Inhibidores-de-tirosinasa-de-origen-natural-y-semisinteticos

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL 
AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
 
 
 
 
 INHIBIDORES DE TIROSINASA DE ORIGEN 
NATURAL Y SEMISINTÉTICOS. 
 
 
 
 
TESIS 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICO DE ALIMENTOS 
PRESENTA 
CARLOS ISRAEL XINASTLE CASTILLO 
 MÉXICO, D.F. 2009 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
ii 
 
JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: Federico Alfredo García Jiménez 
VOCAL: Profesor: María Reyna Gómez Gómez 
SECRETARIO: Profesor: José Serafín Calderón Pardo 
1er. SUPLENTE: Profesor: Héctor García Ortega 
2° SUPLENTE: Profesor: Luz del Carmen Castellanos Román 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
ÁREA DE INVESTIGACIÓN DE PRODUCTOS NATURALES, LABORATORIO 7-C, 
INSTITUTO DE QUÍMICA, LABORATORIO DE BIOQUÍMICA BÁSICA DE LA 
FACULTAD DE QUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO. 
 
 
ASESOR DEL TEMA: JOSÉ SERAFÍN CALDERÓN PARDO 
 
 
SUPERVISOR TÉCNICO : LUZ DEL CARMEN CASTELLANOS ROMÁN 
 
 
SUSTENTANTE (S): CARLOS ISRAEL XINASTLE CASTILLO 
 
iii 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Este trabajo se realizo en el laboratorio 7 del edificio “C” 
del Instituto de Química y en el laboratorio de Bioquímica Básica 
de la Facultad de Química de la Universidad Nacional Autónoma de México, 
con el apoyo económico de una beca otorgada por 
el Sistema Nacional de Investigadores (SNI) 
iv 
 
 
 
 
 
Dedicatorias y Agradecimientos. 
 
 
Y al final de cualquier camino, es adecuado y enriquecedor darse el tiempo para voltear hacia 
atrás y contemplar lo recorrido, tomar un suspiro y emprender de nuevo el andar, es egoísta no 
considerar la ayuda de las personas que nos rodean, pensar que no necesitamos de nadie y que en 
nuestros éxitos no intervino nadie mas que nosotros. De alguno u otro modo somos y nos 
debemos en buena parte a las personas que influyen con su forma particular pero significativa en 
nuestra vida, aquellas con las que nos hemos encontrado y a las que nos acompañan a lo largo del 
camino, es por ello inevitable no considerar y recurrir a ellas para seguir aquí. Así pues, con este 
paso les dedico mis éxitos y les ofrezco un verdadero agradecimiento a todos ustedes que 
estuvieron, están y estarán en mi camino. 
 
Académicos, maestros, compañeros, amigos, a mis padres y hermanos, 
a todos ustedes, mi gran familia, gracias. 
POR MI RAZA HABLARA EL ESPIRITU. 
 
 
v 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INHIBIDORES DE TIROSINASA 
DE ORIGEN NATURAL Y 
SEMISINTÉTICOS 
 
 
 
ÍNDICE 
vi 
 
 
 Página
 
CAPITULO I. INTRODUCCIÓN............................................................................... 1 
 Objetivos..................................................................................................... 3 
 Justificación................................................................................................ 3 
 Hipótesis..................................................................................................... 3 
 
 
CAPITULO II. ANTECEDENTES............................................................................. 4 
 2.1. Reacciones de oscurecimiento en alimentos........................................ 5 
 2.2. Melanogénesis..................................................................................... 5 
 2.3. Prevención del oscurecimiento enzimático.......................................... 7 
 2.3.1. Controlando la cantidad de sustrato en el medio............ 7 
 2.3.2. Reduciendo los productos de oxidación de la tirosinasa 8 
 2.3.3. Alteración de la estructura terciaria de la proteína......... 8 
 2.3.4. Uso de inhibidores.......................................................... 9 
 2.3.4.1. Inhibidores de origen sintético................... 9 
 2.3.4.2. Inhibidores de fuentes naturales................ 10 
 2.4. Tirosinasa de Agaricus bisporus.......................................................... 11 
 2.4.1. Estructura y dominios..................................................... 12 
 2.4.2. Mecanismo de acción de la tirosinasa............................. 14 
 2.4.3. Sustratos de la tirosinasa................................................. 16 
 2.4.4. Ubicación y función........................................................ 18 
 2.5. Flavonoides.......................................................................................... 19 
 2.5.1. Quercetina....................................................................... 20 
 2.5.1.1. Inhibición competitiva de la quercetina..... 22 
 2.6. Ensayos enzimáticos............................................................................ 24 
 2.6.1. Caracterización de la actividad enzimática de tirosinasa 24 
 2.6.2. Efecto cinético y caracterización del tipo de inhibición. 27 
 2.6.3. Determinación del IC50................................................... 27 
 2.7. Modificación química de los inhibidores............................................. 29 
vii 
 
 2.7.1. Reacción con yoduro de metilo en medio básico........... 29 
 2.7.2. Reacción con diazometano............................................. 30 
 2.7.3. Reacción con anhídrido acético...................................... 31 
 
 
CAPITULO III. DESARROLLO EXPERIMENTAL................................................. 32 
 3.1. Diagrama general de investigación...................................................... 33 
 3.2. Equipo, materiales y reactivos............................................................. 34 
 3.2.1. Aislamiento, purificación y reacciones de metabolitos 
secundarios................................................................................ 34 
 3.2.2. Ensayos enzimáticos....................................................... 35 
 3.3. Quercetina (3,3',4',5,7-pentahidroxiflavona)....................................... 37 
 3.3.1. RMN............................................................................... 37 
 3.4. Obtención de los productos semisintéticos.......................................... 37 
 3.4.1. Pentaacetato de quercetina.............................................. 37 
 3.4.1.1. Reacción con anhídrido acético............... 37 
 3.4.1.2. RMN........................................................ 37 
 3.4.2. Ayanina (3, 7, 4’- trimetoxiquercetina).......................... 38 
 3.4.2.1. Reacción con diazometano...................... 38 
 3.4.2.2. RMN........................................................ 38 
 3.4.3. 5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona....................... 38 
 3.4.3.1. Reacción con yoduro de metilo en 
medios básico........................................................ 38 
 3.4.3.2. RMN........................................................ 39 
 3.5. Aislamiento y purificación de flavonoides de origen natura............... 39 
 3.5.1. 4’-metilpenduletina........................................................ 39 
 3.5.1.1. Extracción y purificación......................... 39 
 3.5.1.2. RMN........................................................ 40 
 3.5.2. Santina (5,7 dihidroxi-3,6,4´-trimetoxi flavona)............ 40 
 3.5.2.1. Extracción y purificación......................... 40 
 3.5.2.2. RMN........................................................40 
 3.5.2.3. EMIE........................................................ 41 
viii 
 
 3.6. Actividad enzimática........................................................................... 42 
 3.6.1. Medida de la actividad enzimática de tirosinasa............ 42 
 3.6.2. Efecto cinético y tipo de inhibición................................ 43 
 3.6.3. Determinación del IC50................................................... 44 
 
 
CAPITULO IV. DISCUSIÓN DE RESULTADOS.................................................... 46 
 4.1. Medida de la actividad enzimática de la tirosinasa.............................. 47 
 4.1.1. Valores de Km y Vmax de la enzima tirosinasa................ 49 
 4.2. Efecto cinético y tipo de inhibición..................................................... 50 
 4.2.1. Quercetina....................................................................... 50 
 4.2.2. Pentaacetato de quercetina.............................................. 52 
 4.2.3. Ayanina........................................................................... 53 
 4.2.4. 5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona....................... 54 
 4.2.5. 4’-metilpenduletina........................................................ 56 
 4.2.6. Santina............................................................................ 58 
 4.3. Determinación del IC50........................................................................ 59 
 
 
CAPITULO V. CONCLUSIONES............................................................................. 63 
 
 
ESPECTROS............................................................................................................... 66 
 
CAPITULO VI. BIBLIOGRAFÍA.............................................................................. 74 
 
ix 
 
Índice de figuras, graficas y tablas 
Capitulo II: Antecedentes 
• Esquema 1 Vía de la melanogénesis (Seo, Sung-Yum,. et al. 2003) 6 
• Figura 1 Estructura de algunos inhibidores naturales y sintéticos de tirosinasa. 11
• Figura 2. Estructura tridimensional de la tirosinasa aislada de Agaricus bisporus 12
• Figura 3. Sitio activo de la tirosinasa.( Donghyun, Kim., et al., 2006) 13
• Esquema 2. Mecanismo de acción de la tirosinasa (Peñalver, Maria J., et al., 2005) 15
• Esquema 3. Reacciones de oxidación de la tirosinasa para los diferentes tipos de 
sustrato (Seo, Sung-Yum., et al. 2003) 17
• Figura 4. Estructura básica de algunos flavonoides. (Martínez M. Alejandro., 2005) 19
• Figura 5. Estructura de la quercetina 20
• Figura 6. Inhibición de la quercetina por desplazamiento del sustrato 21
• Figura 7. Inhibición de la quercetina por quelatación de cobre 22
• Figura 8. Inhibición Competitiva 23
• Figura 9. Inhibición no Competitiva 23
• Figura 10. Inhibición Acompetitiva 24
• Figura 11. Determinación del IC50 28
• Figura 12. Mecanismo de reacción de la metilación de fenoles con yoduro de metilo 29
• Figura 13. Obtención de diazometano y mecanismo de reacción de metilación de 
fenoles 30
• Figura 14. Mecanismo de reacción de acetilación de fenoles 31
 
 
x 
 
 
Capitulo III: Desarrollo experimental 
• Esquema 3. Posible patrón de fragmentación de la santina. 41
 
 
Capitulo IV: Discusión de resultados 
• Gráfica. 1 Efecto de la concentración de sustrato (L-DOPA) en la producción de 
DOPAcromo en la enzima tirosinasa. 47
• Gráfica. 2 Efecto de la concentración de sustrato (L-DOPA) en la producción de 
DOPAcromo por la enzima tirosinasa. 48
• Gráfica. 3 Representación gráfica de la ecuación de Lineweaver – Burk dela actividad 
de la enzima tirosinasa bajo las condiciones de trabajo. 49
• Tabla 1. Valores de Km y Vmax para la tirosinasa bajo las condiciones de trabajo. 50
• Gráfica 4. Actividad de la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en presencia de 0.05 
mM y 0.1 mM de quercetina. 51
• Tabla 2. Valores de Km y Vmax para la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en 
presencia de dos concentraciones de quercetina. 50
• Gráfica 5. Actividad de la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en presencia de 0.05, 
0.1 y 0.2 mM de pentaacetato de quercetina. 52
• Tabla 3. Valores de Km y Vmax para la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en 
presencia de tres concentraciones de pentaacetato de quercetina. 53
• Gráfica 6. Actividad de la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en presencia de 0.15, 
0.2 y 0.25 mM de 5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona. 55
xi 
 
