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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Centro de Desarrollo de Productos Bióticos ESTUDIO DE LA DIGESTIBILIDAD DEL ALMIDÓN Y CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE UNA TORTILLA ELABORADA CON UNA MEZCLA DE MAÍZ DE ALTA CALIDAD PROTEÍNICA (Zea mays L.) Y FRIJOL NEGRO (Phaseolus vulgaris L.) TESIS Que para obtener el grado de Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos PRESENTA Eva María Grajales García Directores de tesis Dr. Luis Arturo Bello Pérez Dr. Salvador Horacio Guzmán Maldonado Yautepec, Morelos; Noviembre 2010 El presente trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Control de Calidad del Departamento de Desarrollo Tecnológico del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección del Dr. Luis Arturo Bello Pérez y el Dr. Salvador Horacio Guzmán Maldonado, así como en la Unidad Asociada de Investigación Nutrición y Salud Gastrointestinal (UCM/CSIC) de la Facultad de Farmacia en la Universidad Complutense de Madrid, bajo la supervisión de la Dra. Isabel Goñi Cambrodon. Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), al Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) y a la Secretaría de Investigación y Posgrado (SIP) por las becas otorgadas para la realización de los estudios. AGRADECIMIENTOS Al Dr. Luis Arturo Bello Pérez, por permitir que me integrara en su grupo de trabajo, ser director de esta Tesis y el apoyo otorgado para su realización. Al Dr. Salvador Horacio Guzmán Maldonado, por dedicar su tiempo y dirigir esta Tesis. A la Dra. Perla Osorio Díaz por el conocimiento compartido, la orientación proporcionada y su constante paciencia. A la M. en C. Maribel Ovando Martínez y el M. en C. Vicente Espinosa Solis, por el conocimiento compartido y su valiosa amistad. A la Dra. Isabel Goñi Cambrodon, por posibilitar la realización de una parte del trabajo experimental en la Universidad Complutense de Madrid y tener la oportunidad de conocer nuevas culturas. A mi comité tutorial: Dra. Edith Agama Acevedo, Dra. Perla Osorio Díaz, Dra. Silvia Evangelista Lozano; así como al Dr. Miguel Gerardo Velázquez del Valle por las valiosas observaciones para el mejoramiento del trabajo de investigación. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), al Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) y a la Secretaría de Investigación y Posgrado (SIP) por las becas otorgadas para la realización de los estudios. A mis amigos, mi pareja y mi familia, por el apoyo brindado y su grata compañía durante esta etapa de mi formación. DEDICATORIA A mis padres, Job y Lola, gracias por todo su amor y apoyo durante toda mi vida, los amo mucho A mi hermanita Fabiola, por ser mi hermana, compañera hermosa de travesuras y mi amiga, te amo mucho hermanita A mi abuelita Nina, gracias por sus bendiciones abuelita, la amo mucho A mi abuelita Poli y a mis abuelitos Delfino y Vicente, donde quiera que estén, los amo mucho, esta es para ustedes también A mi familia en general, con quienes he tenido momentos hermosos A mis amigos, con quienes comparto mis alegrías y mis tristezas A ti mi amor, por todo tu amor y apoyo, agradezco el haberte conocido, te amo mucho Jaime A ese ser universal (Dios), a quien le pido que nos cuide e ilumine I RESUMEN La tortilla y los frijoles son los componentes básicos en la dieta de las personas en zonas urbanas y rurales de México. Se sugiere el uso del maíz de alta calidad proteínica para la preparación de tortillas, debido a que presenta un incremento en los niveles de lisina y triptófano. Los frijoles contienen una cantidad importante de fibra dietética, que confiere características de digestibilidad particulares al almidón, además contienen una cantidad importante de polifenoles. El objetivo de este estudio fue evaluar la composición química, digestibilidad del almidón y capacidad antioxidante en una tortilla elaborada con una mezcla de maíz de alta calidad proteínica y frijol negro. La tortilla adicionada con frijol presentó mayor contenido de proteína, fibra dietética y almidón resistente, y menor contenido de almidón digerible que la tortilla control. La velocidad de hidrólisis y la predicción del índice glucémico de la tortilla disminuyeron con la adición del frijol a la mezcla. Se detectaron taninos condensados en la tortilla adicionada con frijol, no así en la tortilla control. Con respecto a los polifenoles extraíbles, la tortilla adicionada con frijol presentó un contenido mayor en comparación con la tortilla control. Este patrón produjo una mayor capacidad antioxidante en la tortilla adicionada con frijol que en la tortilla control. La adición del frijol a la tortilla modificó la digestibilidad del almidón y las características antioxidantes de la tortilla, obteniendo un producto con características nutracéuticas. II ABSTRACT Tortilla and beans are the basic components in the diet of people in the urban and rural areas of Mexico. Quality protein maize is suggested for tortilla preparation due to that presents an increase in lysine and tryptophan levels. Beans contain important amount of dietary fiber that conferring particular digestibility characteristics to starch; they have also contain important amount of polyphenols. The objective of this study was to assess the chemical composition, digestibility of starch and antioxidant capacity, in tortilla prepared with a blend of quality protein maize and black bean. Tortilla with bean had higher protein, ash, dietary fiber and resistant starch content, and lower digestible starch content than control tortilla. The hydrolysis rate and the predicted glycemic index of tortilla decreased with the addition of bean in the blend. Condensed tannins in the tortilla with bean were detected, but the control sample did not. Tortilla with bean had higher extractable polyphenols content than control tortilla. This pattern produced higher antioxidant capacity in tortilla with bean than control tortilla. The addition of bean to tortilla modified the starch digestibility and antioxidant characteristics of tortilla, obtaining a product with nutraceutical characteristics. III ÍNDICE Página Resumen I Abstract II Índice III Índice de cuadros VI Índice de figuras VIII Abreviaturas IX 1. INTRODUCCIÓN 1 2. REVISIÓN DE LITERATURA 3 2.1 Biodisponibilidad de los carbohidratos 3 2.2 Almidón 5 2.3 Digestibilidad del almidón 8 2.3.1 Digestión del almidón 8 2.3.2 Índice glucémico 9 2.3.3 Factores que afectan la digestibilidad del almidón 11 2.3.4 Almidón resistente 14 2.4 Fibra dietética 16 2.5 Polifenoles 20 2.6 Capacidad antioxidante 25 2.7 Enfermedades relacionadas con la nutrición en México 25 2.8 La tortilla como alimento básico en la dieta mexicana 27 2.9 Fortificación de la tortilla 27 2.10 Maíz de alta calidad proteínica 28 2.11 Centro de origen del frijol 31 2.12 El frijol y sus propiedades 31 2.13 Estudios de digestibilidad del almidón de la mezcla maíz y frijol 32 3.JUSTIFICACIÓN 34 4. OBJETIVOS 35 IV 4.1 Objetivo general 35 4.2 Objetivos específicos 35 5. METODOLOGÍA 36 5.1 Elaboración de las muestras 37 5.1.1 Elaboración de la harina de frijol negro 37 5.1.2 Elaboración de la masa de maíz de alta calidad proteínica 37 5.1.3 Elaboración de la tortilla de maíz de alta calidad proteínica 37 5.1.4 Elaboración de la tortilla compuesta de una mezcla de maíz de alta calidad proteínica y frijol negro 38 5.2 Composición química proximal 38 5.2.1 Humedad 38 5.2.2 Proteína 39 5.2.3 Lípidos39 5.2.4 Cenizas 40 5.3 Fibra dietética total 40 5.4 Estudios de digestibilidad del almidón 42 5.4.1 Almidón total 42 5.4.2 Almidón disponible 43 5.4.3 Almidón resistente 43 5.4.4 Tasa de hidrólisis del almidón in vitro 44 5.5 Estudios de capacidad antioxidante 46 5.5.1 Compuestos polifenólicos 46 5.5.2 Capacidad antioxidante 48 5.6 Análisis estadístico 49 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 50 6.1 Composición química proximal 50 6.2 Fibra dietética total 53 6.3 Estudios de digestibilidad del almidón 54 6.3.1 Almidón total 54 V 6.3.2 Almidón disponible 55 6.3.3 Almidón resistente 57 6.3.4 Tasa de hidrólisis del almidón in vitro 58 6.4 Estudios de capacidad antioxidante 61 6.4.1 Contenido de polifenoles 61 6.4.2 Capacidad antioxidante 63 7. CONCLUSIONES 66 8. PERSPECTIVAS 67 8. LITERATURA CITADA 68 VI ÍNDICE DE CUADROS Cuadro Página 1. Clasificación de los carbohidratos de acuerdo a su biodisponibilidad. 6 2. Valores de índice glucémico (IG) de diferentes alimentos. 10 3. Características de la fibra dietética y su relación con su función en el intestino delgado. 18 4. Características de la fibra dietética y su relación con su función en el intestino grueso. 19 5. Clasificación de los taninos en base a su estructura química y monómeros constitutivos. 23 6. Prevalencia nacional de sobrepeso y obesidad de acuerdo con la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición del 2006 (ENSANUT 2006). 26 7. Composición química proximal de productos de maíz QPM de diferentes variedades (g/100 g). 30 8. Composición química proximal de harina de frijol negro, masa de maíz de alta calidad proteínica (QPM), tortilla QPM y tortilla QPM-frijol negro (g/100 g). 51 9. Contenido de fibra dietética total de harina de frijol negro, masa de maíz de alta calidad proteínica (QPM), tortilla QPM y tortilla QPM-frijol negro (g/100 g). 54 10. Almidón total de harina de frijol negro, masa de maíz de alta calidad proteínica (QPM), tortilla QPM y tortilla QPM-frijol negro (g/100 g). 