Factores-Involucrados-en-el-proceso-de-reversion-en-un-modelo-experimental-de-fibrosis-hepatica

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POSGRADO EN CIENCIAS
BIOLÓGICAS
FACULTAD DE CIENCIAS
FACTORES INVOLUCRADOS EN EL PROCESO DE REVERSIÓN EN
UN MODELO EXPERIMENTAL DE FIBROSIS HEPÁTICA
TE SIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
(BIOLOGIA EXPERIMENTAL)
PRESENTA
GUMARO CANO GUTIÉRREZ
DIRECTOR DE TESIS: DAVID KERSHENOBICH STALNIKOWITZ
\.AA \
DICIEMBRE 2005
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
Ing. Leopoldo Silva Gutiérrez
Director General de Administración Escolar, UNAM
Presente
COORDINACiÓN
Por medio de lapresente me permito informar a usted que en la reunión ordinaria del Comité Académico del
Posgrado en Ciencias Biológicas, celebrada el día 29 de agosto del 2005, se acordó poner asu consideración
el siguiente jurado para elexamen de grado de Maestría en Ciencias Biológicas (Biología Experimental) del(a)
alumno(a) CANO GUTIERREZ GUMARO con número de cuenta 503005384 con la tesis titulada: Factores
involucrados en el proceso de reversión en un modelo experimental de fibrosis hepática, bajo la
dirección del(a) Dr. David Kershenobich Stalnikowitz.
Presidente:
Vocal:
Secretario:
Suplente:
Suplente:
M. en C. Armando Gamboa Domínguez
Dra. María Concepción Gutiérrez Ruíz
Dr. David Kershenobich Stalnikowitz
Dra. Aída Mariana Santiago Lomelí
Dr. Luis tlorente Peters
Sin otro particular, quedo de usted.
Atentamente
"POR MI RAZA HABLARÁ EL EspíRITU·
Cd. Universitaria, D.F. a, 1 eoctu (fe12005
Or. Juan a án
Coordi r del Programa
c.c.p. Expediente del interesado
Edif. de Posgrado P.B. (Costado Sur de la Torre 11de Humanidades) Ciudad Universitaria c.P. 04510 México, D.F.
Iei: ,JO¿;) u1I6 Fax: 56230172 http://pcbibl:posgrado.unarn.tux
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLOGICAS
COORDINACION
Ciudad Universitaria, D.F. a 31 de agosto del 2005.
CANO GUTIÉRREZ GUMARO
No. de cuenta: 503005384
Presente.
Por medio de la presente me permito informar a usted que el Comité Académico
del Posgrado en Ciencias Biológicas, en su reunión ordinaria del 29 de agosto del 2005,
aprobó el jurado para la presentación de su examen para obtener el grado de Maestro en
Ciencias Biológicas (Biología Experimental) del Posgrado en Ciencias Biológicas, con
la tesis titulada: "Factores involucrados en el proceso de reversión en un modelo
experimental de fibrosis hepática", integrado de la siguiente manera:
Presidente:
Vocal:
Secretario:
Suplente:
Suplente:
M. en C. Armando GamboaDomínguez
Dra. María ConCepción GutiérrezRuiz
Dr. David Kershenobith Stalnikowitz
Dra. Aída Mariana Santiago Lomef
Dr. Luis LJorente Peters
Sin más por el momento, me despido.
Atentamente
"POR MI RAZA HABLARA EL ESPIRITU"
C. c. p. Miembros del Jurado.
C. c. p. Expediente del Alumno.
Autorizo a la Oíreccl6llGeneralde Bibliotecas de la
UNAM adifundir en formato IMocUéflíco einpreso ei
contenido de mi tr~o :""pof~nal.
NOMBRE: 6vmoco GWe ~(rtP
F.~~ _
2
El presente trabajo fue realizado gracias a la beca-crédito otorgada por CONACYT y
becaDGEP.
COMITÉ TUTORAL
M. en C. Armando Gamboa Domínguez
Dra. María Concepción Gutiérrez Ruíz
DI. David Kershenobich Stalnikowitz
Dra. Aída Mariana Santiago Lomelí
DI. Luís Llorente Peters
3
AGRADECIMIENTOS
A mi Madre Martha Gutiérrez Sánchez
A mi Padre Gumaro Cano Velasco
A mis Hermanas Berenice, Verónica y Karen
A la Tte. Corb. SSN. Psic. María Concepción Cano Rodríguez
A el DI. David Kershenobich Stalnikowitz
A la Dra. María Concepción Rodríguez Ruíz
A el Dr. Armando Gamboa Domínguez
A el DI. Miguel Ángel Mercado Díaz
A la Dra. Aída Mariana Santiago Lomelí
A la Dra. Milena Saqui Salces
A el Filol. M.V.Z. Juan José Salazar Morales
A la C.D.E.O. Genny Miriam Castro Alvarado
A la Q. Rosa María Muñoz Fuentes
A la Q.F.B. Socorro Cruz Castellanos
A la Q.F.B. Sara Sixtos Alonso
A la Q.F.B. Teresa Ramírez Iglesias
4
CONTENIDO
Páginas
1. Resumen 5
2. Introducción 6
2.1. Antecedentes 9
2.2. Fibrosis y células estelares 11
2.3. Citocina y fibrosis 12
2.4. Factor de crecimiento transformante beta 1 13
2.5. Factor de necrosis tumoral alfa 15
2.6. Factor de crecimiento de hepatocitos 17
2.7. Apoptosis y fibrosis 18
2.8. Fas 20
2.9. Reversión de la fibrosis hepática y destino de las células estelares 22
2.10. Modelo Experimental 23
3. Justificación 25
4. Objetivos 26
4.1. General 26
4.2. Particulares 26
5. Hipótesis 27
6. Metodología 27
7. Resultados 37
8. Discusión 56
9. Conclusiones 59
10. Referencias 60
5
RESUMEN
La fibrosis y la cirrosis hepática son el resultado de la mayoría de las agresiones
crónicas al hígado. Se sugiere que la capacidad de recuperación de la fibrosis y de la
cirrosis es posible. Este estudió evaluó los cambios que ocurren en factores claves en la
fibrogénesis como son el Factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-131), Factor
de crecimiento de hepatocitos (HGF) , Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) y el
receptor de muerte Fas, así como la apoptosis de células estelares y hepatocitos durante
la resolución espontánea de la fibrosis hepática en un modelo experimental de cirrosis
hepática con CCk Se utilizaron 40 ratas Wistar macho recibieron CCl4 por 6 semanas.
Se dividieron en cuatro grupos de cinco ratas cada uno, se sacrificaron a las 2, 4 Y 6
semanas un vez suspendido el tratamiento. La fibrosis se evaluó usando la escala de
lesiones de Knodell. Se realizaron determinaciones por RT-PCR de TGF-131, Fas, TNF-
a y HGF. Inmunohistoquímica para TGF-131, Fas, a-actina de músculo liso y apoptosis
por técnica de TUNEL. Los resultados se compararon mediante la prueba U de Mann-
Whitney considerando una p<O.OS como significativa.
La fibrosis en la evaluación por Knodell, se redujo a las 4 y 6 semanas de recuperación
(p<O.üS). Las expresiones del ARNm de TNF-a y Fas regresaron a sus niveles básales
después de 6 semanas de recuperación (p<O.OS), no así TGF-131 y HGF. El marcaje por
inmunohistoquímica para Fas, «-actina de músculo liso revirtieron a sus niveles básales
a las 4 y 6 semanas (p<ü.OS), no así TGF-I31. El mayor índice de apoptosis de células
estelares activadas fue a las 4 semanas de suspendido el tratamiento con CCl4 (p<O.üS).
La reversión de la fibrosis hepática se asocia con la persistencia en la expresión de
TGF-131 y HGF así como la apoptosis de células activadas
6
ABSTRACT
The fibrosis and the hepatic cirrhosis are the result of most from the chronic aggressions
to the liver. It is suggested that the capacity of recovery of the fibrosis and of the
cirrhosis it is possible. Did this study it evaluated the changes that happen in key factors
in the fibrogenesis like they are of transforming growth factor-beta 1 (TGF-~l),
hepatocyte growth factor (HGF), tumour necrosis alpha (TNF-a) and the receiver of
death Fas, as well as the apoptosis of stellar cells and hepatocyte during the spontaneous
resolution of the hepatic fibrosis in an experimental model of hepatic cirrhosis with
CC14. 40 rats Wistar male was used CC14 they received for 6 weeks. They were divided
in four groups of f ive rats e ach o ne, t hey were sacrificed to the 2, 4 and 6 weeks a
suspended time the treatment. The fibrosis was evaluated using the scale of lesions of
Knodell. They were carried out determinations for RT-PCR ofTGF-~l, Fas, TNF-a and
HGF. Immunohistochemistry for TGF-~l, Fas, the cellular smooth musc1e-alpha actin
of flat musc1eand apoptosis for technique of TUNEL. The results were compared by
means ofthe test ofMann-Whitney considering a p<O.OS as significant.