• Tabla 4. Valores de Km y Vmax para la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en 
presencia de cinco concentraciones de 5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona. 54
• Gráfica 7. Actividad de la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en presencia de 0.1 y 
0.15 mM de 4’-metilpenduletina. 57
• Tabla 5. Valores de Km y Vmax para la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en 
presencia de dos concentraciones de 4’-metilpenduletina. 56
• Gráfica 8. Actividad de la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en presencia de 0.05, 
0.1, 0.2 y 0.3 mM de santina. 58
• Tabla 6. Valores de Km y Vmax para la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en 
presencia de cuatro concentraciones de santina. 59
• Gráfica 9. Disminución de la actividad enzimática de la tirosinasa en función de la 
concentración del los diferentes inhibidores. 60
• Tabla 7. Comportamiento de cada inhibidor sobre la actividad de la tirosinasa. 61
 
Índice de espectros 
• Espectro no. 1. RMN1H. Quercetina (3,3',4',5,7-pentahidroxiflavona) 75
• Espectro no. 2. RMN1H. Pentaacetato de quercetina 76
• Espectro no. 3. RMN1H. Ayanina (3, 7, 4’- trimetoxiflavona) 77
• Espectro no. 4. RMN1H. 5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona 78
• Espectro no. 5. RMN1H. 4’-metilpenduletina 79
• Espectro no. 6. RMN1H. Santina (5,7 dihidroxi-3,6,4´-trimetoxi flavona) 80
• Espectro no. 7. EMIE. Santina (5,7 dihidroxi-3,6,4´-trimetoxi flavona) 81
 
1 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INHIBIDORES DE TIROSINASA 
DE ORIGEN NATURAL Y 
SEMISINTÉTICOS 
 
 
 
CAPITULO I: INTRODUCCIÓN 
2 
 
La enzima tirosinasa es una enzima altamente distribuida en la escala filogenética, en 
vertebrados da inicio al proceso de pigmentación en piel, cabello y coroides en los ojos. En 
humanos juega un papel crucial en la protección contra la fotocarcinogénesis en la piel, se le ha 
asociado a diversos eventos que suceden en el cerebro, como en su formación y su intervención 
en algunas enfermedades como el alzheimer. Se piensa que en plantas y hongos cuando ocurre un 
ataque bacteriano y hay un daño el tejido, la tirosinasa actúa como protección, interviene también 
en la formación de esporas y en la diferenciación reproductiva en hongos. En hortalizas, frutas y 
champiñones es causante del indeseable oscurecimiento enzimático post cosecha; así como en 
algunos crustáceos en la etapa post mortem y en insectos interviene en el proceso de muda del 
exoesqueleto. 
La enzima tirosinasa, gracias al grupo prostético de cobre, cataliza dos tipos de reacciones 
subsecuentes en presencia de oxígeno molecular: La primera es la orto hidroxilación de sustratos 
mono fenólicos a o-difenoles y la segunda es la oxidación de éstos o-difenoles a o-quinonas. Las 
restantes fases de la secuencia de reacción (melanogénesis) constan de oxidaciones no 
enzimáticas y finalmente la polimerización a pigmentos melánicos de color rojo, café y hasta 
negro. 
Las plantas de la familia de las compuestas generalmente son ricas en compuestos con algún 
efecto inhibitorio de la tirosinasa, estos compuestos se pueden dividir en dos subgrupos, 
aldehídos y ácidos carboxílicos y polifenoles, estos últimos son los mas abundantes, la mayoría 
de ellos son flavonoides y poseen una alta capacidad de inhibición de la tirosinasa. Se ha 
observado que tanto los grupos funcionales así como la posición en las que éstos se encuentren en 
la molécula, pueden favorecer o disminuir su interacción con la enzima, esto juegaun papel 
importante si se trata de compuestos con una posible actividad inhibitoria de tirosinasa. 
 
3 
 
Objetivos. 
 
Determinar los parámetros cinéticos aparentes (Km, Vmax) de la tirosinasa en presencia de algunos 
inhibidores de origen natural y semisintéticos, así como determinar el IC50 para cada uno de ellos. 
Objetivos específicos. 
• Aislar y purificar los compuestos de origen natural con posible actividad inhibitoria 
de la tirosinasa mediante técnicas cromatográficas. 
• Obtener derivados semisintéticos de la quercetina mediante reacciones químicas. 
• Determinar la actividad enzimática de la tirosinasa utilizando L-DOPA como 
sustrato específico, midiendo la formación de DOPAcromo mediante técnicas 
espectrofotométricas. 
• Determinar la actividad enzimática de la tirosinasa utilizando L-DOPA como 
sustrato específico, en presencia de los compuestos de origen natural y semisintéticos. 
• Obtener el valor de IC50 de los compuestos de origen natural y semisintéticos y 
determinar el tipo de inhibición que presentan cada uno de ellos. 
Justificación. 
En el presente estudio se pretende aislar algunos compuestos de plantas de la familia de las 
compuestas y obtener algunos derivados semisintéticos de la quercetina con el propósito de 
determinar su actividad inhibitoria de la tirosinasa. 
 
Hipótesis. 
Debido a la fuerte actividad inhibitoria que presenta la quercetina en la actividad de la tirosinasa, 
compuestos con estructura similar, naturales o semisintéticos, presentarán una actividad 
inhibitoria mayor, menor o semejante al de la quercetina. 
4 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INHIBIDORES DE TIROSINASA 
DE ORIGEN NATURAL Y 
SEMISINTÉTICOS 
 
 
 
CAPITULO II: ANTECEDENTES 
5 
 
2.1 Reacciones de oscurecimiento en alimentos. 
En los alimentos se llevan a cabo varias reacciones que causan su oscurecimiento o 
pardeamiento, básicamente provocados por reacciones de Maillard, reacciones de 
caramelización, la oxidación del ácido ascórbico y el oscurecimiento enzimático, este último es 
prácticamente el único que es mediado en sus primeras etapas por una enzima, la tirosinasa 
también conocida como polifenoloxidasa (PPO), fenolasa, catecolasa y/o creolasa, aunque en 
algunos casos también en la oxidación de ácido ascórbico es mediado por otras enzimas 
(Fennema, Owen R., 1993). 
En frutas como la manzana, el plátano, las peras, el melocotón, el albaricoque y el aguacate; en 
tubérculos como la papa; en champiñones y hasta en algunos crustáceos como el cangrejo (Kubo, 
I., 1997); la acción de golpes durante el transporte o el almacenamiento , la congelación, la 
senescencia (en productos vegetales) y algunas enfermedades dañan a los tejidos y por tanto a las 
células, desencadenando una serie de reacciones enzimáticas donde participa la tirosinasa, que 
resultan en la formación de melaninas (melanogénesis) dando como resultado colores y aromas 
indeseables, la perdida estética del alimento y la reducción en la calidad nutritiva por destrucción 
de los nutrientes. (Pardo, A., et al., 2001) 
 
2.2 Melanogénesis. 
La formación de melaninas (Esquema 1) comienza con la acción sucesiva de dos reacciones 
catalizadas ambas por la tirosinasa, la primera en llevarse a cabo es la o-hidroxilación de 
sustratos monofenólicos a o-difenoles (actividad monofenolasa) seguida de la oxidación de estos 
o-difenoles a o-quinonas (actividad difenolasa), usando oxígeno molecular en ambos casos. 
Cuando se utiliza L-tirosina como sustrato, el primer producto formado a partir de la actividad 
monofenolasa se trata de L-DOPA, el segundo producto debido a la actividad difenolasa es la 
6 
 
DOPAquinona, ésta al ser inestable, inmediatamente es transformada por reacciones no 
enzimáticas a un intermediario relativamente mas estable, el DOPAcromo, éste evoluciona hasta 
melaninas las cuales se pueden polimerizar entre si o reaccionar con aminoácidos y péptidos para 
resultar en pigmentos cafés, rojos o negros. (Madani,W., et al., 1999) 
Esquema 1. Vía de la melanogénesis (Seo, Sung-Yum,. et al. 2003) 
7 
 
 2.3 Prevención del oscurecimiento enzimático. 
A pesar de que la tirosina en los seres vivos cumple con cierta función para el desarrollo del 
organismo, en la industria de conservación alimentaria su actividad no es muy deseable, pues es 
el catalizador de las reacciones de oscurecimiento y por lo tanto del deterioro en los alimentos, 
debido a lo cual la investigación para evitar la vía de la melanogénesis ha sido muy estudiada, 
incluso no sólo en la área de alimentos, si no también en la de cosméticos llegando a desarrollar 
medicinas relacionadas con la hiperpigmentación (Kubo. I., Kinst-Hori, Ikubo., 1998). Se han 
desarrollado diferentes maneras para poder evitar la formación de melaninas, la mayoría de estos 
métodos se han basado en afectar directa o indirectamente la actividad de la tirosinasa. 
 
 
2.3.1 Controlando la cantidad de sustratos en el medio. 
Ambas actividades catalizadas por la tirosinasa requieren de un ambiente en presencia de 
oxígeno molecular, una de las opciones para evitar la acción de la tirosinasa es eliminar este 
oxígeno por completo del medio lo cual resulta muy difícil, en la industria de alimentos esto se 
puede lograr en productos envasados o empacados, en los cuales se llega a manipular la presencia 
de oxígeno en el alimento. Los fenoles son otros de los sustratos de la tirosinasa, debido a que 
regular su presencia en los alimentos es poco probable, no es una buena medida para la 
prevención del oscurecimiento enzimático, sin embargo una medida alterna es evitar daños en los 
tejidos durante su transporte o almacenamiento (Ceftel, Jean – Claude., Chaftel, Henri., 1992) 
 
 
 
 
8 
 
2.3.2 Reduciendo los productos de oxidación de la tirosinasa. 
Se ha propuesto la adición de compuestos con propiedades reductoras al medio con la intención 
de retardar el oscurecimiento enzimático. Cuando la actividad difenolasa se lleva a cabo, los 
productos de reacción constan de o-quinonas, los compuestos reductores hacen que estas 
quinonas se reduzcan a sus correspondientes fenoles obteniendo así de nuevo los sustratos 
monofenólicos sin la formación de melaninas, esto retrasa el oscurecimiento enzimático pero solo 
temporalmente pues al agotarse el agente reductor la vía de la melanogénesis sigue su curso 
normal. El compuesto mas utilizados con este fin es el ácido ascórbico. (Ceftel, Jean – Claude., 
Chaftel, Henri., 1992) 
 
 
2.3.3 Alteración de la estructura terciaria de la proteína. 
Cuando una enzima se encuentra bajo condiciones desfavorables de temperatura, pH o alguna 
sustancia (detergentes), se crea un cambio conformacional en su estructura terciaria quitándole su 
actividad catalítica (desnaturalización); el efecto de la acidez y de la temperatura son factores con 
los que se logra evitar el oscurecimiento enzimático en los alimentos; la pasteurización, el 
escaldado, la acidificación del medio (con ácido cítrico, ácido málico o ácido fosfórico) son 
algunas de las técnicas utilizadas, sin embargo estos tratamientos tienen sus desventajas, pues 
también modifican las características organolépticas e incluso nutritivas del propio alimento. 
(Fennema, Owen R., 1993) 
 
 
 
 
9 
 
2.3.4 Uso de Inhibidores. 
Un inhibidor enzimático, es cualquier molécula que interacciona con la enzima provocando la 
disminución de su actividad, esta unión puede ser reversible o irreversible, normalmente, los 
inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima de forma covalente y modifican su estructura 
química a nivel de residuos esenciales de los aminoácidos necesarios para la actividad enzimática 
es decir el sitio activo, mientras que los inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no 
covalente (por puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y enlaces iónicos), dando lugar a 
diferentes tipos de inhibiciones, dependiendode si el inhibidor se une a la enzima, al complejo 
enzima-sustrato o a ambos (Murray, Robert K., et al., 2001). En el caso de la tirosinasa existen 
diferentes inhibidores y de distintos tipos conocidos hasta ahora, los cuales se pueden clasificar 
dependiendo de su naturaleza. 
 
