Germinacion-simbiotica-y-reintroduccion-de-orquideas-terrestres-en-la-Reserva-Ecologica-del-Pedregal-de-San-Angel-Mexico-DF

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MÉXICO 
 
 
 
POSGRADO EN CIENCIAS 
BIÓLOGICAS 
 
Instituto de Geología 
 
 
“Germinación simbiótica y reintroducción 
 
de orquídeas terrestres 
 
en la reserva ecológica del 
 
Pedregal de San Ángel, 
 
 México, D. F.” 
 
 
 
 
T E S I S 
 
QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE 
 
 
MAESTRO(A) EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
(Biología Ambiental) 
 
P R E S E N T A 
 
Biól. Mónica Rangel Villafranco 
 
 
 
 
Director(a) de Tesis: Dra. Maria del Pilar Ortega Larrocea 
 
 
México, D.F. JUNIO 2006 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
Agradecimientos 
 
 
Al apoyo del CONACYT por haberme otorgado la beca con número 181874 que me permitió 
realizar los estudios de Maestría. 
 
Al apoyo de la Dirección General de Estudios de Posgrado de la Universidad Nacional 
Autónoma de México (UNAM) por haberme otorgado la beca complementaria que me 
permitió realizar los estudios de Maestría. 
 
Al Instituto de Geología de la UNAM por recibirme como alumna y por la beca que me otorgó 
para finalizar la escritura de esta tesis. 
 
Al la Maestría de Restauración Ecológica de la UNAN y al fundación Packard por el apoyo 
económico otorgado para la realización de esta tesis. 
 
A la Dra. Ma. Pilar Ortega Larrocea por brindarme la oportunidad de seguir trabajando bajo 
su dirección, por su tiempo, su invaluable apoyo en el trabajo del laboratorio y en campo, 
especialmente por su paciencia que es infinita y por ser una amiga para mí, por ser un apoyo 
cuando la cima parecía inalcanzable. 
 
A los integrantes del Jurado: al Dr. Gerardo Adolfo Salazar Chávez, Dra. Alma Delfina Lucía 
Orozco Segovia, Dr. Víctor Manuel Chávez Ávila, Dra. Ma. Dolores González Hernández, por 
tiempo, su paciencia y comprensión así como ha sus acertados comentarios para la mejora 
de este trabajo. 
 
Al Instituto de Ecología A. C. por permitirme realizar una parte importante de este trabajo en 
sus instalaciones. En el laboratorio de Sistemática Molecular a cargo de la Dra. Ma. Dolores 
González Hernández, a quien agradezco por enseñarme con gusto con una nueva área de la 
ciencia. A la M. en C. Cristina Bárcenas del Laboratorio del Secuenciador Automático ADN, 
por su apoyo durante mi estancia en el INECOL y su ayuda para secuenciar mis muestras y a 
mis compañeros de laboratorio que me hicieron más fácil mi estancia: Adriana Cruz, Karina 
Salazar, Brenda Diaz y Rafael Ortega. 
 
Al Ing. Alfredo Martínez Sigüenza coordinado de áreas verdes de la Coordinación de áreas 
verdes y forestales de la dirección general de obras y conservación por todo el apoyo 
brindado durante la realización de este trabajo 
 
A la M. en C. Maria de los Ángeles Aída Téllez Velasco del Jardín Botánico del Instituto de 
Biología de la UNAM por su ayuda en el trabajo de campo, por su interés en la realización y 
progreso del mismo, así como por su invaluable amistad. 
 
Al Biól. Israel Cárdenas por su apoyo en campo y comentarios sobre el mismo. 
 
A mis compañeros de laboratorio por su compañía y apoyo: Cris, Fred, Jani, Gabi y Jorge. 
 
A mis amigos incondicionales: Liliana Ruvalcaba, Cristal Pérez, Abigail González, Nicol 
Fuentes, Juan Manuel Sánchez, Ana Maria Quiroz, Rigoberto Romualdo y Ottmar Reyes. 
 
Parte de esta tesis se desarrolló en el Invernadero Automatizado del Instituto de Geología 
por permitirme realizar una parte de mi Trabajo en sus instalaciones. 
 
Este trabajo lo quiero dedicar a: 
 
 
 
La persona que esta siempre para mi, Israel. 
 
 
A mis padres Virginia y Eduardo por su ejemplo de lucha 
 
 
A mis hermanos Ely, Sonia y Lalo por su tenacidad 
 
 
A mis suegros Julia y Aurelio por su apoyo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La vida es hacer preguntas y no saber las respuestas… 
el deseo de ver lo que esta por delante nos impulsa a 
continuar… 
debemos continuar haciendo preguntas, deseando 
comprender… 
aun sabiendo que nunca encontraremos las respuestas… 
debemos seguir haciendo las preguntas 
 
Alli, TaKen. 
 
 
Índice. 
 
 
Resumen Ι 
 
Capitulo 1: Introducción general 1 
 
1. Familia Orchidaceae 1 
1.1. Germinación de las semillas de las orquídeas e importancia de la 
 micorriza orquidácea. 3 
1.2 Hongos micorrízicos de las orquídeas. 7 
2. Amenazas a la diversidad de las orquídeas. 11 
3. Estrategias de conservación. 12 
3.1. Métodos de conservación in situ 13 
3.2. Métodos de conservación ex situ. 14 
4 Área de estudio. 17 
5. Justificación. 21 
6. Objetivo general 22 
 
Capitulo 2: Germinación simbiótica in situ y ex situ de Bletia campanulata, 
Dichromanthus aurantiacus y D. cinnabarinus. 23 
 
1. Introducción. 23 
2. Área de estudio 25 
3. Método. 26 
3.1 Pruebas de germinación simbiótica in situ de Bletia campanulata y 
 Dichromanthus aurantiacus 26 
3.2. Aislamiento de hongos micorrízicos. 27 
3.3. Pruebas de germinación simbiótica in vitro. 28 
4. Resultados. 30 
4.1. Pruebas de germinación simbiótica in situ 30 
4.2. Aislamiento de hongos micorrízicos. 34 
4.3. Pruebas de germinación simbiótica in vitro. 34 
5. Discusión. 385.1. Pruebas de germinación simbiótica in situ 38 
5.2. Aislamiento de hongos micorrízicos. 42 
5.3. Pruebas de germinación simbiótica in vitro 43 
6. Conclusiones. 46 
 
Capitulo 3: Caracterización molecular de hongos micorrízicos. 48 
 
1. Introducción. 48 
2. Método. 51 
2.1. Banco de germoplasma de hongos micorrízicos. 51 
2.2. Caracterización morfológica. 51 
2.3. Extracción de ADN. 52 
 
2.4. Amplificación y secuenciación de la región ITS. 52 
3. Resultados. 53 
3.1. Determinación morfológica y molecular 53 
5. Discusión. 56 
6. Conclusiones. 59 
 
Capitulo 4: Reintroducción de plántulas simbióticas de Dichromanthus aurantiacus a 
su hábitat 61 
 
1. Introducción. 61 
2. Sitios de reintroducción. 64 
3. Método. 64 
3.1. Obtención de plántulas simbióticas y aclimatación ex vito. 64 
3.2. Reintroducción a su hábitat. 65 
4. Resultados. 66 
4.1. Aclimatación de plántulas simbióticas ex vitro. 66 
4.2. Reintroducción a su hábitat . 69 
5.Discusión. 70 
6. Conclusiones. 72 
 
Capitulo 5. Conclusiones generales y consideraciones finales. 73 
 
Literatura citada. 76 
 
Anexos. 87 
Anexo 1. Descripción de las especies de orquídeas. 87 
Anexo 2. Descripción de los sitios e siembra de los dispositivos de germinación in 
situ de Bletia campanulata y Dichromanthus aurantiacus. 90 
Anexo 3. Medios de cultivo y soluciones nutritivas utilizadas. 91 
Anexo 4: Características morfológicas de los aislados de hongos micorrízicos de 
orquídeas del banco de germoplasma. 92 
Anexo 5: Bases de las secuencias las regiones ITS. 96 
Anexo 6. Mapas de los sitios de reintroducción. 101 
Anexo 7Base de datos de las plántulas simbióticas de Dichromanthus aurantiacus 
reintroducidas. 107 
 
 
 
RESUMEN. 
 