The fibrosis in the evaluation for Knodell, decreased to the 4 and 6 weeks of recovery (p
<0.05). The expressions ofthe RNAm ofTNF-a and Fas retumed at their levels normal
after 6 weeks of recovery (p <0.05), 1 didn't seize TGF-~l and HGF. The colored for
immunohistochemistry f or Fas, the cellular smooth m usc1e-alpha actin reverted at i ts
levels normal to the 4 and 6 weeks (p <0.05), 1 didn't seize TGF-~1. The biggest index
of apoptosis of activated stellar cells went to the 4 weeks of suspended the treatment
with CC14 (p <0.05).
The reversion of the hepatic fibrosis associates with the persistence in the expression of
TGF-~1 and HGF as well as the apoptosis of activated cells
INTRODUCCIÓN
La cirrosis hepática es una de las causas más frecuentes de muerte en el mundo
occidental y en nuestro país ocupa el cuarto lugar dentro de las causas de mortalidad (l).
Este padecimiento es una enfermedad progresiva y fatal que se debe a fibrosis del
hígado, lo que conduce a graves alteraciones de su función metabólica y su circulación
sanguínea. Las causas más frecuentes de lesión hepática son el abuso de alcohol, la
hepatitis crónica de cualquier etiología, la enfermedad biliar crónica y los padecimientos
relacionados con depósitos de hierro (hematocromatosis). Las investigaciones en el área
de patología celular y biología molecular han revelado perspectivas muy alentadoras en
modelos animales acerca de la posibilidad de entender los procesos de reversión y
encontrar tratamientos efectivos para este padecimiento (2).
Se ha evaluado la respuesta génica durante la agresión hepática ha través de estudios
con microarreglos de ADN de tejido hepático. Los cambios encontrados en la expresión
génica han establecidos la respuesta molecular aguda por CC14 y revela las bases
genéticas de la toxicidad hepática, principalmente en genes que participan en
proliferación, muerte celular y metabolismo. Varios genes involucrados muestran
cambios significativos en su expresión, en respuesta al daño y la información generada
por estos estudios muestran una evaluación general de la respuesta del hígado ante el
daño (49, 50, 53).
7
Estos estudios han revelado información únicamente con respecto a la respuesta de fase
aguda y crónica del hígado al daño. Los cambios génicos expresados a un tiempo
prolongado de daño hepático impactan fundamentalmente sobre el desarrollo de la
enfermedad. Esto ha permitido entender en modelos animales el mecanismo de daño y
comprender los que podrían participar durante la fibrosis.
Hasta ahora se ha considerado que la evolución de la fibrosis a cirrosis es irreversible, el
punto en el cual la cirrosis o la fibrosis llegan a ser irreversibles no se ha establecido.
Avances recientes en el proceso de la fibrogénesis hepática han confirmado que aún en
cicatrices en las cuales se pensaba que no eran reversibles, si lo son, en ellas se llevan
procesos dinámicos para su mantenimiento o crecimiento, lo que permite sugerir que la
reversión de la cirrosis es posible, por lo menos en modelos animales y en algunos
casos en humanos.
Se sabe que una vez establecido el daño, la fibrosis es progresiva y es mediada por
diferentes citocinas claves entre las que se encuentran el TGF-131, TNF-a, HGF y el
receptor de muerte Fas, así como la activación de células estelares hepáticas.
Por lo que resulta interesante investigar el comportamiento de estos mediadores durante
la reversión de la fibrosis espontánea del hígado en un modelo de cirrosis con CCl4 y
conocer los cambios que ocurren en los mismos.
8
En este sentido la presente investigación se centra en conocer los cambios en la
expresión del ARN mensajero durante la reversión de la fibrosis hepática en un modelo
de cirrosis experimental con CC14, se incluye en él la evaluación de la expresión de
mediadores que participan como pro inflamatorios, inmunomodu1ares, profibróticos así
como apoptóticos como son TNF-a, TGF-l3l, HGF YFas respectivamente. Se examina
por inmunohistoquímica en tejido hepático la presencia de TGF-131 por su importancia
como mediador fibrótico y promotor de apoptosis de hepatocitos así como disminuir la
proliferación de los mismos. Fas por su elevada implicación en la inducción de
apoptosis en hepatocitos. También se evalúa con a-actina de músculo liso la
transformación de células estelares así como la apoptosis de hepatocitos y células
estelares a través de la técnica de TUNEL.
9
ANTECEDENTES
El proceso patogénico central de la cirrosis es la fibrosis progresiva, está se define como
un proceso de cicatrización en el daño hepático crónico que se caracteriza por
incremento en el depósito y alteración en la composición de la matriz extracelular. El
siguiente estadio es la cirrosis, en donde la estructura del hígado esta alterada con la
formación de nódulos de regeneración carentes de vena central (3).
Desde décadas atrás se sospechaba que el depósito de tejido conectivo era una respuesta
cicatrizal anormal a la lesión hepática producida por agentes químicos o infecciosos y
que era consecuencia de la infiltración de fibroblastos en el parénquima hepático. Por
ello se le ha considerado un proceso irreversible como ocurre con cualquier otra cicatriz
(4).
Actualmente se cuenta con un panorama más preciso de la complejidad biomolecular
del proceso de fibrogénesis basado en estudios del tejido conectivo del hígado normal
así como de el hígado cirrótico. En el hígado normal, las colágenas intersticiales (tipo I
y Ill) se encuentran casi exclusivamente en los espacios porta y en las venas centrales,
mientras que la colágena tipo IV forma fibras muy delgadas alrededor de los espacios de
Disse. En cambio en la fibrosis, las colágenas I y III se depositan en y a través de los
lobulillos hepáticos creando progresivamente septos irregulares que pueden llegar a ser
muy gruesos que cortan y circundan porciones dellobulillo hepático (5,6).
10
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Esta distorsión de la arquitectura hepática es la causa de la alteración grave a la
circulación arterial y venosa intrahepáticas. El depósito de colágena tipo IV en el
espacio de Disse se acompaña de pérdida de las fenestraciones en las células
endoteliales sinusoidales lo que elimina el intercambio entre los hepatocitos y el plasma.
Todo ello conduce a insuficiencia hepática con las consecuencias clínicas como son
ascitis, debilidad muscular, sangrado de varices, ictericia y encefalopatía. Avances
recientes en el entendimiento del proceso de la fibrogénesis hepática han confirmado
que el proceso es dinámico con respecto a las células y al recambio de las proteínas de
matriz extracelular y sugiere que la capacidad de recuperación de la fibrosis y de la
cirrosis avanzada es posible. Entre los factores involucrados en el desarrollo de la
fibrosis hepática se mencionan a continuación.
11
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FIBROSIS y CÉLULAS ESTELARES
La mayor parte del exceso de colágena en la fibrosis no sólo es producto de los
fibroblastos, si no de un tipo de células perinusoidales conocidas como células hepáticas
"estelares" o células de Ito. Estas células que se encuentran rodeando los espacios de
Disse, funcionan normalmente como elementos de almacenamiento de vitamina A y
algunos otros lípidos, por lo que también se conocen como células almacenadoras de
grasa. En condiciones normales las células estelares tienen como función almacenar
lípidos, pero durante el proceso fibrótico se activan y transforman en células de tipo
miofibroblástico y son así capaces de producir colágena, proteínas de matriz
extracelular y numerosas citocinas pro inflamatorias que alteran el microambiente
hepatocelular. Actualmente se considera que las células estelares ocupan el papel central
en el proceso fibrogénico hepático y por ello son el blanco principal de las
investigacionespara revertir o detener la fibrosis (9).
Durante el daño hepático, las células estelares responden a la lesión en dos fases:
primero en la etapa temprana de activación conocida como de iniciación, se producen
un cambio rápido tanto de la expresión génica como del fenotipo de las células
estelares, lo que hace que las células sean muy sensibles a diferentes citocinas y a
estímulos locales, segundo, en la fase de perpetuación, se activa la sensibilidad a
múltiples factores de crecimiento como el factor de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF), el HGF y el TGF-~llo que ocurre en forma autócrina y parácrina.
En esta fase se inicia una remodelación acelerada de la matriz extracelular, durante la
cual hay una degradación de algunas formas de colágena y depósito de otras. El
depósito de colágena fibrilar altera de manera importante la arquitectura y función
hepatocelular, a su vez es capaz de estimular la proliferación de células estelares (lO).
12
CITOCINAS y FIBROSIS
Independientemente del factor causante del daño, el hígado desarrolla una respuesta al
mismo. La necrosis hepatocelular es seguida de fibrosis que es el resultado de un
aumento en la síntesis y depósito de colágena así como de proteínas de matriz
extracelular, sintetizadas principalmente a nivel de células estelares activadas,
fibroblastos, hepatocitos y células endoteliales (11).
Cuando el hígado es lesionado, como respuesta aguda al daño se incrementa la
producción de citocinas por las células estelares, por los propios hepatocitos, células de
Kupffer y por las células endoteliales lo cual amplifica el proceso inflamatorio e
incrementan el daño hepático.
