Implementacion-y-evaluacion-de-la-transparentacion-del-charal-Chirostoma-humboldtianum-con-soluciones-alcoholicas

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UNIVERSIDAD NACIONAL 
AUTONOMA DE MÉXICO 
 
FACULTAD DE ESTUDIOSSUPERIORES 
IZTACALA 
 
 
CARRERA DE BIOLOGIA 
 
LABORATORIO DE ANATOMIA ANIMAL COMPARADA 
 
 
 
IMPLEMENTACIÓN Y EVALUACIÓN DE LA 
TRANSPARENTACION DEL CHARAL (Chirostoma 
humboldtianum) CON SOLUCIONES ALCOHÓLICAS. 
 
 
 
TESIS QUE PARA 
OBTENER EL TITULO DE BIÓLOGA 
PRESENTA: 
 
Baeza Andrade Mónica Elizabeth. 
 
 
Director de Tesis: 
M. en C. Jorge R. Gersenowies Rodríguez 
 
 
 
 México 2008 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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INDICE 
 
 CONTENIDO PÁGINA 
 
0 RESUMEN 
 
1 
I. INTRODUCCIÓN 
 
2 
II. ANTECEDENTES 
 
7 
 II. 1 FIJADORES 
 
7 
 II. 2 TINCIÓN DEL ESQUELETO 
 
8 
 II. 3 TRANSPARENTACIÓN 
 
9 
 II. 4 FUNDAMENTOS DE LA TÉCNICA DE 
TRANSPARENTACIÓN 
 
12 
 II. 5 ORGANISMO MODELO PARA EL ESTUDIO 
 
15 
III. JUSTIFICACIÓN 
 
18 
IV. HIPOTESIS 
 
19 
V. OBJETIVOS 
 
20 
VI. MÉTODO 
 
21 
 VI. 1 RUTA CRÍTICA 
 
21 
 VI. 2 DESCRIPCIÓN DEL METODO 
 
22 
VII. RESULTADOS 
 
26 
 VII.1 ANÁLISIS CUALITATIVOS 
 
26 
 VII.2 ANÁLISIS CUANTITATIVO 
 
29 
VIII. ANÁLISIS DE RESULTADOS 
 
32 
IX. CONCLUSIÓN 
 
34 
X. BIBLIOGRAFÍA 
 
35 
XI. ANEXO (ESQUEMA Y TABLA DE LOS DATOS MERISTICOS) 42 
 
1 
 
RESUMEN. 
 
Los investigadores dedicados al estudio del esqueleto continuamente se enfrentan 
con la decisión de modificar las técnicas que se emplean para lograr la obtención 
de muestras de mejor calidad para realizar su trabajo. Se debe tomar en cuenta 
que la mayoría de los organismos terminan siendo manipulados constantemente 
por el investigador y almacenados por largo tiempo, procesos que lleva a su 
deterioro. 
Una de estas técnicas emergentes en el estudio del Bauplan es aclarar y colorear 
tejidos, órganos y sistemas, tanto de organismos completos como de porciones, 
siendo de gran valor e importancia para los estudios comparativos. La técnica de 
Hollister es un método ya estandarizado para la obtención de especímenes 
transparentados pero con características poco viables para su manejo. En el 
presente trabajo se modificó la técnica para obtener preparaciones más 
resistentes y manejables. Se implementó la técnica de transparentación de 
Hollister combinada con distintas concentraciones de alcohol (20%, 40%, 60%, y 
80%) obteniendo buenos resultados en la transparentación de Chirostoma 
humboldtianum, con excepción de la concentración al 80% y KOH al 4%. En las 
demás soluciones no se afecto la digestión alcalina, pero si la consistencia del 
tejido resultando diferentes grados de deformación. Las diferencias fueron: el 
grupo control y la solución de alcohol 60% y KOH al 4% presentaron una mayor 
deformación en comparación de las demás soluciones. Una deformación 
intermedia se observa en la solución de alcohol al 40% y KOH al 4% y por último 
podemos decir que la solución que presento menor deformación se encuentra en 
la solución de alcohol al 20% y KOH al 4% la cual sugerimos utilizar en este tipo 
de técnica combinada. 
 
 
 
 
 
2 
 
 
 
 
I. INTRODUCCIÓN 
 
El estudio de la estructura de los organismos es el objeto fundamental de las 
ciencias morfológicas, y constituye la parte más antigua y quizás la más extensa 
de la biología (Estrada, 1982). 
Esto es debido a que el estudio de la estructura de los vertebrados pertenecientes 
a las diversas clases pone de manifiesto su parentesco, no solo entre sí, sino 
también con el hombre (Weichert 1989). Esto es más sobresaliente dado que 
existen alrededor de 50,000 especies vivas de vertebrados y su gran diversidad de 
conductas se asocia a su complejidad morfológica (Harvey y Pagel, 1991). 
Indudablemente uno de los objetivos de la biología es la investigación de las 
relaciones filogenéticas entre las especies ya que sus diferencias reflejan 
adaptaciones morfológicas, fisiológicas y ecológicas, cuyo conocimiento son 
esenciales para su aprovechamiento como recurso (Rosen, 1973). Una de las 
ramas de las ciencias naturales que se inclina por este estudio es la anatomía; 
que deriva de las dos declinaciones griegas “ana” y “temmo”, que quiere decir 
separar, cortar, dividir (González, 1961). La anatomía es la ciencia médica mas 
antigua, su estudio formal se inicio en Egipto y Mesopotamia (Gersenowies, 2000); 
y se ocupa del estudio de la organización estructural o Bauplan de los seres vivos, 
estudiando las partes que entran en su constitución, examinando sus múltiples 
caracteres estáticos en el cadáver por la práctica de la disección (González, 
1961). 
Para mayor facilidad de estudio, la morfología se dividió a principios del siglo XVIII 
en una parte macroscópica y una microscópica. Los aspectos macroscópicos son 
revisados por la anatomía comparada la cual abarca el conocimiento de la 
organización de todos los seres vivos cuando han alcanzado su pleno desarrollo 
(González, 1961); además compara estructuras, resaltando las principales 
similitudes y diferencias poniendo de relieve los aspectos funcionales y evolutivos 
3 
 
