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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
 
Técnicas actuales de laboratorio para el diagnostico de anemias hemolíticas 
hereditarias asociadas a defectos a nivel de membrana eritrocitaria. 
 
 
 
 
 
 
 
TRABAJO MONOGRÁFICO 
DE ACTUALIZACIÓN 
 
 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE 
 
QUÍMICA FARMACEUTICA BIOLOGA 
 
 
PRESENTA 
 
 
GARCÍA CASILLAS ALMA ELENA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
México, D.F 2006 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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LA VIDA NO ES NINGÚN PASILLO RECTO Y FÁCIL 
QUE RECORREMOS LIBRES Y SIN OBSTÁCULOS, 
SINO UN LABERINTO DE PASADIZOS, 
EN EL QUE TENEMOS QUE BUSCAR NUESTRO CAMINO, 
PERDIDOS Y CONFUSOS, DETENIDOS, 
DE VEZ EN CUANDO, POR UN CALLEJÓN SIN SALIDA. 
 
 
 
PERO SI TENEMOS FE, SIEMPRE SE ABRE 
UNA PUERTA ANTE NOSOTROS; 
QUIZÁ NO SEA LA QUE IMAGINAMOS, 
PERO SÍ SERÁ, FINALMENTE, 
LA QUE DEMUESTRE SER BUENA PARA NOSOTROS 
 
 
 
 
A.J. CRONIN 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
 
---Agradezco a mi madre la señora Alma Patricia Casillas, cuyo entusiasmo, amor y 
 Sabiduría me guiaron a terminar una carrera universitaria. 
 
---Gracias a mi novio y esposo Jorge Alberto Villagran por enseñarme a conocer el 
amor y apoyar todas mis decisiones incondicionalmente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Jurado asignado: 
 
Presidente Prof. GRACIELA EVANGELINA NAVA DÍAZ ....................................... 
 
Vocal Prof. EVA DELIA CALDERON GARCIDUEÑAS....................................... 
 
Secretario Prof. ARACELI MENDIETA RERGIS ...................................... 
 
1er sup. Prof. MARIA DEL SOCORRO CECILIA REYNA RODRÍGUEZ 
 
2do sup. Prof. PERLA DEYANIRA MALDONADO JIMENEZ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Asesorado por: ARACELI MENDIETA RERGIS ------------------------------------- 
 
 
Sustentada por: ALMA ELENA GARCIA CASILLAS ------------------------------------ 
 
INDICE 
 
 
I. INTRODUCCIÓN................................................................................................................................ 1 
 
II. GENERALIDADES..............................................................................................................................4 
 
III. TÉCNICAS ACTUALES DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DE 
ANEMIAS HEREDITARIAS ASOCIADAS A DEFECTOS A NIVEL DE MEMBRANA 
ERITROCITARIA 
 
 A)ESFEROCITOSIS HEREDITARIA.................................................................................... 40 
 1. Manifestaciones clínicas 
 2. Manifestaciones de laboratorio 
 3. Enfoque diagnóstico 
 
B) ELIPTOCITOSIS HEREDITARIA.................................................................................... 55 
 1. Manifestaciones clínicas 
 2. Manifestaciones de laboratorio 
 3. Enfoque diagnóstico 
 
C) PIROPOIQUILOCITOSIS HEREDITARIA.................................................................... 61 
 1. Manifestaciones clínicas 
 2. Manifestaciones de laboratorio 
 3. Enfoque diagnóstico 
 
D) ESTOMATOCITOSIS HEREDITARIA ...........................................................................64 
 1. Manifestaciones clínicas 
 2. Manifestaciones de laboratorio 
 3. Enfoque diagnóstico 
 
E) XEROCITOSIS HEREDITARIA........................................................................................ 67 
 1. Manifestaciones clínicas 
 2. Manifestaciones de laboratorio 
 3. Enfoque diagnóstico 
 
F) ACANTOCITOSIS HEREDITARIA.................................................................................. 70 
 1. Manifestaciones clínicas 
 2. Manifestaciones de laboratorio 
 3. Enfoque diagnóstico 
 
IV. CONCLUSIONES............................................................................................................................ 74 
V. BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................................... 76 
VI GLOSARIO....................................................................................................................................... 81 
 
 
I. INTRODUCCIÓN 
 
Objetivo: El objetivo de esta tesis es proporcionar la forma diagnostica más actual y completa de 
anemias hemolíticas hereditarias asociadas a defectos a nivel de membrana eritrocitaria, sirviendo en 
particular como texto informativo y de referencia para el clínico. 
ANEMIA 
Definición 
 
 En términos ideales la anemia se define como una reducción de mas del 10% del valor normal en el 
número total de eritrocitos, la cantidad de hemoglobina (Hb) circulante y la masa eritrocitaria en un 
paciente en particular. Sin embargo, esta definición no es aplicable, porque a menudo no se conocen 
los valores normales habituales de los pacientes. 
 Una definición mas convencional es la disminución de los eritrocitos, la Hb y el hematocrito están 
por debajo de los valores normales establecidos con anterioridad para las personas sanas de la misma 
edad, sexo y raza y en condiciones ambientales similares. Con esta definición convencional pueden 
surgir problemas por varias razones. Los valores hemàticos de las personas no anémicas pueden 
estar por debajo del nivel normal. Los de personas con anemia leve pueden entrar dentro de los 
valores bajos del rango normal. Este ultimo grupo por lo general no se diagnóstica, a menos que se 
evalué el extendido de sangre o se determinen los índices eritrocitarios. (Harrison, 2006) 
 Cada laboratorio debe de determinar sus rangos de referencia de acuerdo con la población de 
pacientes de su área de influencia. La altitud geográfica influye sobre los niveles de hemoglobina, 
así como otros factores. 
 
Anemia (del griego, 'sin sangre'), enfermedad de la sangre caracterizada por una disminución 
anormal en el número de glóbulos rojos (eritrocitos o hematíes) o en su contenido de 
hemoglobina.(Satamatelos,2002) 
 1
 
 
TABLA 1.1.- Clasificación de las anemias 
 
PERDIDAS DE SANGRE DESTRUCCION AUMENTADA 
(ANEMIAS HEMOLITICAS) 
ALTERACIONES DE 
LA PRODUCCION 
Agudas: Traumatismos 
 
Alteraciones extravasculares 
a) Hereditarias 
1.- Alteraciones de membrana 
2.-Déficit enzimáticos de eritrocitos 
3.-Trastornos de la síntesis de 
hemoglobina. 
 
 b) Adquiridas 
 
 1.- Defecto de la membrana: 
Hemoglobinuria paroxística nocturna. 
 
Trastornos de la 
proliferación y 
diferenciación de las 
células madre. 
 
 
 
 
 
Crónicas: Lesiones del tubo 
digestivo, trastornos 
ginecológicos 
Alteraciones intravasculares 
 1.- Mediadas por anticuerpos 
 2.- Por traumatismos mecánicos 
 3.- Infecciones 
 4.- Por agentes químicos 
 5.- Por secuestro del sistema 
mononuclear fagocítico 
 
 
 
 
 
 
Trastornos de la 
proliferación y 
maduración de los 
eritroblastos 
 
 1.- Síntesis defectuosa 
de ADN. 
 2.-Síntesis defectuosa 
de hemoglobina. 
 
Detección de una anemia hemolítica 
 
El laboratorio inicial del paciente incluye un número limitado de determinaciones: 
 
-Biometría hemàtica 
 
-Recuento de reticulocitos-Identificación de la hemólisis 
 
-Prueba de Coombs. (Pérez, 2005) 
 
Para nuestro estudio en particular solo nos concentraremos en las anemias hemolíticas 
extravasculares hereditarias ocasionadas por defecto a nivel de membrana eritrocitaria. 
 2
 
 
 Membranopatìas eritrocitarias 
 Las membranopatìas del eritrocito obedecen a defectos de alguno de los componentes estructurales 
(proteínas o lípidos) de la membrana. Cuando este trastorno se traduce por una alteración 
característica de la forma eritrocitaria, el examen morfológico es fundamental para realizar el 
diagnostico. 
Las membranopatìas de mayor interés clínico pueden clasificarse en seis grandes tipos: 
 
TABLA 1.2- Clasificación de las anemias hemolíticas hereditarias ocasionadas por 
defectos a nivel de membrana eritrocitaria 
 
Nombre de la anemia 
hemolítica hereditaria 
 
Defecto a nivel de membrana 
eritrocitaria 
Forma del eritrocito 
característica 
Esferocitosis hereditaria Déficit de espectrina Esferocito 
Eliptocitosis hereditaria Defecto en la cadena alfa y beta de 
espectrina 
Eliptocito 
Piropoiquilocitosis hereditaria Heterodímeros de espectrina defectuosos Poiquilocitos 
Estomatocitosis hereditaria Sobrehidratación de las células 
insuficiencia de la bomba sodio /potasio 
Estomatocito 
Xerocitosis hereditaria Deshidratación de las célalas 
Insuficiencia de la bomba sodio/potasio 
Células en blanco de 
tiro, 
Acantocitosis hereditaria Defecto de lípidos de membrana 
Deficiencia de apolipoproteína beta 
Acantocito 
 
TABLA 1.3- Frecuencia de las anemias hemolíticas hereditarias ocasionadas por defectos a 
nivel de membrana en la Republica Mexicana. 
 
Nombre de la anemia hemolítica hereditaria
 
Frecuencia en la Republica Mexicana
Esferocitosis hereditaria Zona central y noroeste de la Republica
Eliptocitosis hereditaria 0.02% al 0.05% de la población general
Piropoiquilocitosis hereditaria No reportada 
Estomatocitosis hereditaria No reportada 
Xerocitosis hereditaria No reportada 
Acantocitosis hereditaria No reportada 
 
 3
II. GENERALIDADES 
 
Origen y Formación del glóbulo rojo. 
 Todas las células de la sangre derivan de una misma célula o precursor común (célula madre) que 
en el sujeto adulto se halla en la medula roja de los huesos (tejido hematopoyetico de la medula 
ósea). El proceso de formación de las células sanguíneas se conoce con el nombre de hematopoyesis 
y su localización en el organismo humano varia con el desarrollo, como se puede observar en la tabla 
siguiente: 
TABLA 1.4- Localización del tejido hematopoyetico según las etapas del desarrollo. 
 
