuntos del Personal Académico, DGAPA, por su apoyo a través
de la beca MADEMS 2005.
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vii
Agradecimiento institucional:
El Herbario Metropolitano “Dr Ramón Riba y Nava Esparza” de la Universidad Autónoma
Metropolitana, unidad Iztapalapa (UAM-I),
El laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Jardín Botánico IB-UNAM
La Facultad de Ciencias UNAM
La Dirección General de Asuntos del Personal Académico, DGAPA, por su apoyo a través
de la beca MADEMS 2005.
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viii
Resumen:
Se exploró el potencial regenerativo de gametofitos de tres especies de helechos. Dos helechos
arborescentes de la familia Cyatheaceae Kaulf., con distribución restringida a bosque mesófilo de
montaña: Cyathea divergens Kunze var. tuerkheimii (Maxon) R. M. Tryon y Alsophila firma (Baker)
D. S. Connant; y un helecho de amplia distribución Phlebodium areolatum (Humb. & Bonpl. ex
Willd.) J. Sm. Se probaron diferentes tratamientos de desinfección de esporas.
La germinación se presentó en C. divergens conforme a lo reportado para la especie, sin embargo
en P. areolatum se identificó de tipo teratológica, pues de la espora se originó un filamento con
varios centros meristemáticos que originaron una gémula. En A. firma no se observó algún indicio
de germinación, a pesar de mantener los cultivos por más de 6 meses.
Se logró una rápida propagación vegetativa de gametofitos en C. divergens var. tuerckheimii y en
P. areolatum mediante la formación de gémulas. Dichas estructuras se originaron a partir del
desarrollo de centros meristemáticos cuyas células mostraron un comportamiento parecido al
protonema (primera célula gametofítica). En algunos gametofitos obtenidos se notó la presencia de
engrosamientos y proyecciones más o menos cilíndricas que presumen la posibilidad de obtener
esporofitos apogámicos en ambas especies. En los gametofitos engrosados de P. areolatum se
encontraron traqueidas. Así mismo, el mantenimiento de gametofitos y gémulas en medio líquido
indujo la obtención de cultivos de suspensióncelular. Las alícuotas, tomadas de dicho medio,
subcultivadas originaron el desarrollo de numerosos gametofitos.
El subcultivo de gémulas y gametofitos de P.areolatum en Sphagnum condujo a la obtención de
esporofitos cuyo desarrollo concuerda con reportes anteriores, sin embargo en el presente estudio
se identificó la condición anfiestomática en el primordio del esporofito; ausente en las
subsiguientes hojas.
La capacidad regenerativa de los gametofitos puede encontrarse en función de la adaptabilidad de
la especie. Se obtuvieron gametofitos en C. divergens pero no se logró mantenerlos, por lo que no
se obtuvieron esporofitos. Se presume la presencia de traqueidas en crecimientos cilíndricos
obtenidos en algunos gametofitos de esta especie. En P. areolatum se obtuvieron proyecciones
cilindricas, gametofitos con traqueidas, gametangios y esporofitos.
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ix
Abstract:
The gametophyte’s regenerative potential in three fern species was explored; two of them were tree
ferns of the Cyatheaceae family with restricted distribution to cloud forest: Cyathea divergens Kunze
var. tuerckheimii (Maxon) R. M. Tryon and Alsophila firma (Baker) D. S. Connant; the third specie is
a widespread fern Phlebodium areolatum (Humb. & Bonpl. ex Willd.) J. Sm. Different spore
desinfecction treatments were tested.
Germination was observed in C. divergens according to previous reports, but in P. areolatum we
founded a teratological germination: from the spore was originated a filament with abundant
meristematic centers that develops in a gemmae. In A. firma no one spore germinated although the
cultures were mainteined during 6 months.
It was obteined a rapid gametophyte vegetative propagation in C. divergens var. tuerckheimii and
P. areolatum by gemmae formation, which were originated from the development of many
meristematic centers whose cells showed a protonematal (first gametophytic cell) like-behavior.
Some of the gametophyte obteined, had a thick connical, more or less cilindrical proyections thus
presums the ability to obtein apogamic sporophytes in both species, because in the thiked
gametophytes of P. areolatum were founded tracheids.
The maintenance of gametophytes and gemmae in liquid medium produced a cell suspension
culture and the subculture of his alicuots promoted the development of more gametophytes.
The culture of gemmae and gametophytes of P. areolatum in Sphagnum, improved the
development of sporophytes whose characteristics were acording to previos reports but differed in
the amphistomatic condition observed in the first leaf promordium of them. This condition
disappeared during the sporophyte development.
The gametophyte regenerative potencial would be in function of the adaptative ability of the specie.
It was obteined gametophytes of C. divergens, but it wasn´t able to survive, that´s the reason why
that sporophytes were not obtained. It was presumed the tracheid presence in cylindrical
proyections outgrowths obteined in few gametophytes of this specie. On P. areolatum it was
obteined cylindrical proyections, gametophytes within tracheid, gametangial and sporophytes.
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x
Auszug:
Die regenerierte Leistungfähigkeit der gametophyten in drei Farnsorten wurde erforscht; zwei von
ihnen waren Baumfarne der Cyatheaceae Familie mit eingeschränkter Verteilung zum wolken Wald:
Cyathea divergens Kunze Sorten tuerckheimii (Maxon) R. M. Tryon und Alsophila firma (Bäcker) D.
S. Connant; das dritte ein weitverbreitetes Farn Phlebodium areolatum (Humb. u. Bonpl. ex Willd.).
Unterschiedliche Spore desinfizirung Behandlungen wurden geprüft.
Keimung wurde in den C. divergens entsprechend vorhergehenden Reports beobachtet, aber im P.
areolatum gründeten wir eine teratological Keimung: von der Spore wurde einem Heizfaden mit
reichlich vorhandenen meristematic Mitten entstanden, der in gemmae entwickelt. Im A. firma
keimte keine Spore, obgleich die Kulturen untërhaltet während 6 Monaten waren.
Eine schnelles vegetativen gametophyten Fortpflanzung im C. divergens Sorten tuerckheimii und P.
areolatum durch gemmae Anordnung wurde erreichet, die von der Entwicklung vieler meristematic
Mitten entstanden wurden, deren Zellen ein protonematal (erste gametophytic Zelle) Wieverhalten
zeigten. Etwas von dem gewinneten gametophyten, hatten ein starkes connical, mehr, oder
weniger zylindrische Projektion folglich es ist anzunehmen dass, die Fähigkeit zu den apogamic
sporophytes in beiden Sorten gewinen, weil in der zylindrische gametophytes Projektions von P.
areolatum gegründete tracheids beobachtet wären.
Die Wartung von gametophytes und von gemmae im flüssigen Mileu hätte ein Zellen
Aufhebungkultur produzierte und die Nebenkultur seiner alicuots förderte die Entwicklung von mehr
gametophyten.
Die Kultur der gemmae und der gametophytes von P. areolatum in Sphagnum, verbessert der
Entwicklung von sporophytes deren Eigenschaften zu den previos davor, berichtet, aber
unterschied sich in amphistomatic Zustand, der im ersten vorrangige Blatt von ihnen beobachtet
wird. Diese Bedingung verschwand während der sporophyte Entwicklung.
Das gametophyte verbessernde potencial würde in Abhängigkeit von der adaptative Fähigkeit der
Sorte sein. Es war gametophytes von C. Divergens gewinnetet, aber esWAR nicht in der Lage zu
überleben, das der Grund ist, warum sporophytes nicht erreicht wurden. Es wurde vorausgesetzt,
daß die tracheid Anwesenheit in den zylinderförmigen proyections Ergebnissen in wenigen
gametophytes dieses specie obteined. Auf P. areolatum, das es war, obteined zylinderförmige
proyections, gametophytes innerhalb des tracheid, gametangial und der sporophytes
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xi
Abreviaturas
2,4-D Ácido 2,4-diclorofenoxiacético
ACC Ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico
BMM Bosque mesófilo de montaña
CITES Convention on Internacional Trade in Endangered Species
MS ó MS1 Medio nutritivo Murashige & Skoog
MSS Medio MS adicionado con sacarosa
MSLS Medio MS líquido adicionado con sacarosa
MSL Medio MS líquido
MSL24D Medio líquido adicionado con 2,4-D
PPM Plant Preservative Mixture ®
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1
1.- Introducción:
Desde el inicio de la humanidad, el hombre se ha valido de la naturaleza para
satisfacer sus necesidades básicas como son la alimentación, el vestido, la salud. Hoy en día,
la actividad antropogénica repercute en todo el planeta. Factores como la sobreexplotación de
los mantos acuíferos, el crecimiento de zonas urbanas, la constante producción de gases de
efecto invernadero, la sobrecolecta de especies útiles, entre otros, han puesto en peligro de
desaparecer a muchas especies de plantas y animales; incluyendo a algunos helechos. Por
esta razón algunas especies como Alsophila firma (Baker) D. S. Conant y Cyathea divergens
Kunze var. tuerckheimii (Maxon) R. M. Tryon; se encuentran incluidas en el apéndice II de
CITES y dentro de la Norma Oficial Mexicana NOM-ECOL-059-2001 como especies sujetas a
protección especial y se consideran, junto con otras ciateáceas, como prioritarias para la
conservación (Portugal, 2000 cit. en López, 2003). Phlebodium areolatum J. Sm. es un helecho
que afortunadamente aún no se encuentra en esta situación, pero debido a la pérdida de
hábitat y el creciente interés de la industria farmacéutica en él, por sus propiedades
medicinales, podría estar en peligro en un futuro próximo. Por esta razón, se estima que estas
especies deben ser consideradas prioritarias para la elaboración de planes de manejo
sostenible.
