Glicosilacion-enzimatica-de-compuestos-hidrofobicos-mediante-el-uso-de-glicosiltransferasas-activas-en-solventes-organicos

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
 
 
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Glicosilación enzimática de compuestos hidrofóbicos mediante 
el uso de glicosiltransferasas activas en solventes orgánicos 
 
 
 
 
 
TESIS que para obtener el grado de: 
Maestra en Ciencias 
Presenta: 
Arlette Mena Arizmendi 
 
 
Tutor: Dr. Edmundo Castillo Rosales 
 
 
Cuernavaca, Mor. 2007
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
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reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente proyecto se llevó a cabo en el Departamento de 
Ingeniería Celular y Biocatálisis del Instituto de 
Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de 
México, bajo la dirección del Dr. Edmundo Castillo Rosales, 
en el laboratorio del Dr. Agustín López-Munguía Canales. 
Los estudios de Maestría fueron posibles gracias al apoyo 
económico otorgado por el Consejo Nacional de Ciencia y 
Tecnología (CONACyT) con el número de registro 194853. 
 
 
 
 
 
 
 
A mis padres Soco y Ángel, a mi hermana Wendy, a mi 
sobrino Daniel y a Oscar 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Al Dr. Agustín López-Munguía Canales por permitirme ser miembro de su grupo de investigación, 
por todo el apoyo brindado durante la realización de este proyecto y por su valiosa amistad. 
Al Dr. Edmundo Castillo Rosales por dirigir esta tesis de la forma que lo hace un buen asesor, por 
esforzarse de verdad en la formación de sus alumnos y por ser un gran amigo. 
A la Dra. Laura A. Palomares Aguilera y el Dr. Rafael Vázquez Duhalt por las valiosas ideas que 
aportaron durante la realización del presente proyecto. 
Al jurado revisor de tesis: Dr. Guillermo Gosset Lagarda, Dr. Edmundo Castillo Rosales, Dr. Jaime 
Escalante García, Dr. Enrique Rudiño Piñera y Dr. Francisco Barona Gómez, por dedicar parte de 
su tiempo en la revisión de este trabajo y por los comentarios y sugerencias hechas al respecto. 
Al Dr. Ignacio Regla Contreras por la ayuda técnica en la purificación por cromatografía de 
columna y por la realización de la síntesis química del ácido dihidrocaféico y el éster metílico 
derivado del mismo. 
Al T.L. Fernando González Muñoz por el apoyo técnico durante el desarrollo de los sistemas de 
análisis por HPLC. 
A la Q.F.B. Myriam Ortiz García por el apoyo en la liofilización durante el desarrollo de 
protocolos de purificación de productos. 
A la Q. Ma. de los Ángeles Peña González por la realización de los espectros de RMN. 
A la I.Q. Victoria Labastida Galván por la realización de los espectros de FAB-MS. 
 
 
 
 
 
 
Agradezco de manera muy especial a mis padres Socorro Arizmendi Bahena y Ángel Mena Landa 
por el apoyo y el amor que recibo de ellos a cada momento en cualquier circunstancia. A mi 
hermana Wendy por aconsejarme a su modo, a mi sobrino Daniel por hacerme sonreír y a la 
numerosa familia (incluido chimbombi). 
A Oscar Gallegos, por todo su amor y por permanecer a mi lado este tiempo, por apoyarme y 
darme ánimos en los momentos más difíciles. 
A todo el laboratorio ALM, las arpías Sandrita, María y Chelo, por su cariño, por escuchar y 
aconsejar cuando ha sido necesario; por supuesto al Dr. Agustín, por su amistad, el apoyo y la 
confianza depositada en todos los que con él trabajamos; al Dr. Cható, Fer, el patito (Alex, que 
buen mix) y Alina, quienes además de saber escuchar en algún momento, hacen los comentarios 
más divertidos; Ángela, Male, Iván, Sarita (y el albañil), Alfonso, Gina, Sandra, Yanet, Clarita, 
Nacho, Jaime, Verito, Judit y Aure; así como a Raunelito y Adri (Vazquez); a todos ellos por la 
amistad que me han brindado y por hacer tan amena la jornada de trabajo. 
A los amigos de generación, sobre todo a Karla M., Erickita, Luary, Lili, Ana, Alberto, Karla G. y 
Julio por todos los momentos compartidos, desde los más estresantes hasta los súper divertidos. 
Al IBQ José Luis Morales, a Tati, Jey, Michelle, Cats, Ari, Saac, Rox y Dianita; al Che primo Toño, 
Willy, Tere y Lili; a Omar (hermanito); a todos ellos por ser amigos en las buenas y en las malas, 
por seguir en contacto y estar al tanto de nuestras vidas. 
 
 
 
 
ACRÓNIMOS 
 
2M2P 2-metil-2-propanol 
B-1299 Dextransacarasa de Leuconostoc mesenteroides B-1299 
BnOH Alcohol bencílico 
BS-LVS Levansacarasa de Bacillus subtilis 
DNS Ácido dinitrosalicílico 
D.O. Densidad óptica 
DSRS B-512F Dextransacarasa de Leuconostoc mesenteroides B-512F, recombinante 
F1-Hq Monofructósido de Hidroquinona 
F1-Rsr Monofructósido de Resorcinol 
FAB-MS Espectrometría de masas por bombardeo de átomos rápidos 
F-BnOH Monofructósido de alcohol bencílico 
F-L Monofructósido de lactosa 
F-M Monofructósido de maltosa 
HPLC Cromatografía de líquidos de alta resolución 
IR Índice de Refracción 
LevC 
Levansacarasa de Leuconostoc mesenteroides ssp mesenteroides, 
recombinante 
PEG5000 Polietilenglicol peso molecular 5000 
RMN Resonancia Magnética Nuclear 
RMN13C Resonancia Magnética Nuclear del isótopo de Carbono 
RMN1H Resonancia Magnética Nuclear de Protón 
TLC Cromatografía de capa fina 
UV Radiación Ultravioleta 
 
 
 
 
 
 
 I
ÍNDICE DE CONTENIDO 
 
ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................................................ III 
ÍNDICE DE FIGURAS..........................................................................................................................IV 
1. RESUMEN.................................................................................................................................. 1 
2. INTRODUCCIÓN....................................................................................................................... 2 
3. ANTECEDENTES ........................................................................................................................ 4 
3.1 Importancia biológica de la glicosilación ............................................................................... 4 
3.2 Glicósidos: importancia y propiedades .................................................................................. 4 
3.3 Síntesis de glicósidos ............................................................................................................ 7 
3.3.1 Método químico .............................................................................................................. 8 
3.3.2 Método enzimático .......................................................................................................... 9 
3.4 Glicosidasas ...................................................................................................................... 10 
3.5 Glicosiltransferasas ............................................................................................................ 12 
3.5.1 Glucosiltransferasas ....................................................................................................... 14 
3.5.2 Fructosiltransferasas ....................................................................................................... 15 
3.6 Ingeniería de solventes ....................................................................................................... 17 
3.7 Reacciones de aceptor con glicosiltransferasas .....................................................................18 
3.7.1 Reactividad de las moléculas aceptoras ........................................................................... 20 
4. HIPÓTESIS............................................................................................................................... 23 
5. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................ 23 
5.1 Objetivos particulares......................................................................................................... 23 
6. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................ 24 
6.1 Materiales ......................................................................................................................... 24 
6.2 Preparación enzimática ...................................................................................................... 24 
6.2.1 Preparación de la Levansacarasa BS-LVS ......................................................................... 25 
6.2.2 Preparación de la Dextransacarasa DSRS B-512F............................................................. 26 
6.2.3 Preparación de la Levansacarasa LevC ............................................................................ 26 
6.2.4 Preparación de la Glucosiltransferasa B-1299.................................................................. 26 
6.3 Determinación de la actividad glicosiltransferasa .................................................................. 27 
6.4 Reacciones de aceptor........................................................................................................ 27 
6.5 Análisis de sustratos y productos de reacción........................................................................ 27 
6.5.1 Cromatografía de Capa Fina.......................................................................................... 27 
6.5.2 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución ................................................................. 28 
6.5.3 Análisis estructural de los productos de reacción .............................................................. 29 
 
 II
6.6 Purificación de los productos de reacción............................................................................. 29 
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN..................................................................................................... 31 
7.1 Estudio de estabilidad de la DSRS B512F recombinante en 2M2P.......................................... 31 
7.2 Estudio de estabilidad de la LevC recombinante en 2M2P ..................................................... 33 
7.3 Reacciones de aceptor con glicosiltransferasas ..................................................................... 34 
7.3.1 Reacciones de aceptor con moléculas hidrofóbicas........................................................... 37 
7.3.2 Optimización de la producción de F-BnOH ..................................................................... 42 
7.3.3 Análisis por RMN del producto de fructosilación con BnOH .............................................. 45 
7.3.4 Fructosilación de compuestos fenólicos y otras moléculas hidrofóbicas............................... 47 
7.3.5 Análisis de los fructósidos de dihidroxibencenos ............................................................... 57 
8. CONCLUSIONES..................................................................................................................... 59 
9. PERSPECTIVAS ......................................................................................................................... 61 
10. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 62 
11. APÉNDICE............................................................................................................................... 68 
 
 
 III
ÍNDICE DE TABLAS 
Tabla 1. Tipos de glicosiltransferasas................................................................................16 
Tabla 2. Sistemas enzimáticos empleados. ........................................................................24 
Tabla 3. Composición del medio de cultivo para B. subtilis ................................................25 
Tabla 4. Gradiente de flujo para el análisis por HPLC de fructósidos de moléculas 
aromáticas. .......................................................................................................29 
Tabla 5. Resultados de RMN13C para F-BnOH ..................................................................46 
Tabla 6. Alcoholes aromáticos evaluados como aceptores de la BS-LVS ..............................49 
Tabla 7. Resultados de la evaluación de compuestos fenólicos en las reacciones de 
aceptor con BS-LVS............................................................................................54 
 