 
2.3.4.1 Inhibidores de origen sintético. 
Un gran número de compuestos químicos como el peróxido de hidrógeno, la hidroxilamina, 
dimetil sulfuro, algunos tioles, y ácidos carboxílicos aromáticos han sido reportados por tener una 
actividad de inhibición de la tirosinasa. Los ácidos dihidroxibenzoicos (DBA), la L-mimosina, el 
ácido kójico, la tropolona y los resorcinoles sustituidos en la posición 4 (oxiresveratrol) son otro 
tipo de inhibidores (Figura 1) encontrados y estudiados recientemente. (Seo, Sung-Yum., et al., 
2003). 
 
 
 
 
10 
 
 
2.3.4.2 Inhibidores de fuentes naturales. 
Las plantas son ricas en sustancias que tiene un efecto inhibitorio de la tirosinasa (Figura 1), 
generalmente para su estudio se han dividido en dos subgrupos; 
Los polifenoles: son el grupo de compuestos mas abundantes en las plantas, la mayoría de ellos 
son flavonoides y presentan una alta capacidad inhibitoria, el kaempferol, la quercetina y la 
kurarinona, son algunos de éstos. En la mayoría de éstos se propone que su inhibición es como 
agente quelante. 
Los aldehídos y sus derivados los ácidos carboxílicos: como lo son el anisaldehído, el 
cuminaldehído, el ácido cinámico, el ácido cumárico y el ácido benzoico entre otros. La 
inhibición de éstos se a propuesto por la formación de una base de Schiff con el grupo amino 
primario de la enzima. 
Algunos hongos también producen sustancias que inhiben la actividad tirosinasa, Aspergillus 
niger produce una proteína llamada metalotioneina que es un fuerte agente quelante de cobre, 
mientras que A. bisporus produce agaritina que en estudios in vitro funciona como un inhibidor 
no competitivo con L-DOPA y como un inhibidor competitivo con L-tirosina. (Seo, Sung-Yum., 
et al., 2003). 
11 
 
O
O
OH
OH
HO
OH
Kaempferol
O
O
OH
OH
HO
OH
OH
Quercetina
O
OOMe
HO
OHHO
Kurarinona
CH
O
O
CH3
Anisaldehido
CH
O
Cuminaldehido
OH
O
Ácido cinámico
C
Ácido cumárico
HO
O
OH
C
O
Ácido benzoico
OH
H2N OH
Hidroxilamina
HOOC
OH
Ácidos dihidroxibenzoicos
OH
N
HO
O
NH2
O
OH
L-Mimosina
O
O
OH
HO
Ácido Kojico
O
OH
Tropolona
H3C
S
CH3
Dimetil sulfuroHO
OH
OH
OH
Oxiresveratol
Figura 1. Estructura de algunos inhibidores naturales y sintéticos de tirosinasa. 
 
2.4 Tirosinasa de Agaricus bisporus. 
La enzima tirosinasa (Número E.C 1.14.18.1), se encuentra en algunos alimentos como frutos, 
tubérculos y algunos crustáceos, se destaca su presencia en los champiñones, la especie mas 
consumida y representativa se trata de Agaricus bisporus y ha llegado a ser la mas estudiada de 
12 
 
esta familia, es por esta razón que muchos de los estudios recientes de la actividad de la tirosinasa 
se han basado en la enzima aislada a partir de esta especie de champiñón. En plantas superiores, 
así como en hongos la tirosinasa se encuentra en varias isoformas: como enzima inmadura, como 
enzima madura en su forma latente y como enzima activa. (Seo, Sung-Yum., et al., 2003). 
 
Figura 2. Estructura tridimensional de la tirosinasa aislada de Agaricus bisporus 
 
2.4.1 Estructura y dominios. 
La tirosinasa aislada de Agaricus bisporus (Figura 2) está constituida como un heterotetrámero 
compuesto por dos subunidades ligeras “L” (12 ± 1 kDa) y dos subunidades pesadas “H” (42± 1 
kDa) con una masa molecular aproximada de 120 kDa. Consta de tres dominios, uno de ellos el 
dominio central, contiene dos átomos de cobre ligados (llamados generalmente CuA y CuB), en el 
se encuentran seis residuos de histidina que son los que ligan a los dos átomos de cobre (tres 
13 
 
residuos de histidina por cada átomo de cobre) y conforman una parte del sitio activo (Figura 3) 
de la enzima. Adicionalmente en otro dominio de la enzima, dos residuos de cisteína forman un 
puente disulfuro que además de darle estabilidad a la enzima, juegan un papel importante en la 
modulación de la actividad enzimática por algunos inhibidores (Seo, Sung-Yum., et al., 2003). 
 
Figura 3. Sitio activo de la tirosinasa.(Kim, Donghyun., et al., 2006) 
 
El sitio activo consiste básicamente en dos átomos de cobre que pueden existir en tres diferentes 
estados de oxidación: 
Deoxi-tirosinasa: es la forma reducida de la enzima con Cu+ - Cu+ 
Met-tirosinasa, es la forma oxidada, contiene Cu2+ - Cu2+, 
Oxi-tirosinasa, es la forma oxidada con un peróxido Cu2+ - O2 – Cu2+ 
Estos complejos de cobre muestran alta actividad catalítica sobre sustratos fenólicos con grupos 
donadores de electrones en la cadena lateral del anillo. 
 
14 
 
 2.4.2 Mecanismo de acción de la tirosinasa. 
La acción catalítica de la tirosinasa es posible debido a una pequeña proporción de oxi-tirosinasa 
(2 a 30%) presente en la enzima (Peñalver, M. J., et al., 2005). La catálisis (Esquema 2) comienza 
precisamente cuando esta proporción de enzima en su forma “oxi” (Eox) interactúa con un 
monofenol (M), el alto poder nucleofílico del oxígeno en el grupo hidroxilo del sustrato fenólico 
puede favorecer la formación de puentes de hidrógeno entre el protón del fenol y el nitrógeno 
desprotonado de un residuo de histidina EoxM0 (el residuo de histidina se localiza en el sitio 
activo pero no en el centro binuclear de cobre), un ataque nucleofílico al hidroxilo fenólico por el 
cobre del centro activo, da lugar a la forma EoxM1, subsecuentemente se da lugar a un ataque 
electrofílico esta vez del peróxido unido el cobre a la posición “orto” del anillo, produciendo 
EmD3, desde este intermediario el complejo enzima-sustrato puede rearreglarse liberando un o-
difenol (D) y a la enzima como Em ó se puede formar EmD2 el cual puede oxidar el ortodifenol 
(D) a una o-quinona (Q) y liberar a la enzima en su forma Ed. Cuando se llega a formar Em este 
puede re-ligar al o-difenol (D) liberado regresando al estado EmD2 y generando Ed y una o-
quinona (Q), el estado Ed tiene una afinidad por O2 regenerando el estado Eox, éste además de 
oxidar a M (regenerando el ciclo catalítico) también puede actuar sobre un o-difenol (D) 
oxidándolo a una o-quinona (Q) y formar de nuevo el estado Em. Durante el transcurso de la 
reacción al presentarse el estado Em, éste puede formar un complejo sin salida EmM1 (Dead-end), 
cuando reacciona con un monofenol (M), este complejo sin salida provoca un periodo largo en la 
actividad monofenolasa (Espin, J. C., Varón, Ramón., 2000). 
Cinéticamente el paso limitante en la actividad de la tirosinasa es el ataque nucleofílico del cobre 
al hidroxilo del fenol, ya que su velocidad de reacción es mas baja que la del ataque electrofílico 
(Espin, J. C., Varón, Ramón., 2000). 
 
15 
 
 
Esquema 2. Mecanismo de acción de la tirosinasa (Peñalver, M. J., et al., 2005) 
 
" 
8 H O r , o 
N.....y'*".9 ~J ..... N 
N - "-r e..., • • 
¡¡ 
'" P' Vi. sin salida 
N"I ...... i ,N "Dead-end" 
N_Yu_!(cij. 
• • , 
E n> '\\1 
" " Q ~ HO OH D • N, y .. , .. /~ 
/' 
N- U_
9
_Cu• 
~ 
, ,o 
Actividad 
Oxidas. 
" 
~~ + 
00 
" 
, . , 
·: 011)0 
" 
N" .. + 3~ 
oj" , '\, , . , 
" Q" 
¡ ~, 
N~ .. , . t "" N- U_r CG. 
. 
. , , 
Actividad 
Hidroxjl ... 
O''iro' Ed Ot oxi·TiroslnUl 
'" " , Q ... . H .... • ~~.I ~ + N-ru_b-"C .... • • 00 
Oxi·Tirosinul E", " 
~ ,oq 
N, .. .. 1.I~ 
N·~U_9·C". . , , 
t. 
• n .. y 
'0 
16 
 
2.4.3 Sustratos de la tirosinasa. 
La tirosinasa usa como sustratos para los dos tipos de reacciones que cataliza (o-hidroxilación y 
oxidación) además del oxígeno molecular, una gama de sustancias fenólicas como lo son los 
monofenoles (p-cresol y tirosina), difenoles (el catecol, L-DOPA, D-DOPA, catequinas y ácido 
clorogénico) y trihidroxifenoles, sin embargo presenta una mayor afinidadpor los 
dihidroxifenoles (Seo, Sun-Yum., et al., 2003). Es interesante mencionar que la enzima presenta 
esteroespecificidad entre los enantiómeros tipo “L” y “D”, los valores de Km revelan una mayor 
afinidad por los enantiómeros tipo “L” (menor Km) que para los enantiómeros tipo “D” (Espin, J. 
C. et al., 1998). Por otro lado se ha visto que la propiedad de afinidad (Km) y el poder catalítico 
(Vmax / Km) de la tirosinasa, se incrementa con la reducción en el tamaño de la cadena lateral en el 
anillo aromático de los substratos (Seo, Sun-Yum., et al., 2003). Algunos autores (Peñalvert, M. 
J., et al., 2002) han clasificado a los sustratos de la tirosinasa según el tipo de quinona que 
produce, pudiendo diferenciar tres tipos: 
A) Muy estables a través de la reacción; el 4-t-butilfenol es un ejemplo de este tipo (Esquema 
3, Figura A). 
B) Inestables por ciclización; las o-quinonas obtenidas a partir de este tipo de sustratos se ven 
sometidas a un ataque intramolecular, por la cadena lateral al anillo de benceno formando leuco-
compuestos que pueden ser oxidados por otras o-quinonas a un amino-cromo (como el 
DOPAcromo) y regenerando una molécula de o-difenol (Esquema 3, Figura B). Un ejemplo de 
este sustrato es la L-tirosina. 
C) Inestables por hidroxilación; se trata de aquellos sustratos en las que sus respectivas o-
quinonas sufren un ataque al anillo por el agua, formando un compuesto trihidroxilado el cual 
reacciona con una molécula de o-quinona regenerando un o-difenol y produciendo una p-quinona 
(Esquema 3, Figura C), un ejemplo de este tipo de sustrato es el p-cresol. 
17 
 
 
Esquema 3. Reacciones de oxidación de la tirosinasa para los diferentes tipos de sustrato 
(Seo, Sung-Yum., et al. 2003) 
4-t-Butilcatecol 4 -t -B util-0-b eru:oqumona 
Fi¡un B 
Tirosma 
o-DOP Aquinona 
~-
00 " 
¡ 
~-
00 " 
DOPAcromo LeucoDOPAcromo 
Fi¡ura e 
»CHJ -"-'-0":". -,-;" • pOlJ 
p -Cre~ol 4 -rnetil-o -benzoquin.,na 
18 
 
En el hongo Agaricus bisporus los principales sustratos endógenos que se encuentran son la L-
tirosina, la L-Dihidroxifenilalanina (L-DOPA), el p-aminofenol y sus productos de condensación 
con glutamato como el gama-glutaminil-4-hidroxibenceno (GBH) (Pardo, A., et al., 2001). 
 
