Biossíntese de Trehalose em Saccharomyces cerevisiae

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24/10/2022

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

“CONSTRUCCIÓN DE RUTAS BIOQUÍMICAS SIMPLIFICADAS PARA
EL ANÁLISIS DEL CONTROL METABÓLICO DE LA BIOSÍNTESIS
DE TREHALOSA EN Saccharomyces cerevisiae”

INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR
EN LA MODALIDAD DE:

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE
INGENIERO BIOTECNÓLOGO

PRESENTA
JOSÉ ISRAEL HERNÁNDEZ OROPEZA

DIRECTOR DE PROYECTO
DR. JUAN SILVESTRE ARANDA BARRADAS

FIRMA DEL DIRECTOR

MÉXICO, D. F., MAYO DEL 2007

A mi madre.

iii
AGRADECIMIENTOS.

Al Dr. Juan Silvestre Aranda Barradas por su valiosa asesoría durante
todo este tiempo en el cual aprendí que la modelación metabólica es más que
la Ecuación de Monod.

Al Biol. Exp. Fidel Montalbán Castellanos por sus sabios consejos y
enseñanzas y por mostrarme que la “plantología” es la ciencia del futuro.

A mis compañeros Isela, Luz y Daniel por el apoyo bibliográfico en todo
momento.

Y a todos aquellos que por un olvido involuntario no aparecen aquí.

INDÍCE DE CONTENIDO

RESUMEN……………................................................................................................vi

1. INTRODUCCIÓN

1.1 LA LEVADURA Saccharomyces cerevisiae …………………………...........1

1.2 PROCESO GENERAL DE LA PRODUCCIÓN DE LEVADURA …………..1

1.3 CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO, CLA …………………………………3

1.4 CRECIMIENTO CELULAR …………………………………………………….3

1.5 ESTEQUIOMETRIA DE UNA REACCIÓN MICROBIANA …………………4
1.6 CINETICA DE CRECIMIENTO…………………………………………………4

1.7 ASPECTOS GENERALES DEL METABOLISMO DE Saccharomyces
cerevisiae …………………………………………………………………………….6

1.8 METABOLISMO ENERGÉTICO EN Saccharomyces cerevisiae …………6

1.9 METABOLISMO DE COMPUESTOS DE RESERVA EN Saccharomyces
cerevisiae …………………………………………………………………………….8

1.10 TREHALOSA …………………………………………………………………..9

1.11 BIOSÍNTESIS DE TREHALOSA EN Saccharomyces cerevisiae ………10

1.12 MODELOS PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO …………………..11

1.13 INGENIERIA METABÓLICA ………………………………………………..12

1.14 ANÁLISIS DEL CONTROL METABÓLICO ……………………………….13

1.15 COEFICIENTE DE CONTROL DE FLUJO ……………………………….13

1.16 COEFICIENTES DE CONTROL DE LA CONCENTRACIÓN …………..14

1.17 COEFICIENTES DE ELASTICIDAD ……………………………………….14

2. ANTECEDENTES ………………………………………………………………………15

3. JUSTIFICACIÓN ………………………………………………………………………..16

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL ………………………………………………………..17

4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS …………………………………………………17

5. METODOLOGÍA

5.1 CONSTRUCCIÓN DE LA RED METABOLICA DE LA BIOSÍNTESIS
DE TREHALOSA EN Saccharomyces cerevisiae ……..……………………....18

5.2 ELABORACION DE LA BASE DE DATOS CMBTSc ……………………..20

5.3 CONSOLIDACION Y SIMPLIFICACIÓN DE LA RED ……………………..21

5.4 DETERMINACIÓN DE LOS COEFICIENTES ESTEQUIOMÉTRICOS …21

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ………………………………………………………..22

7. CONCLUSIONES ……………………………………………………………………….30

8. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ………………………………………………….31

9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS …………………………………………………..32

ANEXO 1 ……………………………………………………………………………………35

ANEXO 2 ……………………………………………………………………………………39

ANEXO 3 ……………………………………………………………………………………47

vi
RESUMEN

En general, la producción de metabolitos de origen microbiano depende de la
condición fisiológica del microorganismo productor, esto es, de la distribución de
flujos de carbono, nitrógeno, fósforo y azufre principalmente, en las diferentes
reacciones bioquímicas que, consideradas en su totalidad, constituyen el
metabolismo celular. Puesto que el estado fisiológico microbiano es función de las
variables de operación establecidas en el cultivo (la composición y disponibilidad del
medio de cultivo, el pH, la tensión de oxígeno disuelto y el mezclado), la generación
de productos del metabolismo está indirectamente relacionada con tales condiciones
de cultivo.

El dímero trehalosa es un metabolito intracelular que se sintetiza en la
levadura Saccharomyces cerevisiae al ser cultivada bajo limitación de carbono,
fósforo o nitrógeno. La acumulación de trehalosa en el citoplasma de la levadura
responde a las funciones celulares que se le atribuyen. Por un lado, la trehalosa
sustituye moléculas de la esfera de solvatación de proteínas cuando disminuye la
actividad acuosa circundante, con lo que la levadura se mantiene viable aún
después de pasar por algún proceso de deshidratación. Por otro lado, la hidrólisis de
la trehalosa aporta moléculas energéticas para el mantenimiento del metabolismo en
condiciones basales, dado que el disacárido está constituido por dos moléculas de
glucosa. Tales funciones celulares explican que la calidad de una levadura utilizada
en la producción de pan esté estrechamente relacionada con la concentración
intracelular de trehalosa que tenga. Si la trehalosa rebasa el 10 % del peso de
biomasa seca, la levadura se mantiene viable como buen insumo biológico para la
elaboración de pan, y su vida de anaquel se incrementa significativamente. Con
menores contenidos citoplásmicos de trehalosa, la levadura no resiste los procesos
de acondicionamiento que la transforman en insumo para la panificación, y su vida
de anaquel es considerablemente corta. Lo anterior determina la importancia de la
acumulación de trehalosa durante los procesos de producción de levadura para
panificación.

Se conocen diversos procesos de producción de Saccharomyces cerevisiae
en los que se logra inducir empíricamente una biosíntesis intensificada de trehalosa,
sin embargo no se ha desarrollado una explicación del fenómeno fundamentada en
el conocimiento de las rutas metabólicas de la levadura.

Son varios los eventos bioquímicos involucrados en la acumulación del
dímero, y para evaluar su importancia es necesario asociarles mediciones
cuantitativas. El conjunto de reacciones bioquímicas implicadas en la biosíntesis de
trehalosa puede ser analizado en términos de sus velocidades de reacción, esto es,
de la estimación numérica de conversión de reactivos a productos (o intermediarios)
por unidad de tiempo en cada reacción de una ruta bioquímica especificada. En una
reacción lenta por su velocidad de reacción habrían menores cantidades
transformadas de un sustrato a cierto producto. En contraste, si la velocidad de
reacción estimada es elevada, la reacción será rápida y mayor el recambio de
sustrato a producto. Por tanto, el análisis de las velocidades de reacción permite la
identificación de las rutas del metabolismo más activas o con mayor flujo de carbono
y otros elementos a través de ellas.

vii
Así, mediante la estimación de velocidades de reacción en el metabolismo
energético de la levadura, es posible determinar en principio el flujo de carbono
dirigido a la síntesis de la trehalosa en citoplasma. Un requisito necesario para
aplicar el análisis de las velocidades de reacción es la construcción de una ruta
bioquímica consistente para la acumulación de trehalosa intracelular. Si no se
dispone del esquema de reacciones que conllevan a la producción de trehalosa, no
es posible generar análisis confiables de las velocidades de reacción
correspondientes. Establecer el conjunto de intermediarios metabólicos necesarios
en la biosíntesis de trehalosa, y desarrollar el subsiguiente análisis de velocidades
de reacción de las rutas bioquímicas que los generan o consumen, es el propósito
central del presente proyecto.

1
1. INTRODUCCIÓN

1.1 LA LEVADURA Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae ha sido probablemente el microorganismo más
ampliamente utilizado por el hombre a través del tiempo. Su uso tanto en
investigación básica como en el desarrollo de procesos de producción ha permitido
resultados con aplicación importante en el sector alimentario.

La levadura Saccharomyces cerevisiae ha estado presente en la alimentación
humana desde tiempos remotos. En un principio el hombre no tenía conciencia de la
participación de este microorganismo en la elaboración de diversos alimentos como
el pan o las bebidas alcohólicas. En tiempos actuales, el desarrollo de disciplinas
como la microbiología, la bioquímica, la ingeniería bioquímica y varias más que
convergen en el amplio concepto de biotecnología, han hecho de la producción de
levadura y de sus aplicaciones en el sector alimentario procesos sólidamente
fundamentados en conocimientos científicos e ingenieriles (Aranda y Salgado,
2002).