 
 IV
ÍNDICE DE FIGURAS 
Figura 1. Glicósidos encontrados como metabolitos secundarios de plantas. ..........................5 
Figura 2. Glicósidos naturales de interés industrial................................................................7 
Figura 3. Síntesis de Koenigs-Knorr: esquema general de reacción. .......................................8 
Figura 4. Reacciones catalizadas por glicosiltransferasas .....................................................14 
Figura 5. Intercambio isotópico por la reversibilidad de la reacción de formación del 
complejo glucosil-enzima en glucosiltransferasas..................................................15 
Figura 6. Estructura de flavonoides reportados en la glicosilación con dextransacarasa y 
alternansacarasa.. .............................................................................................18 
Figura 7. Estructuras del galato de epigalocatequina y catequina.........................................19 
Figura 8. Estructuras resonantes de fenol y 4-metoxifenol. Efecto electrodonador de los 
sustituyentes del anillo. .......................................................................................21 
Figura 9. Estabilidad al almacenamiento en 10% de 2M2P de la DSRS B512F sin y con 
polímero ...........................................................................................................32 
Figura 10. Estabilidad al almacenamiento de la enzima LevC recombinante en 10% de 
2M2P para los sistemas sin y con polímero. .........................................................33 
Figura 11. Esquema general de la reacción de aceptor catalizada por levansacarasa BS-
LVS...................................................................................................................34 
Figura 12. Reacciones de aceptor con Maltosa y Lactosa mediante BS-LVS en diferentes 
concentraciones de 2M2P. .................................................................................35 
Figura 13. Moléculas utilizadas en las reacciones de aceptor con BS-LVS, LevC y B­1299........37 
Figura 14. Análisis por TLC de la reacción de aceptor con BnOH, catalizada por BS-LVS 
en mezclas con solvente orgánico. Relación sacarosa/aceptor 1:1, 400 mM ..........39 
Figura 15. Efecto de la concentración de BnOH en la actividad de las enzimas B-1299, 
LevC y BS-LVS. ..................................................................................................40 
Figura 16. Análisis por TLC de las reacciones de aceptor con salicina y alcohol salicílico 
con las enzimas BS-LVS, LevC y B-1299, evaluada a una relación 
sacarosa/aceptor 1:1, 400 mM. .........................................................................41 
Figura 17. Análisis por HPLC con detección UV a 254 nm de la reacción de aceptor con 
BnOH catalizada por BS-LVS ..............................................................................42 
Figura 18. Efecto de la concentración de aceptor en la producción de F-BnOH......................43 
Figura 19. Efecto de la concentraciónde sólidos disueltos totales en la producción de F-
BnOH, manteniendo una relación BnOH/S 2:1. ..................................................44 
Figura 20. Análisis por TLC de las reacciones de aceptor con BnOH a diferente 
concentración de sólidos disueltos en relación BnOH/sacarosa 2:1 .......................44 
Figura 21. Producción de F-BnOH en función de la concentración de sacarosa......................45 
Figura 22. Estructura del producto de fructosilación de BnOH determinada por RMN1H y 
RMN13C............................................................................................................46 
 
 V
Figura 23. Moléculas evaluadas como aceptores de BS-LVS con diferencias en el grupo 
funcional hidroxilo .............................................................................................48 
Figura 24. Una de las estructuras resonantes del catecol.......................................................48 
Figura 25. Análisis por TLC de la reacción con catecol .........................................................50 
Figura 26. Estructura química de otros aceptores fenólicos probados en la reacción de 
fructosilación con BS-LVS....................................................................................51 
Figura 27. Análisis por TLC de la reacción de fructosilación de hidroquinona y resorcinol ........52 
Figura 28. Análisis por TLC de la reacción con fenol.............................................................52 
Figura 29. Análisis por TLC de las reacciones con 4-metoxifenol y o-aminofenol.....................53 
Figura 30. Análisis por TLC de las reacciones de aceptor con 9 diferentes sustratos 
catalizadas por BS-LVS .......................................................................................55 
Figura 31. Estructuras resonantes de ácido caféico y dihidrocaféico. ......................................56 
Figura 32. Vista de la cavidad del sitio catalítico de BS-LVS ...................................................57 
Figura 33. Estructura general de los productos de fructosilación de catecol, hidroquinona y 
resorcinol catalizada por BS-LVS. ........................................................................57 
Figura 34. Análisis por HPLC con detección UV a 280 nm e IR de la reacción de aceptor 
con hidroquinona catalizada por BS-LVS..............................................................58 
Resumen 
 1
1. RESUMEN 
En el presente proyecto se estudió la glicosilación de alcoholes hidrofóbicos empleando 
enzimas del tipo glicosiltransferasa activas en presencia de solvente orgánico. La 
importancia de la glicosilación radica en la posibilidad de modificar las propiedades de 
las moléculas a las que se une el residuo glicosilo, encontrando con ello diversas 
aplicaciones a nivel industrial. El estudio de la reacción de glicosilación con diversas 
glicosiltransferasas permitió identificar a la levansacarasa de Bacillus subtilis (BS-LVS) 
como la mejor enzima en términos de estabilidad y compatibilidad con los solventes y los 
sustratos empleados. Se demostró que esta enzima es capaz de glicosilar compuestos 
como el alcohol bencílico (BnOH) en presencia de altas concentraciones del alcohol sin 
disminuir significativamente sus propiedades catalíticas. Asimismo, BS-LVS permitió la 
glicosilación de fenoles obteniendo con ellos mayor producción de fructósidos que con 
alcoholes primarios (como BnOH), principalmente en los casos en que el aceptor posee 
un segundo grupo electrodonador como −OH, −OCH3 ó –NH2. Diez de los sustratos 
hidrofóbicos evaluados actuaron como aceptores para la reacción con BS-LVS, siete de los 
cuales poseen hidroxilos fenólicos y tres con alcoholes primarios. Por otro lado, algunos 
compuestos con estructuras potencialmente reactivas no fueron sustrato para BS-LVS en 
las condiciones evaluadas, haciendo evidente que el éxito de la glicosilación no sólo 
depende de la reactividad del aceptor sino también de la selectividad que da la propia 
estructura de la enzima. 
Introducción 
 2
2. INTRODUCCIÓN 
Los glicósidos son compuestos que contienen un carbohidrato unido covalentemente a 
una molécula de naturaleza química diferente (no-carbohidrato) denominada aglicona. 
Estas moléculas se encuentran ampliamente distribuidas en los seres vivos y desempeñan, 
entre otras funciones, la señalización o la protección de moléculas reactivas (Vetter, 
2000). Gracias a la posibilidad de manipular su naturaleza anfifílica, las aplicaciones de 
los glicósidos en el área industrial incluyen su uso como emulsificantes (Richard y col., 
2003), acarreadores en formulaciones antitumorales o medicamentos relacionados con 
enfermedades cardiacas (de Roode y col., 2003), entre otras. El mayor interés por el 
empleo de moléculas glicosiladas en medicamentos radica en la posibilidad de modificar 
las propiedades farmacocinéticas del producto (Schottelius y col., 2002). 
En la actualidad, la principal ruta de síntesis química de compuestos glicosilados resulta 
muy poco atractiva debido a su baja selectividad, lo que trae como consecuencia la 
necesidad de protección y desprotección de los sustratos y productos. Aunado a esto, la 
mayoría de los catalizadores empleados son tóxicos y poco específicos limitando su 
aplicación en la industria farmacéutica y de alimentos. Alternativamente, la creciente 
incidencia de la biocatálisis en diferentes procesos de síntesis química ha abierto la 
posibilidad del desarrollo de procesos alternativos selectivos, eficientes y menos agresivos. 
Las enzimas de uso potencial para el proceso de glicosilación de moléculas de interés son 
en general glicosidasas o glicosiltransferasas. La síntesis de glicósidos mediante el uso de 
glicosidasas ha sido ampliamente estudiada, reportándose generalmente bajos 
rendimientos en los productos de glicosilación. La principal causa de esta limitación reside 
en el hecho de que estas enzimas, de manera natural, catalizan la hidrólisis del enlace 
glicosídico y no la incorporación del carbohidrato a la aglicona. Como principales 
estrategias para incrementar el rendimiento se ha utilizado la disminución de la actividad 
de agua del sistema de reacción, el incremento de las concentraciones de sustrato o 
retirando de la mezcla los glicósidos producidos. Estas condiciones finalmente son 
desventajosas debido a los laboriosos procesos de separación que implican. Por otro 
lado, las glicosiltransferasas son enzimas que naturalmente catalizan la transferencia de un 
Introducción 
 3
residuo glicosilo de una molécula donadora hacia alguna molécula aceptora y, a pesar 
de que pueden utilizar como aceptor al agua y dar como resultado la hidrólisis del 
sustrato donador, ésta reacción lateral se puede eliminar mediante diferentes estrategias 
como son la adición de solventes orgánicos miscibles en agua o el aumento en la 
concentración de sustratos. En nuestro grupo se ha trabajado desde hace varios años en 
la búsqueda y caracterización de glicosiltransferasas (Morales-Arrieta y col., 2006; 
Olivares-Illana y col., 2003). Se cuenta con diversos genes y sistemas de expresión de los 
mismos, además de contar con las enzimas silvestres. Respecto al estudio de las 
propiedades de las enzimas, se ha demostrado la estabilidad de algunas 
glicosiltransferasas en solventes orgánicos, lo cual favorece además la reacción de 
transferencia, disminuyendo considerablemente la reacción de hidrólisis. Este hecho abre 
la posibilidad de emplear estas enzimas en la formación de glicósidos de moléculas 
hidrofóbicas de interés en la industria farmacéutica, tales como los polifenoles, 
compuestos hidrofóbicos que han cobrado importancia gracias a sus propiedades 
antioxidantes y cuyas propiedades farmacocinéticas podrían ser mejoradas mediante la 
glicosilación. 
Antecedentes 
 4
3. ANTECEDENTES 
3.1 Importancia biológica de la glicosilación 
La síntesis de moléculas glicosiladas es un áreaque ha ganado particular interés y cuyo 
estudio se ha vuelto más intenso en los últimos años. Se trata de moléculas unidas 
mediante un enlace éter (glicosídico) a un azúcar. Esto se debe a la gran variedad de 
compuestos glicosilados existentes en los organismos eucariotes y que realizan diversas 
funciones biológicas; esta unión a carbohidratos les confiere a las moléculas propiedades 
específicas que les permite realizar su función. 
La molécula que se une al carbohidrato recibe el nombre de aglicona y ésta puede variar 
desde alcoholes de cadena mediana hasta proteínas, mientras que el residuo glicosilo 
puede ser desde una sola molécula de azúcar (monosacáridos) hasta largas cadenas de 
éstos (polisacáridos) (de Roode y col., 2003). 
Cuando la aglicona consiste en proteínas y lípidos reciben el nombre de glicoproteínas y 
glicolípidos, respectivamente, y en conjunto se les conoce como glicoconjugados (Verbert 
y Cacan, 2000). Los glicolípidos generalmente se encuentran asociados a membrana y 
están involucrados en el reconocimiento celular, en la modificación de la estructura 
tridimensional de proteínas y además participan de manera importante en la transducción 
de señal (Dove, 2001; Borgia y col., 2001). 
Existe otro grupo de moléculas glicosiladas biológicamente importantes que reúne a todos 
aquellos compuestos no incluidos en los glicoconjugados. Estos compuestos se conocen 
como glicósidos, los cuales son el objetivo del presente proyecto. 
3.2 Glicósidos: importancia y propiedades 
Los glicósidos se encuentran principalmente formando parte del metabolismo secundario 
de plantas, siendo ejemplo de ellos las saponinas, los glucosinolatos, los glicósidos 
cianogénicos, los glicósidos cardiacos y otros glicoalcaloides, que resultan de importancia 
por los efectos tanto benéficos como tóxicos que pueden ejercer en la nutrición humana y 
animal (Cheeke, 2001). En la figura 1 se presentan ejemplos de éstos y otros glicósidos 
encontrados en plantas. 
Antecedentes 
 5
O
HO
HO
OH
O
OH
COOK
OH
d)Glicósidos responsables de movimiento de hojas:
 5-O-β-D-glucopiranosilgentisato de potasio
(Mimosa pudica L.)
O
HO
HO
OH
O
HOOC
O
HO
HO
O
HOOC
COOH
a) Saponinas:glicirrizina
O
HO
HO
OH
O
OH
O
HO
HO
OH
O
CN
c) Glicósidos cianogénicos: Amigdalina.
O
OH
O
H3C
O
O
O
OH
b) Glicósidos cardiacos: Oleandrina
O
HO
OH
O
O
OH
HO
OH
O
OH
OH
O
OOH
HO
OH
e) Glicósidos de flavonoides: Quercetina-3'-O-
β-D-xilopiranosil-(1-2)-β-D-galactopiranósido
O
O CH3
O
 