 
2.4.4 Ubicación y función. 
Generalmente cuando la célula se encuentra intacta, esta enzima y sus sustratos fenólicos se 
encuentran en diferentes compartimentos celulares, de tal forma que no entran en contacto entre 
sí; sin embargo, cuando las células resultan dañadas, los fenoles son liberados al citoplasma y 
bajo la presencia de oxígeno molecular y la acción de la tirosinasa, los fenoles son transformados 
en melaninas. En plantas superiores la tirosinasa se encuentra unida a la membrana subcelular 
(membrana tilacoidal de los cloroplastos), en hongos como Agaricus bisporus se encuentra en el 
citosol (Marqués, Laurence., et al., 1995), en animales superiores está confinada a la piel, el 
cabello, las corneas, aunque puede presentarse en tejidos internos como el cerebro. 
En los seres vivos la tirosinasa cumple con una determinada función; en humanos juega un papel 
crucial en la protección contra la fotocarcinogénesis en la piel (Seo, Sung-Yum., et al., 2003), se 
le ha asociado a diversos eventos que suceden en el cerebro, como en su formación y en algunas 
enfermedades (Chen, Qing-Xi and Kubo, I., 2002); en plantas así como en hongos se piensa que 
sirven como protección contra ataques bacteriales después de un daño en el tejidos, en la 
formación de esporas y en la diferenciación reproductiva en hongos (Seo, Sung-Yum., et al., 
2003), en insectos interviene en el proceso de muda del exoesqueleto (Kubo, I., 1997). 
 
 
 
19 
 
2.5 Flavonoides. 
Los flavonoides son compuestos orgánicos sintetizados por las plantas como metabolitos 
secundarios, es decir, como compuestos que no tienen una influencia directa en el crecimiento o 
reproducción de la planta. Actualmente mas de 4000 estructuras del tipo flavonoide han sido 
identificadas en plantas (Kim, Donghyun., et al., 2006). Estructuralmente se trata de una familia 
de moléculas de bajo peso molecular, con estructura de fenilbenzopironas, están basadas en un 
núcleo de tres anillos; dos anillos de tipo benceno unidos a través de un anillo heterocíclico de 
pirano en medio. Por su estructura se pueden clasificar en diferentes tipos: chalconas, flavonas, 
flavonoles, flavanonas, flavanonoles, antocianidinas, catequinas, epicatequinas, auronas, 
isoflavonoides, pterocarpanos, rotenoides, etc (Figura 4). 
O O
O O
OH
O
OH
O
O
OH
O
O O
O
O
O
Chalconas Flavonas (+) - Catequinas (-) - Epicatequinas
Flavonoles Flavanonas Auronas Isoflavonas
O
O
Flavanonoles
OH
O
Antocianidinas
O
O
Pterocarpanos
O
O
O
Rotenoides
Figura 4. Estructura básica de algunos flavonoides. (Martínez M. Alejandro., 2005) 
20 
 
A muchos flavonoides se les han encontrado y reportado cierta actividad inhibitoria para la 
tirosinasa, esta inhibición por ciertos flavonoides se debe muy probablemente a la interacción 
con los iones metálicos en el dominio catalítico de la enzima. (Kim, Donghyun., et al., 2006) 
 
2.5.1 Quercetina. 
La quercetina (Figura 5) un flavonoide del tipo flavonol (Martínez M. Alejandro., 2005), es uno 
de los polifenoles de este tipo mas utilizados y estudiados en la actividad catalítica de tirosinasa, 
tal que, suele ser usado como referencia por su alto poder inhibitorio en la actividad o-difenolasa 
de la tirosinasa. 
O
O
OH
OH
OH
HO
OH
A
B
3
4
5
7
3'
4'
 
Figura 5. Estructura de la Quercetina 
 
Durante la actividad de la tirosinasa, algunos autores (Kubo, I., et al., 2000), han descrito la 
existencia de una fase lag (atribuida a la oxidación de monofenoles) y que puede ser acortada o 
abolida en presencia de agentes reductores (donadores de hidrógeno) especialmente o-difenoles. 
Juzgando por su estructura química, la quercetina (un difenol) puede servir como donador de 
protones y actuar como cofactor para iniciar esta actividad de hidroxilación, de hecho la L-
tirosina (un monofenol), es oxidada por la tirosinasa sin la fase lag en presencia de quercetina 
(Kubo, I., et al., 2000). 
21 
 
Por otro lado cuando la tirosinasa está en presencia solo de sustratos difenólicos (como el L-
DOPA), la quercetina actúa como un inhibidor competitivo sobre la actividad o-difenolasa de la 
tirosinasa posiblemente de distintas formas, una de ellas se debe a la relación que existe entre la 
quercetina y la forma met-tirosinasa y oxi-tirosinasa, en la cual la quercetina desplaza al o-difenol 
del sitio activo por su similitud evitando así la oxidación del sustrato (Figura 6) (Chen, Qing-Xi 
and Isao Kubo, 2002), o bien como agente quelante de cobre, en los que puede intervenir el grupo 
catecol del anillo B (Kim, Donghyun., et al., 2006), el grupo hidroxilo en posición 3 junto con el 
grupo carbonilo en posición 4 (Figura 7) e incluso el grupo carbonilo en posición 4 junto con el 
grupo hidroxilo en posición 5 del anillo A (Kubo I. et al., 2000), estas tres estructuras en la 
quercetina son las responsables de quelatar a los iones Cu2+ en el sitio activo de la enzima y por 
lo tanto, evitar la interacción enzima sustrato impidiendo se lleve a cabo la actividad difenolasa 
en la tirosinasa. 
Cu2+
N
N
N
O Cu
2+
N
N
N
Forma Emet Cu2+N
N
N
O Cu
2+
N
N
N
OHO
OH O
OH
O
O
 
Figura 6. Inhibición de la quercetina por desplazamiento del sustrato (Xie, Li-Ping., et al., 2003) 
 
22 
 
Cu2+
N
N
N
O Cu
2+
N
N
N
Forma Emet Cu2+
N
N
N
O
Cu2+
N
N
N
O
O
HO
OH
OH
OH
OH
 
Figura 7. Inhibición de la quercetina por quelatación de cobre. (Xie, Li-Ping., et al., 2003) 
 
De modo semejante se ha visto que varios flavonoides mas, actúan sobre la actividad difenolasa 
de la tirosinasa como la quercetina, sin embrago dependiendo de los sustituyentes en la molécula, 
se ha visto un cambioen su poder inhibitorio (Kim, Donghyun., et al., 2006). 
 
2.5.1.1 Inhibición competitiva de la quercetina. 
Cuando un inhibidor competitivo como lo es la quercetina, se encuentra en presencia de la 
enzima tirosinasa, compite por el sitio activo de ésta con el sustrato difenólico (L-DOPA), debido 
a que la enzima puede ligar tanto a la quercetina como al sustrato. Por lo que se necesitaría una 
concentración de sustrato mayor, tal que la de quercetina sea casi imperceptible y así la enzima 
alcanzaría su velocidad media, esto se refleja en la Km aparente de la enzima y causa el aumento 
de este parámetro. Por otro lado, la velocidad con que la enzima trabaja seguirá siendo la misma 
en presencia o en ausencia de un inhibidor competitivo, por lo que la Vmax se mantiene constante. 
(Figura 8) 
23 
 
 
Figura 8. Inhibición Competitiva 
 
Los inhibidores no competitivos (Figura 9) se unen a la enzima en un sitio diferente al sitio 
activo, esto ocasiona un ligero cambio conformacional en la enzima sin parar la reacción por 
completo, esto solo reduce la velocidad de catálisis, pero no la afinidad por el sustrato, viéndose 
reflejado en una disminución en la Vmax sin verse afectada la Km. 
 
Figura 9. Inhibición no Competitiva 
 
24 
 
 
Otro tipo de inhibición se presenta con aquellas moléculas que interactúan con el complejo 
enzima-sustrato, la interacción del inhibidor le da una estabilidad a este complejo de tal forma 
que se evita tanto la interacción de la enzima con nuevo sustrato alterando la Km aparente, así 
como la velocidad con la que forma el producto , en estos casos tanto la Vmax como la Km se ven 
reducidas. (Figura 10). (Murray, Robert K., et al., 2001) 
 
Figura 10. Inhibición Acompetitiva 
 
 
2.6 Ensayos enzimáticos. 
 
2.6.1 Caracterización de la actividad enzimática de tirosinasa. 
 
La caracterización de la actividad o-difenolasa de la tirosinasa; 
2 L-DOPA + O2 ⎯⎯⎯⎯ →⎯TIROSINASA 2 DOPAquinona + 2H2O 
25 
 
Se determina mediante un seguimiento espectrofotométrico a través del tiempo, utilizando para 
ello la tirosinasa, L-DOPA como sustrato específico a diferentes concentraciones y DMSO, bajo 
condiciones controladas de temperatura (35ºC) y pH (6.5) (Jesús Juárez, Natividad de. 2003). El 
producto de reacción principal es DOPAquinona, sin embargo su alta reactividad la hace muy 
inestable causando que inmediatamente después de su formación, le ocurran reacciones sucesivas 
hasta la formación de un intermediario relativamente mas estable (antes de llegar a melanina), el 
DOPAcromo, este intermediario, tiene la propiedad de tener un máximo de absorción a 475 nm. 
Gracias a esto nos es posible la medición indirecta por vía espectrofotométrica de la actividad o-
difenolasa a través del tiempo. Los intermediarios entre DOPAquinona y DOPAcromo, no 
interfieren en la medición a esta longitud de onda, pues no absorben, lo que hace factible por este 
método, que se haga el seguimiento de la reacción monitoreando la formación de DOPAcromo en 
lugar de DOPAquinona (Peñalver, M. J., et al., 2002). 
 Se utiliza la ecuación de Lambert & Beer: 
lcA ε= 
Y se relaciona con la ecuación de la velocidad de reacción: 
(min)
547
t
aAbsorbenci
V
Δ
Δ
= 
Para obtener la ecuación 1: 
) ( ) ( (min) 
)( 475
gomLenzimadecantidadcmlt
LVolumenaAbsorbenci
A ensayo
με ×××
×Δ
= -------- Ecuación 1 
A = Actividad enzimática 
 ε = Coeficiente de extinción molar del DOPAcromo a 475 nm (3600M-1 cm-1) 
l = longitud de la celda utilizada (1 cm) 
 