Se presenta un estudio integral que va desde la germinación simbiótica in situ y ex situ 
hasta la reintroducción de algunas orquídeas terrestres de la Reserva Ecológica del 
Pedregal de San Ángel, en México D. F. Este hábitat tiene un deterioro a pesar de su 
protección y ha resguardado a una orquideoflora importante del Valle de México. De 
las 24 especies de orquídeas registradas para el mismo, han desaparecido ya 
poblaciones como Bletia punctata, Cyrtopodium macrobulbon, Epidendrum anisatu, 
Habenaria strictissima y Liparis greenwoodiana. Es necesario elaborar protocolos de 
propagación y reintroducción en especies vulnerables y en especies modelo, que 
permitan ser aplicados para la conservación de las plantas y los hongos y la 
restauración futura de este hábitat. 
Debido a que las orquídeas establecen una relación simbiótica obligada con 
hongos micorrízicos durante la germinación, la propagación simbiótica es la estrategia 
que debería desarrollarse para fines de reintroducción. Esta sin embargo necesita 
varios pasos de distinta complejidad. Desde el aislamiento de cepas que estimulen la 
germinación, hasta los protocolos de aclimatación en invernadero de las plantas 
propagadas. Los hongos que estimulan la germinación pueden ser distintos de los 
establecidos en plantas adultas por lo que es necesario realizar estudios de 
germinación in situ. Finalmente, la caracterización de los aislados que promueven la 
propagación simbiótica con fines de restauración es de suma importancia para 
contribuir al conocimiento de la especificidad y ecología de esta familia en el hábitat. 
Los estudios taxonómicos tradicionales junto con la integración de datos moleculares, 
permitirían identificar de una manera certera a los hongos aislados y seleccionados en 
diversas pruebas de germinación in vitro. 
En el presente trabajo se implementaron por vez primera, los dispositivos de 
germinación simbiótica en campo en los que se lograron aislar 14 cepas de hongos 
micorrízicos que promueven la germinación de Dichromanthus aurantiacus, una 
especie bien representada en El Pedregal que puede servir de modelo. Estos aislados, 
junto con algunos otros obtenidos de plantas adultas de la misma especie y D. 
 I
cinnabarinus, se integraron al banco de germoplasma ya existente del Laboratorio de 
Microcosmos Bioedáfico del Instituto de Geología de la UNAM. 
Se realizaron pruebas de germinación in vitro con diversos aislados de este banco 
de germoplasma en Bletia campanulata, Dichromanthus aurantiacus y D. 
cinnabarinus. Los resultados obtenidos demostraron que estas plantas presentan una 
especificidad a nivel genérico en la asociación con sus endofitos. Tres especies del 
género Bletia (B. campanulata, B. urbana y Bletia sp.), resultaron estar asociadas con 
la familia Tulasnellaceae, mientras que D. aurantiacus y D. cinnabarinus están 
asociadas a la familia Ceratobasidiaceae. Esta especificidad fue corroborada con las 
secuencias del análisis molecular de la región ITS de los aislados que concuerdan con 
las caracterizaciones morfológicas de estas dos familias. 
Los hongos del banco de germoplasma se utilizaron para realizar la germinación 
simbiótica in vitro y aclimatación de Bletia campanulata, Dichromanthus aurantiacus y 
D. cinnabarinus. Al respecto, algunos delos aislados probados con anterioridad que 
demostraron ser altamente efectivos en la germinación de las semillas, no tuvieron el 
mismo efecto en prácticas posteriores. Estos resultados dejan claro la complejidad del 
manejo de cepas efectivas en estudios monoxénicos y su reproducibilidad. Sin 
embargo, aún cuando los aislados no tuvieron el mismo efecto en la germinación de 
algunas especies como Dichromanthus aurantiacus, un porcentaje considerable de 
plantas obtenidas en la primera propagación simbiótica fue reintroducida en campo 
con resultados exitosos de sobrevivencia del 12 % después de un año. Un nuevo grupo 
de plantas propagadas de esta misma especie con distintos aislados del banco de 
germoplasma provenientes inclusive, de hongos aislados de protocormos germinados 
in situ, fueron reintroducidos en la época de lluvias del año anterior por lo que no se 
incluyen resultados de esta práctica. 
En el presente trabajo se lograron desarrollar métodos de conservación in situ y 
ex situ complementarios para algunas orquídeas terrestres del Pedregal de San Ángel, 
apoyados por diferentes metodologías como cultivo in vitro, experimentos en el campo 
e identificación molecular. Este trabajo puede ser tomado como un modelo para 
desarrollar una estrategia de conservación y restauración de poblaciones de otras 
orquídeas terrestres. 
 
 II
Capítulo 1: Introducción general. 
 
 
 
1. Familia Orchidaceae. 
 
 
La familia Orchidaceae es una de las familias de plantas con flor mas grandes y 
diversas. Se estima que está conformada por 20 000 a 30 000 especies 
distribuidas en 5 subfamilias (Cribb et al., 2003). Esta diversidad es el resultado de 
una larga historia evolutiva, que comienza con la aparición de las primeras 
orquídeas hace unos 100 o 110 millones de años (Hágsater et al., 2005). Esta 
familia ha podido establecerse en casi todos los ambientes de la tierra, desde 
selvas hasta desiertos. Sus formas de vida son diversas; algunas son terrestres 
(arraigadas en el suelo), otras son epifitas (que crecen sobre los troncos y ramas de 
los árboles), algunas litofitas (que crecen en la superficie de una roca) y otras más 
crecen como lianas o son completamente subterráneas (Dressler, 1981; Peña, 
1990; Hágsater et al., 2005). Una característica importante de esta familia es su 
capacidad de establecer interacciones con otros seres vivos como hongos 
micorrízicos, polinizadores, árboles hospederos u hormigas mutualistas (Dressler, 
1993; Cozzolino y Widmer, 2005; Hágsater et al., 2005). 
La familia Orchidaceae pertenece a la clase de las monocotiledóneas, las 
cuales son principalmente plantas herbáceas y presentan dos tipos de crecimiento: 
1) monopodial, cuando el tallo o eje principal crece a partir de un solo meristemo 
apical; 2) simpodial, cuando cada nuevo crecimiento se desarrolla a partir de una 
yema o meristemo lateral en el anterior. Los tallos de muchas orquídeas se 
engrosan para formar pseudobulbos (aéreos) o cormos (subterráneos), los cuales 
actúan como órganos de almacenamiento de agua y sustancias nutritivas. Las 
raíces de las orquídeas son simples o ramificadas, con un diámetro entre 1 y 10 
mm. Muchas orquídeas presentan en la epidermis de la raíz una cubierta de células 
muertas llamada velamen que tiene como principal función la captación de agua. 
En otras orquídeas las raíces son gruesas, carnosas y sirven como reserva de 
nutrimentos y agua (Larson, 1988; Peña, 1990; Dressler, 1993; Hágsater et al., 
2005). 
 1
Las flores de las orquídeas son la parte más vistosa de la planta; pueden 
presentarse en racimos o panículas y en ocasiones en forma solitaria. Hay seis 
características principales que separan a las flores de las orquídeas de todas las 
demás flores del reino vegetal (Fig. 1) (Dressler, 1981; Larson, 1988; Peña, 1990 
Cozzolino y Widmer, 2005; Hágsater et al., 2005): 
 
1. La flor presenta zigomorfismo (simetría bilateral). 
2. Los órganos sexuales femenino y masculino están fusionados formando la 
columna o ginostemio. 
3. Generalmente tienen un solo estambre fértil. 
4. La flor presenta tres sépalos y tres pétalos, uno de los cuales está 
modificado y es denominado labelo o labio, situándose en posición opuesta 
a la columna. 
5. Los granos de polen están agrupados en masas compactas o polinios. 
6. La columna presenta un rostelo, una parte no receptiva que separa los 
polinios de la superficie fértil del estigma e interviene en la dispersión de los 
polinios. 
 
 
 
Sépalo dorsal 
Estambre 
Pétalo Estigma 
Rostelo 
Sépalo lateral 
B 
A Labelo
Figura. 1. Estructura de una flor de orquídea. A, flor de Encyclia, vista frontal; B, vista ventral de la 
columna. Tomado de Dressler (1993). 
 
 
Las flores de las orquídeas son polinizadas comúnmente por una gran variedad 
de insectos, entre ellos, abejas, avispas, moscas y mariposas y en ocasiones por 
 2
algunas aves como los colibríes. Los polinizadores son atraídos por diferentes 
estímulos visuales (colores y formas de las flores), texturas y olores (Cozzolino y 
Widmer, 2005; Hágsater et al., 2005). 
Los frutos de las orquídeas son cápsulas que al madurar liberan las semillas, 
que varían en su número de unos pocos miles a cuatro millones. Su tamaño es muy 
pequeño; miden entre 0.05 y 6.00 mm (Arditti y Ghani, 2000). 
 
 
1.1. Germinación de las semillas de las orquídeas e 
importancia de la micorriza orquidácea. 
 
 
Las diminutas semillas de las orquídeas contienen un embrión indiferenciado y 
puede estar constituido desde 8 a 734 células en orquídeas terrestres. El embrión 
no presenta cotiledones y no tiene reservas alimenticias (carece de endospermo); 
puede contener en sus células lípidos o proteínas que pueden ser suficientes para 
iniciar la germinación, pero que no están disponibles metabólicamente. Sin 
embargo, algunas especies de orquídeas de los géneros Dactylorhiza y Orchis 
pueden llegar a metabolizar estas reservas para germinar (Rasmussen, 1995; 
Arditti y Ghani, 2000). La mayoría de las semillas de las orquídeas dependen de la 
energía y nutrimentos que les proporcionan hongos micorrízicos para germinar y 
desarrollarse (Rasmussen 1995; Smith y Read, 1997); es decir, atraviesan por una 
fase micoheterótrofa antes de llegar a ser autótrofas. Otro beneficio que 
proporciona el hongo en algunas especies de orquídeas es la interrupción de la 
latencia (Brundrett et al., 2003; Peterson et al., 2004). 
La germinación de las orquídeas marca la transición del estado de embrión 
latente a una forma metabólicamente activa, en donde se producen eventos como 
el aumento de la tasa de respiración, la síntesis de enzimas y ácidos nucleicos, la 
división celular e hidratación de proteínas (Pritchard, 1993). Estos eventos 
dependen de factores abióticos como la luz, el agua y la temperatura. El proceso de 
germinación se inicia con la imbibición (movimiento del agua al interior del 
embrión), produciendo un aumento de volumen que rompe la testa. A partir de este 
evento, comienza la división celular, formando una estructura casi esférica o en 
forma de trompo denominada protocormo, en donde se puede distinguir un 
meristemo en la parte superior y por otro lado, rizoides (Arditti, 1992). El 
protocormo posteriormente se desarrollará en una plántula donde Zettler y McInnis 
 3
(1993), proponen las siguientes etapas de desarrollo que serán referidas durante 
el desarrollo del presente trabajo (Fig. 2): 0, semillas antes de germinar; 1, 
imbibición y ruptura de testa; 2, protocormo con presencia de rizoides; 3, 
protocormo con primordio foliar; 4, aparición de primera hoja verdadera; 5, 
alargamiento de la hoja y aparición de raíz; 6, plántula. 
 
