Análisis de comunidades microbianas en tapetes hipersalinos

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
 
 
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 
 
 
 
 
 
 
 
“ANÁLISIS DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS 
ASOCIADAS A TAPETES HIPERSALINOS DE LA LAGUNA 
ROSADA DE UAYMITUN, YUCATÁN, MÉXICO” 
 
 
 
TESIS 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 
 
 
PRESENTA: 
 
 
B. M. SALVADOR ELÍAS CASTELL GONZÁLEZ 
 
 
REYNOSA, TAMPS DIEMBRE DEL 2010 
 
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
 
 
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 
 
 
 
 
 
 
 
“ANÁLISIS DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS 
ASOCIADAS A TAPETES HIPERSALINOS DE LA LAGUNA 
ROSADA DE UAYMITUN, YUCATÁN, MÉXICO” 
 
 
 
TESIS 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 
 
 
PRESENTA: 
 
 
B. M. SALVADOR ELÍAS CASTELL GONZÁLEZ 
 
 
REYNOSA, TAMPS DICIEMBRE DEL 2010 
 
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
 
CARTA DE CESION DE DERECHOS 
 
 
 
 
ACTA DE REVISIÓN DE TESIS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo que lleva por título “Análisis de las comunidades 
microbianas asociadas a tapetes hipersalinos de la laguna rosada de 
Uaymitun, Yucatán, México”, se realizó en el laboratorio de Laboratorio de 
Biotecnología Industrial del Centro de Biotecnología Genómica del Instituto 
Politécnico Nacional, en conjunto con el Laboratorio de Biotecnología de la 
Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Autónoma de Yucatán, bajo la 
dirección del Dr. José Alberto Narváez Zapata y del Dr. Rafael Antonio Rojas 
Herrera, y fue financiado por los Proyectos: "Desarrollo de procesos 
metodológicos para la evaluación de la microdiversidad eucariotica y 
procariótica de diferentes sistemas ambientales" (Proyectos SIP 20091080 y 
20100700) y "Estudio de la composición taxonómica y dinámica poblacional de 
la comunidad bacteriana de una laguna costera" (Proyecto 89253, Apoyo 
Complementario 2008 y SISTPROY: FIQI-2009-0001). 
 
i 
 
INDICE 
 
 
 
SECCIÓN Página 
 
DEDICATORIA .............................................................................................. iv 
 
AGRADECIMIENTOS ................................................................................... v 
 
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................... v 
 
LISTA DE CUADROS ................................................................................. viii 
 
LISTA DE SÍMBOLOS Y NOMENCLATURA ............................................. x 
 
RESUMEN ...................................................................................................... xi 
 
ABSTRACT ................................................................................................... xii 
 
1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 1 
 
2 ANTECEDENTES ........................................................................................ 4 
 
2.1 Ecosistemas hipersalinos .................................................................................. 4 
2.2 Producción microbiana en ambientes hipersalinos ........................................... 5 
2.3 Tapetes microbianos ......................................................................................... 8 
2.3.1 Definición y primeros estudios............................................................... 8 
2.3.2 Dinámica fisicoquímica en los tapetes microbianos ............................ 10 
2.3.3 Diversidad en los tapetes microbianos ................................................. 11 
2.4 Estudios metagenómicos ................................................................................. 13 
2.4.1 Identificación de genomas específicos en un metagenoma .................. 14 
2.5 Análisis de la restriccion de las amplificaciones del ADNr (ARDRA) .......... 14 
2.6 Análisis cualitativo de los diferentes genomas presentes en un sistema 
ambiental .............................................................................................................. 15 
2.7 Análisis semicuantitativo de la biodiversidad ................................................. 16 
 
3 JUSTIFICACIÓN ........................................................................................ 19 
 
4 HIPÓTESIS ................................................................................................. 20 
 
5 OBJETIVO GENERAL .............................................................................. 20 
 
5.1 Objetivos específicos ...................................................................................... 20 
 
6 MATERIAL Y METODOS ........................................................................ 21 
 
ii 
 
6.1 Diseño experimental ....................................................................................... 21 
6.2 Zona de colecta ............................................................................................... 22 
6.3 Colecta de muestras ........................................................................................ 23 
6.4 Separación de capas ........................................................................................ 24 
6.5 Análisis de los factores fisicoquímicos macro y micro ambientales ............... 25 
6.6 Pretratamiento de muestras ............................................................................. 25 
6.7 Tinción de muestras para microscopia óptica ................................................. 26 
6.7.1 Tinción con azul de bromofenol ........................................................... 26 
6.7.2 Hibridación con naranja de acridina ..................................................... 26 
6.8 Fijación de muestra para microscopia electrónica .......................................... 26 
6.9 Extracción de ADN metagenómico por método de sílica ............................... 27 
6.10 Determinación de la integridad del ADN por electroforesis ......................... 28 
6.11 Cuantificación del ADN Metagenómico ....................................................... 28 
6.12 Amplificación por PCR de la región ribosomal ............................................ 28 
6.13 Purificación de los productos de PCR ........................................................... 29 
6.14 Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) ....................... 30 
6.15 Clonación y construcción de amplicotecas ................................................... 31 
6.16 Conservación de las Amplicotecas ............................................................... 31 
6.17 Selección de clonas representativas y método de análisis de la 
restriccion de las amplificaciones del ADNr (ARDRA) ............................ 32 
6.17.1 Tamizaje de la biblioteca metagenómica ........................................... 32 
6.17.2 Extracción de ADN plasmídico (ADNp) ........................................... 32 
6.17.3 Digestión enzimática de las muestras ................................................. 33 
6.17.4 Secuenciación de clonas representativas ............................................ 33 
6.18 Caracterización de las clonas seleccionadas en el Ribosomal DataBase 
Proyect (RDP) ............................................................................................. 33 
6.19 Análisis de la filogenia molecular ................................................................. 33 
6.20 Estadística descriptiva e índices ecológicos .................................................. 34 
 
7.RESULTADOS ........................................................................................... 35 
 
7.1 Proceso de formación de tapetes microbianos................................................ 35 
7.1.1 eterminación de tapetes maduros y muestreo ..................................... 355 
7.2 Fisicoquímicos .............................................................................................. 377 
7.3 Tipología microscópica de tapetes microbianos hipersalinos ....................... 388 
7.3.1 Fracción eucarionte ............................................................................ 388 
7.3.2 Fracción procarionte ........................................................................... 388 
7.3.3 Tinciones .............................................................................................. 39 
7..3.4 Microscopia electrónica ...................................................................... 40 
7.4 Caracterización metagenómica de los tapetes microbianos hipersalinos ...... 422 
7.4.1 Tratamiento con EDTA y extracción del ADN metagenómico ......... 422 
7.4.2 Amplificación por PCR de la región ribosomal. ................................ 422 
7.4.3 Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) ............. 433 
7.4.4 Amplicotecas ........................................................................................ 43 
7.4.5 Analisis de la Restriccion de las Amplificaciones del ADNr 
(ARDRA) ...................................................................................................... 45 
7.4.6 Secuenciación de clonas representativas ............................................ 466 
7.4.7 Caracterización de las secuencias mediante Ribosomal DataBase 
Proyect (RDP) ................................................................................... 477 
7.5 Ecología molecular ....................................................................................... 477 
7.6 Filogenia molecular ...................................................................................... 611 
iii 
 
7.6.1 Filogenia de Archaea ......................................................................... 622 
7.6.2 Filogenia de Bacteria ......................................................................... 633 
7.6.3 Filogenia de phylla persistentes ......................................................... 644 
7.6.3.1 Bacteroidetes ......................................................................... 644 
7.6.3.2 Firmicutes ............................................................................. 655 
7.6.3.3 Proteobacteria ...................................................................... 666 
 
8 DISCUSIÓN ....................................................................................................... 677 
 
9 CONCLUSIONES ............................................................................................... 74 
 
10 RECOMENDACIONES ........................................................................... 76 
 
11 REFERENCIAS CITADAS ...................................................................... 77 
 
12 APÉNDICE 1. PROTOCOLOS DE PCR ................................................. 92 
 
13 APÉNDICE 2. FORMULAS EMPLEADAS PARA EL ÁNALISIS 
ECOLÓGICO ................................................................................................. 93 
 
12 APÉNDICE 3. DIVERSIDAD TOTAL .................................................... 94 
 
13 APÉNDICE 4. ARCHIVO FOTOGRÁFICO ......................................... 102 
 
14 APÉNDICE 5. ÁRBOLES FILOGENÉTICOS EN EXTENSO ............ 111 
 
GLOSARIO .................................................................................................. 114 
 
 
 
 
 
 
 
iv 
 
DEDICATORIA 
 
 
 
 
 
A mi familia que siempre ha confiado en que haría algo extraordinario de mi vida y que 
espero esto sea una pequeña prueba que sus esfuerzos no quedaran en vano. 
 
Un Lamento Por Gaia 
 
v 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A todos los Investigadores que me apoyaron y creyeron en mí durante el desarrollo de 
este proyecto, por no encontrarse dentro de los rubros generales del área. 
 
A la naturaleza y su evolución que me brindaron de ese hábitat tan misterioso y fabuloso 
que a manera de microcosmos me sirvió de materia prima para el desarrollo del presente 
documento. 
 
Al Dr. José Narváez y al Dr. Rafael Rojas, por soportar mi necedad de aplicar mis 
números en donde no habían sido aplicados. 
 
Especialmente a mis padres Grisel y Omar, a mis hermanos Scarlett y Alejandro por 
soportar mí cada vez más intolerable carácter en búsqueda del conocimiento. 
 