55 11. Almidón disponible de harina de frijol negro, masa de maíz de alta calidad proteínica (QPM), tortilla QPM y tortilla QPM-frijol negro (g/100 g). 56 12. Almidón resistente de harina de frijol negro, masa de maíz de alta calidad proteínica (QPM), tortilla QPM y tortilla QPM-frijol negro 57 VII (g/100 g). 13. Porcentaje de hidrolisis a los 90 min (H90) y predicción del índice glucémico (pIG) de harina de frijol negro, tortilla de maíz de alta calidad proteínica (QPM) y tortilla QPM-frijol negro. 60 14. Contenido de polifenoles de harina de frijol negro, tortilla de maíz de alta calidad proteínica (QPM) y tortilla QPM-frijol negro. 62 15. Capacidad antioxidante de harina de frijol negro, tortilla de maíz de alta calidad proteínica (QPM) y tortilla QPM-frijol negro. 64 VIII ÍNDICE DE FIGURAS Figura Página 1. Resumen de los factores que influyen en la biodisponibilidad de los carbohidratos. 4 2. Enlaces α-(1-4) y α-(1-6) entre unidades de glucosa presentes en la amilosa y amilopectina del almidón (A); representación esquemática de la amilopectina indicando los puntos de ramificación (enlaces α-(1-6)) (B). 7 3. Efecto de las dietas con alimentos de índice glucémico bajo (A) o alto (B) en la absorción de glucosa gastrointestinal y glucosa en sangre postprandial. 12 4. Estructuras de los derivados del acido benzoico (A) y derivados del acido cinámico (B). 21 5. Estructura química de algunos flavonoides. 22 6. Diagrama experimental de trabajo. 36 7. Hidrólisis del almidón in vitro de la harina de frijol negro (∙∙), tortilla de maíz de alta calidad proteínica (QPM) (—) y tortilla QPM-frijol negro (– –). Las barras de error representan el error estándar. 59 IX ABREVIATURAS Abreviatura Significado µmol eq de Trolox/g Micromol equivalente de Trolox por gramo AACC American Association of Cereal Chemists ABTS Ácido 2,2´-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) AD Almidón disponible AGCC Ácidos grasos de cadena corta AR Almidón resistente AR1 Almidón resistente tipo 1 AR2 Almidón resistente tipo 2 AR3 Almidón resistente tipo 3 AR4 Almidón resistente tipo 4 AT Almidón total CA Capacidad antioxidante Ca(OH)2 Hidróxido de calcio (cal) CIMMYT Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo CRCC Carbohidratos resistentes de cadena corta DNS Ácido 3,5-dinitrosalicílico DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidracil ENSANUT 2006 Encuesta nacional de salud y nutrición del 2006 FD Fibra dietética FNB Food and Nutrition Board of the National Academy of Sciences, USA FRAP Ferric Reducing Activity Power GLL Glucosa lentamente liberada GOD-POD Glucosa oxidasa peroxidasa GRL Glucosa rápidamente liberada H90 Porcentaje de hidrólisis a los 90 minutos HCl Ácido colrhidrico IG Índice glucémico X INIFAP Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias maíz QPM Maíz de alta calidad proteínica Masa QPM Masa de maíz de alta calidad proteínica OMS Organización Mundial de la Salud PE Polifenoles extraíbles PH Polifenoles hidrolizables pIG Predicción del índice glucémico PNA Polisacáridos no amiláceos TC Taninos condensados Tortilla QPM Tortilla de maíz de alta calidad proteínica Tortilla QPM-frijol negro Tortilla compuesta de una mezcla de maíz de alta calidad proteínica y frijol negro 1 1. INTRODUCCIÓN En México, en algunos países de América Central y Mexicanos que viven en Estados Unidos de América, consumen la mayoría del maíz (Zea mays L.) después de un proceso de cocción con cal llamado ―nixtamalización‖. La nixtamalización es un proceso antiguo, donde los granos de maíz son cocidos en un medio alcalino, remojados por 16-18 horas en el agua que se cocieron, y después lavados para remover el pericarpio y el exceso de cal. Los granos cocidos en el medio alcalino son llamados ―nixtamal‖, y después de molerlos se produce una pasta suave conocida como ―masa‖. La masa es usada para la producción de la tortilla, la cual es el alimento básico principal en la dieta Mexicana (Paredes-López y Saharopulos-Paredes, 1983; Robles et al., 1988). En México, el consumo per cápita de la tortilla en algunos grupos es de 120 kg/año, lo cual es equivalente a 328 g/día (Amaya-Guerra et al., 2004). Se sabe que el maíz es deficiente en lisina y triptófano, dos aminoácidos esenciales, por esta razón la fortificación de la tortilla es necesaria. Sin embargo, el maíz de alta calidad proteínica (QPM) puede ser una alternativa para mejorar la calidad nutricional de la tortilla, el cual fue desarrollado a partir del maíz opaco-2. El maíz QPM muestra un contenido mayor de lisina (3.4-6.0 g/ 100 g de proteína) y triptófano (0.8–1.2 g/100 g de proteína) que el maíz regular (Serna-Saldívar y Rooney, 1994). Se han realizados estudios de la composición química (Bressani et al., 1990; Amaya-Guerra et al., 2004; Mora-Avilés et al., 2007), contenido de minerales (Bressani et al., 1990; Mora-Avilés et al., 2007), contenido de aminoácidos (Bressani et al., 1990; Amaya-Guerra et al., 2004; Mora-Avilés et al., 2007) y digestibilidad de proteína (Amaya-Guerra et al., 2004; Mora-Avilés et al., 2007) en tortillas elaboradas con maíz QPM. Mora-avilés et al. (2007) realizaron un estudio de los cambios en la digestibilidad de proteína y el contenido de proteína, lisina, triptófano y minerales durante el proceso de nixtamalización del maíz QPM. También se han realizado estudios de optimización del proceso alcalino (Millán-Carrillo et al., 2004) y análisis de los cambios en la calidad de la proteína en función del tiempo de remojo (Rojas-Molina et al., 2008) en harinas de maíz QPM nixtamalizado. El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) ocupa un lugar importanteentre las leguminosas de mayor producción y consumo en África, India, América Latina, y México (Sathe et al., 1982; 2 Bourges, 1987; Reyes-Moreno y Paredes-López, 1993). En zonas rurales de México, el consumo de frijol en una dieta normal representa el 15% (Paredes-López et al., 2000). El frijol común y el maíz representan la fuente principal de alimento para más de 25 millones de personas Mexicanas que viven en zonas rurales, así como para 30 millones de personas que viven en zonas urbanas marginales (Rosado et al., 1992). Los frijoles son una fuente rica de proteínas (20-25%) y carbohidratos (50-60%), son de bajo costo (Rehman et al., 2001) y son benéficos para la salud, con índice glucémico bajo (Foster-Powell y Brand-Miller, 1995). Recientemente, se ha estudiado la capacidad antioxidante in vitro de tres leguminosas consumidas en México (frijol negro, lenteja y garbanzo cocidos), encontrando que el frijol negro tuvo la mayor concentración de taninos condensados (o antioxidantes) (Hernández- Salazar et al., 2010). Tradicionalmente, las personas que viven en zonas rurales de México y América Central consumen un alimento constituido por tortilla, frijol y chile llamado ―taco‖ (Sáyago-Ayerdi et al., 2005). Se sabe que como una mezcla se mejoran algunas de las características nutricionales de los elementos individuales, especialmente en las características nutricionales relevantes de los polisacáridos presentes en este alimento compuesto (Sáyago-Ayerdi et al., 2005). Se ha sugerido que la mayoría de las propiedades benéficas de los ―carbohidratos de lenta digestión‖ de los frijoles negros son retenidas en el taco, una observación que puede proporcionar bases para nuevos usos alimentarios de este alimento tradicional (Tovar et al., 2003). Mora-Avilés et al. (2007) prepararon una tortilla con una mezcla de maíz QPM y frijol, y evaluaron la composición química, calidad de proteína y digestibilidad de proteína. Sin embargo, en la tortilla producida a partir de una mezcla de ―masa de maíz QPM‖ y frijol negro cocido no se ha estudiado su digestibilidad del almidón y capacidad antioxidante. Por lo que el objetivo de este trabajo fue estudiar la composición química, digestibilidad del almidón y capacidad antioxidante de una tortilla preparada con una mezcla maíz QPM y frijol negro. 3 2. REVISIÓN DE LITERATURA 2.1 Biodisponibilidad de los carbohidratos Los carbohidratos son una fuente esencial de energía para el cuerpo (Brennan, 2005). El concepto de biodisponibilidad de los carbohidratos define la utilización de estos en el tracto gastrointestinal y sus efectos biológicos. Dependiendo de su destino en el tracto gastrointestinal, se definirá si estos son glucémicos (absorbidos en el intestino delgado y disponibles para el metabolismo) o no glucémicos (llegan al colon como sustrato para la fermentación y/o son excretados por las heces) (Englyst y Englyst, 2005). Esta biodisponibilidad está influenciada por: Los componentes del alimento (carbohidratos, grasas, proteínas) Las propiedades fisicoquímicas de los carbohidratos del alimento El individuo que lo consume (lo cual es una variación biológica) A su vez, las propiedades fisicoquímicas de los carbohidratos están determinadas por su identidad química y la matriz del alimento. La identidad química de los carbohidratos está determinada por el origen botánico y en el caso de los alimentos compuestos, por la mezcla de los ingredientes usados; la identidad química de los carbohidratos es definida por el tipo de monosacárido, los enlaces entre los monosacáridos y el grado de polimerización, esta identidad determina a nivel químico sí las enzimas digestivas endógenas pueden hidrolizar el carbohidrato y el monosacárido que esté presente para su metabolismo. La matriz del alimento está determinada por el origen botánico y el grado de procesamiento del alimento (Figura 1). La matriz del alimento tiene una