 
 
Figura 2. Semilla y diferentes etapas de desarrollo y crecimiento de Spiranthes cernua: rh, 
rizoides; Ip, primordio foliar; tl, hoja verdadera; rt, raíz. Tomado de Zettler y McInnis (1993). 
 
 
Para que estos eventos se lleven a caboen condiciones naturales, es necesario 
que la semilla sea colonizada por un hongo micorrízico capaz de establecer una 
relación simbiótica estable. Esta relación inicia comúnmente cuando las hifas del 
hongo atraviesan las células del suspensor, llegando hasta las células del embrión 
donde se introducen y comienzan a formar masas de hifas tridimensionales (los 
pelotones), estructuras típicas de esta asociación (Fig. 3). Con estos eventos se 
inicia la colonización o simbiosis en donde el embrión comienza la digestión de las 
hifas que forman los pelotones, obteniendo con ello carbohidratos y nutrimentos y 
comienza a aumentar hasta que se forma el protocormo (Clements, 1988; 
Rasmussen, 1995; Peterson et al., 2004). Durante el desarrollo del protocormo 
simbiótico, se observa su polarización (región del meristemo apical y parte basal) 
en donde se observan los pelotones distribuídos en la parte basal (Fig. 4). Algunas 
hifas, pueden salir del protocormo a través de los rizoides. En algunos casos la 
 4
1 . Ip 
colonización o recolonización se puede dar a través de los rizoides (Clements, 
1988; Arditti, 1992; Rasmussen, 1995; Peterson et al., 2004). 
 
 
 
B 
 A 
Figura 3. A. Microfotografía de microscopio electrónico de barrido de pelotones de un protocormo de 
Orchis morio. Tomado de Peterson et al. (2004). B. Microfotografía de microscopia de luz de 
pelotones de un protocormo de Dichromanthus aurantiacus 400 X. Foto tomada por Rangel (2005). 
 
 
Figura 4. Corte longitudinal de un protocormo de Bletia urbana (estadio 4), mostrando la parte 
inferior colonizada por hongos micorrízicos (zona oscura) (microscopia de luz). Foto proporcionada 
por Ortega-Larrocea. 
 
 
El protocormo continúa su desarrollo hasta transformarse en una plántula, la 
colonización del hongo micorrízico se limita a la parte basal y va migrando a las 
raíces recién formadas, sin llegar a colonizar al meristemo de las raíces (Ortega-
Larrocea et al., datos no publicados). En algunas especies, la transición de la fase 
micotrófica a la fase autótrofa (fotosintética) de las plántulas, puede tardar varios a 
años (Rasmussen y Rasmussen, 1991). La relación simbiótica puede continuar a lo 
largo de la vida de la orquídea. En la etapa adulta, el tejido micotrófico o área de 
 5
desarrollo del hongo, se encuentra fundamentalmente en la corteza de las raíces y 
ocasionalmente en otros órganos como tallos (Ramsay et al., 1986; Rasmussen, 
1995). Las zonas de colonización en las raíces de las orquídeas terrestres suelen 
presentarse en parches y con una distribución irregular, algunas de ellas se pueden 
distinguir por una coloración amarillenta en la epidermis (Mitchell, 1989). 
La presencia de la asociación micorrízica es vital para la germinación y el 
establecimiento de las plántulas de orquídeas en condiciones naturales, 
especialmente para las especies terrestres (Rasmussen, 1995; Zettler, 1997). 
Bayman et al. (2002) desarrollaron un experimento en Puerto Rico con una 
población silvestre de plántulas de Lepanthes rupestris que presentaba pelotones. 
Fumigaron las plantas con un fungicida y observaron que las plántulas se vieron 
afectadas negativamente en su crecimiento y que el número de pelotones 
disminuyó, además de que la mortandad de las mismas aumentó. Los datos de 
estos autores apoyan la hipótesis de que la inhibición del crecimiento del hongo 
micorrízico podría reducir el crecimiento y la sobrevivencia de plántulas de 
orquídeas. En las plantas adultas, la micotrofia o dependencia de sus hongos 
endofitos puede no ser tan grande, pero la colonización micorrízica les proporciona 
ventajas como la obtención de fósforo, así como la adquisición de otros 
suplementos nutrimentales (Rasmussen, 1995; Zettler, 1997; McCormick et al., 
2004; Peterson et al., 2004). Cabe señalar que existen orquídeas aclorofitas como, 
Corallorhiza spp., Galeola spp., Neottia spp., las cuales son totalmente 
dependientes de la relación micorrízica durante toda su vida y establecen 
relaciones simbióticas altamente específicas. Otras orquídeas terrestres presentan 
una sucesión de hongos micorrízicos a lo largo de su vida (Taylor et al., 2002; 
Zettler et al., 2003; Peterson et al., 2004). 
El establecimiento de una relación micorrízica presenta beneficios para la 
planta huésped ya que le permite tener mayor acceso a recursos limitantes del 
suelo como el agua y minerales. Las micorrizas incrementan la tolerancia a la 
sequía, favorecen el crecimiento de las plantas en suelos pobres y les proporcionan 
protección ante los patógenos. Por estas razones y las anteriormente expuestas, se 
ha sugerido que el desarrollo de la relación micorrízica es crucial en la evolución de 
la familia Orchidaceae, dado que puede afectar la diversidad de las orquídeas, su 
distribución, tamaño poblacional y reservorio (pool) genético (Rasmussen y 
 6
Whigham, 1998; Batty et al., 2001a; Bayman et al., 2002; Taylor et al., 2002; 
Brundrett et al., 2003; McCormick et al., 2004). 
 
 
1.2. Hongos micorrízicos de las orquídeas. 
 
 
La asociación simbiótica de las orquídeas es de tipo endomicorrízico, ya que las 
hifas penetran la pared vegetal para establecerse entre ésta y la membrana celular, 
sin perforarla (Read et al., 1992). Como se mencionó antes, la estructura típica de 
esta asociación micorrizica son los pelotones, los cuales sufren un proceso de lisis 
o digestión por la célula vegetal, liberando el contenido citoplasmático del hongo. 
Este proceso se puede dar en dos formas diferentes denominadas tiofagia y 
tolipofagia (Burgeff, 1959). La diferencia radica en que en la primera, la lisis de las 
estructuras del hongo es total y en la segunda, se dan ciclos de lisis seguidos por 
otros de nueva formación de pelotones en el mismo estrato celular, observándose 
capas celulares hospederas y regiones de digestión (Fig. 5) (Reyes, 1973; Mukerji 
et al., 2000). 
 
 
 
B 
A 
Figura. 5. A Tiofagia. Raíz de Gastrodia callosa. Se observan dos capas de células de pasaje y una 
capa de fagocitosis que muestra hifas liberando su contenido citoplasmático el cual es absorbido 
por estructuras esféricas llamadas tiosomas. B Tolipofagia. Raíz de Platanthera chlorantha. Se 
observa una capa de células hospederas adyacentes a la epidermis y dos capas de células 
digestoras (fagocitos). Ilustración original de Burgerff (1959) tomada de Reyes (1973). 
 
 
 7
Los hongos aislados de tejidos de orquídeas que presentan pelotones se han 
identificado con el género forma Rhizoctonia (Sneh et al., 1991; Ulloa y Hanlin, 
2001; Taylor et al., 2002). Es frecuente que a estos hongos se les asignen dos 
nombres basados en dos grupos de características. Uno para el anamorfo, basado 
en características vegetativas como la morfología de las hifas y esporas asexuales y 
el segundo asignado al telomorfo, basado en las estructuras sexuales, es decir, las 
características de los esporocarpos. Sin embargo, es muy raro observar la fase 
sexual de los hongos asignados al género forma Rhizoctonia, por lo que es más 
frecuente poderse referir a ellos o identificarlos en su fase anamórfica (Sneh et al., 
1991; Mukerji et al., 2000; Taylor et al., 2002). La determinación del género forma 
Rhizoctonia en su forma anamórfica se basa principalmente en características 
observables del micelio creciendo in vitro incluyendo las siguientes (Fig. 6) (Moore, 
1987; Andersen, 1990; Sneh et al. 1991): 
 
1. Color de la colonia generalmente hialina o marrón. 
2. Hifas septadas. 
3. Bifurcación a 90° cerca del septum distal en hifas jóvenes. 
4. Formación de células monilioides (propágulos asexuales). 
5. Doliporo septado. 
6. Hifas binucleadas o multinucleadas. 
7. Ausencia de conexiones en puente (clamp), esclerocios diferentes, 
conidias, rizomorfos. 
 
 
 
 8
 
A 
 B C 
Figura 6. A. Dibujo de una típica Rhizoctonia mucoroides. Tomado de Arditti (1992). B. 
Microfotografíasde Epulorhiza inquilin. C. Epulorhiza repens. B y C Tomadas de Peterson et al. 
(2004). Las flechas cabezas de flecha señalan las hifas septadas y las células monilioides. 
 