En lo que concierne a los usos de Saccharomyces cerevisiae con fines de
producción de alimentos, ha sido clásicamente empleada en la fabricación de pan y
de bebidas alcohólicas. También se utiliza en la producción de enzimas, entre las
que destaca la invertasa. Saccharomyces cerevisiae también ha sido considerada
como fuente de proteína unicelular y de complementos nutricionales como vitamina
B, C, E y ciertos oligoelementos como selenio, cobre, hierro y calcio para consumo
humano y animal.

Figura 1. Saccharomyces cerevisiae se usa en la elaboración
de diversos alimentos como el pan y las bebidas alcohólicas

1.2 PROCESO GENERAL DE LA PRODUCCIÓN DE LEVADURA

En todos los procesos de producción de levadura se pueden distinguir tres
etapas principales.

1. La preparación de medios de cultivo y de inóculos. En esta etapa se lleva a
acabo la preparación de los equipos de proceso, materias primas e inóculos
necesarios para la producción de Saccharomyces cerevisiae. La materia
prima esencial para la propagación de la levadura es la melaza de jugos de
caña o betabel. La melaza se compone de los azúcares no cristalizables que
reciben un tratamiento de hidrólisis química y una separación de sólidos

2
suspendidos. La melaza clarificada se incorpora al medio de cultivo para la
etapa de producción (Rosen, 1989).

El inóculo para la propagación del microorganismo en grandes
volúmenes (120 m3) inicia su desarrollo en matraces de 1 L cuyo volumen es
transvasado sucesivamente a biorreactores de 500 L (cultivo vegetativo
primario) y 10,000 L (cultivo vegetativo secundario). Una vez concluido el
crecimiento en el segundo reactor semilla, la levadura es utilizada para iniciar
la etapa de producción.

2. La producción de biomasa. En esta etapa ocurre el crecimiento de
Saccharomyces cerevisiae en cultivo por lote alimentado que puede alcanzar
concentraciones celulares de 90-120 g/L. La estrategia de alimentación del
medio de cultivo es un factor determinante de la productividad y el
rendimiento del proceso, así como de la calidad de la levadura producida.

3. La recuperación de la levadura y su acondicionamiento. Una vez que la
biomasa ha sido producida, se requiere un conjunto de procesos de
acondicionamiento para la obtención de diversas presentaciones existentes
de levadura o de los productos derivados de ella. Entre tales procesos se
pueden encontrar la decantación, la centrifugación y la filtración, la
evaporación, la encapsulación, la congelación y varios procesos de secado
que confieren al producto terminado sus características específicas distintivas.

Figura 2. La producción de levadura se lleva a cabo en biorreactores con capacidad
hasta de 10, 000 L donde se alcanzan concentraciones celulares de 90-120 g/L.
1.3 CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO, CLA

Se denomina cultivo por lote alimentado, CLA, a aquel proceso donde se
suministra un flujo de sustrato de manera continua o intermitente, constante o no y
en los que no existe una corriente de salida del mosto fermentado.

El cultivo por lote alimentado tiene un importante uso a escala industrial por las ventajas
que ofrece. Al dosificar el sustrato a la velocidad con la que está siendo consumido y
transformado por el microorganismo se eliminan problemas de represión de la síntesis del
producto por glucosa (efecto glucosa) y problemas de limitación del crecimiento celular
por exceso de sustrato (principalmente por aquellos que presentan un umbral de toxicidad a
concentraciones relativamente bajas como metanol, etanol, fenol) también puede
emplearse en fermentaciones en las que se utilicen cepas sobreproductoras sujetas a
auxotrofía (Ordaz y Orozco, 1999).

Los equipos adicionales y la forma operacional requerida en un cultivo por lote
alimentado, CLA, al compararse con el cultivo por lote, CL, no ocasionan problemas
ni representa gastos económicos que no puedan ser solventados exitosamente
como consecuencia de los incrementos en los rendimientos del producto o
productividad alcanzados en esta forma de cultivo.

1.4 CRECIMIENTO CELULAR

El crecimiento celular es el resultado de una gran variedad de reacciones
bioquímicas que ocurren dentro de las células. En modelos descriptivos del
crecimiento microbiano, las rutas metabólicas generalmente son reducidas y
conjuntadas en una sola reacción global. El crecimiento celular involucra el
transporte de los sustratos dentro de la célula, siguiendo con la conversión de éstos
a sustratos intracelulares para formar biomasa y productos metabólicos. Finalmente
esos productos son excretados hacia el medio extracelular (Nielsen y Villadsen,
1994).

Figura 3. Reacciones involucradas en el crecimiento celular. Las letras mayúsculas
representan las especies intracelulares (S sustratos; X biomasa; P productos) las
minúsculas simbolizan las especies extracelulares (s sustratos; p productos).

Los sustratos son compuestos químicos presentes en el medio que pueden
ser tomados por las células y convertidos en otros que éstas necesiten para crecer.
En algún caso las células reutilizan un producto metabólico. Este producto puede
servir como segundo sustrato. Un ejemplo es el crecimiento diáuxico de
Saccharomyces cerevisiae, en donde se forma etanol y biomasa cuando la levadura
crece con presencia de glucosa. Cuando se termina la glucosa, el crecimiento
continúa con el etanol como sustrato. Dependiendo del proceso descrito, un
compuesto puede considerarse como sustrato y como producto.

4
Los componentes de la biomasa son sustancias formadas a partir de los
sustratos que no pueden pasar la envoltura celular. Algunos ejemplos son proteínas,
RNA, DNA, y moléculas más pequeñas como ATP, NADH y NADPH.

Los productos metabólicos son especies formadas en las reacciones
intracelulares y que son capaces de atravesar la envoltura celular hacia la fase
abiótica. Los productos metabólicos no son únicamente moléculas simples, también
pueden ser macromoléculas como algunas enzimas hidrolíticas.

1.5 ESTEQUIOMETRÍA DE UNA REACCIÓN MICROBIANA

Considerando un sistema microbiano con N sustratos, M productos
metabólicos y L componentes de la biomasa es posible realizar un balance global.
Las especies intracelulares son simbolizadas con letras mayúsculas. Así, los
sustratos Si que son consumidos en las reacciones intracelulares son diferentes de
los sustratos extracelulares si, además, sus reacciones de transporte hacia el interior
de la célula pueden involucrar algunas de las L partes estructurales de la biomasa Xi.
De la misma forma Pi, representa los productos metabólicos formados en las
reacciones intracelulares. La excreción de los productos hacia el medio puede
involucrar algunos componentes celulares. La estequiometría para los tres tipos de
reacciones puede representarse como en (1), (2) y (3), donde α, β y γ son los
coeficientes estequiométricos que pueden ser positivos, negativos o cero (Nielsen et
al., 1994).

NjsPXSa
M
i
iijis
Li
ijis
N
i
ijis .....1;0
1
.
1
.
1
. ==−++ ∑∑∑
===
βγ (1)

∑∑∑
===
==++
M
i
iji
L
i
iji
N
i
iij JjPXS
111
.....1;0βγα (2)

MjPXS
M
i
ijip
N
i
L
i
ijipijip .....1;0
1
.
1 1
.. ==++ ∑∑ ∑
== =
βγα (3)

1.6 CINÉTICA DE CRECIMIENTO
La cinética clásica de crecimiento poblacional establece que la velocidad instantánea
de crecimiento dN/dt es proporcional al número de individuos presentes:

N
dt
dN
∝ (4)

al eliminar la proporcionalidad de la ecuación anterior se obtiene:

N
dt
dN µ= (5)

en la que: N = número de individuos presentes.
dN/dt = velocidad instantánea de crecimiento.
µ = velocidad específica de crecimiento.

En esta ecuación, el término N puede ser sustituido, para el caso del crecimiento
microbiano, por su sinónimo X (masa total microbiana). La definición de µ se obtiene de
dicha ecuación:

µ =
1
X
dX
dt
(6)

Figura 4. Curva de crecimiento microbiano en una fermentación sumergida y en lote
en la que se muestra la velocidad instantánea de crecimiento a distintos tiempos.