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), al Programa Institucional 
de Formación de Investigadores (PIFI), a Santander ECOES por el apoyo para el 
sustento y movilidad necesaria para la realización y culminación del proyecto. 
 
vi 
 
LISTA DE FIGURAS 
Figura Página 
 
1 Diversidad y Dinamica Fisicoquimica en tapetes microbianos hipersalinos . 10 
 
2 Diagrama general de la metodología empleada ............................................. 21 
 
3 Ubicación de la zona de colecta. .................................................................... 22 
 
4 Caracteristicas Macroscopicas de tapates microbianos hipersalinos 
maduros .......................................................................................................... 24 
 
5 Ciclo de formación y de degradación de tapetes hipersalinos en la Laguna 
Rosada de Uaymitún, Yucatán. ...................................................................... 36 
 
6 Tapete microbiano hipersalino con sus diferentes capas ............................... 36 
 
7 Gráfico de dispersión para los datos fisicoquímicos macroambientales ........ 37 
 
8 Contaminación exógena en las observaciones al microscopio óptico ............ 38 
 
9 Observaciones al microscopio óptico de frotis de tapetes microbianos ......... 39 
 
10 Observaciones al microscopio de tinciones realizadas a la muestra .............. 39 
 
11 Observaciones en MEB de tapetes microbianos hipersalinos ........................ 40 
 
12 Observaciones en MEB de la estructura de la matriz en tapetes 
microbianos hipersalinos ................................................................................ 41 
 
13 Diversidad morfológica de tapetes microbianos hipersalinos mediante 
MEB ............................................................................................................... 41 
 
14 Extracción de ADN metagenómico, de tapetes microbianos hipersalinos, 
de la Laguna Rosada de Uaymítun, Yucatán ................................................. 42 
 
15 Amplificaciones mediante técnica de PCR para los iniciadores gc338F y 
518R para Bacteria. ........................................................................................ 43 
 
16 DGGE de tapetes microbianos hipersalinos ................................................... 44 
 
17 Patrones de restricción (EcoR1) para las amplicotecas de Bacteria ............... 46 
 
18 Gráfico de barras para el número de secuencias distintas, para cada uno 
de los muestreos y totales para cada uno de los juegos de iniciadores .......... 48 
 
vii 
 
19 Gráfico de la curva de rarefacción para Archaea, Bacteria y total, del 
esfuerzo de muestreo vs número de representantes para Clase, Orden, 
Familia y Género . .......................................................................................... 48 
 
20 Gráfico porcentual de distribución de frecuencias totales por phyllum. ........ 51 
 
21 Árbol filogenético para Archaea .................................................................... 62 
 
22 Árbol filogenético para Bacteria .................................................................... 63 
 
23 Árbol filogenético para Bacteroidetes ............................................................ 64 
 
24 Árbol filogenético para Firmicutes ................................................................65 
 
25 Árbol filogenético para Proteobacteria ......................................................... 66 
 
26 Diagrama de conjuntos poblacionales para la similitud de grupos ................ 69 
 
27 Esquema de la dinámica de cambio poblacional en relación con los 
fisicoquímicos, en la Laguna Rosada de Uaymítun, Yucatán ........................ 72 
 
 
viii 
 
LISTA DE CUADROS 
 
Cuadro Pagina 
 
1 Parámetros fisicoquímicos macroambientales y microambientales 
asociados a la capa fototrófica de tapetes microbianos hipersalinos en las 
diferentes épocas de muestreo. ....................................................................... 37 
 
2 Análisis binominal de capas del DGGE por capa. ......................................... 43 
 
3 Análisis binominal del desarrollo de la capa superior verde azulada del 
DGGE por época de muestreo. ....................................................................... 44 
 
4 Tasa de transformación y eficiencia de las amplicotecas. .............................. 45 
 
5 Reacciones de digestión con EcoR1 por genoteca. ........................................ 46 
 
6 Número de haplotipos obtenidos medainte digestión con EcoR I ................. 46 
 
7 Número de representantes para cada uno de los niveles taxonómicos .......... 47 
 
8 Frecuencias encontrados para cada uno de los phyllum, por muestreo y 
total. ................................................................................................................ 49 
 
9 Análisis de persistencia, dinámica e intercambio de poblaciones. ................. 50 
 
10 Grupos persistentes según datos generados de las Amplicotecas .................. 52 
 
11 Análisis de diversidad y frecuencias para los rangos taxonómicos 
mayores a partir de las secuencias de las amplicotecas por época de 
muestreo. ........................................................................................................ 53 
 
12 Análisis binominal para los rangos taxonómicos mayores por época de 
muestreo mediante Cuadro de ausencia presencia a partir de las 
secuencias de las amplicotecas. ...................................................................... 54 
 
13 Cuadro de análisis de densidad taxonómica para cada uno de los 
muestreos según dominio y totales. ................................................................ 55 
 
14 Análisis de correlación de Pearson de los Fisicoquímicos vs la diversidad 
encontrada mediante el DGGE y las Amplicotecas, según dominio. ............. 56 
 
15 Análisis de correlación de Pearson de los Fisicoquímicos vs la densidad 
taxonómica encontrada mediante las Amplicotecas, según dominio. ............ 57 
 
ix 
 
16 Análisis de diversidad para el DGGE y las Amplicotecas mediante índice 
de Shannon (paramétrico y no paramétrico), y la diversidad alfa. ................. 58 
 
17 Índices ecológicos para similitud población, uniformidad y distancias 
ecológicas totales. ........................................................................................... 59 
 
18 Índices ecológicos para similitud población, uniformidad y distancias 
ecológicas para el dominio Bacteria. .............................................................. 60 
 
19 Índices ecológicos para similitud población, uniformidad y distancias 
ecológicas para el dominio Archaea. .............................................................. 61 
 
 
 
x 
 
LISTA DE SÍMBOLOS Y NOMENCLATURA 
 
pb Pares de base 
TA Temperatura Ambiente (25
o
C) 
M Molar 
g/L Gramos por litro 
rpm Revoluciones por minuto 
A260 Absorbancia a 260 nm 
NaCl Cloruro de Sodio 
EDTA Sal disódica de del ácido etilendiaminotetraacético. 
SSCP Polimorfismo de Conformación de Cadena Sencilla. 
DGGE Electroforesis en Gel de Gradiente Desnaturalizante 
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa 
MEB Microscopia Electrónica de Barrido 
ADNr ADN ribosomal 
ADNp AND plasmídico 
ARDRA Análisis de la Restricción de las amplificaciones del ADNr 
RDP Ribosomal DataBase Proyect 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
xi 
 
RESUMEN 
 
Los ambientes hipersalinos, son un tipo de ambiente extremofilo que tiene un alto nivel 
de estrés osmótico que genera una presión selectiva muy fuerte. En este tipo de 
ambientes, los consorcios microbianos desarrollaron distintos tipos de asociaciones para 
su supervivencia. El más complejo y diverso de este tipo de asociaciones, son los tapetes 
microbianos, que son una serie de biopeliculas en tándem, que forman micronichos 
estratificados, de acuerdo a los distintos metabolismos de los organismos embebidos en 
la biopelícula. El presente estudio tiene la intención de interpretar las dinámicas de las 
comunidades microbianas que se llevan a cabo en estos tapetes microbianos. Este trabajo 
fue realizado en una poza salinera de la Laguna Rosada de Uaymitún (Yucatán, México) 
mediante tres muestreos: M1 (Mayo-Junio), M2 (Julio-Agosto) y M3 (Septiembre-
Octubre), que abarcan desde el final de la época de secas hasta la época de lluvias. Las 
muestras se tomaron en el mismo punto para analizar los cambios en las comunidades 
microbianas desde dos perspectivas: su estructura mediante técnicas de microscopia, 
clásica y electrónica de barrido, y segundo la diversidad por métodos moleculares 
metagenómicos como fueron el DGGE y el análisis de Amplicotecas de ADN ribosomal. 
La extracción del ADN metagenómico se realizó utilizando el método de silica. El 
análisis utilizo amplificaciones por PCR de la región 16s del ADNr, utilizando los 
juegos de iniciadores 16SS/16SR y gc338F/PRUN518R para la construcción de las 
Amplicotecas y el análisis por DGGE, respectivamente. Para el análisis de la fracción de 
Archaea se utilizaron los iniciadores A571F y UA1204R para ambas metodologías 
moleculares. Los resultados indican una mayor diversidad por métodos indirectos 
(DGGE) en el muestreo M1, aunque el análisis de las Amplicotecas indica una mayor 
diversidad en el muestreo M3. Estas comunidades microbianas se encuentran en dos 
grandes grupos, un grupo de microorganismos más abundante (Proteobacteria, 
Firmicutes y Bacteoidetes) que persiste, y otra poco abundante pero muy diversa que 
varía a lo largo de los muestreos. Estas dinámicas se ven significativamente afectadas 
por la salinidad para la biodiversidad, y la temperatura para la abundancia. Finalmente, 
el análisis del índice de Morisita indica que las comunidades son una misma con proceso 
de sucesión ecológica estacional influenciado por el ambiente. 
xii 
 
ABSTRACT 
 
Hypersaline environments are a type of extremophile environment that has a high level 
of osmotic stress that generates a strong selective pressure. In this environment, the 
microbial consortia developed different types of partnerships for their survival. The most 
complex and diverse of such associations are the microbial mats, which are a group of 
biofilms in tandem, with stratified micro-niches according to the different metabolisms 
of the organisms embedded in biofilm. This study aims to interpret the dynamics of 
microbial communities which are conducted in these microbial mats. This work was 
conducted in a salt pond in the Laguna Rosada Uaymitún (Yucatán, Mexico) by three 
samples: M1 (May-June), M2 (July-August) and M3 (September-October), ranging from 
the end of the dry season to rainy season. The samples were taken at the same point to 
analyze changes in the microbial communities from two perspectives: its structure using 
microscopy techniques, classical and electronic scanning and second diversity by 
molecular methods were metagenomics as DGGE and analysis library ribosomal DNA. 
Metagenomic DNA extraction was performed using the silica method. The analysis uses 
PCR amplification of 16S rDNA region using primers games gc338F/PRUN518R 
16SS/16SR and construction of libraries and DGGE analysis, respectively. Forthe 
analysis of the fraction of Archaea primers were used for both UA1204R A571F and 
molecular methodologies. The results indicate a greater diversity by indirect methods 
(DGGE) in a sample M1, although the analysis of the libraries indicates greater diversity 
in the M3 sample. These microbial communities found in two groups, one group of 
organisms more abundant (Proteobacteria, Firmicutes y Bacteoidetes), that is persistent, 
and another one pour abundant but very diverse along various samples. These dynamics 
are significantly affected by salinity for the biodiversity, and temperature for prosperity. 
Finally, the analysis of Morisita index indicates that the communities are the same, and 
have a seasonal process of ecological succession mainly affected by the environmental 
changes. 
 