P. areolatum pertenece a la familia Polypodiaceae Bercht. & J. S. Presl. Es un helecho
epífito, epipétrico o terrestre distribuido en bosques mesófilos de baja montaña, bosques
húmedos, bosques de Pinus-Quercus-Liquidambar, bosques caducifolios, bosque tropical
deciduo, bosques de Pinus-Quercus y en cafetales; en lechos de lava, riscos, peñas, etc.,
desde los 550 a los 2500 msnm; en México y Centroamérica (Mickel & Smith,2004). Su
importancia etnobotánica radica en el empleo intensivo de su rizoma, junto con sus especies
hermanas P. aureum J. Sm. y P. decumanum (Willd.) J. Sm., en la elaboración de la medicina
natural llamada “anapsos”; con propiedades inmunoreguladoras, cicatrizantes, y antitusígenas
(Fernández et al., 2001). En mesoamérica se le conoce con el nombre vulgar de “calaguala” o
“lengua de ciervo”.
En México existen pocos estudios en donde se hace mención del uso de esta especie,
como cicatrizante y como antitusígeno (Fernandez et al., 2001); mientras que en reportes de
Guatemala y Honduras, se ha descrito su uso extensivo como diurético, antitumoral e
inmunomodulador (Balick, 1996; Pradas de la Fuente, 2007). Cáceres, (2004) resaltó en el XIII
Congreso Italo-Latinoamericano de Etnomedicina, realizado en Italia, la necesidad de realizar
estudios de mercado y de desarrollo de tecnologías de cultivo de especies medicinales, como
P. decumanum y P. areolatum, para la elaboración de una estrategia de manejo sostenible de
este recurso.
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2
Alsophila firma (Baker) D. S. Conant pertenece a la familia Cyatheaceae. Es un helecho
arborescente distribuido en bosques mesófilos de montaña, bosques húmedos; a lo largo de
arroyos y veredas desde los 600 a los 2500 msnm. En México se distribuye en los estados de
Chiapas, Hidalgo, Jalisco, México, Oaxaca, Puebla, Querétaro, San Luís Potosí y Veracruz; en
centro y Sudamérica se encuentra en Belice, Costa Rica, Ecuador, El Salvador, Honduras,
Nicaragua y Panamá, (Moran,1995; Mickel & Beitel, 1988; Large & Braggins, 2004). A. firma es
ampliamente aprovechado o utilizado, al igual que Cyathea fulva (M. Martens et Galeotti) Feé y
Sphaeropteris horrida (Liebm.) R. M. Tryon, para la elaboración de artesanías como macetas,
adornos y otros artículos de uso doméstico; particularmente en las comunidades rurales y
suburbanas de la sierra de Chinconquiaco en el estado de Veracruz o en las comunidades de
Teziutlán y Cuetzalán, dentro del estado de Puebla (Riba, 1978; Robledo & Arias 2001). Su
importancia etnobotánica radica en el empleo de las partes aéreas como un efectivo
antihemorrágico, en comunidades de Cuautitlán, Jalisco (Large & Braggins, 2004). Su
importancia biológica radica en la utilización de las escamas del pecíolo, por algunas especies
de colibríes (Chlorostilbon sp.) en la elaboración de sus nidos (Riba & Herrera, 1973) y el
soporte, como sustrato natural, que su rizoma ofrece a helechos epífitos como Hymenophyllum
undulatum (Sw.) Sw., Trichomanes capillaceum L., T. hymenoides Hedw., T. kraussii Hook. et
Grev. , Terpsichore asplenifolia (L.) A.R. Sm., Blechnum falciforme (Liebm.) C. Chr.,
Campyloneurum xalapense Feé., Anthrophyum ensiforme Hook., Polypodium fraternum Schltdl.
et Cham., P. echinolepis Feé., y Vittaria dimorpha Müll. Berol (Riba, 1998).
Cyathea divergens Kunze var. tuerckheimii (Maxon) R.M. Tryon (Cyatheaceae) se
distribuye en bosques de niebla con Pinus, Quercus y Liquidambar, desde los 300 hasta los
2500 msnm; en México se encuentra en los estados de Chiapas, Oaxaca, Puebla y Veracruz;
en centro y Sudamérica se encuentra en Colombia, Costa Rica, Ecuador, Guatemala, Guyana,
Guyana Francesa, Panamá, Perú, Venezuela, y Surinam (Moran, 1995; Large & Braggins,
2004). Esta especie también sirve como sustrato natural para numerosas plantas epífitas;
helechos (Trichomanes capillaceum L., y T. reptans Sw.) y angiospermas como Peperomia
cuadrifolia (L.) (Piperaceae), Syngonium Schott. (Araceae) (Mehltreter et al., 2000).
El cultivo de tejidos vegetales se puede considerar como una alternativa a implementar
para lograr la elaboración de planes de manejo sostenible de estas tres especies; pues permite
establecer una rápida propagación masiva de las especies vegetales además que puede
constituir un medio para la preservación de germoplasma. Así, desde hace algunas décadas,
se ha empleado exitosamente el cultivo in vitro en helechos para determinar los factores que
influyen en el desarrollo gametofítico (hormonas, sales, carbohidratos, radiación, luz,
temperatura, medios de cultivo, humedad, sustrato, presión osmótica, entre otros.) (Stokey,
1930; Kato, 1963; Evans & Bozzone, 1977; Whittier, 1964; Raghavan, 1989). Se ha utilizado
además para el estudio de otros eventos fisiológicos y reproductivos como germinación,
elongación, gametogénesis y singamia (Furuya, 1985; Agnew et al.,1984; Raghavan, 1992;
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Racusen, 2002). En la actualidad existen investigaciones morfogenéticas cuyo objetivo es la
propagación de helechos ornamentales y/o sujetos a protección especial o en peligro de
extinción (Finni & van Standen, 1987; Kwa et al., 1997; Fernández & Revilla, 2003).
El presente trabajo pretende aportar conocimientos básicos, nuevos y originales a fin
de contribuir al conocimiento de nuestros recursos bióticos, así como proponer nuevas
herramientas para la conservación de A. firma, C. divergens var. tuerckheimii y P. areolatum
mediante la exploración de su potencial regenerativo in vitro, estableciendo las condiciones
bióticas y abióticas del cultivo de esporas y gametofitos; así como la formación de esporofitos
por organogénesis apogámica, en aras de preservar estas especies para el aprovechamiento
de las generaciones futuras; proporcionando material vegetal para estudios posteriores de otra
índole.
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2.- Objetivos:
2.1.- Objetivo general: Establecer un protocolo de propagación in vitro de gametofitos
en A. firma, C. divergens var. tuerckheimii y P. areolatum.
2.2.- Objetivos particulares:
Definir un procedimiento de desinfección de esporas que permita el
establecimiento y germinación en condiciones in vitro.
Explorar y comparar el potencial morfogenético de la fase gametofítica de
helechos en condiciones in vitro.
Examinar el efecto de algunos reguladores del crecimiento en los gametofitos
de helechos cultivados in vitro.
Explorar el efecto de la sacarosa en la regeneración de gametofitos.
3.- Hipótesis:
• Al someter las esporas de helechos a diferentes tratamientos de desinfección, se
espera encontrar respuestas diferentes; de la comparación de los resultados para las
tres especies estudiadas se puede definir un procedimiento de desinfección.
• Sí el gametofito asexuado e inmaduro, como estructura monoestratificada se encuentra
formada por células poco diferenciadas, totipotenciales; entonces se pueden regenerar
gametofitos al seccionar o aislar células, con la posibilidad de formar numerosos
gametofitos a partir de uno solo (cultivo monospórico).
• Sí las secciones del gametofito se someten a un pulso de auxina, como 2,4-D ( Acido
2, 4 – diclorofenoxiacético), entonces se puede promover el desarrollo de nuevos
centros meristemáticos que originarán gametofitos completos y maduros,
incrementando su capacidad regenerativa.