posición central en el concepto de biodisponibilidad de los carbohidratos. En los alimentos que se elaboran a partir de materias primas sin refinar, los constituyentes de la pared celular tienen un efecto de encapsulación, el cual restringe la velocidad a la cual el almidón y los azúcares son digeridos, así como su absorción en el intestino delgado. Sin embargo, si el alimento se procesa en exceso se destruye este efecto de encapsulación; por ejemplo, las propiedades de la matriz del alimento se pierden en gran parte 4 Figura 1. Resumen de los factores que influyen en la biodisponibilidad de los carbohidratos (Englyst y Englyst, 2005). Utilización en el tracto gastrointestinal (Velocidad y duración de la digestión y absorción) Propiedades fisicoquímicas de los carbohidratos del alimento Componentes del alimento (Carbohidratos, lípidos y proteínas) Factores del individuo (Variación biológica) Identidad química (Identidad del monosacárido, tipo de enlace y tamaño) Matriz del alimento (Origen biológico y procesamiento del alimento) Fisiología y utilización de los carbohidratos glucémicos Fisiología y utilización de los carbohidratos no glucémicos Absorbido en el intestino delgado Entra al intestino grueso 5 cuando los granos enteros son molidos o cuando las frutas,como la manzana, son cocidas o molidas para hacer jugo. La clasificación de los carbohidratos de acuerdo a su biodisponibilidad se presenta en el Cuadro 1. En general, dentro de los carbohidratos glucémicos se encuentran los azúcares libres, maltodextrinas y el almidón disponible; dentro de los carbohidratos no glucémicos se encuentran el almidón resistente, polisacáridos no amiláceos (se encuentran naturalmente como material de la pared celular en los alimentos vegetales), carbohidratos resistentes de cadena corta (se definen como carbohidratos con un grado de polimerización de dos o más, los cuales son solubles en etanol al 80% y no son susceptibles a la digestión por la α-amilasa pancreática y enzimas del borde de cepillo, incluyen a fructooligosacáridos, isomaltooligosacáridos, xilomaltooligosacáridos, entre otros) y azúcares alcoholes (aunque algunos se absorben en poca cantidad en el intestino delgado, éstos no se metabolizan y se excretan en la orina, los que no se absorben, se fermentan en el intestino grueso, incluyen al sorbitol, manitol, xilitol, entre otros) (Englyst y Englyst, 2005). 2.2 Almidón El almidón representa una fracción importante en diversos productos agrícolas como los cereales (maíz, trigo y arroz), cuyo contenido va del 30 al 80%; leguminosas (frijol, chícharo, haba), con 25 a 50% de almidón; tubérculos (papa, yuca), en los que el almidón representa entre 60 y 90%, y algunas frutas, como el plátano y el mango, que en su estado verde o inmaduro alcanzan contenidos de almidón de hasta 70% en base seca (Bello-Pérez y Paredes- López, 1999). Químicamente, el almidón está compuesto de dos tipos de polímeros de D-glucosa (alfa- glucanos), llamados amilosa y amilopectina (Figura 2). La amilosa es relativamente larga, se considera una molécula lineal debido a que el alfa-glucano linear contiene alrededor de un 99% de enlaces glucosidicos α-(1-4) y el 1% restante de enlaces glucosidicos α-(1-6), estos forman puntos de ramificación dentro de la molécula. El tamaño y la estructura de la amilosa dependen del origen botánico (Tester et al., 2004). El peso molecular de la amilosa varía entre 7x10 4 y 2x10 5 Dalton (Da) (Tharanathan y Mahadevamma, 2003) y constituye típicamente del 6 Cuadro 1. Clasificación de los carbohidratos de acuerdo a su biodisponibilidad. Tipo de carbohidrato Componentes químicos Agrupación nutricional Principal función biológica Carbohidratos Glucémicos Azúcares libres Fructosa y azúcares libres Metabolizado por el hígado. Posible efecto perjudicial enel metabolismo de lípidos Maltodextrinas GRL y GLL GRL y GLL refleja la velocidad de la glucosa liberada del alimento, lo cual es un factor importante para el índice glucémico Almidón Investigaciones sugieren que la respuesta metabólica asociada con los carbohidratos de lenta liberación (GLD) conducen a una salud óptima Carbohidratos no Glucémicos AR Varia la velocidad y duración de la fermentación PNA PNA intrínsecos: se encuentran naturalmente como material de la pared celular en alimentos vegetales La matriz del alimento modera la liberación de carbohidratos Señalados para una dieta alta en fibra, rica en micronutrientes PNA adicionados Varían la velocidad y duración de la fermentación CRCC CRCC intrínsecos: naturales Varían la velocidad y duración de la fermentación CRCC adicionados Azúcares alcoholes Presentes naturalmente y Adicionados Absorbidos, pero no metabolizados. Los que no son absorbidos, son fermentados en el intestino grueso CRCC: Carbohidratos resistentes de cadena corta; GRL: Glucosa rápidamente liberada; GLL: Glucosa lentamente liberada; PNA: Polisacáridos no amiláceos; AR: Almidón resistente. Fuente: Englyst y Englyst, 2005. 7 A B Figura 2. Enlaces α-(1-4) y α-(1-6) entre unidades de glucosa presentes en la amilosa y amilopectina del almidón (A) (Tharanathan y Mahadevamma, 2003); representación esquemática de la amilopectina indicando los puntos de ramificación (enlaces α-(1-6)) (B) (Tester et al., 2004). Enlace α-(1-6) (punto de ramificación) Enlace α-(1-4) ←α-(1-6) 8 15 al 20% del almidón (Sajilata et al., 2006). La amilopectina es una molécula altamente ramificada (Figura 2), la cual está constituida por una cadena principal de D-glucosas unidas por enlaces α-(1-4), con ramificaciones de cadenas más cortas (formadas también por enlaces α-(1-4)), que se unen a la cadena principal por medio del enlace α-(1-6) (Tharanathan y Mahadevamma, 2003). La amilopectina contiene aproximadamente 95% de enlaces α-(1-4) y 5 % de enlaces α-(1-6) (Tester et al., 2004); su peso molecular tiene un valor > 2x107 Da, por lo que la amilopectina es una de las macromoléculas más grandes que existen naturalmente (Tharanathan y Mahadevamma, 2003). 2.3 Digestibilidad del almidón El almidón provee la mayor fuente de energía fisiológica en la dieta humana (Tharanatha y Mahadevamma, 2003), contribuye con el 60-70% de los carbohidratos ―disponibles‖ o ―glucémicos‖. Estos se definen como la fracción del almidón digerida por las enzimas digestivas humanas en el tracto gastrointestinal y absorbida al torrente sanguíneo (principalmente como glucosa) (Slaughter et al., 2001). 2.3.1 Digestión del almidón La digestión del almidón inicia en la boca, cuando el alimento se mezcla con la α-amilasa salival, pero la hidrólisis se detiene en el estomago debido al pH ácido. Posteriormente, la hidrólisis se reanuda en el duodeno donde la α-amilasa pancreática es secretada (Tharanathan y Mahadevamma, 2003). La α-amilasa hidroliza los enlaces α-(1-4) de la amilosa y la amilopectina y libera oligosacáridos (Hoover y Zhou, 2003). Los productos de esta hidrólisis para la amilosa son: glucosa, maltosa y maltotriosa, mientras que para la amilopectina son: glucosa, maltosa, maltotriosa y α-dextrinas (Eliasson, 1996). Estos productos se difunden del lumen hacia el borde de cepillo del intestino delgado, actuando sobre ellos las enzimas oligosacaridasas y produciendo glucosa. La glucosa es absorbida y transportada vía vena porta hacia el hígado. El hígado mantiene los niveles de glucosa en sangre, convirtiendo la glucosa en glucosa-6-fostafo y glucógeno. La utilización de la glucosa por el cuerpo dependerá de si 9 hay o no glucosa disponible, es decir, cuando hay abundancia de glucosa, ésta es convertida en glucógeno, y cuando los niveles de ésta son bajos, el hígado incrementa el suministro de glucosa en el cuerpo utilizando el glucógeno almacenado (Brennan, 2005). 2.3.2 Índice glucémico El índice glucémico (IG) se define como la relación del área bajo la curva de la respuesta de glucosa en sangre postprandial producida por un alimento a evaluar con respecto a un alimento estándar (glucosa o pan blanco), y consumidos por la misma persona (Jenkins et al., 2002): á La velocidad de digestión de los carbohidratos del alimento es una determinante importante de la respuesta glucémica. En general, la respuesta insulinémica se relaciona directamente con la respuesta glucémica. La velocidad de liberación de los carbohidratos de un alimento en la digestión in vitro refleja el área de glucosa en sangre postprandial del alimento in vivo (Jenkins et al., 2002). Generalmente, al alimento que tiene un efecto similar o más grande que el alimento estándar (IG entre 70-100), es considerado un alimento de IG alto, los alimentos que presentan un IG entre 55-70 son considerados como alimentos de IG medio, mientras aquellos que tienen un IG debajo de 55 se clasifican como alimentos de IG bajo (Brennan, 2005). El IG de diferentes alimentos se muestra en el Cuadro 2. Los alimentos con IG alto son un factor que favorece el desarrollo de enfermedades crónicas (Jenkins et al., 2002). Incrementos de glucosa en sangre incrementan la velocidad metabólica, posiblemente por la vía de acción del sistema nervioso simpático cuya sensibilidad a la glucosa puede tener un papel en el desarrollo de la obesidad. Diversos estudios soportan que la 10 Cuadro 2. Valores de índice glucémico (IG) de diferentes alimentos. Alimento IG (Glucosa = 100) IG (pan blanco = 100) Pan de avena (50%) 44 63 Wafles (Quaker Oats Co, Canada) 76 109 Pastel de chocolate (Betty Crocker, USA) 38 54 Pastel de vainilla (Betty Crocker, USA) 42 60 Mollete de manzana con azúcar 44 63 Amaranto 97 139 Maíz dulce 