En una fermentación en lote, la biomasa total X evoluciona con el tiempo como se
representa en la Figura 4, observando detalladamente la gráfica anterior, en las etapas
tempranas de la fermentación, en la que la masa o concentración celular es baja y en la que el
sustrato disponible para el microorganismo es suficientemente grande (bajo condiciones
favorables para la división celular), el crecimiento celular no tiene barreras que lo limiten, por
tal razón, se puede considerar que la velocidad específica de crecimiento es constante y
máxima en esta etapa. Bajo esta consideración se puede resolver la ecuación (6), resultando:

t
x
x
max
0
ln µ=⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎝
⎛
(7)
1.7 ASPECTOS GENERALES DEL METABOLISMO DE Saccharomyces cerevisiae

6
En el proceso de producción de Saccharomyces cerevisiae se establecen
condiciones de operación (temperatura, suministro de aire, sustratos, control de pH)
que conducen a que la levadura se desarrolle bajo cierto régimen metabólico. El
crecimiento de la levadura en un determinado metabolismo condiciona en alguna
medida las características que tendrá como insumo en cualquiera de sus
aplicaciones finales, de modo que tales características dependen en última instancia
de las reacciones metabólicas favorecidas por las condiciones de operación del
proceso implementado para la producción del microorganismo. Existen dos aspectos
del metabolismo de Saccharomyces cerevisiae que resultan particularmente
importantes en la producción de biomasa: el metabolismo energético, que determina
las rutas bioquímicas favorecidas para la transformación del sustrato
mayoritariamente a biomasa o a etanol; y el metabolismo de los compuestos de
reserva en la levadura, que se relacionan con su viabilidad y vida de anaquel como
producto terminado.

Figura 5. La composición intracelular de la levadura está determinada por las condiciones
de operación con las que se realizó su crecimiento durante la fermentación.

1.8 METABOLISMO ENERGÉTICO EN Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae presenta particularidades en su comportamiento
metabólico que varían en función de las condiciones de operación del proceso de
producción o de cultivo del microorganismo.

Si el microorganismo se desarrolla en anaerobiosis con glucosa (sustrato
limitante) como fuente de carbono y energía, se observa la acumulación de etanol
producido por las células en el medio de cultivo. Cuando se introduce un caudal de
aire al cultivo celular la producción de etanol disminuye, lo cual significa que el
oxígeno induce cambios en el metabolismo de la levadura. También se ha reportado
que a concentraciones bajas de glucosa en un cultivo microbiano aireado, la célula
prácticamente no produce etanol, y el sustrato es casi íntegramente utilizado en la
síntesis de biomasa. Sin embargo, Saccharomyces cerevisiae produce etanol aún en
presencia de oxígeno si la concentración de glucosa en el medio de cultivo es
relativamente elevada (Wang et al., 1979).

Figura 6. Influencia de las concentraciones de O2 y de glucosa
sobre el metabolismo de Saccharomyces cerevisiae.

El metabolismo de Saccharomyces cerevisiae está fuertemente influenciado
por las concentraciones de glucosa y de oxígeno en el medio de cultivo. La Figura 6
indica que el crecimiento de la levadura, y por lo tanto la mayor o menor producción
de biomasa, responden a la presencia del oxígeno y la glucosa en el medio de
cultivo del siguiente modo: manteniendo concentraciones de oxígeno disuelto
relativamente elevadas en el medio de cultivo (mediante biorreactores con un
sistema eficiente de transferencia de oxígeno), y controlando la glucosa para
conservarla a baja concentración en el medio líquido, se obtiene altas
concentraciones de biomasa del cultivo y producción reducida de etanol; en
condiciones de cultivo con concentraciones importantes de glucosa y suministro de
oxígeno limitado, el producto principal del cultivo celular es el etanol, con formación
escasa de biomasa.

La glucosa es asimilada por la levadura mediante la ruta metabólica
denominada glicólisis, y el oxígeno es incorporado en el metabolismo energético
como aceptor final de electrones en la cadena respiratoria. El producto final de la
glucólisis es el piruvato. Este compuesto puede ser incorporado a dos regímenes
metabólicos diferentes como se representa en la Figura 7.

Figura 7. Asimilación de la glucosa en Saccharomyces cerevisiae.

8
Por un lado, el piruvato es descarboxilado para producir etanol y CO2. La
biomasa microbiana se incrementa solo ligeramente bajo este régimen metabólico
que se denomina generalmente metabolismo oxidativo-reductor.

Por otro lado, la formación de la acetilcoenzima A es la primera etapa de
incorporación del piruvato a las rutas del metabolismo respiratorio, a saber: el ciclo
de Krebs y la cadena respiratoria. La activación de este régimen metabólico
denominado metabolismo oxidativo, implica el consumo de oxígeno. La producción
de biomasa aumenta significativamente respecto al metabolismo oxidativo-reductor,
pero se produce poco etanol.

Las diferentes respuestas que se han observado en el metabolismo de Saccharomyces
cerevisiae, cuando se somete a distintas condiciones de cultivo, pueden ser explicadas por la
hipótesis de la saturación de la capacidad respiratoria (Sonnleitner y Kappeli, 1986).

Lo anterior pone de manifiesto que el comportamiento cinético y el estado
fisiológico de la levadura dependen en gran medida de la concentración de glucosa
(o fructosa) en el medio de cultivo, y de la cantidad (por unidad de volumen) de
oxígeno disuelto en el medio líquido que se aporta al cultivo. Las condiciones de
cultivo pueden manipularse con el fin de orientar un cultivo celular de
Saccharomyces cerevisiae hacia la producción de biomasa o hacia la producción de
etanol. Asimismo, puede producirse levadura con ciertas características fisiológicas
según vaya a ser utilizada como materia prima para la producción de bebidas
alcohólicas, en el proceso de panificación o bien como complemento nutricional.

1.9 METABOLISMO DE COMPUESTOS DE RESERVA EN Saccharomyces
cerevisiae

Los compuestos de reserva determinan las características de la levadura que
será utilizada como insumo tanto en la industria de panificación como en la de
elaboración de bebidas alcohólicas. Entre tales características se encuentran la
viabilidad de la levadura, el poder fermentativo o la velocidad de consumo de
glucosa, la velocidad de generación de CO2 y la vida de anaquel. Las células de
Saccharomyces cerevisiae son capaces de acumular sustancias de reserva
energética como el glucógeno y la trehalosa.

El glucógeno es un polímero de glucosa cuya hidrólisis proporciona energía a
la célula mediante la liberación de monómeros metabolizablesa través de la
glucólisis. La síntesis del glicógeno en el citoplasma celular se presenta bajo ciertas
condiciones fisiológicas de la célula y cuando existe una concentración crítica de
sustrato carbonado en el medio de cultivo.

La trehalosa es un dímero constituido por moléculas de glucosa unidas con un
enlace glucosídico α-1,1. Se ha observado que el contenido intracelular de trehalosa
varía en condiciones de cultivo poco favorables, tales como la limitación del
crecimiento por glucosa, nitrógeno, fosfato o azufre, temperaturas elevadas de
cultivo o choques osmóticos (Ertugay et al., 1997). Esto implicaría que la trehalosa
tiene la función de proteger a ciertas estructuras celulares (membranas) y las
proteínas presentes en el citosol cuando la célula no se encuentra en condiciones
óptimas de cultivo.

Figura 8. Estructura molecular de la trehalosa.

Existe una relación entre el contenido intracelular de trehalosa y la capacidad
que tiene la célula de resistir al secado o a la congelación (Grba et al., 1976). La
viabilidad de las levaduras secas o congeladas, una vez reconstituidas y en
condiciones normales de cultivo, es más elevada cuando su concentración
intracelular de trehalosa es mayor. Este fenómeno tiene evidentemente un cierto
interés industrial.

1.10 TREHALOSA

La trehalosa es un azúcar no reductor compuesto de dos moléculas de
glucosa unidas por un enlace glucosídico α-1,1 (Elbein, 1974). Distintos organismos
son capaces de sintetizar trehalosa, como plantas y animales superiores e inferiores,
bacterias, algas, levaduras, entre otros (Silljé et al., 1999).

Figura 9. En Saccharomyces cerevisiae, la trehalosa presenta dos funciones
principales: a) metabolito de protección celular y b) como molécula de reserva.

La trehalosa protege las estructuras biológicas del daño contra la desecación,
el frío, altas temperaturas, choque térmico y otros tipos de condiciones ambientales
desfavorables. Se ha propuesto que la trehalosa estabiliza a las enzimas, proteínas
y membranas deshidratadas. De acuerdo con esto, existe un gran interés en los
mecanismos de síntesis y regulación de trehalosa (Macario, 2000).

La trehalosa es utilizada por la levadura como fuente de energía cuando se
encuentra en un medio con pocos sustratos (Wiemken, 1990).

La concentración intracelular de este compuesto varía en función de la
disponibilidad de ciertos sustratos en el medio, y puede alcanzar hasta un 23 % del
peso seco de la célula según las condiciones de cultivo.

1.11 BIOSÍNTESIS DE TREHALOSA EN Saccharomyces cerevisiae

La biosíntesis de la trehalosa ocurre por completo en el citosol (Ertugay, 1997). El uridil-
glucosa difosfato, UDPG, dona la glucosa que se une a la glucosa-6-fosfato en una
reacción catalizada por la enzima trehalosa-6-fosfato sintetasa (6-fosfato transglucosidasa,
EC 2.4.1.15). Después, una fosfatasa específica (la trehalosa-6-fosfato fosfohidrolasa, EC
3.2.1.28) quita el fosfato de la trehalosa-6-fosfato para formar trehalosa. La trehalosa-6-
fosfato sintetasa y la trehalosa-6-fosfato fosfohidrolasa están asociadas en un complejo
enzimático denominado complejo TPS.