Figura 1. Glicósidos encontrados como metabolitos secundarios de plantas. 
De manera general la glicosilación confiere a las moléculas actividades biológicas 
específicas, las cuales se asocian a respuestas fisiológicas de las plantas hacia factores 
ambientales. Por ejemplo, la realización de funciones tales como el almacenamiento de 
moléculas cianogénicas, utilizadas por la planta como defensa contra herbívoros (Vetter, 
2000); o la función de señalización mediante algunos otros glicósidos precursores de 
fragancias en flores. También están involucrados en el movimiento de las hojas de ciertas 
especies de plantas (Ueda, 2003) así como en la protección contra radiación UV-B, este 
último es el caso de los glicósidos de flavonoides (Hofmann y col., 2000). 
En lo que concierne al residuo glicosilo, la D-glucosa, unida a la aglicona mediante 
enlace β es el arreglo estructural más frecuente en la naturaleza. No obstante, esta forma 
no es exclusiva, encontrándose también xilosa, galactosa, ramnosa, así como disacáridos 
Antecedentes 
 6
y ocasionalmente trisacáridos. En productos microbianos se puede encontrar un gran 
rango de azúcares unidos glicosídicamente y que poseen variaciones estructurales tales 
como azúcares desoxi, grupos amino y carboxilo, ejemplo de éstos son la estreptomicina y 
las antraciclinas (Sturgeon, 2002). 
A nivel industrial cuando la aglicona corresponde a grupos alquilo de cadena larga los 
glicósidos tienen aplicaciones variadas, entre las que se encuentran su uso como agentes 
tensoactivos en detergentes o emulsificantes en cosméticos (Richard y col., 2003); cuando 
la aglicona consiste en grupos alquilo insaturados, como los terpenos, se emplean como 
antifúngicos y antimicrobianos, (de Roode y col., 2003); también tienen aplicación en 
fragancias de liberación controlada (Franssen y col., 2005) y en formulaciones 
antitumorales y medicamentos relacionados con enfermedades cardiacas (de Roode y col., 
2003) para agliconas de características estructurales específicas. 
Un tipo de glicósidos que ha cobrado importancia gracias a sus propiedades antioxidantes 
son los polifenoles, los cuales están presentes en una gran variedad de alimentos y 
bebidas de origen vegetal y su consumo se asocia a la disminución en la incidencia de 
cierto tipo de enfermedades coronarias y algunos tipos de cáncer. Entre los principales 
tipos de polifenoles descritos, la quercetina (flavonol), la genisteína y la genistina 
(isoflavonas) se han distinguido por su elevada capacidad antioxidante in vitro. En los 
alimentos de origen vegetal la mayoría de los polifenoles están presentes en forma de 
glucósidos. Sin embargo, es común que cuando estos alimentos se someten a procesos de 
transformación, dichas moléculas se conviertan a sus agliconas correspondientes. Como 
ya se ha mencionado, la forma glicosilada resulta mejor desde un punto de vista 
farmacológico gracias al aumento en la biodisponibilidad y la actividad biológica. 
Otros glicósidos naturales de interés son hidroquinona-β-D-glucopiranósido (β-arbutina) y 
el bencil-β-D-glucopiranósido (figura 2). El primero de ellos se encuentra ampliamente 
distribuído en plantas de la familia de las Ericaceae, como Uvae ursi, y es utilizado en 
cosméticos como un ingrediente despigmentador de la piel debido a que actúa como 
inhibidor de la actividad tirosinasa, enzima que está involucrada en la síntesis de melanina 
(Wu y col., 2006). Por otro lado, el bencil-β-D-glucopiranósido es un componente del 
Antecedentes 
 7
chabacano japonés (Prunus mume); este compuesto se ha evaluado como agente para el 
alivio de la tensión causada por estrés en ratas (Ina y col., 2004). 
O
HO
HO
OH
O
HO
O
HO
HO OH
O
HO
OH
a) b) 
Figura 2. Glicósidos naturales de interés industrial. a) bencil-β-D-
glucopiranósido, b) hidroquinona-β-D-glucopiranósido. 
Como éstos, existen mucho otros ejemplos de glicósidos de interés industrial, razón por la 
cual, resulta interesante el desarrollo de estrategias para una síntesis eficiente y, que a la 
vez, puedan permitir la generación de análogos más activos que sus correspondientes 
naturales. 
3.3 Síntesis de glicósidos 
La glicosilación puede ser una herramienta útil para mejorar las propiedades de moléculas 
con actividad farmacológica y, por lo tanto, la preparación eficiente del enlace glicosídico 
es la reacción clave en la obtención de sustancias biológicamente activas. 
En principio, la glicosilación es una técnica de protección para compuestos bioactivos 
lábiles tales como fármacos y fragancias sensibles al ácido o a la oxidación (van Rantwijk 
y col., 1999). Otro beneficio de la glicosilación puede ser el decremento en la volatilidad 
respecto a la aglicona (Meulenbeld y Hartmans, 2000), característica que puede ser 
aplicada a fragancias de liberación controlada (Franssen y col., 2005). 
A su vez, la glicosilación permite que compuestos no polares se vuelvan más solubles en 
agua, lo cual puede aumentar la biodisponibilidad de los fármacos (Meulenbeld y 
Hartmans, 2000; van Rantwijk y col., 1999), ya que el incremento en la solubilidad de un 
fármaco disminuirá la cantidad necesaria del mismo para dar un determinado efecto 
terapéutico (Seo y col., 2005). Se ha demostrado que la glicosilación conduce a una 
mejora en las propiedades farmacocinéticas (Schottelius y col., 2002) al facilitar el 
transporte del fármacohacia los tejidos objetivo y su posterior excreción. 
Antecedentes 
 8
Debido a los beneficios que representan las moléculas glicosiladas y sus diversas 
aplicaciones industriales, resulta importante la producción de glicósidos a gran escala y 
por consiguiente, la búsqueda de un método eficiente para lograrlo. 
3.3.1 Método químico 
Las primeras reacciones de glicosilación fueron desarrolladas por Michael y Fischer de 
manera independiente a finales del siglo XIX, las cuales permitieron sintetizar aril glicósidos 
y alquil glicósidos respectivamente, pero generando mezclas muy complejas de isómeros 
(Demchenko, 2003; Collins y Ferrier, 1995). Hasta ahora el primer procedimiento 
químico controlado de glicosilación se atribuye a Koenigs y Knorr quienes llevaron a cabo 
la síntesis de glicósidos vía sustitución nucleofílica en el centro anomérico del residuo 
glicosilo en 1901. Este método se ha convertido en el enfoque clásico para la síntesis de 
diversos compuestos que van desde glicósidos simples hasta complejas estructuras de 
oligosacáridos y se utiliza ampliamente en la actualidad (Demchenko, 2003). 
La obtención de 1,2-trans-glicósidos (β-glicósidos) de fenoles mediante el procedimiento 
de Koenigs-Knorr se basa en la reacción de 1,2-cis-halo derivados (α-halogenuros, 
principalmente bromuros) de azúcares protegidos (acetilados) en presencia de una 
solución acetona-agua de fenoles y de un álcali, de acuerdo al esquema presentado en la 
figura 3. 
O
O
O
O
Br
O
Ac
Ac
Ac
Ac
O
O
O
O
O
OR
Ac
Ac
Ac
Ac
CO2+ + +
ROH
Ag2CO3
AgBr H2O
 