1 
 
1. INTRODUCCIÓN 
 
Los ecosistemas hipersalinos son ambientes extremos que se encuentran poco estudiados 
y generalmente considerados poco diversos y productivos (Fourçans et al., 2004). 
Recientemente, se han desarrollado diversas metodologías moleculares que permiten 
analizar de manera más extensa las microcomunidades existentes en dichos sistemas, ya 
que se incluyen con estas metodologías toda la gama de organismos no cultivables que 
no son caracterizados por los métodos clásicos microbiológicos, el conjunto de estas 
metodologías son llamadas técnicas metagenómicas (Xu, 2006). Al aplicar estas 
metodologías a estos sistemas hipersalinos se ha observado que la diversidad y 
complejidad de estos haloambientes es mucho mayor de la que se consideraba (Minz et 
al.,1999a; Ley et al., 2006), y este fenómeno se repite en todos los ecosistemas extremos 
en los cuales se han realizado este tipo de investigaciones en los últimos años. En 
México se han realizado estudios en la Laguna Ojo de Liebre en Guerrero Negro, Baja 
California Norte (Spear et al., 2003; Ley et al., 2006) y en las pozas minerales de Cuatro 
Ciénagas, Coahuila (Breitbart et al., 2009); estas investigaciones indican que las 
dinámicas microecológicas, la complejidad de los microhábitats y formación de 
consorcios microbianos y la biodiversidad reportada, son inmensamente mayor con 
respecto a las estimaciones generadas mediante estudios preliminares. Dentro de estos 
microcomunidades hipersalinas, los sistemas más complejos parecen ser los llamados 
tapetes microbianos (Taton et al., 2003), los cuales son asociaciones microbianas muy 
complejas que se encuentran embebidas en matrices de polímeros (biopelículas) que 
forman consorcios interdependientes a manera de estratos en tándem (Nübel et al., 
2001), donde se generan micronichos biogeoquímicos en cada uno de estos estratos de 
acuerdo al metabolismo de los microorganismos, con una dinámica semicerrada con 
intercambio de productos entre capas (Des Marais, 2003), favoreciendo así con este 
aislamiento del medio y entre capas, una homeostasis poblacional que permiten la 
supervivencia a las condiciones ambientales extremas (Minello et al., 2003; Abed et al., 
2007). 
Este tipo de consorcios, son los fósiles más antiguos conocidos, como es el caso de los 
Estromatolitos, que datan de hace 3800 millones de años, que son consorcios que 
2 
 
presentaban este tipo de asociación microbiana, conservando este tipo de arreglo 
probablemente a manera mecanismo de resistencia a los cambios ambientales drásticos 
de la atmósfera reductora primitiva (Hoeler et al., 2003; Des Marais, 2003; Leuko et al., 
2007). Estos se encontraban formados principalmente por cianobacterias primitivas y 
que se proponen como los principales causantes del cambio climático global hacia una 
atmósfera rica en oxígeno mediante algún tipo de fotosíntesis primitiva, que 
posteriormente condujo a la explosión biológica existente, a la par de algunos cambios 
en los procesos biogeoquímicos (Cloud, 1976; Grotzinger, 1980). 
Los actuales tapetes microbianos están constituidos por descendientes directos de estos 
microorganismos primitivos y han mantenido un proceso constante de evolución, no 
solo de sus genomas individuales, sino también de las interacciones ecológicas 
existentes entre ellos. Por lo anterior, el estudio de las interacciones existentes entre los 
principales grupos de microorganismos es de gran importancia para entender otras 
interacciones ecológicas existentes, su desarrollo y formación, en otros ambientes 
extremofilos y no extremofilos. 
Una de las características más importante en estos sistemas ambientales es la 
variabilidad a la cual se encuentran sometidos. Por ejemplo, a nivel macroambiental en 
estos sistemas hipersalinos existen grandes cambios en la disponibilidad de agua dulce; 
estos aportes provienen de varias fuentes como los sistemas pluviales, escorrentía, 
florecimientos naturales, aporte de las mareas y cambios estacionales temporales y/o 
permanentes (Pinckney et al., 1995), provocando variabilidad en la biodiversidad 
existente debido a los cambios en los niveles de salinidad (Wenke y Vogt, 1981; 
Alexander y Dunton, 2002). También hay evidencia de que la dinámica poblacional 
estacional no es la única que existe en estos ecosistemas, ya que se han observado 
variaciones verticales, habiendo diferencias entre los organismos presentes en cada uno 
de los estratos en ciclos de 24 horas (Villanueva et al., 2007); esto propone la existencia 
de migración biológica vertical inducida por factores microambientales como la 
radiación UV, Oxígeno disuelto y la temperatura (Bebout y García-Pichel, 1995). Otra 
característica interesante es que los fenómenos de distribución de nichos ecológicos, 
procesos tróficos y biogeoquímicos complejos se dan en dimensiones muy pequeñas, 
comparando los procesos similares, como los que se dan en el medio marino entre la 
3 
 
superficie y la zona profunda anaeróbica con dinámicas de intercambio que van de unos 
cuantos metros hasta varios miles; De esta manera se genera una estratificación de tres 
zonas bien definidas, una óxica, otra zona de transición y finalmente una zona anóxica 
(Dollhopf et al., 2005), esta zona óxica es la que está en contacto con el ambiente 
exterior, mediante las otras se distribuyen hacia lo profundo. Estas zonas se forman por 
diferentes grupos que establecen las condiciones del microambiente y posteriormente la 
migración de otros grupos que se establecen en las zonas más favorables para su 
supervivencia. Esta distribución de los microorganismos se distribuye según su 
tolerancia primaria al oxígeno, la luz y la temperatura, siendo primeramente los 
organismos fotosintéticos como las cianobacterias y algunos heterótrofos aeróbicos en el 
primer estrato (0-3 mm), sulfobacterias fototróficas y quimiotróficas en el segundo 
estrato (2-5mm) y organismos fermentadores, sulfato reductores y metanogénicos en el 
último estrato (5-10mm) (Minz et al., 1999a, 1999b, Smith et al., 2008). La complejidad 
del microhábitat en conjunto con lo reducido de la escala y la reducida fracción 
cultivable, se dificulta el estudio de la microbiodiversidad en estos hábitats y la 
evaluación de los parámetros fisicoquímicos existentes. Actualmente es posible analizar 
estos parámetros utilizando microelectrodos capaces de analizar cambios en el pH, O2 
disuelto y potencial redox, en distancias de hasta 200 µm (Revsbech y Ward, 1984). Sin 
embargo, existen muy pocos estudios acoplando el conjunto de técnicas metagenómicas 
y de microlectrodos en estos ambientes (Bebout y Garcia-Pichel, 1995; Ley et al., 
2006). 
Por lo anterior, el presente estudio está enfocado en el estudio de las comunidades 
microbianas en tapetes microbianos presentes en pozas salinas de la Laguna Rosada 
(Uaymitún, Yucatán), en distintos estadios de maduración empleando el conjunto de 
metodologías metagenómicas para así contribuir al conocimiento sobre los procesos 
tróficos, biogeoquímicos y productivos en estos ecosistemas hipersalinos. 
 
4 
 
2. ANTECEDENTES2.1. Ecosistemas hipersalinos 
 
Los ecosistemas hipersalinos se encuentran en ambientes acuáticos o cercanos a ellos y 
se caracterizan por poseer una salinidad superior a 80 ppm de manera permanente o 
estacional. Están representados principalmente por humedales costeros, pozas 
intermareales y algunos otros sistemas de humedal, aunque también se han localizado 
ambiente hipersalinos en cuerpos de agua donde sus componentes edáficos son 
principalmente del tipo cárstico y calcáreo. Las características fisicoquímicas de estos 
ambientes hipersalinos son variables y se encuentran muy relacionados con la aportación 
de agua dulce que modifica las condiciones del medio dándose ciclos estacionales 
(Gorlenko et al., 2010). Estos cambios en las condiciones del medio alteran totalmente 
el ecosistema, dándose cambios en la biodiversidad (Alexander y Dunton, 2002) y 
consecuentemente en las cadenas tróficas y los ciclos biogeoquímicos (Herrera-Silveira 
et al., 2002), así mismo el aporte de contaminantes son una factor selectivo para la 
variabilidad de los componentes de las comunidades (Córdoba-Kreylos et al., 2006). 
Tradicionalmente la microbiota de sistemas salinos mediante técnicas clásicas de cultivo 
se clasifican en: ligeramente halófilo con crecimiento optimo a 3% de NaCl, halófilos 
moderados a 3-15% y halófilos extremos con 25% para crecimiento optimo y un mínimo 
para subsistencia de 12% (Margesin y Schinner, 2001); otro método de estudio es el uso 
de medios selectivos, como el medio MRS para aislamiento de bacterias ácido lácticas 
(Zamudio-Maya et al., 2008) o pruebas bioquímicas buscando generar una respuesta 
metabólica (García, 2007). Entre los primeros trabajos, se encuentra el realizado en la 
costa de Alicante, España, donde se aislaron de sedimento algunas bacterias Gram 
positivas de los géneros Psudomonas, Bacillus, Alcaligenes y Micrococcus, aunque no 
se logró demostrar una correlación significativa entre la salinidad (50 – 250 ppm) y la 
abundancia de cada uno de los géneros (Quesada et al., 1982). Estas asociaciones 
microbianas pueden ser organismos de vida libre, asociadas a partículas y/o sedimentos 
o formando biopelículas, ya sean flotadoras, incrustantes o en tapetes microbianos (Da 
Silva et al., 2007; Biddle et al., 2008; Da Silva et al., 2008). 
5 
 