 
Los miembros del género forma Rhizoctonia que se han aislado de una 
asociación micorrízica con orquídeas pertenecen a los basidiomicetes, los cuales 
apareando los nombres del anamorfo/telomorfo presentan las siguientes 
correspondencias: Epulorhiza (anamorfo) /Tulasnella (telomorfo), 
Ceratorhiza/Ceratobasidium, Opadorhiza/Sebacina y Rhizoctonia 
DC/Thanatephorus (Moore, 1987; Taylor et al., 2002). Las características 
morfológicas en el cultivo in vitro de los anamorfos de estos hongos no permiten 
una fácil distinción y la inducción del estado perfecto es difícil de conseguir en 
algunos casos, por lo que en los últimos tiempos se han comenzado a utilizar 
herramientas moleculares para su identificación y la construcción de árboles 
filogenéticos para su clasificación (Sneh et al., 1991; Mukerji et al., 2000; 
Kristiansen et al., 2001; Otero et al., 2002; Taylor et al., 2002; Peterson et al., 
2004). Las especies del género Rhizoctonia también se han aislado de cultivos 
infectados de papa y otras especies comerciales, causantes de la enfermedad 
conocida como costra negra (Herrera y Ulloa, 1990; Agrios, 1997). 
 9
Por otro lado, los aislados obtenidos a partir de orquídeas adultas en algunos 
casos estimulan la germinación de semillas de la misma especie y frecuentemente, 
también la germinación de un amplio rango de géneros de orquídeas más 
distantemente relacionadas. Sin embargo, se ha documentado que algunos 
aislados bajo condiciones de laboratorio, no establecen un equilibrio simbiótico y 
pueden ser patógenos de ciertas especies de orquídeas (Warcup y Talbot, 1967; 
Smerciu y Currah, 1989). 
Todos los hongos micorrízicos de las orquídeas presentan habilidades saprobias, 
es decir, pueden utilizar diversas fuentes de carbono siendo capaces de obtener 
carbohidratos de polímeros complejos, almidón, pectina, celulosa y lignina, así 
como azúcares solubles, presentes en la materia orgánica del suelo (Smith y Read, 
1997). Algunos hongos forman al mismo tiempo que con orquídeas asociaciones 
con plantas ectomicorrízicas como las gimnospermas, lo que se conoce como 
asociaciones tripartitas. En este tipo de relaciones se ha documentado que las 
orquídeas también pueden obtener compuestos de carbono directamente de la 
traslocación de fotosintatos de los árboles vía el micelio de los hongos (Allen, 1991; 
Read et al., 1992; Taylor et al., 2002; Peterson et al., 2004). 
Los basidiomicetes que forman micorrizas con las orquídeas también son 
importantes en la pedogénesis ya que son descomponedores de materia orgánica, 
permitiendo la mineralización de elementos como el nitrógeno y el fósforo (Allen, 
1991; Read et al., 1992). Dentro de los compuestos más abundantes que 
componen la materia orgánica del suelo están las ligninas, que son muy 
recalcitrantes por lo que su mineralización puede influir en la cantidad de 
nutrimentos disponibles para las plantas. Los principales degradadores de ligninas 
son los hongos basidiomicetes volviendo accesibles el nitrógeno y compuestos de 
carbono asimilables para ellos y las plantas. Algunos hongos que participan en este 
proceso son Marasmius androsaceus, Agaricus bisporus, Thanatephorus ocraceus, 
así como hongos pertenecientes al género anamorfo Ceratorhiza, etc. (Ceratorhiza 
se asocian con orquídeas) (Cádiz y Giller, 1997, Rasmussen, 2002). Del mismo 
modo, el micelio contribuye a desarrollar la estructura del suelo ya que permite la 
agregación de sus partículas minerales y orgánicas (Allen, 1991; Read et al., 
1992). A su vez, la distribución de los hongos micorrízicos de las orquídeas se 
puede ver afectada o delimitada por las características físico-químicas del suelo, 
 10
que de igual manera limitan a las poblaciones de orquídeas en su establecimiento y 
sobrevivencia (Bowles et al., 2005). 
 
 
2. Amenazas a la diversidad de las orquídeas. 
 
 
La biodiversidad del mundo se ve amenazada por diferentes factores 
principalmente de origen antropogénico, como la destrucción, degradación y 
fragmentación de los hábitats. La pérdida de la biodiversidad trae como principales 
consecuencias: la disminución de la diversidad de los ecosistemas, especies y 
genes, aumento en la tasa de extinción, desaparición de relaciones biológicas, 
alteración de las cadenas tróficas, pérdida de servicios ambientales como la 
retención y captación de agua, el paisaje, amortiguamiento de ruido, el reciclaje de 
nutrimentos esenciales como el nitrógeno y el fósforo, la absorción de dióxido de 
carbono, la regulación de temperatura y precipitación, la protección del suelo 
(Toledo, 1994; Wotavová et al., 2004). 
La diversidad de la familia Orchidaceae esta amenazada debido principalmente 
a la destrucción de sus hábitats; a que algunas especies son extraídas 
directamente de su hábitat sufriendo una explotación no sustentable de sus 
poblaciones (Rubluo et al., 1993; Koopowitz et al., 2003). El cambio de uso de 
suelo es uno de los factores que afectan la diversidad y persistencia de las 
orquídeas. Una evidencia experimental de esto es lo observado por Wotavová et al. 
(2004), quienes documentan que el cambio en la concentración de nutrimentos y 
drenaje del suelo propiciados por la agricultura, afectan directamente a las 
poblaciones de Dactylorhiza majalis, una orquídea terrestre. 
México alberga entre el 8 y 12 % del total de especies del planeta, por lo que es 
considerado un país megadiverso. México ocupa el cuarto lugar mundial en cuanto 
a la riqueza de flora y muchas especies que conforman esta riqueza son endémicas 
de este país (Toledo, 1994; Rzedowski, 1998). La familia Orchidaceae esta 
representada por más de 1 200 especies, de las cuales cerca de 450 son 
endémicas; además México es considerado centro de diversificación de los géneros 
Barkeria, Bletia, Clowesia, Deiregyne, Encyclia, Laelia y Schiedeella entre otras 
(Soto, 1988; Hágsater et al., 2005). En cuanto a las orquídeas terrestres 
 11
mexicanas, los géneros de la subtribu Spiranhtes, así como Bletia, Govenia, 
Habenaria y Malaxis son los mejor representados (Soto, 1996). 
Desafortunadamente, México considerado en la lista “Hots-pots” como un lugar 
de elevada diversidad, es considerado como un lugar bajo amenaza crítica de esta 
diversidad. Esta situación es producto de las actividades humanas como la 
agricultura, la ganadería, la expansión de zonas urbanas, la apertura de vías de 
comunicación la tala inmoderada, el comercio ilegal de especies, la sobre colecta, 
etc. (Vázquez-Yánez y Batís, 1996; Damon et al., 2005; Hágsater et al., 2005). En 
México, se han extinguido alrededor de 22 especies de orquídeas en los últimos 20 
años (Hágsater et al., 2005). La Norma Oficial Mexicana, NOM-059-ECOL-2001, 
incluye 181 especies de orquídeas con diversos grados de amenaza, entre de las 
cuales una especie está probablemente extinta en su medio silvestre (Laelia 
gouldiana), 15 en peligro de extinción, 58 amenazadas y 107 sujetas a protección 
especial. Por otra parte, la disminución de las poblaciones, aún cuando no estén 
consideradas como amenazadas, erosiona la diversidad genética, lo que podría 
poner en riesgo la capacidad de sobrevivencia de las especies (Hágsater et al., 
2005). 
 
 
3. Estrategias de conservación. 
 
 
No hay duda de que aún cuando la legislación mexicana considere un número 
particular de especies de orquídeas en peligro, muchas otras especies también 
pueden estar bajo la amenaza de desaparecer, dado que es posible que en muchos 
hábitats todavía se desconozca la diversidad de especies de orquídeas. Aunado a 
esto, la biología de la propia familia representa un reto para su conservación, 
debido a que muchas especies presentan bajas tasas de crecimiento, ciclos de vida 
relativamentelargos y escaso reclutamiento de nuevos individuos en condiciones 
naturales. Para la conservación de la diversidad de orquídeas es necesario 
incrementar nuestro conocimiento sobre la estructura genética de las poblaciones, 
sus ciclos de vida, polinizadores y su relación con sus hongos micorrízicos (Cribb et 
al., 2003; Baltazar, 2004). 
La conservación de la diversidad de las orquídeas es multidisciplinaria debido a 
la complejidad de factores que intervienen para que éstas estén en peligro, por lo 
 12
que requiere del empleo de diversas áreas del conocimiento que comprenden a la 
biología, economía y diversas áreas sociales. Es prioritario diseñar programas de 
recuperación de especies, monitoreo de poblaciones y análisis de posibles causas 
de su declinación, combinados con programas de manejo y restauración de 
hábitats, complementados con cultivo ex situ (fuera de sus hábitats), reintroducción 
y programas de educación pública. Todo esto permitiría un manejo sustentable del 
hábitat de las orquídeas, así como la creación de leyes para su comercialización y 
aprovechamiento (Cribb et al., 2003). 
 