 Periodo embrionario (hematopoyesis mesoblàstica) 
Saco vitelino 
Periodo fetal (hematopoyesis hepática) 
Hígado 
Estado adulto (hematopoyesis mieloide) 
Costillas 
Esternòn 
Cresta ilìaca 
Vértebras 
Epífisis de los huesos largos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La célula madre hematopoyètica pluripotente (CMHP) es el progenitor hematopoyetico mas 
indiferenciado y puede dar lugar a cualquiera de las líneas celulares de la sangre. 
Cuando los precursores hematopoyèticos llegan a una fase de maduración tal, que ya es posible 
distinguirlos mediante el examen morfológico convencional reciben el nombre de precursores 
hematopoyèticos. 
La línea eritropoyètica conduce a la formación de eritrocito y se caracteriza fundamentalmente por la 
síntesis de hemoglobina, este proceso que depende fundamentalmente de la EPO, se acompaña de las 
trasformaciones siguientes: 
 4
a) Un aumento progresivo de la acidofilia celular (aumento de la cantidad de hemoglobina y 
disminución del contenido de ARN) 
b) La pérdida del núcleo. 
 c) La desaparición de todos los organelos citoplasmáticos. 
 
 El proeritroblasto es la primera célula eritroide que puede ser identificada morfológicamente y se 
caracteriza por su gran tamaño, la intensa basofilia citoplasmática y la presencia de un núcleo grande 
con cromatina laxa en la que se pueden apreciarse dos o más nucleolos. La diferenciación de 
proeritroblasto se produce mediante una sucesión combinada de procesos de división mitótica y 
maduración celular que terminan en la maduración de eritrocitos adultos. 
 
 Debe señalarse que aunque cada proeritroblasto puede formar hasta 16 eritrocitos, esto no sucede 
casi nunca en la realidad, debido a la existencia de un cierto grado de eritropoyesis ineficaz. En este 
proceso de maduración, cada proeritroblasto da lugar a la formación de dos eritroblastos basòfilos 
que se caracterizan por un menor tamaño y una mayor madurez citoplasmática, aunque conservan 
una intensa basofilia. Cada eritoblasto basòfilo de lugar, a su vez, por división mitótica a dos nuevos 
eritroblastos de idénticas características morfológicas (eritroblastos basòfilos de tipo I y II 
respectivamente) que, después de una nueva mitosis, se trasforman en un eritroblasto poli cromático 
caracterizado por su citoplasma gris rosado debido a la hemoglobina que inicia su síntesis en esta 
etapa de madurativa de la eritropoyesis. Esta célula ya no sufre ninguna división y se trasforma 
finalmente en eritroblasto ortocromático, que se caracteriza por un mayor contenido citoplasmático 
de hemoglobina (color rosa azulado) y un núcleo. 
Un 20 -25% de los eritroblastos ortocromáticos presentan normalmente granulaciones de 
hemosiderina en su citoplasma, por lo que pueden ponerse fácilmente de manifiesto mediante la 
tinción de Perls (azul de Prusia). Estos eritroblastos se conocen con el nombre de sideroblastos. 
 5
 
 La maduración final del eritroblasto ortocromático consiste en la perdida del núcleo 
(probablemente a través de un mecanismo de extrusión) y su trasformación final en reticulocito, 
célula que se caracteriza por poseer aun capacidad de síntesis hemoglobina. El reticulocito tiene un 
tamaño superior al eritrocito y, al poseer cierta cantidad de ARN en su citoplasma, suele presentar 
mediante tinción, una tonalidad azulada (eritrocito policromático). Antes de madurar 
completamente a eritrocito adulto, el reticulocito permanece 2 a 4 días en la medula ósea y (1-2) en 
sangre periférica. (Lluis 2004). 
Maduración de las células eritropoyèticas 
Célula madre hematopeyètica pluripotente 
 
Precursor mieloide CFC-GEMM 
 
Progenitor BFU-E (Burst forning unit-erythroid) 
 
Progenitor CFU-E 
 
Proeritroblasto 
 
Eritroblastos basòfilos 
 
Eritroblasto poli cromático 
 
Eritroblasto ortocromático 
 
 Reticulocito 
 
Eritrocito 
 6
Características del glóbulo rojo. 
 Los eritrocitos sobreviven normalmente de 90 a120 días en la sangre circulante. Es una célula 
anucleada que no se divide, en la que más del 90% del contenido proteínico corresponde a la 
molécula acarreadora de oxígeno, la hemoglobina. La única función del eritrocito es la de llevar 
oxígeno a los tejidos del organismo. Sobrevive en la circulación gracias a su elevada deformabilidad 
la cual depende de tres factores: 
1.- La forma o relación entre la superficie y el volumen eritrocitarios 
 2.- La estructura de la membrana 
 3.-El contenido hemoglobinico 
La alteración de uno solo de estos factores es suficiente para disminuir la deformabilidad eritrocitaria 
y, con ello, la supervivencia o vida media de los eritrocitos en la circulación. 
 
Ilustración 1 Eritrocito normal 
 7
El descenso de la vida media eritrocitaria o hemólisis puede deberse a dos mecanismos principales: 
a) Mecanismos extrínsecos o lesiones eritrocitarias producidas por factores externos al 
eritrocito, en general de de origen plasmático (anticuerpos). 
b) Mecanismos intrínsecos o alteraciones de uno de sus componentes estructurales: 
 1-membrana 
 2-hemoglobina 
 3-enzimas del metabolismo 
A diferencia de los mecanismos extrínsecos, la mayoría de los defectos intrínsecos tieneorigen 
congénito. (Sans Sabrafen, 2001). 
 
Características generales de la hemoglobina 
 La hemoglobina (Hb) es una molécula proteica que constituye el 95% del peso seco del eritrocito, 
gracias a ella el eritrocito realiza su función transportadora de oxigeno desde los pulmones o los 
tejidos. En los pulmones el oxigeno, se fija a la Hb y de lugar a la formación de oxihemoglobina 
(HbO2) y de esta forma es trasportado hacia los tejidos, donde el oxigeno es liberado y la 
hemoglobina se reduce a desoxihemoglobina. 
Cada molécula de hemoglobina puede fijar un máximo de 4 moléculas de oxigeno y en este caso se 
dice que esta saturada. En condiciones patológicas, la Hemoglobina puede fijar otros gases, como 
por ejemplo el acido sulfhídrico o monóxido de carbono, dando lugar a sulfohemoglobina y 
carboxihemoglobina, respectivamente, que son tóxicos para el organismo, ya que impiden el 
transporte normal de oxigeno. 
La molécula de hemoglobina esta formada por cuatro cadenas de globina iguales dos a dos y cuatro 
grupos hemo, cada uno de los cuales se halla unido a una cadena de globina. En el individuo adulto 
existen cuatro formas moleculares diferentes de cadenas globìnicas. 
 
 8
1.- Cadena alfa 
2.-Cadena beta 
3.- Cadena delta 
4.- Cadena gamma. 
El grupo hemo es el componente no proteico de la hemoglobina y al se le debe el color rojo de la 
sangre. Estructuralmente se compone de una porfirina formada por cuatro pirroles y un átomo de 
hierro en estado reducido, situado en el centro. Cuando el hierro se halla en forma oxidada, la 
hemoglobina se denomina metahemoglobina y carece de función respiratoria. 
La función principal de la hemoglobina es trasportar oxigeno desde los pulmones a los tejidos y, en 
parte, el dióxido de carbono en sentido inverso. 
 
Enzimas del metabolismo 
Los hematíes, al igual que las otras células, precisan energía para realizar su función; si bien en la 
captación, transporte y suministro de oxigeno a los tejidos la consumen en escasa proporción. 
Básicamente los requerimientos energéticos se destinan a mantener: 
- El Fe de la hemoglobina en forma divalente para que la hemoglobina pueda fijar 
reversiblemente el oxigeno. 
- La concentración intraeritrocitaria de sodio y potasio contra gradiente. 
- Los sistemas enzimáticos eritrocitarios en estado activo. 
- La molécula de hemoglobina en forma activa, contribuyendo a la función de la misma. 
- La forma bicóncava del hematíe. 
 Estas funciones las realiza el hematíe gracias a su dotación enzimático proveniente del periodo 
eritroblastico de la eritropoyesis. Hay que tener en cuenta que l hematíe es una célula anucleada no 
dispone de ribosomas ni de mitocondria, por lo que su única fuente de energía proviene del 
metabolismo de la glucosa (glucólisis). 
 9
 
Cabe destacar que este trabajo se enfocara específicamente a los mecanismos intrínsecos, en 
particular aquellos que tienen relación con la membrana eritrocitaria, por lo que se pondrá mayor 
empeño en la caracterización de la membrana eritrocitaria. (Lluis Vives, 2002) 
 
 
Características y componentes de la membrana eritrocitaria 
 
 La membrana eritrocitaria es un componente dinámico de la célula. Posee la propiedad de 
permeabilidad selectiva, facilitando el paso de cationes contra un gradiente iónico, manteniendo el 
ambiente intracelular, tanto de líquidos como de electrolitos. Presenta los lugares antigénicos 
eritrocitarios. 
Funciones de la membrana eritrocitaria. 
En sentido amplio, las funciones de la membrana eritrocitaria son: 
1) Determinar la forma discoide del hematíe y su gran capacidad para la deformabilidad, 
permitiendo a los eritrocitos el paso repetido a través de la microcirculación. 
2) Mantener el equilibrio osmótico entre el espacio intracelular y el plasma, a pesar del efecto 
osmótico que produce la alta concentración de la hemoglobina en el interior de la cedula. 
3) Mantener la distinta composición de cationes existente entre el interior del eritrocito y el 
plasma. Este equilibrio osmótico se consigue gracias a dos propiedades: 
- La membrana eritrocitaria es una barrera a la difusión pasiva de cationes. 
- La presencia de un transporte activo trasfiere cationes a través de la membrana contra 
gradientes de concentración. 
4) Los lípidos y las proteínas de membrana son responsables de la organización estructural y 
determinan las propiedades fundamentales de membrana, tales como la permeabilidad pasiva, 
sistemas de trasporte y sistemas enzimáticos de membrana. Los carbohidratos le confieren 
carga negativa, debido al contenido de acido siàlico, mientras que las diferencias de los 
 10
residuos de carbohidratos de los glicolìpidos determinan los antìgenos específicos 
eritrocitarios. 
Estructura y organización de la membrana eritrocitaria 
La membrana eritrocitaria esta formada por una bicapa lipídica, que contiene proteínas intrínsecas 
extendiendo uniones entre las proteínas que integran la membrana y ciertos fosfolípidos de la 
superficie interna, que determinan una estructura conocida como citoesqueleto. Los componentes de 
membrana son: proteínas, lípidos y carbohidratos. 
Proteínas 
Constituyen el 50% del peso seco de las membranas eritrocitarias. Principalmente son glicoproteinas 
y sialoglicoproteinas. Se ha comprobado la existencia de diferentes bandas proteicas como la 
espectrina (banda 1 y 2), actina (banda 5) y anquirina (banda 2.1), existen otras sin denominar: 
bandas 2.2, 2.3, 2.6, 4.1, 3, 4.2, 4.9, y 7.3. La espectrina, actina y las bandas 4.1 y 4.9, forman los 
constituyentes básicos del citoesqueleto y su disminución o desaparición produce una alteración de 
la forma eritrocitaria y de la integridad del citoesqueleto. 
 
