Inhibicion-de-la-actividad-enzimatica-de-la-oxido-nitrico-sintasa-inducible-y-de-la-NADPH-oxidasa-en-la-nefrotoxicidad-inducida-por-cisplatino

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
 
 
Facultad de Química 
 
PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO 
EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS 
 
 
 
 
INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA 
OXIDO NÍTRICO SINTASA INDUCIBLE Y DE LA NADPH 
OXIDASA EN LA NEFROTOXICIDAD INDUCIDA POR 
CISPLATINO. 
 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTORA EN 
CIENCIAS BIOQUÍMICAS 
 
P R E S E N T A 
M en C YOLANDA IRASEMA CHIRINO LÓPEZ 
 
ASESOR: DR. JOSÉ PEDRAZA CHAVERRÍ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MÉXICO, D.F Enero 2008 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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 Esta tesis se realizó en el laboratorio 209 del edificio F de la Facultad de 
Química en al Universidad Nacional Autónoma de México con el apoyo de la DGAPA 
(IN227103 e IN228206-3) y PAPIIT (IN207007). 
 
 
 El jurado asignado para obtener el grado de Doctora en Ciencias Bioquímicas 
fue el siguiente: 
 
 
Presidente: Dra. Victoria Chagoya de Sánchez 
 
Vocal: Dr. Rogelio Hernández Pando 
 
Secretario: Dr. Armando Tovar Palacio 
 
Suplente: Dr. Julio Morán Andrade 
 
Suplente: Dra. María Elena Ibarra Rubio 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A FELIPE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Esta tesis fue realizada en tiempo en que los poderes fácticos 
dirigen al país; tiempo en que los asesinatos perpetrados por criminales han 
cobrado miles de víctimas; tiempo en que los salarios de los servidores 
públicos llegan a cifras obscenas; tiempo en que todo México es territorio del 
hombre más rico del mundo; tiempo en que los noticiarios encubren la 
profunda desigualdad que segrega a nuestra sociedad; tiempo en que los 
gobernantes preciosos atropellan los derechos humanos sistemáticamente, 
usando al aparato gubernamental como guarida para cometer los más 
impunes crímenes; tiempo en que los periodistas comprometidos con la 
verdad son acosados por los dueños del dinero para impedir la divulgación 
de sus abusos y son asesinados por mafias protegidas por el poder 
económico y político; tiempo en que las masacres más terribles de nuestra 
historia moderna permanecen como el testimonio de la aberración que 
encarna nuestro sistema político; tiempo de fraudes y mentiras masivas; 
tiempo de protección absoluta a las redes pederastas; tiempo de alza 
incontrolable de precios; tiempo de desempleo; tiempo de malos presagios… 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Abreviaturas 
 
 
 
OH Radical hidroxilo. 
1400W N-(3-(aminometil)benzil)acetamida. 
3-NT 3-nitrotirosina. 
4-HNE 4-hidroxinonenal. 
BUN Nitrógeno de urea en sangre. 
CAT Catalasa 
DMTU Dimetiltiourea. 
eNOS Óxido nítrico sintasa endotelial. 
ERO Especies reactivas derivadas de oxígeno. 
GMPc Guanosina-3',5'-monofosfato cíclico. 
GPx Glutatión peroxidasa. 
GR Glutatión reductasa. 
GSH Glutatión reducido. 
GSSG Glutatión oxidado. 
GST Glutatión S- transferasa. 
H2O2 Peróxido de hidrógeno. 
HOCl Ácido hipocloroso. 
iNOS Óxido nítrico sintasa inducible. 
KIM-1 Molécula de daño renal 1. 
LDL Lipoproteínas de baja densidad. 
L-NAME NG-nitro-L-arginina metil ester. 
MDA Malondialdehído. 
MPO Mieloperoxidasa. 
NAG N-acetil-β-D-glucosaminidasa. 
nNOS Óxido nítrico sintasa neuronal. 
NO Óxido nítrico. 
NO2¯ Nitritos 
NO3¯ Nitratos. 
NOS Óxido nítrico sintasa. 
O2 - Anión superóxido. 
ONOO¯ Peroxinitrito 
PAS Tinción con ácido peryódico. 
SOD Superóxido dismutasa. 
SS Solución salina. 
TBARS Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico. 
XO 
 
Xantina oxidasa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMEN 
 
 
 
Antecedentes. El cisplatino es un fármaco usado en el tratamiento de diferentes tipos de 
cáncer, sin embargo, entre el 20 y 30% de los pacientes que reciben este tratamiento 
presentan efectos nefrotóxicos que obligan a suspender el tratamiento. El mecanismo por 
el cual se observan estos efectos aún no está completamente descrito pero se ha 
demostrado que el uso de diferentes antioxidantes y atrapadores de especies reactivas 
derivadas de oxígeno y nitrógeno participan en dicho efecto. En nuestro laboratorio 
previamente encontramos que el peroxinitrito (ONOO¯) forma parte de las especies 
responsables del mecanismo de nefrotoxicidad, especie formada por la reacción entre el 
óxido nítrico (NO ) y el anión superóxido (O2 ¯). 
 
Planteamiento del problema. Debido a que el ONOO¯ es en parte responsable del daño 
renal inducido por cisplatino, es posible que este aumento se deba al incremento en la 
síntesis de sus precursores. Para conocer si está hipótesis es verdadera se utilizó el 
1400W, un inhibidor selectivo de la actividad óxido nítrico sintasa inducible, enzima 
responsable de la síntesis de NO bajo condiciones de estrés oxidativo. Además, se utilizó 
apocinina, un inhibidor enzimático de la NADPH oxidasa, enzima responsable de la 
síntesis de O2 ¯, para conocer el papel de este anión tras la administración de cisplatino. 
 
Objetivo. Determinar el papel del NO derivado de la iNOS y del O2 ¯, derivado de la 
NADPH oxidasa en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino. 
 
Diseño experimental. Para conocer el efecto del 1400W se utilizaron ratas macho de la 
cepa Wistar y se dividieron aleatoriamente en 4 grupos: 1) control, 2) 1400W, 3) Cisplatino 
y 4) Cisplatino+1400W. El grupo 1 recibió una inyección intraperitoneal (ip) de solución 
salina; el grupo 2 recibió 1400W (5 mg/Kg/día) vía subdérmica; el grupo 3 recibió una 
dosis única de cisplatino (7.5 mg/Kg); el grupo 4 recibió la misma dosis de cisplatino que 
el grupo 3 y la misma dosis de 1400W que el grupo 2. Para conocer el efecto de la 
apocinina se utilizó la misma cepa de animales y se dividieron aleatoriamente en los 
siguientes grupos: el grupo 1 recibió una inyección intraperitoneal (ip) de solución salina; 
el grupo 2 recibió apocinina (2g/L) en el agua de beber durante 11 días; el grupo 3 recibió 
una dosis única de cisplatino (7.5 mg/Kg); el grupo 4 recibió la misma dosis de apocinina 
que el grupo 2 durante 7 días y en el día 8 recibió la misma dosis de cisplatino que el 
grupo 3, posteriormente siguió recibiendo apocinina durante 3 días más. Todos los 
animales fueron colocados en jaulas metabólicas durante todo el estudio para la 
recolección de orina y fueron sacrificados 72 h después de la administración de cisplatino 
para obtener muestras de riñón y suero. 
 
Resultados. La administración de cisplatino indujo un aumento en la expresión de la 
iNOS. Además se encontró un aumento en la proteinuria, nitrógeno de urea en sangre 
(BUN), creatinina plasmática así como en la expresión de la molécula de daño renal 1, 
una proteína utilizada como marcador de daño renal, y una disminución en la depuración 
de creatinina además de alteraciones morfológicas en corteza y médula renal. También se 
encontró un aumento en la inmunorreactividad para macrófagos/monocitos, la cual 
representa un marcador de infiltrado túbulointersticial. Además estos animales 
presentaron un aumento en la cantidad de malondialdehído (MDA) en corteza renal y un 
aumento en la presencia de 3-nitrotirosina (3-NT) y 4-hidroxinonenal (4-HNE) en corteza y 
médula renal, los cuales son marcadores de estrés oxidativo (MDA y 4-HNE) y estrés 
nitrosativo (3-NT). La inhibición selectivade la actividad enzimática de la iNOS con 
1400W previno las alteraciones debidas a la administración de cisplatino. Por otra parte, 
la inhibición de la actividad enzimática de la NADPH oxidasa mediante la administración 
de apocinina previno el aumento de proteinuria, BUN, creatinina sérica, excreción urinaria 
de N-acetil-β-D-glucosaminidasa y de glutatión transferasa, MDA renal y de 3-NT y 4-HNE 
en corteza y medula renal. 
 
Conclusión. La inhibición selectiva de la actividad de la iNOS y de la NADPH oxidasa 
previenen los efectos nefrotóxicos asociados a la administración de cisplatino, sugiriendo 
que tanto el NO como el O2 ¯ son especies que participan de manera importante en el 
mecanismo de daño renal. 
 
CONTENIDO 
 
 
1. Introducción 5 
1.1 Cisplatino 5 
1.2 Evidencias de la participación de estrés oxidativo en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino 7 
1.3 Evidencias de la participación de estrés nitrosativo en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino 11 
1.4 Papel del NO en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino 13 
1.5 Inhibición selectiva de la iNOS 14 
1.6 Inhibición selectiva de la NADPH oxidasa 15 
2. Justificación 17 
3. Hipótesis 17 
4. Objetivo 18 
5. Metodología 19 
5.1 Diseño experimental para la evaluación de 1400W 19 
5.2 Diseño experimental para la evaluación de apocinina 19 
5.3 Determinación de la función renal 20 
5.4 Análisis histológico 20 
5.5 Expresión de iNOS y KIM-1 21 
5.6 Lipoperoxidación 22 
5.7 Análisis inmunohistoquímico de estrés oxidativo 22 
5.8 Análisis estadístico 23 
6. Resultados 24 
6.1 Papel del NO en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino 24 
6.1.1 Expresión de la Inos 24 
6.1.2 Evaluación de la función renal 24 
6.1.3 Evaluación histológica 25 
6.1.4 Evaluación del infiltrado túbulointersticial 26 
6.1.5 Evaluación del estrés oxidativo y nitrosativo 28 
6.2 Papel del O2 ¯en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino 30 
6.2.1 Evaluación de la función renal 30 
6.2.2 Evaluación histológica 30 
6.2.3 Evaluación del estrés oxidativo y nitrosativo 32 
7. Discusión 34 
8. Conclusión 37 
9. Referencias 38 
10. Artículos publicados 43 
 
 4
1. INTRODUCCION 
 
1.1 Cisplatino 
 La molécula de cisplatino fue sintetizada en 1844 por Michele Peyrone en Turín, Italia 
y fue hasta 1892, en Zurich, Suiza, cuando Alfred Werner determinó su configuración 
(Werner et al., 1893). La actividad antineoplásica de la cisplatino (Fig. 1) se reportó por 
primera vez en 1965 en la Universidad de Michigan por Barnett Rosenberg (Rosenberg et al., 
1965). Después de un gran número de estudios en modelos tumorales en roedores, perros y 
monos en abril de 1971 se trató el primer paciente con cisplatina en Texas (Rosenberg, 
1985). Posteriormente se determino, mediante estudios de rayos X y resonancia magnética 
nuclear, entre otros, que el mecanismo molecular por medio del cual el cisplatino ejerce sus 
efectos citotóxicos está asociado a la formación de complejos entre el cisplatino y el ADN. La 
molécula de cisplatino puede perder los cloruros y reemplazarlos por moléculas de agua 
generando una estructura con carga positiva capaz de reaccionar con el nitrógeno de la 
posición 7 de la guanina en el DNA. También pueden formarse enlaces cruzados entre el 
platino y guaninas adyacentes y enlaces cruzados que ocurren con menor frecuencia 
(Jamieson and Lippard, 1999). 
 