La variabilidad en la salinidad genera cambios estacionales o puntuales en la 
biodiversidad, estos cambios pueden ser por aportes directos de agua dulce como ocurre 
en la bahía de Hays (Kansas, USA) (Wenke y Vogt, 1981) o estacionales y espaciales 
como se observó en la Laguna Salada de Chiprana (España), diagnosticado mediante 
cambios en las frecuencias de miembros del género Chlorobium (Guerrero et al., 1991). 
 
2.2. Producción microbiana en ambientes hipersalinos 
 
Generalmente, se ha considerado a los ecosistemas hipersalinos ambientes estériles o 
casi estériles con una baja diversidad. Los primeros estudios con fines biotecnológicos 
en estos sistemas fueron dirigidos a analizar la capacidad de retención de glicerol en 
algas hipersalinas (Dunaliella y Asteromonas) bajo condiciones variables de salinidad y 
temperatura (Wegmann et al., 1980). Posteriormente se realizaron ensayos de fijación 
de C
14
, en Dunaliella tertiolecta confirmando la relación entre la salinidad y la 
producción y retención de glicerol (Goyal et al., 1986). Otros estudios realizados en D. 
bardawii y D. salina demostraron la gran capacidad de adaptación de estos organismos 
al stress, mediado por la acumulación de pigmentos fotoprotectores (Ben-Amotz et al., 
1987; Orset y Young, 2000), estrategia que algunos autores proponen como mecanismo 
de control redox (Steinbrenner y Linden, 2003). Estas investigaciones originaron un gran 
interés por la producción de glicerol en estos sistemas hipersalinos a nivel industrial. Por 
ejemplo, se analizó la síntesis de glicerol a varias concentraciones de NaCl en D. salina 
(Chitlaru y Pick, 1991, Hernández et al., 2000), mediante adaptaciones subcelulares 
(Stoynova-Bakalova y Toncheva-Panova, 2003). Otros estudios más recientes 
investigaron el mecanismo activador de la respuesta al estrés osmótico determinando la 
inhibición de esteroles y glicerol en las células mediante cambios en la configuración de 
los lípidos de membrana (Zelazny et al., 1995), o en otros casos la activación de vías 
metabólicas distintas de la síntesis de lípidos como respuestas al estrés salino (Azachi et 
al., 2002). A nivel molecular se conoce la activación de ciertos genes involucrados con 
la acumulación de pigmentos bajo condiciones de estrés salino (Sun et al., 1998), como 
es el caso del gen des 3-1 que codifica para la ω-3 ácido graso desaturasa que participa 
en las modificaciones de ácidos grasos de la membrana (Lyukevich et al., 2003). 
6 
 
Otra herramienta utilizada es el uso de genes relacionados con la producción de 
metabolitos en alguna etapa significativa como el crecimiento temprano (Estévez et al., 
2000), como en la producción de metabolitos de importancia industrial como el glicerol 
(Nevoigt y Stahl, 1997, Kaçka y Dönmez, 2008), carotenos (Steinbrenner y Linden, 
2001), xantofilas (Issacson et al., 2002) e isoprenoides (Schwender et al., 2001), entre 
otros, mediante la búsqueda de genes que se encuentran relacionados en la biosíntesis de 
estos productos. Por otro lado, el uso de marcadores moleculares para determinar cepas 
hiperproductoras (D. bardawil, D. salina y D. parva), como en la producción de 
carotenos mediante la caracterización de los ITS I y II (Olmos-Soto et al., 2002). Este 
mismo procedimiento se ha utilizado para la identificación de bacterias ácido lácticas 
utilizables en procesos fermentativos (Guan et al., 2003). 
La mayoría de los representantes procariontes tienen coloraciones purpúreas o rojizas, 
relacionadas con su metabolismo sulfato reductor y la formación de bacterioruberinas 
(Ollivier et al., 1994; Alinei et al., 2006; Bardavid y Khristo, 2008), que se ha 
demostrado son importantes en los sistemas ambientales con baja salinidad y niveles 
altos de sulfatos (Smith et al., 2008), debido a esto la mayor abundancia se presenta en 
las zonas anóxicas y en los estratos inferiores de los tapetes (Elshahed et al., 2004). 
Algunos de los primeros estudios fueron puramente descriptivos, encontrando 
principalmente miembros de los géneros Halococcus, Halobacterium, y algunas cepas 
con características aprovechables como Volcaniela eurihalina (Quesada et al., 1990), 
Roseovarius tolerans (Labrenz et al., 1999) o Halolactibacillus halophilus (Ishikawa et 
al., 2005) por nombrar algunos. La primera característica que se estudió a fondo fue el 
crecimiento de las cepas en condiciones controladas de salinidad para una posible 
aplicación biotecnológica (Javor, 1984; Girguis et al., 2005)). Posteriormente, se 
realizaron estudios con el metabolismo de los azúcares (Oren y Mana, 2003) y del 
glicerol (Sher et al., 2004) en Salinibacter ruber, que comparte rutas metabólicas con la 
Archaea Haloferax volcanii, indicando que las bacterias halófilas presentan un 
metabolismo conservado con las Archaeas halófilas de las que provienen (Roberts, 
2005). Este estrés haloselectivo ha generado una conservación de vías metabólicas en 
halobacterias, con los mismos productos metabólicos (Falb et al., 2008). Dentro de estas 
Archaeas no cultivables se encuentran representantes oxidantes de amonio, que tienen 
7 
 
un papel crucial en las cadenas tróficas y en los ciclos biogeoquímicos que involucran la 
fijación de nitrógeno (Cavicchioli, et al., 2006), aunque hay indicios de que existe la 
fijación de nitrógeno mediada por las cianobacterias existentes en el sistema (Charpy et 
al., 2010). 
Las bacterias anaeróbicas del género Clostridium han demostrado una buena efectividad 
en la degradación de azúcares para la producción de etanol, ácido acético y ácido 
succínico, entreotros, o la elaboración de productos de fermentación por Desulfovibrio 
mediante el uso de sulfuros como el tiosulfato como aceptor de electrones (Yaşa et al., 
2006). 
Es un hecho que para que estas zonas anóxicas sean productivas y estables, debe haber 
un aporte bidireccional entre las quimioclinas para sustentar el metabolismo de los 
sistemas (Tanner et al., 2010), donde exista una estrecha interrelación entre los grupos, 
como el caso de los géneros Dunaliella, Halobacter, Salinibacter y la arqueobacteria 
Haloquadratum walsbyi que son necesarias para la colonización del ambiente y el 
posterior establecimiento del resto de las comunidades (Bardavid et al., 2008). 
Otros de los productos obtenidos a partir de cultivos de bacterias hipersalinas son 
enzimas hidrolíticas (amilasas, proteasas, ADNasas, lipasas, polulasas) que se acumulan 
en la matriz extracelular en diversos grupos que incluyen: Salinivibrio, Halomonas, 
Chromohalobacter, Bacillus-Salibacillus, Salinococcus y Marinococcus (Sánchez-Porro 
et al., 2003); esta producción aumenta conforme la salinidad incrementa, favoreciendo el 
metabolismo de las comunidades (Sirová et al., 2006). 
Algunos autores proponen a estos microorganismos para la producción masiva de 
metabolitos en sistemas hipersalinos y en algunos casos, la generación de ecosistemas 
hipersalinos artificiales abiertos como granjas productoras (García-González et al., 
2003). Por otro lado, la capacidad de estos complejos microbianos de asimilar y/o 
metabolizar ciertos compuestos o iones metálicos tóxicos el ambiente, los hace 
candidatos idóneos para ser utilizados en biodepuración y biorremediación de 
sedimentos, cuerpos de agua y otros sustratos (Llirós et al., 2003; López-Cortés et al., 
2010), como es el caso del género Halomonas que recupera el selenio del agua (De 
Souza et al., 2001) y también degrada algunos compuestos aromáticos (García et al., 
2005). También se ha observado que los tapetes microbianos se encuentran asociados a 
8 
 
la biorremediación natural de las zonas litorales afectadas por derrames de petróleo 
(Martínez-Alonso y Gaju, 2005; Al-Mailem et al., 2010). Actualmente los tapetes 
microbianos están siendo utilizados con éxito en la biorremediación de agua en 
estanques de cultivo camarón (Lezama-Cervantes et al., 2010). 
 