• Si se ha determinado que la sacarosa induce la formación de esporofitos apogámicos;
entonces al enriquecer el medio de crecimiento gametofítico con sacarosa se
desarrollarán esporofitos apogámicos.
• Si se ha comprobado que el ACC1 es un precursor del etileno; y éste es un agente
inductor de apogamia en los gametofitos de helechos; entonces se pueden obtener
esporofitos apogámicos al añadir ACC al medio de cultivo.
 
1 Ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico
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4.- Justificación:
El presente estudio pretende establecer las condiciones adecuadas para el cultivo in
vitro de A. firma, C. divergens y P. areolatum, con la finalidad de establecer un protocolo de
regeneración que brinde alternativas para el aprovechamiento sustentable y la conservación de
estas especies, ya que los helechos arborescentes A. firma y C. divergens var. tuerckheimii son
especies que crecen casi exclusivamente en BMM2, están incluidas en la Norma Oficial
Mexicana (NOM-ECOL-059-2001) y en los apéndices del CITES como especiesen peligro de
extinción, debido a la colecta inmoderada y pérdida de hábitats. Ambas especies desarrollan
raíces adventicias en donde naturalmente crecen numerosas plantas epifitas; A. firma tiene
además propiedades antihemorrágicas. Phlebodium areolatum es una planta pionera
formadora de suelo; su potencial uso medicinal y su reconocido uso ornamental; lo hacen, junto
con A. firma y C. divergens, una especie importante para incluirla en programas de
propagación y conservación.
 
2 Bosque mesófilo de montaña, bosque de niebla.
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5.- Marco teórico:
5.1.- Importancia de los Bosques Mesófilos de Montaña (BMM)
México se considera como país megadiverso; ocupa el cuarto lugar en biodiversidad
(Toledo, 1994). En él se pueden encontrar diversos ecosistemas dentro de los cuales se
incluye a uno de los más ricos y mayormente amenazado: el Bosque Mesófilo de Montaña
(BMM). Este ecosistema ocupa tan sólo el 1 % de la superficie total de México, se distribuye de
manera discontinua por la Sierra Madre Oriental, desde el suroeste de Tamaulipas hasta el
norte de Oaxaca y Chiapas; y por el lado del Pacífico desde el norte de Sinaloa hasta Chiapas,
aunque se encuentra también en pequeños manchones en el Valle de México. A pesar de la
poca superficie en la que se extiende, se estima que lo constituyen de 2,500 a 3,000 especies
de plantas que aproximadamente corresponde del 10% al 12% de todas las especies vegetales
de México (Rzedowski, 1978). Estas áreas también proporcionan varios servicios ambientales
como son la captación de agua por la alta presencia de nubes y neblina, que permite aumentar
la cantidad del líquido disponible en sus áreas de influencia entre un 7 y un 158% (Williams-
Linera & Robert, 2000).
Formando parte del BMM, se encuentra un grupo de plantas originarias hace más de
140 mda., los helechos arborescentes (Stewart & Rothwell, 1993). Estos son plantas
vasculares cuyo ciclo de vida presenta alternancia de generaciones de fases heteromórficas: la
fase esporofítica y la fase gametofítica. Durante la fase esporofítica (diploide) se producen
estructuras reproductoras llamadas esporas dentro de los esporangios, estos, agrupados en
soros. El enorme número de esporas (a veces hasta 50 millones por cada individuo) constituye
el medio de reproducción y dispersión de estas plantas; lo que nos motiva a pensar que
probablemente no tendrían problemas reales de extinción. Sin embargo, las condiciones
requeridas para la germinación y la vulnerabilidad en el establecimiento de las primeras fases
del desarrollo, además de la baja tasa de germinación y de desarrollo; aunado a la tala de
ejemplares y a la pérdida de hábitats; constituye una amenaza real para la permanencia de
estas especies en nuestros ecosistemas (Riba, 1978).
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5.2.- Helechos Arborescentes, su estatus y explotación
La forma biológica arborescente se circunscribe dentro de las familias Cyatheaceae
Kaulf. y Dicksoniaceae (C. Presl) Bower; considerados de gran importancia ecológica,
económica y social. Se les considera como indicadores biológicos de localidades de BMM poco
o nada perturbados y se incluyen en la Norma Oficial Mexicana como taxa sujetos a protección
especial, raros o en peligro de extinción.
Estas plantas se utilizan como ornato, lo que propicia que se coticen a precios muy
elevados, principalmente en los “mercados negros” o mercados informales. Además presentan
la peculiaridad de desarrollar una gruesa capa de raíces adventicias entrelazadas alrededor del
tronco, conocido como “pesma”, “cola de mico”, “rabo de mico”, “pelma”, ”ocopetate”,
“maquique”, entre otros; con una gran capacidad de retención de humedad; esta estructura
constituye un sustrato ideal para el desarrollo de un elevado número de plantas epifitas, como
bromelias, orquídeas (Riba, 1978); pero destaca por su estatus en peligro de extinción
Psilotum, planta que crece casi exclusivamente en el maquique (Ernesto Velázquez, Lab de
Plantas Vasculares, F. C. UNAM Com. Pers.).
También son materia prima para la elaboración de artesanías como macetas, adornos
y otros artículos de uso doméstico; tal es el caso de varias comunidades rurales y suburbanas
del estado de Veracruz (dentro de la sierra de Chinconquiaco) y Puebla (Teziutlán y
particularmente en Cuetzalan) (Riba, 1978; Robledo & Arias, 2001). El principal obstáculo para
la conservación de estas plantas es la constante pérdida de hábitats por el cambio de uso de
suelo y por el establecimiento de potreros en lugares donde se distribuyen estos helechos
(Pérez-García & Reyes, 1993; Riba, 1998; Sánchez & Barba, 2005).
En México no existen investigaciones que relacionen los estados actuales de
conservación y la diversidad de los grupos de helechos arborescentes, que permitan proponer
a mediano y largo plazo una alternativa o estrategia de manejo sostenible de este recurso, y
otros, que ofrece el BMM; ante esto, se realizó en noviembre de1999, el Encuentro Nacional de
BMM en San Cristóbal de las Casas, Chiapas; en donde se determinaron las prioridades de
conservación de zonas de BMM y se expuso la necesidad de la conservación ex situ; y la
búsqueda de medios de propagación de especies de BMM.
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5.3.- Ciclo de vida de los helechos terrestres:
Los helechos se reproducen mediante esporas y presentan un ciclo de vida con
alternancia de dos generaciones independientes y heteromórficas; la esporofítica (2n) y
gametofítica (n) (Tejro-Díez & Mickel, 2004).
La fase esporofítica tiene un rizoma rastrero escamoso a partir del cual se originan las
hojas; éstas son enteras, pinnatífidas, pinnadas, o con más divisiones; deciduas y por el envés
de ellas se producen mediante procesos meióticos, estructuras reproductoras llamadas
esporas; contenidas dentro de los esporangios, agrupados en soros. La producción de
numerosas esporas constituye el principal medio de dispersión de estas plantas y contribuye en
la colonización de diferentes ambientes. La espora al germinar da origen a la fase gametofítica
(haploide) representada por un diminuto cuerpo membranoso, acorazonado llamado prótalo en
el cual se producen los gametangios (anteridios y arquegonios).
La producción de esporas con la reducción del número cromosómico, constituye el
inicio de la fase gametofítica, caracterizado por su estructura talosa, representada por el
gametofito o prótalo formado a partir de la germinación de la espora.
El gametofito presenta tres fases en su desarrollo; filamentosa, bidimensional y
cordiforme; determinadas por el tipo de crecimiento y su morfología. En él se desarrollan los
gametangios, productores de los gametos que mediante la fecundación dan lugar al cigoto,
formador del embrión o joven esporofito, que al desarrollar raíces, rizoma y hojas provoca que
el gametofito se marchite. La fecundación de la oosfera (gameto femenino) por un anterozoide
(gameto masculino) se nombra “singamia” y mediante él se produce el restablecimiento de la
diploidía con el subsiguiente desarrollo de un embrión que dará origen a una nueva planta o
esporofito (Jones, 1987).
La fase esporofítica es la dominante conspicua y perenne, con la función de dispersión;
mientras que la fase gametofítica es insconspicua y en ella se realiza la singamia.
La mayor distribución de los helechos se encuentra en las zonas tropicales y
subtropicales como en los Bosques mesófilos de montaña (BMM).
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5.4.- Esporas de los helechos:
Las esporas de los helechos han sido objeto de diversos estudios, primero en
investigaciones morfológicas y del desarrollo (Tryon & Lugardon, 1991). Sin embargo, la
primera referencia del cultivo exitoso de esporas de helechos se realizó en 1699 por Morison
en “Plantarum Historiae Universalis Oxoniensis Pars Tertia”, posteriormente Lindsay en 1794
detalló la germinación de las esporas. Los trabajos de descripcionespalinológicas y del interés
en los helechos continuaron durante los siglos XIX y XX; durante éste último se dió un
redescubrimiento de la flora pteridológica con un incremento de las investigaciones en cuanto a
patrones de germinación; morfología y sistemática, entre otras (Riba et al., 2000).