que subyacen a la estructura de los vertebrados, explicando su diseño estructural 
(Bauplan) y las razones por las que este se rige (Kardong, 1999). Ahora bien, la 
estructura o morfología de los animales varía entre especies, no es uniforme y por 
lo tanto no pueden estandarizarse. Aun en el plano individual, existen diferencias 
entre los órganos bilaterales como son: huesos, músculos, articulaciones, 
vísceras, vasos y nervios. Algunos factores responsables de la aparición de las 
variaciones sobre los sistemas orgánicos son la edad, sexo, evolución y el 
ambiente (Sisson y Grossman, 1982). El estudio de estos factores provee al 
morfólogo de evidencia favorable para entender los procesos y productos de la 
evolución orgánica (Hilderbrand, 1995). 
Por otra parte, se señala que para precisar el estatus y las relaciones de los 
diferentes géneros de las especies de vertebrados, es necesario hacer estudios 
sobre comparaciones osteológicas (Flutch et. al,1972) debido a que es la 
estructura que mejor se conserva y resiste los aspectos de descomposición 
(White,1991). Los estudios de la estructura de los huesos son cada vez más 
importantes, especialmente en las ramas de la geología, paleontología, 
arqueología, antropología, y anatomía (White, 1991). Permitiendo comparaciones 
anatómicas que han servido de base para estudios sobre parentesco, 
clasificación, evolución y patologías (Knudsen, 1966). 
En este punto es adecuado considerar que Cajal afirmaba, “lo primero que hay 
que llevar a cabo para realizar una buena investigación, es establecer y 
estandarizar las técnicas a utilizar” (Ramón y Cajal, 2006 ). 
De ahí que los científicos han contribuido con un cierto número de innovaciones y 
de ideas poniendo un mayor énfasis en el trabajo auxiliar al método experimental 
influyendo en la capacidad de hacer herramientas aplicando técnicas establecidas 
y regulares, teniendo en mente los problemas y las necesidades propias de la 
investigación (Gómez,1983). 
Al ir adquiriendo una creciente complejidad, los métodos de investigación y sus 
procedimientos relacionados, también se volvieron más complejos. El desarrollo 
de nuevos planes sistematizados auxilian y optimizan el trabajo experimental en la 
4investigación, creando modelos que permiten predecir el comportamiento de 
algunos fenómenos (Hilderbrand ,1995). 
Desde la antigüedad hasta comienzos del siglo XX, el estudio del esqueleto 
siempre consistió en el desmembramiento de los especímenes y su posterior 
descarnamiento y una limpieza que incluía su desengrasado concluyendo con un 
montaje. 
Fue hasta comienzos del siglo XX cuando se empezó a buscar técnicas 
alternativas que garantizaran que se mantuviera la posición tridimensional del 
esqueleto (Gersenowies, 2000). 
La adquisición de nuevas técnicas o mejoramiento de ellas ha logrado un mayor 
avance en el conocimiento, sobre la organización y función de los organismos, 
dando como resultado, una gran eficiencia y velocidad de la información obtenida 
en los trabajos de investigación, permitiendo la modificación de programas o 
modelos a utilizar (Balbás, 2002). Estos modelos son en principio aproximados, 
pero a medida que progresa el conocimiento de la naturaleza, se refinan y amplían 
(Hilderbrand ,1995). 
Una de estas técnicas emergentes en el estudio del Bauplan es aclarar y colorear 
tejidos, órganos y sistemas incluyendo el esqueleto, tanto de organismos 
completos como de porciones, y es indudablemente de gran valor e importancia 
en los estudios comparativos del esqueleto (Mayorga, 1964). 
La preparación del esqueleto en especímenes puede seguir distintos 
procedimientos; la mayoría de los métodos comprenden remover la carne 
preservando intacto el esqueleto (Simpking,1974). Para grandes vertebrados las 
diferentes técnicas que se tienen para lograr este objetivo son: una sencilla 
disección desollando al organismo retirando piel y músculo del hueso, o bien 
empleando escarabajos (Dermestes vulpinus) para remover la carne del cadáver; 
otra técnica utilizada es la maceración con cal del tejido del cadáver. Una más, es 
enterrar el cadáver en un lugar seguro dejando actuar bajo tierra a los hongos y 
bacterias los cuales removerán la carne del esqueleto (Knudsen, 1966). 
La mayoría de los estudios osteológicos para vertebrados de gran tamaño pueden 
realizarse de manera individual estudiando cada hueso por separado o bien de 
5 
 
manera completa, con todo el esqueleto articulado; si se realiza de manera 
completa, se requiere de técnicas de montaje para el esqueleto, utilizando 
distintos materiales como son alambre, pegamento, laca plástica, y cajas donde se 
pueda montar al espécimen haciéndolo resistente y duradero durante su 
almacenamiento. (Knudsen, 1966). 
El grado de eficiencia o daño al que esta expuesto el esqueleto varía para cada 
una de las técnicas, por ejemplo: cuando se utilizan los fórceps o pinzas, estos 
pueden rayar los huesos, además es muy fácil perder elementos pequeños entre 
el tejido que se va retirando. El uso de químicos para la degradación de tejido es 
extremadamente volátil y la absorción a través de la piel es sumamente peligrosa. 
El someter el material óseo a calor extremo en agua caliente es la técnica que 
causa mayor daño a los huesos y ligamentos, ya que la superficie del hueso se 
vuelve porosa, las suturas comienzan a desarticularse y los dientes tienden a salir 
de los alvéolos (Knudsen,1966). 
El manejo de derméstidos no es recomendable para limpiar organismos pequeños. 
Normalmente en esta técnica, es necesario que el espécimen este completamente 
seco para que los derméstidos primero coman la carne, después ataquen el 
cartílago de las uniones que hay entre los huesos y finalmente el tejido blando; 
pero si la carne está húmeda en el interior, los derméstidos empezaran a comer 
desde el principio la carne junto con el hueso (Simpking, 1974). 
Para preparar un montaje del esqueleto articulado en el que se garanticen la 
resistencia y durabilidad del espécimen muchas veces el uso excesivo de 
pegamento y alambre puede dañar los huesos. El almacenamiento de 
especímenes armados es muy difícil, ya que se requiere de un mantenimiento 
constante. Los huesos guardados individualmente pueden extraviarse o colocarse 
en distintos cajones e inesperadamente ser comidos por algunos animales, y así 
mismo el manejo de todas las piezas por separado hace muy difícil recopilar la 
información del esqueleto completo (Knudsen,1966). 
A través de estos medios comunes se dificulta demasiado el preservar huesos 
pequeños o cartílagos de la acción destructora de los diferentes reactivos, destruir 
un ejemplar valioso o partes del ejemplar bajo tratamiento. Es entonces, que 
6 
 
aparece una novedosa técnica, la técnica de tinción y transparentación, que ha 
demostrado ser útil para el estudio del esqueleto completo de pequeños 
vertebrados sin peligro de dañar el organismo, incluyendo especímenes muy 
delicados como embriones. Además de presentar ventajas como el bajo costo, la 
accesibilidad de los materiales usados y la rapidez con que se obtienen 
preparaciones más claras y precisas (Mayorga 1964). 
Esto se logra, sometiendo el espécimen a la acción de algunas substancias 
digestivas (en el caso de digestión alcalina con KOH y en el caso de digestión 
enzimática con tripsina), permitiendo la observación y el contraste de diversas 
estructuras u órganos, así como organismos completos, que de otra manera no se 
lograrían (Gaviño,1996). 
Esta técnica fue seguida por Davis y Gore (1947), en parte modificada de la 
propuesta por Hollister (1934), continuada por Dingerkus y Uhler (1977), la cual se 
modificó sustituyendo la digestión alcalina por una digestión enzimática. Dentro de 
esta última se incluye la tinción de las estructuras óseas con rojo de Alizarina “S” 
(Dingerkus, 1981). Esta tinción es afín a los depósitos de sales de calcio por lo 
que es absorbida por el hueso y cartílagos calcificados, logrando comprobar las 
distintas etapas de desarrollo basándose en el grado de osificación (Hollister, 
1934). Sin embargo, una de las desventajas que presenta es su fragilidad cuando 
se manipulan. 
 
7 
 
II. ANTECEDENTES 
 
II. I FIJADORES 
 
El conocimiento empírico de las técnicas histológicas puede remontarse a los 
egipcios, con el embalsamamiento de cadáveres y el uso de los fijadores como el 
alcohol etílico para la conservación de los tejidos, sin embargo, se puede decir que 
es a partir del siglo XVI cuando se deja la dependencia escolástica antigua para 
iniciar el método científico moderno (Aguilar et al., 1996). 
Con el advenimiento del microscopio y su empleo en el campo de la biología, se 
abrió un amplio panorama para el estudio y la investigación, y trajo conjuntamente, 
una serie de problemas de difícil solución. Cuando se trataba de hacer estudios 
con cortes de tejidos, animales o vegetales, se apreció que en poco tiempo éstos 
sufrían fenómenos de destrucción. Esta dificultad abrió las puestas a lo que se 
conoce actualmente con el nombre de fijación tisular (Estrada, 1982). 
Robert Boyle (1627-1691), promovió los métodos anatómicos. Afirmó que la 
preservación del cuerpo humano y otros organismos en “espíritu de vino” (como 
entonces conocían al alcohol etílico), con notables facultades balsámicas, resiste 
poderosamente la putrefacción, de partes suaves del cuerpo sin perder su 
consistencia (Cole, 1975). 
Pierre Dionis (1643-1718), usa el ácido tánico en contra del crecimiento de 
hongos. (Arráez, 1997, González y González, 2002) empleado para curtir pieles 
por sus propiedades surfactantes (acción similar a la del jabón o los detergentes) 
por lo que tiene efectos antifúngicos y se usa desde tiempos ancestrales, pues se 
encuentra en el vino tinto y otros alimentos (Torrez, 2000) 
Leeuwenhook en 1714 empleó una solución de alcohol y utilizando la desecación 
espontánea fue la primera forma de fijación (Gaviño, 1996). 
William Hunter (1718-1783), utiliza el alcohol como medio de fijación y 
conservación (Gryglewski, 2002). 
Kart William Sheele (1742-1786), aplicó la glicerina para conservación de 
cadáveres(Arráez, 1997). Scheele descubrió la glicerina en 1779, en los 
8 
 