60 86 Arroz blanco cocido 64 91 Helado sabor chocolate 68 97 Cornflakes (Kellogg‘s, USA) 92 130 Special K (Kellogg‘s, USA) 69 98 Gatorade 78 110 Jugo de manzana (Canadá) 41 59 Jugo de naranja (Canadá) 46 66 Jugo de zanahoria (Australia) 43 61 Coca Cola (USA) 63 90 Platano (Canadá) 62 89 Kiwi (Australia) 58 83 Mango (India) 60 86 Fuente: Foster-Powell et al., 2002 11 señalización de la glucosa, tiene un papel clave en la regularización a largo plazo del balance de energía, principalmente a través de mecanismos metabólicos (Mobbs et al., 2007). Los efectos metabólicos se relacionan con la velocidad a la cual la glucosa es absorbida en el intestino delgado. Una velocidad reducida de absorción de glucosa después del consumo de alimentos (ricos en carbohidratos) de IG bajo, reduce el incremento postprandial de hormonas del intestino (ej. incretinas) y del páncreas (insulina). La absorción prolongada de carbohidratos produce la supresión de ácidos grasos libres y concentraciones de glucosa en sangre bajas (Figura 3). Con la reducción de la concentración de los ácidos grasos libres y la insulinización sostenida del tejido, la glucosa es retirada de la circulación a una velocidad mayor. En consecuencia, la concentración de glucosa en sangre regresa hacia la línea base a pesar de la absorción continua de glucosa en el intestino delgado. Estudios que usaron alimentos con IG bajo, como primera comida, mostraron una mejora en la tolerancia a los carbohidratos en la segunda comida, dicho efecto se llama ―efecto Staub-Traugott‖ (en donde la primera comida mejora la tolerancia de glucosa de la segunda comida) y relativamente mejora la glucemia postprandial de la segunda comida y disminuye la concentración de ácidos grasos libres. Además, los alimentos deIG bajo han demostrado que reducen las respuestas glucémicas e insulinémicas de personas con diabetes. A largo plazo, el aumento en el consumo de alimentos de IG bajo se ha asociado con alteraciones en las concentraciones de enzimas del tejido adiposo y reducción de la concentración de lípidos en sangre (Jenkins et al., 2002). 2.3.3 Factores que afectan la digestibilidad del almidón La estructura del almidón es un factor que afecta en su digestibilidad. Los gránulos de almidón tienen un ordenamiento complejo en forma de estructura semicristalina. La digestión de los gránulos de almidón es un proceso complejo, el cual incluye diferentes fases: la difusión de la enzima hacia el sustrato (con el impacto de la porosidad de éste), la absorción de la enzima en el sustrato y el evento hidrolítico. La difusión de la α-amilasa dentro del sustrato es considerada un paso importante de la hidrólisis del almidón. Interacciones del almidón con la fibra, proteína y otros componentes, pueden impedir la difusión y la absorción efectiva de 12 Figura 3. Efecto de las dietas con alimentos de índice glucémico bajo (A) o alto (B) en la absorción de glucosa gastrointestinal y glucosa en sangre postprandial (Jenkins et al., 2002). G lu co sa G lu co sa Tiempo Tiempo B B A A 13 la enzima. El tamaño de partícula del almidón también tiene un papel importante en la hidrólisis, gránulos pequeños muestran mayor susceptibilidad enzimática (Lehmann y Robin, 2007). La relación amilosa-amilopectina es otro factor que afecta la digestibilidad del almidón debido a que las regiones amorfas (amilosa) son más susceptibles a la amilólisis que las regiones cristalinas (amilopectina) (Lehmann y Robin, 2007). Zhang et al. (2006) reportaron que tanto las regiones amorfas como las cristalinas se digieren, por lo que sugirieron la hipótesis de que, si bien las regiones amorfas son más susceptibles a la hidrólisis, estas están densamente empaquetadas y fijadas fuertemente a la región cristalina, lo cual inhibe su hidrólisis. Los arreglos cristalinos tipo A o tipo B tienen una influencia marcada en la digestibilidad. Se ha reportado que el arreglo tipo A es más susceptible a la hidrólisis que el arreglo tipo B. El arreglo cristalino tipo A y tipo B difieren en el empaquetamiento de las dobles hélices así como en su contenido de agua. Los almidones que presentan un arreglo tipo A tienen dobles hélices más cortas y muestran mayor cantidad de almidón rápidamente digerible y almidón lentamente digerible, comparado con el arreglo tipo B, que presenta un alto contenido de almidón resistente (Lehmann y Robin, 2007). Generalmente, los alimentos son consumidos después de un procesamiento. Los almidones crudos son más resistentes a la hidrólisis enzimática que los almidones gelatinizados. La gelatinización es un proceso en donde el almidón es calentado en presencia de agua en exceso, produciendo cambios irreversibles tales como destrucción de la estructura semicristalina del almidón. Algunas veces, como en el caso de las leguminosas, los gránulos del almidón están rodeados por una pared celular rígida, la cual inhibe el hinchamiento y la dispersión del almidón (Tharanathan y Mahadevamma, 2003), los componentes de la pared celular también bloquean el acceso de las amilasas a los gránulos (Tovar et al., 1992). En algunos alimentos procesados, la proteína puede encapsular los gránulos de almidón (Tovar et al., 1990a). Durante el proceso de gelatinización las cadenas de amilosa pueden formar complejos con los ácidos grasos, que pueden afectar la digestibilidad del almidón. La susceptibilidad in vitro por la α-amilasa porcina de la amilosa que tiene complejos con lípidos, se reduce en comparación con la amilosa libre (Holm et al., 1983). Durante el procesamiento de los alimentos, la amilosa retrograda más rápidamente que la amilopectina, lo cual también afecta la digestión del almidón (Tharanathan y Mahadevamma, 2003). 14 2.3.4 Almidón resistente El almidón resistente (AR) es definido como ―la suma del almidón y sus productos de degradación que no son absorbidos en el intestino delgado de individuos sanos‖, ésta definición surgió de la conciliación de diferentes grupos de trabajo de la Comunidad Europea, en un proyecto conocido como EURESTA (Tovar et al., 2006). El almidón resistente se clasifica en cuatro tipos (Champ et al., 2003): El AR1 se encuentra en granos y semillas parcialmente molidas. Leguminosas como frijoles o lentejas son fuentes principales de este tipo de almidón, debido a que se encuentra atrapado dentro de paredes celulares. El proceso de preparación y cocción de los alimentos cuando se consume es de gran importancia para el contenido de AR1, ya que estos procedimientos pueden contribuir a una ruptura de las paredes celulares. El AR2 corresponde a los gránulos de almidón nativo, los cuales presentan fracciones no gelatinizadas de almidón y en el caso particular de aquellos almidones que muestran un patrón de difracción de rayos X tipo B, el cual se caracteriza por tener un arreglo cristalino del tipo hexagonal, que lo hace menos accesible a la hidrólisis enzimática, provocando una disminución de su digestibilidad; en esta categoría se encuentran los almidones de papa y plátano. El AR3 está presente en la mayoría de los alimentos que han sido cocidos, enfriados y almacenados por varias horas o días. Corresponde a fracciones de almidón retrogradado, el cual se produce por la recristalización de las cadenas de almidón, después de la gelatinización, cuando el producto no se seca inmediatamente. Las cadenas simples forman dobles hélices, principalmente la amilosa es la que está involucrada en la retrogradación, la amilopectina también se retrograda pero más lentamente. El AR4 incluye la estructura de los almidones modificados por tratamientos químicos como la esterificación y eterificación, así como también almidones entrecruzados. 15 El almidón resistente puede ser clasificado como un componente de la fibra dietética con base a las recientes definiciones de la AACC (American Association of Cereal Chemists, por sus siglas en inglés) en el 2001 y de la FNB (Food and Nutrition Board of the National Academy of Sciences, USA, por sus siglas en inglés) en el 2002. Aunque el AR no es un componente de la pared celular, nutricionalmente es más similar a los polisacáridos no amiláceos que al almidón disponible (Sajilata et al., 2006). Son varios los efectos fisiológicos que se le han atribuido al AR, los cuales han probado ser benéficos a la salud (Sajilata et al., 2006): Prevención del cáncer de colon. El AR es fermentado por la microflora del intestino grueso, generalmente no se presenta en las heces humanas y animales, indicando generalmente una fermentación completa y produce un alto rendimiento de butirato. El butirato es la principal fuente de energía para las células epiteliales del intestino grueso (colonocitos) e inhibe la transformación maligna de dichas células, lo cual tiene especial interés para la prevención de cáncer de colon. Efecto hipoglucémico. La fermentación del almidón por la microflora del intestino grueso se lleva a cabo de 5 a 7 horas después de que el alimento que lo contiene es consumido, lo cual reduce la insulinemia y glucemia postprandial, además de incrementar el periodo de saciedad. Una de las aplicaciones principales es la creación de alimentos que contengan AR enfocado para personas diabéticas. El AR reduce la respuesta de glucosa e insulina en sangre, limitando los efectos adversos de hiperglucemia e hiperinsulinemia en personas diabéticas. Además, el AR tiene la capacidad de prevenir o tratar la obesidad, debido a que incrementa el periodo de saciedad (Hendrich, 2010). Prebiótico. El AR es un compuestoprebiótico debido a que promueve el crecimiento de Bifidobacterias. Reducción de la formación de coágulos biliares. El almidón disponible (AD) contribuye a la formación de coágulos biliares a través de una mayor secreción de insulina, la que a su vez conduce a la estimulación de la síntesis de colesterol, por lo que la sustitución de AD por AR reduce el riesgo de la formación de coágulos biliares. 