El método de obtención de las esporas se realiza mediante la sección de los
fragmentos de hojas fértiles o pinnas con esporangios maduros y cerrados; las cuales son
colocadas en sobres de papel o cajas de petri (Pérez-García & Riba, 1982) cerradas a
temperatura ambiente para su natural liberación. De Fossard (1976) recomienda limpiar las
hojas mediante una atomización directa de agua, eliminando esporas extrañas. El contenido
del sobre o de la caja se tamiza en una malla Mont-Inox No. 200 de 0.074 mm de diámetro,
para eliminar los restos de esporangios e indusios (Mendoza et al., 1997, Mendoza y Pérez-
García, 2003).
Phlebodium araneosum (Martens & Galeotti) Mickel & Beitel (sinónimo en activo de P.
Areolatum), P pseudoaureum (Cav.) Lellinger y P. decumanum J.Sm., poseen esporas
monoletes, elipsoides y con coloración áurea; la exospora posee dos estratos, con una
perispora usualmente delgada. La ornamentación que presenta la superficie es de tipo
verrugosa y papilada (Pérez-García et al., 1998; Meza et al., 2006). A. firma y C. divergens var.
tuerckheimii poseen esporas triletes, difieren en la ornamentación que presentan; muy fina y
papilada, respectivamente.
5.5.- Germinación de esporas en condiciones naturales:
Al madurar las esporas, el indusio y los esporangios se abren por desecación,
permitiendo la dispersión de las mismas por viento. La germinación se origina por la presencia
de agua y la incidencia de luz sobre las esporas (Haupt & Psaras, 1989). A pesar de que estos
helechos pueden producir millones de esporas, cada una con la capacidad de generar un
nuevo helecho, muchas de estas esporas no germinan por la alta especificidad de las
condiciones de germinación; o si lo logran, las primeras etapas del gametofito son altamente
vulnerables a los cambios en el microambiente, limitando su sobrevivencia (Riba, 1978;
Raghavan, 1992).
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Se han identificado nueve tipos de germinación, diferenciados por el plano de división
de la célula y la elongación celular (Nayar & Kaur 1969), para P. araenosum, P pseudoaureum
y P. decumanum se cita el tipo Vittaria (Pérez-García, et.al. 1998), caracterizado porque la
primera división celular ocurre perpendicular al eje proximo-distal cercana a la cara proximal,
originando el rizoide; y la segunda división perpendicular a la primera, formando el protonema,
encontrado en ángulo recto al rizoide (Raghavan, 1989); para A. firma y C. divergens var.
tuerckheimii se cita el tipo Cyathea, caracterizado porque la primera división celular ocurre en
paralelo al eje proximo-distal, originando el rizoide; y la segunda división perpendicular a la
primera, formando el protonema, encontrado en ángulo recto al rizoide (Pérez-García, 1988).
5.5.1.- Bancos de esporas
Algunas esporas quedan infiltradas en la superficie porosa del suelo; por debajo de la
vegetación y en condiciones de poca luminosidad; esto provoca un almacenamiento de “banco
de esporas” en el suelo (Camloh, 1999; López, 2003, Ramírez-Trejo et al., 2004).
Estos bancos de esporas son componentes bióticos que funcionan como elementos de
dispersión en quiescencia o inactividad; sólo son afectados por depredación, pérdida de
viabilidad o germinación; incrementando o disminuyendo sus elementos cada año. A pesar de
esto se les considera como una estrategia reproductiva de muchas especies, pues pueden
aprovechar los disturbios que generen condiciones favorables para el desarrollo y
establecimiento de gametofitos. Al contar con fitocromos (germinación fotoblástica); la
activación del fitocromo Pr por las longitudes de onda de 600-700nm activa el proceso de
germinación; y con la simple remoción de la vegetación se puede inducir la germinación de las
esporas depositadas en el suelo; desarrollando poblaciones de gametofitos que aumentarán el
número de esporofitos y las probabilidades de acoplar diferentes genotipos a la población
(Milberg, 1991 cit. en López, 2003; Ramírez-Trejo et al., 2004). Con la germinación de la
espora se inicia el desarrollo del gametofito.
La germinación inicia con la entrada de agua a la espora y la migración del núcleo
hacia el polo proximal, en donde se realiza la primera mitosis que origina al rizoide (célula
pequeña) y a una célula grande que se divide para formar el protonema (célula que originará el
cuerpo del gametofito). En este estado tricelular concluye la germinación; sin embargo, es un
proceso en el que intervienen un gran número de factores, como la luz (cuantitativa y
cualitativamente), humedad, composición del suelo, temperatura, pH, entre otros (Raghavan,
1989).
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5.6.- Morfología de Cyatheaceae
El esporofito se caracteriza por tener un rizoma erecto o tallo, que puede llegar a medir
hasta 15 m, alrededor presenta cicatrices producidas por las bases de los pecíolos y en
algunas especies, como A. firma y Sphaeropteris horrida (Liebm) R.M. Tryon, se presenta el
desarrollo de numerosas raíces adventicias en su base, formando el “maquique”, sustrato
natural para numerosos helechos y plantas epífitas.
Tienen grandes hojas en el ápice del tallo; presentan soros medios en el envés de la
lámina, con receptáculos elevados y globosos o subcilíndricos; el ápice de los tallos y bases de
los pecíolos densamente escamosos. Las esporas son triletes, tetrahédricas o globosas
aclorofílicas.
5.6.1.- Distribución y Hábitat
Género Distribución
Alsophila R. Br. Se distribuye en los trópicos, en bosques mesófilos de montaña (BMM), con
235 especies en el mundo, de las cuales 3 se encuentran en México
(Hoshizaki & Moran, 2001; Mickel & Smith, 2004).
Cyathea Sm. Posee una amplia distribución en los trópicos; son principales componentes
de BMM, con 115 especies en el mundo, de las cuales 8 se encuentran en
México (Moran & Riba, 1995).
5.6.2.- Especies en estudio:
Clasificación Taxonómica según Moran & Riba (1995):
Clase: Polypodiopsida
 Orden: Cyatheales
Familia: Cyatheaceae Kaulf
Género: Alsophila R. Br.
Especie: Alsophila firma (Baker) D. S. Conant
Género: Cyathea Sm.
Especie: Cyathea divergens Kunze var. turckheimii (Maxon) R. M.
Tryon
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5.6.3.- Descripción de las especies:
Según Tryon (1995)
5.6.3.1.- Alsophila firma (Baker) D.S. Conant, J. Arnold Arbor. 64: 372 (1983). Hemitelia firma
Baker, J. Bot. 15: 161(1877). Holotipo: Ecuador, Sodiro s.n. (K).
Sinónimos: Alsophila costalis H. Christ, A. furcata H. Christ, A. tenerifrons H. Christ,
Cyathea arida H. Christ, C. firma (Baker) Domin, C. gemmifera H. Christ, C. mexicana Schltdl.
et Cham., C. patellaris H. Christ, C. trejoi H. Christ, Nephelea mexicana (Schltdl. et Cham.)
R.M. Tryon.
Helecho arborescente con rizoma erecto de 10 a 15 metros de alto, de 30 cm de
diámetro; pecíolo espinoso, con espinas de hasta 12 mm de largo, negras y curveadas;
escamas peciolares bicoloras, negras en la parte central y claras en el margen, con puntas
agudas y abundantes setas marginales largas. Láminas de 3 a 4 m de largo, 2 pinnadas
pinnatífidas, firmes a subcoriáceas; pinnas pecioluladas de 1 cm, venas simples, ápices de la
pinna agudos-ascendentes, crenulados, con márgenes recurvados; pelos en cóstulas y
segmentos de venas medias sobre la cara abaxial; costulas con pequeñas escamas negruscas
no buladas, segmentos de venas medias glabros en la superficie adaxial; pero con pelos y
escamas en la superficie abaxial; presenta soros medios con indusio globoso esferoidal y
número cromosómico 2n=138.
5.6.3.2.- Cyathea divergens Kunze var. tuerckheimii (Maxon) R.M. Tryon, Contr. Gray Herb.
206: 56 (1976). Cyathea turckheimii Maxon, Contr. U.S. Natl. Herb. 13: 4 (1909). Isotipo:
Guatemala, von Türckheim1645 (MO).