2.3. Tapetes microbianos 
 
2.3.1. Definición y primeros estudios 
 
Los tapetes microbianos, son un consorcio de microorganismos asociados que forman 
una matriz de exopolisacáridos, donde estas biopelículas se organizan en estratos con 
características distintivas cada uno, generando micronichos fisicoquímicos a manera de 
quimioclinas (Fourçans et al., 2004), lo que a su vez puede limitar la distribución de los 
organismos embebidos en estos tapetes (Des Marais, 2003), que se forman como 
respuesta a la agresividad del medio, teniendo por esto un mayor desarrollo en la época 
de secas (Da Silva et al., 2007). 
Los tapetes microbianos son sistemas muy complejos que han evolucionado desde hace 
millones de años, teniendo registros fósiles de los mismos, los estromatolitos, datados en 
apróximadamente 3800 millones de años (Ma) (Cloud, 1976). Se han realizado diversos 
estudios en las costas de Canadá, describiendo un total de al menos 28 grupos de 
estromatolitos y miniestromatolitos provenientes de salinas y aragonita, donde se 
presentaron diversos tipos de cianobacterias como Ribularia sp. y Phormidium sp. así 
como algas de los géneros Pseudogymnosolen sp., Yelma sp. y Asperia sp. La 
abundancia relativa de estos grupos indica que los fósiles más antiguos estaban 
principalmente formados por cianobacterias (3800 Ma) y posteriormente se agregaron 
representantes algales, principalmente algas fibrosas o coralinas (2000 Ma) a los 
estromatolitos (Hofmann, 1969; 1976; 1977; Hoffman y Jackson, 1987). Analizando las 
concentraciones de carbono y minerales asociados a las estructuras no filamentosas de 
estos tapetes ancestrales, se encontraron concordancias con los sustratos asociados a 
metabolismos bacterianos, indicando una abundancia importante de bacterias, entras las 
que figuran candidatos como: Eoastrion simplex, Palaeolyngbya barghoorniana, 
9 
 
Eucapsis sp., Eontophysalis belcherensis, Gallionela ferruginata y Archaeotrichion 
contortum como las especies dominantes (Awramik et al., 1988), donde la dinámica de 
sedimentación y el proceso de colonización de las comunidades microbianas 
(Chakrabarti y Shome, 2010) así como el arreglo poblacional que adquieren (Lloyd et 
al., 2010), son de gran importancia en el proceso de formación. Estudios más recientes 
en estromatolitos de la Bahía Tiburón, en el oeste de Australia demuestran la presencia 
de flagelados de los géneros Euglenidae y Dinoflagellata, aunque no se ha encontrado 
ninguna relación de estos con la formación o modificación de los estromatolitos algales 
(Al-Qassab et al., 2002). Otros estudios han demostrado variaciones en la abundancia y 
diversidad de los organismos presentes, lo que incrementa la riqueza total de especies, 
siendo esta menor hacia los estratos inferiores. Lo anterior, probablemente, debido a la 
disponibilidad de sales en el sustrato que favorecen preservación de los tapetes, 
mediante la generación de óxidos y otros sedimentos, que son posteriormente 
introducidos en el sistema y formando así una cubierta en la pared celular que es la base 
para la formación de los estromatolitos (Grotzinger et al., 1980; Shiba et al. 1991). 
Amplificando el dominio sulfito reductasa en bacterias sulforeductoras, se localiza la 
presencia de este grupo en los estromatolitos ancestrales, revelando genes ancestrales 
Archaeas, como el dominio sulfato reductor relacionado con el género Archeoglobus 
(Wagner et al., 1998), y el gen phnA (fosfonoacetato hidrolasa) que participa en la 
mineralización del fosfonoacetato presente en el género Vibrionaceae (Gilbert et al., 
2009). 
El estudio de los tapetes microbianos ancestrales permite sugerir su participación en el 
cambio de la atmósfera reductora con alto contenido de gases de S2 y N2, a oxigénica a 
través del aporte de O2 como producto de desecho de la fotosíntesis primigenia; del 
mismo modo las sales asimiladas y acumuladas o transformadas por estos organismos, 
colaboraron en el proceso de sedimentación biomineral, modificando los procesos 
biogeoquímicos. Se ha considerado estos mismos conglomerados como el medio ideal 
para la colonización de otros ambientes, terrestres y extraterrestres por su resistencia 
adaptativa (Litchfield, 1998). 
 
10 
 
2.3.2. Dinámica fisicoquímica en los tapetes microbianos 
 
En el parque nacional de Yellowstone (USA) se investigó la dinámica fisicoquímica de 
los tapetes microbianos a través de mediciones in situ con microelectrodos, tomando 
lecturas de O2, pH y fotosíntesis del agua intersticial. Estos estudios permitieron 
identificar variaciones en los parámetros a manera de micronichos, con variaciones 
considerables en una profundidad de tan solo 6 mm (Revsbech y Ward, 1984). 
 
 
Figura 1. Diversidad y dinámica fisicoquímica en tapetes microbianos hipersalinos. Cianobacterias (CIA), 
Bacterias Verdes no sulfurosas (BV), Bacterias Sulfato Reductoras (BSR), Bacterias Púrpuras de Sulfurosas 
(BPS), Metanógenos (MET). Estrato Fototrófico (FOT), Estrato Facultativo (FAC) y Estrato Anóxico (ANOX). 
 
Estos quimioestratos también se reportaron en tapetes cianobacterianos de ambientes 
oxigénicos, formados principalmente por organismos del género Cloroflexus, 
observándose variación en las concentraciones de los metabolitos acetato y glicolato 
acumulándose principalmente en la capa superior fototrófica y disminuyendo en la capa 
anoxigénica quimiotrófica; al contrario, del lactato y el etanol; en cambio, las 
concentraciones de H2S y SO4, fueron mayores en la capa intermedia, donde se ubican 
los organismos sulfatoreductores (Fig. 1) (Fründy Cohen, 1992; Tanner et al., 2010). 
Este sulfoestrato es altamente complejo y diverso, de acuerdo a estudios basados en el 
11 
 
análisis de genes sulforeductores (Minz et al., 1999a) y ribosomales (Minz et al., 
1999b), demostrando que la estratificación por quimioclinas biogeoquímicas es un factor 
limitante en la distribución de las comunidades bacterianas, de acuerdo a su 
metabolismo (Inskeep et al., 2010). 
La tasa fotosintética en los tapetes microbianos está directamente relacionada con la 
concentración de nutrientes y que las fluctuaciones quimiotróficas que se observan en 
estos microambientes son similares a los procesos observados en macroambiente, como 
los sistemas marinos (Paerl et al., 1993) y lagunares (Valdés y Real, 1994). 
La rápida adaptación de los organismos presentes a las variaciones fisicoquímicas, e 
incluso a la migración de los mismos de una capa a otra según las condiciones 
favorables del ambiente tales como radiación UV (Bebout y García-Pichel, 1995), 
temperatura y salinidad (Abed et al., 2007), es uno de los principales mecanismos de 
supervivencia de estos tapetes microbianos, como se ha podido comprobar en sistemas 
microbianos sintéticos (Hu et al., 2010). 
. 
2.3.3. Diversidad en los tapetes microbianos 
 
Los primeros estudios en tapetes microbianos indicaban una presencia importante de 
cianobacterias en los estromatolitos (Cloud, 1976), aunque recientemente se ha 
encontrado una gran diversidad de otros organismos, principalmente Gram negativos, y 
algunos representantes eucariotas (Aguilera et al., 2010). Los organismos dominantes 
son del género Themicrospira y algunos grupos afines a Thiobacillus como Beggiota, 
Hyphomicrobium, Pedomicrobium, Termothrix, Leptothrix y Thiothrix; estos se 
encuentran asociados con el mineral todoroquita y las concentraciones de Mn, Fe, Mg, 
Ca, K y Ca presentes, que influyen en su distribución y abundancia, lo que indica que 
son organismos quimiotróficos (Jannasch y Wirsen, 1981); la disponibilidad de 
nutrientes también es un factor importante en la distribución y estructura de las 
poblaciones (Petroff et al., 2010). 
Los avances recientes en ingeniería genética y biología molecular han permitido 
expandir el conocimiento de la diversidad microbiana en estos sistemas ambientales 
mediante el estudio de secuencias no codificantes del ARNr, ADN mitocondrial y ADN 
12 
 
cloroplástidico (Douglas y Penny, 1999; Braun, 2008). Empleando estas metodologías 
fue posible estudiar la diversidad en tapetes microbianos fotótrofos, donde los grupos 
más abundantes fueron las cianobacterias (Oscillatoriales y Chroococcales) y las 
diatomeas (Bracghysira, Amphora, Navicula, Mastogloia, Entomonesi, Nitzschia y 
Gyrosigma), con la presencia de Dunaliella sp., como el único género algal (Nübel et 
al., 1999). 
En México también se han realizado algunos estudios en tapetes microbianos, en los 
cuales sobresalen los estudios realizados en Guerrero Negro, (Baja California Norte) y 
Cuatro Ciénagas (Coahuila). El estudio en Guerrero Negro es importantes por la 
cantidad de organismos encontrados con 1336 secuencias únicas, agrupadas en 752 
filotipos y siendo Cloroflexi, Proteobacteria y Bacteroidetes los grupos más abundantes 
y al mismo tiempo la baja presencia de Cianobacterium con 2.4% de la abundancia total 
(Ley et al., 2006). Estudios posteriores colocan a Lyngbya sp. y Microcoleus 
chtonoplastes como géneros dominantes y mediante el análisis del gen nifH (nitrógeno 
reductasa), se revela que las especies principales encargadas de la fijación del nitrógeno 
son Halothece sp., Plectonema boyranum, Azotobacter vinelandii y Desulfovibrio 
salexigens, y varias otras de novo (Omoregie et al., 2004). En el caso de Cuatro 
Ciénagas se ha encontrado una gran diversidad de eucariontes, eubacterias y Archaeas, 
analizando varios genes de importancia fisiológica que en conjunto con la determinación 
de las características fisicoquímicas se han generado modelos predictivos relacionados 
con el metabolismo de lípidos, nucleótidos y síntesis de membrana (Breitbart et al., 
2009). 
La diversidad observada en las biopelículas ya sea biopelícula sencilla o conformando 
un tapete microbiano, se observa una dinámica de intercambio de especies y/o grupos 
dando una sucesión ecológica (Pielou, 1996; Peters et al., 2000) que va probablemente 
relacionada con los factores ambientales (Anderson et al., 2009; Berlanga et al., 2010). 
En estos procesos de sucesión, hay dos grandes grupos de microorganismos, especies 
persistentes que se infiere son el sustento del sistema y especies de intercambio (Araújo 
et al., 2000), que probablemente se agregan a las biopelículas a manera de reservorio o 
refugio como respuesta al estrés ambiental. 
13 
 