 La espectrina, la principal proteína del citoesqueleto de la membrana, costa de dos cadenas 
polipeptídicas, alfa y beta que son dímeros entrelazados (helicoidales) y se encuentran formando un 
plano sobre la cara citoplásmica de la membrana celular. Cada dímero de espectrina es como el 
segmento de una larga red de cables que se unen entre sí por cabezas, para formar tetrámeros. Estos 
tetrámeros de espectrina están conectados por enlaces laterales de actina. La malla así formada por 
los cables bidimensionales de espectrina está unida a la superficie interna de la membrana celular 
por la ankirina y la proteína 4.1. La anquirina forma un puente entre la espectrina y el transportador 
de iones a través de la membrana, conocido como banda 3, mientras que la proteína 4.1 sirve para 
unir la espectrina a la glucoforina A. Del conjunto de estas proteínas depende el mantenimiento de 
 11
la forma, resistencia y flexibilidad normal de la membrana de los hematíes. (Bernadette F. Rodak, 
2005). 
 
Ilustración 2 Proteínas de membrana 
Lípidos 
Constituyen el 40% del peso seco de la membrana. Los fosfolípidos suponen un 70% y el 30% 
restante lo constituye casi en su totalidad el colesterol, en pequeñas proporciones de glicolìpidos y 
ácidos grasos libres. El significado de la alta proporción de los fosfolípidos se desconoce, existiendo 
diferencias ente las distintas especies en cuanto a la composición de los mismos. Los fosfolípidos se 
disponen de forma asimétrica entre las líneas externa e interna de la capa lipdica. De esta manera la 
fosfatidilcolina se localiza predominantemente en la superficie externa, mientras que el 70% al 90% 
de la fosfatidiletanolamina y casi el 100% de la fosfetilserina se localizan en la parte interna. Esta 
distribución asimétrica de los fosfolípidos esta determinada por la asociación especifica de ciertas 
clases de fosfolípidos en regiones especificas de la membrana y probablemente se deba a la 
interacción entre las subclases de fosfolípidos con las proteínas de membrana. 
 12
El colesterol que constituye el 99% de los lípidos neutros, se intercambia libremente entre las líneas 
externa ye interna de la membrana, encontrándoseen equilibrio con el colesterol plasmático, por lo 
que no es extraño que el contenido del mismo en la membrana este fundamentalmente influenciado 
por la cantidad de colesterol libre plasmático. 
Carbohidratos 
Constituyen el 8% del peso seco de la membrana eritrocitaria. Están localizados en la superficie 
externa de la misma, formando cadenas de oligosacaridos. Los carbohidratos están unidos a las 
proteínas (glicoproteinas) y ciertas subclases de lípidos (glicolìpidos). Las proteínas de membrana 
localizadas en la superficie externa de la misma, presentan diferentes cantidades de carbohidratos, 
unidos a las mismas y las diferencias de los residuos terminales de carbohidratos determinan los 
diferentes grupos sanguíneos. 
Equilibrio osmótico 
El equilibrio osmótico depende de la permeabilidad pasiva y del transporte activo. 
 Permeabilidad pasiva: La membrana eritrocitaria es permeable libremente a los aniones 
hidrofìlicos, tales como el Cl- y el CO3H- , pero es muy impermeable a los cationes hidrofìlicos 
sodio y potasio. 
 Trasporte activo: La membrana eritrocitaria posee un sistema de transporte dependiente de ATP, 
por el cual, mediante la hidrólisis de esta molécula se genera la energía suficiente para extraer 3 
iones sodio del interior de la célula e introducir 3 iones potasio dentro de la misma. Este sistema 
activo de trasporte depende de las concentraciones de sodio y potasio, tanto en el interior como en el 
exterior celular. (Gonzáles, 2006) 
 
 
 
 
 13
Mecanismos de degradación del eritrocito 
 
 El hematíe es una célula anucleada sin mitocondrias ni ribosomas por lo que no puede sintetizar 
proteínas, teniendo por lo tanto una vida definida. Durante su existencia, los enzimas eritrocitarios 
van perdiendo gradualmente su actividad; los procesos metabólicos se deterioran progresivamente y 
la síntesis de ATP es cada vez menor según va envejeciendo la célula. Dado que el ATP es cada vez 
menor según va envejeciendo la célula. Dado que el ATP es la mayor fuente de energía, los procesos 
que la requieren se ven alterados. Igualmente se producirá alteraciones en la estructura y 
funcionalismo de la hemoglobina. 
Estos hechos conducen a la destrucción fisiológica del hematíe, que e realiza por los siguientes 
mecanismos: fragmentación, lisis osmótica, eritrofagocitosis y desnaturalización de la hemoglobina. 
 
Fragmentación: Es la perdida de una porción de la membrana del eritrocito, acompañándose de una 
perdida de contenido celular, incluida la hemoglobina. 
 
Lisis osmótica: Dado el efecto osmótico de la hemoglobina, los hematíes tienden a incorporar agua 
en su interior. Sin embargo esta tendencia es neutralizada por un mecanismo dependiente de energía 
que expulsa sodio y agua al exterior celular. Si la tasa de entrada de agua excede a la capacidad de la 
bomba o si dicha bomba esta alterada, el hematíe gana agua, se hincha y cambia su forma de disco 
bicóncavo a una esfera. Los hematíes normales pueden hincharse entre 1-2 veces su volumen 
original sin perdida del contenido eritrocitario. Sin embargo un aumento superior al volumen, 
produce un defecto en la membrana, que permite la salida de hemoglobina y de otras 
macromoléculas. Este hecho se denomina lisis osmótica. Existen situaciones, derivadas de anomalías 
estructurales eritrociticas en las cuales la lisis osmótica fisiológica se ve favorecida. Dicha situación 
patológica se denomina fragilidad osmótica. 
 14
 
Eritrofagocitosis: Se refiere a la ingestión del hematíe completo por los monocitos o neutròfilos 
circulantes o bien por los macrófagos del sistema reticuloendotelial. 
 
Citolisis inducida por complemento: Una de las propiedades del complemento es su capacidad 
para unirse a las células, pudiendo producir cambios en la estructura de la membrana e inducir la 
lisis celular. Existe escasa evidencia que el complemento este involucrado en la destrucción 
fisiológica de los hematíes, aunque puede tener un gran protagonismo en mecanismos patológicos. 
 
Desnaturalización de la hemoglobina: Cuando los mecanismos enzimáticos que protegen a la 
hemoglobina se alteran esta se desnaturaliza y precipita (cuerpos de Heinz), asociándose a un 
aumento de la permeabilidad de la membrana y un aumento de la fragilidad 
osmótica.(Arguelles,2003) 
 
Hemólisis 
Una vez transcurridos 120 días, a lo largo de los cuales el hematíe ejerce su función transportadora 
es destruido de una manera fisiológica (hemólisis) por los mecanismos expuestos anteriormente. Sin 
embargo, debe recordarse que el termino hemólisis suele emplearse en medicina en el sentido de un 
aumento de la destrucción eritrocitaria. 
 Etimológicamente, la hemólisis puede obedecer a causas muy diversas cuyo denominador común 
es una lesión del eritrocito que condiciona su desaparición precoz de la circulación. 
 15
Al igual que en todo proceso en que disminuye la concentración de hemoglobina, el efecto de la 
hemólisis tiende a ser contrarestado mediante un aumento de la regeneración eritoblastica de la 
medula ósea. En condiciones de estimulo máximo, la medula ósea normal es capaz de aumentar 
entre 6 y 8 veces la producción de los eritrocitos, lo que en teoría permite evitar la aparición de 
anemia, incluso en casos de supervivencia eritrocitaria inferior a 20 días. Ello explica que en algunos 
pacientes con hemólisis no exista anemia, hecho que se conoce como “hemólisis compensada”. En 
general, es preferible emplear el término de síndrome hemolítico para referirse a las manifestaciones 
clínicas y sus correspondientes alteraciones biológicas que permiten poner de manifiesto la 
existencia de hemólisis. 
 