Helecho arborescente con tallo erecto de hasta 12 m; frondas de hasta 4 m de largo;
pecíolo pardo, poco a muy espinoso, las espinas oscuras, filosas, escamas largas, bicoloras,
pardas oscuras con el margen claro; pecíolo densamente escamoso con caspilla clara; lámina
2-pinnado-pinnatífida; pinnas pediculadas, el pedículo hasta 1-2 cm, generalmente más corto
que el ancho de las pínnulas basales; pínnulas 7-14 x 1-3 cm, pediculadas, el pedículo 2-5 mm,
generalmente más corto que el ancho de los segmentos basales de las pínnulas.
5.7.- Morfología de Polypodiaceae
Plantas generalmente epífitas, ocasionalmente terestres o rupícolas, sus rizomas son
generalmente dorsiventrales, con 2 series de hojas en la superficie dorsal, larga a cortamente
rastreros, escamosos, con hojas articuladas a filopodios cortos; al caer no dejan cicatriz. Soros
generalmente redondos.
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5.7.1.- El Género Phlebodium (Mikel & Smith, 2004)
Phlebodium (R. Br.) J. Sm. es un género taxonómicamente conflictivo interpretado
como segregado de Polypodium y al que se le han atribuido diferentes valores taxonómicos; se
distribuye en los trópicos y subtrópicos de América; comprende ca. de tres o cuatro especies,
según el criterio de los autores: P. areolatum (Humb. & Bonpl. ex Willd.) J. Sm., P. aureum (L.)
J. Smith y P. decumanum (Willd.) J. Sm, según Mickel & Smith (2004) ó P. aureum, P.
decumanum, P. araneosum (M. Martens & Galeotti) Mickel & Beitel y P. pseudoaureum (Cav.)
Lellinger), según Moran (1995). Su característica diagnóstica por la cual se le distingue de
Polypodium es la ocurrencia de dos nérvulos, incluidos en la aréola abasteciendo al soro, en
vez de uno. Sin embargo, algunas de sus especies se han clasificado como parte de Pleopeltis
Humb. & Bonpl. ex Willd. (Presl, 1836); el género mismo ha sido caracterizado como
subgénero de Polypodium L. (Christensen, 1934), como sinónimo de él (Tryon & Tryon, 1982;
Smith, 1995; Meza et al., 2006).
Phlebodium araneosum se distingue de las demás especies por la presencia de
escamas en el envés de la lámina y por presentar soros en una sola línea entre la costa y el
margen. P. pseudoaureum se caracteriza por poseer soros de la misma forma que P.
araneosum, pero carece de escamas. P. aureum y P. decumanum presentan más de una línea
de soros; 2-3 y 2-7, respectivamente (Moran, 1995).
5.7.2.- Distribución y hábitat
Phlebodium es un género neotropical que se encuentra en México en los estados de
Chihuahua, Colima, Chiapas, Distrito Federal, Durango, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo,
Jalisco, México, Michoacán, Morelos, Nayarit, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, Querétaro, San
Luís Potosí, Sinaloa, Tamaulipas y Veracruz. Sus hábitos son tanto epífita, rupícola o terrestre
(Mickel & Smith, 2004).
5.7.3.- Potencial medicinal de Phlebodium
El uso tradicional en Centroamérica de especies vegetales como medicina es inherente
a la tradición e historia de los pueblos. Sobre el género Phlebodium, se pueden encontrar
diversas referencias de uso tradicional, bajo el nombre de calaguala (Moran, 1995; Zlotnik,
1987); y actualmente en estudios de uso potencial medicinal en centro América, se reporta la
utilización de especies del género en la curación de dolencias y males con resultado
alentadores contra enfermedades dérmicas como la psoriasis (Gupta, 2006), vitiligo
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(Mohammad, 1989), lupus, y algunos carcinomas (Horvath et al., 1967; Corrales et al ., 1972,
1974, 1983).
En México, a pesar de la gran tradición herbolaria, hay pocas referencias y estudios
sobre la utilización de este recurso biológico; y mientras Vásquez-Dávila (2001) reporta su uso
antipirético en comunidades chontales de Tabasco, otros autores citan otros usos como
antitusígeno (Fernández et al., 2001), cicatrizante (Tuominen, 1992; Abigail Aguilar, Herbario
IMSS, Com. Pers.) y como remedio para afecciones renales (Zolla, 2007). Quizá esta vasta
utilización médica en nuestro país, sea la razón por la que Moran (1995) mencione, en la Flora
mesoamericana, una consideración al género Phlebodium como materia prima para “aliviar
trastornos renales y otros males”.
La mayoría de los estudios etnobotánicos han sido realizados en Honduras y
Guatemala, y se enfocan más al potencial inmunoregulador; utilizado más contra afecciones
dérmicas (psoriasis, lupus, y pigmentaciones anormales, en general), no se ha descartado su
uso antitumoral y se ha probado con buenos resultados en leucemia y en algunos tipos de
carcinomas (Cáceres, 1996). Cabe mencionar que debido a la incertidumbre en la clasificación
de la especie muchos de los reportes de uso se encuentran errados, pues aunque
comúnmente en Honduras y Guatemala la nombran como P. aureum ó Polypodium leucatomos
Poir. (sinónimo de la primer especie); en realidad, tomando en cuenta el trabajo de Mickel &
Smith (2004) la especie usada es P. areolatum o P. decumanum; ya que el área de distribución
de P. aureum sólo comprende en las antillas y Florida; aunque Meza y colaboradores (2006) la
citan para Argentina, se requiere de mayores estudios por lo conflictivo del género.
Es posible que el uso antitumoral se realice también en México sin embargo es
necesaria la revisión de ejemplares de herbario, así como la promoción de estudios
etnobotánicos, para encontrar antecedentes importantes de este uso.
5.7.4.- Estatus y aprovechamiento
Aunque en principio el uso de P. areolatum fue artesanal y de consumo local,
actualmente se preparan extractos líquidos estandarizados del rizoma, se venden en
Centroamérica bajo los nombres Armaya® Difur®, Regender®; fabricados por laboratorios
CENTRUM, Biocaribe y Alacanhan, respectivamente; y los extractos Inmuno-C® y Kalawalla®
fabricados por los laboratorios OHC. La fuente de plantas de estos laboratorios se desconoce,
salvo en el caso de los laboratorios OHC, quienes mencionan la posesión de extensos cultivos
en Honduras. En México sólo se conoce su uso artesanal y local; esto puede ser a raíz que los
estudios etnobotánicos de helechos mexicanos no han sido suficientemente explorados.
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5.7.5.- Morfología de Phlebodium
El esporofito se caracteriza por tener un rizoma rastrero de color blanquecino, con
escamas concoloras anaranjadas, fronda monomorfas, articuladas; pecíolo pardo a estramíneo
acanalado abaxialmente; hojas profundamente pinnatífidas a pinnatisectas con los senos
redondeados, ampliamente oblongos a subdeltados ; pinna amplia, entera, cartácea a coriácea,
usualmente glabra, frecuentemente glauca, venación reticulada, hilera de areolas costales sin
vénulas libres incluidas, areolas adyacentes con o sin vénulas libres incluidas; soros redondos,
exindusiados sobre la areola con las vénulas incluidas, en una a siete hileras entre la costa y
los segmentos marginales, parafisos ausentes, esporangios glabros; esporas bilaterales,
tuberculadas. Numero cromosómico x=37.
.
5.7.6.- Especie en estudio:
Clasificación Taxonómica según Mickel & Smith (2004):
Clase: NCPA3
Orden: NCPA
Familia: Polypodiaceae Bercht. & J. Presl
Género: Phlebodium (R. Br.) J. Sm.
Especie: Phlebodium areolatum (Humb. & Bonpl. ex Willd.) J.
Sm.
5.7.6.- Descripción de Phlebodium areolatum (Humb. & Bonpl. ex Willd.) J. Sm., J. Bot.
(Hooker) 4: 59. 1841.
Sinónimos:
Polypodium areolatum Humb. & Bonpl. ex Willd. Sp. Pl., ed. 4, 5(1): 172. 1810.
Goniophlebium areolatum (Humb. & Bonpl. ex Willd.) C. Presl, Suppl. Tent. Pterid. 186. 1836.
Polypodium aureum L. var. areolatum (Humb. & Bonpl. ex Willd.) Baker in Hooker & Baker, Syn.
Fil. 347. 1867. Tipo: Venezuela. Cumaná, Humb. & Bonpl. s. n. B-Willd. 19645 .
Polypodium araneosum M. Martens & Galeotti, Mém. Foug. Mexique 33. 1842.