Figura 3. Síntesis de Koenigs-Knorr: esquema general de reacción. Este esquema no es estequiométrico. 
La reacción sucede con inversión de la configuración del centro glicosídico y rinde 
exclusivamente el isómero 1,2-trans (Pavlov y col., 2001; Borgia y col., 2001). En muchos 
estudios, la glicosilación de fenoles con bromo derivados de azúcares bencilados y 
acetilados se ha desarrollado con catalizadores de transferencia de fase. Tal modificación 
del procedimiento de Koenigs-Knorr permite la síntesis de 1,2-trans-arilglucopiranósidos 
en rendimientos entre 40 y 80%, además de la preparación de derivados previamente 
Antecedentes 
 9
desconocidos (Pavlov y col., 2001). Sin embargo, la síntesis de Koenigs-Knorr y sus 
modificaciones tienen como principales desventajas la necesidad de protección y 
desprotección de los sustratos y productos (de Roode y col., 2003). Aunado a esto, la 
inestabilidad intrínseca de los glicosil halogenuros, la necesidad de al menos una cantidad 
equimolar (en ocasiones hasta cuatro equivalentes) de sales de metales como promotores 
y la generación de materiales tóxicos de desecho, han hecho que este método resulte 
inapropiado para la industria farmacéutica o de alimentos. 
Una alternativa al proceso químico podría ser el empleo de enzimas glicosilantes, las 
cuales representan ciertas ventajas respecto a los métodos químicos tales como la 
especificidad y selectividad (regio-, enantio- y quimioselectividad) sin la generación de 
desechos tóxicos. 
3.3.2 Método enzimático 
Las enzimas son macromoléculas de naturaleza proteica que catalizan un gran número de 
reacciones en los seres vivos y que desde hace muchos años se emplean en la síntesis de 
diversas sustancias de interés para el ser humano. Entre las principales ventajas de su 
empleo como catalizadores se encuentra la alta especificidad por su sustrato y los bajos 
requerimientos energéticos para la síntesis, puesto que generalmente no se requieren 
condiciones drásticas de temperatura. Debido a esto, actualmente una gran cantidad de 
enzimas se utilizan en procesos de diversas áreas industriales y muchos otros están en 
proceso de investigación. 
El grupo de enzimas que interesa en el presente trabajo son aquellas capaces de realizar 
la formación de glicósidos. En la naturaleza las moléculas glicosiladas son sintetizadas 
utilizando glicosiltransferasas. Sin embargo, no todos los tipos de glicosiltransferasas 
pueden ser aplicadas en síntesis in vitro debido a que muchas de estas enzimas requieren 
sustratos activados (como UDP-Glc y UDP-Gal) y/o cofactores (como iones Manganeso) 
(Franssen y col., 2005; van Rantwijk y col., 1999), o que muchas de ellas no están 
disponibles comercialmente (de Roode y col., 2003). De hecho, la mayor parte de los 
estudios sobre síntesis de glicósidos se ha enfocado al uso de glicosidasas las cuales, bajo 
Antecedentes 
 10
ciertas condiciones promueven la síntesis de glicósidos u oligosacáridos y son disponibles 
comercialmente a bajo costo (Franssen y col., 2005; de Roode y col., 2003). 
3.4 Glicosidasas 
Las glicosidasas (EC 3.2) son una clase de enzimas pertenecientes a la familia de las 
hidrolasas, responsables de la hidrólisis de enlaces glicosídicos y se encuentran 
distribuidas en numerosos microorganismos, plantas y tejidos animales (Choi y col., 
2003). De acuerdo a su mecanismo de reacción se clasifican en dos grandes categorías: 
las que hidrolizan el enlace glicosídico con una inversión neta de la configuración 
anomérica (Ej. trealasa y β-amilasa) y las que lo hacen con una retención neta de la 
configuración anomérica (Ej. β-galactosidasa, invertasa y lisozima) (van Rantwijk y col., 
1999; Withers, 1995). 
Puesto que las glicosidasas son abundantes, estables y accesibles, en la actualidad se 
conocen aproximadamente 2500 de ellas (Daines y col., 2004) y han sido ampliamente 
estudiadas (Heightman y Vasella, 1999). Una de las aplicaciones más interesantes de 
estas enzimas se ha encontrado en las reacciones de síntesis de glicósidos mediante la 
manipulación adecuada de las condiciones de reacción. 
Una de las características que hacen útiles a las glicosidasas en reacciones de síntesis es 
que muestran una baja especificidad respecto a la aglicona, es decir, pueden reconocer 
una gran variedad de compuestos, desde alcoholes alifáticos hasta moléculas más 
complejas como por ejemplo ergoalcaloides y geninas cardiacas. Estas enzimas muestran 
selectividad absoluta respecto a la estereoquímica en el centro anomérico y presenta un 
alto grado de quimioselectividad por diferentes grupos hidroxilo, en donde el orden de 
reactividad es alcoholes primarios>secundarios>fenoles; siendo los alcoholes terciarios 
los menos reactivos (van Rantwijk y col., 1999). 
In vitro, las glicosidasas pueden además llevar a cabo la reacción de hidrólisis inversa, 
que consiste en la condensación de un monosacárido con un alcohol y la consecuente 
liberación de agua de acuerdo a la reacción 1. Mediante este procedimiento se ha 
logrado obtener glicósidos u oligosacáridos (Choi y col., 2003). 
Antecedentes 
 11
 (1) 
Debido a la actividad hidrolítica predominante de las glicosidasas empleadas en estas 
reacciones y a la presencia de agua en proporciones elevadas, con frecuencia se obtienen 
bajos rendimientos de glicósidos. Dicho rendimiento se puede incrementar mediante un 
control termodinámico del equilibrio de la reacción. En este caso se requiere reducir la 
actividad de agua (aw) para desplazar el equilibrio en el sentido de la condensación del 
azúcar y el alcohol. Las formas más comunes para disminuir aw es mediante el incremento 
de la concentración de sustrato o mediante la presencia de solventes miscibles con el 
agua (Franssen y col., 2005). Sin embargo, la principal desventaja de estas estrategias es 
la dificultad de implementarlas a mayor escala (Meulenbeld y Hartmans, 2000). 
La glicosilación con estas enzimas puede también lograrse mediante reacciones de 
transglicosilación a partir de un glicósido donador, reacción que se controla cinéticamente 
si el sustrato donador (1) es mucho más reactivo que el producto (3) de transglicosilación 
(ecuación 2). 
 
 (2) 
El rendimiento del glicósido está determinado por el balance entre las velocidades de 
síntesis e hidrólisis del producto. (van Rantwijk y col.,1999). Así, mientras el donador se 
consume rápidamente, la concentración de producto se incrementará hasta alcanzar su 
nivel más alto, punto en el cual su velocidad de síntesis y desaparición son equivalentes. A 
partir de ese momento el control cinético se pierde y la reacción debe detenerse antes de 
que el producto se consuma significativamente. 
Las enzimas glicosidasas han sido utilizadas en la síntesis de oligosacáridos mediante esta 
actividad transferasa (Choi y col., 2003). Se ha reportado el uso de glicosidasas (mediante 
transglicosilación principalmente) en la síntesis de derivados glicosilados de algunos 
alcoholes complejos con el fin de aumentar su estabilidad. Ejemplos de ellos son: 
catecolaminas (dopa), glicosiladas con la enzima ciclodextrin glucanotransferasa; los 
antibióticos clorfenisina y cloramfenicol, ergoalcaloides farmacológicamente activos y 
geninas cardiacas transformados con β-galactosidasa de A. oryzae, por citar algunos; sin 
Glicosilo-OH + R-OH Glicosilo-OR H2O+
Glicosilo-OR1 + R2-OH Glicosilo-OR2 R1OH+
1 2 3 4
Antecedentes 
 12
embargo, los rendimientos obtenidos van desde 4 hasta 37%, en el mejor de los casos 
(van Rantwijk y col., 1999; Scheckermann y col., 1997). Recientemente se publicó la 
síntesis de guaiacol-α-D-glucósido y curcumina-bis-α-D-glucósido catalizada por una 
amiloglucosidasa de Rhizopus sp. con rendimientos máximos de 52 y 48%, 
respectivamente (Vijayakumar y Divakar, 2005). 
A pesar de las ventajas potenciales de las glicosidasas, en cuanto a su selectividad y a los 
sustratos de bajo costo que son capaces de emplear, su utilidad sintética es limitada 
debido a las bajas conversiones que generalmente se observan. Esto último es debido a la 
presencia de agua, la cual es necesaria para mantener la actividad de la enzima pero 
causa además la hidrólisis no deseada del producto (van Rantwijk y col., 1999). Una 
manera de abatir el problema de la hidrólisis se ha encontrado al utilizar ingeniería de 
proteínas. Al alterar el sitio activo de las glicosidasas se ha logrado la obtención de una 
mutante hidrolíticamente inactiva pero capaz de transferir a un aceptor cuando se cuenta 
con un donador activado (Daines y col., 2004). 
A pesar de que la mayor parte de los estudios sobre glicosilación se han centrado en las 
glicosidasas, existen reportes respecto al empleo de una clase de glicosiltransferasas que 
utilizan a la sacarosa como sustrato donador del residuo glicosilo: las glucansacarasas 
(EC 2.4.1.5) de especies de Streptococcus (glucosiltransferasas) o Leuconostoc 
mesenteroides (dextransacarasas) (Meulenbeld y Hartmans, 2000). 
3.5 Glicosiltransferasas 
En general las enzimas transferasas catalizan la transferencia de un determinado grupo a 
partir de un sustrato donador a otra molécula aceptora. A esta familia pertenecen las 
enzimas glicosiltransferasas (EC 2.4) las cuales transfieren un residuo glicosilo de una 
molécula donadora a la aceptora denominada aglicona. 
El grupo de las glicosiltransferasas está conformado por las hexosiltransferasas (EC 2.4.1), 
las pentosiltransferasas (EC 2.4.2) y las que transfieren otros grupos glicosilo (EC 2.4.99) 
(Boyce y Tipton, 2001). 
Antecedentes 
 13
En los organismos vivos estas enzimas juegan un papel muy importante ya que son las 
responsables de la formación del enlace glicosídico en moléculas como los 
glicoconjugados, metabolitos secundarios glicosilados y polisacáridos. 
Las glicosiltransferasas pueden clasificarse en dos grupos principales. Primero, las que 
pertenecen a la ruta de Leloir, que en general consiste en la activación del azúcar, la 
formación del enlace glicosídico por la glicosiltransferasa y finalmente la modificación del 
producto. Por tanto, las enzimas que pertenecen a esta ruta requieren azúcares 
nucleótidos como donadores del residuo glicosilo, como uridina 5’-(α-D-glicosil difosfato) 
(UDP-Glc, UDP-Gal, UDP-Xyl, entre otros). Segundo, las enzimas que no siguen la ruta de 
Leloir y utilizan sacarosa u otros disacáridos como donadores del residuo glicosilo, tal es 
el caso de las glicosiltrasferasas de origen bacteriano (p. ej. Leuconostoc mesenteroides) 
(Seibel y col., 2006; Meulenbeld y Hartmans, 2000; Toone y col., 1989). Estas enzimas 
son capaces de reconocer a la sacarosa como sustrato donador y toman la energía de su 
enlace para la generación del nuevo enlace glicosídico durante la transferencia. Esto es 
posible gracias a que la sacarosa posee una energía del enlace glucosídico de 5.0-5.5 
kcal/mol, el cual es el mismo nivel de energía encontrado en donadores nucleósidos 
difosfato como UDP-Glc (Robyt, 1995). 
A pesar de que las glicosiltransferasas de la ruta de Leloir son muy específicas y las 
conversiones suelen ser muy altas, su empleo se ve limitado debido al alto costo que 
representa utilizar azúcares nucleotídicos (Daines y col., 2004) y a que generalmente 
requieren cofactores, como los iones Manganeso, así como por la baja estabilidad y 
disponibilidad de estas enzimas. 
Las glicosiltransferasas pertenecientes al segundo grupo, utilizan en cambio a la sacarosa 
como molécula donadora, la cual que es un sustrato más disponible y menos costoso. 
Otra ventaja es que no requieren cofactores para llevar a cabo el proceso catalítico. A 
estas enzimas se les denomina también glicansacarasas y, en adelante, al hablar de 
glicosiltransferasas se hará referencia únicamente a las de origen bacteriano que serán 
objeto de estudio en el presente trabajo. 
Antecedentes 
 14
3.5.1 Glucosiltransferasas 
Las enzimas que catalizan la conversión de sacarosa en polímeros se dividen de manera 
convencional en α-D-glucosiltransferasas, y β-D-fructosiltransferasas (Sinnott, 1990), de 
acuerdo al residuo glicosilo que transfieren. 
Las glucosiltransferasas catalizan principalmente tres clases de reacciones con la sacarosa, 
que se esquematizan en la figura 4: 1) polimerización, en la cual las unidades glucosilo se 
unen secuencial y progresivamente a un polímero en crecimiento que recibe el nombre de 
dextrana; 2) hidrólisis, en donde el residuo glucosilo se transfiere a una molécula de agua, 
generando glucosa y fructosa como productos; y 3) reacción de aceptor, en la cual la 
transferencia de glucosa se realiza hacia una molécula agregada al medio, por ejemplo 
otro carbohidrato de bajo peso molecular, llevando a la formación de oligosacáridos (van 
Hijum y col., 2003; Olivares-Illana, 2003). En este último caso, el aceptor podría ser una 
molécula diferente a los azúcares, siempre y cuando posea grupos suficientemente 
reactivos para llevar a cabo un ataque nucleofílico sobre el residuo glicosilo y formar el 
enlace glicosídico correspondiente, por ejemplo los fenoles o los polifenoles. 
 