 Tabla 1.5 Manifestaciones clínicas del síndrome anémico 
 -------------------------------------------------------------------------------------- 
 Manifestaciones generales 
 *Astenia 
 *Anorexia 
 *Disnea de esfuerzo 
 
 Manifestaciones cutáneas 
 *Palidez de piel y mucosas 
 
 Manifestaciones cardiovasculares 
 *Taquicardia 
 *Soplo sistólico funcional 
 Manifestaciones neurológicas 
 *Trastornos visuales 
 *Cefaleas 
 *Alteraciones de la conducta 
 
 Otras manifestaciones 
 *Amenorrea 
 *Trastornos digestivos 
 ---------------------------------------------------------------------------------------- 
 
Clasificación de las anemias hemolíticas 
 Fisiológicamente, el 80-90 % de destrucción fisiológica eritrocitaria se produce en el espacio 
extravascular a través de los macrófagos del sistema SMF mientras que el 10-20% restante se 
produce en el torrente vascular, denominándose a estas dos formas de destrucción hemólisis 
extravascular e intravascular respectivamente. 
 16
Es a menudo de importancia diagnóstica identificar el tipo de hemólisis. Especialmente en las 
anemias hemolíticas agudas, la distinción entre hemólisis intravascular y extravascular puede ser un 
paso importante en el diagnóstico. 
En la hemólisis intravascular: En esta situación la hemoglobina se libera dentro de la circulación , 
debiendo ser retirada de la misma por una serie de mecanismos que incluyen: haptoglobina, 
aclaración renal, y destino del hem plasmático. Una de las magnitudes del plasma útiles para 
establecer el origen intravascular del proceso hemolítico es la concentración de hemoglobina libre en 
el plasma o hemoglobinemia. Su valor de referencia rara vez excede a los 0.6mg/dl, pero cuandosupera los 50mg/dl confiere al plasma un color rojizo característico. Aumentos significativas de 
hemoglobinemia solo se observan en casos de hemólisis muy intensa (talasemia) o con marcado 
componente intravascular (anemias hemolíticas inmunes). Cuando el valor de hemoglobinemia 
excede el umbral de absorción renal, se elimina por la orina y aparece hemoglobinuria. La 
hemoglobinuria puede ser detectada visualmente en una muestra de orina centrifugada o con la 
tableta comercial Occultest. 
Debido a la resorción activa de la hemoglobina por los tùbulos renales, solo se ve hemoglobinuria 
con hemólisis intravascular grave. 
En casos de hemólisis intravascular reciente, la hemoglobinemia se acompaña de 
metahemalbuminemia que es un derivado de ella por oxidación. La metahemalbumina persiste 
durante varias semanas después del episodio hemolítico y confiere al plasma un color pardo o 
marrón. Cuando la hemólisis intravascular tiene carácter crónico, la eliminación de pequeñas 
cantidades de hemoglobina por el riñón produce por mecanismos de reabsorción, un depósito de 
hemosiderina en las células del tùbulo renal que pueden ponerse en evidencia mediante la tinción de 
Perls del sedimento urinario (hemosiderinuria). La hemosiderinuria, debido a que no aparece hasta 2 
a 3 semanas de haberse iniciado una hemólisis intravascular. Constituye el mejor criterio para 
afirmar su carácter crónico o persistente. (Satamatelos,2002) 
 17
 
La hemólisis extravascular o reticuloendotelial .La función destructora eritrocitaria del SMF 
(especialmente bazo e hígado), depende del grado de alteración eritrocitaria. De esta manera, si la 
alteración eritrocitaria es importante, la destrucción se realiza en todos los lugares del SMF 
(especialmente en el hígado por su gran flujo sanguíneo), mientras que si la alteración no es tan 
importante, dicha destrucción se realiza en el bazo, debida a circulación lenta y sinuosa que ser 
produce en este órgano. La evaluación de un proceso hemolítico extravascular implica varias 
pruebas de selección y un número de técnicas sofisticadas para señalar con precisión el defecto. 
Especialmente en el campo de defectos intracelulares congénitos se necesitara el laboratorio de 
hematologia especializada. 
 
Tabla 1.6- Evaluación de la hemólisis en el laboratorio 
 Extravascular Intravascular 
DATOS HEMATOLOGICOS 
Frotis sanguíneo Policromatofilia Policromatofilia 
Recuento de reticulocitos Aumentada Aumentada 
Examen de la medula ósea Hiperplasia eritroide Hiperplasia eritroide 
 
PLASMA O SUERO 
Bilirrubina no conjugada Aumentada Aumentada 
Haptoglobina Disminuida o ausente Ausente 
Hemoglobina en plasma Normal o aumentada Muy aumentada 
Deshidrogenada de lactato Aumentada o variable Variable 
 
ORINA 
Bilirrubina 0 0 
Hemosiderina 0 Aumentada 
Hemoglobina 0 Aumentada 
 
 
 
 
 
 18
PRUEBA DE COOMBS DIRECTA 
 Dentro de las exploraciones complementarias la prueba mas empleada en el diagnostico etiológico 
de un síndrome hemolítico es la prueba de la antiglobulina directa (PAD) o prueba de Coombs 
directa. Si l a PAD es positiva, e trata de una anemia hemolítica autoinmune (AHAI) y en este caso, 
la etapa siguiente es investigar la naturaleza del autoanticuerpo. Si la PAD es negativa podemos 
sospechar que la anemia hemolítica es de origen hereditario. 
Fundamento 
La prueba de la antiglobulina directa detecta en general la presencia de anticuerpos incompletos que 
quedan fijos a la superficie de los eritrocitos y que, en si mismos, son incapaces de provocar 
aglutinación. Es decir los hematíes que presentan anticuerpos, como en el caso de la enfermedad 
hemolítica por incompatibilidad Rh, se aglutinan con un antisuero producido inmunizando a un 
conejo con globulina o suero humano 
2.-Material y reactivos 
1.-10 ml de sangre del enfermo mantenida a 37ºC 
2.- Centrifuga 
3.- Tubos de ensayo 
4.- Solución salina 
5.- Suero globulina antihumana (de Coombs) 
6.- Células sensibilizadas con suero antiD (control) 
 
 
 
 
 
 
 19
3.-Método 
Extraer 10ml de sangre del enfermo, poner la sangre en un tubo de centrifugación 
 
 
 
Dejar que la sangre se coagule por si misma a 37ºC 
a 2000 r.p.m durante 10 min. 
 
 
 
Separar el suero y guardarlo en un tubo de ensayo a 37ºC. 
 
 
 
Romper el coagulo y separa la fibrina 
 
 
Llenar el tubo de centrifugación con suero fisiológico previamente 
Calentado a 37ºC, centrifugar a 1000 r.p.m. durante 2 min. 
 
 
Separar y desechar el suero fisiológico. Repetir 3 veces mas la técnica de lavado 
 
 
Pasar 0.2ml de las células sedimentadas y lavadas a un tubo de centrifugación, llenar con solución 
salina y lavar varias veces hasta eliminar aglutinación espontánea 
 
 
Preparar una solución de células al 2% mediante adición 
de 10ml de suero fisiológico. 
 
 
Poner 0.2ml de la suspensión al 2% en un tubo de ensayo limpio 
 
Añadir 0.2ml del suero globulina antihumana de /Coombs 
 
 
 20
Incubar los tubos a 37ºC durante 30 min. Centrifugar durante 1min a 500 r.p.m 
Leer aglutinación. 
 
 
Simultáneamente se efectúa una prueba control de la especificidad 
Del suero antiglobulina (hematíes lavados no sensibilizados) 
 
 
Se realiza otro control de la sensibilidad de la prueba 
(Células sensibilizadas con suero anti-D) 
 
 
 
4.-Valores de referencia 
El grado de aglutinación se ordena de la manera siguiente: aglutinación 1+, reacción débil pero sin 
lugar a dudas diferente al control; 2+, muchos grupos pequeños con tono rosado del liquido 
circulante; 3+, grandes grupos con liquido circulante claro; 4+, aglutinación masiva de todas, o casi 
todas las células. 
Para que la prueba sea valida, la prueba control con las células sensibilizadas debe ser positiva y la 
prueba control con células no sensibilizadas normales debe ser negativa. 
 
5.-Interpretación de resultados. 
La mayor parte de enfermos afectos de una anemia hemolítica adquirida debida a anticuerpos 
tendrán positiva la prueba de la antiglobulina directa de Coombs, por lo que a nosotros nos interesa 
que sea negativa pues ello nos haría sospechar que la anemia hemolítica es de origen hereditario. 
Es decir un examen de Coombs directo positivo indica anticuerpos contra los glóbulos rojos, los 
cuales a su vez pueden indicar la presencia de una de las siguientes condiciones: 
- Anemia hemolítica autoinmune sin otra causa subyacente 
- Anemia hemolítica inducida por medicamentos 
 21
- Eritroblastosis fetal 
- Infección por micoplasma 
- Sífilis 
- Reacción por transfusión como la ocasionada por unidades de sangre de compatibilidad 
inadecuada 
- Entre otras. (Lluis Vives,2002) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 22
Estudio inicial de laboratorio 
 Demostración de la hemólisis 
 Los métodos para demostrar la existencia de la hemólisis consisten en el estudio combinado de lo 
siguiente: 
1. Las magnitudes hematológicas generales o básicas (hemograma y examen morfológico de 
los eritrocitos). 
2. Los signos biológicos de hemólisis (pruebas de hemólisis). 
3. La destrucción eritrocitaria periférica y capacidad de regeneración medular. 
 
Magnitudes hematológicas generales o básicas 
 
BIOMETRÍA HEMÁTICA 
Hemograma 
Fundamento 
 Es uno de los exámenes relativamente simple el cual examinalas células de la sangre y en algunas 
situaciones nos ayuda a la evaluación diagnóstica. Este examen entrega datos sobre el hematocrito 
(Hto), concentración de la hemoglobina (Hb), concentraciones de la hemoglobina corpuscular media 
(CHCM), volumen corpuscular medio (VCM), recuento de reticulocitos. El hemograma incluye 
información sobre la dispersión del tamaño de los eritrocitos (RDW), el que se expresa en % y 
representa el coeficiente de variación del tamaño de los eritrocitos. En el hemograma se analiza 
también el frotis sanguíneo que consiste en la evaluación morfológica de los elementos sanguíneos 
lo cual puede ser especialmente útil en los pacientes con anemia. (Malagon,2002) 
Hemograma láser 
 Ahora bien entre las técnicas utilizadas actualmente para el diagnóstico de las anemias hemolíticas 
hereditarias se encuentra aquella que utiliza un contador electrónico y automatizado de células 
 23
sanguíneas o Hemograma láser el cual proporciona gran cantidad de información que es útil para 
definir la gravedad, fisiopatología y etiología de la anemia, Para verificar los datos, realiza una 
combinación de inmunoperoxidasa, rayo láser, cifras numéricas, citometría de flujo, compleja red 
óptica, cambios morfológicos directos, e histogramas, dando una rápida y panorámica visión del 
paciente con una información completa de la serie eritrocítica, leucocitaria y plaquetaria. 
 