Phlebodium aureum (L.) J. Sm. var. araneosum ( M. Martens & Galeotti) L. D. Gómez, Brenesia
18: 163 1981. Phlebodium araneosum (M. Martens & Galeotti) Mickel & Beitel, Mem. New York
Bot. Gard. 46:277. 1988. Tipo: México, Oaxaca, Villa Alta,Galeotti 6460
Polypodium fulvum M. Martens & Galeotti, Mém. Foug. Mexique 33. 1842. Tipo:
México. Oaxaca: “alrededores de Villa Alta,“ “Monte de Tanga,” Galeotti 6463
 
3 Jerarquía taxonómica no considerada por los autores de la clasificació taxonómica
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Polypodium glaucinum M. Martens & Galeotti, Mém. Foug. Mexique 33. 1842. Tipo:
México. “El Sabino después de Ixmiquilpan, Galeotti 6430
Polypodium sporocarpum Willd., Sp. pl. 5: 171. 1810. Nom. Illeg. Tipo: B-Willd 19644
Phlebodium aureum (L.) J. Sm. var. areolatum (Humb. & Bonpl. ex Willd.) Farw., Amer.
Midl. Naturalist. 12: 296. 1931.
Helecho epífito, epipétrico o terrestre con rizoma rastrero de 4 a 10 mm de diámetro,
pruinoso; con escamas de 6 a 10 mm de largo, rojizas a pardas, lanceoladas, cada una con
una base redondeada peltada y márgenes denticulados. Hojas de 20 a 90 cm de largo; pecíolo
de _ a _ de la longitud de la hoja, estramineo a pardo, glabro; profundamente pinnatífida,
ampliamente oblonga a ovado-deltada, de 20 a 40 cm de ancho; pinnas de 4 a 13 pares, de 10
a 30 mm de ancho, linear oblonga a linear deltada, obtusa a acuminada, glabra, aunque a
veces glauca, márgenes enteros, ocasionalmente serrulados o crenados; venas reticuladas con
dos vénulas, o a veces una sola, incluidas en las aréolas; soros redondos, mediales a
submediales, una sola hilera a cada lado de la costa, 2n=74.
5.8.- Cultivo in vitro
La germinación de esporas de helechos en condiciones naturales es sumanente difícil
de observar debido a que el tamaño promedio de ellas varía de los 60 a los 100 m (Banks,
1999 cit in López, 2003). Por ello se han empleado diversas técnicas asépticas de cultivo en
laboratorio; utilizando medios nutritivos artificiales, compuestos por macro y micronutrientes,
aminoácidos y vitaminas, hormonas o reguladores del crecimiento, compuestos orgánicos,
carbohidratos y eventualmente un agente gelificante (Seeman, 1993). Es gracias a estas
técnicas, de cultivo de tejidos o cultivo in vitro, que se conoce la influencia de pH, luz,
carbohidratos y diversas sustancias durante la germinación de la espora, y el desarrollo
posterior de los gametofitos de helechos. Esto es, debido a que en el cultivo in vitro se exige un
control absoluto del ambiente, tanto físico como químico; además, se requiere un nivel óptimo
de asepsia (Toledo, 2004).
El sustento de esta tecnología es la capacidad totipotencial de las células vegetales;
este término se aplica ya que todas las células de una planta tienen la capacidad de regular la
división celular y diferenciación para crecer y lograr regenerar una nueva planta (Teutonico &
Knorr, 1984). Así, el cultivo de tejidos, mediante componentes del medio nutritivo y con la
adición de reguladores de crecimiento, se induce un estrés al explante para obtener una
respuesta determinada. Dicho estrés se logra mediante factores físicos; fotoperíodo, imbibición,
sustratos o medios nutritivos, entre otras; o por factores químicos; reguladores de crecimiento,
carbohidratos, y diversas sustancias o extractos naturales (Calderón, 2007)
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Los cultivos in vitro se pueden iniciar a partir de cualquier parte de la planta (tallo, hoja,
semilla, fruto, embrión, cotiledones, raíz, etc.). Comúnmente se seleccionan aquellas partes de
la planta que se encuentran en división activa, o con una baja especialización o diferenciación
celular, como las regiones meristemáticas (Ochoa-Alejo,1990).
El método más eficiente para la producción masiva de plantas in vitro es la
embriogénesis somatica (Gómez, 1998); que es la formación de un embrión sin la necesidad
de la fusión de gametos. En la naturaleza suele presentarse este fenómeno, llamado también
apomixis o embrionía adventicia (en angiospermas; Strasburger, 1878) y apogamia (en
helechos; Farlow, 1874). Los embriones somáticos son estructuras bipolares con un eje radical-
apical que no poseen conexión vascular con el tejido del cual se originaron; son capaces de
originar plantas normales y pueden originarse directa o indirectamente (mediante formación de
callo) a partir del explante (Gómez, 1998).
Otro método utilizado es la llamada organogénesis, que consiste en la formación de
novo de órganos (raíces o brotes adventicios) en los explantes cultivados. Los brotes
adventicios son estructuras similares a una yema y tienen la capacidad de orifinar una nueva
planta después de elongarse y formar raíces. La organogénesis también puede ser directa o
indirecta, al igula que la embriogénesis; y se origina mediante el desarrollo de meristemoides.
Éstos se encuentran compuestos por células pequeñas e isodiamétricas de pared celular
delgada, con varias vacuolas periféricas y un núcleo grande en posición central; y a partir de
ellos se originan las raíces o brotes (Pérez et al., 1999).
Esta técnica permite el incremento de la producción de plántulas, por clonación, con la
ventaja de producir plantas libres de patógenos. Se considera que en el mundo se producen in
vitro cerca de 500 millones de plantas (ornamentales, agrícolas e industriales, entre otras)
(Chávez, 2005). Además se puede inducir en los explantes de plantas útiles la producción de
metabolitos secundarios de interés farmacológico (véase cuadro 1) (Pierik, 1990).
Cuadro 1.- Metabolitos secundarios o sustancias obtenidas en especies cultivadas in vitro
Especie Metabolito o sustancias
Dioscorea deltoides Wall. Diosgenina
Coffea arabica L. Cafeína
Coptis japonica Berberina
Macleaya cordata (Willd.) R. Br. Protopina
Catharanthus roseus (L.) G. Don Ajmalicina e isómeros
Coleus blumei Benth. Acido rosmarínico
Panax ginseng C.A. Mey. Gingsenoides
Lithospermum erythrorhizon Siebold & Zucc. Chiconina
Morinda citrifolia L. Antraquinonas
Nicotiana tabacum L. Nicotina
Nicotiana tabacum L. Ubiquinona 10
Cassia tora L. Antraquinonas
Catharanthus roseus (L.) G. Don Catarantina
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Cuadro 1 (continuación)
Especie Metabolito o sustancias
Digitalis lanata Ehrh. Digoxina
Glycine max (L.) Merr. Fenólicos
Capsicum frutescens L. Capsaicinoides
Solanum aviculare G. Forst. Esteroides
Daucus carota L. Digoxina
(modificada de Pérez et al., 1999).
La utilización de los sistemas de propagación in vitro permite obtener en un corto
período de tiempo una gran cantidad de plantas, es por ello que desde hace 25 – 30 años se
comenzó a utilizar en programas de conservación ex situ de plantas amenazadas, raras o en
peligro de extinción (véase cuadro 2); y se ha incrementado en la actualidado en la
agroindustria, en cultivo de especies comestibles, medicinales o en propagación de especies
ornamentales (Rout et al., 2006). Además que permite el mejoramiento de cultivos mediante la
transferencia de genes y la selección de linajes a partir de la variación somaclonal (Pérez, et
al., 1999; Goodman et al., 1987). Aunque esta tecnica se encuentramejor estudiada y aplicada
en angiospermas y gimnospermas; en donde se ha logrado la obtención de plantas resistentes
a enfermedades (véase cuadro 3) y la obtención de metabolitos secundarios de interes
industrial-farmacológico, su utilización en helechos se ha incrementado en los últimos años.
Cabe destacar que la planta más propagada por este sistema es el helecho del género
Nephrolepis (véase cuadro 4).
Cuadro 2.- Especies amenazadas, ornamentales o con uso potencial, cultivadas in vitro .
Especie Importancia Referencia
Cephalocereus
apicicephalium E.Y.
Dawson
Cactácea nativa de México, amenazada. Saucedo, 2006
Cyathea australis (R.
Br.) Domin
Helecho arborescente, ornamental ;
especie amenazada
Katarzyna &
Rybczyñski, 1995
Echinocereus
pentalophus (DC.) Haage
Cactácea nativa de México, amenazada. Saucedo, 2006
Platycerium bifurcatum
(Cav.) C. Chr.
Helecho ornamental Teng & Teng, 1997
Picea chihuahuana
Martínez
Frutal, endémica de México, en peligro de
extinción.
Sánchez, 2001
Dicksonia berteroana
(Colla) Hook.
Helechoarborescente, especie
amenazada
Toledo, 2004
Oncidium stramineum
Bateman ex Lindl.
Orquíeda ornamental en peligro de
extinción
Rangel, 1995
Platycerium
coronarium (Mull.)
Desv., P. ridleyi Christ.
Helechos ornamentales Wee et al., 1992
Ariocarpus retusus
Scheidw.