Pt
ClCl
H3N NH3
Cis-diaminodicloroplatino (II)
 
Fig. 1. Estructura química del cisplatino, un antineoplásico usado desde 
hace más de 30 años contra diferentes tipos de cáncer. 
 
Debido a sus propiedades citotóxicas, actualmente el cisplatino se sigue empleando 
contra una gran variedad de tumores, entre ellos el de testículo, ovario, pulmón, cabeza y 
cuello. Sin embargo, la nefrotoxicidad es el efecto secundario más importante y se presenta 
en aproximadamente 25% de los pacientes que reciben el tratamiento (Daugaard and 
Abildgaard, 1989). 
 1
Por otra parte, estudios farmacocinéticos en humanos indican que el 90% del 
cisplatino administrado se une a proteínas con una vida media de 25 a 49 minutos y una vida 
media secundaria de 58 a 73 horas (Weiner and Jacobs, 1983). De 27 a 45% del cisplatino 
es principalmente excretado a través de los riñones dentro de los primeros 5 días posteriores 
a su administración y es precisamente éste órgano el que presenta mayor contenido 
causando efectos nefrotóxicos (Kawai et al., 2005). La nefrotoxicidad es un evento 
secundario a la acumulación de cisplatino en los riñones, específicamente en los segmentos 
S3 de los túbulos proximales (Daugaard and Abildgaard, 1989) (Fig. 2). El mecanismo por 
medio del cual entra el cisplatino a las células incluye tanto procesos de difusión a través de 
las membranas lipídicas, como transportadores de cationes orgánicos hOCT2 (Ciarimboli et 
al., 2005). Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual el cisplatino induce disfunción no 
está completamente descrito (Xiao et al., 2003; Ali and Al Moundhri, 2006), pero existe 
evidencia de que el estrés oxidativo y nitrosativo están fuertemente asociados a la disfunción 
renal. 
 
 
Fig. 2. Tinción con ácido peryódico de 
corteza renal de un animal que recibió 
una dosis de 7.5 mg/Kg/ip de cisplatino. 
Se pueden apreciar zonas necróticas en 
los túbulos proximales, así como la 
formación de vacuolas. También se 
muestra la presencia de cilindros, 
formados principalmente por proteínas 
como consecuencia del daño tubular. El 
glomérulo no muestra alteraciones 
estructurales. 100X. 
 
 
 
 
 
1.2 Evidencias de la participación de estrés oxidativo en la nefrotoxicidad 
inducida por cisplatino. 
 
El primer reporte de nefrotoxicidad asociada a la administración de cisplatino se 
presentó 5 años después del comienzo de su uso. Desde entonces se han realizado un gran 
número de estudios para tratar de conocer el mecanismo por el cual ejerce dicho efecto. Los 
 2
primeros análisis describen alteraciones en la función renal que incluyen aumento en los 
productos nitrogenados en sangre como creatinina y nitrógeno de urea (BUN). Además se 
han realizado numerosos estudios que demuestran que el estrés oxidativo está directamente 
relacionado a la nefrotoxicidad. El estrés oxidativo puede definirse como un desequilibrio 
entre la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) y las defensas antioxidantes 
(Betteridge, 2000). Este desequilibrio se puede generar por una producción excesiva de 
ERO, por una disminución de las defensas antioxidantes o por una combinación de ambas. 
Por otra parte, las ERO son moléculas químicamente reactivas derivadas de oxígeno y este 
término incluye a metabolitos de oxígeno que pueden o no ser radicales libres y que tienen 
funciones fisiológicas definidas. Entre las principales ERO, que son radicales libres se 
encuentran el anión superóxido (O2 -) y el radical hidroxilo ( OH), mientras como ejemplo de 
los no radicales se encuentra el peróxido de hidrógeno (H2O2). Las ERO pueden formarse 
por la reducción univalente del oxígeno dentro de la célula y su sobreproducción resulta en 
un efecto tóxico para la célula ya las éstas son especies con capacidad de oxidar un gran 
número de biomoléculas, entre las que se encuentran el DNA, proteínas, lípidos y 
carbohidratos. La tabla 1 muestra algunas de las características de algunas ERO. Además, 
existen enzimas cuya actividad genera ERO como O2 - entre las que se encuentran la 
xantina oxidasa (XO), la óxido nítrico sintasa (NOS), la lipooxigenasa y la NADPH oxidasa 
(Betteridge, 2000; Fridovich, 1999). Existen algunas otras enzimas que generan otras 
especies oxidantes, entre las que se encuentra la mieloperoxidasa (MPO), enzima presente 
en neutrófilos y macrófagos. Esta enzima es responsable de la producción de ácido 
hipocloroso (HOCl) a partir de H2O2 (Winterbour et al., 2000). 
 
Tabla 1. Característicasde algunas especies reactivas de oxígeno. 
Especie reactiva derivada de 
oxígeno (ERO) 
Características 
Anión superóxido (O2
-) Se forma espontáneamente en medios aerobios, por ejemplo, en la cadena 
de transporte de electrones en la mitocondria por la adición de un electrón al 
oxígeno molecular. Este radical tiene la capacidad de reaccionar con los 
lípidos. 
Peróxido de hidrógeno (H2O2) Se forma entre otras vías, por adición de 1 electrón y 2 protones al O2
-. El 
H2O2 no es un radical libre pero puede atravesar membranas biológicas y por 
lo tanto difundir a muchos organelos. Puede dar lugar a la formación de OH 
mediante reacciones tipo Fenton. 
Radical hidróxilo ( OH) El OH es una molécula altamente reactiva capaz de inducir mayor daño en 
los sistemas biológicos con respecto a otras ERO. Esta especie puede ser 
producida por la adición de un electrón al H2O2 o bien a partir de una reacción 
tipo Fenton. El OH tiene la capacidad de reaccionar con biomoléculas como 
 3
el DNA, proteínas, lípidos y carbohidratos. 
 