26 
 
Esto con el objeto de que a partir de los datos obtenidos de Absorbencia a 475 nm, se pueda 
obtener el valor de la actividad enzimática y simultáneamente los valores de Km y Vmax. 
La Km (constante de Michaellis – Menten) nos da una interpretación de que tan afín es una 
enzima por un determinado sustrato, mientras que la Vmax (velocidad máxima) depende 
directamente de la concentración de enzima existente. Normalmente esta dependencia es 
expresada por la ecuación de Michaellis - Menten: 
[ ]
[ ]SK
SV
V
m 
 max
+
= ---------- Ecuación de Michaellis - Menten 
 
Sin embargo, para el cálculo de Km y Vmax se utiliza la representación inversa de esta ecuación, 
llamada ecuación de Lineweaver – Burk: 
[ ]S
m
V
K
V
V max 
max
 1
1
+
= ---------- Ecuación de Lineweaver – Burk 
 
De esta forma el representar 
V
1 contra [ ]S
1 gráficamente, nos da lugar a una línea recta, de la 
cual podemos obtener la ordenada al origen (que es 
max
1
V
) y la ordenada a la abscisa (que es 
mK
1
− ) y a partir de ellas obtener Vmax y Km respectivamente. (Murray, Robert K., et al., 2001) 
 
 
 
 
27 
 
2.6.2 Efecto cinético y caracterización del tipo de inhibición. 
 
Los ensayos para caracterizar el tipo de inhibición en una enzima se basan en el mismo principio 
que aquellos que se implementan para medir su actividad catalítica, la única diferencia es la 
sustitución de DMSO por la de el inhibidor disuelto en DMSO (a concentración constante por 
experimento), para este caso la formación y medición de DOPAcromo mediante técnicas de 
espectrofotometría a 475nm, resulta igualmente útil. (Xinastle Castillo, C. I., 2008). 
Se requiere realizar una gráfica de doble recíprocos, es decir una gráfica a partir de la ecuación de 
Lineweaver – Burk del ensayo en presencia y en ausencia del inhibidor para poder caracterizar el 
tipo de inhibición que se presenta, 
 
2.6.3 Determinación del IC50. 
El IC50 es un parámetro utilizado como referencia para determinar el alcance inhibitorio de una 
sustancia sobre la actividad de una enzima y se define como la cantidad de inhibidor que se 
necesita para lograr reducir la actividad de una enzima al 50%. De igual forma se utiliza la 
medición espectrofotométrica a 475 nm del intermediario DOPAquinona, esto en presencia de 
diferentes concentraciones del inhibidor a través del experimento y esta vez manteniendo la 
concentración de sustrato constante (Kubo, I., Kinst-Hori, Ikubo., 1999). Cabe mencionar que 
cada concentración de inhibidor evaluada debe de tener su blanco respectivo para que la 
determinación sea confiable. El valor del IC50 se obtiene, realizando una gráfica de porcentaje de 
actividad de la enzima (donde el 100% es en ausencia del inhibidor) contra la concentración de 
inhibidor añadido. (Chen, Qing-Xi and Kubo, I., 2002) 
 
 
28 
 
 
 
Figura 11. Determinación del IC50 
 
 
Una interpolación en la grafica en el 50% de actividad corresponderá al valor de IC50 (Figura 11). 
Sin embargo debido a que algunos inhibidores a altas concentraciones no son solubles en medio 
acuoso, hacen que su poca solubilidad y la turbidez en el medio de reacción interfiera en la 
lectura de absorbencia y provoquen que la determinación sea poco confiable, en algunos estudios 
con problemas de solubilidad del inhibidor (Kubo, I., et al., 2000), se ha utilizado la máxima 
concentración posible de éste, tal que la turbidez permita la medición espectrofotométrica 
confiable, sin embargo no siempre se alcanza el IC50 a estas bajas concentraciones. Por lo que es 
un estimado, pues un aumento en ellas haría que el ensayo fuera dudoso. 
 
 
 
29 
 
2.7 Modificación química de los inhibidores. 
Un cambio en algún grupo funcional de la molécula de inhibidor (Miyazawa, Mitsuo y Tamura, 
Naotaka., 2006), la eliminación o adición de otro en determinada posición e incluso el acomodo 
en diferentes posiciones de un mismo grupo funcional a través de la molécula (Kim, Donghyun., 
et al., 2006), pueden favorecer o disminuir la actividad de inhibición en la actividad de la 
tirosinasa. A menudo se llevan a cabo reacciones químicas que modifican los sustituyentes en un 
inhibidor ya comprobado, esto provoca un cambio en la actividad original del inhibidor y en 
algunos casos puede ser mejorada. 
 
2.7.1 Reacción con yoduro de metilo en medio básico. 
En medio básico losgrupos OH en los fenoles pueden aceptar grupos metilo procedentes de 
agentes metilantes, como es por ejemplo el yoduro de metilo. Debido a que el yodo en el yoduro 
de metilo es muy electronegativo, atrae fácilmente los electrones del enlace en la molécula, esto 
facilita un ataque electrofílico por parte del oxígeno del grupo hidroxilo en el fenol al carbono 
con carga parcial positiva en el yoduro de metilo, el resultado de este ataque es la formación del 
éter metílico del fenol (Figura 12). 
O C
H
H
H
I
H
δ(−)
δ(+) O
H
CH3
I
+
OCH3 + HI
K2CO3
+ KI + H2O + CO2
OCH3
δ(−)
 
Figura 12. Mecanismo de reacción de la metilación de fenoles con yoduro de metilo. 
30 
 
2.7.2 Reacción con diazometano. 
Otra alternativa de metilación de fenoles, es mediante la reacción de éstos con diazometano, este 
se obtiene por la reacción entre la N-metil-N-nitrosourea en un medio básico (Figura 13. A) 
(López, Martín E., et al. 1979). 
 
(A)
(B)
N
N
H3C C
O
NH2
O
OH
H2O H3C N
C
O
HO
N O
NH2 H3C N N O CH2N2
O
H
H2C N N
O
H3C N N
OMe
+ N2
SN2
Figura 13. Obtención de diazometano y mecanismo de reacción de metilación de fenoles. 
 
 
La reacción de metilación a fenoles (Figura 13. B) implica en primer lugar una reacción ácido-
base, donde el carbono del diazometano substrae al protón moderadamente ácido del fenol, 
enseguida el ión fenolato formado reacciona mediante un mecanismo SN2, formando el éter 
metílico del fenol y liberando nitrógeno. (Camps García, Pelayo., et al., 2005) 
 
 
31 
 
2.7.3 Reacción con anhídrido acético. 
Comúnmente las acetilaciones se logran utilizando anhídrido acético o cloruro de acetilo, en 
presencia de una base terciaria o aromática, como lo es la piridina (Mann, Frederick G. and 
Saunders, Bernard C., 1960) 
O
H
δ(-)
δ(+)
CH3OH3C
OO
O
CH3
O
C
CH3
O
O
O
CH3O
CH3
O
O
+
OAc
N
H
H
H
Acetato de piridinio
CH3O
O
N-H
H3C O
O
 
Figura 14. Mecanismo de reacción de acetilación de fenoles 
 
Se lleva a cabo un ataque nucleofílico por parte del fenol sobre el grupo carbonilo del anhídrido 
acético, polarizando el enlace C = O y formando un ión intermediario inestable. El par de 
electrones del oxígeno atacan al carbono cuaternario recién formado liberando un ión acetato y el 
acetato de fenol protonado. El ión acetato formado toma el protón de este acetato de fenol para 
formar finalmente el acetato del fenol y ácido acético, este ultimo reacciona con la piridina para 
formar una sal, el acetato de piridinio. (Figura 14.) 
32 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INHIBIDORES DE TIROSINASA 
DE ORIGEN NATURAL Y 
SEMISINTÉTICOS 
 
 
 
CAPITULO III: DESARROLLO EXPERIMENTAL 
33 
 
3.1 Diagrama General de Investigación. 
 
Productos semisintéticos puros 
Determinación de los parámetros 
cinéticos de la tirosinasa (Kmax y Vmax). 
Efecto cinético de los metabolitos 
secundarios y los productos semisintéticos 
en la actividad de la tirosinasa.
Identificación del tipo de 
inhibición. 
Fuentes naturales de metabolitos 
secundarios 
Obtención de los extractos 
Síntesis de nuevos 
derivados a partir de 
productos naturales y 
sintéticos 
Purificación por CCF 
preparativa de los 
productos de reacción 
mayoritarios 
Purificación por CC y CCF preparativa 
Metabolitos 
secundarios puros 
Identificación de los 
metabolitos secundarios 
Identificación de los 
productos semisintéticos 
Determinación del IC50 de los 
inhibidores de la enzima 
34 
 
3.2 Equipo, materiales y reactivos. 
 
3.2.1 Aislamiento, purificación y reacciones de metabolitos secundarios. 
 
Disolventes 
• Éter de petróleo, acetato de etilo, diclorometano, acetona, éter etílico, fueron 
obtenidos comercialmente y destilados en el laboratorio. 
 Reactivos 
• Piridina, anhídrido acético, HCl, NaOH, Na2SO4 anhidro, K2CO3, 
Nitrosometilurea, yoduro de metilo y quercetina, fueron obtenidos de la compañía 
Aldrich Chemical Company Inc. 
Revelador 
• Solución de Sulfato cérico 
Absorbentes utilizados para CC y CCF 
o Gel de sílica 70/230. 
o Gel de sílica 35/70. 
o Cromatoplacas de sílice gel 100 G/UV254 20x20 y 1.0 mm de 
espesor marca macherey-nagel. 
o Cromatoplacas de sílica gel G7UV 254 de 20x20 cm y 0.20 mm de 
espesor. 
Equipo 
 Rotavapor BÜCHI R114 y baño de agua BÜCHI B-480. 
 Lámpara portátil modelo Moder-UVLS-26 (254-365 nm). 
 Bomba de vació Vacuum Pum, Hitachi Ltd. 
 Varian- Unity 300 MHz. Para datos de RMN 
 Varian-Gemini 200 MHz. RMN. Para datos de RMN 
 Eclipse 300 MHz JEOL. RMN. Para datos de RMN 
35 
 
 
3.2.2 Ensayos enzimáticos. 
 
Reactivos y disolventes 
• Tirosinasa comercial (1.14.18.1) de A. bisporus, marca Sigma-Aldrich Co., 6,050 
U/mg, se conservó a -30º C. 
• L-DOPA (3,4-Dihidroxifenilalanina) marca Sigma-Aldrich Co. 
• Quercetina (3,3',4',5,7-pentahidroxiflavona) marca Sigma-Aldrich Co. 
• DMSO (Dimetil sulfóxido) marca Sigma-Aldrich Co. 
• NaH2PO4 •H2O marca Mallinckrodt A.R. 
• Na2HPO4 • 12H2O marca J.T. Baker 
 
Equipo 
 Balanza analítica Sartorius Basic plus, modelo BP 210S, capacidad 210g d= 0.1 
mg. 
 Espectrofotómetro UV/VIS Pharmacia Biotech Modelo Ultrospec 2000. 
 Ultracongelador Scien Temp, modelo 43-1.7. Para conservación de la enzima 
 Micropipetas Labsystems, Finnpipette 0.5-10 μ L, 5-40 μ L, 40-200 μ L y 100-
1000 μ L. 
 Celdas de plástico Brand, modelo PlaxiBrand 1.5 mL. 
 Baño de calentamiento CRAFT Instrumentos científicos. Modelo BP-1000. 
 