 Por medio de la citometría de flujo incorporada en los equipos hematológicos, se examinan y 
cuantifican tres o más características de una célula, a la increíble velocidad de un millón de células 
por segundo, reconociendo de 1 a 10 células entre 10000 que presentan características diferentes 
aislándolas. Esto permite verificar un estudio más exhaustivo posterior, por medio de histogramas 
impresos, volumen y concentración de hemoglobina para cada hematíe, que le facilitan al clínico la 
obtención de una mirada global hematológica de su paciente. 
Entre los datos hematológicos que proporciona un Hemograma láser y que nos ayuda en el 
diagnostico de una anemia hemolítica hereditaria asociada a defectos a nivel de membrana tenemos: 
 
 Tabla 1.7- Datos hematológicos que proporciona un hemograma 
hemoglobina 
 
Hematócrito 
Cuenta globular (RCB) 
Volumen globular medio(MCV) 
Hemoglobina globular media(MCH) 
Concentración globular media de hemoglobina (MCHC) 
Reticulocitos 
 
 
 
 
 
 24
 
Material y reactivos 
1.-Muestra de sangre venosa o capilar anticoagulada con EDTA 
2.- Espectrofotómetro a 540nm 
3.-Centrifuga de microhematocrito 
4.- Disco lector de hematocrito 
5.-Tubos de ensayo de 13X100 
6.- Pipetas de 1ml 
7.-Pipetas volumétricas de5ml 
8.-Pipetas automáticas de 0.02ml y de Sahli 
9.-Gradilla y capilares de vidrio desechables 
10.-Celdas de 1cm 
11.- Solución EDTA 10% 
12.- Reactivo de Drabkin conocido también como reactivo de cianometahemoglobina 
13.- Solución estándar de Cianometahemoglobina 
14.- Etanol 70% 
3.-Método 
*La hemoglobina Hgb; se mide en gramos por 100 ml y corresponde a la cantidad total de 
hemoglobina en los eritrocitos en 100ml de sangre. Se cuantifica utilizando técnicas 
espectrofotometricas, actualmente el dato también es arrojado por un contador electrónico de células 
sanguíneas. De los métodos espectrofotometricos, el más utilizado en la actualidad, y método de 
referencia de la Sociedad Internacional de Hematología es el de la cianometahemoglobina. En este 
método, la hemoglobina es convertida en cianometahemoglobina al tratar la sangre con una solución 
de ferrocianuro potásico y cianuro sódico. La intensidad del color producido es proporcionar a la 
cantidad de hemoglobina presente. La lectura se realiza a una longitud de onda de 540nm. Este 
 
 25
método mide todas las formas de hemoglobina, incluidas la metahemoglobina y la 
sulfohemoglobina. 
La transformación de la hemoglobina en cianometahemoglobina tiene lugar según el siguiente 
proceso: 
1.- Hemoglobina +ferrocianuro potasico = metahemoglobina 
2.-Metahemoglobina +cianuro de potasio = cianometahemoglobina. 
 
 
Realizar una curva estándar (concentración de hemoglobina contra absorbancia) 
utilizando solución estándar de HbCn y reactivo de Drabkin a diferentes concentraciones. 
 
 
 
Colocar en un tubo 5ml de reactivo de Drabkin 
 
 
 
Homogenizar la muestra problema y tomar con una pipeta de Sahli 
0.02ml de sangre, aforar. 
 
 
 
Transferir el volumen de muestra al tubo que contiene el reactivo de Drabkin 
y enjuagar tres veces la pipeta en la dilución. 
 
 
Dejar reposar durante 10 min. y leer contra un blanco (agua destilada o la 
propia solución de Drabkin) 
 
 
Interpolar lecturas en la curva estándar y obtener el 
Valor de Hb en g/dl. 
 
 
 
 
 
 
 26
 Formula para calcular la concentración de la hemoglobina: 
 
Para calcular la concentración de hemoglobina en cada uno de los tubos de la curva de calibración se 
considera: el volumen de estándar utilizado, la concentración estándar (g/dl) y el volumen total de la 
mezcla. 
 
g/dl de hemoglobina= (ml estándar concentración del estándar (mg/dl)/ ml totales) X (F/1000) 
 
 
F= factor de dilución, cuando se toman 0.02ml de sangre y se agregan 5.0ml de Drabkin 
 
 F= 5.0/0.02 =250 
 
 
 
*El hematocrito Hct; Es el nombre que se le da a la fracción de volumen eritrocitario y corresponde 
al volumen ocupado por los eritrocitos en relación con el volumen total de sangre. 
Un descenso en el hematocrito es indicativo de anemia, mientras que un aumento lo es de 
poliglobulia. No obstante, debe tenerse en cuenta que el valor diagnostico del hematocrito depende 
en gran medida de que el volumen plasmático sea normal. Así un descenso en el volumen plasmático 
(hemoconcentraciòn) se traducirá en un aumento relativo del hematocrito y también de la 
concentración de hemoglobina y por lo tanto, una falsa poliglobulia. Por lo contrario, un aumento del 
volumen plasmático (hemodiluciòn) producirá un descenso del hematocrito y también de la 
concentración de hemoglobina y con ello una falsa anemia. Otro factor que se debe tener en cuenta 
es que el hematocrito, determinado a partir de sangre venosa, es siempre algo inferior al que se 
obtiene cuando se emplea sangre capilar. 
 Además de la determinación del índice Hematócrito por medio de un contador electrónico se han 
propuesto varios métodos. 
 
 
 
 
 27
Técnica del Microhematòcrito 
Se determina aplicando a la sangre total una fuerza centrifuga en un tubo capilar 
 
 
Llenar 2/3 partes de dos tubos capilares con sangre muestra 
 
 
 
El extremo vacío se cierra con flama efectuando movimiento rotatorio 
 
 
 
Colocar los capilares en los canales de la centrifuga 
Con el extremo cerrado dirigido hacia fuera 
 
 
Centrifugar a 1200r.p.m durante 5minutos 
 
 
Usando un disco lector de hematocrito se determina el valor 
de hematocrito en valor porcentual, o bien manualmente midiendo la altura (M2) 
con relación al volumen total de muestra (M1) 
 
 
 La diferencia entre los dos valores obtenidos no debe ser nunca superior a 
0.01. 
 
 
 M1-----------------100% 
 M2-----------------X % (valor del hematocrito) 
 
 
 
 
 
 28
Índices hematológicos 
 
 Relacionan la concentración de la hemoglobina, con la de eritrocitos y el hematocrito para poder 
aprovechar mejor la información proporcionada de estos parámetros. Por lo general tienen poco 
interés en la enfermedad hemolítica puesto que los índices son promedios de una población 
heterogénea de glóbulos rojos, incluso es posible que el elevado numero de células normales 
enmascare grados leves de microesferocitosis.( Lluis Vives, 2002) 
 
**El volumen corpuscular medio o volumen celular VCM; Es el volumen ocupado por cada un 
eritrocito, semide directamente en los aparatos automatizados, expresado en femtolitros (10 a la 
menos 15 litros) pero también puede calcularse por medio de la siguiente formula: 
 VCM (fL) = Hematócrito x 10 / cuenta eritrocitaria x 10 a la seis microlitos de sangre entera. 
 
El VCM clasifica a una anemia como microcítica (VCM menor a 80fl), macrocitica (VCM mayor a 
100fl) o normocítica (VCM 80-100fl ). 
**La hemoglobina corpuscular media (HCM); es la cantidad media de hemoglobina que contiene 
cada glóbulo rojo, y se expresa en picogramos. La hemoglobina corpuscular media es directamente 
proporcional a la cantidad de hemoglobina y también al tamaño de los glóbulos rojos, es posible 
obtenerla por medio de la expresión: 
 HCM (pg) = Hemoglobina x 10 /cuenta eritrocitaria x 10 a la seis microlitos de sangre entera. 
La HCM está elevada en las anemias macrocíticas y disminuida en las anemias microcíticas. 
 
**La concentración corpuscular media de la hemoglobina (CCMH); Corresponde a la 
concentración de hemoglobina por cada litro de eritrocitos (sin consideración del plasma). Se calcula 
por medio de la expresión en los contadores automatizados de la manera siguiente: 
 29
 CCMH = Hemoglobina x 100/ Hematócrito. 
 
Valores de referencia 
Tabla 1.8-Valores normales de los análisis eritrocitarios 
 
ANÁLISIS UNIDADES INTERVALO NORMAL 
Hemoglobina g/100mL Varones:13.5 a17.5 
Mujeres:12.0 a16.0 
Hematócrito % Varones: 40 a 52 
Mujeres: 36 a 48 
Cuenta globular (RCB) X 10 a la 6/microlitro de 
sangre 
Varones:4.5 a 6.0 
Mujeres: 4.0 a 5.4 
Volumen globular 
medio(MCV) 
 fL 81 a 99 
Hemoglobina globular 
media(MCH) 
 Pg 30 a 34 
Concentración globular 
media de hemoglobina 
(MCHC) 
g/100mL 30 a36 
Reticulocitos Núm/microlitro de sangre 40000 a 100000 
*El intervalo de lo normal en muchas de estas cifras varía ligeramente conforme a ciertos 
factores, como la ubicación y el tipo de equipo utilizado, la altura por arriba del nivel del mar y 
la edad del paciente. 
 
 
Interpretación de resultados. 
 
El criterio básico de la OMS basado en la concentración de hemoglobina, la definición de la anemia 
puede así mismo incluir los valores de hematocrito y el conteo de hematíes. Así se considera que un 
hombre padece anemia cuando tiene un recuento de glóbulos rojos menor de 4.5 millones, menos de 
14g/dl de Hb y 42% de hematocrito. Dichos valores en la mujer son de 4 millones, 12g/dl y 37 %, 
respectivamente. (Arguelles, 2003) 
 
 
 
 
 30
EL EXAMEN MICROSCOPICO DE LA MORFOLOGIA ERITROCITARIA (TINCION WRIGHT) 
Fundamento 
Los colorantes usados son mezclas de compuestos como el azul de metileno y colorantes ácidos 
como la eosina. Los ácidos nucleicos, las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma 
inmaduro, fijan el azul de metileno (componentes basòfilos). La eosina fija a las moléculas de 
hemoglobina y a las proteínas básicas (componentes eosinófilos). Otras estructuras se tiñen con 
ambos colorantes (neutròfilos). 
 Material y reactivos 
1.- Portaobjetos perfectamente lavados con agua y jabón, luego con agua caliente abundante y 
posteriormente con agua destilada 
2.- Muestra de sangre capilar o sangre venosa anticoagulada (EDTA). 
3.- Solución de la tinción de Wright 
4.- Solución amortiguadora de fosfatos p H 7.2 
5.- Microscopio y cámara de tinción. 
 