 
3.1. Métodos de conservación in situ. 
 
 
La conservación in situ se define como la preservación de la biodiversidad en sus 
hábitats naturales. Este es el único método mediante el cual se conserva la 
dinámica de las poblaciones propia de los factores selectivos de su medio, 
manteniendo su habilidad para interactuar con otros organismos como sus 
polinizadores y hongos micorrízicos, preservando su diversidad genética y 
manteniendo su capacidad de sobrevivencia para continuar sus procesos 
evolutivos (Dixon et al., 2003; Baltazar, 2004). La principal estrategia en la 
conservación in situ es el decreto de áreas naturales protegidas que tienen por 
objeto preservar y asegurar el aprovechamiento sustentable, aunque no siempre 
posible la conservación de la biodiversidad, para garantizar que las relaciones 
biológicas (cadenas tróficas, relaciones simbióticas, etc.) y presiones de selección, 
se mantengan (Conabio, 1998). 
Una estrategia que enlaza la conservación in situ y la ex situ es la reintroducción 
de plantas nativas. En ella se utiliza material propagado fuera del lugar y se 
restituye a su hábitat con el objetivo de aumentar el número poblacional de alguna 
especie o reintroducir nuevamente un elemento ya desaparecido del ecosistema 
(Ramsay y Dixon, 2003). 
La reintroducción de especies nativas de orquídeas ha tenido en algunos casos 
éxito. Por ejemplo, Gangaprasad et al. (1999) lograron establecer en la India 819 
plántulas de la orquídea terrestre Ipsea malabarica, iniciando el establecimiento de 
protocolos de propagación y reintroducción exitosos para ésta y otras especies de 
ese país. En el Reino Unido después de varios intentos, Ramsay y Stewart (1998) 
 13
lograron establecer plántulas de Cypripedium calceolus, una orquídea rara y que en 
el pasado había sufrido una importante sobrerecolecta. En estos ejemplos se 
utilizaron métodos de propagación asimbióticos, es decir, la germinación y 
desarrollo de las plantas substituyendo a los hongos micorrízicos por medios de 
cultivo enriquecidos. En otra parte del Reino Unido, Ramsay y Dixon (2003) 
propagaron simbióticamente y asimbióticamente a la orquídea terrestre Liparis 
loeselii y sólo lograron establecer plantas provenientes de la propagación 
simbiótica. Stewart y Zettler (2003) reintrodujeron en Estados Unidos 172 plántulas 
propagadas simbióticamente de Spiranthes brevilabris, trabajo con el que 
demostraron que estas orquídeas podían propagarse exitosamente y ser usadas 
potencialmente en proyectos de restauración. 
Para México también existen ejemplos que lograron la reintroducción de 
especies de orquídeas a su hábitat. Rubluo et al. (1993) reintrodujeron plántulas 
de Oncidium stramineum y Lycaste aromatica. Anteriormente, Rubluo et al. (1989), 
reintrodujeron a la reserva ecológica del Pedregal de San Ángel, 133 plántulas de 
Bletia urbana de las cuales sobrevivieron el 15 % después de un año. Con esta 
misma orquídea del Pedregal, Castillo (2002) realizó la primera propagación 
simbiótica que le permitió reintroducir 170 plántulas de las que sobrevivieron 62 % 
en un año. Ortega-Larrocea et al. (sometido) han registrado anualmente la 
sobrevivencia de las poblaciones introducidas por Castillo y han observado que con 
la reintroducción simbiótica, la sobrevivencia se ha mantenido estable en más de 
un 50 % durante 5 años de observación. Estos autores lograron también registrar 
un evento reproductivo autónomo, la producción de la primera cápsula viable 
desarrollada por una de estas plantas reintroducida simbióticamente después de 5 
años. Bletia urbana es una orquídea endémica de México y considerada como 
amenazada y ha servido como modelo para iniciar los estudios de propagación 
simbiótica de orquídeas terrestres de México. 
 
 
3.2. Métodos de conservación ex situ. 
 
 
La conservación ex situ es aquella que se desarrolla fuera del hábitat de las 
especies y se considera como complemento y apoyo a la conservación in situ, ya 
que preserva sólo una parte de la diversidad genética. Esta estrategia tiene como 
 14
objetivo rescatar germoplasma amenazado, producir material para la 
reintroducción, restauración y manejo de los hábitats y para otros propósitos, como 
la comercialización, educación ambiental, exhibiciones, etc. con el fin de eliminar o 
reducir la presión de la recolecta silvestre (Baltazar, 2004). 
Algunas de las estrategias utilizadas en la conservación ex situ son: 1) el 
establecimiento de jardines botánicos, ya que con sus colecciones de plantas vivas 
permiten la realización de investigaciones encaminadas al rescate de especies 
amenazadas o en peligro de extinción (además de contar con programas de 
educación); 2) la creación de bancos de germoplasma que sirven como reservorios 
genéticos de algunos organismos, de individuos o poblaciones, a través del 
almacenamiento de semillas, esporas, propágulos y tejidos conservados in vitro en 
condiciones ideales y prolongadas que permitirán conservar parte de la diversidad 
genética; 3) el cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro que engloba un amplio 
rango de técnicas bajo condiciones asépticas, como la germinación de semillas, la 
micropropagación, el cultivo de meristemos y callos entre otros (Martínez, 1985; 
Arditti, 1992; Baltazar, 2004). 
Las orquídeas fueron una de las primeras plantas en ser propagadas in vitro a 
partir de semillas, lográndose desarrollar dos métodos de obtención de plántulas, 
el simbiótico y el asimbiótico (Arditti, 1992). El método asimbiótico consiste en 
sembrar las semillas de las orquídeas en un medio rico en azúcares como fuente 
externa de carbono, mientras que el método simbiótico se basa en propiciar el 
establecimiento de la relación simbiótica entre las semillas de las orquídeas y un 
hongo micorrízico compatible. El cultivo de tejidos vegetales es un método 
altamente exitoso y muy usado para llevar acabo la propagación masiva de 
orquídeas (Cymbidium, Phalaenopsis, Orchis, Cattleya, Dendrobium, etc) (Arditti y 
Krikorian, 1996). Sin embargo, algunas semillas de orquídeas terrestres son 
generalmente difíciles de germinar in vitro asimbióticamente ya que muchas 
dependen de su hongo micorrízico para llevar a cabo este proceso (Arditti et al., 
1981; Oliva y Arditti, 1984; Smith y Read, 1997). El método simbiótico de 
propagación de orquídeas no ha sido tan usado como el método asimbiótico, sobre 
todo para especies de valor comercial. Esto se debe a que cuando hay dos 
organismos involucrados (cultivo monoxénico), el control de los medios se vuelve 
más delicado y no siempre los resultados son repetibles, aún con la misma cepa de 
hongo y procedencia de semillas. Por ejemplo, en algunos casos se ha observado 
 15
que el hongo puede causar un efecto antagónico sobre el crecimientode los 
protocormos llevándolos a la muerte (Muir, 1989; Sneh et al., 1991). Sin embargo, 
son importantes las ventajas que proporciona la propagación simbiótica para la 
conservación de las poblaciones naturales, como aumentar el porcentaje de 
sobrevivencia, el que se pueda reintroducir y conservar dos organismos nativos al 
mismo tiempo y sobre todo mantener la adecuación de las poblaciones a lo largo 
del tiempo (Batty et al., 2001b; Rasmussen, 2002). 
Se han desarrollado otras vías para la micropropagación de las orquídeas como 
la propagación masiva y clonal a partir de explantes como meristemos, ápices, 
raíces, hojas jóvenes y maduras, inflorescencias jóvenes y maduras, embriones, 
nudos, entrenudos, nudos de inflorescencia, pedúnculos de flores, base de hojas, 
tallo con yemas axilares, etc. (Arditti y Krikorian, 1996). Sin embargo, para lograr 
mantener la variabilidad genética es preferible realizar la propagación desde 
semillas y tomar en cuenta los fines que se tengan. Si proposito de la propagación 
es la reintroducción, se debe considerar el establecimiento de la simbiosis 
micorrízica ya que la presencia del simbionte puede ser necesaria para la 
sobrevivencia y establecimiento de poblaciones a largo plazo. 
Las prácticas documentadas de reintroducción de orquídeas en México, han 
utilizado el método asimbiótico como parte de las estrategias de conservación para 
especies como Cuitlaluzina pendula, Catasetum intergerrimum Mormodes 
tuxtlensis, y Laelia albida, Laelia anceps, Laelia speciosa, Lycaste skinneri y 
Oncidium tigrinum e inicialmente de Bletia urbana (Rubluo et al., 1989 y 1993; 
Baltazar, 2004; Santos-Hernández et al., 2004). Sin embargo, el método simbiótico 
no ha sido explorado en México, en parte porque se tienen pocos ensayos de 
reintroducción y porque no se cuentan con especialistas a nivel nacional en la 
simbiosis orquidácea. El primer trabajo documentado desde el aislamiento del 
simbionte, micropropagación y reintroducción a mediono plazo en México inició con 
Ortega-Larrocea et al. (2000; sometido, 2006) y Castillo (2002) con Bletia urbana y 
otras especies del pedregal (Rangel, 2004). El presente trabajo, es una 
continuación de las investigaciones realizadas en este hábitat. 
 
 
 
 
 
 16
4. Área de estudio. 
 
 
Hace aproximadamente 2 000 años ocurrió la erupción del volcán Xitle y conos 
adyacentes, que cubrió 80 Km2 del valle de México, desde el Ajusco hasta parte de 
lo que hoy son las delegaciones Tlalpan, Coyoacan y Magdalena Contreras 
(González-Hidalgo et al., 2001). La vegetación que se estableció en las partes altas 
de las faldas del Ajusco fue de bosque de pino y encino, mientras que en las partes 
bajas fue matorral xerofilo con Senecio praecox, que se conoce como el Pedregal 
(Rojo, 1994). 
La presión social generada por la demanda de vivienda y servicios en la capital, 
propició el crecimiento de la zona urbana, llevando a la destrucción casi total del 
pedregal quedando pequeños fragmentos aislados. La conservación de algunas de 
las zonas de Pedregal como una acción para frenar la destrucción, fue la creación 
de las reservas ecológicas como la del Pedregal de San Ángel en 1983 y Lomas del 
Seminario en 1989, esta última resguarda una extensión de 727 hectáreas 
aproximadamente (González-Hidalgo et al., 2001). La reserva ecológica del 
Pedregal de San Ángel fue decretada gracias a la preocupación de profesores y 
estudiantes universitarios por proteger lo que quedaba de este tipo de vegetación 
de alta biodiversidad, principalmente dentro de Ciudad Universitaria. La reserva 
contaba con 124 hectáreas cuando fue creada, pero su extensión ha crecido ya 
que en 1990 se incrementó su superficie a 146.8 hectáreas y desde el 2005 
cuenta con una extensión de 237 hectáreas aproximadamente (Fig. 7) (Rojo, 1994; 
De la Fuente, 2005). 
 