Actualmente no se conoce el mecanismo que controla este tipo de respuesta. Por el
contrario cuando la lesión hepática continúa, las células estelares se activan y permiten
el depósito progresivo de bandas de tejido conectivo intersticial, lo que limita y afecta
cada vez más la función hepática. Esto explica cómo el hígado se toma cada vez más
firme y fibrótico y por qué la cirrosis es progresiva (13).
Aunque el mecanismo fribrogénico no es totalmente conocido, existe evidencia de que
diversas citocinas son capaces de actuar en las distintas células hepáticas induciendo
modificaciones intracelulares que culminan con el depósito de colágena y proteínas de
la matriz extracelular y fibrosis. Algunas citocinas a las que se ha atribuido acciones
biológicas importantes durante el daño tisular hepático se mencionan a continuación.
13
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FACTOR DE CRECIMIENTO TRANSFORMANTE BETA 1
EL TGF-~1 es una citocina implicada en el proceso de adipogénesis, condrogénesis e
inhibición de la proliferación de células epiteliales, endote1ia1es, 1infoides y
hematopoyéticas.
Es capaz de inducir a nivel transcripciona1, la síntesis e incorporación de proteínas de
matriz extrace1u1ar, principalmente colágena y fibronectina, con una alta capacidad de
síntesis de receptores proteicos de adhesión celular, propiedades que permiten
establecer que esta citocina tiene un papel importante en el proceso de fibrosis hepática.
En particular se ha demostrado que durante la lesión hepática el TGF-~l actúa como
potente factor quimiotáctico de fibrob1astos y como mitógeno al participar en la
regeneración hepática (15).
La forma en que esta citocina estimula la producción de colágena en células estelares
activas es cuando el ligando de TGF-~1 se une al receptor de tipo Il, creando una
combinación receptor-ligando que tiene una alta afinidad por el receptor del tipo 1. Se
forma un complejo tetramérico en el que el receptor de tipo n fosfori1a al receptor de
tipo 1. Una vez formado el complejo activo, el receptor de tipo 1 fosfori1a a un miembro
de la familia citosó1ica de las Smads, típicamente una Smad se fosfori1a en el residuo
SSXS en el e Terminal. Esto obliga a formar un dímero con el compañero común
Smad4.
14
El heterodímero se importa hacia el interior del núcleo donde se una al ADN y activa la
transcripción del ARNm del TGF-131 y la colágena tipo I, de hecho el ARNm de la
colágena tipo I se incrementa 20 veces más, comparado con las células estelares no
activadas (18,19).
Por esta razón el TGF-131 es una citocina clave en el desarrollo de la fibrosis hepática
(57). En las células estelares activadas favorece la transición a un fenotipo
miofibroblástico, estimula la producción de proteínas de matriz extrace1ular e inhibe su
degradación, también se sabe que en hepatocitos disminuye su proliferación y favorece
su apoptosis. Las investigaciones actuales se han centrado en bloquear la síntesis de esta
citocina o disminuir su acción para detener o revertir la fibrosis en modelos
experimentales (58).
15
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FACTOR DE NECROSIS TUMORAL ALFA
El TNF-a es una citocina sintetizada principalmente por macrófagos y monocitos, pero
también por células B, T, hepatocitos y fibroblastos en respuesta a estímulos
infecciosos, traumáticos, neoplásicos o en enfermedades inflamatorias crónicas.
Se ha demostrado su participación en respuesta a estímulos químicos y bacterianos en el
daño hepatocelular mediado por macrófagos en forma aguda, confiriéndoles
capacidades citotóxicas, con la consiguiente producción de radicales libres de oxígeno.
Poseé la capacidad de regular la expresión de moléculas de adhesión en la superficie de
las membranas de células endoteliales y neutrófilos, favoreciendo además la síntesis de
radicales libres y desgranulación de esta últimas (2). Se conoce también su poder
amplificador en la actividad proliferativa y citotóxica de respuesta de células T, además
de la capacidad moduladora sobre células NK.
El TNF-a se ha implicado en vanas enfermedades hepáticas y es un importante
mediador de muchas condiciones fisiológicas (23). Varios estudios en modelos
experimentales sugieren que el TNF-a es uno de los componentes tempranos en la vía
que lleva a la regeneración (24). Se ha encontrado evidencia que el TNF-a es un factor
endógeno primario que actúa en condiciones de inflamación aguda tal como el choque
endotóxico y apoptosis, que son precursores de la fibragénesis (25).
16
Estudios "in vivo" han demostrado un incremento significativo de los niveles séricos y
en el número de receptores hepáticos del TNF-a en pacientes con daño hepático agudo
y crónico. En el caso de las células estelares, la activación del TNF-a controla los
factores de transcripción AP-l así como c-jun y como resultado hay un incremento en la
expresión génica de metaloproteinasas de matriz así como reducción en la expresión
génica de colágena (22).
En la actualidad se estudian sus efectos sobre la fibrosis hepática y aunque existe aún
controversia parece importante su participación en el proceso de fibragénesis.
17
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FACTOR DE CRECIMIENTO DE HEPATOCITOS
La presencia del HGF se encuentra en poca cantidad en el suero de ratas y humanos
sanos, pero su producción es rápidamente estimulada en presencia de algún tipo de daño
hepático (26,27).
El HGF es importante en la reversión de la fibrosis hepática ya que es una respuesta
fundamental del hígado ante el daño tisular. Se sabe que tiene efectos sobre las células
estelares activadas en modelos animales con fibrosis. Sin embargo el mecanismo exacto
de cómo actúa como antifibrótico no se conoce, pero se sugiere que el HGF puede
inhibir la actividad del TGF-131 (28,29).
Los mecanismos de acción están actualmente en estudio. La inyección de HGF en
modelos de ratas con cirrosis causado por dimetilnitrosamina y CC14 como resultado
disminuye la colágena total del hígado, mejora las enzimas indicadoras de daño
hepático en suero, se recupera parcialmente la integridad del hígado y drásticamente se
reducen la ascitis y la mortalidad (30,31).
18
APOPTOSIS y FIBROSIS
Apoptosis y fibrosis hepática son los dos rasgos más importantes de daño hepático
crónico, que incluye enfermedades metabólicas, virales, colestásicas y genéticas. La
apoptosisde hepatocitos ocurre frecuentemente en las fases agudas de daño hepático y
la fibrosis hepática es una respuesta tardía de las células estelares al proceso de daño
(23).
Se ha especulado una posible relación entre apoptosis y fibrosis hepática. La apoptosis
hepática da como resultado la formación de cuerpos apoptóticos, estos cuerpos son
eliminados del tejido por fagocitosis.
La fagocitosis de los cuerpos apoptóticos es necesaria para la protección del tejido
dañado, que libera contenido pro inflamatorio. Los macrófagos que han fagocitado
células apoptóticas in vitro, inhiben la producción de citocinas pro inflamatorias y
promueven mecanismos que involucran la secreción de TGF-~1.
Aunque los macrófagos son células fagocíticas profesionales y son responsables de la
eliminación de cuerpos apoptóticos, las células epiteliales y los fibroblastos también
muestran capacidad de eliminar cuerpos apoptóticos.
En el hígado, las células de Kupffer son localizadas en el espacio intra-sinusoidal,
mientras que las células estelares están en el espacio de Disse.
19
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Las células estelares están cerca de los hepatocitos y por su localización fagocitan
cuerpos apoptóticos de hepatocitos, incrementando la generación de TGF-f31 y como en
los macrófagos, esta citocina podría iniciar una respuesta profibrogénica en el hígado,
como lo sugieren los estudios realizados por Torok y colaboradores (33).
También se ha observado que las células estelares humanas que fagocitan cuerpos
apoptóticos, estimulan la expresión de TGF-f31 y colágena tipo 1 (34). Estas
observaciones sugieren fuertemente que la fagocitosis de cuerpos apoptóticos por
células estelares puede ser el mecanismo potencial que enlaza el daño hepático y la
fibrosis.
20
FAS
La identificación de receptores de muerte celular, proteínas transmembranales que
pertenecen a la superfamilia del factor de necrosis tumoral, dos de los cuales son de
particular interés para los hepatólogos, dado que se expresan ampliamente en el hígado
una vez iniciado el daño, como es el receptor de muerte celular Fas también llamado
CD-95 o APO-l, es una proteína glucosilada de superficie celular con un peso de 52 kD
Y el receptor factor de necrosis tumoral 1 (TNF-1), han abierto nuevas implicaciones
para entender los mecanismos de daño hepático y desarrollar estrategias citoprotectoras
(35).
Fas se expresa en hepatocitos, colangiocitos, células estelares activadas y células de
Kupffer. El ligando de Fas (FasL) es una proteína transmembranal expresada en los
linfocitos citotóxicos y células cancerosas, este sistema también activa a la maquinaria
apoptótica, a través de la activación de uno del los receptores del factor de necrosis
tumoral, por la citocina TNF-a ó el ligando Fas, dan lugar a apoptosis al inducir la
asociación del receptor con la proteína adaptadora TRADD.