Cactácea en peligro de extinción Olguín, 1994
Dicksonia sellowiana
(Presl.) Hook.
Helecho arborescente, especie
amenazada
Fiilippini et al., 1999
Salvia elegans Vahl Potencial industrial, medicinal. Barrón, 1996
Pelecyphora
strobiliformis (Werd.) Fric
& Schelle
Cactácea. Flores, 2004
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Cuadro 2 (continuación)
Especie Importancia Referencia
Tillandsia macdougallii
L.B. Sm.
Bromelia amenazada Alejandra Martínez,
JB-IB-UNAM. Com.
Pers.
Euchile mariae (Ames)
Withner
Orquídea amenazada, endémica de
México.
Suárez, 2006
Cyathea caracasana
(Klotzsch) Domin.
Helecho arborescente, especie
amenacada
López, 2003
En el cultivo in vitro de gametofitos de helechos Fuentes et al. (2001) plantean que ante
los problemas de germinación y el desarrollo posterior, es menester de cada investigación
establecer el medio de cultivo apropiado para garantizar el crecimiento y desarrollo de los
prótalos en cada una de sus fases, hasta la obtención de esporofitos.
Cuadro 3.- Especies de importancia alimneticia o comercial, con reporte de transferencia de
genes mediante técnicas de cultivo de tejidos.
Especie cultivada Especie donante Característica
Avena sativa (avena) A. sterilis incremento del rendimineto de 25 a
30%
Beta vulgaris (remolacha
azucarera)
B. procumbens Resistencia al nemátodo de la
remolacha azucarera
Brassica napus (nabo sueco) B. campestris Resistencia al "pie gordo"
Cucurbita pepo (calabaza) C. lundelliana Resistenia al moho
Gossypium hirsutum (algodón) G. tomentosum Menor incidencia de pudrición de las
cápsilas por ausencia de nectarios
Gossypium hirsutum G. raimondii Resistencia a la roya
Lycopersicon esculentum
(tomate)
L. hirsutum Resistencia al chancro bacteriano
Lycopersicon esculentum L. peruviannum Resistencia a los nematodos
Lycopersicon esculentum L. peruviannum Carencia de nudos (facilita la cosecha
de fruta limpia sin tallos
Lycopersicon esculentum L. peruviannum Resistencia al VMT
Lycopersicon esculentum L. pimpinellifolium Resistencia a la raza 1 de Fussarium
causante de marchitez
Nicotiana tabacum (tabaco) N. glutinosa Resistencia al MVT
(Tomado de Goodman et al., 1987)
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Cuadro 4.- Plantas de maceta producidas en Holanda, principal productor mundial
Planta
cultivada
1983 1984 1985 1986 1987
Nephrolepis 7 921 630 8 306 700 10 101 350 11 194 900 12 500 300
Saintpaulia 5 371 250 4 400 000 4 389 904 3 715 000 3 950 500
Syngonium 9 300 162 550 242 490 603 500 1 594 200
Anthurium 269 040 400 000 898 700 1 747 000 1 255 000
Cordyline 493 300 578 150 604 500 783 000 1 040 700
Spathiphyllum 13 200 10 300 35 450 512 700 967 600
Ficus 390 000 330 000 161 500 148 000 488 000
Bromeliaceae 278 350 224 080 163 925 250 500 422 700
Alocasia -- 3 200 -- 180 000 195 000
Davallia 258 000 643 000 570 700 340 000 155 000
Caladium 20 000 -- -- 16 000 150 000
Calathea -- -- 240 10 000 120 650
Hortensia 124 000 145 000 105 000 51 000 120 000
Philodendron 6 341 180 29 550 16 500 114 800
Platycerium -- -- -- 36 200 75 000
Pellaea -- -- -- 4 500 50 000
Cryptanthus -- -- -- 38 504 44 066
Dieffenbachia -- 850 750 14 000 29 000
Aternanthera -- -- -- 7 000 21 000
Se muestra la producción anual desde 1983 a 1987. En negritas se muestran los helechos. (tomado de Pierik, 1990,
fragmento).
5.9.- Cultivo de esporas de helechos en condiciones in vitro:
El cultivo in vitro de esporas de helechos ha permitido la descripción y el estudio de
varios factores de los que depende la germinación y desarrollo gametofítico, como el tiempo de
almacenamiento, dormancia y quiescencia, luz y fotoperíodo, hormonas, humedad,
temperatura (Pérez-García & Riba, 1982), pH, gases, entre otros (Raghavan, 1989; Fernández
& Revilla, 2003). Se han elaborado varios trabajos de germinación en diferentes especies de
helechos, y con fines de estudios morfogenéticos en Cyathea y Dicksonia (Huckaby &
Raghavan, 1981), Cyathea delgadii Sternb. (Randi & Felipe, 1988), Lophosoria quadripinnata
var. quadripinnata (J.F. Gmel.) C. Chr. (Pérez-García et al., 1995) L. quadripinnata var.
contracta (Hieron.)R. M. Tryon et A. F. Tryon (Mendoza et al., 1997), Phanerophlebia C. Presl.(
Mendoza & Pérez-García, 2003), Metaxya rostrata (Kunth) C. Presl. (Pérez-García et al., 1994),
Niphidium crassifolium (L.) Lellinger (Reyes et al., 1996), Llavea cordifolia Lag (Reyes et al.,
2000), Microgramma nitida (J.Sm.) (Ramírez & Pérez-García, 1998), Pseudocolysis bradeorum
(Rosenst.) L. D. (Pérez-García et al., 2001), Arachniodes denticulata (Sw.) Ching (Mendoza et
al., 1999), Olfersia alata C. Sánchez et García Caluff y O. Cevina (L.) Kunze (Mendoza et al.,
2002), Woodwardia martinezii Maxon ex Weath y W. spinulosa M. Martens et Galeotii (Pérez-
García & Riba, 1993) y en la familia Cyatheaceae (Pérez-García, 1988). En estos estudios se
utilizó el medio Knopp para estudios de Dicksonia y Cyathea; y el medio Thompson para la
mayoria de las especies.
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De los anteriores estudios, las especies más emparentadas (Metaxya rostrata,
Metaxyaceae y L. quadripinnata; Lophosoriaceae) muestran la ausencia de fecundación a más
de 8 y 36 meses, respectivamente. Sin embargo, sí existe germinación y un desarrollo del
gametofito adulto de 112 días y 270-285 días, respectivamente; mientras que en el de L.
quadripinnata var. contracta se observan los esporofitos a partir de los 150 a 220 días (Pérez-
García et al., 1994; Mendoza et al., 1997).
La germinación in vitro se realiza en medios artificiales de cultivo, en condiciones
asépticas; para ello es necesario evitar la contaminación mediante métodos adecuados de
recolección, extracción, purificación y desinfección de las esporas.
Kleinschmidt (1952, 1957) establece que es necesario para la desinfección de esporas
el uso sinérgico de un agente desinfectante y un surfactante o solución que rompe la tensión
superficial, permitiendo una mayor penetración del agente desinfectante; pues la diversidad en
la ornamentación que muestra la exina de las esporas de los helechos, dificulta la infiltración
de la solución; impidiendo la adecuada desinfección. Los agentes desinfectantes más utilizados
son el hipoclorito de sodio, cloruro mercúrico, cloro comercial y PPM®; el surfactante mas
común es el Tween 20 (Fernández & Revilla 2003).
5.9.1.- Desinfección de esporas
Básicamente los métodos de desinfección de esporas consisten en la agitación de las
esporas en una solución de 5-10% v-v de blanqueador doméstico, con 1 parte de Tween 20
para 2000 partes de la solución de cloros (véase cuadro 5). Las esporas se sumergen por
períodos de 5 a 10 segundos para especies sensibles; y de 10 a 30 minutos para otras
especies (De Fossard, 1976, Rickard, 2002); posteriormente se recobran las esporas
directamente de la superficie, por filtración en papel o en centrifugación en 2000 rpm; la
mayoría de los autores recomienda 3 enjuagues con agua destilada esterilizada (centrifugando
entre cada uno), con excepción de Hoshizaki & Moran (2001), quienes recomiendan dejar
secar las esporas en un área estéril con cambios del papel secante durante 3 días; a partir de
los cuales las esporas se encontrarán listas para ser sembradas.
Cuadro 5.- Desinfección en helechos.
Taxa Desinfección Referencia
Cyathea dregei Kunze Hipoclorito de sodio 0.2% + twen
20
Finnie & van Staden,
1987
Dicksonia sellowiana (Presl.)
Hook.