Método. 
Preparación del frotis (método de cubreobjetos o de portaobjetos) 
 
Colocar la preparación de sangre secada al aire, con la parte del frotis hacia arriba 
 
Recubrir por completo el frotis con la tinción de Wright 
 Reposar durante 2 minutos 
Añadir tampón y soplar con suavidad sobre la superficie 
 Reposar durante 3 minutos 
Eliminar la espuma por flotación con una corriente de agua. 
 31
 
Eliminar el exceso de agua 
 
Secar el frotis moviéndolo con cuidado al aire 
 
Examinar primero la preparación a baja potencia para determinar la distribución 
 
Seleccionar la mejor área para el examen detallado 
 
Examinar los hematíes en cuanto a tamaño, forma, color, y formas normales 
 
Valores de referencia 
En una buena tinción, la preparación debe parecer rosa a simple vista; microscópicamente, los 
hematíes serán rosas; los nucléolos de los leucocitos, azul púrpura, los gránulos neutrofilicos, violeta 
rosado o lila, los gránulos eosinofilicos rojo y las bases de los núcleos quedaran claramente 
diferenciados. Las áreas comprendidas entre las células aparecerán claras, sin capas o tinción 
precipitada visible. 
 
Interpretación de resultados. 
 La observación minuciosa de la morfología eritrocitaria constituye hoy en día, y a pesar de los 
avances de la automatización, una prueba obligada en el estudio inicial de toda anemia hemolítica. 
Esto se debe a que, en algunos casos, la observación morfológica de la extensión sanguínea permite 
por si solo establecer el diagnostico. (González, 2006) 
 
 
 32
Signos biológicos de hemólisis 
 Existen diversas magnitudes biológicas del plasma de gran utilidad diagnostica, ya que 
constituyen signos indirectos de destrucción eritrocitaria, anteriormente ya han sido mencionadas 
aquellas que son de utilidad diagnostica para hemólisis intravascular, en este trabajo daremos 
prioridad a las utilizadas para el diagnostico de hemólisis extravascular. 
 La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima del plasma cuya actividad suele hallarse 
aumentada en el curso de la hemólisis por liberación a partir de la lisis eritrocitaria. No obstante 
carece de gran especificidad, ya que puede hallarse también aumentada en otras situaciones no 
debidas a hemólisis, por ejemplo insuficiencia renal. 
 Haptoglobina (Hp). El descenso de la concentración de haptoglobina en plasma constituye otro 
signo de destrucción eritrocitaria útil en la práctica clínica .Su especificidad no obstante, es similar al 
del aumento de la actividad de la LDH plasmática, ya que la anemia megaloblastica presenta un 
comportamiento similar. 
1.-Fundamento 
La haptoglobina es una alfa globulina, de peso molecular 85.0 que es capaz de fijar la hemoglobina 
cuando esta se halla circulando libremente en el plasma. Gracias ello se evita la eliminación renal de 
hemoglobina en condiciones fisiológicas, ya que el complejo hemoglobina-haptoglobina no puede 
atravesar el filtro glomerular. No obstante, cuando en ciertas situaciones patológicas el nivel de 
hemoglobina libre en plasma sobrepasa los 125mg/dl, se agota la capacidad de fijación de la 
haptoglobina y se elimina directamente por la orina. 
La determinación de la concentración de haptoglobina se basa en su capacidad para aumentar la 
actividad peroxidasa de la metahemoglobina, la cual se determina utilizando la oxidación del 
guayacol. 
 
 33
2.-Material y reactivos 
 1.- Reactivo de guayacol 
 2.- Peróxido de hidrógeno 0.05mol/L. 
 3.- Ferrocianuro (sòdico o potasico) en solución (1g/L) 
 4.- Solución de metahemoglobina 
 5.- Cloruro sòdico 0.15 mol/L (Solución salina fisiológica) 
 6.- Suero problema 
 3.-Método 
 
Diluir un volumen de suero problema en 4 volúmenes de cloruro 
sòdico 0.15mol/L 
 
 
 
Introducir en dos tubos de ensayo 1 ml de la solución anterior 
 
 
 
A uno de ellos (problema) añadir 1 ml de solución de metahemoglobina 
al restante (blanco) añadir 1ml de agua destilada 
 
 
 
Introducir 5ml de guayacol en dos tubos de ensayo, mantenerlos a baño Maria 
25ºC durante 10 min. 
 
 
 
A continuación añadir 0.1ml de solución de suero problema-metahemoglobina 
uno de ellos y 0.1ml del blanco a otro 
 
 
Inmediatamente, añadir a ambos tubos 1ml de solución de peroxido de hidrogeno 
de hidrogeno mantenida previamente a 25ºC, mezclar vigorosamente 
 
 
A los 8 min. leer las absorbancias a partir de na curva de calibración 
previamente preparada y se expresa en términosde metahemoglobina fijada. 
 34
4.-Valores de referencia 
El valor de referencia de la haptoglobina varia entre 0.33 y 2.13 g/L 
5.-Interpretación de resultados. 
Se observan marcados aumentos en diversos estados inflamatorios, mientras que por lo contrario, 
disminuye en las enfermedades hepáticas agudas o graves y en el curso inicial de las anemias 
hemolíticas (Lluis Vives, 2002) 
. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 35
Destrucción de eritrocitos y regeneración medular. 
Hay varios procesos que pueden abreviar la supervivencia de los eritrocitos y producir anemia si la 
medula ósea no es capaz de reponer los eritrocitos que se destruyen prematuramente. 
 Aunque la determinación de la vida media eritrocitaria (Cr51 T/2), continua siendo el procedimiento 
mas directo y especifico para cuantificar el grado de destrucción eritrocitaria, su carácter engorroso y 
molesto para el paciente, hace que se reserve únicamente para casos en los que es estrictamente 
necesario. En un individuo normal el valor de Cr 51 T/2 varía entre 25 y 32 días y, como puede 
apreciarse, no corresponde con el real (aproximadamente 60 días) debido a los factores inherentes a 
la técnica y por los que se pierde parte importante de la reactividad inicialmente inyectada. Con todo 
el valor de Cr51 T/2 constituye una medida útil en clínica por cuanto informa sobre la supervivencia 
de los eritrocitos en la circulación y, a la vez, cuantifica la intensidad con que se realiza dicha 
eliminación. 
Entre los procedimientos que indican la existencia de un aumento de la actividad eritropoyètica 
medular destacan el siguiente: 
 36
1. La concentración de reticulocitos en sangre es una determinación obligada cuando se 
sospecha de hemólisis, ya que en esta situación se halla característicamente aumentada. 
Normalmente los reticulocitos, producto inmediato de la expulsión del núcleo eritoblàstico, se 
caracterizan por su forma esferoidal y superficie invaginada durante los 4 días que permanecen en la 
medula ósea antes de aparecer en la sangre. En la anemia hemolítica, la aceleración del proceso 
madurativo eritoblàstico se acompaña de una salida prematura de reticulocitos, con lo que estos 
abandonan la medula ósea antes de terminar su periodo madurativo normal. Este fenómeno se 
conoce con el nombre de desviación reticulocitaria y se caracteriza por la presencia en la sangre de 
macrocitosis, los macrocitos de coloración azulada y con un fino punteado basòfilo son siempre un 
reflejo de estrés eritropoyètico y su presencia, en caso de reticulocitosis intensa es prácticamente 
siempre, constante. El uso apropiado de la cuenta de reticuocitos implica su conversión a un índice 
que refleje la intensidad de producción de eritrocitos. Se requiere de una corrección inicial para el 
defecto de la eritropoyetina sobre la liberación de reticulocitos por la medula ósea. El índice del 
reticulocito, derivado de esta corrección, refleja la intensidad de producción de eritrocitos en 
comparación al estado basal. En la anemia hemolítica, la intensidad de producción habitualmente es 
de 3 a 8 veces mas de lo normal, de modo que un índice 3 o más se tomo como prueba de hemólisis 
excesiva. 
1.-Fundamento 
El número de reticulocitos es otra cifra que proporciona un contador electrónico automatizado de 
células sanguíneas, pero también el recuento se realiza aprovechando la característica de que los 
reticulocitos son hematíes inmaduros que conservan parte de su RNA. 
Los organelos citoplasmáticos y el ARN residual son precipitados y teñidos con una tinción 
supravital, con azul de cresil brillante o con nuevo de metileno. Se prepara frotis y se cuentan los 
elementos que tienen un precipitado reticular teñido. Las cifras obtenidas son reportadas en valores 
porcentuales. 
 2.-Material y reactivos 
 1.- Sangre capilar o venosa con anticoagulante (EDTA) 
 2.- Microscopio 
 3.- Contador de células 
 4.- tubos de ensayo 
 5.- Pipetas Pasteur con bulbo 
 6.- Portaobjetos 
 7.- Cubreobjetos 
 8.- Gradilla y cámara de tinción 
 9.- Piseta y vaso de precipitados 
 
 37
 Reactivos 
1.- Solución de nuevo azul de metileno 
2.- Solución de azul cresil brillante 
3.- Aceite de inmersión 
3.-Método 
 Tinción y examen microscopio o contadores hematológicos. 
El recuento de reticulocitos debe realizarse dentro de las primeras 24 horas después de la toma de 
muestra. 
Colocar en un tubo 3 gotas de sangre 
 
 
 
Adicionar 3 gotas de colorante supravital 
 
 
 
Mezclar suavemente y dejar en reposo 15min. 
 