 
36 
 
Preparación de reactivos 
 L-DOPA 10 mM 
 0.0197 g de L-DOPA en 10 mL de H2O 
 Amortiguador de fosfatos pH 6.5 0.1 M 
 2.3633 g de NaH2PO4 •H2O y 2.8193 g de Na2HPO4 • 12H2O, aforar a 250 mL 
 Enzima 13800 U/mL 
2.28 mg de enzima 6050 U/mg en 1 mL de buffer de fosfatos pH 6.5, 0.1 M. 
 Quercetina 5 mM 
 0.0169 g en 10 mL de DMSO 
 Pentaacetato de quercetina 5 mM 
 0.0256 g en 10 MmL de DMSO 
 5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona 5 mM 
 0.0179 g en 10 mL de DMSO 
 Santina 5 mM 
0.0172 g en 10 mL de DMSO 
 4’-metilpenduletina 5mM 
 0.0179 g en 10 mL de DMSO 
37 
 
 
3.3 Quercetina (3,3',4',5,7-pentahidroxiflavona) 
3.3.1 RMN (Espectro No. 1) 
RMN 1H, 300 MHz, CDCl3 + DMSO, δ (ppm ): 6.28 (1H, d, J= 2.1 Hz, H-6), 6.42(1H, d, J= 2.1 
Hz, H-8), 6.96 (1H, d, J= 8.7 Hz, H-5’), 7.65(1H, d,d, J= 2.1, 8.7 Hz, H-6’), 7.77(1H, d, J= 2.1 
Hz, H-2’) 
 
3.4 Obtención de los productos semisintéticos. 
 
 3.4.1 Pentaacetato de quercetina . 
3.4.1.1 Reacción con anhídrido acético. 
Se disolvieron 100 mg de quercetina en 1 mL de piridina, una vez disuelta se le añadió 1 mL de 
anhídrido acético y se mantuvo en agitación a una temperatura de 60°C. El avance de la reacción 
se monitoreo por cromatografía en capa fina (CCF). Una vez concluida la reacción (2 horas), los 
reactivos se eliminaron con ayuda de una bomba de vacio, obteniendo un residuo (110 mg). Este 
residuo se purificó mediante cromatografía en capa fina utilizando dos placas cromatográficas de 
20x10 cm y 1mm de espesor cada una, las placas se desarrollaron usando una mezcla 9:1 
diclorometano : acetona, obteniendo 93.8 mg del producto identificado como pentaacetato de 
quercetina. 
 
3.4.1.2 RMN (Espectro No. 2) 
RMN 1H, 300 MHz, CDCl3, δ (ppm ): 2.33 (6H, 2x AcO) 2.334 (6H, 2x AcO), 2.43 (3H, AcO), 
6.88 (1H, d, J= 2.1 Hz, H-6), 7.33 (1H, d, J= 2.1 Hz, H-8), 7.35 (1H, d, J= 8.7 Hz H-5’), 7.69 
(1H, d, J= 2.1 Hz, H-2’), 7.72 (1H, d,d, J= 8.7, 2.1 Hz, H-6’) 
38 
 
3.4.2 Ayanina (3, 7, 4’- trimetoxiflavona) 
3.4.2.1 Reacción con diazometano. 
En un embudo de separación se colocaron 30 mL de NaOH al 40% previamente enfriado y 40 
mL de éter etílico, en pequeñas cantidades se adicionaron 200 mg de N-metil-N-nitrosourea 
dejando reaccionar en reposo por un tiempo de dos horas. La fase etérea conteniendo el 
diazometano, se adicionó a una solución etérea (20 mL) conteniendo 100 mg de quercetina, se 
dejó la reacción 24 horas al cabo de las cuales seeliminó el éter a presión ordinaria, obteniendo 
un residuo de 114 mg. Este fue purificado mediante cromatografía en capa fina en dos placas de 
20x10 cm y 1mm de espesor, utilizando una mezcla 7:3 de hexano : acetona eluyendo tres veces, 
obteniendo 12.5 mg de producto identificado como ayanina. 
 
3.3.4.2 RMN (Espectro No. 3) 
RMN 1H, 300 MHz, Acetona-D6, δ (ppm ): 3.89 (3H, s, OMe), 3.93 (3H, s, OMe), 3.96 (3H, s, 
OMe), 6.31 (1H, d, J= 2.1 Hz, H-6), 6.77, (1H, d, J= 2.1 Hz H-8), 7.12 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-5’), 
7.66 (1H, d, J= 2.1 Hz, H-2’), 7.70 (1H, d,d, J= 8.7, 2.1 Hz, H-6’) 
 
3.4.3 5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona. 
3.4.3.1 Reacción con yoduro de metilo en medios básico. 
Se disolvieron 100 mg de quercetina en 50 mL de acetona anhídra, a esta mezcla se le añadieron 
500 mg de K2CO3 anhídro y 2 mL de yoduro de metilo, la reacción se dejó en reflujo durante 24 
horas, al cabo de las cuales se le adicionaron 50 mL de acetato de etilo y se lavó la solución con 
100 mL de una solución de HCl al 5% y posteriormente con 100 mL de H2O. La fase orgánica 
(acetato de etilo) se secó con Na2SO4 anhidro y se evaporó el disolvente utilizando un rotavapor, 
dejando un residuo de 102 mg. Este fue purificado mediante CCF en dos placas de 20x10 cm y 
39 
 
1mm de espesor cada una, utilizando una mezcla de hexano : acetato de etilo 7:3 y eluyendo tres 
veces, obteniendo 43 mg de un producto identificado como 5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-
tetrametoxiflavona. 
Punto de fusión: 193-195 °C 
 
3.4.3.2 RMN (Espectro No. 4) 
RMN 1H, 300 MHz, CDCl3, δ (ppm ): 3.86 (6H, s, 2x OMe), 3.96 (6H, s, 2x OMe), 6.34 (1H, d, 
J= 2.1 Hz, H-6), 6.43 (1H, d, J= 2.1 Hz, H-8), 6.98 (1H, d, J= 8.7 Hz, H-5’), 7.68 (1H, d, J= 2.1 
Hz, H-2’), 7.72 (1H, d,d, J= 8.7, 2.1 Hz, H-6’), 12.62 (1H, s, C5-OH). 
 
3.5 Aislamiento y purificación de flavonoides de origen natural. 
 
3.5.1 4’-metilpenduletina. 
3.5.1.1 Extracción y purificación. 
La flavona 4’-metilpenduletina fue aislada de la planta denominada Brickellia paniculata 
recolectada en los alrededores de la ciudad de Tamazulapan, Oaxaca en el año 2001. 
Las partes aéreas de la planta secas, fueron extraídas con éter de petróleo y el extracto (5.7 g) se 
pasó por una columna cromatográfica de sílica gel 70/230 (180g). La columna se eluyó con 
mezclas de éter de petróleo y acetato de etilo de polaridad creciente, obteniéndose 38 fracciones. 
Las fracciones 21-28 (400 mg) eluidas con una mezcla 7:3 de éter de petróleo: acetato de etilo, 
fueron purificadas mediante cromatografía en capa fina, para lo cual se utilizaron cuatro placas de 
10x20 cm y 1 mm de espesor, eluidas una sola vez en una fase móvil 6:4 de éter de petróleo: 
acetato de etilo, obteniéndose así 200 mg de un sólido cristalino amarillo p.f. 171-172 0C. 
 
40 
 
3.5.1.2 RMN (Espectro No. 5) 
RMN 1H, 300 MHz, CDCl3, δ (ppm ): 3.87 (3H, s, OMe), 3.90 (3H, s, OMe), 3.93 (3H, s, OMe), 
3.96 (3H, s, OMe), 6.51 (1H, s, H-8), 7.02 (2H, d, J = 9.3 Hz, H-3’, H-5’), 8.08 (2H, d, J= 9.3 Hz, 
H-2’, H-6’), 12.70 (1H, s, C5-OH). 
 
3.5.2 Santina (5,7 dihidroxi-3,6,4´-trimetoxi flavona). 
3.5.2.1 Extracción y purificación. 
Se utilizaron 500g de la planta Tanacetum parthenium, colectada en la delegación Tlalpan en 
mayo del 2008, para realizar un extracto en la planta fresca con 2 litros de diclorometano, 
después de evaporar el disolvente se obtuvieron 34g de extracto total, de los cuales 10.2 g se 
absorbieron en 30 g de sílica gel 35/70 y se colocaron en una columna de 250 g de sílica gel 
70/230. La columna se eluyó con mezclas de éter de petróleo: acetato de etilo de polaridad 
creciente, obteniéndose 90 fracciones. Las fracciones 46-52 eluidas con hexano: acetato de etilo 
6:4, dieron un peso de 387 mg , los que se purificaron en 4 placas cromatográficas de 10 x 20 cm 
y 1.0 mm de espesor, se eluyeron con una mezcla de éter de petróleo : acetona 7:3 dos veces. El 
compuesto purificado dio un peso de190 mg. 
Sólido amarillo p.f. 158-160 °C 
 
3.5.2.2 RMN (Espectro 6) 
RMN 1H, 300 MHz, CDCl3, δ (ppm ): 3.85 (3H, s, OMe), 3.90 (3H, s, OMe), 4.04 (3H, s, OMe), 
6.55 (1H, s, H-8), 7.02 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-3’, H-5’), 8.07 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2’, H-6’), 12.91 
(1H, s, C5-OH). 
 
 
41 
 
 3.5.2.3 EMIE (Espectro No 7) 
EMIE, 70, eV, m/z (int. rel.): 
 344 [M]+ (C18H16O7) (100)
 329 [M-CH3]+ (C17H13O7) (43)
 167 [M-CH3-B] (C7H3O5) (40)
 149 [M-CH3-A]+2H (C9H9O2) (91)
O
O
O
O
HO
O
OHCH3
CH3
CH3
O
C
O
OH
O
H3C
HO
O
CH3
O
CH3
C
C
+
O
C
O
OH
HO O CH3
C
CO
O
C m/z = 167 D m/z = 147
B m/z = 162A m/z = 182
O
O
O
O
HO
O
OHCH3
CH3
CH3
O
O
O
O
HO
O
OHCH3
CH3
 m/z = 329
O
O
O
O
HO
O
OHCH3
CH3
CH3
[M] m/z = 344
 
Esquema 3. Posible patrón de fragmentación de la santina. 
42 
 
3.6 Actividad enzimática 
Para la determinación de la actividad enzimática, se siguió la metodología utilizada por Jesús 
Juárez, Natividad de. 2003, con las siguientes modificaciones: 
 
3.6.1 Determinación de la actividad enzimática de tirosinasa. 
A una longitud de onda de 475 nm en el espectrofotómetro y una temperatura de 35 °C en el baño 
de calentamiento, se añadieron en una celda de plástico los siguientes volúmenes de reactivos, 
adicionando al final la enzima. 
Solución 
L-DOPA 
10 mM 
Amortiguador de fosfatos 
pH 6.5 0.1 M 
DMSO Solución de 
Enzima 
13800 U/mL 
μ L [mM]F μ L μ L μ L UF 
0 0 985 10 5 69 Blanco 
50 0.5 935 10 5 69 
100 1.0 885 10 5 69 
150 1.5 835 10 5 69 
200 2.0 785 10 5 69 
300 3.0 685 10 5 69 
 