Esta producción de ERO dentro de una célula ocurre tanto en forma normal como en 
condiciones fisiopatológicas, sin embargo existen mecanismos antioxidantes enzimáticos y 
no enzimáticos para mantener un balance fisiológico en las ERO producidas. Entre los 
sistemas enzimáticos antioxidantes se encuentran enzimas como la superóxido dismutasa 
(SOD), la cual pertenece a una familia de metaloenzimas que catalizan la conversión del O2 - 
a H2O2 y a oxígeno molecular. La catalasa (CAT) que es una hemoproteína tetramérica que 
cataliza la formación de agua y oxígeno a partir de H2O2 y la glutatión peroxidasa (GPx) que 
cataliza la descomposición del H2O2 o de otros peróxidos orgánicos a H2O utilizando glutatión 
reducido (GSH), que se transforma en glutatión oxidado (GSSG). El GSSG a su vez es 
reducido a GSH por la glutatión reductasa (GR) en presencia de NADPH impidiendo así que 
se agoten las reservas de GSH (Harris, 1992; Ichikawa et al., 1994). El NADPH, a su vez, es 
regenerado por acción de la enzima málica y de la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. 
Además de los sistemas enzimáticos, la célula cuenta con sistemas no enzimáticos que 
pueden actuar de diferentes formas. Por ejemplo, un antioxidante no enzimático puede tener 
la capacidad de reducir compuestos oxidados, puede prevenir la lipoperoxidación o participar 
como cofactor de reacciones enzimáticas antioxidantes. Un ejemplo de estas moléculas es el 
GSH, un tripéptido compuesto por cisteína, glicina y glutamato (Meister y Tate, 1976). Este 
se sintetiza endógenamente (Dalton et al., 2004) además de obtenerse a través de la dieta. 
Otro ejemplo es el ácido ascórbico, una vitamina hidrosoluble que no es posible sintetizar 
endógenamente en el humano por lo que se adquiere a través de la dieta. Otro es el ácido 
ascórbico que ejerce sus propiedades antioxidantes atrapando ERO como el O2 - y evitando 
la oxidación de diversas biomoléculas como proteínas y lípidos. Otra de sus propiedades es 
regenerar al α-tocoferol (Buettner, 1993) y prevenir la oxidación de las lipoproteínas de baja 
densidad (LDL) (Kojo, 2004). Su consumo está asociado a la disminución de estrés oxidativo 
en humanos sanos (Sanchez-Moreno et al., 2004). El α-tocoferol es una vitamina liposoluble 
que no se sintetiza endógenamente y debe ser obtenida a través de la dieta. Esta vitamina 
tiene la capacidad de prevenir la lipoperoxidación en diversos modelos donde está 
involucrado el estrés oxidativo (McArdle et al., 2004; Zhu et al., 2000; Ibrahim et al., 1999) 
además al evitar la oxidación de las LDL (Terentis et al., 2002), disminuye la susceptibilidad 
al desarrollo de aterogénesis. Otros antioxidantes no enzimáticos son los carotenoides, una 
familia de pigmentos presentes en frutas y vegetales, formados por largas cadenas 
 4
hidrocarbonadas con dobles enlaces conjugados y son considerados antioxidantes debido a 
su capacidad para atrapar singulete de oxígeno además de ejercer efectos anticancerígenos 
debido a su capacidad para interactuar con otros radicales (Krinsky, 1989). 
 Una de las estrategias más usadas para evaluar la participación del estrés oxidativo en 
diversos modelos experimentales es precisamente el uso de antioxidantes, la medición de la 
expresión de enzimas antioxidantes así como la medición de marcadores de estrés oxidativo, 
entre los que se encuentran marcadores de daño a lípidos, a proteínas y a ADN. Estas 
estrategias han sido empleadas para investigar si el estrés oxidativo se encuentra 
involucrado en los mecanismos nefrotóxicos de diferentes modelos experimentales. Entre los 
hallazgos se encuentra una disminución de 29% en los niveles renales de GSH en ratas de la 
cepa Wistar 24 horas después de ser tratadas con una dosis única de cisplatino (5 mg/Kg/ip), 
así como un incremento del 29% en lipoperoxidación medido como sustancias reactivas al 
ácido tiobarbitúrico (TBARS) (Silva et al., 2001). Por otra parte, estudios realizados en ratas 
Swiss en donde se administró una dosis única de cisplatino (7.5 mg/Kg/ip), demostraron que 
esta dosis provoca una disminución en la actividad de enzimas antioxidantes como GPx y 
CAT, una disminución en los niveles de GSH y un aumento en malondialdehído (MDA), un 
marcador de lipoperoxidación (Mansour et al., 2002). Por otra parte, Bolaman y 
colaboradores (2004) demostraron que la administración de cisplatino induce un decremento 
en la actividad de enzimas antioxidantes como CAT, SOD y GR. Este estudio también 
demostró que la administración de cisplatino induce un aumento de MDA y de H2O2 en riñón 
(Bolaman et al., 2004). El uso de antioxidantes como deferoxamina (250 mg/Kg/ip), vitamina 
C (100 mg/Kg/ip) y vitamina E (100 mg/Kg/ip) en ratas que habían recibido la misma dosis de 
cisplatino previno la disminución de la actividad de SOD y el aumento de MDA y de H2O2 
(Bolaman et al., 2004). Ulubas y colaboradores (2003) demostraron que la administración de 
una dosis única de cisplatino (6 mg/Kg/ip) induce un aumento en BUN, creatinina en suero y 
MDA en riñón, así como una disminución en la actividad de SOD y CAT. Estos efectos se 
previnieron con la administración de ácido acetilsalicílico (2.5 mg/Kg/ip) (Ulubas et al., 2003). 
La administración de una dosis única de cisplatino (8 mg/Kg/iv) en ratas Sprague-Dawley 
induce un aumento en creatinina en suero y BUN así como alteraciones morfológicas que 
incluyen necrosis en los segmentos S1, S2 y S3 de los túbulos proximales. La administración 
de dimetiltiourea (DMTU) (500 mg/Kg/ip) una hora antes de la administración de cisplatino y 
posteriormente cada 12 horas durante 5 días, previene las alteraciones mencionadas 
(Tsuruya et al., 2003). 
 5
 Estos son sólo algunos ejemplos de los estudios que han demostrado que la 
administración de cisplatino induce nefrotoxicidad en sistemas in vivo y que está asociada 
con un aumento de estrés oxidativo, que incluye disminución del sistema antioxidante 
enzimático (SOD, CAT, GPx y GR) y no enzimático (GSH) y aumento en marcadores de 
estrés oxidativo (MDA y TBARS). La administración de compuestos antioxidantes como la 
deferoxamina, la vitamina C, la vitamina E y el ácido acetilsalicílico es capaz de prevenir las 
alteraciones inducidas por la administración de cisplatino. El mecanismo por medio del cual 
ejercen sus efectos está directamente relacionado con sus capacidades antioxidantes. Por 
ejemplo, la deferoxamina es un quelante de hierro, lo cual sugiere que su capacidad para 
prevenir alteraciones asociadas a la administración de cisplatino se debe al bloqueo de 
reacciones involucradas en la generación de radicales libres dependientes de hierro. 
Además, estudios in vitro han demostrado que la deferoxamina puede reaccionar con O2 - y 
OH (Halliwell, 1989). La vitamina C previene alteraciones debidas a la administración de 
cisplatino, propiedad atribuible a su capacidad para atrapar O2 -y con ello evitar la oxidación 
de proteínas y lípidos. Por su parte los efectos observados tras la administración de vitamina 
E son atribuibles a su capacidad para prevenir la lipoperoxidación. Esta condición es de 
suma importancia ya que al evitar la lipoperoxidación se preservan las membranas, tanto de 
de la célula como de organelos internos. Otro compuesto que mostró conferir protección 
frente al reto oxidativo inducido por la administración de cisplatino fue el ácido acetilsalicílico, 
el cual es capaz de atrapar O2 - (Taubert et al., 2004). La capacidad del DMTU para prevenir 
las alteraciones inducidas por cisplatino sugiere que el OH es un mediador de gran 
importancia en el daño renal inducido por cisplatino. Específicamente se observó que el 
DMTU previene el aumento de productos nitrogenados y necrosis en los segmentos 
tubulares. 
 Estos experimentos demuestran no sólo que el estrés oxidativo está involucrado en la 
nefrotoxicidad inducida por cisplatino, sino que participa activamente en los procesos de 
nefrotoxicidad. Además, se han realizado diversos estudios en sistemas in vitro que han 
permitido profundizar en el conocimiento de las ROS involucradas en el daño celular en este 
modelo. Por ejemplo, en cultivos primarios de células del túbulo proximal de conejo, la 
exposición de cisplatino 2 mM induce necrosis mientras que una concentración de 50 μM 
induce apoptosis. Es posible prevenir la necrosis de estas células con la administración de 
tirón, un compuesto capaz de atrapar O2 -, así como por la administración de CAT y piruvato, 
 6
ambos detoxificadores de H2O2. La DMTU y la tiourea, atrapadores de OH, no tuvieron 
efecto en la necrosis inducida por cisplatina. La apoptosis se previene parcialmente por la 
administración de tirón y DMTU pero no por la de antioxidantes y detoxificadores de H2O2 
(Baek et al., 2003). Estos experimentos proponen que el H2O2 participa en la necrosis 
mientras que el OH participa en la apoptosis, siendo el O2 - común para ambos tipos de 
muerte celular. 
 
1.3 Evidencias de la participación de estrés nitrosativo en la nefrotoxicidad 
inducida por cisplatino. 
 
La información anterior apoya los resultados de experimentos in vivo que demuestran la 
participación del estrés oxidativo en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino, sin embargo, 
existe poca información sobre el papel de especies reactivas derivadas de nitrógeno. Entre 
estas últimas, el peroxinitrito (ONOO¯) es una de las de mayor importancia biológica debido 
a que una de las características que lo hace potencialmente dañino para la célula es su 
capacidad oxidante. Además, el ONOO¯ puede difundir a través de las bicapas de 
fosfolípidos a una velocidad de 8 x 10-4 cm/s (Marla et al., 1997) lo cual favorece el ataque a 
moléculas como lípidos y proteínas. El ONOO¯ puede formarse endógenamente por la 
reacción entre el O2 - y el óxido nítrico (NO ) y como ya se mencionó anteriormente, el O2 ¯ 
puede ser producido por la adición de un electrón al oxígeno molecular o por diferentes 
enzimas como la NADPH oxidasa y XO, entre otras. Por su parte, el NO es sintetizado por la 
NOS a partir de L-arginina, O2 y NADPH. Esta enzima tiene 3 isoformas, la tipo I o neuronal 
(nNOS) y tipo III o endotelial (eNOS), que son constitutivas y están reguladas por las 
concentraciones intracelulares de calcio y la isoforma tipo II o inducible (iNOS), que es 
independiente de calcio y está regulada transcripcionalmente por citocinas como interferón γ, 
productos bacterianos como lipopolisacárido o estrés oxidativo (Kone, 2004). 
Existe evidencia de que el ONOO¯ es una especie muy oxidante que puede reaccionar 
con un amplio número de moléculas, entre las que se encuentran bases nitrogenadas como 
la guanina que es modificada a 8-nitroguanina (Szabo, 2003). El ONOO¯ también reacciona 
con algunos aminoácidos como la tirosina dando lugar a la formación de 3-nitrotirosina (3-
NT), además de reaccionar con otros aminoácidos como triptófano, cisteína y metionina. 
Estos aminoácidos al sufrir alteraciones pueden llevar a la pérdida de la función de la 
proteína en la que se encuentren. También se ha descrito que proteínas como la actina del 
 7
citoesqueleto, la tirosina hidroxilasa y la prostaciclina sintasa entre otras, son blanco de 
ONOO¯. Enzimas como la SOD, la aconitasa, la gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa y la 
creatinina cinasa también son modificadas por el ONOO¯ (Radi et al., 2001) alterando con 
ello la funcionalidad de la célula. Además, el ONOO¯ puede oxidar moléculas de interés 
biológico como la tetrahidrobiopterina, un cofactor de la NOS y de la tiroxina hidroxilasa, y al 
GSH, necesario para la actividad enzimática de la GPx, además de ser una molécula 
antioxidante (Szabo, 2003). Asimismo, el ONOO¯ puede protonarse bajo condiciones 
fisiológicas (pH 7.4) para formar otras especies reactivas derivadas de nitrógeno (ERN) como 
el ácido peroxinitroso y éste, a su vez, puede descomponerse en OH y radical dióxido de 
nitrógeno (Radi et al., 2001). 
La capacidad para generar otros radicales libres así como su potencial oxidante 
convierten al ONOO¯ en una especie notablemente tóxica para la célula y es por ello que ha 
cobrado especial atención conocer su comportamiento y papel en la nefrotoxicidad inducida 
por cisplatino. Hasta el momento se ha descrito poco sobre el estrés nitrosativo en este 
modelo. La formación de 3-NT es una de las modificaciones del ONOO¯ que se han 
empleado como marcadores de estrés nitrosativo y concretamente en el modelo de 
nefrotoxicidad inducida por cisplatino existen varios reportes del aumento en la nitración de 
proteínas. En nuestro laboratorio específicamente encontramos un aumento en la 
inmunotinción de 3-NT en riñones de ratas que recibieron 7.5 mg/Kg/ip de cisplatino y se 
sacrificaron 3 días después. Por otra parte, la administración de FeTPPS, una metaloporfirina 
que participa en la conversión de ONOO¯ a nitratos (NO3-) (Misko et al., 1998), disminuye 
parcialmente no sólo el aumento en la formación de 3-NT en riñón, sino también las 
alteraciones nefrotóxicas inducidas por la administración de cisplatino (Chirino et al,. 2004). 
Lo anterior demuestra no sólo el aumento de ONOO¯ en la nefrotoxicidad inducida por 
cisplatino, sino que es responsable en parte del daño. Entonces, si hay un aumento de 
ONOO- puede deberse al aumento en la síntesis de sus precursores, ya sea de NO , de O2 ¯ 
o de ambos. El aumento de O2 ¯ en este modelo ya se ha demostrado tanto in vivo como in 
vitro mediante el uso de atrapadores de este radical como se discutió anteriormente, aunque 
no se ha precisado cuáles son las fuentes generadoras. Sin embargo, el aumento de NO y 
su papel aún es controversial en este modelo. 
 