 
 
Tomar una gota de mezcla y realizar un frotis 
 
 
Observar el frotis con el objetivo de inversión (100X) 
 
Contar las células que tienen gránulos azules en un total de 500 hematíes 
 
4.-Valores de referencia 
POBLACION VALORES RELATIVOS % VALORES ABSOLUTOS X109/L 
Reticulocitos 0.5-2.0 50-100 
 
 
 38
5.-Interpretación de resultados. 
Cuando disminuye el número de eritrocitos como suele suceder en una anemia, el valor porcentual 
debe corregirse según el valor del hematocrito. 
Se contaran 1000 eritrocitos, normalmente se observan de 5 a 15 reticulocitos aproximadamente en 5 
campos, se utiliza un contador celular. 
(No de Reticulocitos/ 1000 eritrocitos) X 100 = % reticulocitos 
% Reticulocitos corregidos = Reticulocitos observados X (Hto. Paciente/ Hto. Normal 45%) 
 Índice de producción eritrocitaria (IPR) 
IPR = (%Reticulocitos X Hto. Paciente/ Hto. Normal) / Periodo de maduración en días 
IPR menor a 2 escasa actividad eritropeyètica 
IPR mayor a 3 aumento en actividad eritropoyètica. 
 
7.-Variables por enfermedad 
Los reticulocitos se observan aumentados en: 
- Anemias hemolíticas 
- Anemias posthemorragicas 
- Hepatitis viral 
- Leucemia 
- Eritroblastosis fetal entre otras. 
 
8-Comentarios 
 El nuevo azul de metileno es superior al azul de cresilo brillante para la tinción de reticulocitos. 
Con el nuevo azul de metileno la tinción del reticulocito es de un azul mas oscuro y el reticulocito 
sobresale en fuerte contraste con el color ligero azul-verdoso de los hematíes. (Lluis Vives, 2002) 
 
 39
III TÉCNICAS ACTUALES DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DE ANEMIAS 
HEREDITARIAS ASOCIADAS A DEFECTOS A NIVEL DE MEMBRANA 
ERITROCITARIA 
 
1.- ESFEROCITOSIS HEREDITARIA 
Antiguamente era llamada ictericia hemolítica congénita o ictericia crónica familiar, las 
manifestaciones clínicas pueden ser tan leves que a menudo la enfermedad no se reconoce hasta la 
edad adulta. Los individuos con Esferocitosis hereditaria se clasifican en portadores silenciosos, 
leves moderados, ligeramente graves y graves. (Herrera Mayelin, 2002). 
El defecto de la membrana en la Esferocitosis hereditaria es en una de las proteínas que enlaza el 
esqueleto de la membrana eritrocitaria con la doble capa de lípidos. Entre estas proteínas figuran 
espectrina ya sea de la cadena alfa o beta, ankirina, banda tres y proteína 4.1, los defectos de estas 
proteínas provocan una deficiencia de espectrina como “vía final común” que caracteriza a los 
glóbulos rojos con Esferocitosis hereditaria. 
 
Ilustración 3: Esferocitos (De Carr JH, Rodak; Clinical Hematology Atlas 
 
 40
Formación del esferocito 
 
Los reticulocitos y los precursores iniciales del esferocito son normales. El paso del esferocito se 
produce en la circulación y va acompañado de supervivencia celular reducida y enfermedad 
hemolítica. 
 
 El déficit de espectrina ocasiona Existen pedidas de fragmentos 
 menor estabilidad de membrana al no soportar las fuerzas de cizalla 
 de la circulación. 
 
 Se reduce el cociente superficie/volumen 
celular 
 
 Loshematíes adoptan una forma que 
 suponga el menos diámetro para 
 un determinado volumen (esfera) 
 
 
 
 El eritrocito defectuoso solo 
 vive algunas horas o 25 días 
 en casos moderados. 
 
 
1. Manifestaciones clínicas 
 
Síntomas y signos 
 
 Aunque la mayoría de los pacientes tienen una hemólisis compensada y raras veces son 
sintomáticos, las complicaciones pueden requerir intervención medica .Los pacientes pueden sufrir 
diferentes crisis clasificadas como hemolíticas, aplásicas y megaloblásticas, generalmente la 
enfermedad es más seria cuando los síntomas aparecen en la infancia que cuando lo hacen más tarde. 
Durante una crisis se puede producir la muerte, puede producirse una descompensación cardiaca y 
 41
sobrevenir una enfermedad de la vía biliar. Sin embargo, muchos pacientes llegan a una edad 
avanzada a pesar de la anemia crónica. 
 El descubrimiento de cálculos biliares en una persona joven debe hacer sospechar la presencia de 
anemia hemolítica esferocitica, estos cálculos de bilirrubinato se forman por la excesiva producción 
de bilirrubina que acompaña a la hemólisis continua. (Karadimitis, 2002). 
 Los portadores silenciosos, están asintomático, no presentan anemia, esplenomegalia, ni 
 
Esferocitosis. La Esferocitosis leve presenta una hemólisis compensada, en la que la producción 
 
 y destrucción de eritrocitos están equilibradas. Sin embargo en pacientes con Esferocitosis 
 
moderada a grave las manifestaciones clínicas más comunes son la ictericia y la 
 
Esplenomegalia. Es característico de la Esferocitosis hereditaria un aumento moderado del bazo 
 
(500 a 1000g), son pocas las anemias hemolíticas en las que la esplenomegalia es tan intensa o 
 
tan frecuente. 
 
 Puede asociarse dolor abdominal, vómitos, taquicardia y fiebre. Pero son los síntomas de origen 
biliar los que llevan al paciente por primera vez a consultar al medico. Las hemorragias nasales son 
comunes en la infancia pero no se producen hemorragias en otras partes del cuerpo. A veces los 
ganglios linfáticos pueden estar agrandados. 
 La anormalidad esquelética más común asociada a la Esferocitosis hereditaria es el cráneo en forma 
de Torre y en el estudio radiológico puede observarse engrosamiento y estriación huesos frontal y 
parietal. Si los síntomas comienzan en la infancia, el crecimiento puede deteriorarse, incluso 
producir infantilismo. (Tirney J.R, 2002). 
 
 
 
 
 
 
 
 42
2. Manifestaciones de laboratorio 
 
Prueba 1.-Hemograma 
. 
Interpretación de resultados. 
 a) Hemoglobina: En la Esferocitosis hereditaria los niveles de hemoglobina se encuentra entre 9 y 
12 g/dl, durante una crisis se puede producir una caída rápida de 3 ó 4 g/dl. 
 
 b) Volumen corpuscular medio (VCM): El VCM depende del grado de reticulocitosis, del nivel de 
hierro en la sangre y del compromiso megaloblastico, por lo tanto en la anemia esferocitica 
hereditaria el VCM puede estar normal, aumentado o muy disminuido. 
 
 
 c) Hemoglobina corpuscular media (HCM): En la Esferocitosis hereditaria la HCM suele estar 
aumentada como consecuencia de la deshidratación de los eritrocitos. 
 
 d) La concentración globular media de la hemoglobina (MCHC): su mayor utilidad es cuando está 
aumentada, mayor de 36 g/dl, porque es muy característico de la Esferocitosis hereditaria en 
alrededor del 50% de los pacientes. En algunos pacientes puede llegar a 40g/dl o más. (Miale, 2001) 
 
 
Prueba 2.- Recuento de reticulocitos 
 
Interpretación de resultados. 
 En la anemia esferocitica hereditaria los reticulocitos, en forma característica están aumentados en 
número. Los valores entre 5 y 20 % son comunes pero pueden ser muy altos de 50 y aun de 92 % o 
muy bajos de 2%. 
 
 43
 
Prueba 3.- Tinción de Wright. Examen morfológico de células eritrocitarias 
Interpretación de resultados. 
El frotis de sangre periférica de un paciente con Esferocitosis hereditaria demuestra la presencia de 
esferocitos “células pequeñas que han perdido la palidez central a causa de su forma esférica más 
que bicóncava. La presencia de esferocitos no siempre indica anemia esferocitica congénita. Un 
hematíe normal adopta forma esferoidal cuando se altera su medio ambiental, por ejemplo cuando 
varía el p H o la concentración de electrolitos. (García Conde J, 2004). 
 
3. Enfoque diagnostico 
 
Prueba 4.- Fragilidad osmótica presuntiva 
Fundamento 
Es la prueba más utilizada para el diagnostico de la Esferocitosis hereditaria, la cual mide la 
habilidad de los glóbulos rojos de incrementar su volumen cuando son sometidos a soluciones 
hipotónicas de cloruro de sodio de concentraciones variables. Debido a que los eritrocitos tiene una 
relación superficie /volumen disminuida, presentan una capacidad disminuida de aumentar su 
volumen y se lisan a una concentración de sales más elevada que las células normales. 
 
 Material 
1.- Tubos de ensayo 
2.- Sangre venosa oxolatada 
3.- Solución 0.85% de cloruro sòdico 
4.- Solución 0.50% de cloruro sòdico 
 
 
 44
 
Método. 
 Pipetear 0.1ml de sangre venosa oxolatada en dos tubos 
 
 
 
Pipetear 1 ml de solución 0.85% de cloruro sòdico al primer tubo 
 
 
 
Pipetear 1ml de solución 0.50% de cloruro sòdico al segundo tubo 
 
 
 
Mezclar y centrifugar 
 
 
Valores de referencia 
Hemólisis inicial o mínima (4,50 –5.00 g/l) 
Hemólisis total o máxima (2.50-3.50 g/l) 
 Al comenzar la hemólisis se habla de resistencia globular mínima y cuando la hemólisis se completa 
de resistencia globular máxima 
Interpretación de resultados. 
Si se observa hemólisis en el segundo tubo, probablemente la fragilidad osmótica de los hematíes 
esta aumentada. (Lluis Vives, 2002) 
 
 
Prueba 5.- Fragilidad osmótica cuantitativa 
 
Fundamento 
La membrana del eritrocito es semipermeable, es decir permite el libre paso de agua a través, pero 
restringe el de ciertos solutos iónicos (Cl., K y Na principalmente). Debido a ello cuando el 
eritrocito se incuba en un medio hipotónico de concentración iónica inferior a la de su interior, existe 
 45
una entrada de agua y, con ello, una hidratación del eritrocito. Si la hipotonía del medio supera cierto 
límite, se aprecia una alteración de la membrana, por lo cual sobreviene una salida masiva de la 
hemoglobina hacia el medio o hemólisis. Debido a su forma de disco bicóncavo, los eritrocitos 
pueden aceptar sin hemolizar una entrada de agua capaz de aumentar su volumen hasta un 70%. 
La medida de la capacidad de una población de eritrocitos para resistir el efecto hipotónico del 
medio se denomina resistencia osmótica eritrocitaria (ROE) 
Los eritrocitos se someten a tensión metabólica incubándolos en ausencia de glucosa durante 24h a 
37 grados Celsius. (Aixala T.F, 2001). 
 