productos de la saponificación de aceite de oliva. La glicerina posee una 
propiedad solvente peculiar y poderosa, y también es un preservativo excelente y 
sólo el alcohol lo supera, y tiene un uso considerable (Cook, 1869). Su avidez por 
el agua es tan amplia que reduce la humedad de los tejidos a los que se aplica, de 
modo acelerado. La glicerina es un higroscópico poderoso, considerablemente 
antiséptica, mata parásitos y preserva tejidos animales, pero las estructuras 
conservadas en él se tornan blandas (Burck, 1969). 
August Wilhem Von Hofmann (1818-1892), químico alemán, descubre el aldehído 
fórmico, también llamado formol o formalina. El formol y sus derivados desde 1868 
hasta la fecha, con base de la conservación de piezas anatómicas y cadáveres 
completos, y los más usados en las técnicas de conservación y embalsamiento 
(Arraez, 1997). 
Tillant en 1892 y Blum en 1893, señalaron las propiedades del formol como fijador; 
estos procedimientos preservaban los tejidos para su futuro estudio, y modificaban 
su consistencia de manera que los cortes podían prepararse mas fácilmente 
(Estrada, 1982). 
 
II. 2 TINCIÓN DEL ESQUELETO 
 
Un primer apogeo en el uso y la selección de colorantes adecuados se produjo en 
el antiguo Egipto. En aquel entonces, la mayoría de los pigmentos auténticos 
empleados eran inorgánicos. Sin embargo, prendas de vestir de aquella época 
revelan que ya en el año 2,500 a.C. se utilizaban el índigo azul y el rojo alizarina, 
extraído este último de la rubia. Durante siglos, este rojo luminoso, también 
conocido como rojo turco o Rubia tinctorum, fue el único colorante rojo resistente a 
la luz, este colorante era el utilizado para dar su característico color rojo al fez 
turco o a los tapices cazajos (König, 2003). 
En 1567 el médico francés Antonio Mizaldus, utilizando un método antiguo de 
estudio macroscópico de los colorantes, en cuanto el teñido en rojo del tejido óseo 
en proliferación, después de la alimentación de animales con Rubia tinctorum 
(Estrada, 1982). 
9 
 
El desarrollo de la anatomía microscópica avanzó lentamente durante el siglo 
XVIII, el nacimiento de las técnicas de tinción empieza a jugar su trascendente 
papel, aunque de manera muy esporádica y rudimentaria. La primera tinción fue 
hecha por John Belchier (1706-1785) en el tejido óseo y, comprobada por el 
fisiólogo francés Louis Dohamel (1741-1743) afirmando que este colorante era 
fijado por la cal de los huesos. (Aguilar, et.al, 1996) 
En 1868 por primera vez el rojo de alizarina, fue sintetizado, representando el 
primer ejemplo de un trabajo sistematizado en el desarrollo de pigmentos. Graebe 
y Liebermann extrajeron la alizarina, el elemento colorante de la rubia, al 
antroceno presente en el alquitrán de la hulla. La síntesis del colorante de la rubia 
tuvo como consecuencia que en torno al año 1880 la rubia se dejara de cultivar 
prácticamente en todo el mundo (Hollister, 1934). 
 
II. 3 TRANSPARENTACIÓN 
 
Hollister (1934), durante su trabajo en el Departamento de investigación tropical de 
la sociedad de zoología en la Universidad de Nueva York, preparó varias 
soluciones aclaradoras y una tinción para hueso de 300 especímenes entre los 
cuales se encontraban embriones humanos, pequeños mamíferos y embriones de 
serpiente, con la finalidad de facilitar el estudio del esqueleto adaptando a su 
técnica nuevas mejoras con el uso de luz ultra-violeta durante el proceso del 
aclarado de tejidos. 
Mayorga (1964), realizó un estudio anatómico comparativo de la osteología de las 
especies de anfibio Eleutherodatylus portoricencis de la isla de Puerto Rico. 
Empleando un método de transparentación descrito por Davis y Gore (1947) 
sustituyendo KOH por NaOH y coloreando el esqueleto con rojo de Alizarina “S“, 
según la técnica descrita por Hollister (1934). 
Taylor (1967), propuso un método enzimático para aclarar, en el cual se lleva a 
cabo un proceso de digestión del tejido muscular utilizó enzimas pancreáticas que 
remplazaron la maceración alcalina después de teñir con rojo de alizarina “S”. El 
método de Taylor, con una pequeña modificación utilizando azul de alciano para 
10 
 
teñir cartílago (Dingerkus y Uhler,1977) también puede ser un método estándar 
para el aclaramiento de especímenes antes de teñir hueso. 
Dingerkus y Ulher (1977) en la división de ciencias biológicas de Nueva York, 
realizaron un aclarado de tejido utilizando una solución enzimática con tripsina y la 
tinción con azul de alciano para la demostración de cartílago en pequeños 
vertebrados como peces, anfibios, reptiles, aves y mamíferos obteniendo 
resultados confiables. 
Eun-Ho Park y Dong Soonkim (1984) También utilizaron la transparentación en 
embriones, para el estudio de malformaciones osteológicas. 
Chapparad y sus colaboradores (1985), de la universidad de Saint Etienne, 
Francia. Preservaron permanente esqueletos completos con rojo de alizarina “S” 
por aclaración y embebidos en resina poliéster. Posteriormente al procedimiento 
de fijación y tinción. Los especímenes fueron deshidratados de una manera 
gradual en acetona-poliéster. Consecutivamente los especimenes fueron incluidos 
en la resina poliéster. 
Rousseaux (1985), en el colegio Western de Medicina Veterinaria, en el 
departamento de patología veterinaria. Elabora una tinción automatizada de 
cartílago y hueso para el montaje de preparaciones de vertebrados. Usando un 
proceso automático, los especimenes fueron teñidos en azul de alciano por 24 hrs 
y macerados en 3% de hidróxido de potasio. Los especimenes fueron aclarados y 
preservados en glicerina. Obteniendo un total de 600 fetos procesados en menos 
de 5 días. 
Mientras Selby (1987) de la división de biología del laboratorio nacional de 
Tennese, presentó un método rápido de tinción ósea, describiendo dos técnicas 
posibles para roedores de edad y de tamaños mayores. Esto le permitió estudiar 
las malformaciones en el esqueleto de roedores, haciendo observaciones en las 
malformaciones y mutaciones dominantes. 
Harder (1988), del instituto de biología de Alemania. Utilizó sales de cobre para 
tinción del hueso y colágena. Los especimenes o bloques de tejido fueron teñidos 
en fresco o fijados en formalina o alcohol. La tinción comprendió la inmersión del 
11 
 
tejido en sulfato cuproso o cobre clorhídrico por algunas horas. Posteriormente fue 
combinado satisfactoriamente con la técnica de aclarado en glicerina y xileno. 
Song y Parenti (1995). Realizaron la aclaración y tinción de especímenes 
completos de peces para la demostración simultanea de hueso, cartílago y 
nervios. Presentaron un método de aclaración enzimática y tinción de 
especímenes completos de peces para demostrar simultáneamente hueso 
cartílago y nervios. Los nervios fueron teñidos con azul negro o negro de sudán B; 
seguido de tinción con azul de alciano - rojo de alizarina “S” y posteriormente 
aclarados. 
Tomo y sus colaboradores (1997) del departamento de anatomía de Japón y el 
departamento de odontología de Australia. Utilizaron la técnica de 
transparentación para la observación del desarrollo de los cartílagos mandibulares 
en embriones de rata. Describiendo la característica tridimensional en el proceso 
del desarrollo, empleando una doble tinción y aclarado. 
Brown, (1998) de la asociación de profesores de Biología en Kansas. Realizó el 
aclarado y tinción de pequeños vertebrados, para la enseñanza del sistema 
esquelético y la comparación de estructuras homólogas de órganos y sistemas 
siendo útil en la comparación del esqueleto de fetos de diferentes vertebrados. 
Sánchez y colaboradores (1996) de la Universidad Católica de Santa María, 
demostraron el desarrollo óseo de fetos humanos retomando la técnica de 
diafanización de Dawson, modificando algunos pasos en cuanto al uso de xilol 
como disolventede grasas y el carmín alcohólico como colorante del tejido; en 
lugar de acetona y alizarina respectivamente; así mismo, incrementaron la 
concentración de KOH para disminuir el tiempo de transparentación. Se 
emplearon tres fetos humanos de diferentes edades, logrando visualizar el 
desarrollo óseo en forma secuenciada y diferenciando la osificación endocondral 
de la membranosa. 
Young y sus colaboradores (2000),del departamento de toxicología de Kansas, 
elaboraron una manera de preparar hasta 1000 fetos simultáneamente para el 
estudio del desarrollo de toxicidad prenatal donde se llevó a cabo la evaluación del 
desarrollo esquelético fetal. En su artículo describen un método para la tinción de 
12 
 