 
 17
Figura. 7. Mapa de Ciudad Universitaria en donde se aprecia el área destinada a la Reserva 
Ecológica (Fuente: www.unam.mx). 
 
La Reserva Ecológica El Pedregal de San Ángel está localizada en el suroeste de 
la cuenca del valle de México, aproximadamente entre 19°18’ 31’’ - 19° 19’ 17’’N 
y 99° 10’ 20’’- 99°11’ 52’’ O, a una altitud entre 2 200 y 2 277 m.s.n.m. El clima 
de la zona es templado subhúmedo o Cb (w1) (w) según el sistema modificado de 
clasificación climática de Köppen modificada por García (1964), con régimen de 
lluvias en verano, temperatura media anual de 15.5°C, con variaciones que van 
desde los –6 hasta los 34°C y una precipitación anual de 835 mm, distinguiéndose 
una temporada de lluvias de junio a octubre y una de secas de noviembre a mayo 
(Camacho-Salazar et al., 1993a,b,c; Castillo-Argüero et al., 2004; De la Fuente, 
2005). 
 18
En la reserva los distintos patrones de solidificación de la lava y el efecto de los 
procesos físicos de enfriamiento e intemperismo, dieron como resultado la 
presencia de una topografía irregular, presentándose desde planchas de roca 
totalmente plana hasta hondonadas y grietas que van desde 2 cm hasta 6 m de 
profundidad (Figueroa-Castro et al., 1998). La consecuencia es una gran 
heterogeneidad microambiental y un suelo incipiente de origen eólico y orgánico, 
escaso y poco desarrollado con una profundidad media de 5 cm, que se acumula 
parcialmente en grietas, fisuras y depresiones (Cano-Santana y Meave, 1996). 
La Reserva Ecológica El Pedregal de San Ángel es considerada un refugio para 
la vegetación y fauna originarias del Valle de México (Rzedowski, 1954; Valiente-
Banuet y De Luna-García, 1994; Téllez, 2002; Castillo-Argüero et al., 2004; 
Hágsater et al., 2005). La vegetación dominante en el pedregal es el matorral 
xerófilo descrito por Rzedowski en 1954. Está comunidad está constituida 
predominantemente por un estrato herbáceo bien desarrollado, uno arbustivo y 
algunos elementos arbóreos. Las especies son muy diversas, con alrededor de 350 
especies de plantas donde las familias mejor representadas son Asteraceae, 
Poaceae, Leguminoseae y Orchidaceae (Herrera y Almeida, 1994, Hágsater et al., 
2005). La familia Orchidaceae está representada por 25 especies, casi todas ellas 
terrestres exceptuando un único registro de hábito epifito (Epidendrum anisatum) 
(Cuadro 1) (Hágsater et al., 2005). Las especies de orquídeas más vistosas son 
pertenecientes a los géneros Dichromanthus y Bletia. Desafortunadamente algunas 
de las orquideas han desaparecido de la reserva: Bletia punctata, Cyrtopodium 
macrobulbon, Epidendrum anisatum, Habenaria strictissima y Liparis 
greenwoodiana (Hágsater et al., 2005) y otras como B. urbana se encuentran de 
manera muy aleatoria, cada vez menos frecuentemente (Ortega-Larrocea, com. 
pers.). Esto es consecuencia de la fragmentación y deterioro del hábitat, ya que el 
Pedregal de San Ángel enfrenta graves retos a pesar del aumento de su superficie 
sigue afrontando la introducción de especie exóticas que desplazan a la flora 
nativa, contaminación, principalmente por desechos sólidos ya que se la ha tomado 
como basurero, extracción ilegal de especies nativas, fuegos recurrentes 
producidos por negligencia, así como la constante urbanización de Ciudad 
Universitaria. Estos problemas amenazan con terminar con la vegetación original y 
fauna de reserva ecológica en pocos años (Mera et al., 2002; Téllez, 2002; Castillo-
Arguero et al., 2004). Si no se establecen de manera prioritaria protocolos de 
 19
registro, censo, propagación, reintroducción, etc. de las especies nativas, 
predominantemente aquellas más vulnerables que aún cuando no estén 
oficialmente reconocidas como amenazadas pero que en estudios locales de los 
especialistas se detecten en riesgo, no será posible llevar a cabo la conservación 
efectiva del hábitat y en un futuro la restauración del mismo. 
 
 
Cuadro 1. Registro de orquídeas de la reserva ecológica el Pedregal de San Ángel (Rzedowski, 1954; 
Valiente-Banuet y De Luna-García,1994; Téllez, 2002; Castillo-Argüero et al., 2004; Hágsater et al., 
2005). 
Género Especie 
Aulosepalum pyramidale 
campanulata 
macristhmochila 
punctata 
purpurata 
Bletia 
urbana 
Cyrtopodium macrobulbon 
confusa Deiregyne 
albovaginata 
aurantiacus Dichromanthus 
cinnabarinus 
Epidendrum anisatum 
Govenia lagenophora 
novemfida 
strictissima 
Habenaria 
filifera 
Liparis greenwoodiana 
carnosa 
myurus 
Malaxis 
rodriguezana 
Mesadenus polyanthus 
Ponthieva schaffneri 
Sarcoglottis schaffneri 
Schiedeella llaveana 
Triphora trianthophora 
 
 
 20
5. Justificación. 
 
 
Como se destacó anteriormente, la Reserva El Pedregal es un relicto de vegetación 
de matorral con un eminente deterioro y en el que todavía se encuentran muchas 
especies nativas. Para este hábitat hay pocos estudios actuales de censo y registro 
de la orquideoflora, pero se ha probado recientemente por los grupos de 
especialistas que la investigan (Téllez, Salazar, coms. pers.), que muchas de ellas 
se encuentran cada vez con menos frecuencia o limitadas a pocos metros 
cuadrados. Aunado a esto está el hecho de que se tiene poca documentación de 
las poblaciones y su distribución, los métodos de conservación de germoplasma no 
están implementados de manera rigurosa. Por ejemplo, algunos investigadores 
tienen semillas de especies de la reserva pero no se cuenta con un banco de 
germoplasma de semillas bien organizados o una colección representativa de las 
especies del Pedregal, por ejemplo en el Jardín Botánico. Menos aún se tienen 
estudios dirigidos a la conservación in situ de las plantas, contando únicamente 
con las referencias ya mencionadas para el lugar. 
El trabajo desarrollado por Ortega-Larrocea et al. (sometido) con Bletia urbana, 
ha sentado las bases de un protocolo de reintroducción y sobrevivencia a mediano 
plazo de una especie amenazada en este hábitat. Sin embargo, protocolos 
similares deben ser implementados para otras especies por lo que, la propagación 
simbiótica de orquídeas puede constituir una estrategia altamente viable para su 
conservación y a mediano plazo restauración de su hábitat. La propagación 
simbiótica no sólo es una estrategia más natural para la conservación de la 
orquideoflora local; también permite la conservación de los hongos simbiontes que 
promueven su crecimiento y desarrollo. Los hongos no sólo son importantes para 
las orquídeas, sino también juegan un papel fundamental en los microhábitats que 
forman el mosaico de ambientes del lugar, favoreciendo la descomposición de la 
materia orgánica y volviendo disponibles nutrimentos importantes como el fósforo y 
nitrógeno, no sólo para las orquídeas sino para la flora y fauna circundante. 
La propagación simbiótica se vuelve indispensable por ejemplo para las 
especies del género Dichromanthus, Habenaria y Malaxis que difícilmente 
germinan sin la presencia de su hongo simbionte o que germinan pero que no 
logran continuar con su desarrollo. Sin embargo, para establecer protocolos 
efectivos se requieren varios pasos, que van desde el aislamiento de los hongos 
 21
hasta generar conocimiento básico sobre la ecología de las orquídeas y sus hongos 
micorrízicos. Se cuenta con poca información sobre la relación micorrízica de las 
orquídeas para zonas tropicales y los antecedentes publicados están dados para 
especies distribuidas en otras regiones con climas y problemáticas muy diferentes. 
Existe una alta probabilidad de que en décadas subsecuentes el deterioro de la 
reserva ecológica del Pedregal de San Ángel sea tal que ni siquiera haya 
oportunidad de documentar los hongos que promueven el desarrollo de las 
orquídeas y que podría explicar su distribución. Previamente, Rangel (2004) se dió 
a la tarea de aislar diversos hongos micorrízicos a partir de varias especies de 
orquídeas de la reserva. En dicho trabajo se observó que ciertas especies 
presentaban una tendencia a la especificidad al ser germinadas in vitro con los 
hongos aislados de plantas adultas de la misma especie, mientras que otras, eran 
menos específicas y podían germinar y desarrollarse adecuadamente con endofitos 
aislados de varias especies de orquídeas. Con ese trabajo se inició el 
establecimiento de un cepario o banco de germoplasma de hongos micorrízicos 
para este hábitat abriendo la posibilidad de iniciar trabajos que desarrollen 
protocolos de propagación y reintroducción simbiótica de especies de orquídeas 
terrestres y paralelamente realizar la identificación de los hongos asociados para 
sentar las bases de estudios de la biología de la simbiosis en estas especies. El 
presente trabajo se centro en tres especies cuya descripción se encuentra en el 
anexo 1. Los objetivos particulares se indican en cada capítulo. 
 
6. Objetivo general. 
 
 
Establecer protocolos de germinación simbiótica, aclimatización y reintroducción de 
plántulas para algunas orquídeas terrestres del Pedregal de San Ángel, México, D.F. 
 22
Capitulo 2: Germinación simbiótica in situ y 
ex situ de Bletia campanulata, Dichromanthus 
aurantiacus y D. cinnabarinus. 
 