Figura 4. Reacciones catalizadas por glicosiltransferasas 
Las glucosiltransferasas también son capaces de realizar la reacción inversa de la 
formación del complejo glucosil-enzima, llevando a la síntesis de sacarosa (figura 5). Esto 
TRANSFERENCIA 
AL AGUA (HIDRÓLISIS) 
Sacarosa Glucosa 
+
Fructosa 
+
Fructosa Glucósido 
+
Glucosa Fructósido 
REACCIONES 
DE ACEPTOR 
R-OH 
+ 
Fructosa Dextrana 
… 
Glucosa 
+
Fructana 
… 
SÍNTESIS DE 
POLÍMERO 
Antecedentes 
 15
se ha comprobado mediante una reacción de intercambio isotópico, la cual puede ocurrir 
en un sistema que contenga fructosa marcada con un isótopo radioactivo y sacarosa, de 
tal manera que después de un cierto tiempo, el complejo D-glucosil-enzima comenzará a 
incorporar la fructosa para formar sacarosa con la marca radioactiva, comprobando de 
esta forma la reversivilidad de la reacción (Mooser y col., 1985). 
O
1
4 5
HO
HO
OH
6
O
2
3
OH
4'3'
2' O 5'
1' OH
HO
OH
6' OH
Sacarosa
Fructosa
Fructosa
D-Glucosil-Enzima
 
Figura 5. Intercambio isotópico por la reversibilidad de la reacción de formación 
del complejo glucosil-enzima en glucosiltransferasas. 
En la tabla 1 se presentauna clasificación de las glucosiltransferasas de acuerdo a los 
enlaces que generan durante la reacción de polimerización. 
Otro grupo de enzimas bacterianas pertenecientes al grupo E.C. 2.4.1 lo forman las 
ciclodextrin-glucanotransferasas, EC 2.4.1.19 que además de transferir glucosa, generan 
un ciclo con una cadena α-(1-4) de amilosa mediante la formación de un enlace 
glucosídico α-(1-4) dando lugar a ciclodextrinas (Plou y col., 2002). 
Las glucosiltransferasas han ampliado su potencial de aplicación en síntesis gracias a su 
capacidad de transferir glucosa hacia otros aceptores. En este contexto se ha reportado el 
uso de dextransacarasa y alternansacarasa de Leuconostoc mesenteroides en la síntesis de 
alquilpoliglucósidos en medio acuoso, utilizando α-butilglucopiranósido como aceptor 
(Richard y col., 2003), los cuales tienen utilidad como emulsificantes en la industria 
farmacéutica y de alimentos. 
3.5.2 Fructosiltransferasas 
Las enzimas fructosiltransferasas son capaces de transferir el residuo fructosilo de la 
sacarosa a alguna molécula aceptora de acuerdo al esquema presentado en la figura 4. 
Estas enzimas sintetizan dos clases de polímero: inulina (enlaces β-(2-1), ramificaciones en 
Antecedentes 
 16
β-(2-6), inulosacarasa) o levana (enlaces β-(2-6), ramificaciones β-(2-1), levansacarasa). 
Las fructosiltransferasas pueden utilizar carbohidratos distintos a la sacarosa como 
aceptores para la formación de fructooligosacáridos siendo capaces de utilizar D-xilosa, 
D-arabinosa, maltosa, maltotriosa, celobiosa, melibiosa o lactosa como moléculas 
aceptoras (Olivares-Illana, 2003). En la tabla 1 se muestra una clasificación de las 
fructosiltransferasas de acuerdo al tipo de enlace que generan. 
Tabla 1. Tipos de glicosiltransferasas 
Glicosiltransferasas E.C. Enlace Microorganismo 
productor 
Referencia 
Glucosiltransferasas 
Dextransacarasa 2.4.1.5 α-(1-6), 
ramificaciones en 
α­(1-2) y α-(1-3) 
Leuconostoc 
mesenteroides 
(Richard y col., 
2003; Monsan 
y col., 2001) 
Mutansacarasa 2.4.1.5 α-(1-3), 
ramificaciones 
α­(1-6) 
Cepas de 
Streptoccus 
(Plou y col., 
2002) 
Amilosacarasa 2.4.1.4 α-(1-4) Neisseria 
polysaccharea 
(Jensen y col., 
2004) 
Alternansacarasa 2.4.1.140 Enlaces alternados 
α-(1-3) y α-(1-6), 
ramificaciones en 
α-(1-3) 
Leuconostoc 
mesenteroides 
(Cote y col., 
2005) 
Fructosiltransferasas 
Inulosacarasa 2.4.1.9 β-(2-1), 
ramificaciones en 
β-(2-6) 
Streptococcus 
mutans y 
Lactobacillus 
reuteri 
(van Hijum y 
col., 2003; 
Monsan y col., 
2001) 
Levansacarasa 2.4.1.10 β-(2-6) Bacillus subtilis, 
Rahnella 
aquatilis y 
bacterias de la 
cavidad bucal 
(Monsan y col., 
2001) 
 