ambas estructuras, huesos y cartílagos de fetos usando soluciones y procesos en 
una escala industrial. 
Sánchez (2001) en la UNAM. Campus Iztacala, México, realizó la transparentación 
con KOH y rojo de Alizarina “S” de peces pleuronectiformes en su estudio de la 
comparación de las relaciones de similitud entre ocho especies de 
pleuronectiformes mexicanos, analizando el esqueleto postcraneal. 
Menegola y sus colaboradores (2001), del departamento de Biología en Italia 
elaboraron un atlas del esqueleto de rata fetal realizando una doble tinción para 
teñir hueso y cartílago. El esqueleto del feto de rata (rojo de alizarina y azul de 
alciano) es descrito en detalle para obtener un atlas del desarrollo, identificando 
importantes anormalidades en la morfología del esqueleto. 
Green y sus colaboradores (2002), de la escuela de Biología Marina de Australia. 
Realizaron un método rápido y barato para examinar otolitos en larva de peces, la 
técnica fue desarrollada insitu en Amphiprion melanopus, los especímenes fueron 
aclarados y teñidos usando la tinción de plata de Von Kossa método para mostrar 
el calcio. Finalmente se analizaron las variedades de crecimiento. 
 
II. 4 FUNDAMENTOS DE LA TÉCNICA DE TRANSPARENTACIÓN 
 
La primera parte de la técnica consiste en fijar al organismo en una solución de 
formol al 4 %. La fijación tisular consiste en interrumpir rápidamente los procesos 
de autolisis y putrefacción tratando de conservar la arquitectura y composición 
química de la célula o tejido (García, 1993). La mayoría de los fijadores son 
substancias que actúan sobre la porción protéica del espécimen. La acción de los 
fijadores transforma el coloide protoplasmático en geles insolubles e irreversibles, 
es decir, actúan solidificando el protoplasma por medio de coagulación o 
precipitación (entre más denso es un coloide mejor se conserva) (Gaviño, 1996). 
Es útil conocer la velocidad de penetración de un fijador, el grado de 
endurecimiento que provoca en los tejidos y saber si prepara adecuadamente para 
las tinciones que posteriormente se realizarán. Es mayor la de los alcoholes y la 
acetona, pero no preservan tan bien la estructura tisular (García, 1993). 
13 
 
 La fijación al igual que la penetración del fijador, no es instantánea. La mayoría de 
los fijadores no esta siempre en concordancia con su velocidad de penetración: la 
formalina por ejemplo, es un fijador que penetra con relativa rapidez en el tejido y, 
sin embargo, lo fija con cierta lentitud (García, 1993 ). El tejido se puede fijar 
durante un largo periodo (10-24 hrs). El lavado y la deshidratación deben ser 
rápidos (Mercer, 1979). 
La tinción es la combinación química de las moléculas del colorante con las 
moléculas constituyentes de las células, teniendo su aplicación práctica al teñir los 
diferentes componentes celulares y tisulares para facilitar su observación (Aguilar 
et al, 1996). En esta técnica, el tejido se sumerge en una solución acuosa de 
hidróxido de potasio-rojo de alizarina “S” durante 24 hrs. (Hollister,1934). 
El análisis del hueso en vertebrados, muestra que su mayor constituyente es la 
hidroxiapatita de calcio con una pequeña cantidad de carbonato de calcio. Estos 
factores muestran cierta relación concerniente con la afinidad entre el rojo de 
alizarina “S” y hidroxiapatita de calcio del hueso (Hollister, 1934). Las sales de 
calcio absorben la alizarina de acuerdo con la acumulación de minerales en el 
proceso de osificación del organismo y su etapa de desarrollo (Kirwan, 2004). 
La alizarina es soluble en agua y alcohol y es un tinte ácido en solución alcalina y 
vital para huesos (Hollister, 1934). En este proceso, el pH de la solución colorante 
es crítica para asegurar una identificación positiva de las sales cálcicas, y debe 
encontrarse un pH entre 4.1 y 4.3 (García, 1993 ). Esto lleva a la conclusión de 
que el pH bajo (ácido) favorece la coloración básica y que el pH alcalino (elevado) 
favorece la acción de los colorantes ácidos (Gaviño, 1996). 
En presencia de metales iónicos, como el calcio en los sitios de localización se 
cubrirán y estarán rodeados de un precipitado de color rojo-violeta que permite la 
visibilidad de las piezas óseas después de diafanizar los músculos. El tiempo más 
efectivo de inmersión en la solución colorante, esta determinado enteramente por 
su reacción bioquímica y el tamaño del organismo (Aguilar et al., 1996). 
Teñido el organismo se lava y se coloca en una nueva solución de hidróxido de 
potasio al 4% hasta su completa digestión (Barthelemy,1975). El proceso se ve 
influenciado por la cantidad de musculatura del organismo y depende de la talla y 
14 
 
del desarrollo de los mismos. Así como de su contenido de grasas. (Lee y 
Sinnhuber, 1972; Farkas et al., 1977). 
El contenido de grasa del músculo de los peces varía no solamente en relación 
con las familias; también con las estaciones del año. Los contenidos de grasa y 
agua en los tejidos de un pez, tomado como individuo, varían inversamente entre 
una y otra; y, por otra parte, el contenido de grasa varía en el mismo pez (Werner, 
1987). 
Los peces de agua dulce también muestran diferencias según el grupo en su 
contenido relativo de grasa y, generalmente, ésta tiene características químicas 
diferentes a las que presenta la grasa de las especies marinas, incluso, la cantidad 
de ácidos grasos en los peces dulceacuícolas es mayor que en los peces marinos 
(Gruger et al.,1964; Ackman,1967). La principal reserva energética en peces 
corresponde a lípidos, fundamentalmente triacilglicerídos, los cuales son 
consumidos para actividades de alta demanda energética, tales como la 
reproducción, crecimiento y migración, o en actividades de rutinas durante 
períodos de escasez de recursos como reserva en el invierno (Werner, 1987). 
La acumulación de lípidos depende directamente de la adquisición de alimento. 
Durante los períodos de alta ingesta los lípidos pueden ser almacenados en el 
tejido somático e hígado, así como en los mesenterios de los intestinos (Werner, 
1987). 
Una vez digerido, se complementa la técnica con la transparentación por medio de 
su aclarado a través de un tren de glicerina (Simpking, 1974). Posteriormente el 
material obtenido se almacena en glicerina al 100 % (Mayorga, 1964). 
Sin embargo, pese a que la técnica de transparentación se realice por digestión 
alcalina (KOH) o de manera enzimática (tripsina) produce preparaciones, muy 
delicadas y endebles, las cuales fácilmente son deterioradas por la manipulación 
cotidiana (Gersenowies, 2000). Para dar una mayor consistencia se han probado 
al menos dos estrategias diferentes, la inclusión y plastinación que son casos 
particulares de conservación que permiten inmovilizar todas las estructuras de 
forma definitiva y establecer con ello su protección. La primera consiste en el 
encapsulado de los especímenes transparentados en resinas que posee la 
15 
 