El tiempo cero es aquel en que la enzima es añadida, por lo que a su adición inmediata y 
agitación por inversión, se comenzó a tomar el tiempo incubando la mezcla de reacción a 35 °C. 
La absorbancia a 475 nm se leyó cada minuto durante los 10 minutos del ensayo, así para cada 
una de las concentraciones de L-DOPA (0 a 3 mM). 
Una vez determinado el tiempo óptimo (en el experimento anterior) al que la enzima mantiene 
una linealidad y por lo tanto confiabilidad de medición (5 minutos), se obtuvo el comportamiento 
de la reacción espectrofotométricamente a este tiempo a diferentes concentraciones de sustrato 
(L-DOPA) de la siguiente forma: 
 
43 
 
Solución 
L-DOPA 
10 mM 
Amortiguador de fosfatos pH 
6.5 0.1 mM 
DMSO Solución de 
Enzima 
13800 U/mL 
μ L [mM]F μ L μ L μ L UF 
0 0 985 10 5 69 Blanco 
25 0.25 960 10 5 69 
50 0.5 935 10 5 69 
100 1.0 885 10 5 69 
200 2.0 785 10 5 69 
300 3.0 685 10 5 69 
350 3.5 635 10 5 69 
400 4.0 585 10 5 69 
450 4.5 535 10 5 69 
500 5.0 485 10 5 69 
 
3.6.2 Efecto cinético y tipo de inhibición. 
Esta determinación es básicamente igual al de la caracterización de la enzima, teniendo como 
única diferencia los reactivos que se le añaden, ya que en lugar de DMSO se le adiciona una 
solución (5 mM) del inhibidor a probar, a diferentes volúmenes en cada experimento (Xinastle 
Castillo, C. I., 2008), de la siguiente forma: 
Solución de 
L-DOPA 
10 mM 
Amortiguador de fosfatos 
pH 6.5 0.1 mM 
Solución de 
Inhibidor 
5 mM 
Solución de 
Enzima 
13800 U/mL 
μ L [mM]F μ L μ L [mM]F μ L UF 
0 0 985 10 0.05 5 69 
25 0.25 960 10 0.05 5 69 
50 0.5 935 10 0.05 5 69 
100 1.0 885 10 0.05 5 69 
200 2.0 785 10 0.05 5 69 
300 3.0 685 10 0.05 5 69 
350 3.5 635 10 0.05 5 69 
400 4.0 585 10 0.05 5 69 
450 4.5 535 10 0.05 5 69 
500 5.0 485 10 0.05 5 69 
 
En la tabla se muestra el ejemplo de un experimento con la concentración de inhibidor de 0.05 
mM. De modo semejante se probaron distintas concentraciones del inhibidor (desde 0.05 mM a 
44 
 
0.3 mM, según el caso) añadiendo los volúmenes correspondientes de éste y completando 
siempre a un mililitro final de reacción con amortiguador de fosfatos pH 6.5, 0.1 mM. 
3.6.3 Determinación del IC50. 
Para este experimento, se diseño una metodología similar a la que se utilizó en el experimento 
anterior (efecto cinético y caracterización del tipode inhibición), con la diferencia de que se 
mantiene constante la concentración de sustrato (L-DOPA) y modificando la concentración del 
inhibidor a través del experimento. Además de un tratamiento térmico a la enzima, para su uso en 
el blanco. 
Solución 
L-DOPA 
10 mM 
Amortiguador de fosfatos 
pH 6.5 0.1 mM 
Solución de 
Inhibidor 
5 mM 
Solución de 
Enzima 
13800 U/mL 
μ L [mM]F μ L μ L [mM]F μ L UF 
200 2 795 10 * 0 5 69 
200 2 795 10 * 0 5 69 Blanco
200 2 785 10 0.05 5 69 
200 2 785 10 0.05 5 69 Blanco
200 2 775 20 0.1 5 69 
200 2 775 20 0.1 5 69 Blanco
200 2 765 30 0.15 5 69 
200 2 765 30 0.15 5 69 Blanco
200 2 755 40 0.2 5 69 
200 2 755 40 0.2 5 69 Blanco
200 2 745 50 0.25 5 69 
200 2 745 50 0.25 5 69 Blanco
200 2 735 60 0.3 5 69 
200 2 735 60 0.3 5 69 Blanco
200 2 725 70 0.35 5 69 
200 2 725 70 0.35 5 69 Blanco
200 2 715 80 0.4 5 69 
200 2 715 80 0.4 5 69 Blanco
200 2 705 90 0.45 5 69 
200 2 705 90 0.45 5 69 Blanco
200 2 695 100 0.5 5 69 
200 2 695 100 0.5 5 69 Blanco
*Adición de DMSO en lugar de inhibidor 
45 
 
Se muestra el ejemplo de un experimento para la determinación del IC50; los blancos contienen 
los mismos reactivos y concentraciones que su respectivo ensayo, con la única diferencia que las 
69 U de enzima que se le añaden a éste están inactivadas por un tratamiento térmico previo, se 
mantuvo la concentración de L-DOPA fija en 2 mM (concentración óptima), mientras que la 
concentración del inhibidor a través del experimento parte de 0.05 mM hasta 5 mM, cabe 
mencionar que este rango va en función del inhibidor, pudiendo ser mayor o menor. Como se 
muestra en el ejemplo, la variación del volumen en el inhibidor se compensó con la adición de 
amortiguador de fosfatos pH 6.5, 0.1 mM, siempre a un volumen final de reacción de un mililitro. 
A partir de la adición de las 69 U de enzima y la agitación por inversión en la celda, se incubó 
durante 5 minutos a 35 °C y se procedió a leer la absorbencia a 475 nm. 
 
46 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INHIBIDORES DE TIROSINASA 
DE ORIGEN NATURAL Y 
SEMISINTÉTICOS 
 
 
 
CAPITULO IV: DISCUSIÓN DE RESULTADOS 
47 
 
4.1 Determinación de la actividad enzimática de la tirosinasa. 
Se realizó en primer lugar, el monitoreo de la actividad de la tirosinasa a lo largo de 10 minutos a 
un pH de 6.5 y una temperatura de 35°C ± 1, utilizando cinco diferentes concentraciones, 0.05, 
0.1, 0.15, 0.2 y 0.3 mM de sustrato L-DOPA. 
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
tiempo (min)
[D
O
PA
cr
om
o]
 m
M
0.05 mM L-DOPA 0.1 mM L-DOPA 0.15 mM L-DOPA
0.2 mM L-DOPA 0.3 mM L-DOPA
Gráfica. 1 Efecto de la concentración de sustrato (L-DOPA) en la producción de DOPAcromo en 
la tirosinasa. 
 
En la gráfica 1, se puede observar el aumento en la producción de DOPAcromo a través del 
tiempo en una misma concentración de L-DOPA y una relación proporcional al tiempo máximo 
de 5 minutos entre la concentración de L-DOPA y la producción de DOPAcromo. 
 
48 
 
Mientras tanto en la gráfica 2, se observa que a mayor concentración de sustrato la velocidad de 
la enzima aumenta y por otra parte disminuye a través del tiempo, esto debido al agotamiento de 
L-DOPA. 
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
tiempo (min)
V
el
oc
id
ad
 ( Δ
A
bs
 / 
Δ
t)
0.05 mM L-DOPA 0.1 mM L-DOPA 0.15 mM L-DOPA
0.2 mM L-DOPA 0.3 mM L-DOPA
Gráfica. 2 Efecto de la concentración de sustrato (L-DOPA) en la producción de DOPAcromo 
por la tirosinasa. 
 
 La técnica utilizada y las condiciones experimentales de pH y temperatura bajo las que se realizó 
el experimento, nos permitieron elegir el tiempo óptimo y una concentración de sustrato en la que 
la actividad de la enzima tirosinasa puede ser medida confiablemente. Esto es, asegurar que la 
producción de DOPAcromo no sea demasiado baja tal que no pueda medirse y que la actividad 
no se encuentre en su fase de agotamiento del sustrato. 
49 
 
Basándonos en nuestros resultados anteriores se determinó el tiempo de 5 minutos y una 
concentración de 2mM de L-DOPA como óptimos, así las pruebas posteriores se desarrollaron 
bajo estas condiciones. 
 
4.1.1 Valores de Km y Vmax de la enzima tirosinasa. 
Los valores de Km y Vmax de la enzima (tabla 1) fueron obtenidos a partir de la ecuación de la 
recta de la gráfica 3 (ecuación de Lineweaver – Burk), en donde se contemplaron las 
concentraciones de 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 y 5.0 mM de L-DOPA para obtener sus 
respectivos valores de velocidad (utilizando la ecuación 1) con un tiempo de 5 minutos. 
0
0.25
0.5
0.75
1
1.25
1.5
1.75
2
2.25
‐2.5 ‐2 ‐1.5 ‐1 ‐0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
1/ L ‐DOPA  (mM)
1/
 V
  (
U
/m
L)
S in Inhibidor L ineal (S in Inhibidor)
 
Gráfica. 3 Representación gráfica de la ecuación de Lineweaver – Burk de la actividad de la 
tirosinasa bajo las condiciones de trabajo. 
50 
 
 
 
 Ecuación de la recta Km Vmax 
Tirosinasa 
y = 0.2468x + 1.0895 
R2 = 0.9729 
0.2265 mM 0.9179 U/mL 
Tabla 1. Valores de Km y Vmax para la tirosinasa bajo las condiciones de trabajo. 
 
 
4.2 Efecto cinético y tipo de inhibición. 
 
4.2.1 Quercetina. 
La quercetina, un inhibidor al cual ya se le ha descrito su actividad, se utilizó en este estudio 
tanto como referencia para valorar el método y las condiciones de trabajo, así como para 
comparar su actividad contra los demás inhibidores naturales y semisintéticos obtenidos. 
Bajo las mismas condiciones y metodología, se obtuvo la gráfica 4, en la que se muestra la 
representación gráfica de la ecuación de Lineweaver – Burk para la actividad de la tirosinasa en 
ausencia de inhibidor y en presencia de dos concentraciones de quercetina (0.05 y 0.1 mM). 
 Ecuación de la recta Km (mM) Vmax (U/mL) 
Ausencia de inhibidor 
y = 0.2468x + 1.0895 
R2 = 0.9729 
0.2265 0.9179 
0.05 mM de quercetina 
y = 1.7688x + 0.7155 
R2 = 0.9994 
2.4721 1.3976 
0.1 mM de quercetina 
y = 4.31x + 0.6651 
R2 = 0.9658 
6.4802 1.5035 
Tabla 2. Valores de Km y Vmax para la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en 
presencia de dos concentraciones de quercetina. 
 
51 
 
‐8
‐6
‐4
‐2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
‐2 ‐1.5 ‐1 ‐0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
1/ L ‐DOPA  (mM)
1/
 V
  (
U
/m
L)
S in Inhibidor 0.05 mM Quercetina
0.1 mM Quercetina L ineal (S in Inhibidor)
L ineal (0.05 mM Quercetina) L ineal (0.1 mM Quercetina)
 
Gráfica 4. Actividad de la tirosinasa en ausencia de inhibidor 
y en presencia de 0.05 mM y 0.1 mM de quercetina. 
 
Una aparente intersección de las rectas en el eje de las “ordenadas” (1/V) (gráfica 4) y sus valores 
correspondientes de Km y Vmax (tabla 2), evidencian una inhibición del tipo competitivo ya que 
los valores de Vmax se mantienen casi constantes en cambio en los valores de Km se observa una 
variación significativa. 
Esto además comprueba la efectividad del método, ya que experimentos reportados en la 
literatura (Chen, Qing-Xi and Kubo, I., 2002) mencionan a la quercetina como un inhibidor del 
tipo competitivo. 
52 
 
 4.2.2 Pentaacetato de quercetina. 
En la reacción con anhídrido acético de la quercetina, el rendimiento obtenido fue de 55.3%, 
llevándose a cabo una acetilación en los cinco grupos hidroxilo presentes en la quercetina, el 
compuesto se identificó por RMN. Para los ensayos del tipo de inhibición se probaron 3 
concentraciones de este compuesto (0.05, 0.1 y 0.2 mM). 
‐4
‐2
0
2
4
6
8
10
12
‐2 ‐1 0 1 2 3 4
1/ L ‐DOPA  (mM)
1/
 V
  (
U
/m
L)
S in Inhibidor 0.05 mM Inhibidor
0.1 mM Inhibidor 0.2 mM Inhibidor
L ineal (S in Inhibidor) L ineal (0.05 mM Inhibidor)
L ineal (0.1 mM Inhibidor) L ineal (0.2 mM Inhibidor)
Gráfica 5. Actividad de la tirosinasa en ausencia de inhibidor 
y en presencia de 0.05, 0.1 y 0.2 mM de pentaacetato de quercetina. 
 
53 
 
 Ecuación de la recta Km (mM) Vmax (U/mL)
Ausencia de inhibidor y = 0.2468x + 1.0895 
R2= 0.9729 
0.2265 0.9179 
0.05 mM de pentaacetato de quercetina y = 0.7733x + 1.4912 
R2 = 0.8948 
0.5186 0.6706 
0.1 mM de pentaacetato de quercetina y = 1.8561x + 1.1757 
R2 = 0.9723 
1.5787 0.8506 
0.2 mM de pentaacetato de quercetina y = 2.6314x + 1.3173 
R2 = 0.9978 
1.9976 0.7591 
Tabla 3. Valores de Km y Vmax para la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en presencia de 
tres concentraciones de pentaacetato de quercetina. 
 
En la tabla 3 podemos observar los valores de Km y Vmax pertenecientes a la tirosinasa en 
presencia de las tres concentraciones de pentaacetato de quercetina, una tendencia en la que los 
valores de Vmax se mantienen mas constantes que los de Km y la aparente intersección en el eje de 
las “ordenadas” (1/V) en la representación grafica de la ecuación de Lineweaver – Burk (gráfica 
5) nos sugieren una inhibición del tipo competitivo. 
 
4.2.3 Ayanina. 
La reacción de quercetina con diazometano dio una mezcla de varios productos, de los cuales el 
mayoritario fue identificado por RMN como ayanina, sin embargo debido al bajo rendimiento del 
producto (10.9%) no se pudo llevar a cabo el estudio de inhibición para la tirosinasa. 
 
 
 
 
54 
 
 4.2.4 5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona. 
Por otra parte, cuando se sometió a la quercetina en medio básico con yoduro de metilo, se 
obtuvo un producto de reacción en el que se metilaron cuatro de los grupos hidroxilo, dando un 
compuesto tetrametilado, el cual fue identificado por RMN como 5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-
tetrametoxiflavona, el cual se obtuvo con un rendimiento del 36.3%, siendo posible determinar el 
estudio de inhibición sobre la tirosinasa. 
 Ecuación de la recta Km (mM) Vmax (U/mL)
Ausencia de inhibidor 
y = 0.2468x + 1.0895 
R2 = 0.9729 
0.2265 0.9179 
*0.05 mM de 
5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona 
y = 0.2616x + 1.0568 
R2 = 0.9721 
0.2475 0.9463 
* 0.1 mM de 
5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona 
y = 0.2916x + 1.0874 
R2 = 0.9581 
0.2682 0.9196 
0.15 mM de 
5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona 
y = 0.6681x + 0.8676 
R2 = 0.9973 
0.77 1.1526 
0.1 mM de 
5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona 
y = 0.7536x + 1.1674 
R2 = 0.9713 
0.6455 0.8566 
0.25 mM de 
5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona 
y = 1.1458x + 0.7703 
R2 = 0.9859 
1.4875 1.2982 
Tabla 4. Valores de Km y Vmax para la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en presencia de 
cinco concentraciones de 5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona. 
* Concentraciones de inhibidor evaluadas no mostradas en la gráfica 6. 
55 
 
‐2
‐1
0
1
2
3
4
5
6
‐2 ‐1.5 ‐1 ‐0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
1/L ‐DOPA  (mM)
1/
V
 (U
/m
L)
S in inhibidor 0.15 mM Inhibidor
0.2 mM Inhibidor 0.25 mM Inhibidor
L ineal (S in inhibidor) L ineal (0.15 mM Inhibidor)
L ineal (0.2 mM Inhibidor) L ineal (0.25 mM Inhibidor)
 
Gráfica 6. Actividad de la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en presencia 
de 0.15, 0.2 y 0.25 mM de 5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona. 
 
 
 
 
56 
 
Se observa que a concentraciones menores de 0.1 mM los valores de Km y Vmax (tabla 4) no se 
observa claramente el tipo de inhibición, incluso en su representación gráfica sus rectas se 
sobreponen con la recta sin inhibidor y no muestran una diferencia significativa en sus 
actividades (razón por la cual no se incluyen en la gráfica 6), sin embargo a concentraciones 
mayores de 0.1 mM se observa la variación de los valores de Km y en cambio los valores Vmax 
son casi constantes. La aparente intersección de las rectas en el eje de las “ordenadas” (1/V), nos 
propone de forma mas clara un tipo de inhibición competitiva para el 5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-
tetrametoxiflavona en la actividad de la tirosinasa. 
 
 4.2.5 4’-metilpenduletina. 
Para el caso de la 4’-metilpenduletina aislada de Brickellia paniculata, se probaron solo dos 
concentraciones, 0.1 y 0.15 mM, esto debido a que a concentraciones altas del inhibidor este es 
poco soluble en agua, formando una turbidez que interfiere con la medición de la absorbencia y 
por el contrario a concentraciones bajas no se observa una variación en los valores de Km y Vmax y 
por lo tanto no se puede identificar el tipo de inhibición. 
 Ecuación de la recta Km (mM) Vmax (U/mL)
Ausencia de inhibidor 
y = 0.2468x + 1.0895 
R2 = 0.9729 
0.2265 0.9179 
0.1 mM de 4´-metilpenduletina 
y = 0.3902x + 1.0263 
R2 = 0.9472 
0.3802 0.9743 
0.15 mM de 4´-metilpenduletina 
y = 0.5295x + 1.1616 
R2 = 0.9407 
0.4558 0.8609 
Tabla 5. Valores de Km y Vmax para la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en presencia de 
dos concentraciones de 4’-metilpenduletina. 
 
57 
 
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
‐2 ‐1 0 1 2 3 4
1/ L ‐DOPA  (mM)
1/
 V
  (
U
/m
L)
S in Inhibidor 0.1 mM Inhibidor
0.15 mM Inhibidor L ineal (S in Inhibidor)
L ineal (0.1 mM Inhibidor) L ineal (0.15 mM Inhibidor)
Gráfica 7. Actividad de la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en presencia 
de 0.1 y 0.15 mM de 4’-metilpenduletina. 
 
De tal forma que si observamos la gráfica 7, donde se observan las rectas con inhibidor y sin él, 
la intersección es cercana al eje de las “ordenadas” (1/V), esto junto con los valores numéricos de 
Vmax constantes y Km mas dispersos (tabla 5), evidencian una inhibición del tipo competitivo para 
la 4´-metilpenduletina. 
 
 
58 
 
4.2.6 Santina. 
‐3
‐1
1
3
5
7
9
‐2 ‐1 0 1 2 3 4
1/ L ‐DOPA  (mM)
1/
 V
  (
U
/m
L)
S in Inhibidor 0.05 mM Inhibidor
0.1 mM Inhibidor 0.2 mM Inhibidor
0.3 mM Inhbidor L ineal (S in Inhibidor)
L ineal (0.05 mM Inhibidor) L ineal (0.1 mM Inhibidor)
L ineal (0.2 mM Inhibidor) L ineal (0.3 mM Inhbidor)
Gráfica 8. Actividad de la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en presencia 
de 0.05, 0.1, 0.2 y 0.3 mM de santina. 
 
En el caso de la santina aislada de Tanacetum parthenium a concentraciones de 0.05 y 0.1 mM se 
observa solo un pequeño cambio en los parámetros de Vmax y Km, sin embargo a concentraciones 
mayores de 0.1 mM (tabla 6), se observa mas claramente el aumento en los valores de Km y una 
variación pequeña en los valores de Vmax. Por otra parte a estas concentraciones la intersección de 
59 
 
las rectas (gráfica 8) son mas cercanas al eje de las “ordenadas” (1/V), por lo que el efecto de la 
santina sobre la tirosinasa, se contempla como una inhibición del tipo competitivo. 
 Ecuación de la recta Km (mM) Vmax (U/mL) 
Ausencia de inhibidor 
y = 0.2468x + 1.0895 
R2 = 0.9729 
0.2265 0.9179 
0.05 mM de Santina 
y = 0.3333x + 1.073 
R2 = 0.9899 
0.3103 0.9319 
0.1 mM de Santina 
y = 0.3984x + 1.1434 
R2 = 0.9951 
0.3484 0.8746 
0.2 mM de Santina 
y = 1.3816x + 0.7568 
R2 = 0.9837 
1.8256 1.3214 
0.3 mM de Santina 
y = 2.159x + 1.2299 
R2 = 0.9566 
1.7554 0.8131 
Tabla 6. Valores de Km y Vmax para la tirosinasa en ausencia de inhibidor y en 
presencia de cuatro concentraciones de santina. 
 
 
4.3 Determinación del IC50. 
Para la determinación del IC50 en cada uno de los inhibidores las concentraciones que se probaron 
fueron diferentes entre sí (gráfica 9), esto debido principalmente a dos razones: 
La primera, la solubilidad en medio acuoso de las muestras en algunos de estos casos era baja, 
por lo que a concentraciones relativamente altas de cada uno de estos inhibidores, la turbidez en 
el medio hacían poco confiable la medición espectrofotométrica, tal es el caso de la 4’-
metilpenduletina, la 5-hidroxi-3, 7, 3’, 4’-tetrametoxiflavona y el pentaacetato de quercetina, que 
a concentraciones mayores de 0.15, 0.3 y 0.25 mM respectivamente, mostraron dificultad en su 
solubilidad y por lo tanto no se probaron concentraciones mayores. La segunda razón por la cual 
los inhibidores se probaron a diferentes concentraciones fue la tendencia que cada uno de ellos 
60 
 
mostraba; por ejemplo, para el caso de la quercetina y la santina, a concentraciones de 0.2 y 0.5 
mM respectivamente ya se había logrado alcanzar el IC50, mientras que para el caso