16 Efecto hipocolesterilémico. El AR tiene un efecto hipocolesterolémico, por lo que se sugiere su uso en alimentos enfocados en mejorar la salud cardiovascular. Inhibición de la acumulación de grasas. El AR incrementa la oxidación lipídica postprandial, sugiriendo una disminución de la acumulación de grasas a largo plazo. Absorción de minerales. El AR puede tener un efecto positivo en la absorción intestinal de calcio y fierro. El AR por lo tanto puede considerarse como un compuesto nutracéutico. El término ―nutracéutico‖ se refiere a ―cualquier sustancia que puede ser considerada como alimento o parte de un alimento y proporciona beneficios médicos o de salud, incluyendo la prevención y tratamiento de enfermedades‖ (Guzmán et al., 2009). 2.4 Fibra dietética Según Asp (2004) la digestibilidad en el intestino delgado es una clave determinante de las características nutricionales de los carbohidratos presentes en los alimentos y debe ser por lo tanto el elemento crucial a la hora de distinguir entre los carbohidratos y la fibra dietética. En el año 2001, la AACC adoptó la siguiente definición: "Se entiende por fibra dietética las partes comestibles de las plantas o los carbohidratos análogos que son resistentes a la digestión y a la absorción en el intestino delgado de los seres humanos y fermentan total o parcialmente en el intestino grueso." “La fibra dietética comprende los polisacáridos, los oligosacáridos, la lignina y sustancias afines. Las fibras dietéticas promueven efectos fisiológicos benéficos que incluyen efectos laxantes y/o reducción del colesterol y de la glucosa presentes en la sangre." En el año 2002, el FNB adoptó las siguientes definiciones: "La fibra dietética consta de carbohidratos no digeribles y lignina, que son intrínsecos y se hallan intactos en las plantas. La fibra funcional consta de carbohidratos aislados no digeribles y lignina que surten efectos fisiológicos benéficos en los seres humanos. La fibra total es la suma de la fibra dietética y la fibra funcional." 17 Estas nuevas definiciones coinciden en incluir oligosacáridos resistentes, almidón resistente y lignina en la fibra dietética y la fibra total. Aún más: ambas definiciones requieren que los componentes incluidos no sólo sean indigeribles en el intestino delgado, sino que ejerzan los efectos fisiológicos benéficos que caracterizan a la fibra dietética (FD) (Asp, 2004). La FD tiene un papel importante en la disminución de riesgo de padecer enfermedades tales como la diabetes mellitus, enfermedades cardiovasculares y cáncer de colon. Estos beneficios se asocian con alimentos con altos contenidos de FD, la cual retrasa la absorción de nutrientes, aumentan el volumen fecal, disminuyen la concentración de lípidos en sangre, funcionan como una barrera para la digestión enzimática, acelera el tiempo de tránsito intestinal y se fermenta en el intestino grueso. Los efectos fisiológicos benéficos de la FD en relación a sus funciones en el intestino delgado y grueso se muestran en el Cuadro 3 y 4, respectivamente (Schneeman, 1999). La fermentación colonica de la FD produce principalmente ácidos grasos de cadena corta (AGCC) y gases (CO2, CH4 y H2). Los AGCC son rápidamente absorbidos por la mucosa colonica junto con minerales y agua. El butirato es el substrato principal de energía para los colonocitos, el propiaonato también es metabolizado pero en menor proporción. Los AGCC previenen el cáncer de colon, el butirato y hasta cierto punto el propionato, han mostrado inducir diferenciación y apoptosis en células cancerígenas del colon. Se ha propuesto que el propionato inhibe la síntesis hepática de colesterol. La fermentación se lleva a cabo en el ciego y en el colon ascendente, pero el tipo de sustrato puede afectar el sitio de la fermentación, por ejemplo, el salvado de trigo retrasa la fermentación del almidón de maíz alto en amilosa hasta la parte distal del intestino grueso, por lo que la combinación de carbohidratos indigeribles puede afectar el sitio de liberación de los AGCC en el intestino grueso (Henningsson et al., 2002). La FD se clasifica principalmente en dos tipos: FD insoluble y FD soluble. La FD insoluble en agua está constituida por celulosa, lignina y algunas hemicelulosas, mientras que la FD soluble 18 Cuadro 3. Características de la fibra dietética y su relación con su función en el intestino delgado. Característica Efecto en el intestino delgado Implicación fisiológica Dispersibilidad en agua Incrementa el volumen del contenido intestinal y diluye los componentes Se han asociado con una digestión de carbohidratos y lípidos más lenta, lo cual promueve la absorción de nutrientes en la parte distal del intestino y su asociación con la reducción de colesterol en plasma y una disminución en las respuestas insulinémica y glucémica Aumento de peso Aumenta el peso de la fase del contenido intestinal Viscosidad Retarda el vaciamiento gástrico y altera la difusión en el contenido intestinal Absorción/envolvimiento Incrementa la excreción de ácidos biliares en el contenido intestinal Reduce el colesterol en plasma Fuente: Schneeman, 1999. 19 Cuadro 4. Características de la fibra dietética y su relación con su función en el intestino grueso. Característica Efecto en el intestino delgado Implicación fisiológica Dispersibilidad en agua Provee una fase acuosa para la penetración de la microflora en el contenido intestinal Aumento de la descomposición de los polisacáridos por la microflora Aumento de peso Aumenta el peso y el volumen del contenido intestinal Efecto laxante Absorción/envolvimiento Incrementa la concentración de ácidos biliares en el contenido intestinal Incremento en la excreción de ácidos biliares Fermentabilidad Crecimiento de la microflora, adaptación de la microflora a las estructuras de los polisacáridos del contenido intestinal Incremento de la masa de la microflora y producción de ácidos grasos de cadena corta Fuente: Schneeman, 1999. 20 son fibras que forman geles naturalmente, como las pectinas, gomas, mucílagos y algunas fracciones hemicelulosicas (Sthephen, 1995). 2.5 Polifenoles Los polifenoles son metabolitos secundarios de las plantas y generalmente están implicados en la defensa contra la radiación ultravioleta y el ataque de plagas y otros agentes patógenos (Manach et al., 2004). Las clases principales de polifenoles están definidas de acuerdo a su esqueleto de carbono (Scalbert y Williamson, 2000). De esta forma, los polifenoles incluyen ácidos fenólicos, flavonoides, taninos condensados, taninos hidrolizables, entre otros (Naczk y Shahidi, 2004). Los ácidos fenólicos (Figura 4) pueden subdividirse en dos grandes grupos, derivados del ácido benzoico y derivados del ácido cinámico, estos pueden estar presentes en su forma libre o ligada a componentes de la pared celular (Liu, 2004).Dentro del grupo de flavonoides se encuentran los flavonoles, flavonas, isoflavonas, flavanonas, y flavanoles (Figura 5) (Manach et al., 2004). Los taninos condensados o proantocianidinas son polímeros y oligomeros de polihidroxiflavanos (o flavanoles) (Serrano et al., 2009). El nombre de proantocianidinas deriva de la reacción de oxidación ácido-catalizada, la cual produce antocianidinas rojas a partir del calentamiento de proantocianidinas en soluciones ácidas de alcohol (Reed, 1995). Los monómerosmás comunes (Cuadro 5) son los diasterómeros (+)- catequina/(-)-epicatequina, (-)-galocatequina/(-)-epigalocatequina y (+)-afzelequina/(- )epiafzelequina, los respectivos oligómeros y polímeros se llaman procianidinas, prodelfininas y propelargonidinas (Serrano et al., 2009). Los taninos hidrolizables son más susceptibles a la hidrólisis enzimática y no enzimática que los taninos condensados y usualmente son más solubles en agua (Reed, 1995). Los taninos hidrolizables son poliésteres de ácidos orgánicos y azúcar (u otro compuesto que no sea polihidroxiaromatico). En la mayoría de los casos el azúcar es una glucosa. Si el componente ácido es el ácido gálico, los compuestos son llamados galotaninos. Los esteres con ácido hexahidroxidifénico (que forma el ácido elágico cuando se hidroliza eliminando el agua), son llamados elagitaninos (Cuadro 5) (Serrano et al., 2009). 21 (A) Ácido benzoico (B) Ácido cinámico Derivados del ácido benzoico Substitutos Derivados del ácido cinámico Substitutos R1 R2 R3 R1 R2 R3 p-Hidroxibenzoico H OH H p-Cumárico H OH H Protocatecuico H OH OH Cafeico OH OH H Vanílico CH3O OH H Ferúlico CH3O OH H Siríngico CH3O OH CH3O Sinápico CH3O OH CH3O Gálico OH OH OH Figura 4. Estructuras de los derivados del ácido benzoico (A) y derivados del ácido cinámico (B) (Liu, 2004). 22 Figura 5. Estructura química de algunos flavonoides (Manach et al., 2004). Flavonoles R1 = R2 = OH; R3 = H: Quercetina Flavonas R1 = R2 = OH: Luteolina Isoflavonas Flavanonas Flavanoles R1 = H: Diazeina R1 = H; R2 = OH: Naringenina R1 = R2 = OH; R3 = H: Catequinas 23 Cuadro 5. Clasificación de los taninos en base a su estructura química y monómeros constitutivos. Grupo Monomero Estructura del monómero Taninos condensados (+)-Catequina R1=OH, R2=H (+)-afzelequina R1=H, R2=H (-)-galocatequina R1=OH, R2=OH (-)-Epicatequina R1=OH, R2=H (-)-epiafzelequina R1=H, R2=H (-)-epigalocatequina R1=OH, R2=OH Taninos hidrolizables Ácido gálico Ácido hexahidroxidifenico Ácido elágico (formado después de la hidrólisis) ácido gálico ácido hexahidroxidifenico Fuente: Serrano et al., 2009. 