Figura 10. Biosíntesis de la trehalosa en Saccharomyces cerevisiae.
1.12 MODELOS PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO

El modelamiento es una herramienta poderosa mediante la cual se puede
describir el comportamiento actual y probable del crecimiento microbiano mediante
una teoría bien establecida que, cuando es descrita en términos matemáticos,
representa un modelo de trabajo del proceso. Para el establecimiento de un modelo,
el modelador debe conocer la naturaleza de todos los parámetros importantes del
proceso, sus efectos sobre el mismo y cómo pueden ser definidos en términos

11
cuantitativos (debe identificar las variables importantes y sus efectos por separado
sobre el proceso). La expresión matemática del modelo constituye un factor
determinante para la concepción básica y real del proceso. Una vez que se ha
formulado el modelo matemático, tiene que ser resuelto y comparado o validado con
datos experimentales bajo las mismas condiciones establecidas en el modelo.
Cualquier diferencia debe ser investigada para redefinirlo o mejorarlo hasta que
posea exactitud en la predicción de los datos experimentales. Así, el modelo servirá
para el diseño, optimización y control de procesos y para predecir el comportamiento
bajo nuevas condiciones de experimentación (Ordaz y Orozco, 1999).

Un modelo en el se represente al total de la población como un
microorganismo promedio, en el que su estado fisiológico se describa en función de
su velocidad de crecimiento, sin considerar variaciones en las estructuras internas
que lo componen, se clasifica como NO SEGREGADO Y NO ESTRUCTURADO. Si
en dicho modelo se tomaran en cuenta las estructuras internas, sus relaciones y
variaciones con el tiempo, se clasificaría como NO SEGREGADO Y
ESTRUCTURADO.

Los modelos que no consideran las variaciones entre los individuos de una
población se llaman no segregados y segregados a los que sí consideran las
variaciones. De acuerdo a esto, los modelos segregados serán de mayor precisión
que los no segregados, sin embargo, la precisión de estos últimos está en función
directa del tamaño de la población. Como en una población microbiana la densidad
de población comúnmente oscila por arriba de 107 individuos por mililitro, los
modelos no segregados se vuelven muy precisos.

NO ESTRUCTURADOS.

ESTRUCTURADOS.

NO
SEGREGADOS

El caso más idealizado.
La población celular se trata
como un solo componente.
Se considera que la “célula
promedio” consta de varios
componentes.

SEGREGADOS

Se considera solo un
componente con variaciones
entre los individuos.
Se consideran varios componentes
con variaciones entre los
individuos.

Tabla 1. Perspectivas de representación de los modelos cinéticos del crecimiento
microbiano.

En la literatura existe una diversidad de modelos cinéticos no estructurados.
Comúnmente estos modelos son empíricos y relacionan la velocidad específica de
crecimiento (µ) con una función relativamente sencilla de la composición del medio
de cultivo (concentración de sustrato, oxígeno disuelto, inhibidores, etc.). El modelo
de Monod es el más ampliamente utilizado en razón de su naturaleza relativamente
sencilla. En el se expresa que la µ de un microorganismo es una función de la
concentración del sustrato limitante (la fuente de carbono), dándose por hecho que
los demás se encuentran en exceso o por arriba de las mínimas necesidades del
microorganismo, como se ve en la siguiente ecuación:

12
µ µ = max
s
s ks+
(8)

en la que µmax es la velocidad específica de crecimiento máxima, ks la constante de
saturación del microorganismo por el sustrato y s la concentración del mismo. Las
constantes µmax y ks son función del microorganismo, del sustrato y de las
condiciones ambientales en las que se efectúa el crecimiento (Ks es la concentración
de sustrato que da como resultado que el microorganismo tenga una velocidad
específica de crecimiento igual a la mitad de su máxima).

1.13 INGENIERIA METABÓLICA

La ingeniería metabólica es una ciencia multidisciplinaria que utiliza los
principios y técnicas de la genética, la bioquímica, la biología molecular, la
bioinformática, la ingeniería bioquímica y las matemáticas para modelar, analizar y
dirigir los flujos bioquímicos hacia el incremento en la producción metabolitos de
interés industrial y médico (Nielsen, 2001).

La ingeniería metabólica consiste en el mejoramiento celular mediante la manipulación de
las funciones enzimática, de transporte o de regulación, usando la tecnología del DNA
recombinante. Inicialmente, la ingeniería metabólica sólo era considerada como la
aplicación de la biología molecular, pero con el rápido desarrollo de nuevas técnicas
analíticasy de clonación, fue posible introducir cambios genéticos directos y determinar
las consecuencias de esas modificaciones a nivel celular, por lo tanto, la ingeniería
metabólica está conformada tanto del análisis de las funciones celulares como de la
ingeniería genética (Bailey, 1991).

Un aspecto importante de la ingeniería metabólica es el análisis fisiológico
para comprender los mecanismos que ocurren dentro de las células. Este análisis
suele dividirse en tres partes:

1. Identificación de la estructura de la red metabólica o topología de ruta
bioquímica.
2. Cuantificación de los flujos en los puntos de bifurcación de la red
metabólica.
3. Identificación de las estructuras de control dentro de la ruta.

1.14 ANÁLISIS DEL CONTROL METABÓLICO

El Análisis del Control Metabólico fue desarrollado inicialmente por Kacser y
Burns en Escocia, y por Heinrich y Rapoport en la antigua Alemania Oriental. Este
análisis permite identificar y diseñar estrategias experimentales que puedan conducir
al mejoramiento de la característica deseada en un organismo (la acumulación de
metales pesados, la producción acelerada de etanol, de CO2, de lactato o de acetato
o la inhibición del flujo de una vía metabólica esencial con fines terapéuticos). A
través del Análisis del Control Metabólico es factible determinar cuantitativamente el
grado de control que ejerce cada una de las enzimas de una vía sobre el flujo y
sobre la concentración de cada intermediario. La adecuada aplicación de este

13
análisis evita embarcarse en una serie de experimentos de ensayo y error para tratar
de manipular una conceptualmente errónea “etapa limitante”.

El análisis de control metabólico establece que para entender cómo se
controla una vía, y eventualmente estar en posibilidad de manipularla, primero tiene
que evaluarse la estructura de control. La estructura de control consiste del
coeficiente de control de flujo, Cri, que es el grado de control que ejerce una enzima i
sobre el flujo r, el coeficiente de control de concentración, Cij, que es el grado de
control que ejerce una enzima i sobre la concentración de un intermediario
metabólico j, y los coeficientes de elasticidad. Los coeficientes de control son
propiedades sistémicas de la vía, que están a su vez determinados por los
coeficientes de elasticidad, εij, los cuales se definen como el grado de sensibilidad
(cambio en velocidad) de una enzima i a la variación en algunos de sus ligandos:
sustratos, productos o moduladores alostéricos.

1.15 COEFICIENTE DE CONTROL DE FLUJO

Estudia la sensibilidad del flujo total en el estado estacionario denominado r
con respecto a las actividades enzimáticas individuales dando valores constantes a s
y p:

X
r
r
X
C
ei
eir
i ;∂
∂
= (9)

Los coeficientes del flujo de control son definidos como valores relativos, son
independientes de las unidades utilizadas para calcularlos, son adimensionales y
tienen valores entre 0 y 1. Para algunos sistemas pueden tener valores negativos.

La enzima con un mayor coeficiente controla el flujo a través de la vía
metabólica; el incremento de la enzima se traduce en el incremento del flujo global.
Si Cir tiene un valor cercano a 1, la i enzima de la ruta es la que proporciona la
velocidad limitante. Si el valor tiende a cero esta enzima no ejerce un control
significante en el flujo. Se puede decir que la suma de los coeficientes de flujo de
control es igual a 1.

1
1
=∑
=
L
i
r
iC (10)
Esto es conocido como el Teorema de la Suma del Control de Flujo.
Especifica que si existe una activación o desactivación simultánea de todas las
enzimas por el mismo factor, o más preciso, si todas las velocidades de reacción de
la ruta cambian por el mismo incremento fraccional a, el flujo global cambia por un
factor (1+ a) y el nivel de todos los intermediarios permanece constante.

1.16 COEFICIENTES DE CONTROL DE LA CONCENTRACIÓN

14
Este coeficiente especifica el cambio relativo del intermediario j cuando el
nivel de la enzima i cambia. El nivel de los intermediarios no cambia cuando todas
las enzimas son cambiadas por el mismo factor a.