Sin embargo, al contrario que Fas, en ciertas condiciones, la unión de TNFR1 a
TRADD se continúa con la unión de otras proteínas adaptadoras dando lugar a la
activación del factor de transcripción denominado factor nuclear KB (NF-KB), al
estimular la degradación de su inhibidor (IKB) (36).
21
El factor de transcripción NF-KB/IKB se considera de sobrevida cuando esta activado.
En el hepatocito, cuando el receptor está expresado de manera que la célula requiere de
un mecanismo que controle la densidad de receptores de muerte celular que permita la
expresión de Fas sin daño hepático. Por lo que es importante conocer los mecanismos
que permite a la célula estelar evitar la apoptosis y no así el hepatocito. (38).
22
REVERSIÓN DE LA FIBROSIS HEPÁTICA y DESTINO DE LAS CÉLULAS
ESTELARES HEPÁTICAS
En modelos animales durante la reversión de la fibrosis hepática, el número de células
estelares disminuye y la integridad del tejido se restablece (39). Hay dos teorías que
explican la reversión de la fibrosis, la primera mediante la reversión de la activación de
las células estelares o bien mediante la eliminación de células estelares activadas por
apoptosis (40). Se ha observado en cultivos que las células estelares pueden revertir a
células quiescentes, pero no se ha demostrado in vivo (41).
La apoptosis de las células estelares activadas aumenta durante la resolución de la
fibrosis hepática. Uno de los factores que regula la apoptosis en células estelares
transformadas es el TNF-a, ya que promueve su sobrevida vía NF-KB. Esto se demostró
con gliotoxina, que es una toxina de un hongo que inhibe la activación de NF-KB e
induce apoptosis de las células estelares en ratones tratados con CC14 en donde el grado
de daño hepático y fibrosis fue mínimo (42, 43).
23
MODELO DE CIRROSIS EXPERIMENTAL CON CCl4
Existen varios modelos experimentales para estudiar la fibrosis hepática en roedores los
cuales intentan semejar el daño que ocurre en humanos, entre ellos se encuentran los
modelos tratados con alcohol, dimetilnitrosamina, tioacetamida, CC14 y ligadura del
conducto biliar.
En el estudio se utilizó el modelo de CC14 ya que permite controlar el daño, al ser dosis
dependiente. El CC4 es una hepatoxina que causa necrosis hepática, fibrosis y cirrosis
cuando se administra de manera crónica y también asemeja al daño producido en el
humano, con la ventaja de que puede retirarse en cualquier momento para estudiar la
reversión de la cirrosis hepática.
El efecto tóxico del CC14 se debe a su conversión por el citrocromo P-450 en el radical
libre triclorometilo (CCbo) el cual es un tóxico altamente reactivo. Los radicales libres
producidos localmente causan la oxidación de los ácidos grasos poliénicos presentes en
el interior de los fosfolípidos de membrana. Ahí se inicia la oxidación de los lípidos de
membrana y tras reaccionar con oxígeno (peroxidación lipídica), se forman peróxidos
orgánicos.
Esta reacción es autocatalítica puesto que se forman nuevos radicales a partir de los
propios radicales peróxidos.
24
Por tanto la descomposición rápida de la estructura y perdida de función del retículo
endoplásmico se debe a la oxidación de los lípidos de membrana, explicando por qué el
daño CC14 es grave y al mismo tiempo extremadamente rápida en su inicio.
En menos de 30 min se produce una disminución en la síntesis de proteínas hepáticas y
a las dos horas, hinchazón del retículo endop1ásmico liso y disociación de los ribosomas
del retículo endop1ásmico rugoso.
Se reduce la salida de lípidos desde los hepatocitos debido a su incapacidad para
sintetizar la apoproteinas que permita la formación de complejos con los triglicéridos y
por tanto facilita la secreción de lipoproteína. El resultado es un hígado graso debido a
la intoxicación por CC14. Después se produce lesión mitocondrial y esta va seguida por
una turgencia progresiva de las células debido a un aumento en la penneabi1idad de la
membrana plasmática permitiendo una entrada masiva de calcio y muerte celular (44).
La respuesta inflamatoria causada por el CC14 juega un papel importante en el daño
hepático. En este proceso las células hepáticas, incluyendo las células de Kupffer,
células estelares hepáticas y células endoteliales sinusoidales son activadas para secretar
citocinas, la cuales son mediadores de la fibrosis hepática que permiten el depósito de
matriz extracelular como consecuencia del estrés oxidativo (45).
25
JUSTIFICACIÓN
La cirrosis hepática es un problema de salud pública, en México ocupa el cuarto lugar
como causa de muerte entre los 25 y 64 años de edad. Es una enfermedad devastante en
términos de costo de atención médica, pérdida de años productivos y con un pronóstico
extremadamente malo, a los 48 años de seguimiento, aproximadamente el 50% han
fallecido, condicionando a una evolución más severa que en muchos tipos de cáncer. La
muerte secundaria a cirrosis y las complicaciones que le preceden son en su mayoría
debidas a secuelas de cicatrización o fibrosis del hígado, aún no existen tratamientos
que tengan impacto sobre la prevalencia de la enfermedady se aplican en forma tardía
una vez que el daño tisular es irreversible. Este trabajo busca entender el proceso de la
reversión fibrótica en el hígado, el cual pretende estudiar la generación de señales que
actualmente se consideran claves y relacionarlo con la inducción de apoptosis en la
regresión fibrótica del hígado ya que estudios recientes en modelos animales de fibrosis
y en humanos indican que la fibrosis hepática se puede revertir mediante remodelación
de la matriz, aún en casos de enfermedad avanzada.
26
---------------- ~ ~--
OBJETIVO GENERAL
Conocer los cambios en la expresión de HGF, TNF-a, TGF-~l y Fas, así como la
apoptosis de hepatocitos y células estelares durante la reversión espontánea de fibrosis
hepática en un modelo experimental con CCk
OBJETIVOS PARTICULARES
1. Estudiar los cambios que ocurren en la progresión y durante la reversión de la
fibrosis hepática inducida por CC14 con respecto a HGF, TNF-a, TGF-~l y Fas.
2. Evaluar el grado de fibrosis hepática después de 6 semanas de tratamiento con
CC14.
3. Evaluar la reversión de la fibrosis hepática después de suspender el tratamiento
con CC14 a las 2, 4 Y6 semanas.
4. Cuantificar la presencia de TGF-~l y Fas durante el daño y la reversión de la
fibrosis hepática.
5. Identificar la presencia de células estelares activadas durante la progresión y la
reversión de la fibrosis hepática.
6. Relacionar la apoptosis de hepatocitos y células estelares activadas durante la
progresión y la reversión de la fibrosis hepática.
27
--------------~--
HIPÓTESIS
En la reversión espontánea de la fibrosis hepática habrá un decremento en la expresión
del ARNm de los factores TGF-~l y TNF-a, al ser estas citocinas las responsables de la
fibrosis e inflamación hepática, al igual que Fas la cual nos indica disminución en la
apoptosis hepática e incremento de HGF al regenerar el parénquima hepático dañado
por el CCk Se observará un aumento de marcaje positivo de TGF-~l y Fas en tejido
hepático después de 6 semanas de tratamiento con CC14 y el marcaje descenderá durante
la reversión espontánea. Así mismo la apoptosis de hepatocitos descenderá durante la
reversión de la fibrosis y la apoptosis de células estelares activadas aumentará
permitiendo la regeneración y la reducción de fibrosis hepática.
METODOLOGÍA
Este proyecto se realizó en los Laboratorios de Gastroentero1ogía y Patología del
Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición "Salvador Subirán".
28
ANIMALES
Se utilizaron 40 ratas Wistar macho de 6 semanas de edad con peso de 200 gr, libres de
patógenos, con agua y comida ad libitum y en condiciones controladas de temperatura,
humedad y ciclo luz/oscuridad de 12/12. Los animales recibieron por vía intraperitoneal
una inyección de CCl4 (Sigma Chemical) a una dosis de 0.4 glKg de peso, disuelto en
aceite mineral como vehículo o únicamente como vehículo, como control, 3 veces a la
semana por el tiempo que a continuación se menciona:
29
---------------~-_._---- - --
Los grupos experimentales fueron los siguientes, 40 ratas que se dividieron en 8 grupos:
Grupo I (+)
5 ratas con administración de CC14 por 6 semanas, se suspendió el tratamiento y
posteriormente se sacrificaron.
Grupo I (-)
5 ratas con administración de vehículo por 6 semanas, se suspendió el tratamiento y
posteriormente se sacrificaron.
Grupo II (+)
5 ratas tratadas con CC14 por 6 semanas, se suspendió el tratamiento, se dejaron
recuperar 2 semanas y se sacrificaron.
Grupo II (-)
5 ratas tratadas con vehículo por 6 semanas, se suspendió el tratamiento, se dejaron
recuperar 2 semanas y se sacrificaron.
Grupo III (+)
5 ratas tratadas con CC14 por 6 semanas, se suspendió el tratamiento, se dejaron
recuperar 4 semanas y se sacrificaron.