desventaja de no tener una buena manipulación del espécimen para observar 
estructuras finas, por lo que solo es de utilidad en museografía (Gersenowies, 
2000). La otra estrategia consiste en plastinar con resinas poliéster el espécimen 
transparentado, pero aun,los resultados no han podido ser definitivos debido a 
que organismos mucho más delicados como son fetos y juveniles durante el 
desarrollo de esta técnica el tejido adquiere una consistencia quebradiza (Kirwan, 
2004). Por ello es necesario buscar una técnica de transparentación en donde el 
tejido blando posee una mayor consistencia permitiendo que los especímenes 
transparentados sean más resistentes a la manipulación cotidiana y a tratamientos 
posteriores. 
Como alternativa a la técnica de tinción y transparentación, en este trabajo se 
propone realizar algunas modificaciones en el proceso de digestión alcalina, se 
sustituirá el agua con diferentes concentraciones de alcohol etílico para preparar la 
solución digestora de KOH. Los alcoholes pueden considerarse como derivados 
del agua en los que uno o dos átomos de hidrógeno han sido remplazados por 
grupos alquilo (Vollhardt y Shore, 1999). Son compuestos con fórmula general 
(ROH), todos los alcoholes contienen el grupo hidroxilo (OH), el grupo puede ser 
primario, secundario o terciario (Morrison,1990). Sirven como disolventes y 
también como importantes intermediarios de reacción, son miscibles en agua y 
pueden formar puentes de hidrógeno consiguiendo tener un punto de ebullición 
alto (Burgoyne,1983), también estabiliza la membrana celular permitiendo que el 
tejido se endurezca. 
 
II. 5 ORGANISMO MODELO PARA EL ESTUDIO 
 
Los peces óseos cuentan en la actualidad con más de 20,000 especies 
(Young,1985). La investigación para generar más conocimiento de la vida de los 
peces ha sido el resultado del natural deseo por saber más sobre la naturaleza y 
de nuestra necesidad de recabar más información relacionada con las especies 
que nos sirven para el comercio. Sin embargo, la mayor parte de los estudios de 
estos organismos se han centrado en la biometría, pero la osteología puede 
16 
 
aportar nuevos elementos para la resolución de problemas taxonómicos 
(Valdéz,1997). 
El género Chirostoma es endémico del territorio mexicano, actualmente constituido 
por 18 especies, todas dulceacuícolas, las cuales se distribuyen de manera natural 
en el Altiplano Mexicano (Sánchez et. al 2006). La especie Chirostoma 
humboltianum es una especie carnívora y básicamente ingiere zooplancton (ver 
figura 1), es de gran importancia cultural y económica, al ser utilizada durante 
décadas como alimento por las poblaciones localizadas alrededor de los lagos 
(Blancas, 2004); tenía una amplia distribución, pues se le encontraba al oriente 
desde los lagos interiores del valle de México como Xochimilco, Chimalhuacán, 
Texcoco y Tláhuac (Soto,1953), la cuenca del río Lerma y hacia el oeste, en las 
lagunas de Juanacatlán (Jal. ) Santa María y San Pedro Lagunillas (Nay.). En la 
actualidad se encuentran en la laguna de Zacapu (Mich.); Trinidad Fabela, 
Huapango, Danxhó, Tiacaque y Tepuxtepec (todas en el Estado de México). En 
1988 Alaye, menciona la existencia de Chirostoma humboltianum en Pátzcuaro, 
producto quizá de una introducción involuntaria como sucedió en los embalses el 
Bosque (Mich.),y Villa Victoria (Méx), ubicados en la cuenca del río Balsas (Rosas, 
1970, Bonilla, 1982; Chávez- Toledo, 1987). 
 
 
 
Figura 1. Chirostoma humboldtianum 
 
De acuerdo a los criterios de Lagler et al (1977) y Barbour (1973), la clasificación 
taxonómica de Chirostoma humboltianum es la siguiente: 
 
PHYLUM CHORDATA 
 SUBPHYLUM VERTEBRATA 
17 
 
 SUPERCLASE PISCES 
 CLASE OSTEOICHTHYES 
 SUBCLASE ACTINOPTERYGII 
 SUPERORDEN TELEOSTEI 
 ORDEN PERCIFORMES 
 SUBORDEN MUGILOIDEI 
 FAMILIA Atherinidae 
 GÉNERO Chirostoma 
 ESPECIE C. humboldtianum 
 
Algunas de las características que posee este organismo fueron adecuadas para 
llevar a cabo este trabajo, como primer dato tenemos que es una especie 
endémica del territorio mexicano ( Paulo et al., 2000 ), de la cual se puede decir 
que tiene una amplia distribución en el país (Soto, 1953). Su reproducción se da 
casi todo el año, por lo tanto, se puede encontrar en diferentes épocas y conseguir 
en cualquier centro comercial. 
Es una especie muy comercial y factible su cultivo, por ende su costo es 
económico (Barbour, 1973). Es una especie pequeña, que cumple con las 
características de los vertebrados, poseyendo un esqueleto complejo además de 
ser un organismo que puede manipularse fácilmente. 
Esto nos lleva a decir que de acuerdo a su fácil manejo, se puede medir de 
manera indirecta la resistencia del tejido a través del ángulo de deformación del 
cuerpo. 
 
18 
 
III. JUSTIFICACIÓN 
 
Los investigadores relacionados con la anatomía animal, continuamente se 
enfrenta a la decisión de modificar las técnicas que emplea para lograr la 
obtención de muestras de mejor calidad para la realización de su trabajo. De modo 
que puede extender las posibilidades para nuevas propuestas metodológicas para 
el estudio del grupo de interés. Se debe tomar en cuenta que la mayoría de los 
organismos terminan siendo manipulados constantemente por el investigador y 
almacenados por largo tiempo, procesos que llevan a su deterioro. 
En el caso de la transparentación, el modificar la técnica para obtener 
preparaciones más resistentes y manejables será un auxiliar para llevar a cabo un 
estudio osteológico más completo. 
Al ofrecer una mejor consistencia y composición, puede ayudar a preservarlos 
más tiempo, sin que ocurran deformaciones en su morfología, y así promover una 
más apropiada observación y facilidad de manejo. 
Esto conlleva a la propuesta del presente trabajo, donde se pretendió realizar 
modificaciones de la digestión alcalina utilizando alcohol etílico como vehículo que 
permita una mejor preservación de la membrana y así obtener preparaciones con 
especímenes con mejor firmeza, ya que la propiedad del alcohol como fijador 
brinda un efecto endurecedor sobre el tejido dándole más resistencia, y de este 
modo mejorar y facilitar el trabajo del investigador. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
19 
 
IV. HIPÓTESIS 
El presente trabajo considera la siguiente hipótesis: 
Sí, el alcohol permite una preservación más adecuada de las membranas 
celulares y al mismo tiempo permite realizar una digestión alcalina de los 
elementos intracelulares, entonces la modificación de la técnica de 
transparentación usando una digestión alcalina en soluciones alcohólicas, 
permitirá obtener especímenes transparentados más resistentes al manejo 
cotidiano. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
V. OBJETIVOS 
 
• Obtener una serie de especímenes transparentados con el método de 
Hollister (1934). 
• Estandarizar la técnica de transparentación sustituyendo la digestión 
alcalina en agua con la digestión alcalina en un medio alcohólico. 
• Comparar la deformación en los cuerpos de Chirostoma humboldtianum 
por la técnica de transparentación clásica de Hollister con la técnica de 
transparentación modificada con una digestión alcalina en medio alcohólico. 
• Proponer una técnica alternativa para la transparentación de Chirostoma 
humboldtianum. 
 