24 De acuerdo a su solubilidad, los polifenoles se pueden clasificar en: polifenoles extraíbles y polifenoles no extraíbles. Generalmente, los resultados de polifenoles reportados en los alimentos corresponden a análisis de polifenoles en extractos acuosos orgánicos (polifenoles extraíbles), mientas que son ignorados los polifenoles que se quedan en los residuos de dicha extracción (polifenoles no extraíbles), los cuales son potencialmente activos (Saura-Calixto et al., 2007). Los polifenoles extraíbles, son compuestos fenólicos que presentan peso molecular bajo o intermedio; estos son extraídos fácilmente usando diferentes disolventes (agua, metanol, acetona, etc.) e incluyen a los ácidos fenólicos libres, oligómeros de taninos condensados y taninos hidrolizables de peso molecular bajo (Bravo, 1998). Los polifenoles no extraíbles son polifenoles con un alto grado de polimerización o son polifenoles asociados con compuestos de alto peso molecular; comprenden a los taninos condensados (o proantocianidinas) y los polifenoles hidrolizables. Los polifenoles hidrolizables comprenden taninos hidrolizables y ácidos fenolicos ligados a la fibra dietética o proteína, los cuales se liberan por hidrólisis ácida fuerte. También pueden ser detectados flavonoides que no son proantocianidinas en los hidrolizados del análisis de polifenoles hidrolizables (Saura-Calixto et al., 2007). Los polifenoles son agentes reductores, que junto con otros agentes como la vitamina C, vitamina E y carotenoides, protegen los tejidos del cuerpo contra el estrés oxidativo. Como antioxidantes, estos pueden prevenir varias enfermedades asociadas con el estrés oxidativo, como lo son cánceres, enfermedades cardiovasculares, inflamación y otros (Scalbert y Williamson, 2000). Los efectos a la salud de estos dependen de la cantidad consumida y de su biodisponibilidad (Manach et al., 2004). Sólo los polifenoles liberado de la matriz del alimento por la acción de las enzimas digestivas (intestino delgado) y la microflora bacteriana (intestino grueso) son biodisponibles (Saura-Calixto et al., 2007). Cuando el polifenol llega al intestino grueso y es liberado por la microflora, éste puede ser absorbido de manera intacta a través el epitelio colónico y pasar al torrente sanguíneo, o se puede descomponer su estructura original en metabolitos (Williamson y Manach, 2005). Por otro lado, el polifenol puede no ser absorbido y contrarrestar los efectos prooxidantes producidos durante el metabolismo de la microflora colónica (Saura-Calixto et al., 2007). 25 2.6 Capacidad antioxidante La capacidad antioxidante de los polifenoles está afectada por su estructura. Cuando se determina la capacidad antioxidante, ésta se ve afectada por el tipo de solvente de extracción, el proceso de aislamiento, la pureza del componente activo, así como el sistema de análisis y el substrato a ser protegido por el antioxidante (Moure et al., 2001). Son varios los compuestos cromógenos (ABTS, DPPH, FRAP, entre otros) que se utilizan para determinar la capacidad de los compuestos fenólicos que contienen los alimentos, para captar los radicales libres (Saura-Calixto y Goñi, 2006; Pérez-Jiménez y Saura-Calixto, 2005). Entre los métodos más usados se encuentra el de capacidad antioxidante equivalente en Trolox o TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity, por sus siglas en inglés). En este método se cuantifica la capacidad de un compuesto antioxidante para captar el radical libre ABTS ●+ (Ácido 2,2´-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)). Este radical catión pre-formado por oxidación de ABTS con persulfato potásico, es reducido por la presencia de antioxidantes. Para ello, se mide la decoloración producida en la mezcla por el antioxidante y se valora frente a un control sin antioxidante. Con el ABTS se puede medir la actividad de compuestos de naturaleza hidrofílica y lipofílica. El radical ABTS ●+ tiene la ventaja de que su espectro presenta máximos de absorbancia a 414, 654, 754 y 815 nm en medio alcohólico (Re et al., 1999). 2.7 Enfermedades relacionadas con la nutrición en México La malnutrición puede expresarse en dos formas: desnutrición y obesidad. Se define como polarización alimentaria-nutrimental a la situación de las familias en las que conviven niños con alto riesgo de padecer desnutrición proteínico-energética y padres con problemas de sobrepeso u obesidad, dicha situación es frecuente en familias de la población urbana (Delgado, 2006). De acuerdo con la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición del 2006 (ENSANUT 2006), en México existe una prevalencia nacional en talla baja de 12.70% para niños en edad preescolar (entre 0 y 5 años de edad), lo cual se considera alarmante debido a 26 que representa que casi 1.2 millones de niños padecen de desnutrición. Por otro lado, se reporta un porcentaje elevado de prevalencia a nivel nacional en sobrepeso y obesidad a partir de los 5 años de edad (Cuadro 6) (Olaiz et al., 2006). A nivel mundial, México ocupa el segundo lugar en sobrepeso y obesidad desde el año 2004, de acuerdo con lo reportado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (Loureiro, 2004); por otro lado, México se ubica en el primer lugar a nivel mundial de infantes con obesidad (con edad entre 5 y 11 años) de acuerdo con la Encuesta Nacional de Coberturas realizada por el Instituto Mexicano del Seguro Social en el 2006 (IMSS, 2008). Cuadro 6. Prevalencia nacional de sobrepeso y obesidad, de acuerdo con la EncuestaNacional de Salud y Nutrición del 2006 (ENSANUT 2006). Edad Años Prevalencia Nacional Mujeres Hombres Niños (escolar) 5 a 11 26% 26.80% 25.90% Adolecentes 12 a 19 33.33% - - Adultos Mayores de 20 - 71.90% 66.70% Fuente: Olaiz et al., 2006. El sobrepeso y la obesidad son factores de riesgo importantes para el desarrollo de enfermedades crónicas, incluyendo las enfermedades cardiovasculares, diabetes y cáncer (Olaiz et al., 2006). De acuerdo con la ENSANUT del 2006, en México existe una prevalencia nacional de diabetes del 7%, y para personas en edad de 60 a 69 años la prevalencia 27 incrementa a un 19.2%. Con respecto a la hipertensión arterial, la prevalencia para personas mayores de 20 años es de 30.8% y para personas mayores de 50 años aumenta a casi 60%. Para la enfermedad de hipercolesterolemia, la prevalencia nacional es del 26.5% (Olaiz et al., 2006). Por su parte la OMS reporta, con respecto a las estimaciones del 2002, que México tuvo una incidencia de 194 nuevos casos de cáncer por cada 100,000 habitantes (WHOGIB, 2008a). Además, en sus proyecciones del 2005, en México las enfermedades cardiovasculares representaron la segunda causa de muerte con un 23.2% y el cáncer representó la cuarta causa de muerte con un 12.5% (WHOGIB, 2008b). Las proyecciones de mortalidad para el 2005 se obtuvieron usando los datos del registro de muertes entre los años 1950 y 2002 (Mathers y Loncar, 2006). 2.8 La tortilla como alimento básico en la dieta mexicana En México, el consumo per cápita de la tortilla en algunos grupos es de 120 kg/año, lo cual es equivalente a 328 g/día (Amaya-Guerra et al., 2004).La tortilla sola proveé 38.8% de las proteínas y 45.2% de las calorías de la dieta diaria de la población mexicana, y en zonas rurales proveé aproximadamente el 70% del total de las calorías y el 50% de las proteínas ingeridas diariamente (Figueroa et al., 2001). Sin embargo, el maíz utilizado para la elaboración de estas tortillas es deficiente en lisina y triptófano, con valores de 0.290% y 0.067%, respectivamente; dichos aminoácidos son esenciales para el crecimiento y desarrollo humano (Sierra et al., 2004). 2.9 Fortificación de la tortilla Debido a que la tortilla presenta deficiencias en el contenido de lisina y triptófano, diversos investigadores se han dado a la tarea de fortificar la tortilla con fuentes ricas en proteína, además de otros micronutrientes esenciales para la salud, entre las cuales destacan: Harina de soya desgrasada, vitaminas (tiamina, riboflavina, nicotinamida, ácido fólico) y minerales (hierro reducido y oxido de zinc) (Figueroa et al., 2001; Figueroa et al., 2005). 28 Residuos de leche de soya (Waliszewsky et al., 2002). Lisina y triptófano (Waliszewsky et al., 2003). 