Grupo III (-)
5 ratas con administración de vehículo por 6 semanas, se suspendió el tratamiento, se
dejaron recuperar por 4 semanas y se sacrificaron.
Grupo IV (+)
5 ratas tratadas con CC14 por 6 semanas, se suspendió el tratamiento, se dejaron
recuperar 6 semanas y se sacrificaron.
Grupo IV (-)
5 ratas tratadas con administración de vehículo por 6 semanas, se suspendió el
tratamiento, se dejaron recuperar 6 semanas y se sacrificaron.
30
El método de sacrificio fue por cámara de CO2. Posteriormente se removió el tejido
hepático, una porción de éste se fijo en formol al 10% Y se incluyó en parafina para ser
valorado histológicamente, otra porción se congeló con nitrógeno y luego a -70°C para
realizar determinaciones por PCR de HGF, TNF-a, TGF-~1 y Fas
DISEÑO EXPERIMENTAL
Grupo l: 5 rata.
Grupo 11: 5 rata.
Grupo 1II: 5 rata.
Grupo rv: 5 ratas
Grupo 1(control) : 5 ratas
Grupo 11 (control!: 5 retes
Grupo III(control): 5 ratas
Grupo rv(conuoll: 5 ratas
Determinación histológica de
fibrosi" por técnlca de Masllon y
HE
Sacrificio
024
Tratamiento con
CCI4
6
Obtención de Tejido
Hepático
8 10 12 Semanas
Reversión espontanea
2 4 S semanas
)
EvalUación de expresión por
RT-PCR de TNF·a;. TGF-IH. HGF Y
Fas
Inmunohistoquimica para células
estelares actlvades con o-actína de
musculoliso.
lnmunohistoqulmica p.•ra TGF-rny
Fas
Determinación de apoptcsls por
técnica de TUNEL
EXAMEN HISTOPATOLÓGICO
A partir de tejido fijado en formol al 10%, se realizaron tinciones con
hematoxilina/eosina (HE) y de Masson. Con un patólogo cegado al tratamiento se
evaluó la inflamación y la fibrosis, utilizando el esquema de gradificación de lesiones de
acuerdo a la escala de Knodel1, como se muestra en la tabla 1 (38).
31
Tabla 1. Gradificación de las biopsias hepáticas.
Escala de Knodell
Necrosis No. Degeneración No. Inflamación No. Fibrosis No.
periportal intralobar y portal
en puente necrosis focal
Nada O Nada O Nada O Nada O
Leve l Leve (cuerpos l Leve (células 1 Expansión 1
acidófilos inflamatorias portal por
degeneración diseminadas fibrosis.
globoide y/o en 1/3 de los
focos espacios
diseminados de porta)
necrosis
hepatocelular en
<1/3 de los
espacios de
lóbulos o
nódulos.
Moderada 3 Moderada 3 Moderada 3 Fibrosis en 3
(involucra (afecta 1/3-213 (mayor puente
menos del de los lóbulos o infiltrado en (porto-portal
50% de la nódulos) 1/3-2/3 de o porto
circunferencia espacios central)
de la mayoría porta).
de espacios
porta
Necrosis 4 Grave 4 Grave 4 Cirrosis 4
grave en (afecta<2/3 de (infiltrado
sacabocado los lóbulos o denso en >2/3
(afecta>50% nódulos) de los
de la espacios
circunferencia porta).
de la mayoría
de espacios
porta).
Necrosis 5
moderada en
sacabocado +
necrosis en
puente.
Necrosis 6
grave en
sacabocado +
necrosis en
puente.
Necrosis 10
multilobular.
32
EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL DEL TEJIDO HEPÁTICO
La extracción del ARN total del tejido hepático se realizó con el reactivo de Trizol. Se
agregó 1 ml de Trizol (Gibco) en un tubo de ensaye, se homogenizó y lisó el tejido, se
depositó en tubos Eppendorf. El homogenado se dejó reposar 5 min a temperatura
ambiente. Después se le agregó 0.2 ml de cloroformo y se agitó vigorosamente en
vortex por 15 seg. Se dejó reposar 5 mino Las muestras se centrifugaron a 12000 rpm
por 15 min a 4 "C. Se tomó la fase acuosa y se le agregó 0.5 ml de isopropano1. Se dejó
reposar 15 min a temperatura ambiente. Luego se centrifugó a 12000 rpm por 10 min a
4°C. Se decantó el sobrenadante y el pellet obtenido se le agregó 1 mI de etanol al 75%.
Se agitó vigorosamente con vortex y se centrifugó a 12000 rpm por 5 min a 4°C. Se
desechó el sobrenadante y se secó el pellet al vació. Finalmente se disolvió en agua
DEPC.
RT-PCR
El RT-PCR se realizó usando un ensayo comercial (GeneAmp, Perkin Elmer). Para la
transcripción reversa (RT), se tomaron 1.5 ug/rnl de ARN total y se le agregaron 2 ul de
MgCh 25 mM; 1 ul de cada dNTP's a una concentración de 10 mM; 0.5 ul de inhibidor
de ARNasa (lO U/¡..tl), 0.5 ul, de oligo d(T)16 5 nmoles; 0.5 ¡..tI de transcriptasa reversa a
una concentración de 50 U/¡..tl y 1 ul. de buffer para PCR 10X. La mezcla se llevo a
reacción en un termociclador (Perkin Elmer 480) y se sometió a 37°Cpor 60 min
seguido de 5 min a 95 "C.
33
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se llevo a cabo utilizando el ensayo
comercial anteriormente mencionado. A 3 ul de ADN complementario (ADNc) que se
obtuvo en la reacción de RT, se le agregaron 2 ul de MgCh; 4 ul de Buffer PCR lOX;
31.75 ul de agua estéril. 0.25 I..L1 de DNA polimerasa (AmpliTaq DNA polimerasa,
Perkin Elmer) a una concentración de 5 U/¡.tl y 2.5 ¡.tI de los oligonucleótidos
específicos.
La mezcla se llevó a reacción al termociclador con las condiciones especificas para cada
proteína, las cuales son las siguientes: HGF: Sentido GCT CGC CCT GCA ATC CTG
GA Antisentido GGG ATG GCA CAT CCA CGA CC, peso aproximado 347 pb;
condiciones del termociclador 94 "C por 3 min, 35 ciclos de 93 "C por 1 min, 55 "C por
1 min, 72 -cpor 1 mino TGF-~l: Sentido CCG CCT CCC GCA AAG ACT Antisentido
GCG GCG CCC CAG GGA ACT, peso aproximado 404 pb condiciones del
temociclador 94 "C por 3 min, 35 ciclos de 93 "C por 1 min, 60°C por 1 min, 72 "C por 1
min; TNF-a: Sentido GAG CCC CCA ATC TGA GAC CTT CTA, Antisentido CCC
CGA CCT TCC AAA TAA ATA CAT, peso aproximado 545 pb condiciones del
temociclador 94°C por 3 min, 35 ciclos de 93 "C por 1 min, 5SoCpor 1 min, 72 "C por 1
min, Fas Sentido GAG GAC AAC AGC CCC CAA GAT G Antisentido AGC GGA
AGA CTG AGG AAA TGA GAC, peso aproximado 450 pb condiciones del
termociclador 57.5 "C por 3 min, 35 ciclos de 93 "C por 1 min, 55 "C por 1 min, 72 "C
por 1 min; ~-actina: Sentido ATG GCA TCC TGC GTC TGG ACC TGG C,
Antisentido AGC ATT TGC GGT GCA CGA TGG AGG G, peso aproximado SOO pb,
condiciones del termociclador 94 "C por 3 min, 35 ciclos de 93 "C por 1 min, 55 "C por
1 min, 72 -c por 1 mino
34
Los productos amplificados se separaron por electroforesis en geles de azarosa al 1%
con 0.5 mg/ml de bromuro de etidio y fueron fotografiados en un transiluminador con
película Polaroid, la cuantificación de los productos se realizó por densitometría a través
del programa Kodak Digital Science, como control interno se utilizó 13-actina.
35
INMUNOHISTOQUÍMICA
El tejido se incluyo en parafina y se obtuvieron cortes de 4fl en laminillas cargadas
positivamente, que se mantuvieron por 24 h en estufa de secado a 56 oc. Los tejidos
fueron desparafinados y rehidratados en baños consecutivos de xilol, alcohol y
finalmente Tris. No se realizó recuperación antigénica. La inmunohistoquímica se
realizó en el sistema automatizado NexES (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ),
empleando el sistema de detección iView DAB (Ventana Medical Systems).
Los anticuerpos que se usaron fueron contra TGF-131 (Santa Cruz Biotechnology, lnc
Anticuerpo IgG policlonal de conejo a una dilución 1:100), Fas (Santa Cruz
Biotechnology, lnc anticuerpo policlonal de conejo IgG a una dilución 1:50) ya-actina
de músculo liso (Santa Cruz Biotechnology 1:100). Se colocó el anticuerpo secundario,
dejándose incubar por 25 mino Se lavaron las laminillas y se colocó estreptoavidina
ligada a peroxidasa 100 ml y se incubaron por 25 min, se enjuagaron y se aplicó
diaminobencidina (DAB) y peróxido de hidrógeno (H202) para obtener el precipitado
colorido, se enjuagaron y se contrastaron con hematoxilina. Las laminillas se
deshidrataron en baños consecutivos de alcohol y xilol, posteriormente se montaron en
resina para ser analizadas por microscopia de luz.