 Material 
1.-15 a 20 ml de sangre en condiciones asépticas. No se usaran nunca anticoagulantes como el 
oxalato o el citrato debido a su efecto sobre la concentración salina del medio hipotónico. 
2.-Cuentas de cristal 
3.-Pipetas y viales 
4.- Soluciones de cloruro sòdico de diferentes concentraciones 
5.-Espectrofotómetro 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 46
Método. 
Se extrae de 15 a 20 ml de sangre en condiciones asépticas 
 
 
 
Se ponen en un matraz Erlenmeyer estéril con 15 cuentas de cristal, 
y se hace girar suavemente (sangre desfibrinada) 
 
 
 
Colocar 5ml de soluciones de cloruro sòdico al 0.85, 0.75, 0.65, 0.60 
0.55, 0.50, 0.45, 0.40, 0.35, 0.30, 0.20 y 0.10% a una serie de tubos. 
 
 
 
Añadir 0.05ml de sangre desfibrinada a cada tubo 
 
 
Mezclar las solucionesy dejarlas a temperatura ambiente durante30min. 
 
Mezclar otra vez los soluciones, centrifugar durante 5min a 2.00 r.p.m y 
aspirar los líquidos sobrenadan tes 
 
 
La hemólisis puede leerse a simple vista y anotarse como punto inicial 
y hemólisis completa. Para efectuar un trabajo mas cuantitativo, se leen las 
soluciones sobrenadan tes en el fotocolorimetro 
 
 
La fragilidad osmótica después de incubar la sangre a 37ºC durante 24 horas se 
determina de la misma manera pero con soluciones mas salinas 1.2,0.90,0.80 y0.70% 
de cloruro sòdico 
 
 
Es aconsejable efectuar una prueba paralela con un control normal 
 
Se realiza una grafica en donde los porcentajes de hemólisis se anotan 
en las ordenadas de la grafica y las concentraciones de cloruro sòdico en las 
abscisas. 
 
 47
 
 
Fig. 4: Curvas de fragilidad osmótica eritrocitaria .Porcentaje de hemólisis para cada concentración de 
NaCl, tanto en fresco como tras incubación a 37°C durante 24h 
 
La curva es sigmoidea, lo cual refleja una población eritrocítica heterogénea 
Valores de referencia 
Tabla 1.9- Valores normales de la fragilidad osmótica 
 
Concentración en % de cloruro 
sòdico 
% de hemólisis antes de 
incubación 
% de hemólisis después de la 
incubación 
0.85 0 0 
0.75 0 0-2 
0.65 0 0-19 
0.60 0 0-40 
0.55 0 5-70 
0.50 0-5 36-88 
0.45 0-45 54-96 
0.40 50-90 65-100 
0.35 90-99 72-100 
0.30 97-100 80-100 
0.20 100 91-100 
0.10 100 100 
 48
 
Interpretación de resultados. 
La fragilidad osmótica incubada indica simplemente la presencia de esferocitos y no diferencia entre 
una Esferocitosis hereditaria y otra debida a otras causas, como las quemaduras. 
La curva ROE puede adoptar diferentes formas según el porcentaje de esferocitos circulantes. 
(Serrano, 2006) 
 
 
Prueba 6.- Prueba de la autohemólisis 
 
Fundamento 
Los eritrocitos mantienen su integridad (estructura y función hemoglobinica) gracias a su escaso, 
pero suficiente contenido en ATP, que obtiene exclusivamente a través de la glucólisis, es decir de la 
oxidación de glucosa a piruvato. Si por un defecto congénito el metabolismo disminuye la capacidad 
glucolìtica del eritrocito, el descenso de ATP producirá un acortamiento de su supervivencia o vida 
media, y por lo tanto, una anemia hemolítica. 
La prueba de autohemólisis a 37ºC tiene como finalidad poner de manifiesto la capacidad de los 
eritrocitos para mantener su integridad in vitro después de un cierto tiempo (24h) de incubación 
frente a su propio plasma. Esta prueba se realiza tanto en presencia como en ausencia de cantidades 
suficientes de glucosa con el fin de valorar las necesidades metabólicas de la célula en dichas 
condiciones. 
 
 
 
 
 49
 Material y reactivos 
1.- Solución de glucosa al 10% 
2.- Solución de adenosin trifosfato (ATP) 
3.- 20 ml de sangre en condiciones estériles 
4.-Cuentas de cristal 
5.-Viales con tapones de rosca 
6.- Espectrofotómetro 540nm 
7.- Sangre total desfibrinada estéril 
8.-Estufa de cultivos 
Método. 
Extraer 20ml de sangre en condiciones estériles. 
 
 
 
Se ponen en un matraz Erlenmeyer estéril con 15 cuentas de cristal, 
y se hace girar suavemente (sangre desfibrinada) 
 
 
 
Preparar 6 viales de 5ml con tapones de rosca, añadir 0.1ml de solución 
de glucosa a los viales 3y 4. 
 
 
 
Añadir 0.1ml de solución de ATP a los viales 5 y 6 
 
 
Añadir a cada vial 2ml de sangre desfibrinada estéril 
 
Poner los 6 viales en un incubador a 37ºC y dejar en reposo 24 horas 
 
 
Al cabo de 24 horas, hacer girar lentamente unas 5 a 10 veces y luego 
Dejar reposar durante 24 horas más en el incubador 
 
 50
 
Después de un periodo total de 48 horas de incubación observar si hay contaminación 
sino hay, centrifugar para obtener el suero. 
 
La cuantía de hemólisis espontánea se determina midiendo la 
cantidad de hemoglobina que tiene el suero. Para hacerlo se diluye el 
suero de 1:25 o al 1:50, según el grado de hemólisis. 
 
 
Como blanco se usa una dilución adecuada del suero sin incubar y como patrón 
una dilución al 1:100 o al 1:200 de la sangre total. 
 
 
Siempre es aconsejable efectuar una serie control de pruebas con sangre normal 
 
Valores de referencia 
 El tanto por ciento de hemólisis, teniendo en cuenta la variación del volumen de los hematíes 
sedimentados producida por la incubación, se calcula de la siguiente manera: 
% hemólisis= (D2- D3) X dil. Suero X (100-V.H.S/D1 X dil. de la sangre) 
D1= densidad óptica de la sangre total diluida 
D2= densidad óptica de suero diluido después de la incubación 
D3= densidad óptica del suero diluido sin incubar 
V.H.S= volumen de los hematíes sedimentados en ml/100ml 
 L a sangre normal sufre muy poca hemólisis espontánea al incubarla durante 48 horas en 
condiciones estériles. 
 La adición de la glucosa o de ATP reduce el grado de hemólisis .La cifra de autohemólisis hallada 
en la sangre normal varia según la exactitud de las condiciones en que se efectúa la prueba. 
 
 
 51
Tabla 1.10- Valores normales de autohemólisis 
 
 
Interpretación de resultados 
Ningún aditivo Aditivo Glucosa Aditivo ATP 
 2 
 (0.2-4) 
 0.3 
 (0.1-0.6) 
 0.2 
 (0.1-0.8) 
 
La prueba de autohemólisis es relativamente sensible para la Esferocitosis hereditaria, pero en 
muchos laboratorios no se usa en forma sistemática porque los resultados son variables y en 
poblaciones normales hay resultados falsos positivos. 
Tabla 1.11- Valores de autohemólisis para esferocitosis 
 
 
 
Ningún aditivo Aditivo Glucosa Aditivo ATP 
 16 
 (6-30) 
 3 
 (0.2-14) 
 3 
 (1-6) 
Prueba 7.- Prueba de la lisis de glicerol acidificado (PLGA) 
 
Fundamento 
. Es otra prueba de fragilidad eritrocitaria basada en la medida del tiempo (en segundos) que tarda 
en iniciarse la hemólisis de los eritrocitos cuando estos se incuban en una solución acidificada de 
glicerol. Lamentablemente a pesar de su simplicidad, esta prueba presenta escasa reproducibilidad y 
una elevada variabilidad entre laboratorios 
 
 
 
 
 52
 Material y reactivos 
1.-3ml de sangre total con heparina o EDTA 
2.-Solución amortiguadora de fosfato 0.1M (solución A) 
3.-Solución de glicerol 0.3M (solución B) 
4.-Espectrofotómetro y cronometro 
5.-Micro pipetas 
 
Método. 
Los reactivos deben estar a temperatura ambiente y el espectrofotómetro equilibrado a 625nm 
con un blanco 1ml solución A + 2ml solución B 
 
 
 
Introducir en un tubo 5ml de solución A, añadir 20 microlitos de sangre total. 
 
 
 
Mezclar, pipetear 1ml de la suspensión e introducirlo 
en la cubeta de lectura 
 
 
 
Añadir 2ml de solución B, mezclar y leer inmediatamente 
la absorbancia inicial, una vez estabilizada, dispara el cronometro 
 
 
Anotar los valores de absorbancia cada minuto hasta los30min 
realizar el calculo 
 
Porcentaje de hemólisis= 100-(absorbancia cada minutox100/absorbancia inicial) 
 
 
 
 
 53
Valores de referencia 
El valor normal siempre es superior a 1.800 seg. después de 30 min. Así pues, para eritrocitos 
normales se considera que la lisis frente al glicerol acidificado se inicia después de 1.800seg de 
incubación. 
 Interpretación de resultados 
 
En la esferocitosis hereditaria el valor de PLGA es prácticamente inferior a 1.800seg lo que significa 
que el fenómeno de hemólisis frente a este medio es superior al que se observa para los eritrocitos 
normales. 
La PLGA puede resultar positiva menor a 1.800seg en las anemias autoimunes cuando cursan con 
esferocitos circulantes, embarazo, leucemias crónicas y enfermedades renales. (Lluis Vives, 2002) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 54
2. ELIPTOCITOSIS HEREDITARIA 
 
 En los pacientes con Eliptocitosis hereditaria