Diferentes procedimientos se pueden realizar con el fin de modificar la actividad de las 
enzimas hacia una reacción específica. En nuestro grupo de investigación (Olivares-Illana 
y col., 2003) se estudió la relación estructura-función de la inulosacarasa de Leuconostoc 
Antecedentes 
 17
mesenteroides. Para ello, se produjeron enzimas que difieren en tamaño respecto a la 
enzima nativa haciendo cortes en el extremo carboxilo y se encontró que la versión más 
corta posee mayor actividad hidrolítica que de transferencia a polímero. Además, a 
diferencia de la enzima original, es capaz de utilizar otros azúcares como aceptores. Otra 
manera de modificar la actividad de una enzima consiste en manipular el medio de 
reacción. 
3.6 Ingeniería de solventes 
Se ha demostrado que la selectividad de una enzima se puede modificar variando 
únicamente el medio en el que ésta actúa. A esta manipulación del medio de reacción 
para controlar la selectividad de una enzima es a lo que se conoce como Ingeniería de 
Solventes. En un principio las enzimas se estudiaron en medio acuoso que es su medio 
natural. Sin embargo, desde hace dos décadas se han logrado síntesis enzimáticas en 
medios no-convencionales como son los solventes orgánicos (Klibanov, 1990), y los 
fluidos supercríticos (Lozano y col., 2004; Tsitsimpikou y col., 1998) entre otros, con el fin 
de favorecer la formación de un producto específico. Recientemente en nuestro grupo de 
trabajo (Castillo y Lopez-Munguía, 2004), se evaluó la actividad de la enzima 
levansacarasa de Bacillus subtilis (BS-LVS) en solventes orgánicos y se encontró que en un 
medio compuesto por agua/2-metil-2-propanol (2M2P) 50:50 la sacarosa es 
principalmente utilizada por la enzima para la formación de polímero; esto es, se favorece 
la reacción de transferencia sobre la de hidrólisis debido a la baja concentración de agua 
disponible para actuar como aceptor. 
Debido a la compatibilidad de la enzima BS-LVS con diferentes solventes orgánicos, el 
empleo de esta enzima en este tipo de medios de reacción, abre la posibilidad de 
enfrentar moléculas polares, que es el caso de la sacarosa, a sustratos altamente 
hidrofóbicos como los flavonoides u otros compuestos fenólicos, y así obtener sus 
correspondientes derivados glicosilados. 
Existen reportes acerca de la glicosilación de diferentes aceptores utilizando 
glucosiltransferasas, sin embargo los rendimientos son muy bajos debido principalmente a 
la baja solubilidad del sustrato aceptor y que no puede mejorarse con la adición de 
Antecedentes 
 18
solventes orgánicos debido a la inestabilidad de la enzima en dicho medio (Seo y col., 
2005; Richard y col., 2003; Meulenbeld y Hartmans, 2000). 
3.7 Reacciones de aceptor con glicosiltransferasas 
En vista del gran potencial que se ha encontrado en las ezimas glicosiltransferasas para 
llevar a cabo reacciones de aceptor, actualmente se estudia su uso en la glicosilación de 
compuestos hidrofóbicos interesantes por sus propiedades y su actividad biológica. 
Un ejemplo de ello es la glicosilación del flavonoide luteolina catalizada por la 
dextransacarasa de L. mesenteroides NRRL B-512F. Esta reacción se llevó a cabo en una 
mezcla formada por amortiguador de acetatos/bis(2-metoxietil) éter, 70:30, con una 
concentración inicial de aceptor igual a 9 mM, logrando una conversión del 44% con 
respecto al aceptor (3.96 mM de producto) (Bertrand y col., 2006). Además los autores 
reportan la obtención de productos de glucosilación del flavonoide miricetina con 
rendimiento del 49% (4.4 mM de producto) y con quercetina, esta última catalizada con la 
alternansacarasa B-23192, aunque con un rendimiento tan solo del 4% (0.36 mM de 
glucósido); en todos los productos identificados la glicosilación se localizó en las 
posiciones 3’ y 4’ de acuerdo con la estructura general que se muestra en la figura 6. 
 
Figura 6. Estructura de flavonoides reportados en la 
glicosilación con dextransacarasa y alternansacarasa. 
Luteolina: R1 = H, R2 = H; Miricetina R1 = OH, R2 = OH; 
Quercetina R1 = H, R2 = OH. 
En otro estudio se reportó la producción de tres glucósidos de galato de epigalocatequina 
(figura 7A), catalizada por una glucansacarasa de L. mesenteroides B-1299. Los autores 
reportaron una conversión igual a 92% partiendo de una concentración inicial de aceptor 
7
6
5
8
4 3
2
O
1'
6'
5'
4'
3'
2'
OH
OH
R1
HO
OH O
R2
Antecedentes 
 19
igual a 4.3 mM, logrando la glicosilación en las posiciones 4’, 4’’ y 7 (Moon y col., 
2006). 
 
Figura 7. Estructuras del galato de epigalocatequina (A) y catequina (B). 
Por otro lado, la glucosilación de catequina, figura 7B, se ha realizado mediante una 
glucosiltransferasa de Streptococcus sobrinus consiguiendo transferir un residuo glucosilo 
a la posición 4’ con un rendimiento del 13.7%, respecto a una concentración inicial de 
aceptor igual a 3.4 mM (Nakahara y col., 1995) y con glucosiltransferasa-D de 
Streptococcus mutans GS-5 alcanzando conversiones del 90%, a partir de 10 mM de 
aceptor (Meulenbeld y col., 1999). Con esta misma enzima se ha reportado la 
glicosilación de compuestos más pequeños, como catecol (1,2-dihidroxibenceno), 4-
metilcatecol y 3-metoxicatecol con rendimientos de65, 50 y 75 % respectivamente, 
utilizando 40 mM de aceptor (Meulenbeld y Hartmans, 2000) y los autores argumentan 
que los dos grupos hidroxilo adyacentes de la estructura de catecol son esenciales para la 
reacción con esta enzima, ya que con fenol y alcoholes como el salicílico no detectaron 
productos de glicosilación. 
Finalmente, en un estudio con glucansacarasas de L. mesenteroides B-1315 y B-1299-
BF563 se encontró transferencia de glucosa a salicina y alcohol salicílico produciendo 
más de 12 y 9 productos, respectivamente, mientras que con B-1299-BF563 se obtuvieron 
dos productos de glicosilación de fenol (Seo y col., 2005), aunque los autores no reportan 
rendimientos. 
7
6
5
8
4
3
2O 1'
6'
5'
4'
3'
2'
OH
OH
HO
OH
OH
7
6
5
8
4
3
2O 1'
6'
5'
4'
3'
2'
OH
OH
HO
OH
O
4''
2''
6''
OH
OH
OH
O
OH
A B 
Antecedentes 
 20
Se puede apreciar que existen compuestos hidrofóbicos que se han logrado glicosilar 
mediante el uso de glicosiltransferasas. No obstante, es importante mencionar que en la 
mayoría de los casos la concentración de aceptor empleada no es superior a 40 mM, 
teniendo como consecuencia una baja productividad del glicósido. En el caso de los 
ejemplos de glicosilación de flavonoides, la baja concentración empleada del aceptor es 
consecuencia de su hidrofobicidad, lo que reduce considerablemente su solubilidad en 
medio acuoso. Una estrategia para favorecer la solubilidad, consiste en utilizar mezclas 
con un solvente orgánico, siempre y cuando la enzima utilizada sea estable y activa en el 
sistema. 
Otra de las causas por las que se emplean bajas concentraciones de aceptor en los 
ejemplos anteriores es la incompatibilidad del sustrato con la enzima; tal es el caso de la 
glicosilación de catecol mediante glucosiltransferasa-D de S. mutans GS-5, donde los 
autores no lograron emplear una concentración mayor de sustrato debido a que esto 
causa inactivación de la enzima (Meulenbeld y Hartmans, 2000). 
Es claro que algunos compuestos hidrofóbicos pueden causar un efecto negativo sobre 
ciertas enzimas; asimismo, los compuestos que actúan como aceptores para un tipo de 
glicosiltransferasa, pueden no hacerlo con otras. Esto lleva a considerar que el éxito de la 
reacción dependerá tanto de las características de la enzima, como de las condiciones de 
reacción y la reactividad química del aceptor. 
3.7.1 Reactividad de las moléculas aceptoras 
A diferencia de lo que se conoce sobre reactividad de β­glicosidasas (de Roode y col., 
2000), hasta el momento no se ha reportado de que manera afecta la reactividad del 
aceptor en la formación del enlace glicosídico mediante glicosiltransferasas. 
De acuerdo con lo reportado por de Roode et al (2000), la capacidad de β­glucosidasas 
(EC 3.2.1.21) para transferir glucosa hacia diferentes alcoholes primarios, secundarios y 
fenólicos se ve disminuida drásticamente para estos últimos debido su baja nucleofilicidad 
y, consecuentemente, baja reactividad. Puesto que la nucleofilicidad no es un parámetro 
directamente medible, se puede correlacionar la reactividad de los compuestos con 
parámetros que pueden ser determinados mediante cálculos semi-empíricos de química 
Antecedentes 
 21
cuántica. Los autores encuentran una clara relación entre la carga en el átomo de oxígeno 
calculada para el nucleófilo y la viabilidad de ser glicosilado. Con base en este estudio, 
demuestran que la carga en el átomo de oxígeno para compuestos fenólicos no es lo 
suficientemente negativa para actuar como aceptor. Esto se puede explicar por la 
resonancia que se genera al interior del anillo bencénico de acuerdo a la figura 8a. 
 
Figura 8. Estructuras resonantes de fenol y 4-metoxifenol. 
Efecto electrodonador de los sustituyentes del anillo. 
El grupo hidroxilo de los fenoles es un grupo electrodonador, es decir, el oxígeno puede 
ceder fácilmente uno de sus pares electrónicos hacia el anillo, generando estructuras 
resonantes con carga positiva en el oxígeno, reduciendo así su poder nucleofílico. Una 
manera de inducir mayor nucleofilicidad es utilizar otros sustituyentes electrodonadores en 
el anillo fenólico como el grupo metoxilo de la figura 8b. 
Por otro lado, de acuerdo con lo reportado por de Roode y col. (2000) para las β-
glicosidasas la carga en el átomo reactivo (nucleofilicidad) en moléculas como la que se 
muestra en la figura 8b, sigue siendo menos negativa que para alcoholes primarios, razón 
por la cual los autores argumentan que no es posible glicosilarlas con este tipo de 
enzimas. 
Por lo tanto, es posible considerar que existe mayor probabilidad de éxito en la 
glicosilación de compuestos hidrofóbicos con alcoholes primarios en su estructura debido 
O
H
O
H
O
H
O
O
H
O
Fenol
4-metoxifenol
a) 
b) 
Antecedentes 
 22
a una mayor nucleofilicidad y, en consecuencia, mayor reactividad. Como ejemplo de una 
molécula que posee un hidroxilo primario y que resulta interesante por su actividad 
biológica se puede mencionar al perillol, que es un terpeno para el que se ha encontrado 
actividad como anticancerígeno (Ripple y col., 2000) así como el alcohol bencílico, cuyo 
derivado glucosilado (bencil-β­D-glucopiranósido) se ha evaluado para aliviar estrés en 
modelos de ratas (Ina y col., 2004). 
No obstante, en este trabajo no se descarta la posibilidad de evaluar moléculas con 
diferente funcionalidad en los grupos hidroxilo, ya que si bien la reactividad del aceptor es 
un factor crucial en la glicosilación, las características propias de la enzima son también 
un elemento clave en el éxito de la reacción. 
 