=ijC
ei
j
j
ei
X
X
X
X
∂
∂
(11)

0
1
=∑
=
L
i
ijC (12)

1.17 COEFICIENTES DE ELASTICIDAD

El coeficiente de elasticidad está definido por la ecuación (6), donde ri es la
velocidad neta de la reacción enzimática i. Un valor negativo de εji implica que
cuando el nivel del intermediario se incrementa la velocidad neta de la reacción i
decrece y viceversa.

j
i
i
j
ji X
r
r
X
∂
∂
=,ε (13)

Se puede apreciar el efecto que se tiene al incrementar un intermediario en la
velocidad de reacción de una de las enzimas, si el intermediario j no influye en la
velocidad de la reacción i, la velocidad de esta reacción es independiente de la
concentración de j, luego εji vale cero.

Los coeficientes de elasticidad están conectados con los coeficientes de
control de flujo a través del teorema de conectividad flujo-control:

0
1
, =∑
=
L
i
ji
r
iC ε (14)

2. ANTECEDENTES

En la literatura existen diversos artículos sobre los fundamentos del Análisis
del Control Metabólico y sus aplicaciones: Control of enzyme flux (Kacser y Burns,
1973), Metabolic control analysis in theory and practice (Bowden, 1995), Metabolic
control analysis: biological applications and insights (Wildermuth, 2001) y El Análisis
de Control de Flujo como herramienta en la manipulación de vías metabólicas
(Herrera, 2005).

Los estudios donde se aplica el Análisis del Control Metabólico en
microorganismos o células con fines de elucidar los factores que incrementan los
flujos metabólicos hacia la producción de un compuesto de interés son bastantes:

15
Metabolic control analysis of glycolysis in tuber tissue of potato (Solanum
tuberosum): explanation for the low control coefficient of phosphofructokinase over
respiratory flux (Mooney et al., 1997), Lactate dehydrogenase has no control on
lactate production but has a strong negative control on formate production in
Lactococcus lactis (Andersen, Pedersen y Jensen, 2001).

Saccharomyces cerevisiae también ha sido objeto de estudio por distintos
grupos de investigación dedicados a la ingeniería metabólica y el Análisis del Control
Metabólico en el mundo, se pueden citar: Metabolic Control Analysis of glycerol
synthesis in Saccharomyces cerevisiae (Cronwright, Rohwer y Prior, 2002), Control
of xylose consumption by xylose transport in recombinant Saccharomyces cerevisiae
(Gardonyi et al., 2003)

A pesar de los conocimientos bioquímicos disponibles sobre el metabolismo
de Saccharomyces cerevisiae y sobre la regulación de la síntesis intracelular de
trehalosa, los estudios cuantitativos que incluyen la modelación matemática del
fenómeno son relativamente pocos.

La investigación sobre la biosíntesis de trehalosa en Saccharomyces
cerevisiae han sido preferentemente dirigida hacia la evaluación de la acumulación
del metabolito bajos distintos tipos de estrés, ingeniería genética y la biología
molecular de la regulación de los genes del complejo trehalosa sintetasa: Effects of
various types of stress on the metabolism of reserve carbohydrates in
Saccharomyces cerevisiae: genetic evidence for a stress-induced recycling of
glycogen and trehalose (Parrou, Teste y François, 1997), Regulation of genes
encoding subunits of the trehalose synthase complex in Saccharomyces cerevisiae:
novel variations of STRE-mediated transcription control (Winderickx et al., 2002).

Sin embargo se han realizado modelos que describen la síntesis de este
disacárido en Saccharomyces cerevisiae como los siguientes: La regulación
bioquímica y genómica del ciclo de la trehalosa en la levadura mediante el análisis
de un “modelo canónico” (Voit, 2003), Acumulación de trehalosa en células de
Saccharomyces cerevisiae: Datos experimentales y modelaciónestructurada
(Aranda, Salgado y Taillandier 2004).

3. JUSTIFICACIÓN

Durante el proceso de manufactura de la levadura Saccharomyces cerevisiae
existe una disminución en su viabilidad, lo que le resta calidad al producto comercial.

La trehalosa es una sustancia de reserva para la célula, además contribuye a
la estabilidad de estructuras proteicas en el citoplasma, mejorando la viabilidad y la
vida de anaquel de la levadura.

Dadas las funciones y las características que confiere a la levadura, resulta
importante comprender las condiciones fisiológicas celulares y de operación del
cultivo del microorganismo bajo las cuales se intensifica la biosíntesis de la
trehalosa.

16
El uso de la levadura Saccharomyces cerevisiae como insumo en la industria
panificadora ha propiciado la investigación sobre el dímero intracelular trehalosa.

Un modelo cuantitativo y predictivo de la acumulación de la trehalosa en
Saccharomyces cerevisiae permitiría fundamentar diseños de producción de la
levadura para mejorar su calidad como insumo en la industria panificadora.

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Generar una ruta metabólica consistente para explicar la biosíntesis de
trehalosa en la levadura Saccharomyces cerevisiae, considerando su interacción con
el metabolismo energético del microorganismo.

4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

1. Elaborar una revisión de la teoría básica de la ingeniería metabólica y del
Análisis del Control Metabólico, ACM.
2. Revisar rutas bioquímicas propuestas para la biosíntesis de trehalosa con
propósitos de análisis metabólico.
3. Establecer la estequiometría del conjunto de reacciones que constituyan la
ruta metabólica construida para la biosíntesis de trehalosa.

17
4. Determinar las condiciones de experimentación para un cultivo observable de
Saccharomyces cerevisiae, conducente a la estimación de velocidades de
reacción de la ruta metabólica para la biosíntesis de trehalosa.

5. METODOLOGÍA

Figura 11. Estrategia metodológica para la determinación del control metabólico
de la biosíntesis de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae.

5.1 CONSTRUCCIÓN DE LA RED METABOLICA DE LA BIOSÍNTESIS DE
TREHALOSA EN Saccharomyces cerevisiae.

Se consultó la base de datos de la Kyoto Encyclopedia of Genes and
Genomes, KEGG, del Laboratorio Kanahisha del Centro de Bioinformática del
Instituto para la Investigación Química de la Universidad de Kyoto para recopilar la
información existente sobre las vías metabólicas involucradas en la síntesis de la
trehalosa.

Las vías metabólicas reportadas en la base de datos de la Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes son generales, por cual fue necesario
discriminar las reacciones que sí intervienen en el anabolismo de la trehalosa en
Saccharomyces cerevisiae de aquellas que no. Así pues, se eliminaron las
reacciones ajenas del metabolismo de Saccharomyces cerevisiae, obteniéndose de
esta forma únicamente las rutas bioquímicas propias de la levadura de interés.

Figura 12. Secuencia empleada para la obtención de las rutas involucradas la biosíntesis
de la trehalosa en S. cerevisiae partir de un mapa metabólico global.

Cabe mencionar que en la KEGG PATHWAY Datebase es posible identificar
las reacciones particulares de un organismo determinado de la ruta metabólica
global, por medio de la opción Pathway for, seleccionando de un listado que

20
contiene las especies más comúnmente estudiadas el requerido. La KEGG
PATHWAY Datebase marca de color verde las enzimas del organismo especificado.

Finalmente, se armó la red metabólica de la biosíntesis de trehalosa en
Saccharomyces cerevisiae, empleando compuestos comunes entre las diferentes
rutas aisladas como puntos de unión, usando el editor de imágenes JPhotoBrush
Pro 1.3.

5.2 ELABORACION DE LA BASE DE DATOS CMBTSc

Para la elaboración de la base de datos CMBTSc (por sus siglas en español,
Control Metabólico de la Biosíntesis de Trehalosa en Saccharomyces cerevisiae) fue
necesario, primeramente, establecer qué información sería útil durante el desarrollo
del proyecto. Fue menester considerar entonces las actividades posteriores a la
construcción de la red metabólica: la consolidación de la ruta bioquímica generada,
la determinación de los coeficientes estequiométricos, el cálculo de las velocidades
de reacción y de los coeficientes de sensibilidad. Los temas fueron dos: compuestos
(sustratos y productos) y enzimas.

Existen muchas bases de datos que contienen una abundante gama de
información científica sobre enzimas. Se eligieron dos: nuevamente la KEGG del
Laboratorio Kanahisha de la Universidad de Kyoto y la BRENDA - The
Comprehensive Enzyme Information System del Dr. D. Schomburg del Instituto de
Bioquímica de la Universidad de Köln.

Figura 13. Sitos Web empleados para la recopilación de la información referente a los
compuestos y enzimas que participan en la síntesis de la trehalosa en S. cerevisiae.

El llenado de la base de datos CMBTSc se realizó con la información
contenida en los sitios Web: http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html y
http://www.brenda.uni-koeln.de/

21
Los datos compilados sobre los compuestos fueron: clave KEGG, nombre
sistemático en español e inglés, fórmula, peso molecular y estructura química. Para
las enzimas se buscó: número EC, nombre común, nombre sistemático, reacción
catalizada, balances carbono-mol, reversibilidad (KEGG y BRENDA), cofactores y
comentarios adicionales.