 
21 
 
VI. MÉTODO 
VI. 1 RUTA CRÍTICA 
 
La ruta crítica seguida se muestra a continuación: 
 
 
 
Obtención de los 
organismos 
Fijación con 
formol 
1 
I TRANSPARENTACIÓN I 
Grupo control 
Hollister 1934 
j 
Hidróxido de potasio a14% 
Rojo de alilarina S 0.01 
Hidróxido de potasio al 4% 
1 
Tren de glicerina 20-100 % 
L [ Alcoholes 
1 
Hidróxido de potasio a14% 
Rojo de alilarina S 0.01 
Hidróxido de potasio a14% + 
Alcohol en concentradones20. 40. 60 Y 80 " 
1 
, I __ --'l--' ____ --, ~e ,Uce'; •• 20- 100 % 
Medlcióndelosánguloscon ~ 
transportador 
'F-O-Io-,-r-'f-I'-'-d":~-Io-.-o-r-,-.n-I-sm-o-. ' S 
mostrando los ángulos 
Análisis de varianla y 
Estadístico comparativo 
1 
ANAlISIS DE RESULTADOS 
Y 
CONCLUSIONES 
22 
 
VI. 2 DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO. 
 
Se obtuvieron 106 peces del género Chirostoma humboldtianum (charal) en un 
centro de distribución comercial, tomando en cuenta tanto hembras como machos 
entre los rangos de medida 8 cm a 13.6 cm de largo (los organismos provienen de 
la laguna de Zacapu, Michoacán, información proporcionada por los 
distribuidores). Posteriormente se mantuvieron en hielo durante el transporte al 
Laboratorio de Anatomía Animal Comparada en la Unidad de Morfofisiología de la 
Universidad Nacional Autónoma de México Campus Iztacala; donde se obtuvieron 
los datos merísticos (ver anexo 1). Cada uno de los organismos fue etiquetado. 
Los organismos fueron descamados tratando que la piel quedara totalmente 
limpia. Así mismo se identificaron los especímenes con las claves de Castro-
Aguirre (1978) y Álvarez del Villar (1970). Para evitar la autodigestión enzimática y 
la descomposición por microorganismos, los organismos fueron fijados en formol 
al 4% durante 5 días. 
Una vez fijados, se lavaron con abundante agua corriente y se dejaron remojando 
por 24 hrs para eliminar el exceso de formol. Posteriormente, se colocaron en un 
recipiente, donde se sumergieron durante 48 hrs en una solución de rojo de 
alizarina “S” al 0.01 % y KOH al 4%, hasta que el esqueleto de los especímenes 
estuviera bien teñido. Esto para que los elementos óseos se tornaran de un color 
rojo-púrpura. Nuevamente los especímenes fueron lavados en abundante agua 
corriente. 
Una vez que los organismos estuvieron teñidos y lavados, los 106 peces se 
separaron al azar en grupos, los cuales se colocaron cada grupo en frascos de ½ 
litro; posteriormente se asignaron al azar cada uno de los siguientes tratamientos. 
 
• Control : se ocupo 1.5 litros de solución de KOH al 4% 
• KOH al 4% en alcohol al 80%: se ocupó 1.5 litros de solución compuesta 
por 300 ml de KOH al 20% + 1.2 litro de alcohol etílico. 
23 
 
• KOH al 4% en alcohol al 60%: se ocupó 1.5 litros de solución compuesta 
por 300 ml de KOH al 20% + 300 ml de agua destilada+ 900 ml de alcohol 
etílico. 
• KOH al 4% en alcohol al 40%: se ocupó 1.5 litros de solución compuesta 
por 300 ml de KOH al 20% + 600 ml de agua destilada+ 600 ml de alcohol 
etílico. 
• KOH al 4% en alcohol al 20%: se ocupó 1.5 litros de solución compuesta 
por 300 ml de KOH al 20% + 900 ml de agua destilada+ 300 ml de alcohol 
etílico. 
 
Los frascos del grupo control se sometieron de acuerdo a la técnica de 
transparentación de Hollister (1934). Se observaron continuamente anotando los 
cambios ocurridos durante el proceso de transparentación, es decir hasta que el 
esqueleto quedara completamente visible a contra luz definiéndose sus 
elementos. 
Así mismo se hizo el seguimiento de la transparentación en las diferentes 
porciones del cuerpo según como se fueron aclarando. Para esto, el cuerpo del 
pez se dividió de la siguiente manera (Figura 2): 
 
• Región cefálica: la cabeza empieza en la parte anterior del morro y termina 
en la parte posterior del opérculo. 
• Región torácica: el tronco comienza en el extremo de las aberturas 
branquiales y acaba en el ano. 
• Región caudal: inicia al término de la aleta anal y en la mayoría de los 
peces termina en una aleta caudal, la aparte musculosa recibe el nombre 
del pedúnculo caudal. 
24 
 
 
 
Figura 2. Esquema del pez por regiones. 
 
Cuando los organismos se encontraron completamente traslúcidos, se colocaron a 
un tren de glicerina en las siguientes concentraciones 
20%,40%,60%,80%,90%,100%, permaneciendo una semana en cada solución. 
Terminado el proceso de transparentación los organismos se almacenaron en 
glicerina al 100%. 
Los organismos fueron fotografiados con una cámara digital para el análisis 
posterior. Después se toman las medidas de deformación, para lo cual se utilizó el 
ángulo que formaba con respecto a la horizontal cuando se sostiene el espécimen 
por el pedúnculo caudal, las medidas obtenidas se ocuparon para conseguir un 
estimado de la turgencia del tejido y de este modo determina cuál es la 
concentración adecuada para estandarizar la técnica de transparentación 
alcohólica. 
Para obtener los ángulos de curvatura del pez, se consiguió una pieza de formaica 
de 30 x 30 cm. que tuviera una superficie lisa. En un extremo de la tabla se 
midieron 20 cm, tomando la medida desde el borde hacia el centro y trazando una 
línea horizontal. Así mismo se marco la mitad de esta línea con un pequeño punto, 
25 
 
quedando como referencia para colocar uno a uno los organismos sujetos de 
costado a la altura de la aleta anal. De esta forma el cuerpo por gravedad caerá de 
manera natural formando un arco. La parte final del arco, corresponde al extremo 
del morro se marcó y se trazó una línea desde este punto hasta la línea horizontal 
formando el ángulo de interés. 
Para facilitar la medición y marcar con mayor rapidez los ángulos, se colocó por 
detrás de la línea horizontal un transportador de modo que el punto de referencia 
de la línea coincidiera con la medida de referencia del transportador, 
posteriormente, en un extremo del transportador se amarró un hilo para delinear el 
ángulo y medirlo directamente en el transportador (Figura 3). 
Con los datos obtenidos de los ángulos de las distintas concentraciones y con las 
del grupo control, se llevaron acabo las comparaciones realizando un análisis de 
varianza unífactorial junto con el procedimiento Post Hoc de Tukey, para ello se 
utilizó el programa “Statistica” ver 6. 
 
 
Figura 3. Fotografía de la manera en que se medió el ángulo de deformación de 
Chirostoma h. 
 
 
 
26 
 
VII. RESULTADOS 
VII. 1 CUALITATIVOS 
Durante el proceso de digestión se observó que, tanto en el grupo control como en 
los grupos experimentales, el tiempo en que se transparentaban los organismos 
de mayor y menor talla eran diferente, resultando que los de menor talla se 
transparentaban más rápido que los de mayor talla. Otra característica que 
presentaron, fue la cantidad de grasa de los organismos que variaba de acuerdo a 
los meses del año en que se realizó la compra, por lo que se tuvo que cambiar las 
soluciones a todos los tratamientos una vez durante el proceso. La 
transparentación también varió de acuerdo a las estaciones del año siendo en 
invierno más lento y en verano más rápido. 
Se observó que las primeras porciones del cuerpo que comenzaron a 
trasparentarse fueron las aletas (pectoral, pélvica, dorsal y caudal), 
posteriormente, se formó una zona clara alrededor del pez. Después, se continúo 
transparentando la porción correspondiente a la región cefálica y al finalizar esta 
porción, se comenzó a transparentar la región caudal, después de 2 a 3 días se 
transparentó la porción correspondiente a la región torácica. 
Los resultados obtenidos del grupo control por la técnica de Hollister (1934) fueron 
los siguientes; los organismos se transparentaron sin presentar algún problema 
tanto en la digestión alcalina por KOH como en el tren de glicerina. Presentan un 
buen aspecto, sin daño visible de los tejidos o esqueleto, pero al tacto tienen una 
gran fragilidad y flacidez que los hace poco manipulables, esto se puede apreciar 
en la figura 4. Estos organismos se transparentaron en pocos días. 
 