 
 
1. Introducción. 
 
 
La micorriza es una asociación entre algunas especies de hongos del suelo y las raíces 
de las plantas que involucra una transferencia de nutrimentos (Brundrett, 2002). Este 
tipo de relación simbiótica es la más ampliamente distribuida en la naturaleza y es 
característica en casi el 90 % de las plantas (Kulikov y Filippov, 2001). Esta simbiosis 
es particularmente importante para las especies de la familia Orchidaceae, pues al 
tener semillas muy pequeñas (0.05 a 6. 00 mm) no tienen tejidos de reserva de 
energía para iniciar su germinación (Arditti y Ghani, 2000). Por esta razón, las semillas 
de las orquídeas dependen de los nutrimentos suplementados por un hongo 
micorrízico para germinar en condiciones naturales. Algunas especies de orquídeas 
mantienen esta relación simbiótica durante todo su ciclo de vida (Brundrett et al., 
2003). 
Varios de los estudios sobre la relación micorrízica se han desarrollado in vitro con 
aislados provenientes de plantas adultas que presentan características afines al 
género forma Rhizoctonia (Hadley, 1970; Clements, 1988; Smreciu y Currah 1989; 
Peterson et al., 1996, Zettler et al., 1998, Hollick et al., 2001). Sin embargo los 
resultados de estos estudios pueden llevar a conclusiones inexactas sobre la 
especificidad de la relación orquídea-hongo, ya que muchas orquídeas presentan una 
sucesión de hongos micorrízicos a lo largo de su vida y en algunos casos, el hongo que 
se asocia a una orquídea adulta no es el mismo que estimuló su germinación. En otros 
casos se han probado aislados que provienen de orquídeas adultas en semillas de 
otras especies de orquídeas, observándose que se puede establecer la relación 
simbiótica. A este tipo de especificidad se le llama especificidad in vitro (Masuhara y 
Katsuya, 1994; Rasmussen, 1995; Rasmussen y Whigham, 2002). 
 23
El papel del hongo micorrízico en la naturaleza ha sido poco estudiado; no fue 
hasta que Rasmussen y Whigham (1993) desarrollaron el método de “baiting” o 
dispositivo de germinación in situ, que se pudo seguir este proceso en condiciones 
naturales. Con esta aproximación se logró obtener aislados de hongos micorrízicos que 
favorecen la germinación in situ y permiten conocer la especificidad ecológica 
orquídea-hongo que se da en condiciones naturales. Esta técnica ha sido utilizada 
exitosamente por múltiples investigadores (Masuhara y Katsuya, 1994; Van der 
Kinderen, 1995, Rasmussen y Whigham, 1998; McKendrick et al. , 2000 a y b, Batty et 
al., 2001 a, Brundrett et al., 2003, Feuerherdt et al., 2005; Whigham et al., 2006). El 
uso de los dispositivos de germinación in situ ha servido para evaluar la influencia de 
los hongos asociados a plantas adultas, la época de germinación de las semillas de las 
orquídeas y la influenciade las condiciones abióticas en el establecimiento de la 
relación simbiótica. La utilización de estos dispositivos contribuye al desarrollo de 
conocimientos sobre la ecología y distribución de los hongos micorrízicos y de las 
orquídeas y a su vez, permitirán establecer planes de manejo para la conservación de 
sus hábitats, así como desarrollar estrategias de reintroducción y restauración de las 
poblaciones de orquídeas con sus endofitos naturales (Van der Kinderen, 1995; Batty 
et al., 2001 a; Brundrett et al., 2003, McCormick et al., 2004). 
México es un país megadiverso que alberga más de 1 200 especies de orquídeas y 
muchas de estás son endémicas (Hágsater et al., 2005). Sin embargo, se cuenta con 
muy pocos estudios sobre la relación micorrizica de las orquídeas de este país. En la 
Reserva Ecológica El Pedregal de San Ángel se han efectuado estudios pioneros sobre 
esta asociación: Ortega-Larrocea et al. (2000) establecieron el cultivo simbiótico de 
Bletia urbana a partir del aislamiento de su endofito natural de una planta adulta y la 
germinación de sus semillas con el mismo. Posteriormente, Rangel (2004) llevó a cabo 
el aislamiento de endofitos de plantas adultas de cuatro especies de orquídeas 
(Cuadro 2), estableciendo el primer cepario de hongos micorrízicos de orquídeas en 
México. Además realizó pruebas cruzadas de germinación in vitro para evaluar la 
capacidad simbiótica y de efectividad de los aislados. En estas observó que las 
especies pertenecientes al género Bletia requieren de luz para germinar y pueden 
desarrollarse con aislados provenientes de otras especies del mismo género. Las 
especies de los géneros Habenaria y Dichromanthus requieren oscuridad para 
 24
germinar y en particular las especies del ultimo se desarrollan adecuadamente con 
aislados provenientes de plantas adultas de la misma especie. Para el caso particular 
de Bletia campanulata, presentó una elevada germinación en todos los tratamientos 
simbióticos. Dichromanthus aurantiacus geminó escasamente (34 %) en los diferentes 
tratamientos simbióticos, pero sólo se desarrollo a estadio de plántula de manera 
simbiótica con el aislado obtenido desde una planta adulta de la misma especie. La 
realización de estudios de germinación in situ que permitan obtener endofitos 
relacionados con la germinación en la naturaleza permitirían evaluar las tendencias 
observadas in vitro y estudiar la capacidad de los endofitos obtenidos para ser usados 
dentro de las estrategias de conservación de las orquídeas. En este capítulo, se 
plantearon los siguientes objetivos particulares: 
• Establecer un protocolo de germinación simbiótica in situ considerando dos 
especies de orquídeas con requerimientos diferentes para su germinación 
Bletia campanulata y Dichromanthus aurantiacus. 
• Llevar a cabo el aislamiento de hongos micorrízicos a partir de protocormos 
obtenidos de la germinación simbiótica in situ y de algunas plantas de 
orquídeas adultas como Bletia campanulata, Dichromanthus aurantiacus y D. 
cinnabarinus. 
• Realizar la germinación simbiótica in vitro de semillas de Bletia campanulata, 
Dichromanthus aurantiacus y Dichromanthus cinnabarinus, con aislados de las 
pruebas de germinación en campo y de plantas adultas. 
 
 
2. Área de estudio. 
 
 
Las pruebas de geminación simbiótica in situ se realizaron en tres sitios de la parte 
poniente de la reserva ecológica del Pedregal de San Ángel (descrita en el Cáp. 1), Los 
sitios de estudio tienen las coordenadas 14479736 E; 2136043 N a 2297 m.s.n.m 
para el primer sitio 14479825 E; 2136402 N 2324 m.s.n.m y 14479718 E; 2136049 
N a 2 324 m.s.n.m para el sitio tres. Estos sitios cuentan con vegetación de matorral 
xerofilo y en todos los casos la profundidad de suelo no sobrepasaba los 7 cm. Se 
 25
seleccionaron sitios con la presencia de plantas adultas de los géneros Bletia y 
Dichromanthus. 
 
 
3. Método. 
 
 
3.1. Pruebas de germinación simbiótica in situ de Bletia 
campanulata y Dichromanthus aurantiacus. 
 
 
Las pruebas de germinación simbiótica in situ se hicieron con semillas de Bletia 
campanulata y Dichromanthus aurantiacus, las cuales fueron previamente 
recolectadas maduras en la reserva El Pedregal de San Ángel (Rangel, 2004) y fueron 
ingresadas al banco de germoplasma del laboratorio Microcosmos Bioedáfico en el 
Instituto de Geología de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) (los 
números de colección se identifican con la clave MCCBHQ3 y MCCBH46, 
respectivamente). En este lugar permanecieron almacenadas en un desecador al 40 % 
de humedad relativa a una temperatura de 25 °C por dos años. 
Los dispositivos de germinación in situ se montaron de acuerdo al protocolo 
establecido por Rasmussen y Whigham (1993). Estos consistieron de 0.5 g de arena 
de mar (lavada múltiples veces con agua corriente y posteriormente con agua 
destilada y esterilizada en autoclave a 15 libras por 30 min), a los cuales se les 
agregaron 0.006 g de semillas para B. campanulata y 0.001 g de D. aurantiacus para 
sembrar un intervalo de 50 a 300 semillas (Rangel, 2004). Las semillas fueron 
colocadas en medio de dos secciones de malla de nylon de 23 X 23 mm con una 
apertura de 35 µm, las mallas fueron adheridas a un marco plástico para montar 
diapositivas. Se elaboraron 11 dispositivos de este tipo con semillas de B. 
campanulata y 19 con semillas de D. aurantiacus, los cuales fueron sembrados el 23 
de agosto del 2004 en tres sitios diferentes seleccionados por contar con la presencia 
de orquídeas terrestres adultas (B. campanulata, B. urbana y D. aurantiacus). En el 
sitio 1 (zona núcleo) se colocaron 11 dispositivos de germinación in situ de B. 
campanulata y 8 de D. aurantiacus; en el sitio 2 (Instituto de Biología) se sembraron 3 
 26
de D. aurantiacus y los restantes 8 de D. aurantiacus en el sitio tres (Instituto de 
Ecología). Esta disposición respondió a la distribución de las orquídeas adultas (Anexo 
2). Los dispositivos se colocaron a una distancia de 2 a 5 cm de las plantas adultas de 
orquídeas y a ras de suelo. Algunos de los dispositivos de D. aurantiacus fueron 
sembrados cerca de plantas adultas de orquídeas del género Bletia, ya que se observó 
con anterioridad (Rangel, 2004) que los aislados de plantas adultas de este género 
eran capaces de promover la germinación de semillas del género Dichromanthus. Los 
dispositivos de germinación in situ de B. campanulata sólo se colocaron cerca de 
plantas adultas del mismo género ya que también se observó que aislados obtenidos 
de plantas de diferente género no estimulaban la germinación de semillas del género 
Bletia. Los dispositivos se dejaron en los sitios por tres periodos de tiempo: un periodo 
de 3 meses después del cual se recolectaron y fueron transportados al laboratorio en 
bolsas plásticas para su estudio tomando 2 de B. campanulata y 3 de D. aurantiacus; 
4 meses donde se recolectaron 3 de B. campanulata y 10 de D. aurantiacus y 5 meses 
donde se recuperó el resto, 4 de B. campanulata y 4 de D. aurantiacus. Es importante 
mencionar que 4 de los dispositivos de germinación in situ no se encontraron después 
del periodo de permanencia en campo (2 dispositivos de germinación in situ de cada 
especie). 
Una vez en el laboratorio, los dispositivos se lavaron y se abrieron para cuantificar 
el porcentaje de germinación, cuantificando desde el estadio 1 (Fig. 2). Se realizó una 
un análisis de varianza (ANOVA) de tres vía (especies, tiempo de permanencia en 
campo y sitio) después de corroborar la normalidad de los datos bajo la prueba de 
Kolmogorov-Smirnov. Se seleccionaron tres protocormos al azar para verificar el 
establecimiento de la relación simbiótica (constatar la presencia de pelotones), los 
cuales fueron teñidos con azul de Tripán y se observaron en un microscopio óptico. 
 