Se usaron como controles positivo: hígados cirróticos de humanos. En todos los casos
se tuvieron controles negativos al omitir el anticuerpo primario en el procedimiento
rutinario de marcaje.
36
TUNEL
La apoptosis se determinó in situ utilizando la técnica de desoxinuc1eotidi1 transferasa
mediante marcaje de trifosfatos de desoxiuridina terminales (TUNEL) como se ha
descrito previamente (51). Para este fin se empleó un estuche de Apoptag Plus
Preoxidase (S7101, Chemicon Intemational), siguiendo las instrucciones del fabricante.
El índice de apoptosis se determinó al contar las células con marca positivas para
TUNEL, se realizó un índice para hepatocitos y células estelares. El índice resulta de la
relación: células totales positivas/células totales contadas xl00 en 5 campos. Los
resultados se expresan como valores promedio de TUNEL de los animales por cada
grupo.
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Los resultados se expresaron en medias ±DE. La comparación entre los grupos se
realizó mediante la prueba no paramétrica U de Mann- Whitney. Las diferencias se
consideraron significativas para una p<0.05. Se utilizó el paquete SPSS 12.0 para
Windows para conocer los niveles de significancia.
37
RESULTADOS
HEPATOXICIDAD INDUCIDA POR CCl4
Después de que las ratas fueron tratadas durante 6 semanas con CC4, la fibrosis
hepática se valoró con tinción de Masson y hematoxilina/eosina, con el microscopio de
luz y los resultados se presentan en la figura 1 y 2. El grado de daño hepático se
clasificó de acuerdo al esquema de gradificación de lesiones de knodell (Tabla 1).
El grupo tratado con aceite mineral utilizado como control interno se comparó contra el
grupo tratado con CC14 por 6 semanas para validar el modelo de fibrosis hepática. Se
observa como el grupo control tratado con aceite mineral por 6 semanas no desarrolló
ninguna lesión comparado con el grupo tratado con CC14 por 6 semanas, esto nos indica
que le modelo de daño hepático actúo como se esperaba.
InflamaciónNecrosís
2
1.1\
1
c.s
U-l------ --'--_......L__
a
Degeneración íntralobar
l.S
l
2.$
2
1.5
1
05¡¡-l--- -...J....__--l-_~
Grupo rr
e
Grupo 1
Fibrosis
IL
b
IL
Grupo 11
d
Figura L Evaluación de fibrosis hepática por Knodell, en el grupo 1 (grupo tratado con aceite mineral por
6 semanas utilizado como control interno), contra el grupo II tratado con aceite mineral con CCl4 por 6
semanas, se observan niveles de significancia comparados entre ambos grupos. *Representa una p<O.OS.
38
Una vez confirmado el daño hepático provocado por el tratamiento con CC14 por 6
semanas se suspendió el tratamiento y se dejaron recuperar por 2, 4 Y 6 semanas, y
posteriormente se sacrificaron, se evaluó la regresión comparándolos contra el grupo 1
tratado con CC14 por 6 semanas, los resultados mostrados pertenecen a los grupos con
daño producido con CC14 contra los grupos en recuperación a las 2, 4 Y6 semanas. Los
grupos tratados con vehículo solo se tomaron como controles internos por lo que no se
muestran los resultados.
1.5- Necrcsíe a5,
25 2.,5
LS 1.5,
c.s .. .. t15
D
Grupo' Grupo 11 Gruoo¡¡¡ GrupoIV Grup. ¡
a
:;\5 Inflamación
1 35
Z.S
25
15 2
1,$
O.S
H
Grupo l Grup" I Gn¡po ill Grupof\l e
C Grupo'
Degeneración lntralobar
b
Fibrosls
Figura 2. Evaluación de la reversión de la necrosis, degeneración intralobar, inflamación y fibrosis. n=5
ratas en cada grupo, se gradificó de acuerdo a la escala de Knodell, los resultados se presentaron con
medias ±DE. *p<O.05 significativa comparado con el grupo 1 (tratado con CC14 por 6 semanas).
El análisis de los resultados mostró una diferencia significativa para necrosis (p<O.05), degeneración
intralobar (p<O.05), en inflamación portal (p<O.05), durante su recuperación, comparado con el grupo
control. La fibrosis tuvo cambios significativos en las 4 y 6 semanas de recuperación (p<O.05)
observándose expansión portal por fibrosis en puentes en la mayoría de los casos estudiados como se
observa en la figura 3 y 4.
39
HEMOTOXILINA/EOSINA
Figura 3. Muestras representativas de tejido hepático obtenido en cada grupo tratado con CCI4 y grupo
con recuperación de 6 semanas. En los paneles a y b los tejidos fueron teñidos con hematoxilina y eosina
(HE), el panel (a) representa el grupo 1, tratado con CCI4 por 6 semanas. El panel (b) corresponde al
grupo IV con recuperación de 6 semanas. Las fotografías se presentan con un aumento de 40x. La
necrosis indicada por cabezas de flecha.
40
MASSON
Figura 4. Tinción de Masson para evaluación de fibrosis hepática. El panel (e) corresponde al grupo I
tratado con CCI4 por 6 semanas, se observa fibrosis enpuente porto portal. El panel (d) corresponde al
grupo IV con recuperación de 6 semanas, se observa un decremento en la fibrosis encontrándose solo
expansión portal. Las fotografias se presentan con un aumento de 40x. Fibrosis indicada por flechas
41
CAMBIO EN LA EXPRESIÓN DE GENES
El RT-PCR se realizó para conocer los cambios en la expresión del ARN mensajero de
HGF, TGF-~l, TNF-a y Fas una vez establecida la fibrosis hepática, se presentan los
grupos tratados con aceite mineral utilizados como controles internos (grupo 1) contra
los grupos tratados con CC14 por 6 semanas (grupo 11) para validar el modelo de fibrosis
y encontrar alteraciones en los mismos .
--- ------.-..-_.... ...
.. .._---.- ....-
-----
HGF
70
*
eo
50
~ 'oa
le JO
¡;
Q
20
10 nO
a GNpo i Gruoo I
TNF-a.
*
70
eo
"
~·o
i '0
j
a ~o
~
20
10
,x-,
~
b GNpO' Grupo I
Grupo I
Aceite Mineral
por 6 semanas
Grupo I
Aceite Mineral
por 6 semanas
Grupo 11
CCI4 por
semanas
Grupo 11
CCI4 por
semanas
,B-actina 800 pb
HGF 347 pb
,B-actina 800 pb
TNF-a 545 pb
Figura 5. Camb ios en la expre sión de ARNm de HGF y TNF-a paneles a y b respectivamente. Se
present an los resultados comparados con el grupo I (tratado con ace ite mineral por 6 sem anas) contra el
grupo 11 (tratado con CC\4 por 6 semanas), se observan diferencias una vez establecido el daño , estas 2
citocinas incrementan su expresión con respecto al grupo 1. El grupo I se tomo como control interno.
"Representa diferencia significativa con respecto al grupo I (p<O.05).
42
----------
';' z.,--,.. ..". .... __~_
TGF-~1
70
~O
50
140
.\l
! 30
~
Q
20
10
a Gr\lCo1 GIUpO I
Grupo I
Aceite Mineral
por 6 semanas
Grupo 11
CCI4 por
semanas
~-acti na 800 pb
TGF-~1 404 pb
--...---- ....-----
Fas
70
60
50
i ~ o
a
l! 30
~
20
10
~
b G,. ool
..
Gruo. I
Grupo I
Ace ite Mineral
por 6 semanas
Grupo 11
CCI4 por
semanas
,B-actina 800 pb
Fas 450 pb
Figura 6. Cambios en la expresión de ARNm de TGF-p I Y Fas, panales e y d respectivamente. Se
presentan los resultados comparados con el grupo 1 (tratado con aceite mineral por 6 semanas) cont ra el
grupo 11 (trata do con CCI4 por 6 semanas), se observan diferencias una vez establecido el daño , estas 2
citocinas incrementan su expresión con respe cto al grupo I. El grupo 1 se tomó como control interno.
*Representa diferencia significativa con respecto al grupo 1 (p<O.OS).
43
CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN DEL ARNm DURANTE LA REVERSIÓN DE
LA FIBROSIS HEPÁTICA
Una vez evaluado los cambios en la expresión de citocinas los grupos tratados con CCl4
se suspendió el tratamiento y se dejaron recuperar 2, 4 Y 6 semanas, el RT-PCR se
realizó para evaluar los cambios en la expresión del ARN mensajero de HGF, TGF-pI ,
TNF-a y Fas durante la reversión de la fibrosis hepática, los estudios se realizaron cada
2 semanas después de retirar el tratamiento con CCI4, los grupos en recuperación se
compararon contra el grupo control (grupo 1 tratado con CC4 por 6 semanas). Se
presentan los análisis por RT-PCR de los genes seleccionados de hígados tratados con
CCl4 por 6 semanas y que se recuperaron 6 semanas después de suspender el
tratamiento con CCk Los resultados obtenidos por el densitómetro, se presentan en
medias ±DE de tres repeticiones, n=S ratas. Cada grupo se comparó contra el grupo 1
(grupo tratado con CC4 por 6 semanas) . *Representa un p<O.OS.