5.3 CONSOLIDACIÓN Y SIMPLIFICACIÓN DE LA RED

Para verificar la consistencia de la vía biosintética propuesta y además
simplificarla, se consideraron cuatro metodologías: el Algoritmo para el Diseño de
Rutas Metabólicas (Mavrovouniotis, 1990), el Agrupamiento de Reacciones para la
Síntesis de Rutas Metabólicas (Stephanopoulos y Nielsen, 1998), La distribución de
Flujos en Bifurcación (Quian y Bassingthwaighte, 2000) y el Teorema de las
Propiedades Conservativas (Zevedei-Oancea y Schuster, 2003). Son pocas las
referencias existentes al respecto, finalmente se optó por el método propuesto por
Mavrovouniotis porque se encontró en éste un sólido fundamento teórico y una
notable facilidad en su realización. (Ver ANEXO 2, ALGORITMO PARA EL DISEÑO
DE RUTAS METABÓLICAS)

5.4 DETERMINACIÓN DE LOS COEFICIENTES ESTEQUIOMÉTRICOS.

Se determinaron los coeficientes estequiométricos (base carbono mol) de
cada reacción considerando lo siguiente:

1. Los coeficientes se expresaron de manera fraccional simplificada.
2. Sólo por convención, se utilizó como referencia el metabolito con mayor
número de carbonos para hacer el balance carbono-mol.
3. En los compuestos carentes de átomos de carbono en su estructura (ATP,
NADH, NADPH) se consideraron los coeficientes como moles de compuesto
por mol de carbono.
4. Los metabolitos no participantes directamente en la transferencia de grupos
carbonados o que no estuvieran contemplados en la red, se descartaron del
balance.
5. En las moléculas transportadoras de materia, el balance fue referenciado al
grupo carbonado únicamente.
6. No se consideraron las moléculas de agua ni las de fosfato inorgánico. (Ver
ANEXO 3, CRITERIOS USADOS EN EL BALANCE CARBONO MOL).

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Del trabajo Modelación de la síntesis de trehalosa en Sacharomyces
cerevisiae mediante análisis metabólico (Aranda, Medina y Urbán, 2006), se tomó la
ruta bioquímica propuesta para la biosíntesis de trehalosa para comprobar su
consistencia. Dicha vía metabólica simplificada está formada por 15 reacciones. No
se indica porque fueron consideradas esas reacciones y no otras, ni la fuente donde

22
se consultaron, únicamente se cita que es la ruta metabólica para la biosíntesis de
trehalosa.

Despuésde una revisión bibliográfica, se encontró que dicha red no poseía
suficiente información bioquímica, particularmente del metabolismo anaplerótico, del
nitrógeno, del azufre y de los aminoácidos. Por lo cual se construyó una nueva ruta
contemplando 82 compuestos (sustratos y productos) y 83 reacciones participantes
en 12 vías metabólicas que se consideraron como las involucradas en la biosíntesis
del disacárido y el metabolismo energético.

G(med) G(cel)G-6P T
P E
AcCoA
CO2
CO2
CO2
NH3 CO2
2 NAD
NAD
NAD
NAD
2 NADH
NADH
CoA
CoA
UDP+
NADH
NADH
ADP
ADP
ADP
3 ADP
ATP
ATP
ATP
2 NADH
NADH
FADH
FAD2 NAD
NAD
NAD
NADH
3 ATP
O
3 ATP
2 ATP
NADH + ½ O2
FADH + ½ O2
UTP UDPG
GLU
GLUT C
α-CG
r15
r14
r12 r13
r11
r10
r1
Pi
Pi

Figura 14. Red metabólica simplificada a 15 reacciones para la biosíntesis
de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae.

Figura 15. Mapa metabólico integrado por las 83 reacciones involucradas en la biosíntesis
de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae.

Se elaboró una base de datos en EXCEL denominada CMBTSc donde se
incluyeron diversos listados con información útil, entre la que destaca la relacionada
con los sustratos y productos integrantes del mapa metabólico hecho (la clave
KEGG del compuestos, sus nombres sistemáticos, sus fórmulas condensadas, sus
pesos moleculares y sus respectivas estructuras).

La base de datos CMBTSc tiene un apartado dedicado a las enzimas que
catalizan las 83 reacciones del mapa bioquímico propuesto, donde se especifican
sus números EC, sus nombres comunes y sistemáticos, las reacciones que
efectúan, sus cofactores, la reversibilidad que presentan (dato necesario para la
construcción de la ruta amplificada y en la aplicación del Algoritmo para el Diseño de
Rutas Metabólicas de Mavrovouniotis).

Figura 16. Apartado Compuestos de la base de datos CMBTSc.

Figura 17. Apartado Enzimas de la base de datos CMBTSc.

Se determinaron los coeficientes estequiométricos para los metabolitos
involucrados en la biosíntesis de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae, aplicando
las consideraciones descritas en el punto 5.4. Cabe mencionar que los coeficientes
estequimétricos son importantes porque a partir de sus valores surge la matriz
estequiométrica total, Τ, indispensable en el cálculo de las velocidades intracelulares
r, de las cuales la correspondiente a la síntesis de trehalosa se pretende usar con
fines de modelación. (Ver ANEXO 3)

Figura 18. Apartado Reacciones vía trehalosa de la base de datos CMBTSc donde se
encuentran los valores de los coeficientes estequimétricos para los metabolitos
involucrados en la biosíntesis de trehalosa.

Se aplicó el Algoritmo para el Diseño de Rutas Metabólicas de
Mavrovouniotis. En la base de datos CMBTSc, se programaron hojas de cálculo con
las funciones necesarias para llevar acabo paso por paso la metodología descrita en
el ANEXO 2 pero para la red metabólica de la biosíntesis de trehalosa en
Saccharomyces cerevisiae.

Figura 19. Apartado Algoritmo compuestos de la base de datos CMBTSc donde se aplicó
el Algoritmo para el Diseño de Rutas Metabólicas propuesto por Mavrovouniotis.

El resultado del algoritmo son todas las posibles vías consistentes mediante
las cuales Saccharomyces cerevisiae puede sintetizar trehalosa empleando como
sustratos glucosa, amonio, sulfato y oxígeno.

Figura 20. Apartado Algoritmo compuestos de la base de datos CMBTSc después de aplicar
56 veces el Algoritmo para el Diseño de Rutas Metabólicas propuesto por Mavrovouniotis.

Se realizaron 56 pasos del Algoritmo de Mavrovouniotis. Se construyeron
rutas simplificadas (Ver Figura 22 y Figura 23), usando las reacciones obtenidas
después de la aplicación del algoritmo. Fue necesario considerar como una
combinación no válida aquella donde se incluyera una reacción reversible porque
significaría truncar la secuencia que permite generar el producto requerido a partir
de los sustratos establecidos.

Figura 21. Apartado Construcción vía de la base de datos CMBTSc donde se seleccionaron
reacciones (en rojo) para construir rutas simplificadas para la biosíntesis
de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae.

Figura 22. Ruta para la biosíntesis de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae
simplificada a 13 reacciones usando el algoritmo de Mavrovouniotis.

Figura 23. Ruta para la biosíntesis de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae
simplificada a 11 reacciones usando el Algoritmo de Mavrovouniotis.

Con base en el Algoritmo de Mavrovouniotis se evidenció que la acumulación
de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae puede darse por distintas vías, sin
embargo, la forma que una cepa utiliza depende de la maquinaria enzimática que
ésta posea, así mismo de las condiciones ambientales y fisicoquímicas del medio
donde el cultivo crezca, que puede favorecer la síntesis y/o actividad de
determinadas enzimas involucradas en las diferentes rutas anabólicas de la
trehalosa.

Por otra parte, se obtuvo que 11 de las 12 rutas bioquímicas consideradas en
un principio sí participan en la biosíntesis de trehalosa y el metabolismo energético
en Saccharomyces cerevisiae, éstas son:

1. Glicólisis
2. Gluconeogénesis
3. Ciclo de Krebs
4. Ciclo del glioxilato
5. Fosforilación oxidativa
6. Metabolismo del nitrógeno
7. Metabolismo del azufre
8. Metabolismo del glutamato
9. Metabolismo de la alanina y el aspartato
10. Metabolismo de la glicina y serina
11. Metabolismo de la cisteína

La vía de las pentosas fosfato se descartó después de analizar los resultados
del algoritmo. Quedó demostrado que los intermediarios de esta ruta bioquímica no
intervienen directamente con el metabolismo del dímero trehalosa.
Experimentalmente, se ha visto que la acumulación de este compuesto en
Saccharomyces cerevisiae ocurre bajo condiciones de crecimiento adversas, en las
cuales, la vía de las pentosas disminuye su actividad, sin embargo, la síntesis de la
trehalosa no se afecta. El algoritmo arroja evidencia que las dos vías no están
íntimamente relacionadas de modo que pueden llevarse a cabo
independientemente.