 
 
 8
 
1.4 Papel del NO en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino. 
El NO es una molécula de gas hidrofóbico con un tiempo de vida corto pero con un alto 
coeficiente de difusión. El NO induce la activación de la guanilato ciclasa soluble, una 
hemoproteína que se encuentra en el citosol. La guanilato ciclasa produce un incremento de 
guanosina-3',5'-monofosfato cíclico (GMPc), el cual actúa como segundo mensajero (Kone, 
2004) en procesos como relajación del músculo liso, regulación de la función vascular, 
proliferación celular y transcripción, entre otras (Liang and Knox, 2000). Debido a que el NO 
es un radical libre de vida corta ha resultado difícil su detección, sin embargo, los NO3- y 
nitritos (NO3-) son productos estables del metabolismo final de NO y han sido utilizados 
como índice de su producción. 
Yildirim y colaboradores (2003) midieron mediante la reacción de Griess, los niveles 
renales de estos metabolitos después de 5 días de la administración de cisplatino (7 
mg/Kg/ip) y encontraron un aumento. Posteriormente, Ozen y colaboradores (2004) 
confirmaron este incremento en el mismo modelo. Sin embargo, Saad y colaboradores(2002) y Saleh y El-Demerdash (2005) encontraron una disminución en el contenido renal de 
estos metabolitos en el mismo modelo de nefrotoxicidad inducida por cisplatino. Existe la 
posibilidad de que el aumento o disminución de NO3─/NO2─ se deba a cambios en la síntesis 
de NO , y para probar esta hipótesis Saad y colaboradores (2002) propusieron que la 
disminución de NO3─/NO2─ podía deberse a una deficiencia en L-arginina, el sustrato de la 
NOS para la síntesis de NO . Este grupo de investigadores dio agua de beber con 1.5% de L-
arginina a ratas que recibirían cisplatino (6 mg/Kg/ip) 24 horas después (Saad et al., 2002). 
Los resultados mostraron una disminución en las alteraciones inducidas por cisplatino. Este 
mismo efecto tras la administración oral de L-arginina se observó por otro grupo de 
investigadores, quienes, además, encontraron que este tratamiento previene el incremento 
de MDA y la reducción de la actividad de GPx y CAT en riñón (Mansour et al. 2003). Estos 
resultados sugieren que el daño inducido por cisplatino podría estar asociado a la 
disminución de L-arginina, que tendría como consecuencia la disminución en la síntesis de 
NO . 
 En la nefrotoxicidad inducida por cisplatino se han reportado resultados controversiales 
con respecto al comportamiento de NO . Srivastava (1996) y colaboradores demostraron que 
en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino hay un aumento en la lipoperoxidación así como 
de la actividad de la iNOS. La administración de NG-nitro-L-arginina metil ester (L-NAME), un 
 9
inhibidor no selectivo de la NOS, reduce la toxicidad renal y la lipoperoxidación. Otros 
estudios muestran que la administración de aminoguanidina, otro inhibidor no selectivo de la 
NOS, previene la nefrotoxicidad y la lipoperoxidación así como la disminución en la actividad 
de GPx (Mansour et al., 2002). Estos resultados proponen que el NO tiene un papel tóxico 
para el riñón en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino, ya que al inhibir su síntesis se 
observan mejorías. 
Por otro lado, Saad y colaboradores (2002) encontraron en animales que habían recibido 
una dosis de cisplatino (6 mg/Kg/ip), una reducción en el contenido renal de NO3─/NO2─, 
disminución de GSH y de la actividad de GPx. La administración conjunta de 2-amino-4-
metilpiridina, un inhibidor no específico de la iNOS, a animales que habían recibido la misma 
dosis de cisplatino, indujo una extensa necrosis tubular. Saleh y El-Demerdash (2005) 
encontraron que la administración de L-NAME agrava los efectos nefrotóxicos de cisplatino. 
Lo anterior sugiere que el NO tiene un papel benéfico en riñón, ya que su inhibición resulta 
en un aumento del daño inducido por cisplatino. 
 
1.4 Inhibición selectiva de la iNOS. 
Se ha demostrado que la producción masiva de NO podría resultar en efectos tóxicos 
para la célula se han realizado diferentes estudios utilizando N-(3-
(aminometil)benzil)acetamidina (1400W), un inhibidor selectivo para la iNOS (Garvey et al. 
1997), con la finalidad de conocer su papel en diferentes modelos experimentales. Thomsen 
y colaboradores (1997) demostraron que este inhibidor previene el crecimiento de 
adenocarcinoma mamario, un tipo de células tumorales que expresan iNOS. En un modelo 
experimental de colitis aguda en ratas se demostró que la administración de 1400W reduce 
la formación de edema, la infiltración de neutrófilos y daño inflamatorio macroscópico 
(Kankuri et al., 2001). Otros datos muestran evidencia de que el 1400W atenúa el daño 
gástrico inducido por LPS (Robinson et al., 2005). 
 
H2N NH
OH
NH O
NH2
L-arginina
N
H
NH2NH
CH3
1400W
 
 
 
 
 
Fig. 3. Comparación entre la estructura del la L-arginina, sustrato de la iNOS, y del 1400W, un inhibidor 
selectivo de la misma enzima. 
 10
Sin embargo, en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino, los resultados no sólo son 
controversiales, sino que no permiten establecer cuál de las isoformas de la NOS pudiera ser 
la responsable de los efectos observados ya que en todos estos diseños experimentales se 
han empleado inhibidores no selectivos de dicha enzima. Además, la participación del 
ONOO-, el aumento de la actividad de la iNOS y de la producción de NO3─/NO2─, como el 
posible papel tóxico del NO en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino y en otros modelos, 
sugieren que el uso de un inhibidor selectivo de la iNOS, como el 1400W, podría mejorar, en 
parte, los efectos tóxicos asociados a la administración de cisplatino. 
 
1.5 Inhibición selectiva de la NADPH oxidasa. 
Actualmente se ha reportado la participación del O2 - en la nefrotoxicidad inducida por 
cisplatino en numerosos estudios, sin embargo aún no ha sido establecido el origen de este 
anión. Una de las fuentes enzimáticas de O2 - en otros modelos es la NADPH oxidasa. Esta 
enzima está presente tanto en células fagocíticas como no-fagocíticas y está compuesta por 
diferentes subunidades: gp91phox, p22phox, que están en la membrana celular, y p40phox, 
p47phox, p67phox y una proteína RAC que están en el citosol. Bajo ciertos estímulos, como por 
ejemplo infecciones bacterianas, se promueve la fosforilación de la subunidad p47phox para 
que los componentes citosólicos se trasloquen a la membrana y se active el complejo 
enzimático. En consecuencia, se produce O2 - para ejercer su efecto biológico que consiste 
en eliminar a las bacterias causantes de la infección. Sin embargo, debido a que este anión 
es tóxico, se ha reportado que alteraciones en la expresión y/o actividad de la NADPH 
oxidasa pueden participar en los mecanismo fisiopatológicos de diferentes enfermedades. 
Por ejemplo, Tojo y colaboradores (2007) reportaron un incremento en la expresión de esta 
enzima en el glomérulo y túbulos distales de ratas con nefropatía diabética, y este 
incremento está relacionado con el estrés oxidativo en estos animales (Tojo et al., 2007). Por 
otra parte, estudios realizados por Biswas y de Faria (2007) demostraron que la subunidad 
p47phox esta elevada en riñones de ratas hipertensas. Este grupo de investigadores encontró 
un incremento en la nitración de proteínas y de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina en los mismos 
animales. Estos son sólo algunos de los reportes en los que se asocia a la NADPH oxidasa 
con el estrés oxidativo y nitrosativo. Además, el aumento en la producción de O2 - conduce a 
una disminución en la disponibilidad del NO , ya que al reaccionar se forma ONOO-, especie 
oxidante y potencialmente tóxica para la célula. Es posible entonces suponer, que un 
 11
aumento en la actividad de la NADPH oxidasa favorecería los eventos tóxicos asociados a la 
administración de cisplatino y que el uso de un inhibidor de esta enzima permitiría conocer su 
papel en este modelo experimental. En este sentido, la apocinina (4-hidroxi-3-
metoxiacetofenona), un inhibidor selectivo de la NADPH oxidasa (Erdös et al., 2006; Gracia-
Sancho et al., 2007; Chan et al., 2007), representa una herramienta útil para establecer el 
papel del O2 - frente a la administración de cisplatino. Este inhibidor, ha sido empleado en 
diferentes modelos experimentales, demostrando prevenir alteraciones asociadas a la 
actividad enzimática de la NADPH oxidasa. Por consiguiente, existe la posibilidad de que el 
O2 - proveniente de la NADPH oxidasa contribuye al daño renal inducido por cisplatino, y el 
uso de la apocinina permitiría conocer cual es el papel de este anión. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Estructura de la apocinina. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 12
 
2. JUSTIFICACIÓN 
 
El cisplatino es un fármaco antineoplásico ampliamente usado en el tratamiento de 
diferentes tipos de cáncer. Sin embargo, el efecto secundario más importante de este 
fármaco es la nefrotoxicidad. Por otra parte, existe evidencia de que el estrés oxidativo es 
uno de los mecanismos estrechamente asociados a la nefrotoxicidad y se ha postulado, 
además, queel ONOO- es responsable, al menos en parte, del daño inducido por la 
administración de cisplatino en ratas macho de la cepa Wistar. Debido a que el NO y el 
O2 - son los precursores del ONOO-, es posible que la presencia de estas especies esté 
aumentada en este modelo experimental. Además, existe evidencia que sustenta que el 
NO aumenta 4 horas después de la administración de cisplatino y que hay un incremento 
de O2 - que participa en el mecanismo de daño renal inducido por cisplatino. Sin embargo, 
existe controversia sobre el papel del NO y no se conoce con precisión cuáles son las 
fuentes de O2 - tras la administración de cisplatino. 
Lo anterior justifica el estudio de la iNOS y de la NADPH oxidasa como posibles 
fuentes de NO y de O2 - , respectivamente, para elucidar el mecanismo de nefrotoxicidad 
inducida por este importante antineoplásico. 
 
 
3. HIPÓTESIS 
 
El papel del NO aún es controversial en este modelo experimental pero si su 
producción se encuentra aumentada podría ser debido al aumento en su síntesis por la 
iNOS, ya que se ha demostrado que esta enzima se induce bajo diferentes estímulos, 
entre los que se encuentra el estrés oxidativo, y específicamente, la administración de 
cisplatino. Si hay un aumento en la producción de NO debido a la inducción de la iNOS, 
la inhibición selectiva de la enzima resultaría en un efecto benéfico frente a la 
administración de cisplatino. 
Por otra parte, existen numerosos reportes de que el O2 - aumenta después de la 
administración de cisplatino, sin embargo no se conocen la fuente de este anión. Debido a 
que la NADPH oxidasa está involucrada en condiciones fisiopatológicas, es posible que la 
inhibición de esta enzima resulte en una disminución en la producción de O2 - y en 
 17
consecuencia, se observe una disminución en el daño inducido por la administración de 
cisplatino. 
 
 
4. OBJETIVO 
 
Evaluar el efecto de 1400W, un inhibidor selectivo de la iNOS, así como el efecto de la 
apocinina, un inhibidor de la NADPH oxidasa, sobre la nefrotoxicidad inducida por 
cisplatino. 
 
 18
5. METODOLOGÍA 
5.1 Diseño experimental para la evaluación de 1400W 
Se utilizaron 23 ratas macho de la cepa Wistar (230-270 g) y se mantuvieron durante 
todo el estudio en cajas metabólicas bajo condiciones de temperatura controlada (18-22 
ºC) y ciclos de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se dividieron aleatoriamente en 
los siguientes grupos: 1) grupo control (CT, n=8), al cual se le administró una dosis única 
de 1.4 mL de solución salina isotónica estéril (SS) vía intraperitoneal; 2) grupo 1400W el 
cual recibió una dosis de 5 mg/Kg de 1400W (László y Whittle, 1997) en una solución de 
52.05 mg/mL (0.2 M) de SS en una bomba miniosmótica que libera 1 μL/h (±0.15 μL/h) vía 
subdérmica; 3) grupo cisplatino (Cis, n=8), al cual se le administró una dosis única de 7.5 
mg/Kg/ip de cisplatino (Al-Majed et al., 2003) en una solución de 1.5 mg/mL (5 mM) de SS 
y 4) grupo cisplatino+1400W (Cis+1400W, n=7), al cual se le administró una dosis única 
de 7.5 mg/Kg/ip de cisplatino y, además, la misma dosis y vía de administración del 
1400W. Para colocar la bomba miniosmótica se anestesiaron a los animales con 
pentobarbital sódico (30 mg/Kg/ip) y se realizó una incisión de 1 cm en la parte dorsal de 
cada animal para colocar la bomba intradérmicamente cerrando la incisión mediante 
sutura. La bomba colocada tiene una capacidad de 200 μL y se mantuvo durante las 72 
horas del estudio. Después de cada tratamiento, los animales se mantuvieron en cajas 
metabólicas para la recolección de orina. Durante todo el estudio los animales recibieron 
agua y alimento ad libitum. 
 
5.2 Diseño experimental para la evaluación de apocinina 
Se utilizaron 40 ratas macho de la cepa Wistar (240-260 g) y se mantuvieron durante 
todo el estudio en cajas metabólicas bajo condiciones de temperatura controlada (18-22 
ºC) y ciclos de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se dividieron aleatoriamente en 
los siguientes grupos: 1) grupo control (CT, n=10), al cual se le administró una dosis única 
de 1.4 mL de solución salina isotónica estéril (SS) vía intraperitoneal; 2) grupo apocinina 
(Apo, n=10) el cual recibió 2 g/L de apocinina en el agua de beber (Pech et al., 2006) 
recibiendo una dosis de 240 mg/Kg de peso ya que bebieron aproximadamente 30 mL por 
día; 3) grupo cisplatino (Cis, n=10), al cual se le administró una dosis única de 7.5 
mg/Kg/ip de cisplatino (Al-Majed et al., 2003) en una solución de 1.5 mg/mL (5 mM) de SS 
y 4) grupo cisplatino+apocinina (Cis+Apo, n=10), al cual se le administró una dosis única 
de 7.5 mg/Kg/ip de cisplatino, además de recibir apocinina en el agua de beber. Los 
 19
grupos Apo y Cis+Apo recibieron la apocinina en el agua de beber una semana antes del 
inicio del estudio y durante las 72 horas posteriores a la administración de cisplatino. 
Los animales de los 8 grupos se mantuvieron en cajas metabólicas recibiendo 
alimento y agua ad libitum durante todo el estudio. Durante las últimas 24 horas del 
estudio se recolectó orina de cada rata para determinaciones posteriores. 72 horas 
después del inicio del tratamiento, los animales se anestesiaron con pentobarbital sódico 
(30 mg/Kg/ip) para la recolección de sangre de la aorta. Uno de los riñones extraídos de 
cada rata se seccionó y se fijó en formaldehído para obtener cortes histológicos. Se 
separaron corteza y médula renal almacenándose a –74°C. 
 
5.3 Determinación de la función renal 
La proteinuria se midió mediante turbidimetría utilizando ácido tricloroacético al 10% y 
leyendo la absorbencia de cada muestra a 420 nm. Los resultados se interpolaron en una 
curva estándar de albúmina sérica bovina al 0.1% en un intervalo de 0.04 a 0.8 mg/mL y 
el resultado se expresó como mg/ 24 h (Barrera et al., 2003). La concentración tanto de 
creatinina como de BUN se calculó mediante el uso de un estándar, de creatinina y BUN, 
respectivamente expresándose como mg/dL y se determinó mediante un analizador 
automático (Technicon RA-1000, Bayer Tarrytown, NY, USA). La depuración de creatinina 
se calculó con la siguiente fórmula: C=O*F/P, donde O es la concentración de creatinina 
en orina, F es el flujo urinario y P es la concentración de creatinina plasmática. La 
actividad enzimática de la N-acetil-b-D-glucosaminidasa se determinó mediante un 
ensayo basado en la conversión del p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminido en p-nitrofenol 
en medio alcalinol Los resultados se interpolaron en una curva de p-nitrofenol leyendo la 
absorbencia a 405 nm. Los resultados se expresaron como unidades (U) de NAG/24 h, 
en donde 1 U se define como la cantidad de enzima que libera un μmol de p-nitrofenol por 
minuto. La actividad enzimática de GST en orina se determinó mediante la reacción entre 
el GSH y el 1,cloro-2,4, diclonitrobenceno, que en presencia de la GST forma un 
conjugado que absorbe a 340 nm. Los resultados se expresaron como U/24 h, en donde 1 
U se define como la cantidad de enzima que libera 1 μmol de conjugado por minuto. 
 
 
 
 
5.4 Análisis histológico 
 20
Una sección longitudinal de uno de los riñones se fijó en una solución de formalina al 
10% y posteriormente se les dio el siguiente tratamiento: (1) un baño en etanol al 100% 
(2) un baño en etanol al 96% (3) un baño en una mezcla 1:1 de xilol-etanol y (4) dos 
baños en xilol durante 1 hora cada uno. A continuación las secciones de riñón se 
incluyeron dando 3 baños de parafina durante 1 hora cada uno. Posteriormente se 
realizaron cortes de tejido de 3 μm de espesor los cuales se desparafinaron con dos 
baños consecutivos de 3 minutos en: xilol, una mezcla 1:1 de xilol-etanol, etanol al 100%, 
etanol al 96%, agua destilada, ácido peryódico por 15 minutos y teñidos con hematoxilina 
durante 30 segundos. Posteriormente se colocó una resina sobre la muestra y finalmente 
un cubreobjetos. Pararealizar la cuantificación de los cilindros, se seleccionaron 
aleatoriamente 5 campos de corteza renal y 5 campos de médula de cada laminilla, que 
representan a cada uno de los animales. Los resultados se expresaron como porcentaje 
de túbulos positivos a la tinción con ácido peryódico (PAS). 
Para la detección de infiltrado túbulointersticial se realizó una inmunotinción en cortes 
de 3 mm de riñón con una dilución de 1:100 de anticuerpo monoclonal contra CD68, una 
proteína presente en monocitos y macrófagos, en cortes de tejido renal de 3 μm de todos 
los animales utilizados en el estudio. El anticuerpo se incubó durante 12 horas y se 
realizaron 3 lavados con amortiguador de fosfatos durante 10 minutos cada uno. 
Posteriormente las laminillas se incubaron durante 2 horas con una dilución 1:100 de 
anticuerpo secundario (IgG anti-ratón) biotinilado. Al término de la incubación se hicieron 
3 lavados con amortiguador de fosfatos durante 10 minutos cada uno. El anticuerpo unido 
al tejido se detectó mediante un sistema de revelado de avidina acoplado a una 
peroxidasa biotinilada y se utilizó diaminobencidina como sustrato de la peroxidasa. Una 
coloración café en las laminillas indica la presencia de macrófagos y/o monocitos, la cual 
indica la presencia de inflamación túbulointersticial. Se sustituyó el anticuerpo primario 
con suero de cabra como control negativo en cada grupo y todas las laminillas se 
contrastaron con hematoxilina y examinadas al microscopio. Todas las laminillas se 
trataron bajo las mismas condiciones. Se analizaron 30 campos por cada laminilla, 
excluyendo el glomérulo, a 400X de aumento. Los resultados se expresaron como el 
número células positivas a CD68 por cada 0.1312 mm2. 
 
 
 
5.5 Expresión de iNOS y KIM-1 
 21
Se extrajo el ARN total de la corteza renal de cada animal usando TRIzol y 
posteriormente se determinó la concentración de ARN aislada mediante una electroforesis 
en gel de agarosa al 1% midiendo la absorbencia a 260 nm. Se utilizaron 2.5 μg de ARN 
total de cada muestra de corteza renal para la transcripción reversa, la cual se llevó a 
cabo a 37ºC a 60 minutos usando 200 U de transcriptasa reversa del virus de leucemia 
murina (Invritrogen), 100 pm de hexámeros (Invitrogen), 0.5 mM de dNTP (Sigma 
Chemical Co., St. Louis, MO, USA) y amortiguador (75 mM de KCl; 50 mMde Tris-HCl y 3 
mM de MgCl2 a pH=8.3. Los niveles de iNOS y KIM-1 se cuantificaron mediante la 
reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real con el programa Prisma 7300 
(Taíman, Applied Biosystems ABI, Foster City, CA, USA). Para la detección de iNOS y 
KIM-1 se utilizó la sonda FAM (6-carboxifluorosceína) y para la detección de rARN 
subunidad 18S se utilizó la sonda VIC (Applied Biosystems). La cuantificación de la 
expresión génica de iNOS y de KIM-1 se realizó mediante el método comparativo de 
ciclos umbral. Un ciclo umbral es el número de ciclos al cual se obtiene fluorescencia a 
cierto nivel. En todos los experimentos, el rARN eucariótico 18S se usó como control. 
Además, se incluyeron controles negativos para cada reacción (Vaidya et al., 2006). Los 
resultados se expresaron como la relación entre el número de veces que aumenta el 
ARNm de la iNOS con respecto al ARNm 18S. 
 
5.6 Lipoperoxidación 
Se cuantificó el contenido de MDA en los homogenados de corteza renal (1:10). 
Dichos homogenados se prepararon en amortiguador de fosfatos 20 mM pH 7.4 con 
hidroxitolueno butilado 0.5 M en acetonitrilo y se centrifugaron a 3000 x g a 4°C durante 
10 minutos. Se tomaron 200 μL del sobrenadante y se adicionaron 650 μL de 1-metil-2 
fenilidol en acetonitrilo a una concentración final de 10 mM y posteriormente se diluyó 3:1 
con metanol al 100%. Se agitó en vórtex y se adicionaron 150 μL de HCl al 37%. Por 
cada muestra se realizó un blanco con 200 μL del sobrenadante, 650 μL de una 
disolución de acetonitrilo y metanol 3:1 y 150 μL de HCl al 37%. Se realizó una curva 
estándar a partir de una disolución de 1,1,3,3,-tetrametoxipropano 10 mM en Tris-HCl 20 
mM pH 7.4 adicionando 650 μL de una disolución de acetonitrilo y metanol 3:1 y 150 μL 
de HCl al 37%. Después de incubar 50 minutos a 45°C, las muestras se centrifugaron a 
2000 x g durante 10 minutos a 4°C. Se obtuvo el sobrenadante en el que se encuentra el 
MDA que al reaccionar con el 1-metil-2 fenilidol forma un complejo azul que se detecta a 
586 nm (Erdelmeier et al., 1998; Gerard-Monnier et al., 1998). La concentración de 
 22
proteínas de los homogenados se determinó por el método de Lowry y la cantidad de 
MDA se expresó como nmol MDA/mg proteína. 
 
5.7 Análisis inmunohistoquímico de estrés oxidativo 
El análisis inmunohistoquímico de estrés oxidativo se realizó mediante una detección 
inmunológica de 4-HNE y 3-NT en cortes de 3 mm de riñón. Los cortes se colocaron en 
portaobjetos para desparafinizar y posteriormente hidratar como se explicó en la sección 
4.3. Las muestras se incubaron con Declere, que es un líquido que desenmascara los 
sitios antigénicos, y posteriormente se incubaron con H2O2 al 0.03% en metanol absoluto 
durante 1.5 h para inhibir la actividad de peroxidasas endógenas, posteriormente, las 
laminillas se incubaron con albúmina sérica bobina al 3% en amortiguador de fosfatos pH 
7.4 durante 30 minutos. Una serie de laminillas se incubó con anticuerpo anti-3-NT diluido 
1:70 y otra serie con anticuerpo anti-4-HNE diluído 1:200; ambas series se incubaron 
durante 12 horas a 4 ºC y se realizaron 3 lavados con amortiguador de fosfatos durante 
10 minutos cada uno. Posteriormente las laminillas se incubaron durante 2 horas con una 
dilución 1:100 de anticuerpo secundario (IgG anti-ratón) biotinilado. Al término de la 
incubación, se hicieron 3 lavados con amortiguador de fosfatos durante 10 minutos cada 
uno. El anticuerpo unido al tejido se detectó mediante un sistema de revelado de avidina 
acoplado a una peroxidasa biotinilada, y se utilizó diaminobencidina como sustrato de la 
peroxidasa. Una coloración café en las laminillas indica la inmunolocalización de 3-NT o 
4-HNE. Además, se realizó un análisis morfométrico de la inmunotinción fotografiando 
aleatoriamente 5 campos por cada laminilla en un aumento de 100X con un microscopio 
Axiovert 200M (Carl Zeiss, Jena, Alemania), en donde el área total corresponde a 1x106 
μm2. Mediante un programa computarizado para análisis de imágenes (KS-300 3.0) se 
determinó el porcentaje de área inmunoteñida por campo y se realizó un promedio de los 
5 campos seleccionados por laminilla para cada uno de los animales en estudio (24 
ratas). El resultado se expresó como porcentaje de inmunotinción (Cruz et al., 2007). 
 
5.8 Análisis estadístico 
Los resultados se compararon mediante un análisis de varianza seguido de 
comparaciones individuales de Bonferroni entre cada grupo. Los resultados se expresaron 
como el promedio ± error estándar. Los valores de p<0.05 se consideraron significativos. 
 
 23
6. RESULTADOS 
6.1 PAPEL DEL NO EN LA NEFROTOXICIDAD INDUCIDA POR CISPLATINO 
6.1.1 ARNm de la iNOS. Para saber si la actividad enzimática de la iNOS tiene algún 
papel en este modelo experimental, es necesario conocer si hay inducción en la expresión de 
dicha enzima. La figura 5 muestra el aumento en la expresión de iNOS 72 horas después de 
la administración de cisplatino. Además, la administración de 1400W no tiene efecto sobre 
esta inducción. 
 
ARNm de iNOS
0.0
2.5
5.0
7.5
Ct Cis Cis+1400W
iN
O
S/
18
S
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 5. Expresión de ARNm de iNOS en corteza renal (n=6-8) del grupo Ct, Cis y 
Cis+1400W. El análisis se realizó 72 horas después de la administración de cisplatino. 
ap<0.05 vs Ct. 
 
6.1.2 Evaluación de la función renal. 
Después de 72 horas de la administración de una dosis única de cisplatino se 
encontraron alteraciones en diferentes marcadores de daño renal. Por otra parte, la inhibición 
selectivade la iNOS mediante la administración de 1400W a los animales que recibieron 
cisplatino previno las alteraciones debidas al cisplatino. La tabla 2 muestra que el 1400W 
previno el aumento de proteinuria, BUN, creatinina plasmática y expresión de KIM-1, así 
como la disminución en los valores de depuración de creatinina. 
 24
 
Tabla 2. Efecto de1400W en el peso corporal y en la función renal en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino. 
 Ct 1400W Cis Cis+1400W 
Peso corporal final,g (n=6-8) 255±5.2 258.9±4.5 254±2.3 253±2.7 
Proteinuria, mg/24 h (n= 6-7) 11.5±3.3 14.2±1.4 51.6±8.9a 27.3±5.2b
BUN, mg/dL (n=7) 17.3±1.7 20.3±1.6 69.1±4.9a 35±7.1c
Creatinina plasmática, mg/dL (n=6-7) 0.3±0.05 0.3±0.03 2.8±0.14a 0.8±0.18 c,d
Depuración de creatinina, mL/min (n=5-8) 1.3±0.4 1.8±0.4 0.1±0.04e 1.1±0.23b
Molécula de daño renal, KIM-1/18S (7-8) 1.0±0.02 ND 1591±429.5a 233.5±115.5f
Ct=Control, Cis=Cisplatino, ND=no determinado. Los datos están representados como promedio±error 
estándar. ap<0.001, dp<0.05, ep<0.05 vs Ct; bp<0.05, cp<0.001, fp<0.01 vs Cis. 
 
6.1.3 Evaluación histológica. 
Los resultados anteriores mostraron que la inhibición selectiva de iNOS previene la 
disfunción renal debida a la administración de cisplatino, y para saber si dicha inhibición está 
asociada con la prevención de alteraciones histológicas, se realizó una tinción con PAS. Esta 
tinción permite hacer un análisis histológico del tejido renal, así como la formación de 
cilindros, que corresponden a conglomerados proteicos debidos al daño en los túbulos 
proximales. 
El análisis histológico del tejido de animales del grupo control no presentó alteraciones 
en corteza ni médula renal. Por otra parte, el grupo cisplatino mostró daño en el epitelio 
tubular y zonas de necrosis en corteza renal, así como la presencia de cilindros tanto en 
corteza como en médula renal. La inhibición selectiva de la iNOS mostró disminuir dichas 
alteraciones en corteza renal (Fig. 6A). El análisis cuantitativo de los túbulos positivos a la 
tinción de PAS, mostró que la administración de cisplatino induce un aumento significativo en 
la formación de cilindros tanto en corteza (Fig. 6B) como en médula renal (Fig. 6C). El 
1400W, inhibidor de la actividad de la iNOS, previene el aumento en la formación de cilindros 
en forma significativa, tanto en corteza (Fig. 6B) como en médula renal (Fig. 6C). 
 25
 
Análisis histológico 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 6. (A) Análisis histológico y (B) cuantitativo en corteza y (C) medula renal del grupo Ct, Cis y Cis+1400W. El 
análisis se realizó 72 horas después de la administración de cisplatino. ap<0.001 vs Ct; bp<0.01, cp<0.05 vs Cis. 
Aumento 100X. 
 
6.1.4 Evaluación del infiltrado túbulointersticial 
Para seguir investigando el papel del 1400W en el daño inducido por cisplatino, se evaluó 
su efecto en el infiltrado túbulointersticial mediante una detección inmunológica de CD68, una 
glicoproteína expresada en la membrana de macrofágos/monocitos. La inmunotinción mostró 
Análisis cuantitativo 
Ct Cis Cis+1400W
Corteza renal 
Médula renal 
A 
 Túbulos PAS-positivos
 en corteza renal
0
10
20
30 a
b
Ct Cis Cis+1400W
B
Po
rc
en
ta
je
 d
e 
tú
bu
lo
s
 TúbulosPAS-positivos
 en medula renal
0
10
20
30
40 a
c
Ct Cis Cis+1400W
C
Po
rc
en
ta
je
 d
e 
tú
bu
lo
s
 26
que la administración de cisplatino induce un aumento de estas células de la respuesta 
inmune tanto en corteza como en médula renal (Fig. 7A). Sin embargo, la inhibición selectiva 
de la iNOS previene significativamente este aumento (Fig. 7A y 7C). 
 
 
Ct Cis Cis+1400W
Inmunotinción de 
CD68 en corteza renal 
Inmunotinción de 
CD68 in medula 
renal 
 
A 
Infiltrado túbulointersticial 
 
 Análisis cuantitativo del infiltrado túbulointersticial 
 
 Células CD68-positivas en
 medula renal
0
5
10
15
20
Ct Cis Cis+1400W
a
c
C
Po
si
tiv
e 
ce
lls
/0
.3
12
 m
m
2
Células CD68-positivas en
corteza renal
0
1
2
3
Ct Cis Cis+1400W
a
b
B
Po
si
tiv
e 
ce
lls
/0
.3
12
 m
m
2
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 7. (A) Análisis histológico y (B) cuantitativo en corteza y (C) medula renal del grupo Ct. Cis y Cis+1400W 
(n=5). El análisis se realizó 72 horas después de la administración de cisplatino. (A) Las flechas rojas indican la 
inmunolocalización de macrófagos/monocitos. ap<0.001 vs Ct; bp<0.01, cp<0.05 vs Cis. Aumento 100X. 
 
El análisis cuantitativo de CD68 mostró que la administración de 1400W previene el 
aumento significativo de infiltrado de macrófagos/monocitos tanto en corteza (Fig. 7A) como 
medula renal (Fig. 7B) debido a la administración de cisplatino. 
 27
 
6.1.5 Evaluación del estrés oxidativo y nitrosativo. 
Por otra parte, se ha descrito ampliamente el incremento de ROS tras la administración 
de cisplatino, y para saber si el efecto observado está relacionado con la disminución de 
est los siguientes marcadores de estrés 
oxi
 
 
 
 
ecta proteínas con residuos de tirosina modificados 
rincipalmente por ONOO-, mientras que el 4-HNE es un producto final de lipoperoxidación. 
mbos marcadores de estrés oxidativo se encuentran aumentados tanto en corteza como en 
as especies, se determinó el comportamiento de
dativo: MDA en corteza renal y presencia de 3-NT y 4-HNE en tejido renal. El contenido de 
MDA, el cual es un producto final de la lipoperoxidación, tuvo un aumento en el grupo de 
ratas que recibió cisplatino, mientras que la administración de 1400W previno parcialmente 
este incremento (Fig. 8). 
 
 
 
Contenido de MDA en corteza
renal
 2.5
 
 
 
 La inmunotinción de 3-NT det
p
A
médula renal (Fig. 9) y la inhibición selectiva de iNOS previno este aumento 
significativamente (Tabla 2). 
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
3.0 a
b,c
Ct Cis Cis+1400W
nm
ol
/m
g 
pr
ot
eí
na Fig. 8. Contenido de MDA en corteza 
renal (n=6-8) en los grupos Ct. Cis y 
Cis+1400W. El análisis se realizó 72 
horas después de la administración de 
cisplatino. ap<0.001, bp<0.05 vs Ct; 
cp<0.05 vs Cis. 
 28
Cortex
Medulla
Ct Cis Cis+1400W
Cortex
Medulla
In
m
un
ot
in
ci
ón
de
4-
H
N
E
In
m
un
ot
in
ci
ón
de
 3
-N
T
 
 
 
Tabla 2. Análisis cuantitativo de la inmunotinción para marcadores de estrés oxidativo (%) 
 Corteza renal Médula renal 
 Ct Cis Cis+1400W Ct Cis Cis+1400W 
3-NT 2.7±0.4 17±0.9a 5.4±0.6b,c 2.3±0.3 17.9±0.9a 5.9±0.8b,c
4-HNE 2.8±0.3 15.1±1.3a 6.1±0.5a,c 2.5±0.4 16.6±1.1a 5.8±0.7b,c
 
Fig. 9. Inmunodetección de 3-NT (n=5) y 4-HNE (n=5) en los grupos Ct. Cis y 
Cis+1400W. El análisis se realizó 72 horas después de la administración de cisplatino. 
Aumento 100X. 
 
Ct=Control, Cis=Cisplatino, 3-NT=3-nitrotirosina, 4-HNE=4-hidroxi-2-nonenal. Los datos están representados 
como el promedio±error estándar, n=5. ap<0.001, bp<0.05 vs Ct; 
c
p<0.001 vs Cis. 
 
 29
6.2 PAPEL DEL O2 ¯ EN LA NEFROTOXICIDAD INDUCIDA POR CISPLATINO 
 
 Los resultados anteriores indican por primera vez que el NO proveniente de la iNOS 
juega un papel muy importante en el mecanismo de nefrotoxicidad inducido por cisplatino. 
Entonces, es posible que el aumento de ONOO¯ encontrado previamente en nuestro 
laboratorio y que es producto de la reacción entre el NO y O2 ¯ en animales que recibieron 
cisplatino, puede deberse al aumento en la actividad enzimática de la iNOS. Sin embargo, 
aún no están definidas las fuentes de O2 ¯ y decidimos evaluar el efecto de la inhibición de la 
NADHP oxidasa en este modelo. Los resultados encontrados fueron los siguientes: 
 
6.2.1 Evaluación de la función renal. 
 Utilizando el mismo esquema de tratamiento con cisplatino, encontramos 72 horas 
después de su administración, alteraciones en la función renal que la apocinina fue capaz de 
prevenir de forma significativa (tabla 3). 
 
Tabla 3. Efecto de la apocinina en el peso corporal y en la función renal en la nefrotoxicidad inducida porcisplatino. 
 Ct Apo Cis Cis+Apo 
Peso corporal final (g, n=10-18) 251±5.7 257.8±6.4 246±6.3 251±3.0 
Proteinuria (mg/24 h, n=10-12) 16.4±1.9 19.8±2.3 56.5±3.8a 21.2±3.8c
BUN (mg/dL, n=10-12) 20.1±1.2 23.8±0.2 74.7±9.6a 25.4±5.8c
Creatinina sérica (mg/dL, n=10-12) 0.37±0.02 0.35±0.03 3.2±0.2a 1.5±0.4c
NAG urinaria (U/24 h, n=8-14) 0.73±0.14 0.66±0.11 1.28±0.12b 0.26±0.09e
GST urinaria (U/24 h, n=10-14) 36.5±4.4 30.9±1.8 80.8±6.6b 44.1±7.9d
 
Ct=control; Apo=apocinina; Cis=cisplatino; GST=glutatión transferasa; NAG=N-acetil-β-D glucosaminidasa; 
MDA=malondialdehído. Los datos están representados como promedio±error estándar. ap<0.001, bp<0.05 vs Ct; 
cp<0.001, dp<0.05,ep<0.01 vs Cis. 
 
6.2.2 Evaluación histológica. 
Después de observar que la inhibición de la NADPH oxidasa previene la 
nefrotoxicidad, decidimos evaluar si las alteraciones histológicas debidas a la acumulación de 
cisplatino en los túbulos proximales del riñón son prevenidas por la inhibición de esta enzima 
encargada de la producción de O2 ¯. La figura 10A muestra que la aparición de cilindros en 
corteza y médula está asociada a la producción de O2 ¯ mientras que su inhibición con 
 30
apocinina previene la formación de estos cilindros, que representan acumulación de 
proteínas debido al daño renal. 
 
 
 Análisis histológico 
 
 
 
Ct Apo Cis Cis+Apo
Corteza 
renal 
Medula 
renal 
A 
 
 Análisis cuantitativo 
 
 Túbulos PAS-positivos
 en corteza renal
0
10
20
a
Ct Cis Cis+Apo
b
B
Po
rc
en
ta
je
 d
e 
tú
bu
lo
s
Túbulos PAS-positivos
 en médula renal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Ct Cis Cis+Apo
a
a
C
Po
rc
en
ta
je
 d
e 
tú
bu
lo
s
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 10. (A) Análisis histológico y (B) cuantitativo en corteza y (C) médula renal en los grupos Ct. Cis y Cis+Apo. 
El análisis se realizó 72 horas después de la administración de cisplatino. ap<0.001 vs Ct; bp<0.01, cp<0.001 vs 
Cis. Aumento 100X. 
 
 31
La inhibición de la actividad de la NADPH oxidasa previno el aumento en la formación de 
estos cilindros significativamente, tanto en corteza como en médula renal (Fig 10 B y C). 
Debido a que se observó que inhibiendo a esta enzima disminuyeron los daños funcionales y 
estructurales en forma significativa, decidimos evaluar diferentes marcadores de estrés 
oxidativo, ya que la inhibición en la síntesis de O2 ¯ podría prevenir no sólo los daños 
celulares por este anión, sino la aparición de otras especies, ya que este es precursor de 
H2O2, OH y ONOO¯. 
 
6.2.3 Evaluación del estrés oxidativo y nitrosativo. 
Debido a que el MDA es un producto de lipoperoxidación, proceso iniciado por 
radicales libres como el OH, evaluamos la cantidad de MDA presente en tejido renal de los 
animales tratados con cisplatino y se compararon con los que recibieron 
cisplatino+apocinina. El resultado mostró que la inhibición de la producción de O2 ¯ previene 
el aumento de MDA en tejido renal (Fig. 11). 
 
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Ct
Malondia
nm
ol
 d
e 
M
D
A
/m
g 
pr
ot
ei
n
a
b
Cis Cis+ApoApo
ldehído en tejido renal
 
Fig 11. Contenido de MDA en tejido renal 
(n=5-10) en los grupos de ratas estudiados. 
El análisis se realizó 72 horas horas después 
de la administración de cisplatino. ap<0.01vs 
Ct; bp<0.001 vs Cis. 
 
Para investigar la localización en que se previene el aumento de estrés oxidativo 
debido a la administración de la NADPH oxidasa, se realizó una inmunotinción de 3-NT y 4-
HNE. En la figura 12 puede apreciarse un aumento en la presencia de estos marcadores 
tanto en corteza como en médula renal en donde la inhibición de la producción de O2 ¯ con 
la administración de apocinina, previene el aumento de 3-NT y 4-HNE. La tabla 3 muestra es 
análisis cuantitativo de la inmunotinción en dónde se confirma que la inhibición del O2 ¯ 
previene el aumento de 3-NT y 4-HNE. 
 
 32
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Fig. 12. Inmunodetección de 3-NT (n=5) y 4-HNE (n=5) en los grupos de 
ratas estudiados. El análisis se realizó 72 horas después de la 
administración de cisplatino. Aumento 100X. 
 
 
Tabla 3. Análisis cuantitativo de la inmunotinción para marcadores de estrés oxidativo (% 
de área) 
 Ct Apo Cis Cis+Apo 
3-NT 2.1±0.3 2.0±0.3 46.9±3.4a 28.6±2.5b
4-HNE 1.5±0.3 1.2±0.2 23.6±3.0a 8.9±1.0b
 
Ct=Control, Cis=Cisplatino, 3-NT=3-nitrotirosina, 4-HNE=4-hidroxi-2-nonenal. Los datos están representados 
como el promedio±error estándar, n=5. ap<0.001 vs Ct, bp<0.001 vs Cis. 
 
 
 33
7. DISCUSIÓN 
El cisplatino es un agente antineoplásico ampliamente usado debido a su efectividad 
contra una gran variedad de tumores sólidos, sin embargo, la nefrotoxicidad es su 
principal efecto secundario que ha limitado su uso (Davis et al., 2001). El mecanismo por 
el cual induce nefrotoxicidad no está completamente descrito, pero existen evidencias que 
sustentan la participación de ERO y ERN en el daño. Actualmente se sabe que el 
cisplatino es nefrotóxico debido a que se acumula en el riñón al entrar a la células del 
túbulo proximal a través de transportadores de cationes orgánicos conocidos como 
hOCT2 (Ciarimboli et al., 2005). 
En este estudio se administró una dosis única de 7.5 mg/Kg, a ratas macho de la cepa 
Wistar, encontrándose un aumento en la expresión del ARNm de la iNOS. Sin embargo, el 
papel de esta enzima en este modelo experimental ha resultado contradictorio según lo 
reportado en la literatura especializada en los últimos años. Debido a lo anterior, el 
objetivo de este trabajo se centró en la evaluación de 1400W, un inhibidor selectivo de la 
iNOS, en animales que recibieron cisplatino. 
El grupo de ratas que recibió una dosis única de cisplatino mostró notables 
alteraciones tanto a nivel funcional como estructural. Interesantemente, la inhibición 
selectiva de la iNOS mostró prevenir significativamente ambos tipos de alteraciones. Entre 
los marcadores de función renal usados en este estudio se encuentra la actividad de GPx 
plasmática, debido a que es una enzima que se sintetiza en los túbulos proximales y 
cuando existe daño en los mismos disminuye su síntesis y en consecuencia su actividad 
en plasma. KIM-1 es una glicoproteína membranal de túbulos proximales con expresión 
indetectable bajo condiciones fisiológicas. Recientemente se ha descrito que esta 
glicoproteína puede detectarse en etapas tempranas de daño renal y ha resultado de gran 
utilidad en el establecimiento de patologías renales debido a que aumenta su expresión 
aún cuando otros marcadores clásicamente usados aún no presentan alteraciones, como 
proteinuria, creatinina o BUN. Entre las alteraciones estructurales encontradas debidas a 
la administración de cisplatino se observó la presencia de zonas necróticas en corteza 
renal además de la aparición de cilindros tanto en corteza renal como en médula. Estas 
alteraciones disminuyeron mediante la inhibición de la actividad de la iNOS. Hasta este 
punto es importante resaltar que la inhibición de actividad de la iNOS tiene un papel 
benéfico en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino, ya que al estar inhibida dicha enzima 
se previenen las alteraciones funcionales y estrucurales debidas a la administración de 
cisplatino. Lo anterior significa que la producción de NO debida a esta isoforma 
contribuye a los mecanismos nefrótoxicos. Los últimos reportes en la literatura que 
 24
trataron de explicar el papel del NO en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino resultaron 
contradictorios. Srivastava y colaboradores en 1996 y Mansour y colaboradores en 2000, 
reportaron que la inhibición de la NOS resulta en un efecto benéfico usando L-NAME y 
aminoguanidina, respectivamente. Ambos inhibidores son no selectivos para alguna de 
las isoformas de la NOS, de tal forma que no es posible identificar cuál de las 3 proteínas 
esta participando en el daño renal. Por otra parte, el uso de 2-amino-4-metilpiridina (Saad 
et al., 2002)y una vez más de L-NAME (Saleh and El-Demerdash, 2005) mostró por 
grupos de investigadores independientes, que la inhibición de la NOS exacerba el daño 
renal y estructural inducido por cisplatino. Lo anterior propone un papel tóxico del NO en 
este modelo experimental. No obstante, estos inhibidores tampoco son selectivos para 
alguna de las isoformas de la NOS. 
 El uso de 1400W permitió estudiar el papel de la iNOS en este modelo debido a que 
es actualmente, uno de los inhibidores de primera elección para el estudio de la iNOS por 
ser selectivo para la iNOS. El interés de estudiar a esta isoforma en diferentes modelos 
experimentales, se debe, en parte, a que es una isoforma que se induce bajo diferentes 
estímulos, entre ellos la administración de cisplatino (Deng, et al. 2001) y el estrés 
oxidativo (Kone, 2004). Además, como se demostró en la figura 9, la administración de 
cisplatino induce un aumento en la infiltración de macrófagos/monocitos y estas células 
expresan iNOS con la finalidad de sintetizar NO como mecanismo de defensa contra 
agentes patógenos. Por otra parte, la prevención del aumento en el infiltrado 
túbulointersticial en los animales que recibieron 1400W puede deberse a la disminución 
de las lesiones funcionales y estructurales. 
La inducción de la iNOS tiene como consecuencia la producción masiva de NO que 
puede causar daño al reaccionar con O2 ¯ debido a la formación de ONOO
-, una molécula 
con capacidad de modificar residuos de tirosina dando lugar a la formación de 3-NT, entre 
otras muchas modificaciones. Debido a que los precursores del ONOO- son radicales 
libres, y a que el ONOO- por sí mismo es una molécula oxidante, se ha usado a la 3-NT 
como marcador de estrés oxidativo y/o nitrosativo. En este trabajo se encontró un claro 
aumento de la nitración de proteínas en corteza y médula en los animales que recibieron 
cisplatino mientras que el 1400W previno este incremento (Fig. 9). El aumento en la 
formación de 3-NT está fuertemente asociado con alteración de la funcionalidad de las 
proteínas en las que se indujo dicha modificación, por lo que la prevención en su 
formación tiene un papel benéfico en la célula. Es posible entonces, asociar la 
disminución en la nitración de proteínas en los animales que recibieron cisplatino y 
1400W, con una disminución en las alteraciones debidas a la administración de cisplatino. 
 25
Por otra parte, el 4-HNE ha sido ampliamente usado como marcador de estrés oxidativo. 
La administración de cisplatino indujo un aumento en la inmunotinción de este marcador 
poniendo en evidencia que las células renales sufrieron un proceso de lipoperoxidación. 
Este proceso puede iniciar con la presencia de ROS como O2 ¯ o OH, y se ha reportado 
que ambas especies están involucradas en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino. Lo 
anterior se ha logrado establecer mediante atrapadores de OH como DMTU (Baek et al., 
2003), atrapadores de O2 ¯ como tirón (Baek et al., 2003) o mediante la sobreexpresión 
de SOD (Davis et al., 2001). Al respecto, es posible proponer que la lipoperoxidación es 
un evento secundario a la formación de ROS y explica el aumento de 4-HNE en el 
presente trabajo. Por otra parte, el ONOO-, especie que también participa en los eventos 
nefrotóxicos inducidos por cisplatino (Chirino et al., 2004), es capaz de iniciar procesos de 
lipoperoxidación (Radi et al., 1991). Los resultados de este trabajo muestran una 
disminución significativa en el grupo Cis+1400W en la inmunoticinción de 4-HNE en tejido 
renal (Tabla 2) que puede deberse en parte, a la en la producción disminuida de NO 
como consecuencia de la inhibición selectiva de la iNOS con el 1400W. 
Por otra parte, el papel tóxico del O2 ¯ en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino se 
ha demostrado mediante el uso de diferentes atrapadores de este anión (Lieberthal y 
Levine 1996; Baek, 2003), compuestos que mimetizan la actividad enzimática de la SOD 
(Matsushima et al., 1998; Nishikawa et al., 2001) así como la sobreexpresión de la SOD 
(Davis et al., 2001). Las posibles fuentes de O2 ¯ pueden ser la cadena de transporte de 
electrones, enzimas como la lipooxigensa, NOS y NADPH oxidasa, entre otras. El O2 ¯ 
tiene funciones biológicas definidas, sin embargo, se ha demostrado que la producción de 
este anión por la NADPH oxidasa resulta nocivo. Para demostrar el papel tóxico de esta 
enzima, se ha usado a la apocinina por su capacidad para inhibir la actividad enzimática 
que conduce a la síntesis de O2 ¯ (Erdös et al., 2006; Gracia-Sancho et al., 2007; Chan et 
al., 2007). El mecanismo de acción de la apocinina consiste en unirse a los grupos tiol de 
la subunidad p47phox impidiendo su traslocación a la membrana y por lo tanto, impidiendo 
la síntesis de O2 ¯ (Barbieri et al., 2004; Kanegae et al., 2007). En este trabajo quedó 
demostrado que la inhibición de la actividad de la NADPH oxidasa previene el daño renal 
inducido por la administración de cisplatino. La apocinina previno el daño renal y las 
alteraciones estructurales así como el estrés oxidativo y nitrosativo. Estos resultados 
resultan congruentes con lo reportado en la literatura, en donde la administración de 
apocinina en el agua de beber ha mostrado prevención en alteraciones cardiovasculares 
y producción de radicales libres inducidos por la infusión de angiotensina II en ratas 
 26
(Rugale et al., 2005). Este grupo de investigadores encontró que la administración de 
apocinina redujo la producción de O2 ¯ en el ventrículo izquierdo, lo resultó benéfico en 
este modelo. Además, se ha visto que la apocinina en el agua de beber a animales 
previene el aumento en la expresión de la NADPH oxidasa en ratas que recibieron una 
dieta alta en sal (Pech et al., 2006). Otro reporte mostró que la apocinina administrada en 
el agua de beber previno el aumento en la expresión de la subunidad p22phox en ratas 
hipertensas (Cui et al., 2006). Estos resultados muestran que al inhibir la producción del 
O2 ¯ con apocinina, se previenen efectos nocivos asociados a este anión y es posible 
que se deba, entre otras razones, a que al inhibir su producción se reduzca la presencia 
de otras especies reactivas como el H2O2, OH y ONOO¯, que pueden oxidar un gran 
número de biomoléculas y afectar funciones celulares indispensables. Además, un 
aumento en la producción de O2 ¯ puede inactivar al NO , no sólo formado ONOO¯, que 
es una especie oxidante, sino impidiendo las funciones fisiológicas de este radical. 
 
 
8. CONCLUSIÓN 
 
 Este trabajo demostró que la actividad de la iNOS y de la NADPH oxidasa forman parte 
del mecanismo de nefrotoxicidad inducido por la administración de cisplatino. 
 
 27
 
9. REFERENCIAS 
 
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cisplatin and other platinum compounds: a review of some recent research. Food. 
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