Figura 4. Organismo control 
27 
 
 
Los resultados de la técnica estandarizada para las distintas concentraciones de 
alcohol son las siguientes: 
Los organismos en solución de alcohol al 80% y KOH al 4% fueron los más 
afectados, ya que algunos días después de estar inmersos en la solución, 
mostraron deterioro en los tejidos, aproximadamenteen dos semanas los radios 
de las aletas comenzaron a perder su forma, seguidos de desintegración de los 
especímenes y al poco tiempo, tanto el tejido muscular como los huesos quedaron 
como sedimento en la solución. 
Los organismos en solución de alcohol al 60% y KOH al 4%, a los 38 días 
presentaron las aletas completamente transparentadas y al igual que la porción de 
la cabeza, además, se había formado una línea traslucida que rodeaba el cuerpo 
del pez. Posteriormente, al día 41 de digestión, los organismos, se trasparentaron 
completamente y fueron trasladados a glicerina para completar el proceso de 
transparentación, concluyó a los 51 días. Los de mayor talla terminaron el 
procedimiento alrededor del día 67. En estos organismos no se presentó ninguna 
ruptura en la piel pero al pasarlos por glicerina cambió el estado de turgencia del 
tejido presentando una mayor rigidez. La rigidez que presenta en el cuerpo estos 
organismos no es muy notoria, si observamos la figura 5 el ángulo que forma el 
cuerpo es muy parecido al ángulo que forma el grupo control. 
 
Figura 5. Organismo en solución al 60% 
 
28 
 
Los organismos en solución de alcohol al 40% y KOH al 4%, se transparentaron a 
los días 45 y terminaron su proceso en glicerina alrededor del día 54. Los de 
mayor talla terminaron todo el proceso alrededor del día 73. Se observó que por lo 
menos el 2% de los especímenes presentaron ruptura en la piel. El 1% de ellos lo 
presentaron dorsalmente en la parte donde termina la segunda aleta dorsal y el 
resto presentó la ruptura a un costado por debajo de la segunda aleta dorsal. Otro 
punto a mencionar es que en estos organismos la rigidez del cuerpo fue más 
evidente a diferencia de los organismos al 60% como se puede observar en la 
figura 6. 
 
Figura 6. Organismo en solución al 40% 
 
Los organismos en solución de alcohol al 20% y KOH al 4%, comenzaron a ser 
traslucidos a los 48 días, después fueron trasladados al tren de glicerina 
finalizando el proceso al día 56. Los de mayor talla finalizaron el proceso al día 
59. En esta concentración se encontró que el 1% de los organismos presentaron 
ruptura en la piel. En cuanto a la consistencia del tejido, como se puede apreciar 
en la figura 6, podremos notar que el ángulo de deformación del cuerpo es menor, 
por lo tanto, el cuerpo del organismo se encuentra más rígido en comparación con 
los anteriores tratamientos. 
El grado de endurecimiento de todos los organismos se mantuvo aún después de 
pasarlos por el tren de glicerina. 
 
29 
 
 
Figura 7. Organismo en solución al 20% 
 
VII. 2 CUANTITATIVOS 
Los datos obtenidos de los ángulos se pueden observar en la tabla 5, junto con la 
talla y el número del organismo. Entre los organismos de mayor ángulo (poca 
rigidez) se encuentra el grupo control, con los rangos 35-60º y la concentración 
alcohólica de 60% con un rango de 26-63º; le siguen los organismos de la 
concentración alcohólica al 40% que se ubica entre los rangos 10-30º y por último, 
los organismos que presentaron mayor rigidez en el cuerpo y por lo tanto un 
ángulo menor son los de la solución al 20% entre los rangos 9-26º. 
Al aplicar el análisis de Varianza se obtuvo un valor de F=55.030 con P=0.001, el 
cual nos dan evidencias suficientes para afirmar que los ángulos entre los 
diferentes tratamientos son significativamente diferentes. 
Esto solo muestra que existen diferencias significativas, pero no indica los 
diferentes grados de deformación que produce cada tratamiento, para lo que se 
realizó una prueba Honesta de Tukey (tabla 2) en donde se observa lo siguiente: 
 En este podemos observar que la solución de alcohol al 20% y KOH al 4% es la 
que menor deformación presenta (Media 20%= 17.133º contra Media 40%= 26.350º, 
Media 60%=42.696º, y Media control= 47.056º); siendo estadísticamente significativa 
esta diferencia (P≤ 0.001671). La deformación intermedia se observa en la 
solución de alcohol al 40% y KOH al 4% (Media 20%= 17.133º < Media 40% = 26.35º 
< (Media 60% = 42.696º y Media control = 47.056º)) siendo estadísticamente 
significativa esta diferencia (P≤ 0.001671). 
30 
 
El grupo control y el experimental (solución de alcohol al 60% y KOH al 4%) son 
los que mayor deformación presentaron (Media control= 47.056º y Media 
60%=42.696º) no existiendo diferencias significativas entre ellos (P= 0.428731). El 
análisis se replicó utilizando la medida en radianes (tablas 3 y 4), pero arrojó los 
mismos resultados que el análisis realizado con grados. 
 
Tabla 1.Resultado del ANOVA del ángulo medido en grados. 
 
 
 
 
Tabla 2. Resultado de la prueba Honesta de Tukey del ángulo medido en grados. 
 
 Tratamiento 
Control 
47.05 
soluc 20% 
17.13 
soluc 40% 
26.33 
soluc 60 % 
42.69 
1 soluc 60% 0.428731 0.000139 0.000139 0 
2 soluc 40% 0.000139 0.001671 0 
3 soluc 20% 0.000139 0 
4 Control 0 
 
 
Tabla 3. Resultado de la ANOVA del ángulo medido en radianes. 
 
 SC Gl CM F p 
Tratamiento 4.52442 3 1.50814 55.030 0.001 
Error 2.79538 102 0.02741 
 
 
 
Tabla 4. Resultado de la prueba Honesta de Tukey del ángulo medido en 
radianes. 
 
 Tratamiento 
Control 
0.82128 
soluc 20% 
0.29903 
soluc 40% 
0.45990 
soluc 60 % 
0.74519 
1 soluc. 60% 0.428731 0.000139 0.000139 0 
2 soluc 40% 0.000139 0.001671 0 
3 soluc 20% 0.000139 0 
4 Control 0 
 
 SC Gl CM F p 
Tratamiento 14852.7 3 4950.9 55.030 0.001 
Error 9176.7 102 90.0 
31 
 
Resultados numéricos de las 
deformaciones. Tabla 5. 
 
Resultados numéricos de las 
deformaciones. Tabla 6. 
 
Ángulos de deformación en grados 
Contr
ol 
soluc 
20% 
soluc 
40% 
soluc 60 % 
51 
51 
59 
53 
38 
51 
46.5 
52 
59 
37 
47.5 
39 
55 
40 
39 
35 
42 
52 
17 
14 
12 
14 
15 
16 
15 
10 
15 
9 
18 
12 
19 
31 
27 
18 
15 
23 
20 
18 
26 
18 
11.5 
10 
23 
13 
19 
15.5 
21 
19 
17.5 
16.5 
16.5 
24 
17 
34.5 
10 
27.5 
32 
21 
18 
39 
36 
44 
24 
32 
32 
27 
48 
64 
18 
23 
15 
26 
19 
20 
30 
24 
19 
16 
26 
42 
48 
50 
37 
37 
33.5 
55 
63 
66 
51 
46 
11 
55 
51 
45 
53 
41 
40 
35 
31 
28 
40 
39 
39 
39 
48 
46 
 