2.10 Maíz de alta calidad proteínica Otra forma de incrementar la calidad proteínica de la tortilla es el uso de maíz de alta calidad proteínica o maíz QPM (quality protein maize, por sus siglas en inglés), como materia prima. Los maíces QPM se derivan del aprovechamiento del gen mutante opaco o2o2, expresado en condición homocigótica recesiva que determina mayor contenido de lisina y triptófano (Mertz et al., 1964). A partir del 1996, el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), en colaboración con el Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT), han generado y evaluado híbridos de maíz de alta calidad proteínica, que contienen, dependiendo del híbrido, hasta 100% más lisina y triptófano que los maíces comunes. Sierra et al. (2004) evaluaron el contenido medio de proteína, triptófano y lisina del híbrido H-553C (híbrido de maíz de alta calidad proteínica), cuyos valores fueron 9.35%, 0.085% y 0.426%, respectivamente, mientas los valores presentados por el híbrido H-515 (híbrido de maíz normal) fueron de 11.84%, 0.067% y 0.290%, respectivamente. Lo que significó que el contenido de triptófano y lisina en el hibrido H-553C superó en un 44% y 46%, respectivamente, al híbrido normal H-515. En este mismo estudio también se evaluó el rendimiento por hectárea del H-553C durante el ciclo primavera-verano 2001, en las localidades de Cotaxtla, Papantla e Islas, Veracruz y Huimanguillo, Tabasco, el H-553C rindió 6.87 t/ha, rendimiento que representó 8% más que el testigo normal H-513. Aunado a esto, el INIFAP también produce maíces de origen criollo con alta calidad proteínica, los cuales tienen un 75% de germoplasma criollo y un 25% del donador QPM. El que se puedan obtener diferentes variedades de QPM a partir de variedades de maíz común localmente adaptadas a cualquier sitio donde crezca el maíz, tiene el fin de que la variedad QPM que se obtenga, presente un alto rendimiento, sea resistente a plagas y enfermedades, tenga un endospermo vítreo y contenga, además, la característica de maíz de alta calidad proteínica (Graham, 1993). En el 2005, se reportó la ficha tecnológica de un maíz de calidad 29 proteínica de origen criollo, el cual contiene un porcentaje de lisina y triptófano de 0.292 y 0.048 mg/100 g de grano, los cuales son superiores en un 50% a los maíces criollos de grano normal (0.182 y 0.021 mg/100g, respectivamente). Con respecto a su rendimiento, se reporta que supera las 2.5 t/ha (Aguilar, 2006). En estudios posteriores, se reportó un rendimiento promedio de 3.5 t/ha de un maíz de calidad proteínica de origen criollo blanco y de 3.4 t/ha de un maíz de calidad proteínica de origen criollo amarillo, los cuales superan en más del 300% al rendimiento medio obtenido con los criollos normales (ej, criollo X‘tup, 0.9 t/ha) (Aguilar et al., 2006). Desde el año 1999, se cuenta con semillas QPM certificadas, sin embargo el maíz QPM no se produce extensivamente a nivel nacional, actualmente se trabaja en el mejoramiento de la multiplicación de la semilla para disminuir sus costos de producción (Espinosa et al., 2005), además de que se están buscando estrategias para su distribución debido a que no existe una institución gubernamental encargada de esta actividad (Espinosa et al., 2002). La composición química proximal de diferentes productos de QPM de diferentes variedades se muestra en el Cuadro 7. Se puede observar que los productos del QPM, así como de los cereales en general, son una fuente rica de carbohidratos. 30 Cuadro 7. Composición química proximal de productos de maíz QPM de diferentes variedades (g/100 g). Producto Humedad Proteína Lípidos Cenizas Carbohidratos Tortilla de maíz QPM hibrido H-368C a - 7.2 2.5 1.4 82.5 Tortilla de maíz QPM variedad Nutricta b 12.8 9.5 3.1 1.5 73.1* Tortilla de maíz QPM variedad no reportada c 6.8 9.6 3.7 1.7 78.2* Harina de maíz QPM nixtamalizado Variedad V 537 d - 10.3 5.0 1.9 82.8 *valor obtenido por diferencia. Fuentes: a Mora-Avilés et al., 2007. b Bressani et al., 1990. c Amaya-Guerra et al., 2004. d Milán-Carrillo et al., 2004 31 2.11 Centro de origen del frijol Se planteó la hipótesis que establece tres centros de origen y domesticación del frijol común: 1) Sur de los Andes, que abarca desde el sur de Perú hasta San Luis, Argentina, con menor especiación y transferencia temprana de materiales hacia los otros dos centros, donde se efectuó una especiación más activa. 2) Norte de los Andes, desde el occidente de Venezuela hasta el Norte de Perú, lugar que se llevó a cabo cierta especiación que, posteriormente dio origen a dos distribuciones desproporcionadas: una hacia Mesoamérica y otra hacia el sur de los Andes y 3) La región limitada por los valles de los ríos Panuco y Santiago en México, hasta el norte de Costa Rica, donde se llevó a cabo una especiación elevada. Sin embargo, se acepta que el principal centro de origen del género Phaseolus fue México, y que de ahí se difundieron algunas especies hacia el sur del continente.Este planteamiento responde al hecho de que en México se han identificado 47 de las 52 especies clasificadas de este género, además de que en este país se han identificado los ancestros silvestres verdaderos de las cinco especies cultivadas del género: P vulgaris o frijol común, P acutifolius Asa Gray o frijol tépari, P lunatus o frijol lima, P coccineous o frijol escarlata y P polyanthus o frijol anual, lo que no has sucedido en Centro y Sudamérica. Por otro lado, el 30% del frijol común que se encuentra en el banco de germoplasma del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT, Colombia) es en su mayoría de origen mexicano, en contraste con la región andina (20%), Europa (15%) y África (10%), lo cual demuestra la importancia que tiene México como fuente de diversidad genética (Guzmán-Maldonado y Paredes-López, 1998). 2.12 El frijol y sus propiedades Actualmente, existe la tendencia de incorporar nuevos ingredientes derivados de fuentes de alimentos tradicionales a los alimentos más consumidos en forma de formulaciones, con el fin de desarrollar productos más saludables para la población. Entre estos ingredientes se encuentran los granos de leguminosas, los cuales están libres de gluten, tienen un alto contenido de fibra dietética, bajo contenido de grasas saturadas, son libres de colesterol, no 32 son genéticamente modificados y contienen niveles altos de lisina para complementar la deficiencias de lisina en las dietas a base de cereales (Patterson et al., 2010). La fibra dietética de las leguminosas se encuentra tanto en la testa como en el cotiledón. Las paredes de las células del cotiledón contienen sustancias pécticas, celulosa y glucanos no amiláceos. La testa contiene cantidades grandes de celulosa y cantidades pequeñas de hemicelulosa y pectinas (Patterson et al., 2010). Diversos autores han reportado un contenido alto de fibra dietética de diferentes variedades de frijol (Rosin et al., 2002; Candela et al., 1997; Bednar et al., 2001). Las leguminosas también contienen una cantidad importante de almidón resistente comparado con los cereales (Hoover y Zhou, 2003). Anteriormente se especificaron los efectos fisiológicos benéficos al consumo de fibra dietética y almidón resistente. Además, los frijoles tienen característica de digestión lenta del almidón (Tovar et al., 1990b). Los frijoles también contienen cantidades importantes de polifenoles (Aparicio-Fernandez et al., 2005; Xu et al., 2007; Paredes-López et al., 2006; De Mejía et al., 2003; Guzmán- Maldonado et al., 1996), y se ha demostrado que dietas ricas en polifenoles ayudan a reducir el riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares y cáncer (Kris-Etherton et al., 2002). 2.13 Estudios de digestibilidad del almidón de la mezcla maíz y frijol Tradicionalmente, las personas que viven en zonas rurales de México y América Central consumen un alimento constituido por tortilla, frijol y chile llamado ―taco‖ (Sáyago-Ayerdi et al., 2005). Tovar et al. (2003) realizaron un estudio de la digestibilidad del almidón del taco y sus ingredientes (tortilla y frijol), por su parte Sáyago-Ayerdi et al. (2005) realizaron un estudio semejante, en ambos estudios encontraron que el taco tiene un menor índice de hidrólisis y predicción de índice glucémico que la tortilla sola, lo cual indicó que el frijol en el taco juega un papel predominante en la digestibilidad del almidón, ya que el taco conserva las características de digestión lenta del almidón de los frijoles. Sáyago-Ayerdi et al., (2005) también encontraron que el taco contiene una menor cantidad de almidón disponible y mayor 33 cantidad de almidón resistente que la tortilla sola, esto debido a que el frijol tiene mayor contenido de almidón resistente, por lo que disminuyó el contenido de almidón disponible en el taco. Por su parte, Hernández-Salazar et al. (2006) realizaron un estudio de la digestibilidad del almidón de tortillas elaboradas con una harina comercial compuesta de maíz y frijol, de la cual no se conocía la relación de estos componentes, encontrando que la cantidad de almidón total y almidón disponible en la tortilla de maíz y frijol fue menor que la tortilla de maíz, lo cual se debió al menor contenido de almidón total y disponible en los frijoles en comparación con el maíz. La tortilla de maíz y frijol también tuvo mayor cantidad de almidón resistente que la tortilla de maíz. No se han realizado estudios de la digestibilidad del almidón (ni de la capacidad antioxidante) en una tortilla producida a partir de una mezcla de maíz QPM y frijol negro cocido. Mora- Avilés et al. (2007) prepararon una tortilla con una mezcla de maíz QPM y frijol, y evaluaron la composición química, la calidad de proteína y digestibilidad de la proteína. Al adicionar el frijol al maíz QPM para elaborar la tortilla, se incrementó en contenido de minerales, lisina y triptófano y la calidad de la proteína de ésta. 34 3. JUSTIFICACIÓN Debido a que la tortilla forma parte de la base de la alimentación en México y a la problemática que se tiene con respecto a sus altos índices de sobrepeso y obesidad, se pretendió elaborar una tortilla con una mezcla de maíz de alta calidad proteínica y frijol negro que, además de su mayor cantidad de aminoácidos esenciales, lo cual podría prevenir la desnutrición, principalmente infantil, también presente mayor capacidad antioxidante y un menor índice glucémico, con respecto a la tortilla elaborada con maíz de alta calidad proteínica, que podría ayudar a prevenir el sobrepeso, la obesidad y por lo tanto, enfermedades crónicas degenerativas. Actualmente, la producción de maíz QPM en México no es extensiva, sin embargo se están buscando estrategias para la distribución de su semilla, por lo que este trabajo de investigación podría dar una ventaja adicional para su mayor producción. 