HGF
70
60
"' so'c
'a;
E .:lO
s
~ 30
el>
Q 20
10
0 +---1.- ---'- -,----''--- '---,--- ''--- -'----,---'----'---,
Grupo I Grupo 11 Grupo 111 Grupo IV
Figura 7. Expresión del ARNm de HGF durante la reversión de la fibrosis hepática. La expresión de HGF
a las 2, 4 Y 6 semanas de recuperación no existió tendencia significativa al decremento con respecto al
grupo 1tratado con CCI4 por 6 semanas .
44
70
60
~ 50.;:-Q,l
E 40
C>:::: 30Vle
Q,l
Q 20
10
O
TGF-pl
T
T
T T
Grupo I Grupo 11 Grupo 11 1 Grupo IV
Figura 8. Expresión del ARNm de TGF-p 1 durante la reversión de la fibrosis hepática . En lo que respecta
a la expresión de TG F-p 1, no hubo cambios significativos en su expresión durante su recuperación
después de retirar el daño a las 2, 4 Y6 semanas con respecto al grupo 1.
TNF- a.
70
60
~ SO';:-Q,l 40E
C>:::: 30Vle
Q,l
Q 20
10
O
T T
* *T T
Grupo I Gru po 11 Grupo 111 Grupo IV
Figura 9. Expresión del ARNm de TNF-a durante la reversión de la fibrosis hepát ica. La expresión de
TNF-a disminuyo significativamente a las 2 y 6 semanas de recuperación, a las 2 semanas existió
tendencia no significat iva al decremento. *Representa una p<O. 05.
45
70
60
l'l: 501:
Q.i
40E
o
:= 30VI
c:
(l,)
Q 20
10
O
Fas
T ..
*T *
~
Grupo I Grupo 11 Grupo 111 Grupo IV
Figura 10. Expresión del ARNm de Fas durante la reversión de la fibrosis hepática . A las 4 y 6 semanas
de recuperación la expresión del ARNm para esta citocina se encontró significativamente reducida, a las 2
semanas de recuperación no se aprecia diferencia con el grupo control.
46
ANÁLISIS INMUNOHISTOQUÍMICO
Una vez realizado el RT-PCR se estudio la presencia de TGF-¡31 en tejido hepático por
su importancia en la fibrosis hepática y Fas implicado en la inducción de apoptosis. Y
relacionar los resultados de su expresión con la presencia de la proteína en el tejido
fibroso.
INMUNOHISTOQUÍMICA PARA TGF-¡31
En la gráfica 11 se muestran los resultados del análisis por inmunohistoquímica. El
índice del marcaje para TGF-¡31 se determinó a partir del número de células positivas de
hepatocitos dividido entre el número de células totales xl 00 contados en 5 campos.
TGF-Bl
16
al 14
"¡;;'
~ 12
n:
E 10
al
"c a
al
lJ 6
"c
e 4
2
O
T
T
T...
Grupo I Grupo 11 Grupo 111 Grupo IV
Figura 11. Índice de células positivas de hepatoc itos durante el daño provocado con CC14 , durante 6
semana s y su posterior recup eración. Se observan los tiempos comp arados a las 2, 4 Y 6 semanas de
recuperación. A las 4 y 6 semanas de recuperación el índice de células positivas para TG F-p 1 no se
encuentran diferenc ias significativas con el control.
47
... ...
......
b
Figura 12. Imágenes representativas de las reacciones de inmunohistoquímica para TGF-~ 1. En los
paneles a y b se muestran con flechas el marcaje positivo para TGF-~1 la reacción para esta citocina se
localizó en la membrana plasmática de los hepatocitos. Se presentan el grupo tratado con CCl4 por 6
semanas grupo I (a) con hepatocitos positivos para TGF-~1 con respecto al grupo en recuperación (b)
después de 6 semanas grupo IV. Las fotografias se presentan con un aumento de IOOx.
48
INMUNOHISTOQUÍMICA PARA Fas
En la gráfica 13 se muestra el resultado del análisis por inmunohistoquímica de Fas. El
índice del marcaje de Fas se determinó a partir del número de células positivas de
hepatocitos dividido entre el número de células totales xl 00 contados en S campos. Se
identificó tendencia al decremento en el número de células marcadas a las 2 y 4
semanas de recuperación. El menor número de células positivas para Fas fue observado
a las 6 semanas con una diferencia significativa después de la última administración de
CCl4 (p<O.OS).
Fas
16
.~ 14
r:
~ 12
r:
E 10
al
~ 8
al
(,) 6
~
e 4
2
O
T T
T
*
T
Grupo I Gru po 11 Grupo 111 Grupo IV
Figura 13. El marcaje por inmunohistoquímica de Fas disminuyó significativamente después de 6
semanas de recuperación, a las 2 y 4 semanas existió tendencia no significativa al decremento. El grupo
control establecido como el grupo 1 (tratado por 6 semanas con CCI4) , en comparación con los grupos
recuperados 11 , III YIV. "Representa una p<O.OS.
49
Fas
Figura 14. Se muestran las imágenes representativas de las reacciones de inmunohistoquímica para Fas.
La marca café ocre identifica los sitios de reacción de Fas en la membrana de los hepatocitos. En el panel
(a) se observa el grupo I después de la lesión provocada con CCI4 por 6 semanas, con daño y
degeneración del parénquima hepático así como un mayor número de marcas positivas para Fas en
hepatocitos comparado con el grupoIV recuperado después de 6 semanas, panel (b). La imagen se
representa a un aumento IOOx.
50
INMUNOHISTOQUIMICA PARA CÉLULAS ESTELARES
Se valoró la activación de las células estelares durante el daño hepático y la
recuperación, mediante la tinción con a -actina para músculo liso, ya que estas células
juegan un papel importante durante la fibrogénesis . La activación de las células
estelares se determinó por inmunohistoquímica para cc-actina. El número mayor de
células estelares activadas se identificó en las 6 semanas de tratamiento con CCk Se
observó reducción significativa del número de células estelares a o-actina positivas a las
2, 4 Y6 semanas de retirado el daño químico.
Células estelares activadas
16
(l) 14
T'¡:coo 12"-re
E 10
(l)
"C 8 *(l)
(,)
6 T *"C *e 4 T T
I I2 I IO
Grupo I Grupo 11 Grupo 111 Grupo IV
Figura 15. Índice de células positivas para u-actina de músculo liso. Los grupos en recuperación se
compararon con el grupo tratado con CCl4 por 6 semanas tomado como control. *Represe nta una p<0.05.
El índice del marcaje de n-actina se determinó a part ir del número de células posit ivas dividido entre el
número de células totales en 5 campos x100.
51
CÉLULA ESTELAR ACTIVADA
Figura 16. Células estelares transformadas con marca positiva para u-actina de músculo liso indicadas
con flechas, la imagen se representa en un aumento IOOx.
52
APOPTOSIS DE HEPATOCITOS
Durante el daño inducido por CC4 a las 6 semanas se realizó la técnica de TUNEL en
las muestras estudiadas para determinar el grado de apoptosis en hepatocitos durante el
daño y su posterior recuperación. El porcentaje mayor de hepatocitos en apoptosis se
identificó en el grupo con el daño por 6 semanas. A partir de la suspensión de la
administración de CCl4 se apreció tendencia al decremento del porcentaje de apoptosis
de hepatocitos.
APOPTOSIS HEPATOCITOS
VI
ca
>
E
en 16o
~ 14
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;:, 12
.~ 10
~ 8
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1: 4
Cl,l
e 2
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Q. o
T
T
T
*
T
I I
Grupo I Grupo 11 Grupo 111 Grupo IV
Figura 17. Porcentaje de hepatocitos con TUNEL positivo. A las 6 semanas de suspendido el daño , el
porcentaje de hepatocitos en apoptosis fue significativamente menor. El porcentaje de hepatocitos se
determinó a partir del número de células positivas, entre el número de células totales xl 00 en 5 campos.
53
TUNEL HEPATOCITOS
t
t t
Figura 8. TUNEL positivo para hepatocitos. Se muestran con flechas los hepatocitos con TUNEL positivo
(núcleos color café), en los animales con daño con CCI4 por 6 semanas. La fotografía se representa
a un aumento de IOOx.
54
APOPTOSIS DE CÉLULAS ESTELARES
La determinaci ón de muerte de células estelares por apoptosis mediante doble marcaje
con cc-actina y TUNEL, identificó un incremento en el núm ero de apoptosis a partir de
la suspensión de la administración de CCk El mayor porcentaj e de apoptosis de células
estelares ocurrió a las 4 semanas de recuperación p<Ü. Ü5 con decremento del fenómeno
2 semanas después. El número mayor de células estelares acti vadas que sufrieron
apoptosis se observó en las zonas II y III de Rappaport.