2.4. Estudios metagenómicos 
 
El metagenoma se define como la colección de genomas provenientes de un sistema 
ambiental (Handelsman et al., 1998) en estudios de la microflora de la rizósfera de la 
soya, con el fin de identificar organismos microbianos desconocidos con probables 
aplicaciones industriales, encontrando que la diversidad de organismos no cultivables 
era mayor que el número de cepas en cultivos aislados. Las técnicas moleculares 
metagenómicas consisten en la extracción de los genomas de todos los organismos que 
se encuentran en un sistema ambiental (e. g. suelo, flora intestinal, biopelículas) y la 
identificación de los organismos presentes utiliza varios marcadores moleculares 
basados en la amplificación mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa 
(PCR), en secuencias específicas (codificantes y no codificantes). Las secuencias 
obtenidas pueden ser preservadas en amplicotecas (Rondon et al., 2000) o pueden ser 
separados a través de geles especiales para su aislamiento y posterior caracterización 
genética. 
El uso de las técnicas metagenómicas ha ido en aumento en sistemas ambientales 
extremos donde es difícil aislar la microbiota cultivable o en sistemas que tienen una 
complejidad muy grande para ser caracterizada por métodos clásicos. Adicionalmente, 
muchos microorganismos cuando se encuentran en asociación (e.g. biopelículas 
microbianas), pueden modificar su morfología y su fisiología, perdiendo en algunos 
casos todas sus ultraestructuras características, haciendo difícil y en ocasiones imposible 
su aislamiento e identificación; hasta el momento se desconocen la mayoría de las 
relaciones fisiológicas entre microorganismos y su relación con los cambios 
fisicoquímicos que imperan en estos ambientes microbianos. 
Estos estudios se han realizado en gran cantidad de ambientes diferentes en todo el 
mundo como en las marismas en California (Córdoba-Kreylos et al., 2006), sedimentos 
marinos en Perú (Biddle et al., 2008), lagunas hipersaladas de Chile (Da Silva et al., 
2008b), las costas del Mediterráneo (Caumette et al., 1994), Shark Bay, Australia 
(Papineau et al., 2005), ventilas hidrotermales en el Tibet (Lau et al., 2009) y Tailandia 
(Portillo et al., 2009) por nombrar algunos; inclusive en estudios de ecología arrecifal 
14 
 
para la determinación de factores de patogenicidad en corales, como Porites compressa 
(Vega et al., 2008). 
 
2.4.1. Identificación de genomas específicos en un metagenoma 
 
La obtención del ADN metagenómico plantea dificultades técnicas debido a la variedad 
de sistemas ambientales y la contaminación inherente de la muestra. En la actualidad se 
han generado algunas técnicas de extracción de ADN metagenómico basados en la 
precipitación o purificación selectiva de los ácidos nucléicos presentes. Por ejemplo, el 
método de extracción conjunta de ADN y ARN de alta calidad en algas verdes (La 
Claire y Herrin, 1997) o el método de afinidad en sílice (Rojas-Herrera et al. 2008). 
Una vez obtenido el ADN metagenómico se caracterizan los genomas individuales que 
lo componen, para lo que se utiliza una variedad demetodologías moleculares 
dependiendo del nivel de resolución esperado o bien si se prefiere que los datos sean 
cuantitativos o cualitativos. En el caso de las amplicotecas se emplea la amplificación 
y/o digestión arbitraria de secuencias no codificantes, usualmente ARN ribosomal, que 
tiene una alta especificidad. La técnica más común es el análisis de restricción de la 
amplificación del ADN ribosomal o ARDRA por sus siglas en ingles. Esta técnica 
cuando es empleada en amplicotecas permite también comparar semicuantitativamente 
el porcentaje de haplotipos específicos para cada genoma en el sistema ambiental 
(Zhang et al., 2008). 
 
2.5. Análisis de la restricción de las amplificaciones del ADNr 
(ARDRA) 
 
La técnica de ARDRA se utilizó originalmente para caracterizar especies y/o cepas 
patógenas dentro un mismo género como Cryptococcus (Vigalys y Hester, 1990), 
Mycobacterium (Vaneechoutte et al., 1993; De Baere et al., 2002), Polimixya (Ward et 
al., 1994) y Gardnerella vaginalis (Ingianni et al., 1997), con el fin de realizar un 
diagnóstico rápido. También se ha realizado la caracterización de la flora intestinal 
humana (Ingrassia et al., 2001) de pacientes sanos y enfermos para encontrar una huella 
15 
 
metagenómica patogénica. Otra línea de investigación es la caracterización de 
organismos con aplicaciones biotecnológicas como el orden Glomales (Redecker et al., 
1997) y el género Dunaliella sp. (Olmos et al., 2000). Dentro de las aplicaciones 
ambientales se encuentran la determinación de la biodiversidad en distintos ambientes 
(Ventura et al., 2001), estudios filogenéticos (Weisburg et al., 1991), así como estudios 
de impacto ambiental para detectar variaciones en las especies por causa de la 
contaminación (Smit et al., 1997). Una de las grandes ventajas de este método es la 
posibilidad de identificar especies con un alto grado de confianza en comparación con 
otros métodos como el RAPD, AFLP y RFLP que utilizan el genoma completo para el 
análisis (Jawad et al., 1998; Koeleman et al., 1998), pudiendo resolverse grupos 
complejos como el de Arthrospira con tan solo dos segmentos amplificados 
(Scheldeman, et al., 1999). 
Los resultados microbiológicos clásicos y los del ARDRA son similares, y denotan una 
gran efectividad de esta técnica molecular para determinar especies (Hall et al., 1999). 
Esa técnica de ARDRA consiste en la amplificación del ADNr por medio de la PCR y 
posteriormente digeridas con una enzima o más enzimas, dependiendo de la 
especificidad esperada, comúnmente una de corte moderado y una enzima de corte 
constante, esta doble selección primero por amplificación y después por digestión, 
permite descartar filotipos distintos, al resolver el producto de la amplificación-digestión 
en un gel de agarosa o acrilamida. La simplicidad del método permite su aplicación en 
estudios de ecología como un indicador de las frecuencias de los diferentes genotipos 
(Ley et al., 2006), y poder analizar cambios en una misma comunidad como en los 
procesos de colonización y sucesión ecológica (Dang y Lowell et al., 2000), o comparar 
entre comunidades de distintos ecosistemas (Liu et al., 2003). 
 
2.6. Análisis cualitativo de los diferentes genomas presentes en un 
sistema ambiental 
 
Además del análisis ARDRA, es posible utilizar técnicas de alta resolución para la 
identificación de secuencias específicas de los diferentes genomas presentes en un 
sistema ambiental. Tal es el caso del polimorfismo conformacional de la hebra simple o 
16 
 
SSCP y el análisis del polimorfismo de nucleótidos simples o SNP por sus siglas en 
inglés; estas técnicas tienen una sensibilidad de un nucleótido en la secuencia, 
permitiendo ubicar variaciones de secuencia aun entre organismos de una misma 
población (Hayashi, 1991; Sunnucks et al., 2000). 
Estas metodologías se han empleado para identificar especies en estudios de ecología 
molecular descriptiva, donde se ha realizado la identificación de metaespecies 
(Donoghue, 1985) y variedades según el principio de presencia o ausencia de secuencias 
distintivas (De Haro, 1999). La caracterización molecular empleando las técnicas 
descritas anteriormente permiten también obtener la riqueza específica y las relaciones 
evolutivas entre los distintos componentes de los sistemas biológicos (Kaneko, 1993). 
El nuevo enfoque de la ecología molecular requiere de identificar no solo los 
componentes del sistema, si no que trata de comprender mejor los sistemas mediante la 
aplicación de métodos de ecología clásica utilizando la abundancia relativa de cada 
componte de estos complejos, recurriendo a métodos que cuantifiquen la frecuencia 
específica para organismo, siendo necesario cuantificar el número de representantes de 
cada uno en el sistema mediante alguna técnica molecular aplicable a la metagenómica. 
 