Cloro comercial 5% por 10 m Fillipinni, 1998
Cyathea delgadii Sternb. Cloro comercial al 5% Randi 1991
Ceratopteris richardi Brongn,
Lygodium sp., Sw. y Pteridium
sp., Gled. Ex Scop
Hipoclorito de sodio al 0.875% Warne, 1986
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22
Cuadro 5 (continuación)
Asplenium nidus L.; A.
ensiformis L., Dryopteris affinis
(Lowe) Fraser-Jenk.;Osmunda
regalis L.; Pteris ensiformis
Burm. f.; Woodwardia virginica
(L.) Sm.
Hipoclorito de sodio 0.5% +
Tween 20 por 10 m.
Fernández et al. (1999,
1997b) Fernández &
Revilla (2003)
Phanerophlebia, Cheilanthes
Sw., Cyatheaceae,
Phlebodium, entre otros
Tamizado sin solución
desinfectante.
Mendoza
Pérez-García
1986-2003
Pteridium aquilinum (L.) Kuhn,
Athyrium filix-femina (L.) Roth;
Dryopteris expansa (C. Presl)
Fraser-Jenk. & Jermy; Anemia
phyllitidis (L.) Sw.
Agua destilada estéril +
detergente 18-24 h; hipoclorito de
sodio 2.5% 2 m
Shefield et al 2001
A. phyllitidis Cloro comercial 2.5% v/v 10 m Raghavan, 1992
Polypodium cambricum L. 5 mg de esporas, hipoclorito de
sodio 5 g/l 10 m
Bertand 1999
Blechnum spicant (L.) Sm. Agua destilada estéril 24 h
hipoclorito de sodio 0.5 % 10 m
Fernández, 1997
Pérez- García (1988) reporta el uso de esporas no desinfectadas de Ciateáceas,
probablemente por una adecuada colecta de frondas con esporangios maduros y
perfectamente cerrados; López (2003) en su trabajo con Cyathea caracasana (Klotzsch) Domin
emplea con éxito una solución de hipoclorito de sodio al 0.1% adicionado con tween 20,
sugiriendo el uso de esta solución para la desinfección de esporas de helechos.
5.9.3.- Medios de cultivo:
Mientras los medios sólidos con agar, o algún otro agente gelificante, gozan de una
gran popularidad entre los proyectos de investigación morfogenéticos y los protocolos de
propagación comercial; Douglas & Sheffield, en 1992 comparan el desarrollo de gametofitos de
las especies Pteridium aquilinum (L.) y Anemia phyllitidis (L.) en medio Moore en 4 condiciones
diferentes: sólido, liquido en agitación, cultivo inmovilizado y en cultivo bajo fermentador de
burbujeo. Sus resultados indican que el cultivo en sólido no ofrece el máximo crecimiento y
desarrollo, comprobando las propuestas de De Fossard (1976) en cuya recopilación menciona
varias investigaciones en la germinación de esporas, desarrollo de gametofitos y propagación
de esporofitos (luz, temperatura, desinfección, medios nutritivos, dormancia, entre otras) de
varias especies.
Sin embargo, Hoshizaki & Moran, 2001 mencionan que el desarrollo del prótalo es
mayor en medio sólido que en el líquido; por ello proponen utilizar el medio sólido con agar y/o
sustitutos de agar. De la misma forma, Pérez-García (1988) establece que el desarrollo de
gametofitos en medio líquido es mas lento y tiende a estabilizarse en la fase filamentosa; para
continuar su desarrollo bidimensional y/o tridimensional, es necesaria la presencia de un
sustrato sólido.
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23
Los medios más utilizados para la germinación son el Knop y el Knudson, aunque De
Fossard (1976) menciona que inclusive el agua es el medio más simple para llevarla a cabo.
Otros medios que se han reportado son el Moore, Klekowski, Thompson, MS, Hoagland, Miller
& Miller, Beyernick (Fernández & Revilla 2003).
De éstos, en un cultivo de esporas, en el medio MS adicionado con 3% de sacarosa,
Fernández et al. (1999) registraron la formación de esporofitos de Woodwardia virginica en 1
mes; mientras que Pérez-García & Riba (1993) utilizando medio Thompson sin la adición de
carbohidrato, en W. martinezii Maxon ex Weath. desarrollaron esporofitos a los 11 meses.
5.9.4.- Factores que afectan la germinación:
En su amplia revisión de los cultivos de helechos, Fernández & Revilla (2003) indicaron
una relación directa de los carbohidratos, en el medio de cultivo, con desarrollo del gametofito;
determinando que la sacarosa promueve la formación y crecimiento del prótalo (masa) en
helechos leptosporangiados, aunque, su presencia disminuye la formación de esporofitos
(Sheffield et al., 2001); y en algunas especies, como Woodwardia virginica y Dryopteris affinis
puede, inclusive, inhibir su desarrollo, provocando una necrosis. (Fernández et al., 1999). Por
otro lado, la sacarosa y otros carbohidratos se han determinado como factores que intervienen
en la formación de esporofitos apogámicos (Whittier, 1964a, 1966). Así mismo, Raghavan
(1989) determinó que la fructosa, ribosa, arabinosa y ramnosa inhiben la germinación; mientras
que la glucosa y la manosa no tienen un efecto apreciable. En la germinación de esporas de
helechos homospóricos leptosporangiados, Miller, 1968 cit in Fernández y Revilla (2003)
reportó que el mejor rango de pH para su germinación va de ácido a neutro.
Por su parte, Raghavan (1989) hace una recopilación de la biología del desarrollo en
gametofitos de helechos; en donde menciona entre otros muchos aspectos, que las giberelinas
inducen la germinación mediante la hidrólisis de sustancias de reserva y el rompimiento de la
exina (cubierta de la espora); reduciendo la dormancia e induciendo germinación completa en
obscuridad en especies con desarrollo fotodependiente como Lygodium japonicum (Thunb.)
Sw., y Anemia phyllitidis (L.) (Sugai et al., 1987); así como la presencia de fotoreceptores a luz
roja, que activan el desarrollo o alargamiento (Fiillipini et al., 1999); y receptores al azul, los
cuales activan mecanismos de crecimiento plano, necesarios para la formación del esporofito.
Las giberelinas en la fase gametofítica, según Fernández et al. (1997a) están relacionadas con
el desarrollo de anteridios y establece que las especies protándricas producen un
anteridiógeno, con estructura similar a las giberelinas. Además menciona que las auxinas
Neevia docConverter 5.1
24
promueven el desarrollo y crecimiento de los gametofitos, sin embargo, el efecto promotor ha
sido limitado a los lóbulos o a los gametofitos más maduros.
También se han realizado pruebas de cultivo de esporas de Ciateáceas en medio MS
(Finnie & Van Staden, 1987) y en medio MS con 10% de extracto de suelo; determinando una
ventaja de desarrollo en el crecimiento dentro del medio estéril; y acotando la experimentación
plena con el medio MS para las Ciateáceas (Katarzyna & Rybczyñski, 1995). En las
polypodiáceas también se ha utilizado el medio MS, como en Polypodium cambricum L.
(Bertrand et al., 1999), Platycerium bifurcatum (Cav.) C.Chr.(Dolin_ek & Camloh; 1997,
Dolin_ek et al., 2002; Teng, 1997; Teng & Teng, 1997). Por la utilidad contrastante en familias
de Pteridofitas, y en angiospermas en general, se puede tomar al medio MS como el idóneo
para la experimentación morfogenética en este grupo de plantas.
5.9.5.- Cultivo de Gametofitos:
Además del cultivo de esporas, se han desarrollado nuevos métodos para la
propagación de helechos (Douglas & Sheffield, 1992); como la inducción de la propagación
vegetativa a partir de rizomas, el cultivo de gametofitos y la formación de esporofitos por
apogamia (Fernández & Revilla, 2003), dentro de esta metodología, el cultivo de gametofitos
ha mostrado una alta tasa de efectividad; mediante homogenizaciones de los prótalos de
Woodwardia virginica (L.) Sm. se ha logrado una regeneración completa y la obtención de
esporofitos; sin embargo para otra especie como Osmunda regalis L., si bien se logró la
regeneración de gametofitos, la obtención de esporofitos no ha sido reportada; esto llevó a
Fernández & Revilla (2003) a sugerir que la homogenización de tejido puede inhibir la
formación de esporofitos en algunas especies (Fernández et al., 1999, 1997b).
Bertrand et al. (1999) por su parte reportó una alta tasa de regeneración esporofítica a
partir de la formación de cuerpos globulares verdes en explantes de rizoma de Polypodium
cambricum L.; incubados en medio MS con y sin reguladores de crecimiento como BA; 6-
bencilaminopurina o benciladenina. Raghavan (1989) en su amplia revisión menciona los
efectos del 2,4-D y de los carbohidratos en la formación de esporofitos apogámicos,
encontrando una relación entre estos dos compuestos y la llamada organogénesis esporofítica.
De dicha revisión sobresalen los
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5.10.- Estudios sobre el desarrollo del gametofito
El desarrollo del gametofito consta de una fase filamentosa originada