TUNEL ESTELARES
In 7
ro
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en
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O
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T
T T
T
I I
Grupo I Grupo 11 Grupo 111 Grupo IV
Figura 19. Porcentaje de célu las estelares, teñidas con doble marcaje (TUNEL y a -actina de músculo
liso). En el grupo III con 4 semanas de recuperación ocurre el mayor porcentaje de muerte de células
estelares transformadas. El porcentaje de apoptosis se determinó a partir del número de células positivas,
entre el número de célu las totales x l OO. *Representa una p<O.OS con respecto al grupo 1.
55
Figura 20. Imagen representativa de una célula estelar hepática en apoptosis con doble marcaje con
TUNEL positivo (núcleo y membrana color café) (flecha), la imagen se representa en un aumento 100x.
56
DISCUSIÓN
Mediante el tratamiento con CC14por 6 semanas a ratas se confirmó que en el hígado de
los animales tratados el tratamiento con CC14 es capa z de producir degeneración
intralobar, necrosis focal , inflamación portal y fibrosis. El tratamiento con CC14 se ha
utilizado como modelo en la inducción de fibrosis y cirrosis hepática en modelos
experimentales, lo cual ha permitido conocer algunos cambios patológicos que ocurren
en el hígado, junto con algunas alteraciones en las vías bioquímicas involucradas en la
fibrosis y cirrosis hepática Lee GP (2005) YWasser S (1999) .
Algunos estudios han indicado que la fibrosis experimental inducida por CC14 es
reversible una vez que se suspende el daño Issa R. (2004). Los resultados que se
obtuvieron de este estudio, demostraron que los cambios en la expresión de genes, en
respuesta a 6 semanas de tratamiento con CC14 son reversibles. En el presente estudio se
encontró de las alteraciones morfológicas del tejido hepático de manera semejante al
estudio realizado por Jiang Y (2004).
En lo que respecta al ARNm de TNF-a y Fas en nuestro estudio, la expresión revirtió a
sus niveles basales después de 6 semanas de suspender el tratamiento con CCk El
análisis del ARNm de TNF-a mostró que a las 2 semanas de suspender el tratamiento
con CC14 tuvo un decremento en su expresión a las 4 y 6 semanas después de suspender
el tratamiento con CCk Esto se podría explicar al tener el conocimiento que el TNF-a
esta implicado en el daño por CC14 como se ha mostrado en modelos experimentales
con ratas De Cicco et al. 1998) . En estos estudios la principal fuente de TNF-a es
producida por las células de Kupffer como respuesta inmediata al daño.
57
Se sabe que el TNF-a debe disminuir su expresión para permitir la regeneración de la
fibrosis hepática como lo confirman el estudio realizado por Jiang Y (2004), en donde la
expresión de TNF-a también disminuyó al irse recuperando la reversión de la fibrosis
hepática. La disminución de la expresión de TNF-a a las 4 y 6 semanas, podrá deberse
que fue a través de la interleucina 10 (IL-lO) ya que está citocina regula de manera
negativa la inflamación, mediante la inhibición de la producción del TNF-a por
macrófagos Safadi R.( 2002).
En lo que respecta a los resultados obtenidos para TGF-SI con CC14, donde su
expresión del ARNm por RT-PCR se encontró incrementada después de 6 semanas de
tratamiento con CC14, al igual que la marca para inmunohistoquímica de TGF-SI,
después de suspender el tratamiento y observar los resultados después de 6 meses de
recuperación, la expresión del ARNm de TGF-Sl no tuvo un decremento significativo
con respecto al grupo tratado con 6 semanas con CC14, pero sí se encontró una
disminución en la marca por inmunohistoquímica lo cual podría explicarse porque hay
regulación postranscripcional que no permite que se sintetice la proteína. Esta citocina
también se encontró elevada en otros estudios de reversión de fibrosis hepática Jiang Y
(2004) e Issa R (2004). El TGF-SI parece ser mediador clave de la fibrogénesis
Gressner A-M (2002), se sabe que participa en la disminución de la proliferación de
hepatocitos e induce apoptosis de los mismos Arendt E (2005). Actualmente está en
investigación el desarrollo de estrategias para evitar la síntesis o señalización del TGF-
SI para disminuir la fibrosis experimental Sheck FW (2004).
58
En lo que respecta a la expresión del ARNm de HGF tampoco regresó a sus niveles
basales con respecto al grupo tratado con CC14 por 6 semanas después de suspender el
tratamiento por 6 semanas con CC14, esto se explica por que su expresión aumente
durante el daño y como respuesta a la regeneración hepática como se sugiere en los
trabajos de regeneración hepático por Nakamura T (1989). Se sabe que es importante en
la regeneración del daño hepático ya que el HGF evita el incremento en la señalización
del TGF-/31, con lo que inhibe la fibrogénesis y la apoptosis de hepatocitos, permitiendo
la reversión de la fibrosis en el hígado cirrótico Funakoshi H (2003).
La administración exógena de HGF en hígados cirróticos tratados conCC14 se ha
observado que revierte el daño hepático Tahara M (1999). El HGF le confiere actividad
anti-apoptótica con respecto a los hepatocitos, esto se puede explicar por la reducción de
la expresión de la proteína anti-apoptótica Bcl-xL en el hígado e inhibiendo la
inducción de caspasa 3 Veki T (1999).
En un estudio por Loffrede (1997) identificó con RT-PCR e inmunohistoquímica, en
hígados de ratas con tratamiento con CC14, que alrededor de las células biliares y
endoteliales cerca de la región porta, está incrementada la expresión del TNF-a durante
la regeneración hepática. En otro estudio Díaz-Gil JJ (2003) sugiere que el TNF-a está
involucrado en la actividad mitogénica del HGF.
El HGF colabora con la reversión de la fibrosis hepática, inhibiendo la proliferación de
las células estelares activadas así como inducir la apoptosis de los mismas Kim WH
(2005).
ESTA TESIS
SALIR DE lA
ti" DElE
J¡dúiJECA
59
Con respecto al marcaje positivo para TUNEL y a-actina de músculo liso (doble
marcaje) para células estelares activadas los resultados demostraron que el decremento
de las mismas es mediado vía apoptosis. Esto propone que la apoptosis es el mayor
factor regulador del número de células estelares activadas durante la regeneración del
daño hepático Yoon IR (2002).
En otros estudios cuando se suspende el daño hepático, las células estelares entran en
apoptosis lo que conlleva a una reversión de la fibrosis, el mecanismo es a través de la
estimulación de los receptores de muerte expresados en las células estelares activadas y
una disminución de sus factores de sobrevivencia, lo que conduce a una apoptosis de
células estelares activadas Bataller R. (2005) y Friedman (2002). Todo ello es debido a
que no se ha encontrado un mecanismo por el cual las células estelares activadas
reviertan su fenotipo a células quiescentes.
También los factores de sobrevida son regulados en las células estelares activadas, se
sabe que TNF-a promueve la sobrevida de las células estelares activadas vía NF-KB
Friedman SL (2003). Actualmente varios estudios tratan de promover este mecanismo
para encontrar terapias antifibróticas efectivas.
En resumen los resultados que se obtuvieron de este estudio demostraron que los
cambios en la expresión de Fas y TNF-a regresaron a sus niveles basales después de
suspender el daño con respecto al grupo tratado con CC14 por 6 semanas, lo cual se
relacionó y confirmo con la evaluación morfológica.
60
Sin embargo el TGF-p1 y HGF no regresaron a sus niveles basales después de
suspender el tratamiento con CC14, comparado con el grupo tratado con CC14 por 6
semanas, con lo que podríamos sugerir que estos mecanismos quedan encendidos para
mediar la respuesta durante la reversión de la fibrosis hepática.
CONCLUSIONES
La apoptosis de células estelares activadas se relacionó con la reducción de la fibrosis
evaluado por Knodell así como una expresión a la alta de HGF y TGF-pl por lo que se
concluye que son importantes en este modelo para disminuir el número de las mismas
para permitir la reversión fibrótica del hígado.
61
Sin embargo el TGF-f31 y HGF no regresaron a sus niveles basales después de
suspender el tratamiento con CC14, comparado con el grupo tratado con CC4 por 6
semanas, con 10 que podríamos sugerir que estos mecanismos quedan encendidos para
mediar la respuesta durante la reversión de la fibrosis hepática.
CONCLUSIONES
La apoptosis de células estelares activadas se relacionó con la reducción de la fibrosis
evaluado por Knodell así como una expresión a la alta de HGF y TGF-f31 por 10 que se
concluye que son importantes en este modelo para disminuir el número de las mismas
para permitir la reversión fibrótica del hígado.
61
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68
	Portada
	Contenido
	Resumen
	Introducción
	Justificación
	Objetivo General
	Hipótesis Metodología
	Resultados
	Discusión
	Conclusiones
	Referencias