2.7. Análisis semicuantitativo de la biodiversidad 
 
No hay muchos estudios que interpreten la diversidad metagenómica encontrada en 
sistemas ambientales, pero muy pocos han sido aplicados a los datos obtenidos a partir 
de técnicas moleculares. Esto principalmente por el costo de las técnicas moleculares 
para la realización del muestreo. También es importante el hecho que las curvas de 
rarefacción (Ley et al., 2006) tienen una pendiente pronunciadas, indicando que el 
muestreo es todavía incompleto y que falta mucha diversidad por caracterizar. 
Algunas de las propuestas para el análisis de datos de comunidades y poblaciones 
metagenómicas, son el uso de Cuadros de ausencia y frecuencia generadas a partir de 
datos de pruebas indirectas como el DGGE y el SSCP, a partir de los cuales se pueden 
hacer inferencias acerca de la diversidad de la población para comparación de diferentes 
poblaciones. Esto se ha realizado para poder comparar la diversidad diurna y nocturna 
(Bench et al., 2007; Villanueva et al., 2007) y para observar la estacionalidad de la 
17 
 
diversidad (Helton y Wommack 2009) así como las variaciones verticales que presentan 
estas comunidades (Treusch et al., 2009). 
Es así que los resultados encontrados por lo limitado del muestreo comúnmente se 
transforman a un análisis semicuantitativo, para hacer inferencias de diversidad, 
esperando que en un futuro con la proliferación de las técnicas moleculares y la 
disminución del costo de estas técnicas se puedan realizar muestreos más exhaustivos 
para poder cubrir una porción más significativa de la comunidad y así poder generar 
mejores modelos de las dinámicas poblaciones. 
Un grupo de investigadores está realizando estudios del tipo de metapoblaciones 
(Gyllenberg y Hanski, 1992; Hanski, 2004) para demostrar estos procesos poblacionales 
como la sucesión de especies (Amarasekare y Possingham, 2001), el efecto de la 
variabilidad ambiental en estas metapoblaciones (Anderson et al., 2009) y de algún 
modo entender las dinámicas que se llevan a cabo analizando estas variaciones de la 
presencia de haplotipos dentro de un grupo poblacional (Drechsler y Wissel, 1997; 
Bascompte, 2001; Cassagrandi y Gatto, 2002) de acuerdo a las densidades y 
abundancias de cada uno (Geritz et al., 2009) y algunos procesos como la migración 
(Gandon y Michakalis, 1999; Hanski y Zhang, 1993), el suicidio evolutivo (Gyllenberg 
y Parvinen, 2001) mediante el análisis con procesos estocásticos (Etienne y Nagelkerke, 
2002). 
Para el análisis de las comunidades, se han empleado gran cantidad de propuestas que 
consideran principalmente la varianza de los grupos presentes en las comunidades y/o 
poblaciones, estos índices se encuentran básicamente en dos grupos, los que contemplan 
la varianza de la población de manera independiente como el índice de Shannon (H’) 
(Chao y Shen, 2003) o el caso del índice en Alfa (α) (Duhachek et al., 2005) que 
considera la varianza con respecto a la varianza total; En cuanto a los índices de 
similitud poblacional, se basan en dos principios:en el análisis de las probabilidades 
independientes de cada grupo entre las poblaciones como el índice de Morista-Horn 
(MH) (Morisita, 1971; Bloom, 1981) o considerando el número total de representantes 
del muestreo como en el caso del índice de Canberra que muestra las tendencias 
migratorias según la población con menor varianza (Bloom, 1981); por otro lado los 
índices Beta arrojan índices que muestran la relación que existe entre las poblaciones de 
18 
 
acuerdo a las diferencias y similitudes entre estas poblaciones como el índice Jaccard 
(CZik) (Jaccard, 1912; Magurran, 1988; Koleff et al., 2003) que indica la relación entre 
las especies persistentes y el total; otro ejemplo es el índice Beta de Whittaker (Bw) 
(Whittaker, 1960; Magurran, 1988; Koleff et al., 2003) que considera al número total de 
representantes distintos como el indicativo de la variabilidad; por otro lado el análisis de 
las distancia poblacional (Bc)(Cody, 1975; Magurran, 1988; Koleff et al., 2003) 
considera el número total de representantes que no se encuentran en las dos poblaciones. 
Ya un análisis de estos datos transformados considerando a los datos como datos 
algebraicos son el índice de Beta de Routledge (Br) (Routledge, 1977; Magurran, 1988; 
Koleff et al., 2003) y el índice Beta vectorial (Bhv). 
Todos estos índices, son inferencias que en ecología se utilizan para realizar modelos y 
ensayos de las dinámicas poblaciones como son la migración, la sucesión ecológica y la 
muerte evolutiva. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
19 
 
3. JUSTIFICACIÓN 
 
Los ecosistemas hipersalinos, son ambientes muy diversos aunque poco estudiados (Ley 
et al., 2006). Recientemente, con el desarrollado de metodologías metagenómicas es 
posible analizar más profundamente las microcomunidades existentes en dichos sistemas 
(Xu, 2006). Dentro de estos sistemas hipersalinos, los sistemas más antiguos y 
complejos son los llamados tapetes microbianos (Taton et al., 2003), los cuales son 
asociaciones microbianas formando biopelículas estratificadas (Nübel et al., 2001). 
Estas asociaciones microbianas ancestrales (estromatolitos) evolucionaron en este 
arreglo, para resistir los cambios ambientales drásticos de la atmósfera primitiva (Des 
Marais, 2003; Leuko et al., 2007) y dan origen a los actuales tapetes microbianos que 
han mantenido un proceso constante de evolución individual y poblacional. Por lo 
anterior, el estudio de las interacciones existentes entre los principales grupos de 
microorganismos es de gran importancia para entender otras interacciones ecológicas 
existentes en otros ambientes, así como su capacidad de resistir la agresividad del medio, 
que le permiten sobrevivir y asimilar metales pesados, petróleo, entre otros 
contaminantes, colocándolos como candidatos idóneos para usarse para biorremediación 
y biodepuración. 
Por todo esto, el presente estudio está enfocado en el análisis de las comunidades 
microbianas en tapetes microbianos presentes en un poza salinera en la Laguna Rosada 
(Uaymitún, Yucatán) en 3 estadios diferentes, utilizando el conjunto de metodologías 
metagenómicas y fisicoquímicas para así contribuir al conocimiento sobre lo 
biodiversidad, procesos tróficos y algunas de las dinámicas que se presentan en estos 
ambientes complejos 
 
20 
 
4. HIPÓTESIS 
 
Existen cambios en los perfiles microbianos a través de distintos muestreos (estadios) en 
un mismo tapete microbiano. 
 
5. OBJETIVO GENERAL 
 
Caracterizar el perfil microbiano y su relación con los parámetros fisicoquímicos 
existentes en diferentes tapetes hipersalinos obtenidos en la Laguna Rosada de 
Uaymitún, Yucatán, México. 
 
5.1. Objetivos específicos 
 
1. Determinar las características significativas (conductividad, pH, etc.) de tapetes 
maduros para la selección del punto de muestreo. 
2. Observar la diversidad microbiana por métodos de microscopia (óptica y 
electrónica). 
3. Determinar la diversidad microbiana mediante DGGE. 
4. Caracterizar la diversidad microbiana a partir de las amplicotecas (ADNr). 
5. Analizar la filogenia molecular de las secuencias obtenidas 
 
 
21 
 
6. MATERIAL Y METODOS 
 
6.1. Diseño experimental 
 
El análisis se realizó en dos partes principalmente, una utilizando las metodologías 
microscópicas clásicas para observar la biodiversidad y una segunda parte empleando 
técnicas moleculares, para selección del área muestral y búsqueda de secuencias para 
análisis (Fig. 2). 
 
 
Figura 2. Diagrama general de la metodología empleada. 
. 
22 
 
6.2. Zona de colecta 
 
La Laguna Rosada de Uaymitún se localiza en la costa norte del estado de Yucatán, con 
una distribución paralela a la línea de playa, comenzando al este-sureste cerca de la 
ciudad y Puerto de Progreso y prolongándose hacia el este por apróximadamente 26 Km 
considerando el cuerpo acuífero y la zona de humedal. La zona de muestreo se localiza 
en el extremo este de esta la Laguna Rosada en las coordenadas 21°18’56’’ N y 
89°20’59’’ O, a orillas de la carretera a Telchac Puerto – Dzemul. Esta carretera conecta 
al norte con la Carretera Federal 27 que va de Chicxulub – Telchac Puerto y que viene 
de la ciudad y puerto de Progreso y al este-noreste de la zona arqueológica de Xcambó 
(fig. 3). 
 
 
Figura 3. Ubicación de la zona de muestreo en la laguna rosada de Uaymitún, Yucatán, México. A, B, C y D, 
sucesión de imágenes satelitales para ubicación de la zona de muestreo, en la laguna rosada de Uaymitún. E 
Panorámica de la poza salinera, mostrando la zona de colecta. 
 
Esta laguna es un sistema kárstico con depresiones paralelas a la costa, sin aporte de 
agua dulce por escorrentía de ríos superficiales (Herrera-Silveira, et al. 2002), con un 
23 
 
importante aporte de agua dulce a través de los nacimientos provenientes de ríos 
subterráneos. Esto genera una dinámica entre las masas de agua generando una 
variabilidad en la salinidad de manera vertical y horizontal. Estos cambios en la 
salinidad, están regidos por el régimen de lluvias, marcándose tres temporadas 
principales, la de secas (marzo-mayo), lluvias (junio-octubre) y nortes (noviembre-
febrero) (Herrera-Silveira et al. 1998). En algunas partes de la laguna principalmente 
hacia el este, es posible encontrar varias pozas salineras artesanales vestigio de la cultura 
maya, y algunas actuales que se encuentran en uso por parte de los habitantes de la 
región. El aporte de sedimentos se da de manera constante por una corriente débil, 
proveniente de la Corriente de Yucatán o derrame del Banco de Campeche (Capurro, 
2003), con un aumento drástico en la época de huracanes (agosto-septiembre), por las 
fuertes corrientes y mareas (Herrera-Silveira, 2006). Finalmente, las mareas tienen una 
influencia significativa en estos ecosistemas de marisma, ya que por sus características 
geomorfológicas, es difícil el drenaje del agua que aporta la marea alta, favoreciendo la 
acumulación de las sales por evaporación (Meyer-Arendt, 1987; Ihl et al., 2006). 
La flora macroscópica característica son principalmente plantas herbáceas como Typha 
domingensis, Cladium jamaicense, Eleocharis cellulosa, E. interstincta como especies 
dominantes (Rejmankova et al., 1996), mangles y pseudomangles (Rhizophora mangle, 
Laguncularia racemosa, Avicennia germinans y Conocarpus erectus) (CONABIO, 
2008); así como algunas algas del género Dunaliella y otras algas halotolerantes; 
también algunos pastos marinos como la Ruppia marítima en nacimientos subterráneos y 
Halodule wrightii para salinidades mayores a 25 ppm (Herrera-Silveira, 2006). Pero el 
más vistoso de los organismos de la zona es el Phoenicopterus ruber (flamingo rosa) 
que junto con algunas otras aves migratorias ocupan las lagunas como refugios. 
 