Ángulos de deformación en radianes 
Control soluc 20% soluc 40% soluc 60 
% 
0.8901 
0.8901 
1.030 
0.9425 
0.6632 
0.8901 
0.8115 
0.9076 
1.030 
0.6458 
0.8290 
0.6807 
0.9599 
0.6981 
0.6807 
0.6109 
0.7330 
0.9076 
0.2967 
0.2444 
0.2094 
0.2444 
0.2618 
0.2792 
0.2618 
0.1745 
0.2618 
0.1571 
0.3142 
0.2094 
0.3316 
0.5410 
0.4712 
0.3142 
0.2618 
0.4014 
0.3491 
0.3142 
0.4538 
0.3142 
0.2007 
0.1745 
0.4014 
0.2269 
0.3316 
0.2705 
0.3665 
0.3316 
0.3054 
0.2879 
0.2879 
0.4189 
0.2967 
0.6021 
0.1745 
0.4799 
0.5585 
0.3665 
0.3142 
0.6807 
0.6283 
0.7679 
0.4189 
0.5585 
0.5585 
0.4712 
0.8378 
1.117 
0.3142 
0.4014 
0.2618 
0.4538 
0.3316 
0.3491 
0.5236 
0.4189 
0.3316 
0.2792 
0.4538 
0.7330 
0.8378 
0.8727 
0.6458 
0.6458 
0.5760 
0.9599 
1.100 
1.152 
0.8901 
0.8028 
0.1920 
0.9599 
0.8901 
0.7854 
0.9250 
0.7156 
0.6981 
0.6109 
0.5410 
0.4887 
0.6981 
0.6807 
0.6807 
0.6807 
0.8378 
0.8028 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
32 
 
 
VIII. ANÁLISIS DE RESULTADOS 
 
La manera en que el cuerpo se fue transparentando corresponde a la forma en 
cómo está distribuida su musculatura, así tenemos que las aletas fueron las 
primeras partes del cuerpo que se transparentaron ya que están formadas por 
expansiones membranosas o pliegues epiteliales sostenidos por unas varillas 
esqueléticas o radios. Se continuó con la región cefálica ya que la densidad de su 
musculatura es menor y están relacionados con las mandíbulas, branquias y con 
el aparato opercular. Después se transparentó la porción musculosa de la cola lo 
que corresponde al pedúnculo caudal, la cual consta de musculatura axial que se 
extiende desde la porción occipital de la cabeza. La última porción en 
transparentarse fue la región del tronco ya queaquí se encuentra la mayor parte 
de masa muscular somática de los peces, la musculatura axial. 
La mayoría de las soluciones atraviesa la membrana de la célula de manera 
pasiva (difusión pasiva) dependiendo de la diferencia de concentración del medio 
externo e interno (ley de Fick ). 
Las distintas concentraciones de los medios en los que se encontraron los 
organismos y cómo se comportaron dentro de ellas nos pueden indicar el tipo de 
solución y sus efectos; por ejemplo los organismos que se encontraron en 
soluciones al 80%, los pliegues que pudimos observar al comienzo de la digestión 
se debieron a que se encontraba en una solución hipertónica. Es decir, que afuera 
de la célula las concentraciones de solutos disueltos son mayores y la 
concentración de agua es menor, lo que provocó una deshidratación drástica que 
junto con la digestión provocó la destrucción de los especímenes de la solución de 
80% de alcohol y 4% KOH. 
En el caso de los organismos que presentaron rupturas en la piel, en la parte 
dorsal o a un costado, posiblemente se debió a que la tonicidad de la solución en 
la que se encontraban era hipotónica. Otra de las posibilidades es que el tejido 
haya estado deteriorado y no hayan resistido la entrada de solución a la célula ya 
que la presencia o ausencia de uniones estrechas y glucocalix influencía el como 
33 
 
las células responderán a las fluctuaciones osmóticas del medio, que es lo 
observado en la digestión con la solución del 40% de alcohol y 4% KOH. 
Así tenemos que los organismos sin problemas se encontraban en una solución 
isotónica, el movimiento de agua hacia fuera está balanceado con el movimiento 
de agua hacia dentro. Este desequilibrio osmótico es la causa de que la célula 
desarrolle una gran presión hidrostática interna, o presión de turgencia, que 
empuje hacia la pared celular, exactamente como la cámara de una llanta que 
empuja contra la cubierta. La presión de turgencia aumenta justo en el punto 
donde la célula esta en equilibrio osmótico, impidiendo la entrada neta de agua a 
pesar del desequilibrio salino proporcionando la mayor parte de la rigidez, esto es 
lo observado en la solución del 20% de alcohol y 4% de KOH). 
La turgencia celular que proporcionaba la rigidez fue medida en los organismos de 
manera indirecta dando el ángulo de conformación que presentaba el 
cuerpo. El ángulo que se formó, depende de la rigidez del cuerpo de cada 
organismo obtenida a través del tratamiento a que fueron sometidos. 
De los tratamientos, la mejor combinación de alcohol-KOH, fue la solución al 20%, 
siendo significativo con un valor de 55.030 de probabilidad en la prueba de “F”, y 
en la misma combinación para prueba de Tukey con un valor de 0.001671. Por lo 
tanto es el mejor sustituto entre la soluciones de alcohol para la técnica de 
transparentación, ocasionando una menor deformación; mientras que la solución 
al 40% causo una deformación intermedia y la solución al 60%, causa un grado 
mayor de deformación. 
De acuerdo a lo anterior podemos afirmar que una técnica alternativa sería: 
• Fijar organismos en formol al 4%. 
• Quitar el exceso de formol. 
• Sumergir en solución de KOH al 4% y 0.01de rojo de alizarina “S”. 
• Retirar el exceso de la solución de tinción. 
• Colocar los organismos en solución de alcohol al 20% y KOH al 4%. 
• Terminada la digestión, colocarlos en un tren de glicerina 
• Por último, se almacenan en glicerina al 100% 
Siendo esta la propuesta concreta del presente trabajo. 
34 
 
IX. CONCLUSIÓN 
En el proceso de tinción el tiempo requerido fue ideal (24 hrs), no solo dependía 
del colorante, también del espécimen por teñir, que puede variar desde varios 
minutos hasta varios días. El colorante penetró rápidamente los tejidos tiñendo el 
esqueleto de rojo-púrpura sin faltar ningún de los elementos óseos disponibles. 
La técnica de Hollister es un método ya estandarizado para la obtención de 
especímenes transparentados, pero con características poco viables para su 
manejo constante, dado que se provoca mucho estrés en el organismo (sometido 
a desecación) en su estudio anatómico. 
Se logró implementar la técnica de trasparentación de Hollister combinada con las 
distintas concentraciones de alcohol obteniendo buenos resultados en la 
transparentación de peces del género Chirostoma humboldtianum. El alcohol 
por lo visto no afectó la digestión alcalina, pero sí la consistencia del tejido ya que 
tuvo diferentes grados de deformación comprobados por los distintos ángulos 
obtenidos de cada concentración, por lo tanto, la técnica resultante de este estudio 
permitió establecer cuál concentración de alcohol es la más apropiada para la 
transparentación de organismos pequeños, siendo esta la combinación de alcohol 
al 20 % y KOH al 4 %. 
El grupo control no tuvo una consistencia adecuada por lo que la resistencia del 
tejido no fue suficiente, por tanto que los organismos se presentaban con una 
mayor flexibilidad en el cuerpo y una dificultad para poder ser manipulados. A 
diferencia de los organismos en soluciones alcohólicas donde la consistencia del 
tejido fue notoria presentando una resistencia a todas las manipulaciones 
siguientes sin deformarse. 
Después de realizada una variedad de soluciones alcohólicas y comparadas entre 
sí con respecto a la turgencia, se puede decir que la solución más aceptada para 
la realización de esta técnica implementada con alcoholes se encuentra en la 
solución al 20% es la que presenta una mejor preservación y menor deformación 
de los tejidos de Chirostoma humboldtianum. 
Por lo que se propone la técnica presentada en la página 22 como una alternativa 
a la técnica de Hollister. 
35 
 
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42 
 
ANEXO 
 
DATOS MERÍSTICOS 
 
 
 
 
A) Longitud total 
B) Longitud furcal 
C) Longitud patrón 
D) Altura mínima 
E) Altura máxima 
F) Longitud cefálica 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
D 
A 
43 
 
DATOS MERÍSTICOS 
TABLA DE RESULTADOS 
 
 
 
 
Tabla de resultados de las medidas 
merísticas de Chirostoma 
humboldtianum; A) Longitud total, 
B) Longitud furcal, C) Longitud 
patrón, D) Altura mínima, E) Altura 
máxima y F) Longitud cefálica. 
	Portada 
	Índice
	Resumen
	I. Introducción
	II. Antecedentes
	III. Justificación
	IV. Hipótesis
	V. Objetivos
	VI. Método
	VII. Resultados
	VIII. Análisis de Resultados
	IX. Conclusión
	Bibliografía
	Anexos