35 4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo general Evaluar la digestibilidad del almidón así como la capacidad antioxidante de una tortilla elaborada a partir de una mezcla de maíz de alta calidad proteínica y frijol negro. 4.2 Objetivos específicos Determinar la composición química proximal de la harina de frijol negro, masa QPM, tortilla QPM y tortilla QPM-frijol negro. Determinar el contenido fibra dietética total de la harina de frijol negro, masa QPM, tortilla QPM y tortilla QPM-frijol negro. Determinar el contenido de almidón total, disponible y resistente de la harina de frijol negro, masa QPM, tortilla QPM y tortilla QPM-frijol negro. Evaluar la tasa de hidrólisis del almidón in vitro de la harina de frijol negro, tortilla QPM y tortilla QPM-frijol negro. Determinar la predicción del índice glucémico de la harina de frijol negro, tortilla QPM y tortilla QPM-frijol negro. Cuantificar el contenido de polifenoles extraíbles, taninos condensados y polifenoles hidrolizables, y su capacidad antioxidante de la harina de frijol negro, tortilla QPM y tortilla QPM-frijol negro. 36 5. METODOLOGÍA El diagrama experimental de trabajo (Figura 6) consistió en la obtención de harina de frijol negro y masa de maíz de alta calidad proteínica. Posteriormente se elaboró la tortilla de maíz de alta calidad proteínica y la tortilla elaborada con una mezcla de maíz de alta calidad proteínica y frijol negro cocido (grano y caldo) en una proporción 70:30 en base seca, respectivamente. Se realizó el análisis proximal, pruebas de digestibilidad del almidón y capacidad antioxidante en las muestras. Figura 6. Diagrama experimental de trabajo. * Metodología no determinada en la masa QPM. Grano de maíz QPM Masa QPM Tortilla QPM (control) Grano de frijol negro Harina de frijol negro Tortilla QPM- frijol negro (70:30) Digestibilidad del almidón: - Almidón total - Almidón disponible- Almidón resistente - Tasa de hidrólisis del almidón in vitro* - Predicción del índice glucémico* Capacidad antioxidante*: - Polifenoles extraíbles - Taninos condensados - Polifenoles hidrolizables - Composición química proximal - Fibra dietética total 37 5.1 Elaboración de las muestras Se utilizó como materia prima frijol común (Phaseolus vulgaris L.) variedad Negro 8025 y maíz (Zea mays L.) variedad QPM Ancho. El frijol Negro 8025 fue cosechado en septiembre del 2008 y proporcionado por el campo experimental Bajío del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), ubicado en Celaya, Guanajuato. El maíz QPM Ancho, fue cosechado en mayo del 2009 y proporcionado por el INIFAP, campo experimental Iguala, Guerrero. 5.1.1 Elaboración de la harina de frijol negro Los granos de frijol negro fueron cocidos durante 85 min a 97 ºC en agua con NaCl (10 g/Kg de frijol), los granos cocidos se molieron con el caldo en una licuadora Proctor Silex (Modelo 57171- MX, Hamilton Beach/Proctor-Silex, Inc.), las pasta posteriormente fue liofilizada y finalmente fue molida en un molino Cyclotec (1093 Sample Mill) y tamizada en malla 40. La harina obtenida se almacenó a 10 ºC en bolsas de polietileno. 5.1.2 Elaboración de la masa de maíz de alta calidad proteínica (Masa QPM) Los granos de maíz QPM fueron cocidos por 30 min a 97 ºC en una solución de agua (1:3 p/v) a un pH alcalino usando cal (10 g/Kg de grano), posteriormente se dejaron remojar durante 12 horas. Después del remojo, los granos se lavaron tres veces con agua y se llevaron a moler a una tortillería comercial con la finalidad de obtener una masa homogénea. La masa se liofilizó y finalmente se molió en un molino Cyclotec (1093 Sample Mill) y tamizó en malla 40. La muestra se almacenó a 10 ºC en bolsas de polietileno. 5.1.3 Elaboración de la tortilla de maíz de alta calidad proteínica (Tortilla QPM) Se utilizó la masa QPM recién elaborada para hacer las tortillas, la elaboración de las tortillas se realizó en una tortillería comercial con la finalidad de obtener tortillas homogéneas. Se 38 elaboraron tres lotes. Las tortillas QPM se liofilizaron y finalmente se molieron en un molino Cyclotec (1093 Sample Mill) y tamizaron en malla 40. La muestra se almacenó a 10 ºC en bolsas de polietileno. 5.1.4 Elaboración de la tortilla compuesta de una mezcla de maíz de alta calidad proteínica y frijol negro (Tortilla QPM-frijol negro) Se utilizó la masa QPM recién elaborada, se sustituyó en un 30 % (peso seco) de la masa QPM por harina de frijol negro, posteriormente se elaboraron las tortillas, la elaboración de las tortillas se realizó en una tortillería comercial con la finalidad de obtener tortillas homogéneas. Se elaboraron tres lotes. Las tortillas QPM-frijol negro se liofilizaron y finalmente se molieron en un molino Cyclotec (1093 Sample Mill) y tamizaron en malla 40. La muestra se almacenó a 10 ºC en bolsas de polietileno. 5.2 Composición química proximal 5.2.1 Humedad Se determinó por el método oficial 44-19, de la AACC (2000). Se pesaron 0.5 g de muestra en charolas de aluminio (puestas previamente a peso constante), se colocaron en la estufa (Lab- line, Imperial V, USA) a 100±1 °C durante 3 h, posteriormente se enfriaron en un desecador por 20 min. Finalmente se pesaron y se determinó la humedad por diferencia de peso con la siguiente ecuación: 39 5.2.2 Proteína La determinación de proteína se realizó en las muestras desgrasadas. Estas se cuantificaron con el método oficial 46-13 de la AACC (2000). El porcentaje de proteína se determinó indirectamente por la cuantificación de nitrógeno total utilizando el método Kjeldahl. Se pesó 1 g de muestra y se pasó a un tubo Kjendahl, al cual se le agregó 1 g de sulfato de cobre, 10 g de sulfato de potasio anhídro y 15 ml de ácido sulfúrico concentrado. La muestra se calentó gradualmente a 400 °C, hasta que el contenido del tubo presentó un color verde claro (digestión). El tubo se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se le adicionaron 15 ml de agua para lavar los residuos que quedaron en la pared del tubo, posteriormente se adicionaron 50 ml de hidróxido de sodio al 40%. Por otro lado, en un matraz erlenmeyer se añadieron 50 ml de ácido bórico al 4% y 10 gotas de indicador wesslow. Se realizó la destilación hasta obtener un volumen de 100 ml de la muestra en el matraz preparado anteriormente. La muestra obtenida se tituló con ácido clorhídrico 0.1N. Se calculó el porcentaje de proteína con la siguiente ecuación: Donde F: Factor de conversión a proteína, 6.25 N: Normalidad 5.2.3 Lípidos Se utilizó el método oficial 30-25 de la AACC (2000). Se pesaron 3 g de muestra seca en cartuchos de celulosa. Se colocaron en el aparato de extracción Soxhlet (Böchi Labortehnik AG, Extraction system B-811, Suiza), se adicionaron 100 ml de éter de petróleo a los vasos del equipo y posteriormente se realizó la extracción por 4 h. Finalmente, los vasos se secaron 40 en la estufa (Lab-line, Imperial V, USA) a 60±1 °C por 1 h y se pesaron para determinar el porcentaje de lípidos con la siguiente ecuación: é 5.2.4 Cenizas Se analizaron con el método 08-01 de la AACC (2000). Se pesó 1 g de muestra en un crisol (puesto a peso constante), se carbonizó la muestra sobre la flama de un mechero y se introdujo en la mufla (Thermolyne, Furnace 6000, USA), a 550±1 °C por 5 h. Cuando las cenizas estuvieron blancas, se enfriaron en un desecador. Finalmente se pesaron y se calculó el porcentaje de cenizas como: 5.3 Fibra dietética total La fibra dietética total (FDT) es determinada para muestras gelatinizadas por duplicado (anteriormente desgrasadas si su contenido de grasa es > 3%) con α-amilasa termoestable, las cuales se digieren con proteasa y amiloglucosidasa para eliminar la proteína y el almidón, posteriormente se diluye la digestión acuosa con cuatro volúmenes de etanol para precipitar la fibra dietética soluble. El residuo se filtra; se lava con etanol al 75% v/v, etanol al 95% v/v y acetona; se seca y se pesa. La FDT colectada es corregida restando la determinación de proteína y cenizas del residuo. Esta determinación se realizó por el método oficial 985.29, de la AOAC 1997. 41 Primeramente se llevó a cabo una limpieza de impurezas de los crisoles de vidrio de fondo poroso (2µm), colocándolos en la mufla (Thermolyne, Furnace 6000, USA) a 550 ±1 ºC por 45 minutos, posteriormente se llevaron a peso constante a 100 ºC. Se pesaron 4 porciones de 1 g de muestra en base seca o desgrasada en vasos berzelius de 400 ml, se le adicionaron 50 ml de regulador de fosfatos 0.08M (pH 6). Se verificó que el pH fuera de 6. Se adicionó 0.1 ml de α-amilasa termoestable (A3306, Sigma Aldrich Co., ST Luis, MO, USA) y se incubaron en un baño de agua a temperatura de ebullición durante 15 min (agitando suavemente cada 5 min). Posteriormente se dejaron enfriar. Se agregaron 10 ml de NaOH 0.275 N, se ajusto el pH a 7.5, se agrego 0.1 ml de solución de proteasa (50 mg/ml regulador de fosfatos 0.08M, P3910, Sigma Aldrich Co.) y se incubaron en un baño de agua a 60±0.5 ºC por 30 min con agitación constante. Se dejaron enfriar. Se agregaron 10 ml de HCl 0.325 N, se ajusto el pH a 4.75, se agrego 0.1 ml de solución de amiloglucosidasa (A9913, Sigma Aldrich Co.) y se incubaron en un baño de agua a 60±0.5 ºC por 30 min con
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