 
 3.2. Aislamiento de hongos micorrízicos. 
 
 
De los protocormos recolectados de los dispositivosde germinación in situ se 
seleccionaron algunos para llevar a cabo el aislamiento de hongos micorrízicos. 
También se obtuvieron aislados de raíces de plantas adultas de D. aurantiacus, D. 
 27
cinnabarinus siguiendo el método propuesto por Dixon y Batty (2003). Los 
protocormos y las raíces se lavaron con agua corriente para retirar el sustrato, después 
fueron desinfectados con hipoclorito de sodio (NaCl) al 15 % por 5 min y se enjuagaron 
tres veces con agua destilada estéril. Los pelotones se extrajeron de los protocormos y 
las raíces realizando un corte transversal y removiéndolos desde la corteza. Los 
pelotones se colocaron en medio de aislamiento fúngico (MAF) (ver Anexo 2) y se 
incubaron a 25°C por una semana. Los cultivos puros se obtuvieron desde ápices de 
hifas que crecieron de los pelotones viables. Estos ápices se cultivaron en un medio de 
papa-dextrosa-agar 39 g/L (PDA) BIOXON®. Los aislados obtenidos fueron depositados 
en el banco de germoplasma del Laboratorio de Microcosmos Bioedáfico en el Instituto 
de Geología de la UNAM. 
 
 
 3.3. Pruebas de germinación simbiótica in vitro. 
 
 
Inicialmente se planteo como única estrategia llevar a cabo la propagación 
simbiótica de semillas de B. campanulata y D. aurantiacus con aislados efectivos 
probados anteriormente por Rangel (2004) (Cuadro 2). Debido a que con esto no se 
logró obtener protocormos, se implementó una segunda propagación para evaluar 
otros aislados del banco de germoplasma no probados anteriormente con una sola 
repetición. Una tercera propagación simbiótica in vitro se hizo para evaluar la 
efectividad de nuevos aislados obtenidos en este trabajo con las semillas de las 
cápsulas de D. aurantiacus, D. cinnabarinus (con números de colección MCCBGQ46 y 
MCCBGQ57, respectivamente). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 28
Cuadro 2. Claves de los aislados obtenidos de plantas adultas por Rangel (2004) y las especies con las 
que fueron probadas en ese trabajo. 
Clave del Cepario Especie origen Aislados probados en: 
MCCBGHQ0001-3 Bletia campanulata No probado 
MCCBGHQ0004-9 Bletia urbana No probado 
MCCBGHQ0010-11 Dichromanthus aurantiacus No probado 
MCCBGHQ0012 Dichromanthus aurantiacus B. campanulata, B. sp., B. urbana y D. aurantiacus 
MCCBGHQ0013 Bletia campanulata B. campanulata, B. sp., B. urbana y D. aurantiacus 
MCCBGHQ0014 Bletia sp. B. campanulata, B. sp., B. urbana y D. aurantiacus 
MCCBGHQ0015 Bletia urbana B. campanulata, B. sp., B. urbana y D. aurantiacus 
 
 
Para todos los experimentos se siguió la siguiente metodología. Se pesaron las 
semillas para obtener entre 50 y 300 (Rangel, 2004), éstas fueron colocadas en 
sobres de papel filtro Whatman® no. 1 y se desinfectaron con hipoclorito de calcio al 7 
% y enjuagadas con agua destilada estéril tres veces. Se sembraron para su 
germinación en cajas Petri con 20 mL de medio asimbiótico Knudson C (KC) (Knudson, 
1946) (control positivo) y los tratamientos simbióticos en medio básico de avena (MBA) 
(ver Anexo 3). La inoculación se realizó el mismo día de la siembra con cubos de agar 
de aproximadamente 0.5 cc (uno por caja donde todos los aislados fueron diferentes y 
provenientes del banco de germoplasma, ver Anexo 4). En la segunda propagación se 
utilizó un aislado para B. campanulata y dos para D. aurantiacus y para la tercera se 
probaron 12 aislados nuevos para D. aurantiacus y 2 aislados nuevos para D. 
cinnabarinus. Los experimentos contaron con una repetición en el segundo y con tres 
en el tercero. Las cajas fueron selladas con egapak e incubadas. Las semillas de B. 
campanulata fueron incubadas en luz desde su siembra, mientras que las semillas de 
D. aurantiacus así como las semillas de D. cinnabarinus, permanecieron en oscuridad 
hasta la aparición del primordio foliar,. El fotoperiodo aplicado a todos los tratamientos 
fue de 16/8 h (luz/oscuridad) con una iluminación promedio de 880 Lux, 35 % de 
humedad relativa y temperatura de 25 ± 2 °C. A los 28 días de la siembra se 
cuantificó el porcentaje de germinación bajo un microscopio estereoscópico 10 X y se 
cuantificaron los porcentajes de las semillas que alcanzaron los estadios descritos en 
 29
la introducción (Fig. 2). Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía para la 
variable de respuesta de germinación de D. aurantiacus y D. cinnabarinus, del tercer 
experimento donde se corroboró la normalidad de los datos bajo la prueba de 
Kolmogorov-Smirnov. 
 
 
 4. Resultados. 
 
 
 4.1. Pruebas de germinación simbiótica in situ. 
 
 
Los resultados de la germinación de las semillas en los dispositivos se presentan 
en la figura 8 y cuadro 3. En la especie B. campanulata sólo se logró cuantificar el 
número de semillas imbibidas en todos los tiempos, debido a que no se observó en 
ningunos de los dispositivos ni tiempos de permanencia en campo, una verdadera 
germinación que implica la formación de un protocormo. Es por esto que los valores en 
la figura representan porcentaje de imbibición para B. campanulata y de germinación 
para D. aurantiacus. Cabe señalar que el criterio de germinación en campo para 
algunos autores es la imbibición con ruptura de testa (Rasmussen y Whigham 1993). 
Para D. aurantiacus si se logró observar la germinación bajo el criterio utilizado en este 
trabajo (protocormo con o sin rizoides, estadio 2) (Fig. 2) y se observó que a los tres 
meses de siembra en el suelo de los dispositivos de germinación in situ así como que 
los protocormos prosiguieron su desarrollo en un mes más alcanzaron el estadio 4; a 
los 5 meses se observó que no continuó su desarrollo, e incluso se comenzaron a 
etiolar por la falta de luz y desecar por el comienzo de la sequía (Fig. 9). 
En la figura 8 se observa que, a los cuatro meses de siembra en campo se alcanzó 
el mayor porcentaje de respuesta para ambas especies y para D. aurantiacus se 
observó que el porcentaje de germinación se mantenía en los sitios 1 y 3 mientras que 
aumentaba ligeramente en el sitio 2; a los cinco meses se observó una tendencia a la 
desecación de las semillas de ambas especies (Fig. 8). En general se obtuvo un mayor 
porcentaje de germinación de D. aurantiacus que de imbibición para B. campanulata 
en los tres tiempos de incubación. No se encontraron diferencias entre las variables de 
tiempo de permanencia en campo ni de sitio (F=2.75, p<0.05; g.l. 1). 
 30
Los dispositivos de germinación in situ de D. aurantiacus fueron colocados en tres 
sitios diferentes cerca de plantas del género Bletia y de plantas adultas de la misma 
especie. Para el caso de B. campanulata, no se evaluó el efecto de plantas adultas de 
diferente género ya que se había observado anteriormente que esta especie no se 
desarrollaba con aislados provenientes de plantas adultas de diferente género 
(Rangel, 2004). No se encontraron diferencias atribuibles a la planta hospedera para 
ambas especies (F=.078, p<0.05; g. l. 2) (Cuadro 3). 
 
 
 
 
 
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Tiempo (meses) 4
1 2 3
Tiempo (meses) 5
1 2 3
Figura 8. Porcentaje de imbibición in situ de B. campanulata y porcentaje de germinación de D. 
aurantiacus durante los meses de permanencia en campo y en los sitios de colocación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 31
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Cuadro 3. Porcentaje de germinación de Bletia campanulata y Dichromanthus aurantiacus, en los 
Dispositivos de germinación in situ durante los diferentes tiempos de permanencia en campo y sitios. 
Especie 
Clave de los 
dispositivos 
de 
germinación 
in situ 
Planta cercana al 
dispositivo de 
germinación in situ. 
Tiempo de 
incubación 
(meses) 
Sitio Germinación (%) 
MRV-B024 Bletia