Finalmente, se formó la matriz estequiométrica total, que contiene los
coeficientes de los metabolitos incluidos en la ruta simplificada, con la cual es
posible relacionar las velocidades volumétricas cuantificables con las velocidades
intracelulares. De las últimas, la que interesa es la de formación de trehalosa con
fines de modelación.

1 α-D-Glucosa + (1/6) ATP→α-D-Glucosa-6P
2 α-D-Glucosa-6P→Piruvato + (1/2) ATP + (1/3) NADH
3 α-D-Glucosa + α-D-Glucosa-6P + (1/6) ATP→ (2) α,α-Trehalosa
4 α,α-Trehalosa→D-Glucosa
5 (3/2) Piruvato→Etanol + (1/2) CO2
6 (6) IsoCitrato + (3) Piruvato + CO2 + ATP+ NADH→ (10) 2-Oxo-Glutarato
7 (5/6) 2-Oxo-Glutarato + (1/6) CO2 + (1/3) NADPH→ IsoCitrato
8 2-Oxo-Glutarato + (1/5) Amonio + (1/5) NADH→L-Glutamato
9 L-Glutamato→2-Oxo-Glutarato + (1/5) Amonio + (1/5) ATP + (1/5)NADH
10 (2) Metilentetrahidrofolato + CO2 + (4) 2-Oxo-Butanoato + (2) Amonio + Sulfato + (2) ATP + NADH + NADPH → (7) Cistationina
11 O2 + NADH→ATP

Tabla 2. Las 11 reacciones que forman la ruta simplificada para la biosíntesis de trehalosa
en Saccharomyces cerevisiae usando el Algoritmo de Mavrovouniotis.

COMPUESTOS r1 r2 r3 r4 r5 r6 r7 r8 r9 r10 r11
α-D-Glucosa -1 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0
Amonio 0 0 0 0 0 0 0 -1/5 1/5 -2 0
Sulfato 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0
O2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1
α-D-Glucosa-6P 1 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0
Piruvato 0 1 0 0 -3/2 -3 0 0 0 0 0
IsoCitrato 0 0 0 0 0 -6 1 0 0 0 0
2-Oxo-Glutarato 0 0 0 0 0 10 -5/6 -1 1 0 0

Tabla 3. Matriz estequiométrica total de la ruta para la biosíntesis de trehalosa en
Saccharomyces cerevisiae simplificada a 11 reacciones.

Mediante el análisis metabólico es posible determinar como se distribuyenlos
flujos de carbono a través de las diversas rutas bioquímicas dentro de la célula.
Estos flujos pueden ser modificados, sin embargo, es necesario primeramente
determinar la estructura de control para la red metabólica en cuestión, por lo cual es
indispensable verificar la consistencia de la red, para que los resultados tengan un
fundamento que los avale.

Un requisito para aplicar el análisis de las velocidades de reacción es la
construcción de una ruta bioquímica consistente para la acumulación de trehalosa
intracelular. Si no se dispone del esquema de reacciones que conllevan a la
producción de trehalosa, no es posible generar análisis confiables de las velocidades
de reacción correspondientes.

La estructura de control está compuesta por los coeficientes de control de
flujo, de control concentración y de elasticidad. Sus valores representan la variación
del los flujos si se modifican ya sea la concentración de una enzima, la
concentración de un metabolito intermediario o de factores que alteren la actividad
enzimática. Teniendo entonces las posibles rutas bioquímicas mediante las cuales
Saccharomyces cerevisiae sintetiza trehalosa es factible elucidar los sitios de control
empleando métodos experimentales o aproximaciones matemáticas. Para este caso
en particular se recurrirá al modelaje matemático y al análisis de elasticidades
posteriormente.

7. CONCLUSIONES

Se generaron dos rutas simplificadas consistentes para la descripción de la
biosíntesis de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae.

Se evidenció que la acumulación de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae
puede darse por distintas vías cada una con un conjunto de enzimas particular.

La forma que una cepa utiliza depende de la maquinaria enzimática que ésta
posea.

L-Glutamato 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 0
D-Glucosa 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
α,α-Trehalosa 0 0 2 -1 0 0 0 0 0 0 0
Etanol 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
CO2 0 0 0 0 1/2 -1 -1/6 0 0 -1 0
ATP -1/6 1/2 -1/6 0 0 -1 0 0 1/5 -2 1
NADH 0 1/3 0 0 0 -1 0 -1/5 1/5 -1 -1
NADPH 0 0 0 0 0 0 -1/3 0 0 -1 0
2-Oxo-Butanoato 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -4 0
Metilentetrahidrofolato 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -2 0
Cistationina 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0

30
Al analizar la red simplificada de 15 reacciones para la biosíntesis de
trehalosa en Saccharomyces cerevisiae se encontraron significativas deficiencias,
particularmente en el metabolismo de compuestos anapleróticos, del nitrógeno, del
azufre y de algunos aminoácidos.

Se construyó un mapa metabólico global para la biosíntesis de la trehalosa en
Saccharomyces cerevisiae compuesto por 83 reacciones.

Se elaboró la base de datos CMBTSc que contiene información referente a
los 82 compuestos y 83 enzimas que integral el mapa metabólico propuesto para la
biosíntesis de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae.

Se formó la Matriz Estequiométrica Total a partir de los coeficientes
estequiométricos de los metabolitos intermediarios de una ruta simplificada
compuesta por 11 reacciones.

8. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES.

Cronograma de actividades
Febrero de 2006 a Febrero de 2007 M A M J J A S O N D E F M
Revisión bibliográfica. X X X X X X X X X X X X X
Revisión de rutas bioquímicas
involucradas en el metabolismo de
la trehalosa en S. cerevisiae.
X X X X X X X
Revisión de métodos para el diseño
de rutas bioquímicas. X X X X X

31
Aplicación de la metodología
seleccionada para la construcción
de rutas simplificadas para la
síntesis de trehalosa.
X X X
Determinación de los coeficientes
estequiométricos y generación de la
Matriz Estequiométrica Total a partir
de las reacciones de las rutas
simplificadas.
X X X
Redacción de informes. X X

32
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Saccharomyces cerevisiae y usos en el sector alimentario. Tecnol. de
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13. Macario J. (2000). Stressors, stress and survival: overview. Frontiers in
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33
14. Márquez, J., Figueroa C., Vázquez L., Calderón A. y Valenzuela E. (2005).
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sintasa de plantas de Selaginella lepidophylla totalmente hidratadas.
Tesis de maestría del primer autor.

15. Mavrovouniotis M. (1990). Computed-Aided Synthesis of Biochemical
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35
ANEXO 1

ALGUNAS VERSIONES DEL MAPA METABOLICO DE LA BIOSINTESIS
DE TREHALOSA EN Saccharomyces cerevisiae.

Figura A. Red metabólica simplificada a 15 reacciones para la biosíntesis
de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae.

Figura B. Red metabólica de la biosíntesis de trehalosa en
Saccharomyces cerevisiae v. 3.5 (77 reacciones)

Figura C. Red metabólica de la biosíntesis de trehalosa en
Saccharomyces cerevisiae v. 10.1 (91 reacciones)

Figura D. Red metabólica de la biosíntesis de trehalosa en
Saccharomyces cerevisiae v. 12 (83 reacciones)

39
ANEXO 2
ALGORITMO PARA EL DISEÑO DE RUTAS METABÓLICAS

El algoritmo descrito por Mavrovouniotis permite construir rutas metabólicas de
manera consistente, obteniendo todas las vías bioquímicas posibles para llegar de un sustrato
hasta un metabolito de interés.

A continuación se detalla una descripción del algoritmo partiendo de una red
compuesta de 10 reacciones donde se buscan las posibles vías para llegar al metabolito L
desde el sustrato A:

Fig1. Ruta propuesta por Mavrovouniotis.
Todos los metabolitos son designados como reactivos excluidos y productos excluidos
con excepción de A que es un reactivo requerido y de L que es un producto requerido. Un
reactivo o producto excluido no puede participar en una ruta tal que implique que un reactivo
tenga que ser provisto externamente, o en el caso del producto, que sea el metabolito de
interés.

El primero paso consiste en integrar al conjunto de reacciones, las inversas en los
casos donde exista reversibilidad. Cada reacción se considera como una ruta de un solo paso.