Hipótesis y Objetivo 
 23
4. HIPÓTESIS 
Bajo la premisa de que las glicosiltransferasas incrementan su capacidad para transferir 
residuos glicosídicos de la sacarosa a un aceptor apropiado en medios con solventes 
orgánicos y considerando que son enzimas compatibles con altas concentraciones de 
éstos, se plantea como hipótesis para este trabajo que: 
Las glicosiltransferasas pueden llevar a cabo reacciones de glicosilación sobre aceptores 
hidrofóbicos como los polifenoles en presencia de solventes orgánicos miscibles con el 
agua. 
5. OBJETIVO GENERAL 
• Partiendo del modelo enzimático de la levansacarasa de Bacillus subtilis, 
desarrollar un sistema enzimático estable capaz de glicosilar eficientemente 
sustratos hidrofóbicos en condiciones de reacción no convencionales. 
5.1 Objetivos particulares 
• Desarrollar un sistema enzimático estable y funcional en presencia de solventes 
orgánicos miscibles con el agua, con el fin de favorecer la solubilidad de aceptores 
hidrofóbicos. 
• Evaluar el efecto que causa el empleo de solventes orgánicos en la actividad 
hidrolítica y transferasa de las enzimas estudiadas, así como el efecto en las 
reacciones de aceptor con sustratos hidrofóbicos. 
• Emplear como aceptores no naturales en las reacciones de glicosilación 
compuestos hidrofóbicos con la finalidad de modificar su solubilidad y 
biodisponibilidad. 
• Determinar de qué manera influyen las características estructurales de los 
compuestos hidrofóbicos al ser utilizados como aceptores en reacciones de 
glicosilación e identificar los productos generados a partir de las reacciones con 
estas moléculas. 
Materiales y Métodos 
 24
6. MATERIALES Y MÉTODOS 
6.1 Materiales 
La sacarosa, fructosa, glucosa, maltotriosa, maltoheptaosa, polietilenglicol (PEG), Ác. 
Trifluoroacético, alcohol bencílico, salicina, fenil etanol, catecol, resorcinol y guaiacol 
fueron adquiridos de Sigma Chemical Co. (MO, USA). Los compuestos quercetina, 
hidroquinona y 4-metoxicatecol se adquirieron de Fluka (Edo. de Méx., México). El 
Alcohol salicílico, 2-fenil-1-propanol, perillol, 4-metoxifenol, 3-metilcatecol, 3-
metoxicatecol y ácido caféico fueron adquiridos de Aldrich (WI, USA). El fenol se adquirió 
de Research Organics, Inc. (OH, USA) 
El ácido dihidrocaféico y el metil éster de ác.dihidrocaféico fueron sintetizados en el 
Laboratorio de Síntesis de Fármacos de la Facultad de Estudios Superiores de Zaragoza, 
UNAM. 
Los solventes 2-metil-2-propanol (2M2P), Metanol, Ácido Acético y Éter Etílico en grado 
analítico, las sales para soluciones amortiguadoras y el o-aminofenol fueron adquiridos de 
J. T. Baker, Co. (Edo. de Mex., México). El solvente Acetonitrilo en grado HPLC, se 
adquirió de Burdick & Jackson (MI, USA). La arena de cuarzo para cromatografía flash, la 
sílica gel 60, las placas de sílica gel 60 ALUGRAM® SIL G/UV254 y ADAMANT de la marca 
Macherey-Nagel se obtuvieron de TECROM (D.F., México) 
6.2 Preparación enzimática 
Las enzimas utilizadas durante la realización de este proyecto se enlistan en la tabla 2. 
Tabla 2. Sistemas enzimáticos empleados. 
Enzima Actividad Microorganismo de 
origen 
Presentación 
BS-LVS Levansacarasa B. subtilis Soluble 
DSRS B-512F Dextransacarasa L. mesenteroides B-512F Soluble 
LevC Levansacarasa L. mesenteroides ssp 
mesenteroides (ATCC 
8293) 
Soluble 
B-1299 Dextransacarasa L. mesenteroides B-1299 Células 
Materiales y Métodos 
 25
6.2.1 Preparación de la Levansacarasa BS-LVS 
La enzima levansacarasa de B. subtilis se obtuvo a partir de una cepa derivada de B. 
subtilis Marburg 168, diseñada con el genotipo ∆npr, ∆aprE, CmR, degU32 (Hy). La 
mutación degU32 (Hy) induce efectos pleiotrópicos en B. subtilis entre los cuales se 
encuentran: 1) la sobreproducción de la proteasa alcalina y otras enzimas tales como la 
levansacarasa, la proteasa neutra, la β­glucanasa y la serin-proteasa intracelular; 2) 
defectos en la síntesis de flagelo y del desarrollo de competencia; y 3) alteraciones en la 
represión catabólica normal de la esporulación por glucosa (Martínez, 1997). Los genes 
que codifican para la proteasa alcalina (aprE) y la proteasa neutra (npr) se encuentran 
interrumpidos en la cepa empleada, la cual posee resistencia a cloramfenicol (CmR) como 
marcador de selección. La enzima se produjo por fermentación en matraz fernbach de 2.8 
L con 950 mL de medio de fermentación, cuya composición se especifica en la tabla 3. 
Tabla 3. Composición del medio de cultivo para B. subtilis 
Componente Concentración (g/L) 
Sacarosa 20 
Extracto de levadura 20 
K2HPO4 20 
MgSO4 · 7 H2O 0.2 
MnSO4 · 7 H2O 0.01 
FeSO4 · 7 H2O 0.01 
CaCl2 · 2 H2O 0.05 
NaCl 0.1 
Se realizó la fermentación hasta alcanzar una densidad óptica (D.O.) de 6 a 600 nm 
(entre 5 o 6 horas). Posteriormente las células se separaron mediante centrifugación a 
8600 G durante 10 min a 4°C. La enzima BS-LVS del sobrenadante se recuperó mediante 
precipitación adicionando lentamente por cada parte de sobrenadante un volumen igual 
de una solución al 50% de PEG5000 en agua. La mezcla se mantiene a 4°C con 
agitación durante 1 h y posteriormente se centrifuga a 22100 G y el precipitado se 
resuspende en amortiguador de fosfatos 50 mM, pH 6.0. 
Materiales y Métodos 
 26
6.2.2 Preparación de la Dextransacarasa DSRS B-512F 
La enzima DSRS B-512F corresponde a la recombinante proveniente de Leuconostoc 
mesenteroides DSRS B-512F y está expresada en E. coli Top10 que posee un promotor 
inducible por arabinosa. La producción de la enzima se realizó mediante fermentación en 
matraz fernbach durante 18 h, a 22°C y 200 rpm hasta alcanzar una D.O. a 600 nm 
entre 1.5 y 2. Las células se recuperaron mediante centrifugación a 3800 G durante 20 
min a 4°C, se lavaron y se resuspendieron en amortiguador de acetatos 20 mM, pH 5.2, 
tritón 1% e inhibidores de proteasas para posteriormente realizar el rompimiento celular 
con prensa de French a 1150 psi. Los restos celulares se separaron nuevamente mediante 
centrifugación a 12800 G, 30 min a 4°C. 
6.2.3 Preparación de la Levansacarasa LevC 
La enzima LevC recombinante proviene de Leuconostoc mesenteroides ssp mesenteroides 
ATCC 8293 y está expresada en E. coli TOP 10. La fermentación se realizó en un matraz 
tipo fernbach 2.8L con 950 mL de medio YT2X ampicilina 200µg/mL con un 0.02% de 
arabinosa como inductor y cultivadas a 25°C y 250 rpm hasta alcanzar una D.O. a 600 
nm de 1.5 o 2 unidades. 
Las células se recuperaron mediante centrifugación a 3800 G durante 20 min a 4°C, se 
resuspendieron en 20 mL de amortiguador de fosfatos 50 mM pH 6.5 y se rompieron 
utilizando una prensa de French 1800 psi. Los restos celulares se separaron por 
centrifugación a 12800 G por 30 min a 4°C. 
6.2.4 Preparación de la Glucosiltransferasa B-1299 
Esta enzima pertenece a la cepa Leuconostoc mesenteroides B-1299 y se produjo 
mediante fermentación en matraz fernbach de 2.8 L con 950 mL de medio durante 4 h a 
29°C y 200 rpm procurando que el pH sea entre 5.4 y 5.6, fuera de este rango se pierde 
la actividad de la dextransacarasa. Las células se separaron por centrifugación a 3800 G 
durante 20 min a 4°C, se lavaron y recuperaron en amortiguador de acetatos 50 mM pH 
5.4-5.6 y se mantienen en este amortiguador a 4°C. La suspensión de células se empleó 
directamente en los ensayos enzimáticos. 
Materiales y Métodos 
 27
6.3 Determinación de la actividad glicosiltransferasa 
La actividad glicosiltransferasa de la enzima producida se evaluó en función de la 
velocidad de liberación de azúcares reductores a partir de una solución de 100 g/L de 
sacarosa en solución amortiguadora a pH adecuado para cada enzima, o mezclas de 
amortiguador con solvente orgánico 2-metil-2-propanol (2M2P) si fuera el caso. La 
medición se realizó durante los primeros 10 min de reacción a una temperatura de 30°C 
utilizando el método de ácido dinitrosalicílico (DNS) y tomando la glucosa como estándar. 
La unidad de actividad enzimática global está definida como la cantidad de enzima que 
libera el equivalente a 1 µmol de glucosa/min. 
La actividad enzimática en presencia de solvente orgánico se determinó empleando 
diferentes proporciones del solvente orgánico y solución amortiguadora al pH óptimo para 
cada enzima. 
6.4 Reacciones de aceptor 
Las reacciones de síntesis enzimática de glicósidos de los compuestos hidrofóbicos 
evaluados se llevaron a cabo en frascos viales con 3 mL de volumen de reacción y todas 
se realizaron por duplicado. En general los sustratos se emplearon en relación 1:1 
Sacarosa/Aceptor en concentración 400 mM y se agregó una cantidad de enzima para 
alcanzar una concentración final de 1 U/mL de reacción. El medio de reacción empleado 
consistió principalmente en solución amortiguadora de fosfatos 50 mM, pH 6.0 para la 
enzima BS-LVS o el amortiguador adecuado para las otras enzimas evaluadas. En algunos 
casos se probaron mezclas con solvente orgánico 2M2P. Las reacciones se mantuvieron 
en un baño de agua a 30°C con agitación magnética durante 24 horas y posteriormente 
se analizaron mediante cromatografía de capa fina. 
6.5 Análisis de sustratos y productos de reacción 
6.5.1 Cromatografía de Capa Fina 
El análisis de los sustratos y productos de reacción se realizó cualitativamente mediante 
Cromatografía de Capa Fina (TLC, por sus siglas en inglés) de acuerdo a las técnicas 
convencionales en placa de vidrio recubiertas con sílica gel 60 ADAMANT o placa de 
Materiales y Métodos 
 28
aluminio Alugram Sil G/UV254, utilizando como sistema de elución una mezcla 
acetonitrilo/agua 80:20 con 0.5 % de ácido acético, el cual permite la elución rápida de 
los sustratos hidrofóbicos que migran aproximademante a un Rf de 0.9 y la fructosa a un 
Rf de 0.5, lo cual deja un rango adecuado para observar claramente los fructósidos 
producidos de cada molécula hidrofóbica aceptora. 
6.5.2 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución 
El análisis cuantitativo se llevó a cabo mediante Cromatografía de Líquidos de Alta 
Resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) utilizando un cromatógrafo Waters (Millipore 
Corp., MA, USA) equipado con dos detectores en línea, uno de arreglo de diodos 996 y el 
otro de índice de refracción 410 utilizandouna columna para análisis de carbohidratos 
Prevail Carbohydrate ES, 5 µm, 4.6 x 250 mm (Alltech Associates Inc., IL, USA). El sistema 
de elución consistió en una mezcla acetonitrilo/agua (80:20) con flujo de 1 mL/min. 
La actividad transferasa e hidrolítica se evaluó a partir del análisis por índice de refracción 
en función de la fructosa liberada al medio, la cual se considera que solo puede provenir 
de la reacción de hidrólisis, mientras que la glucosa liberada representa la conversión 
total de sacarosa. Por tanto, la diferencia entre glucosa y fructosa liberadas al medio es 
equivalente a la actividad transferasa. 
Los sustratos aromáticos hidroquinona y resorcinol, así como los productos de la reacción 
de aceptor se identificaron mediante el detector de arreglo de diodos en un rango de 190 
a 300 nm con el sistema descrito previamente. La preparación de las muestras consistió 
en añadir tres volúmenes de etanol y centrifugar para desechar el polímero precipitado. 
Posteriormente el sobrenadante se lleva a una dilución final 1/10. 
Para el caso del sustrato alcohol bencílico y productos del mismo, se utilizó un detector 
de arreglo de diodos con monitoreo en un rango de 200 a 370 nm utilizando una 
columna Alltima HP C18 HL, 3 µm, 150mm x 4.6mm (Alltech Associates Inc., IL, USA). La 
fase de elución consistió en acetonitrilo/agua, TFA 0.1%, a un flujo de 1 mL/min en 
gradiente de concentración como se muestra en la tabla 4. 
 
Materiales y Métodos 
 29
Tabla 4. Gradiente de flujo para el análisis por HPLC 
de fructósidos de moléculas aromáticas. 
Tiempo 
(min) 
Agua 
0.1 % TFA (%) 
Acetonitrilo 
0.1% TFA. (%) 
0 95 5 
8 70 30 
9.5 70 30 
11.5 95 5 
20 95 5 
 
6.5.3 Análisis estructural de los productos de reacción 
El análisis estructural de los productos de reacción se realizó mediante Resonancia 
Magnética Nuclear (RMN) o por espectrometría de masas, con el fin de confirmar la 
glicosilación de los sustratos hidrofóbicos así como determinar con precisión el número de 
residuos glicosilo incorporados. El análisis por RMN, tanto de protón (RMN1H) como del 
isótopo de carbono (RMN13C) se llevó a cabo en colaboración con el Instituto de 
Química, UNAM, empleando un espectrómetro Eclipse 300 MHz Jeol (E), con agua 
deuterada (D2O) como disolvente. El análisis por espectrometría de masas se realizó en 
colaboración con el Centro de Investigaciones Químicas, UAEM, mediante la técnica de 
bombardeo de átomos rápidos (FAB-MS, por sus siglas en inglés) en modo positivo 
empleando un espectrómetro JEOL MStation JMS-700. Los productos de reacción se 
purificaron para estos análisis y para emplearlos como estándares para HPLC y TLC 
mediante cromatografía de columna o TLC preparativa. 
6.6 Purificación de los productos de reacción 
Para la obtención del producto de fructosilación de alcohol bencílico se empleó un 
volumen de reacción de 100 mL en las condiciones establecidas previamente. La reacción 
se dejó transcurrir durante 40 horas y se inactivó colocando en un baño de agua a 
ebullición por 20 min. Parte del aceptor que permaneció sin reaccionar se extrae de la 
mezcla de reacción con acetato de etilo en relación 1:1. Posteriormente la fase acuosa se 
evapora en rotavapor a 60°C y -0.7 bar. La mezcla obtenida posee un alto contenido de 
Materiales y Métodos 
 30
azúcares y polímero levana. Este último se precipita mediante la adición de 30 mL de 
etanol y el polímero se separa por centrifugación a 6300 G, durante 10 min a 4°C. El 
sobrenadante se evapora nuevamente en rotavapor y el residuo obtenido se resuspende 
en una mínima cantidad de metanol (en el cual todo resultó soluble) con el fin de 
adsorber los productos sobre sílica gel 60, la cual se adiciona en una proporción 1:1 
sílica/mezcla. Finalmente los productos se separan mediante cromatografía de columna 
empacada con sílica gel 60 y empleando acetonitrilo como fase móvil. Cada etapa de la 
purificación, así como el proceso de cromatografía de columna, se monitoreó mediante 
TLC. La estructura del producto así purificado se determinó mediante RMN1H y RMN13C. 
La purificación de los fructósidos de dihidroxibencenos se realizó mediante TLC 
preparativa empleando la fase de elución previamente descrita y el análisis estructural de 
los mismos se efectuó por FAB-MS. 
 
Resultados y Discusión 
 31
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
De acuerdo con el objetivo de este proyecto, una condición para efectuar reacciones de 
glicosilación sobre aceptores hidrofóbicos es contar con glicosiltransferasas que sean 
activas en altas concentraciones de solventes orgánicos. Esta condición en principio 
permitiría aumentar la solubilidad de sustratos hidrofóbicos, como las moléculas 
polifenólicas, y a su vez favorecer la actividad transferasa sobre la actividad hidrolítica que 
poseen estas enzimas. Como una primera aproximación se decidió trabajar con dos 
fructosiltransferasas: Levansacarasa de Bacillus subtilis (BS-LVS) y Levansacarasa de 
Leuconostoc mesenteroides, subespecie mesenteroides, recombinante (LevC); y una 
glucosiltransferasa: Dextransacarasa B512F recombinante (DSRS B512F). 
De estudios previos se conoce el efecto del solvente sobre la estabilidad de la BS-LVS 
(Castillo y Lopez-Munguía, 2004), por tanto fue necesario evaluar la estabilidad al 
almacenamiento en 2M2P de las otras glicosiltransferasas tomando como referencia este 
reporte. 
7.1 Estudio de estabilidad de la DSRS B512F recombinante en 2M2P 
En un ensayo preliminar se evaluó la actividad de la enzima DSRS B512F en presencia de 
diferentes concentraciones de 2M2P en las condiciones descritas en la metodología. Se 
encontró que a una concentración del 10% de solvente la actividad se ve reducida 
respecto a la actividad medida en medio acuoso, mientras que con 20% del solvente la 
actividad se pierde completamente. Por lo anterior, se decidió evaluar la estabilidad al 
almacenamiento de esta enzima a una concentración de 10% de 2M2P. El ensayo se 
realizó incubando el extracto enzimático con 10% del solvente y evaluando actividad en 
medio acuoso. El resultado se muestra de forma gráfica en la figura 9 en la cual se 
presenta la actividad relativa, que corresponde a la actividad medida a diferentes tiempos 
de almacenamiento de la enzima respecto a la obtenida sin almacenar. Puede observarse 
que la caída de la actividad ocurre bruscamente en los primeros 10 minutos de 
almacenamiento el solvente 2M2P. 
Resultados y Discusión 
 32
De acuerdo con los estudios previos al presente trabajo, la BS-LVS presenta actividad 
catalítica en reacciones efectuadas en presencia de hasta el 83% de 2M2P (Castillo y 
Lopez-Munguía, 2004) además resultó estable al almacenamiento, encontrándose que a 
las 24 h de almacenamiento en ausencia de sustrato y en presencia de diferentes 
concentraciones de 2M2P, la pérdida máxima de actividad fue del 50%, la cual ocurre a 
concentraciones de 63% de 2M2P. 
Es importante notar que la DSRS B512F recombinante se expresa libre de polímero, a 
diferencia de la BS-LVS que se obtiene con el polímero levana asociado a su estructura. 
Por lo tanto, se optó por determinar si la presencia de polímero podría ser el factor que 
ayudara a estabilizar la enzima al colocarla en un medio con solvente orgánico. Para ello 
se adicionó 2% de sacarosa al extracto de la DSRS B512F y se incubó a 30°C durante 3 
horas para permitir la formación del polímero dextrana que, por analogía con el sistema 
BS-LVS, podría ejercer un efecto protector en la enzima. 
Con el nuevo sistema DSRS B512F asociado a polímero dextrana se realizó un estudio de 
estabilidad al almacenamiento en 10% de 2M2P obteniéndose el perfil que se muestra en 
la figura 9. 
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150
Tiempo (min)
Ac
tiv
id
ad
 r
el
at
iv
a 
(%
) Sin polímero
Con polímero
 
Figura 9. Estabilidad al almacenamiento en 10% de 
2M2P de la DSRS B512F sin y con polímero