6.3. Colecta de muestras 
 
Se seleccionó un punto de muestreo, donde se realizaron 3 muestreos en los meses de 
mayo,julio y septiembre, utilizando el estado de maduración de los tapetes microbianos 
y la conformación del área de muestreo. Las muestras se tomaron con una espátula 
estéril (48 h, 80ºC) en secciones de apróximadamente 10cm x 10cm, para 
24 
 
posteriormente colocarlas en recipientes sellados para su transportación al laboratorio y 
conservación a -80ºC. 
El criterio mediante el cual se seleccionó la zona de muestreo se basó en las 
características macroscópicas de un tapete maduro, como son las 3 capas ya 
completamente formadas, con la trama superior completamente cerrada, y la 
consistencia del tapete (Fig. 4). 
 
 
 
 
 
Figura 4. Características Macroscopicas de tapetes microbianos en distinto grado de maduración. A y B, tapetes 
microbianos inmaduros, aunque presentan ya la precipitación de la biopelícula y comienzan a formar la malla, todavía 
no se encuentra está completamente cerrada. C, tapete microbiano maduro, con la malla completamente cerrada. D, 
Tapete microbiano deshidratado. 
 
6.4. Separación de capas 
 
Se cortaron tiras de 1 cm de ancho por 5-7 cm de largo, retirando el exceso de sedimento 
con agua destilada estéril. Posteriormente, las muestras se colocaron en un recipiente a 
T. A. con solución de NaCl (1%) por 5 min, para finalmente introducirlas en un 
ultracongelador (-80ºC) por 30 min para generar un shock térmico. Transcurrido este 
25 
 
tiempo se separaron las capas de manera manual, utilizando una espátula de disección 
estéril, cuidando de no romper la capa y finalmente se enjuagaron con agua destilada 
estéril. Las capas ya separadas se almacenaron en tubos nuevos de 1.5 ml estériles 
rotulados a -80
o
C. 
 
6.5. Análisis de los factores fisicoquímicos macro y micro 
ambientales 
 
Los factores fisicoquímicos macroambientales considerados fueron la temperatura 
ambiental y la precipitación obtenidos de la base de datos de CONAGUA (2009). Los 
factores microambientales se obtuvieron mediante cálculos de extrapolación; Se tomaron 
de 200 a 300 µg de muestra, que se maceró con cuidado y se transfirieron a un matraz 
aforado de 50 ml, y se agregó agua destilada hasta llegar al aforo; considerando el 
volumen agregado, se toman las lecturas por triplicado con el multiparametro BIOLINE. 
Con los datos de volumen inicial (50 ml – Volumen agregado), Volumen final (50 ml) y 
la lectura del multiparámetro se calcula el dato de la conductividad y al concentración de 
los radicales de Hidrogenión mediante la fórmula de C1V1 = C2 V2. 
 
6.6. Pretratamiento de muestras 
 
Se fraccionó la muestra en cantidades de 200-300 μg y se transfirieron a tubos de 1.5 mL 
estériles y rotulados. El pre-tratamiento de las muestras se realizó agregando 500 μL de 
EDTA 0.5M, posteriormente se maceró ligeramente usando palillos estériles y luego se 
mezcló mediante Vortex por 10 seg hasta homogenizar y se dejó incubar por 24 h a T A. 
Transcurrido este tiempo la muestra se resuspende mediante Vortex por 10 seg y 
centrifugación a 13,000 rpm por 10 min. Se descartó el sobrenadante y se repite el 
pretratamiento con EDTA 0.1M de 3 a 5 veces (según el nivel de contaminación). 
El pre-tratamiento para microscopia electrónica se realizó a partir de pequeños cuadros 
(10 x 10 mm) en un recipiente y se incubaron de la misma manera que el proceso 
anterior, pero con un periodo de 5 a 10 días en la segunda incubación (EDTA 0.1M). 
 
26 
 
6.7. Tinción de muestras para microscopia óptica 
 
6.7.1. Tinción con azul de bromofenol 
 
A partir de una de las alícuotas pretratadas se realizó un frotis agregando unas gotas de 
azul de bromofenol (1:50 azul de bromofenol-etanol 70%, pH 4.6), se incuba (10 min), 
enjuaga, se deja secar, y se observó al microscopio óptico. 
 
6.7.2. Hibridación con Naranja de acridina 
 
A partir de una de las alícuotas pretratadas se realizó un frotis, cubriendo completamente 
con una gota de naranja de acridina (1/10000 gr/v), el cual se dejó hibridar por 5 minutos 
a T A. Posteriormente, el frotis se enjuagó con agua destilada y se observó al 
microscopio de epifluorescencia marca MOTIC modelo 107M, con el filtro FITC 
(excitación a 502 nm y emisión a 525 nm). 
 
6.8. Fijación de muestra para microscopia electrónica 
 
Una alícuota de la muestra se fijó con glutaraldehído (2.5%) con amortiguador de 
fosfatos (NaH2PO4-Na2HPO4, 0.02 M, pH 7.2) por 10 días a 4ºC. Posteriormente, a la 
muestra se le realizaron tres lavados más con amortiguador de fosfatos (0.2 M) por 30 
min a 4ºC. La deshidratación se realizó mediante una serie de cambios de etanol en 
concentraciones ascendente dividida en dos partes. En la primera parte se utilizó etanol 
al 30% y 50% v/v, con dos cambios cada uno, con un intervalo de 30 min entre cada 
cambio; para terminar esta primera deshidratación la muestra se colocó en etanol al 70% 
y se almacenó a 4ºC por no menos de una semana. En esta concentración la muestra se 
puede mantener hasta por 6 meses sin que se afecte la calidad de la muestra. 
La última parte de la deshidratación se llevó a cabo poco antes de realizar la observación 
en el microscopio electrónico de barrido (MEB) modelo JSM6369LV de la compañía 
JEOL Electrón Optics Instruments (Tokyo, Japon). Se sustituyó el etanol al 70% con la 
última serie de deshidratación utilizando etanol al 85%, 96% y absoluto, con dos 
27 
 
cambios cada uno con 30 minutos entre cada cambio. (Se recomienda aplicar vacío y 
mantener las muestras a 4º C durante el tiempo de deshidratación). 
Se hicieron cortes transversales de 1-2 mm de grosor y secado mediante punto crítico en 
CO2 líquido en el desecador semiautomático SAMDRI-795 (31º C y 1072 ps), con un 
tiempo de purga de 10 min y descompresió a 150 ps/min. Se colocaron los cortes en 
bases metálicas con tiras de carbono para la metalización que se realizó en un DESK II 
de Denton (Scotia, NY, USA), con un baño de oro atomizado (120 A) vertical y en otro 
ángulo. Una vez metalizada la muestra se en las bases porta muestra del MEB y su 
observación de 2,000x a 25,000x y un voltaje de 14-17kv. 
 
6.9. Extracción de ADN metagenómico por método de sílica 
 
De acuerdo al protocolo de Rojas-Herrera et al. (2008), se tomaron 200 a 250 μg de la 
muestra pre-tratada y se colocaron en tubos nuevos, estériles y rotulados de 1.5 ml; se 
agrega 1 ml de solución amortiguadora TEN (100mM Tris-HCl, 50mM EDTA, 500mM 
NaCl, pH8.0) y se mezcló por 2 min. Posteriormente, el homogenizado es centrifugado a 
13,000 rpm por 10 min a T A, se descarta el sobrenadante y se repite el lavado de 3 a 5 
veces; Una vez terminado el lavado, la pastilla se resuspende en 1 ml de amortiguador 
TEN con 1 µL de lisozima (20mg/mL) y se incubó por 2h a 37ºC con agitación 
moderada (300 rpm). Se añaden 100 µL de SDS (20%) y mezclado por 5 seg seguido de 
3 ciclos de 10 min en hielo y 5 min a 65ºC. Las muestras se dejaron reposar por 30 min a 
temperatura ambiente y luego se centrifugaron a 10,000 rpm por 10 min. El 
sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo, se le agregaron 500 µL de Acetato de Potasio 
(5M) y se dejó incubar a 65ºC por 5 min. Posteriormente, los tubos se colocaron en hielo 
por 20 min y centrifugados en frío (4ºC) por 30 min a 14,000 rpm. El sobrenadante se 
transfirió nuevamente a otro tubo nuevo agregándole la suspensión de silica (recién 
mezclada en Vortex); el complejo ADN-silica se recuperó por centrifugación a 14,000 
rpm por 2 min a T A, desechando el sobrenadante; se lavó la pastilla con 1 ml de etanol 
frio (70%) y se centrifugó a 14,000 rpm por 2 min, desechando el sobrenadante. 
Finalmente, el ADN se recupera agregando 50 µL de agua bidestilada estéril e 
incubando a 55ºC por 5 min y centrifugación a 14,000 rpm por 5 min a temperatura 
28 
 
ambiente; finalmente se recuperó el sobrenadante y se mezcló con amortiguador TE 
(Tris-HCl 100 mM (pH 8); EDTA-NaOH 100mM (pH 8)) con glicerol (1:5) y se 
almacenó a -80
o
C. 
 
6.10.