Se enlistan separadamente cada metabolito y las rutas en las que participa. Utilizando
la convención de que al juntar ciertas rutas, estas estarán entre corchetes, e.g. [2a, 2(-g), b]
será la construcción lineal de la combinación de las reacciones a, -g y b con coeficientes 2, 2 y
1 respectivamente, y para representar la transformación que realiza esta vía se usa la
expresión 2E B+C. Y estas pueden ser combinadas en 2E [2a, 2(-g), b] B+C. Usando
esta notación, la ruta problema se escribe:

Fig 2. Reacciones en un solo sentido (reversibles e irreversibles).
Y el arreglo de metabolitos con las vías en las que participan queda como:

Fig 3. Primer arreglo de metabolitos y reacciones, Mavrovouniotis.
Siguiendo el algoritmo, los metabolitos que participan in pocas reacciones deben ser
procesados primero. Aquí L que participa solo en una reacción se procesa primero. L es un
producto requerido (y un reactivo excluido). Por que L se produce en una ruta parcial y no es
consumido por ninguna otra, por lo que al procesar este metabolito no se cambia ninguna ruta.
El metabolito que se procesa después debe ser A o B, el orden en que estos dos son
procesados no afecta los resultados, así que arbitrariamente se escoge B. Una nueva ruta se

41
construye: [a,b] como combinación de [a] y de [b]; esta operación se denota como [a]+ [b]=
[a,b]. Notar aquí que no es permitido construirla ruta [a,b]- [a,b], por que involucraría la
misma reacción en ambas direcciones y se haría un “bucle trivial” sin lograr ninguna
transformación. Después de combinar [a,b] las reacciones [a], [b] y [-b] se borran de la base
de datos de las reacciones, esto reduce el conjunto de rutas como sigue:

Fig 4. Primera transformación reacciones, Mavrovouniotis.
Y el conjunto de metabolitos actualizado que necesitará ser procesado queda como:

Fig 5. Segundo arreglo metabolitos, Mavrovouniotis.
El metabolito A se procesa en seguida. Como A es un reactivo requerido y un
producto excluido, una nueva combinación se construye como [-g]+[a,b]=[-g,a,b] y solo la
reacción [-g] es eliminada. Para el siguiente paso G se selecciona arbitrariamente entre G, H y
K, que participan en el mismo número de reacciones. Al procesar G hay dos rutas que lo

42
consumen [-k] y [m], y dos rutas que lo producen [h] y [k]. Por lo tanto se construirán cuatro
combinaciones posibles, excepto que [k] no puede ser combinada con [-k]. Habrá solo tres
legítimas combinaciones, [h] + [-k] = [h,-k]; [h] + [m] = [h,m]; [k] + [m] = [k,m]; se eliminan
las rutas en las que originalmente participaba G y después de procesar A y G las rutas activas
quedan:

Fig 6. Segundo arreglo rutas, Mavrovouniotis.

El conjunto de metabolitos que necesitará ahora ser procesado queda:

Fig 7. Tercer arreglo metabolitos, Mavrovouniotis.
El metabolito H y K participan en cuatro rutas, se escoge K.
Se crean las combinaciones [d] + [e] = [d,e] y [-e] + [-d] = [-e,-d] y las rutas [d], [e], [-e] y [-
d] son eliminadas. El conjunto de rutas activas se transforma a:

Fig 8. Tercer arreglo rutas, Mavrovouniotis.
El conjunto de metabolitos que necesitará ahora ser procesado queda:

Fig 9. Cuarto arreglo metabolitos, Mavrovouniotis.
Procesando H de manera similar, dos combinaciones de rutas son posibles, [-f] + [-e,-
d] = [-f,-d,-e] y [d,e] + [f] = [d,e,f]; es necesario mencionar nuevamente que las rutas que
involucren la misma reacción en el sentido contrario no son construidas. Las rutas quedan
como:

Fig 10. Cuarto arreglo rutas, Mavrovouniotis.
El conjunto de metabolitos que necesitará ahora ser procesado queda:

Fig 11. Quinto arreglo metabolitos, Mavrovouniotis.
Como D participa solo en cuatro rutas, es el siguiente en procesarse. El hecho de que
el coeficiente de D en las reacciones [d,e,f] y [-d,-e,-f] sea 2 debe ser reflejado en la
construcción de las combinaciones. Las nuevas rutas se construyen como 2[c] + [d,e,f] =
[2c,d,e,f] y [-f,-e,-d] + 2[-c] = [2(-c),-f,-e,-d] y las que involucraban a D son eliminadas. El
conjunto de rutas se convierte ahora en uno significativamente pequeño.

Fig 12. Quinto arreglo reacciones, Mavrovouniotis.

Solo tres metabolitos necesitan ahora ser procesados:

Fig 13. Sexto arreglo metabolitos, Mavrovouniotis.
Como C participa solo en cuatro reacciones es el siguiente en procesarse dejando dos
combinaciones: 3[a,b] + [2c,d,e,f] = [3a,3b,2c,d,e,f] y 3[-g,a,b] + [2c,d,e,f] = [3(-
g),3a,3b,2c,d,e,f]. Después de eliminar las cuatro rutas originales las nuevas quedan como
sigue:

Fig 14. Sexto arreglo rutas, Mavrovouniotis.
Quedan entonces solo dos metabolitos de ser procesados:

Fig 15. Séptimo arreglo metabolitos, Mavrovouniotis.
Los metabolitos de la Fig participan en el mismo número de rutas y pueden ser
procesados en orden tal que nos lleve al resultado final. Si se procesa F primero se llega a tres
combinaciones posibles: [3a,3b,2c,d,e,f] + [k,m] = [3a,3b,2c,d,e,f,k,m]; [h,m] + [k,m] =
[h,k,2m]; y [3(-g),3a,3b,2c,d,e,f] + [k,m] = [3(-g),3a,3b,2c,d,e,f,k,m]. Después de eliminar las
vías originales donde F participa las rutas restantes son:

Fig 16. Séptimo y último arreglo de rutas eliminado metabolito F,
Mavrovouniotis.
El metabolito restante sin procesar E participa en las cuatro rutas y deja las siguientes
combinaciones: (1/3)[3a,3b,2c,d,e,f,k,m] + (2/3)[3(-g)3a,3b,2c,d,e,f,k,m] = [2(-
g),3a,3b,2c,d,e,f,k,m]; [3a,3b,2c,d,e,f,k,m] + 2[h,k,2m] = [3a,3b,2c,d,e,f,3k,5m,2h]; y la mas
simple [g] + [h,k,2m] = [g,h,k,2m]. Cabe destacarse aquí que se utilizaron los coeficientes
fraccionales (1/3 y 2/3 enlugar de 1 y 2) para obtener números mas pequeños, aunque el
resultado es el mismo si se divide todo entre 3. Claramente se aprecia que el resultado de
conjuntar las vías no se afecta si se multiplica por constantes. Lo único que importa es la
proporción molar de los metabolitos. Por lo tanto las rutas finales son:

Fig 17. Rutas finales producto del algoritmo, Mavrovouniotis.
Estas tres rutas son soluciones de síntesis para el problema original (Fig). Todas las
demás vías son combinaciones lineales de este conjunto, con coeficientes positivos. Se puede
observar también que solo dos de las vías anteriores son linealmente independientes ya que la
marcada con [P2] en la figura se puede obtener como [P1] + 2[P3]. Sin embargo el conjunto
de enzimas de [P2] no es el mismo que el de [P1] o el de [P3] la enzima g esta presente en
[P1] y [P3] pero no en [P2]. Según lo deseado las tres rutas obtenidas son completamente
útiles. Si se quiere una producción alta del metabolito se aprecia que [P3] es la mejor de las
tres rutas. Este algoritmo permite construir rutas consistentes aparte de sintetizarlas, ya que
parte de una ruta real completa. En todos los casos las rutas generadas por el algoritmo
dependen de las condiciones fisiológicas de las células regidas por las condiciones de cultivo,
genéticas, etc. Es posible con esto especificar flujos de carbono y rendimientos para algún
sustrato determinado.

ANEXO 3

EJEMPLOS SIGNIFICATIVOS DEL BALANCE CARBONO MOL

Para el caso de la reacción:

Se elige a la trehalosa como compuesto referencia para el balance porque es el
metabolito que, en la reacción, posee mayor número de átomos de carbono en su estructura,
por lo tanto, los coeficientes estequiométricos se determinan dividiendo el número de átomos
de carbono de cada compuesto entre el número de átomos del compuesto de referencia.
Entonces el balance queda:

Sin embargo, como las moléculas de agua y el fosfato inorgánico no se consideran en
el balance final, la reacción queda simplificado como:

Dada la reacción:

El UDP se elimina porque no participa directamente en la transferencia de grupos
carbonados, luego, el metabolito con mayor número de átomos de carbono es la trehalosa con
12. Entonces el balance resulta en lo siguiente:

Una vez simplificada la reacción queda como:

Otro ejemplo:

El NAD no está incluido en la vía por lo tanto se descarta, el malato y el oxaloacetato
tienen 4 carbonos en su estructura por lo que el balance resultante es el mismo si se escoge a
uno o el otro. El NADH no tiene átomos de carbono pero participa en la ruta compuesta,
entonces el balance carbono-mol queda: