Ricardo-Axayacatl-Gonzalez-Garcia

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA 
MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS 
 
 
TESIS 
“FLUJOS METABÓLICOS EN Escherichia coli: AFECTACIÓN 
DEL CO2 DISUELTO EN LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA 
VERDE FLUORESCENTE” 
 
PRESENTADA PARA OBTENER EL GRADO DE: 
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS 
 
 
POR: 
RICARDO AXAYÁCATL GONZÁLEZ GARCÍA 
INGENIERO BIOTECNÓLOGO 
 
DIRIGIDA POR: 
DR. JUAN SILVESTRE ARANDA BARRADAS 
DR. EDGAR SALGADO MANJARREZ 
 
 
MEXICO, D. F. MAYO 2012 
 
II 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
I 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
II 
 
 
 
 
 
III 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
IV 
 
 
 
 
 
V 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
VI 
 
 
 
 
 
VII 
RESUMEN 
 
La producción de proteínas recombinantes ocupa un lugar importante en el mercado mundial 
debido a las ganancias que genera. Aun cuando se han obtenido resultados exitosos durante la 
obtención de cepas recombinantes, este proceso aun presenta cierta aleatoriedad, pues se 
desconocen los efectos puntuales de las modificaciones genéticas sobre el metabolismo celular. 
Por otro lado, el uso de cultivos celulares de alta densidad ha sido una de las estrategias para 
alcanzar altas productividades de proteínas recombinantes en sistemas procariontes, lo cual 
conlleva una acumulación de CO2 disuelto en el medio de cultivo. Este hecho genera alteraciones 
metabólicas que repercuden en la productividad. 
En el presente trabajó, se desarrolló un modelo metabólico simplificado que consta de 51 
reacciones con el cual se evaluó el efecto metabólico y termodinámico que tiene la presencia de 
CO2 disuelto sobre la producción de una proteína recombinante (proteína verde fluorescente, GFP) 
en una cepa transformada de Escherichia coli (W3110/pV21). Los datos cinéticos de cultivos en 
lote de la cepa recombinante fueron tomados de Baez et al. (2009), y los cambios metabólicos 
fueron analizados durante dos fases: crecimiento en glucosa y crecimiento en acetato. 
Los resultados obtenidos muestran que un efecto acoplado entre la fuente de carbono utilizada 
por la bacteria y la cantidad de CO2 disuelto en el medio sobre la velocidad específica de síntesis 
de GFP. Durante la etapa de crecimiento en glucosa, el aumento en la concentración de CO2 
disuelto provoca una acumulación del flujo de carbono en piruvato, lo cual induce la producción 
de acetato. También se incrementa la velocidad específica de síntesis de GFP debido a la 
asimilación de carbono vía carboxilación de fosfoenolpiruvato. Sin embargo, durante la fase de 
crecimiento en acetato se alcanzó una velocidad mayor de síntesis de GFP al incrementar la 
presión parcial de CO2 hasta 150 mbar. Así, el carbono es asimilado vía acetil coenzima A y se 
incorpora al ciclo de los ácidos tricarboxílicos, abasteciendo de suficientes precursores 
metabólicos para la síntesis de aminoácidos. 
Desde el punto de vista energético, si bien los niveles de ATP y NADH en la célula resultaron 
menores durante el crecimiento en acetato, aun así la producción de estos permitió dar abasto a 
la demanda energética para el mantenimiento de las funciones celulares, con la ventaja de que se 
logra una mayor velocidad de síntesis de GFP. 
En lo referente al análisis termodinámico del sistema planteado, el estado metabólico de la célula 
durante el crecimiento en acetato cambia, pues la concentración de metabolitos intracelulares se 
ve reducida, haciendo que las reacciones bioquímicas se vean favorecidas al presentar valores más 
negativos de energía libre. 
 
 
 
 
 
VIII 
ABSTRACT 
 
Recombinant proteins production has a very important place in world market because of its profits. 
Although of the successful results in the obtaining of recombinant strains, this process presents 
some uncertainty since the effects of genetic modifications over cellular metabolism remain 
unknown. On the other side, the use of high density cell cultures has been one of the principal 
strategies to reach high productivities of recombinant proteins in recombinant prokaryotic 
systems. This fact produces an increment in dissolved CO2 concentration, which causes alterations 
in cellular metabolism and fluctuations in the productivity. 
In the present work, a simplified metabolic model with 51 reactions was developed. The model 
allowed the evaluation of metabolic and thermodynamic effects of the dissolved CO2 in culture 
media over the expression of a recombinant protein (green fluorescent protein, GFP) in a 
genetically transformed strain of Escherichia coli (W3110/pV21). All kinetic data was taken from 
Baez et al. (2009) and the metabolic changes were analyzed in two growth phases: growth on 
glucose and growth on acetate. 
Results showed the existence of a coupled effect between carbon source and the amount of 
dissolved CO2 in culture media over the specific rate of GFP synthesis. During the glucose growth 
phase, the increment in the amount of dissolved CO2 caused a carbon overflow towards pyruvate, 
which induced acetate production. Also, there was a rise in the specific rate of GFP synthesis 
because of the assimilation of carbon via phosphoenolpyruvate carboxylation. Despite of this, 
during acetate growth phase the specific rate of GFP synthesis reached the highest value at 150 
mbar of partial pressure. It means that carbon was assimilated via acetyl coenzyme A and then 
entered to the tricarboxylic acids cycle, supplying enough precursor metabolites for the synthesis 
of aminoacids. 
Energetically, even though ATP and NADH levels in cell were lower in the acetate growth phase, 
their production was enough to supply the energetic requirements to maintain cellular functions. 
In addition, it allowed the highest GFP rate. 
In regards to the thermodynamic analysis, there was a swift in the metabolic state of the cell. Once 
glucose was consumed totally and acetate was used as carbon source, the intracellular 
metabolites concentration fell and consequently all biochemical reaction became more favorable. 
 
 
 
 
 
 
 
 
IX 
AGRADECIMIENTOS 
 
A mi familia, por el apoyo incondicional durante éste proceso. 
 
A mis padres, Rosario y Jaime, quienes han sido mi principal motivación. 
A mis hermanos, Jaime y Víctor, por el apoyo brindado. 
 
 
A mis amigos, quienes en todo momento han sido un pilar para mantenerme de pie. 
 
A Iliana, Paola, Karo, Eve, Montse, quienes me soportaron en las buenas y en las malas. 
A Nadia, por todos esos momentos compartidos. 
A Inés, de quien aprendí que para lograr grandes cosas, hay que tener primero grandes 
aspiraciones. 
 
 
A mis profesores, de quienes aprendí que el conocimiento no solo está en las aulas. 
 
 
A mis asesores, Dr. Juan Aranda y Dr. Edgar Salgado, por su enseñanzas y su ejemplo, pero sobre 
todo, por el apoyo y confianza depositados en mi persona. 
 
 
A los miembros de mi Comité Tutorial y Jurado Evaluador, por sus observaciones, aportaciones y 
críticas, sin las cuales este trabajo no sería lo que hoy es. 
 
 
Al grupo de investigación dirigido por el Dr. Octavio Tonatiuh Ramírez en el Instituto de 
Biotecnología de la UNAM, quienes conceptualizaron las bases del tema central de esta Tesis, y 
que con los resultados de este trabajo, se complementa. 
 
 
A la UPIBI, por haber sido más que una segunda casa. 
 
 
Al Instituto Politécnico Nacional, que a lo largo de esta jornada no solo me dio conocimientos, sino 
una educación. 
 
 
A todos los mencionados y aquellos que olvide mencionar, pero que también participaron en este 
proyecto de vida, gracias. 
 
 
 
 
 
X 
 
 
 
 
 
XI 
Contenido 
1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 1 
2 JUSTIFICACIÓN.............................................................................................................................7 
3 OBJETIVOS ................................................................................................................................... 9 
3.1 GENERAL: ............................................................................................................................. 9 
3.2 ESPECIFICOS: ....................................................................................................................... 9 
4 METODOLOGÍA .......................................................................................................................... 11 
4.1 DESARROLLO MATEMÁTICO ............................................................................................. 11 
4.1.1 CONSTRUCCIÓN DEL MAPA METABÓLICO REDUCIDO.............................................. 11 
4.1.2 PLANTEAMIENTO DEL MODELO MATEMÁTICO ........................................................ 13 
4.1.3 ANÁLISIS TERMODINÁMICO DEL MODELO METABÓLICO REDUCIDO ...................... 17 
4.2 DESARROLLO EXPERIMENTAL ........................................................................................... 18 
4.2.1 CULTIVOS DE E. coli RECOMBINANTE (DATOS REPORTADOS) .................................. 19 
5 RESULTADOS ............................................................................................................................. 21 
5.1 MODELO METABÓLICO REDUCIDO ................................................................................... 21 
5.2 ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS .................................................................................. 30 
5.2.1 VELOCIDADES VOLUMÉTRICAS ................................................................................. 30 
5.2.2 VELOCIDADES DE REACCIÓN ..................................................................................... 36 
5.3 ANÁLISIS TERMODINÁMICO DE LOS MODELOS ................................................................ 63 
6 CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 79 
 
XII 
7 REFERENCIAS ............................................................................................................................. 83 
8 ANEXOS ..................................................................................................................................... 89 
8.1 A1 REACCIONES BIOQUÍMICAS DEL MODELO ................................................................... 89 
8.2 A2 NOMENCLATURA DE LOS COMPUESTOS UTILIZADOS ................................................. 91 
8.3 A3 ACTIVIDADES MOLECULARES CALCULADAS ................................................................ 92 
8.4 A4 SIMPLIFICACION DE RUTAS BIOQUIMICAS .................................................................. 94 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
XIII 
INDICE DE FIGURAS 
 
Figura 5.1 Esquema General del Sistema Metabólico Reducido. Las flechas continuas indican la 
dirección de las reacciones bioquímicas. La línea punteada corresponde a la reacción de síntesis 
de biomasa. ....................................................................................................................................... 23 
Figura 5.2 Estructura de la Matriz estequiométrica TT. Se resaltan en color rojos los compuestos C 
en estado pseudoestable, en verde los compuestos medidos y en amarillo los compuestos 
calculados. En color gris se indican los coeficientes estequiométricos de los compuestos de cada 
reacción diferentes de cero. ............................................................................................................. 26 
Figura 5.3 Esquema General del Sistema Metabólico Reducido para crecimiento en glucosa. Las 
flechas continuas indican la dirección de las reacciones bioquímicas. La línea punteada 
corresponde a la reacción de síntesis de biomasa. .......................................................................... 28 
Figura 5.4 Esquema General del Sistema Metabólico Reducido para crecimiento en acetato. Las 
flechas continuas indican la dirección de las reacciones bioquímicas. La línea punteada 
corresponde a la reacción de síntesis de biomasa. .......................................................................... 29 
Figura 5.5 Velocidades volumétricas medidas. A: velocidad volumétrica de consumo de glucosa. B: 
velocidad volumétrica de producción de biomasa. .......................................................................... 31 
Figura 5.6 Velocidades volumétricas de producción y consumo de acetato. ................................... 32 
Figura 5.7 Velocidad volumétrica de producción de proteína verde fluorescente (GFP). ................ 33 
Figura 5.8 Velocidades volumétricas de producción de CO2 calculadas. .......................................... 34 
Figura 5.9 Velocidades volumétricas de consumo de O2 calculadas. ............................................... 35 
Figura 5.10 Distribución de Flujos durante la fase de crecimiento en glucosa. ................................ 37 
Figura 5.11 Velocidades de reacción dentro del vector rm. .............................................................. 38 
Figura 5.12 Velocidades de reacción en Glucólisis. Las líneas indican la tendencia. ........................ 40 
Figura 5.13 Velocidades de reacción en la vía de las Pentosas Fosfato. Las líneas indican la 
tendencia. .......................................................................................................................................... 41 
Figura 5.14 Velocidades de reacción en el ciclo de los Ácidos Tricarboxílicos. Las líneas indican la 
tendencia. .......................................................................................................................................... 43 
Figura 5.15 Sistemas de resistencia a acidez dependientes de aminoácidos en E. coli. El sistema 
AR2 (izquierda) es dependiente de glutamato mientras que el sistema AR3 (derecha) depende de 
arginina. ............................................................................................................................................ 47 
Figura 5.16 Velocidades de reacción en el ciclo de regulación a acidez. Las líneas indican la 
tendencia. .......................................................................................................................................... 48 
Figura 5.17 Distribución de Flujos durante la fase de crecimiento en acetato................................. 50 
Figura 5.18 Velocidades de reacción en el vector rm. Crecimiento en acetato. ................................ 52 
Figura 5.19 Velocidades de reacción en el ciclo de Krebs y la vía del Glioxilato. Crecimiento en 
acetato. ............................................................................................................................................. 54 
Figura 5.20 Velocidades de reacción dentro del ciclo de regulación de acidez. Crecimiento en 
acetato. ............................................................................................................................................. 55 
Figura 5.21 Velocidades de reacción en Glucólisis. Crecimiento en acetato. ................................... 57 
Figura 5.22 Velocidades de reacción en Pentosas Fosfato. Crecimiento en acetato. ...................... 58 
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XIV 
Figura 5.23 Intervalos de energía libre de reacción estimados para el sistema metabólico 
planteado. ......................................................................................................................................... 63 
Figura 5.24 Distribución de actividadesmoleculares calculadas para las distintas condiciones 
evaluadas. Se consideraron todos los valores para cada compuesto en las distintas condiciones de 
crecimiento. Se muestra la escala en percentiles, siendo el límite inferior 9.26X10-7 M y el límite 
superior 0.35 M. ................................................................................................................................ 68 
Figura 5.25 Rangos de energía libre de reacción estimados para el modelo metabólico de la cepa 
recombinante de E. coli ..................................................................................................................... 70 
Figura 5.26 Actividades moleculares calculadas para piruvato durante las dos fases de crecimiento.
 ........................................................................................................................................................... 71 
Figura 5.27 Actividades moleculares calculadas para AcCoA durante las dos fases de crecimiento.
 ........................................................................................................................................................... 72 
Figura 5.28 Actividades moleculares calculadas para los principales compuestos que participan en 
los sistemas de regulación a acidez. A) H+. B) HCO3
-. C) Agmatina. D) GABA.................................... 73 
Figura 5.29 Actividades moleculares calculadas para las moléculas energéticas. A) ATP. B) 
NADH. C) NADPH ............................................................................................................................... 75 
Figura 8.1 Esquema inicial del sistema metabólico reducido planteado (Modelo MR1) ................. 95 
Figura 8.2 Matriz estequiométrica TT del modelo MR1. En gris aparecen los valores diferentes de 
cero.................................................................................................................................................... 95 
Figura 8.3 Matriz estequiométrica TT del modelo MR2. En gris aparecen los valores diferentes de 
cero.................................................................................................................................................... 95 
Figura 8.4 Matriz estequiométrica TT del modelo MR2. Se muestra la partición en las seis 
submatrices. En gris aparecen los valores diferentes de cero. ......................................................... 95 
Figura 8.5 Matriz estequiométrica TT del modelo MR3. En gris aparecen los valores diferentes de 
cero.................................................................................................................................................... 95 
Figura 8.6 Matriz estequiométrica TT del modelo MR4. En gris aparecen los valores diferentes de 
cero.................................................................................................................................................... 95 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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XV 
INDICE DE ECUACIONES 
 
Ecuación 1 ......................................................................................................................................... 13 
Ecuación 2 ......................................................................................................................................... 13 
Ecuación 3 ......................................................................................................................................... 14 
Ecuación 4 ......................................................................................................................................... 14 
Ecuación 5 ......................................................................................................................................... 14 
Ecuación 6 ......................................................................................................................................... 14 
Ecuación 7 ......................................................................................................................................... 15 
Ecuación 8 ......................................................................................................................................... 15 
Ecuación 9 ......................................................................................................................................... 15 
Ecuación 10 ....................................................................................................................................... 15 
Ecuación 11 ....................................................................................................................................... 15 
Ecuación 12 ....................................................................................................................................... 16 
Ecuación 13 ....................................................................................................................................... 16 
Ecuación 14 ....................................................................................................................................... 16 
Ecuación 15 ....................................................................................................................................... 16 
Ecuación 16 ....................................................................................................................................... 16 
Ecuación 17 ....................................................................................................................................... 17 
Ecuación 18 ....................................................................................................................................... 17 
Ecuación 19 ....................................................................................................................................... 18 
Ecuación 20 ....................................................................................................................................... 18 
Ecuación 21 ....................................................................................................................................... 18 
Ecuación 22 .......................................................................................................................................22 
Ecuación 23 ....................................................................................................................................... 22 
Ecuación 24 ....................................................................................................................................... 25 
Ecuación 25 ....................................................................................................................................... 25 
Ecuación 26 ....................................................................................................................................... 66 
Ecuación 27 ....................................................................................................................................... 66 
Ecuación 28 ....................................................................................................................................... 66 
Ecuación 29 ....................................................................................................................................... 67 
Ecuación 30 ....................................................................................................................................... 67 
 
XVI 
Ecuación 31 ....................................................................................................................................... 67 
Ecuación 32 ....................................................................................................................................... 67 
Ecuación 33 ....................................................................................................................................... 67 
Ecuación 34 ....................................................................................................................................... 67 
Ecuación 35 ....................................................................................................................................... 68 
Ecuación 36 ....................................................................................................................................... 69 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INDICE DE TABLAS 
 
Tabla 4.1 Dimensiones de partición .................................................................................................. 16 
Tabla 5.1 Compuestos en estado Pseudoestable.............................................................................. 25 
Tabla 5.2 Compuestos en estado no estacionario ............................................................................ 25 
Tabla 8.1 Reacciones Bioquímicas del Modelo Metabólico Reducido .............................................. 89 
Tabla 8.2 Reacciones Bioquímicas del Modelo Metabólico Reducido (cont) ................................... 90 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
XVII 
LISTA DE SIMBOLOS 
 
 Vector que contiene los coeficientes estequiométricos para los sustratos 
(adimensional) 
 Vector que contiene los coeficientes estequiométricos para los productos 
(adimensional) 
 Número de compuestos metabólicos en estado pseudoestable 
(adimensional) 
 Fracción masa del componente i en la reacción j 
 Vector que contiene los coeficientes estequiométricos para los 
intermediarios (adimensional) 
 
 
 Energía libre de reaccion minima (kcal/mol) 
 
 
 Energía libre de reacción máxima (kcal/mol) 
 
 Energía libre de reacción estándar (kcal/mol) 
 Energía libre de formación común a todos grupos químicos (kcal/mol) 
 Energía libre de formación del grupo químico n (kcal/mol) 
 Energía libre de formación del compuesto i (kcal/mol) 
 Número de reacciones en el sistema (adimensional) 
 Número de compuestos metabólicos intermediarios (adimensional) 
 Suma de actividades totales de los compuestos participantes en la 
reacción j (M) 
 Número de productos metabólicos (adimensional) 
 Número de sustratos (adimensional) 
 Concentración de producto en el medio (gL-1) 
 Velocidad volumétrica de formación/consumo (gL-1h-1) 
 Velocidad volumétrica de formación de biomasa (gXL
-1h-1) 
 Velocidad volumétrica de consumo de sustrato (gSL
-1h-1) 
 Velocidad volumétrica de formación de producto (gPL
-1h-1) 
 Vector que contiene las velocidades volumétricas para cada compuesto en 
el sistema (gL-1h-1) 
 
XVIII 
 Vector que contiene las velocidades volumétricas cuantificadas 
experimentalmente (gL-1h-1) 
 Vector que contiene las velocidades volumétricas calculadas (gL
-1h-1) 
 Velocidad específica de formación/consumo (ggx
-1h-1) 
 Velocidad específica de consumo de sustrato (gsgx
-1h-1) 
 Velocidad específica de formación de producto (gpgx
-1h-1) 
 Velocidad específica de consumo/formación del compuesto i de sustrato 
(gigx
-1h-1) 
 Matriz estequiométrica total (adimensional) 
 Matrices de partición (adimensional) 
 Tiempo (h) 
 Concentración celular (gL-1); actividad molecular (M) 
 Incertidumbre termodinámica (kcal/mol) 
 
Letras griegas 
 
 Coeficiente estequiométrico para el sustrato i en la reacción j 
(adimensional) 
 Coeficiente estequiométrico para el producto i en la reacción j 
(adimensional) 
 Coeficiente estequiométrico para el intermediario i en la reacción j 
(adimensional) 
 Vector que contiene los coeficientes estequiométricos para la biomasa 
(adimensional) 
 Coeficiente estequiométrico para la biomasa en la reacción j 
(adimensional) 
 Velocidad específica de crecimiento celular (h-1) 
 Velocidad específica de crecimiento celular máxima (h
-1) 
 Actividad molecular del compuesto i en la reacción j (M) 
 
 
FLUJOS METABÓLICOS EN Escherichia coli: AFECTACIÓN DEL CO2 DISUELTO EN LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTE 
 
R. AXAYACATL GONZALEZ GARCIA, MAYO 2012 
1 
1 INTRODUCCIÓN 
 
La Biotecnología ha crecido exponencialmente con los avances desarrollados en la identificación 
de microorganismos, análisis de las rutas bioquímicas y selección de compuestos de alto valor 
sintetizados en las mismas. De igual manera, la caracterización bioquímica y molecular de diversos 
compuestos celulares ha tenido un avance significativo [Palsson, 2009]. A nivel industrial, uno de 
los objetivos de la Biotecnología es la mejora de los rendimientos durante la producción de 
compuestos obtenidos a partir de sistemas biológicos. Una vía para lograr dicha mejora es el 
entendimiento de los procesos celulares a partir de un análisis dinámico del crecimiento celular 
[Gagneur y Casari, 2005]. En todo ser vivo, la relación entre genotipo y fenotipo es fundamental y 
por demás compleja. Esto hace que el estudio para el aprovechamiento de sistemas biológicos sea 
un área ampliamente explotada en el campo de la ciencia. A principios de los 80’s ya existía un 
amplio conocimiento sobre las interacciones a nivel genético y metabólico de algunos 
microorganismos. Pero no fue sino hasta mediados de los 90’s, con la publicación de la primera 
secuencia genómica completa, que se hizo posible identificar todos los productos de la expresión 
de los genes en un solo organismo [Palsson, 2009; Fleischmann et al., 1995]. Este hecho marco un 
hito en el desarrollo de modelos matemáticos que pudieran predecir las interacciones genéticas 
para inducir un determinado comportamiento metabólico valiéndose del constante desarrollo de 
las técnicas de DNA recombinante. Sin restar importancia al análisis metabólico, resultó por demás 
claro que la Ingeniería Genética pudo ser fácilmente implementada como una herramienta 
rentable para la obtención de cepas sobreproductoras de una amplia variedad de compuestos, 
desde aquellos con estructura química sencilla hasta otros más complejos como proteínas 
[Peberdy y Ferenxy, 1985; Palsson, 2006; Price et al., 2004; Lee et al., 2009]. El acoplamiento entre 
genética, metabólica y producción de metabolitosresulta una triada prometedora para la 
obtención de cepas mejoradas con altos niveles de producción. 
Tradicionalmente, la estrategia usada para el mejoramiento genético de microorganismos inicia 
con la selección de una cepa, seguida del análisis global del metabolismo involucrado en la síntesis 
del compuesto de interés con el fin de inducir una desregulación de las rutas que favorezca el 
rendimiento de producción. Esto puede lograrse mediante la eliminación de reacciones, ya sea 
removiendo los genes involucrados, insertando genes exógenos al microorganismo para la síntesis 
FLUJOS METABÓLICOS EN Escherichia coli: AFECTACIÓN DEL CO2 DISUELTO EN LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTE 
 
R. AXAYACATL GONZALEZ GARCIA, MAYO 2012 
2 
del compuesto deseado [Patniak y Liao, 1994] o sobreexpresando una enzima aplicando técnicas 
que van desde la inserción de promotores, mutagénesis sitio dirigida, inserción de un gran número 
de copias de vectores de expresión, entre otros. Debido al amplio conocimiento que se tiene así 
como su relativamente sencilla manipulación genetica, la mejora genética se ha implementado en 
cepas de Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae. Específicamente para la bacteria, la 
producción de insulina humana es considerada como el punto de partida en ingeniería genética. 
Hoy en día existen una amplia gama de productos recombinantes que en la mayoría de los casos 
ha alcanzado resultados exitosos [Zhang et al., 2006], siendo el principal objetivo de mejora la 
última reacción dentro de la ruta de síntesis del compuesto deseado [Ingram, et al., 1987; Bailey, 
1991; Cameron y Tong, 1993]. No obstante, la metodología conlleva un alto grado de aleatoriedad 
e incertidumbre ya que en estos estudios se ha restado importancia al efecto que las 
modificaciones tienen sobre el equilibrio metabólico en los microorganismos. 
En organismos no transformados genéticamente, existe una distribución metabólica estándar que 
permite el mantenimiento de las actividades celulares para crecimiento y mantenimiento. Esta 
distribución se ve alterada por la inserción de genes exógenos cuando son expresados en el 
organismo huésped, por lo que es necesario predecir las consecuencias causadas por las 
perturbaciones inducidas [Stephanopoulos y Vallino, 1991]. Partiendo de los conocimientos 
actuales sobre bioquímica y acoplando a la información genética de los microorganismos, es 
posible generar redes metabólicas especificas para describir un fenotipo objetivo [Edwards y 
Palsson, 2000]. 
De la gran cantidad de productos sintetizados en organismos transformados genéticamente, una 
buena parte corresponde a compuestos de naturaleza proteica. Los principales usos de estas 
proteínas recombinantes se encuentran en el sector alimenticio y de la salud. Al haber sido 
pionero en el campo de la obtención de proteínas recombinantes, el principal microorganismo 
utilizado para este fin es E. coli [Swartz, 2001]. Se han encontrado niveles adecuados de 
producción de proteínas en E. coli a escala industrial, pero también se ha detectado que la 
expresión de proteínas heterólogas conlleva la activación de respuestas a estrés debido a la 
desregulación metabólica, lo cual repercute de forma positiva o negativa en la expresión de la 
proteína recombinante. Inhibición del crecimiento, arresto de la maquinaria celular, choque 
térmico y limitaciones en la trasferencia de masa son algunos factores que han sido identificados 
como respuestas a la sobreexpresión de genes heterólogos [Chou, 2007]. Hasta el momento estas 
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3 
respuestas genéticas solo han sido evaluadas utilizando microarreglos [Oh y Liao, 2000; Richins y 
Chen, 2001], mostrando las tendencias generales sin hacer un análisis detallado sobre la variación 
en los niveles de producción y menos aun en las funciones celulares. 
Para dar solución a estos inconvenientes, la Ingeniería Metabólica surge como una rama de la 
Biotecnología enfocada al entendimiento de la organización modular del metabolismo celular con 
el objetivo de inducir un comportamiento metabólico deseado, a través de cambios en las 
condiciones del medio de crecimiento celular o bien, con el uso de los conocimientos de Ingeniería 
Genética para lograr un fenotipo específico [Bailey, 1991; Stephanopoulos y Vallino, 1991; 
Stephanopoulos y Sinskey, 1993]. Partiendo de un análisis detallado de las rutas bioquímicas se 
logra el desarrollo de modelos predictivos racionales cuya única limitante es la adecuada 
incorporación de la información, lo que representa un alto grado de complejidad debido a las 
interacciones de autorregulación dentro de las redes metabólicas. Con estos modelos es posible 
evaluar el efecto de determinadas modificaciones genéticas sobre el metabolismo mediante un 
análisis basado en la integración de todos los factores involucrados en el sistema [Schuster, 2000], 
reduciendo la aleatoriedad durante la mejora de microorganismos y previendo una descripción 
fundamentada. 
El Análisis de Flujos Metabólicos es una técnica utilizada dentro de la Ingeniería Metabólica para el 
entendimiento de la distribución de carbono dentro del mapa metabólico de un organismo. Las 
bases del Análisis de Flujos Metabólicos es la Ley Fundamental de Conservación de Masa y permite 
la obtención del estado del sistema estudiado considerando la limitación de que debe ser aplicado 
bajo condiciones de estado estacionario y requiere de conocer la estequiometría de las rutas 
analizadas, la demanda metabólica (considerada como consumo de nutrientes) y ciertos 
parámetros específicos de cada cepa [Edwards y Palsson, 1998]. Debido a la complejidad 
estructural de la rutas, han sido implementados al Análisis de Flujos Metabólicos algunos 
algoritmos para la simplificación de estas, siendo el propuesto por Mavrouvouniotis uno de ellos 
[Mavrouvouniotis et al., 1992]. Este método consiste en la discriminación de las reacciones a partir 
de la clasificación de los compuestos que en ellas intervienen en reactivos requeridos, reactivos 
permitidos, intermediarios metabólicos, productos requeridos y productos permitidos, orientado 
todo esto al análisis de las reacciones específicas que describen la biotransformación de un 
sustrato a determinado producto o productos. 
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Si bien el desarrollo de modelos metabólicos predictivos tiene la ventaja de ofrecer información 
referente a la distribución de flujos en una condición metabólica dada, durante la evolución de los 
cultivos celulares se presentan variaciones en las condiciones del medio que repercuten de forma 
directa sobre los procesos intracelulares. Durante el crecimiento celular, se presentan una 
infinidad de momentos metabólicos que pueden ser evaluados para conocer el estado de los 
cultivos celulares. Además, las condiciones del medio cambian de forma simultánea con las 
variaciones en los perfiles de concentración de los sustratos y productos como resultado del 
crecimiento. Se presentan por tanto a lo largo de un cultivo tantos momentos metabólicos como 
se deseen conocer. La presencia de compuestos limitantes en el medio, como lo es la fuente de 
carbono, tiene un efecto directo sobre el crecimiento. Por tanto, analizar los cambios de 
concentración de fuente de carbono así como de sus productos de oxidación resulta una vía 
adecuada para la descripción de los estados metabólicos que se llevan a cabo en la célula, además 
de ser una estrategia adecuada para entender los procesos de autorregulación metabólica. 
La asimilación y producción de CO2 como subproducto del crecimiento celular es un proceso 
común dentro delmetabolismo. Aun así, se ha prestado poca importancia al efecto de la presión 
parcial de CO2 en el medio sobre la fisiología de las células [Dixon y Kell, 1989], y menos al efecto 
cuantitativo como agente de inhibición del crecimiento. Si bien el CO2 es producido en las 
reacciones catabólicas, también es usado durante el anabolismo para dar estabilidad a ciclo de los 
ácidos tricarboxílicos y en casos específicos como activador de reacciones anapleróticas. Pocos 
estudios se han realizados teniendo como objetivo el efecto de CO2 sobre el estado metabólico de 
las células. La información reportada indica que dentro de cultivos en fermentadores sometidos a 
valores altos de presión hidrostática y concentraciones de biomasa altas, el CO2 disuelto se 
acumula en el medio [McIntyre y McNeil, 1997], provocando inhibición en el crecimiento o 
alteraciones en el metabolismo de los microorganismos usados en la industria [Bäumchen et al., 
2007; Castan et al., 2002; Dixon y Kell, 1989; McIntyre and McNeil, 1997; Shojaosadati et al., 2008]. 
Se sabe también que la velocidad específica de crecimiento disminuye a medida que se 
incrementa la concentración de CO2 disuelto, siendo las bacterias gram negativas como E. coli más 
tolerantes a altas concentraciones de CO2 que las bacterias gram positivas [Sutherland et al., 1977]. 
Es por eso que el uso de microorganismos resistentes a altas concentraciones de CO2 ha sido 
evaluado como una alternativa viable para el control de las fermentaciones, pues mediante una 
regulación en la cantidad de CO2 disuelto es posible estimular la producción de biomasa o bien 
redirigir el metabolismo para la formación de un producto específico [Mudgett y Bajracharya, 
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1980]. En el caso de E. coli se ha encontrado que elevadas concentraciones de CO2 disuelto 
provocan una disminución en la tasa de crecimiento, pero estimulan a la vez la producción de 
acetato, además que se presume el CO2 es usado como fuente de carbono al activar determinadas 
reacciones anapleróticas [Castan et al., 2002; Eiteman y Altman, 2006]. Sin embargo, todos estos 
estudios se han realizado con cepas de E. coli no transformadas, por lo que se desconoce qué 
efectos pueda causar la alteración del metabolismo inducida por la transcripción y traducción de 
genes heterólogos [Hewit et al., 2007]. Por otro lado, el efecto de la concentración de CO2 ha sido 
evaluado a partir de la presión parcial del compuesto en corrientes de gas enriquecidas con altas 
presiones parciales de CO2, sin tener un control in situ de la cantidad de CO2 [Baez et al., 2009], 
por lo que se aleja de la realidad de los sistemas de fermentación, donde dicha presión parcial es 
mucho menor. 
Existe una relación entre la de producción de proteínas recombinantes y el efecto del CO2 sobre la 
productividad de las mismas y el crecimiento celular, pues en las fermentaciones a nivel industrial 
donde E. coli es empleada como agente de la biotransformación se opera en lote y lote alimentado. 
Bajo estos sistemas, se alcanzan altas concentraciones celulares [Lemuth et al., 2008]. A medida 
que se incrementa la concentración celular, la producción de CO2 aumenta y por tanto su 
concentración en el medio, alcanzando valores de presión parcial de hasta 0.3 atm [Castan et al., 
2002]. Estos eventos ocasionan una limitación en la trasferencia de oxígeno, lo cual se ve reflejado 
en la producción de acetato y la consecuente reducción en el rendimiento de producción de 
proteína recombinante [Aiteman y Altman, 2006]. Todos estos eventos han sido ampliamente 
discutidos y evaluados a nivel genético, pero no se ha logrado acoplar dicha información con los 
cambios metabólicos que ocurren en E. coli [Aristidou et al., 1995; Lilie et al., 1998; Lemuth et al., 
2008; Baez et al., 2009; Carneiro et al., 2010]. 
La presencia de CO2 en el medio y su alta solubilidad reducen la disponibilidad de oxígeno en el 
medio, induciendo la formación de acetato cuando la fuente de carbono es la glucosa. Ante este 
hecho, el principal objetivo para incrementar la productividad de proteínas recombinantes es la 
eliminación de acetato como subproducto. El acetato no solo reduce los rendimientos de 
producción, sino que también inhibe la síntesis de proteínas y el crecimiento celular a 
concentraciones mayores a 0.5 g/L [Eiteman y Altman et al., 2006]. Diversas alternativas se han 
propuesto para reducir el problema del acetato. La mayoría de ellas implica introducir nuevas 
transformaciones genéticas a la cepa ya modificada, por lo que el entendimiento del metabolismo 
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se hace más complejo. Algunas alternativas que no han sido tan explotadas son el uso de fuentes 
de carbono alternas o el uso de más de una fuente de carbono en distintas etapas de crecimiento. 
Chung et al. (2010) proponen una estrategia para incrementar la producción de proteínas 
recombinantes en la levadura Pichia pastoris que consiste en una fermentación de dos etapas: la 
primera debe asegurar una alta densidad celular utilizando una fuente de carbono y 
posteriormente cambiar a otra más sencilla. De esta forma, se asegura una elevada cantidad de 
aminoácidos en la célula logrando un incremento en la producción de proteína recombinante 
durante la segunda fase de crecimiento [Gorgens et al., 2005]. Aplicando esta lógica, y 
considerando que bajo ciertas condiciones el acetato también puede ser usado como fuente de 
carbono por E. coli, evaluar los efectos acoplados del CO2 sobre la producción de proteína 
recombinante y el tipo de fuente de carbono permitiría, en principio, entender los cambios 
metabólicos en la bacteria. 
La formulación de un modelo metabólico que sea capaz de describir y predecir los cambios 
metabólicos en E. coli durante la producción de una proteína recombinante en la que los efectos 
de cantidad de CO2 disuelto en el medio y fuente de carbono puedan ser evaluados analíticamente 
resulta una vía factible para la optimización del proceso. La construcción de un modelo de esa 
magnitud resulta por demás compleja, pero también debe estar basado en los principios 
bioquímicos y termodinámicos bajo los cuales se rigen los sistemas biológicos. 
La construcción de modelos matemáticos implica el conocer las principales características del 
sistema que se estudia, a fin de establecer los alcances y limitaciones del mismo (restricciones). 
Para el caso de E. coli y de los objetivos del presente trabajo, el modelo debe estar basado en el 
conjunto de reacciones bioquímicas que integran su metabolismo global. Por otro lado, las 
restricciones del modelo deben estar planteadas para simplificar el sistema además de ofrecer 
información suficiente y válida sobre los procesos que se desean evaluar. 
Se desconoce el efecto cuantitativo que tiene la producción de CO2 y su acumulación en el medio 
de cultivo sobre la distribución de flujos en cepas transformadas genéticamente para la obtención 
de proteínas recombinantes. Por tanto, el Análisis de Flujos Metabólicos resulta una herramienta 
útil para integrar ambos efectos y así obtener un mayor entendimiento de la afectación 
metabólica, con el objetivo de hallar los puntos clave que pueden ser optimizados dependiendo de 
los requerimientos de producción. 
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2 JUSTIFICACIÓN 
 
El estudio sobre los niveles de concentración de CO2 en los medios de cultivo cuando se utilizan 
organismos recombinantes ha cobrado importancia debido al efecto de este compuesto sobre 
crecimientocelular y la activación de vías metabólicas anapleróticas. Si bien existen diversos 
estudios en ésta área, los resultados obtenidos solo han evaluado los sistemas biológicos como 
cajas negras. Lo anterior limita la descripción a detalle sobre los procesos metabólicos dentro de la 
célula, por lo que el desarrollo de modelos metabólicos estructurados es una vía adecuada para 
conocer estos procesos. 
Existen actualmente una gran cantidad de modelos metabólicos cuya complejidad y grado de 
descripción permiten explorar las posibles variaciones dentro del metabolismo celular. Estas 
mismas características reducen su aplicación técnica en los procesos de producción a gran escala, 
los cuales buscan soluciones simples y precisas. Es por eso que la implementación de un modelo 
metabólico reducido es una alternativa para describir y predecir de forma matemática la 
redistribución de flujo de carbono. Además, tendría la ventaja de servir como una herramienta 
eficaz para su uso en la optimización de procesos donde se utilicen organismos recombinantes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3 OBJETIVOS 
 
3.1 GENERAL: 
- Establecer un modelo metabólico que incluya en el metabolismo central de Escherichia 
coli la reacción correspondiente a la expresión de una proteína recombinante (proteína 
verde fluorescente, GFP) para así describir los estados metabólicos de la bacteria en un 
cultivo por lote bajo la influencia de distintas concentraciones de CO2 disuelto en el medio. 
 
3.2 ESPECIFICOS: 
- Analizar el Metaboloma de Escherichia coli para la construcción de un modelo metabólico 
reducido, incorporando la reacción de expresión de la proteína recombinante (GFP). 
- Describir la distribución de flujos metabólicos en una cepa recombinante de E. coli 
mediante la aplicación del Análisis de Flujos Metabólicos. 
- Validar el modelo planteado a través de la comparación de los valores de flujos 
metabólicos y los niveles de expresión genética reportados en trabajos previos. 
- Establecer de forma cuantitativa el efecto que tiene el aumento de la concentración de 
CO2 disuelto en el medio sobre el crecimiento celular y la expresión de una proteína 
recombinante. 
- Describir la termodinámica del metabolismo de E. coli recombinante mediante el análisis 
de espontaneidad. 
 
 
 
 
 
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4 METODOLOGÍA 
 
La descripción de la estrategia metodológica se encuentra dividida en dos apartados. El primero 
corresponde al desarrollo del modelo metabólico simplificado y su transformación a un lenguaje 
matemático. De esta forma se logró estimar la distribución de flujos metabólicos, a partir del 
establecimiento de ciertas restricciones inherentes al sistema estudiado (condiciones de 
crecimiento) y a los principios de conservación de masa y energía. En el segundo apartado se hace 
referencia a la obtención de información cinética en cultivos de E. coli transformada a partir de 
fuentes bibliográficas, con el objetivo de incorporar dicha información al modelo planteado en el 
primer apartado y así describir el estado metabólico de los cultivos, asumiendo en todos los casos 
la condición de estado estacionario. 
 
4.1 DESARROLLO MATEMÁTICO 
 
4.1.1 CONSTRUCCIÓN DEL MAPA METABÓLICO REDUCIDO 
Se utilizó la base de datos de Enciclopedia de Genes y Genomas de la Universidad de Kyoto 
(www.genome.jp/kegg) para la obtención del conjunto de reacciones bioquímicas que integran el 
metabolismo global de E. coli. Del total de reacciones, se integró la reacción correspondiente la 
síntesis de la proteína verde fluorescente (GFP) y se aplicó el algoritmo propuesto por 
Mavrouvouniotis [Mavrouvouniotis et al., 1992] para reducir el número de reacciones. La 
estrategia empleada se describe a continuación: 
- Se analizó el mapa metabólico global, y se identificaron las rutas metabólicas involucradas 
en el metabolismo central de E. coli y vías anapleróticas directamente relacionadas con 
crecimiento celular, producción y asimilación de CO2 y metabolismo de acetato. Además, 
se incorporaron las reacciones de síntesis de proteína recombinante (GFP) y de equilibrio 
químico entre las especies CO2, HCO
- y H2CO. 
http://www.genome.jp/kegg
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- Para cada ruta, los metabolitos que participan en cada reacción (J) fueron clasificados en 
sustratos (N), productos (M) e intermediarios (L). 
- De acuerdo al algoritmo, los metabolitos fueron clasificados también en requeridos 
(aquellos compuestos cuya participación en el sistema es necesaria para obtener un 
resultado), permitidos (compuestos cuya participación en el sistema puede ofrecer más 
información pero su ausencia no limita los resultados) y prescindibles (su presencia en el 
sistema no ofrece ninguna información). 
- Para la reducción de las rutas, se usaron los siguientes criterios: 
o Todo conjunto de reacciones consecutivas en forma lineal puede ser sintetizado en 
una sola reacción, considerando los sustratos y productos finales. 
 
se sintetiza en 
 
o Toda bifurcación debe mantenerse, simplificando solo las reacciones consecutivas. 
 
 
 
Se sintetiza en 
 
 
 
o Las reacciones cíclicas pueden ser condensadas en una sola reacción, a menos que 
uno de los metabolitos involucrados en las mismas sea requerido para la 
descripción del sistema. 
 
 
Se sintetiza en la siguiente ruta si B, C, E, G y H son prescindibles 
 
Pero si alguno de ellos es requerido, por ejemplo, G, la simplificación resulta 
 
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o En todos los casos se debe indicar el número de reacciones que han sido 
condensadas. 
- Una vez obtenido el conjunto de reacciones para modelo metabólico reducido, cada 
reacción fue balanceada estequiometricamente. 
- Para evaluar el efecto de CO2 sobre la expresión de una proteína recombinante, se 
incorporó la reacción de síntesis de la de GFP. Esta proteína fue seleccionada como 
producto recombinante modelo, pues es fácilmente cuantificable y no tiene actividad 
catalítica que afecte al metabolismo [Drew et al., 2001]. 
- En la reacción de síntesis de GFP se englobaron el conjunto de procesos que integran la 
traducción del gen gfp hacia la proteína en una sola reacción donde los aminoácidos son 
los sustratos que se transforman a una molécula de GFP. 
 
4.1.2 PLANTEAMIENTO DEL MODELO MATEMÁTICO 
A partir de las reacciones planteadas en lenguaje químico, se realizó una traducción a lenguaje 
matemático en base al principio de conservación de masa. Así, el conjunto de sustratos N son 
convertidos a productos M y biomasa γ, mediante un determinado número de reacciones J en las 
que participan cierto número de intermediarios L. De forma general, el balance para la i-ésima 
reacción en la que el sustrato Si con coeficiente estequiométrico αji se transforma en los 
intermediarios Xint,i con coeficiente estequiométrico gji hasta llegar al producto Pi con coeficienteestequiométrico βji y en biomasa X con coeficiente estequiométrico γ es: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Ecuación 1 
La expresión anterior puede ser reescrita en forma vectorial, agrupando los coeficientes α, β, g y γ 
en las matrices A, B, G y : 
 Ecuación 2 
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Las matrices anteriores pueden reagruparse en vectores, los cuales, para su manipulación, se 
integran en una matriz estequiométrica total T, con dimensiones J x (N+M+L): 
 
 
 
 
 
 Ecuación 3 
 
 
 
 
 
 Ecuación 4 
La ecuación 4 contempla la estequiometría total del sistema metabólico plateando. 
Para llevar a cabo la descripción del estado metabólico del sistema, se aplicó el Análisis de Flujos 
Metabólicos integrando la estequiometría con los procesos de transporte, crecimiento y 
producción dentro de los cultivos de la cepa recombinante de E. coli. 
El AFM comienza con el establecimiento de variables macroscópicas, las cuales corresponden a las 
velocidades volumétricas q de producción y consumo de los compuestos (N+M+L) dentro de la 
ruta. Las unidades de q son g∙L1∙h-1. De acuerdo a la ecuación 5, la velocidad qi describe el cambio 
en la concentración del compuesto ci, por lo que es un valor variable dentro de un cultivo celular, a 
menos que este se encuentre en el estado estacionario (ecuación 6). La condición de estado 
estacionario para los metabolitos se logra en cultivos continuos, pero también en cultivos lote y 
lote alimentado cuando el crecimiento de los microorganismos es balanceado, evento que ocurre 
durante la fase de crecimiento exponencial [Antoniewicz, et al., 2007]. 
 
 
 
 Ecuación 5 
 
 
 Ecuación 6 
Dentro del crecimiento balanceado, existen ciertos metabolitos C para los cuales se cumple la 
ecuación 6, pues su tasa de producción y consumo neto es cero, mientras que el resto de 
compuestos, generalmente sustratos y productos, presentan una acumulación o bien una 
disminución en su concentración el ser consumidos como sustratos. Se tiene entonces un conjunto 
de velocidades qi para los n compuestos totales en el sistema metabólico, agrupados en un vector 
q: 
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 Ecuación 7 
De los compuestos cuya velocidad volumétrica es diferente de cero, una cantidad m pueden ser 
medida experimentalmente mientras que los compuestos c restantes pueden calcularse. Así, el 
vector q puede reescribirse de la siguiente forma: 
 
 
 
 
 Ecuación 8 
Ahora, para incorporar la información cinética contenida en el vector q con la estequiometría del 
sistema dada por la ecuación 4, es necesario aplicar un balance de masa para cada reacción en el 
sistema, relacionando el vector q con el vector r, en h-1, que contiene las velocidades específicas 
de las reacciones celulares: 
 Ecuación 9 
A partir de las ecuaciones 8 y 9: 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ecuación 10 
 
Dada la partición del vector q, la matriz TT puede también reescribirse como un conjunto de 
submatrices Ti: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Ecuación 11 
Las dimensiones de cada matriz aparecen en la tabla: 
 
 
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Tabla 4.1 Dimensiones de partición 
Submatriz Dimensión 
T1 (J-C)x(J-C) 
T2 (J-C)X(C) 
T3 (N+M+L-J)x(J-C) 
T4 (N+M+L-J)x(C) 
T5 (C)x(J-C) 
T6 (C)x(C) 
 
Las dimensiones de las matrices se basan en la cantidad de compuestos y reacciones en las que 
participan, considerando aquellos que deben ser evaluados para el cálculo del resto. Así, para 
lograr un sistema observable, se deben calcular los grados de libertad F del sistema. 
 Ecuación 12 
Finalmente, se lleva a cabo el cálculo de las velocidades volumétricas desconocidas qc y de 
reacción r que describen un momento metabólico: 
 
 
Ecuación 13 
 
 
 
Ecuación 14 
 
 
Ecuación 15 
 
 
 
 
Ecuación 16 
Finalmente, se aplicaron ciertas restricciones, que son al mismo tiempo condiciones de 
observabilidad, para el planteamiento del modelo: 
- El sistema de ecuaciones lineales contenido en la matriz T6 debe ser linealmente 
independiente, por lo que Det(T6)≠0. 
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- El rango de la matriz T debe ser mayor o igual al número de reacciones J. En caso 
contrario, es necesario añadir restricciones al sistema. 
- La submatriz T6 no debe ser singular, lo mismo que la matriz T7. 
 
4.1.3 ANÁLISIS TERMODINÁMICO DEL MODELO METABÓLICO REDUCIDO 
La factibilidad termodinámica del sistema metabólico planteado fue evaluada a partir de la Ley de 
Hess y del método de Análisis Termodinámico de Flujos propuesto por Henry et al. (2006) para 
estimar el cambio en la energía libre de Gibbs, de acuerdo a la siguiente expresión: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Ecuación 17 
donde es la energía libre estándar de formación del compuesto i, R es la constante universal 
de los gases, T es la temperatura absoluta que se asume es 298.15 K, m es el número de 
compuestos en la reacción, a es la actividad molecular de cada compuesto y n es el coeficiente 
estequiométrico del compuesto i en la reacción j. La ecuación 17 es válida siempre que los valores 
de actividad estén dentro del intervalo adecuado para que la reacción se lleve a cabo, y que bajo 
condiciones estándar para una solución acuosa, se considera una actividad promedio de 1 M 
[Finley et al., 2009]. 
Los valores de energía de formación estándar para cada uno de los compuestos fueron 
consultados en bibliografía [Albe et al., 1990]. Para aquellos compuestos cuya no se 
encontró reportada, se calculó su valor mediante un método de contribución de grupos 
[Mavrouvouniotis, et al., 1992] tal como lo expresa la ecuación 18: 
 
 
 
 Ecuación 18 
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Donde es común a todos los grupos, es el número de veces que el grupo está presente 
en la molécula y es la energía libre de cada grupo. El método conlleva una incertidumbre, 
la cual fue calculada a partir de la ecuación siguiente [Henry et al., 2006]: 
 
 
 
 
 Ecuación 19 
Las actividades de compuestos considerados como sustratos y productos pueden aproximarse con 
base en la concentración de los mismos en el medio. Para las actividades del resto de los 
metabolitos en la ruta, cuyos valores cambian respecto a la actividad de cada reacción, se 
establece un rango de actividad de 10-2 mM a 20 mM. Se calcularon los límites de energía libre 
para una actividad máxima xmax y mínima xmin en cada compuesto, obteniéndose así los intervalos 
de energía libre: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ecuación 20 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ecuación 21 
 
4.2 DESARROLLO EXPERIMENTAL 
Una vez que el planteamiento matemático del modelo fue establecido y los grados de libertad del 
sistema fueron calculados, se procedió al acoplamiento del modelo con datos cinéticos. Para la 
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validación, se utilizaron los datos reportados por Baez et al. (2009) de cultivos de E. coli 
recombinante en los cuales se evaluó el efecto de la concentración de CO2 disuelto sobre el 
crecimiento celular, producción de GFP, producción y consumo de acetato, así como expresión de 
genes objetivo. Los resultados del trabajo mencionado solo abordan la etapa de crecimiento en 
glucosa en los cultivos, durante la cual se presentó una acumulación de acetato en el medio. Al 
agotarse la glucosa, el acetato fue consumido. La presencia de estas dos fases implica un análisis 
individual, ya que la fuente de carbono debe ser considerada como variable. La información que se 
menciona en los siguientes apartados de esta sección fue tomada directamente del trabajo de 
Baez et al. (2009) para hacer referencia a las condiciones de cultivo bajo las cuales se obtuvieron 
los resultados. 
 
4.2.1 CULTIVOS DE E. coli RECOMBINANTE (DATOS REPORTADOS) 
Microorganismo, composición del medio y condiciones de cultivo. 
Se llevó a cabo el análisis de los datos cinéticos reportados por Baez et al. (2009) para el cálculo de 
las velocidades volumétricas de biomasa, acetato, GFP y glucosa. Los datos corresponden a 
cultivos en lote de la cepa W3110/pV21 E. coli, transformada con el plásmido pV21 que contiene 
el gen gfp cuya expresión está controlada por el promotor LacZ y contiene un gen de resistencia a 
espectinomicina. Los cultivos fueron realizados en un reactor tanque agitado de 1 L (Bioflo 110 
New Brunswick Scientific, Co., Inc., New Brunswick,NJ). Se utilizó un medio sintético con la 
siguiente composición en (g/L): glucosa, 5.0; Na2SO4, 2.0; (NH4)2SO4, 2.7; NH4Cl, 0.5; K2HPO4, 14.6; 
NaH2PO4 H2O, 4.0; citrato de sodio, 1.0. El pH del medio se mantuvo en un valor de 7 mediante la 
adición de soluciones de NaOH 2M y H3PO4 3 M. Cuatro condiciones de concentración de CO2 en el 
medio fueron evaluadas a partir de la presión parcial del gas en mbar: 20, 70, 150 y 300. La 
temperatura de los cultivos fue 37°C y se mantuvo una tensión de O2 al 20% de la saturación, 
manteniendo el cultivo sin limitación de O2. 
Técnicas analíticas 
El crecimiento celular fue medido por densidad óptica a 600 nm y se transformó a peso seco. Se 
determinó glucosa, acetato y otros ácidos orgánicos. La GFP fue cuantificada por fluorescencia. La 
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expresión de los genes de interés se realizó por cuantificación de mRNA en forma simultánea en 
todas las condiciones a las 6 h de iniciado el cultivo. 
La estimación de velocidades volumétricas se realizó en dos momentos de cultivo en los cuales se 
asumió crecimiento balanceado del microorganismo: durante crecimiento en glucosa y durante 
crecimiento en acetato. Los cálculos fueron realizados tomando los datos reportados y aplicando 
métodos numéricos de alisamiento con polinomios de segundo orden en el software Wolfram 
Mathematica 7.0. El alisamiento permitió reducir el error en las estimaciones de velocidades 
volumétricas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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5 RESULTADOS 
5.1 MODELO METABÓLICO REDUCIDO 
Utilizando la información reportada sobre el metabolismo global de E. coli, se aplicó el algoritmo 
de simplificación descrito previamente. Fueron consideradas las principales rutas bioquímicas 
dentro del metabolismo central de la bacteria, así como la síntesis de aminoácidos y las reacciones 
correspondientes a cadena respiratoria. Además, se incorporó a la ruta la reacción de síntesis de la 
proteína recombinante a partir de los 20 aminoácidos. Esta última reacción es una simplificación 
de los procesos moleculares de transcripción y traducción, cuya complejidad fue reducida en base 
a los objetivos del presente trabajo. En forma similar, la reacción de síntesis de biomasa fue 
simplificada a la conversión de los metabolitos precursores requeridos para formar un mol de 
células [Ingraham, 1983]. El modelo incluye también una reacción de equilibrio químico CO2-HCO3 
y de los sistemas de regulación de acidez AR2 y AR3 con objeto de evaluar la respuesta metabólica 
en estas vías bajo las distintas condiciones de crecimiento a las que fue sometida la bacteria 
[Bearson et al., 2009]. El sistema metabólico consta de 51 reacciones (J) y 53 metabolitos (N+M+L). 
En la figura 5.1 se muestra el esquema global del mapa metabólico reducido. Aparecen solo las 
reacciones más importantes. En el Anexo 1 se puede consultar la lista de reacciones balanceadas 
estequiometricamente. 
El conjunto de reacciones que integran el mapa metabólico reducido permiten una primera 
aproximación para poder evaluar la distribución de flujos. Para corroborar que el sistema 
planteado fuese adecuado para los objetivos del presente trabajo, le fue aplicado un análisis de 
observabilidad. El sistema de reacciones bioquímicas puede ser expresado como un sistema de 
ecuaciones lineales independientes de acuerdo a las ecuaciones 1, 2, 3 y 4. Así, el análisis de 
observabilidad permitió evaluar si la información contenida en el sistema es suficiente para 
encontrar una solución al mismo [Kalman, 1960]. Al agruparse todas las ecuaciones dentro de la 
matriz T, se evaluaron 3 factores: el rango, la dimensión del espacio nulo y el número de condición 
de la matriz. De acuerdo a la ecuación 9, los caculos requieren del uso de TT, siendo las 
dimensiones de esta [N+M+L J]. 
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El rango permite establecer si existe dependencia entre las ecuaciones del sistema, por lo que para 
la matriz TT, se debe cumplir que 
Rank (TT ) > J Ecuación 22 
Dentro de un sistema vectorial, la dimensión del espacio nulo se refiere al número de soluciones 
existentes y viene dada por: 
Dnull= Rank (TT )- J Ecuación 23 
Finalmente el número de condición Cond(TT) permite evaluar la estructura del sistema. Un sistema 
bien estructurado generará una solución adecuada con un error mínimo, mientras que si éste se 
encuentra mal condicionado la propagación del error crecerá de forma considerable. Se espera 
que los valores de Cond(TT ) sean menores a 100, aunque valores mayores pueden aceptarse, 
siempre que no excedan el valor de 1000. En el cuadro 2 se muestran los valores calculados para 
los 3 factores. Es importante mencionar que fue necesario llevar a cabo simplificaciones dentro del 
sistema de ecuaciones antes de obtener un sistema observable. Dichas modificaciones 
consistieron en la eliminación de ciertos compuestos, principalmente aquellos que dentro de las 
reacciones se presentan en pares (ATP/ADP, NADH/NAD, etc.), así como el reacomodo de filas y 
columnas en la matriz total T. La observabilidad del sistema se encuentra directamente 
relacionada con la redundancia de ecuaciones en el sistema lineal. La principal fuente de 
redundancia es la presencia de pares de metabolitos acoplados, como lo son AcCoA-CoA, ATP-ADP, 
NADH, NAD+, entre otros. Por tanto, se decidió solo considerar uno de ellos dentro del sistema de 
ecuaciones. 
 Cuadro 1 Factores de Observabilidad 
Rank(TT) 51 
Dnull(TT) 0 
Cond (TT) 273 
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Figura 5.1 Esquema General del Sistema Metabólico Reducido. Las flechas continuas indican la dirección de las 
reacciones bioquímicas.La línea punteada corresponde a la reacción de síntesis de biomasa. 
3PGLY
PEP
PYR
ACCOA
ISOCIT
a-KETO
SUCC
MAL
OAA
CO2
CO2
CO2
CO2
ACET
CO2
GLUARG
AGM GABA
CO2
CO2Biomass
Glucose
F6P
G3PATP
ADP
NADH
NAD
NADPH
NADP
G6P RIBU5P
R5P
X5P
E4P
CO2
GFP
NH3
H O2
HCO3HCO3
H
HCO3
ADP ATP
NADNADH
FADH FAD
AA
PROTEIN
8.46
GLYOX
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Los valores mostrados en el cuadro 1 indican que el sistema es de rango completo, es decir, no hay 
redundancia en el sistema. Por otro lado, al ser la dimensión del espacio nulo igual a cero, solo 
existe una única solución en el modelo, la cual depende solo de los grados de libertad. El valor del 
número condición, si bien se encuentra arriba de 100, no excede el límite máximo. Por tanto, es 
posible asegurar que el modelo planteado es adecuado y no presentara problemas de cálculo para 
encontrar los valores de velocidades que se desean calcular. 
A partir del sistema matemático planteado, existen diversos algoritmos para obtener una solución 
de la ecuación 9 [Vallino, 1991; Nielsen et al., 2011; Stephanopoulos, 1998]. Cada una de ellos 
depende de las características del sistema. De acuerdo a la ecuación 8, del total de compuestos en 
el sistema hay un número de restricciones C (45), correspondiente a aquellos compuestos cuya 
tasa de cambio es cero, y el resto de compuestos N+M+L-C (8) presentan una velocidad q que 
debe ser medida o estimada para obtener así los valores del vector r. La complejidad de los 
sistemas biológicos está dada por la participación de un gran número de compuestos en las 
reacciones. Considerando esto, la incorporación de todos ellos resultaría en un sistema 
subdeterminado. Vallino (1991) propuso una solución a este problema: eliminar aquellos 
compuestos cuya participación en la ruta es mínima o que actúen como acarreadores de grupos 
químicos sin alterar los balances de carbono. También propone eliminar aquellos compuestos cuya 
determinación no es relevante o bien que no es fácilmente cuantificable, como lo es el agua 
producida en las diferentes reacciones. Todas estas consideraciones fueron aplicadas al sistema 
inicialmente propuesto, resultando en el modelo planteado en el presente trabajo. 
En el presente trabajo se utilizó el algoritmo de solución propuesto por Nielsen et al. (2011), pues 
además de facilitar el cálculo numérico permite identificar las interacciones entre los procesos 
macroscópicos y microscópicos de forma clara. Aunque la estructuración de la matriz T puede ser 
arbitraria, por lo general es necesario hacer un reacomodo de filas y columnas para lograr que la 
partición de TT cumpla con las restricciones de observabilidad. De esta forma, es fácil identificar 
que en el acomodo final de TT la matriz T1 agrupa los compuestos cuya velocidad q debe ser 
medida y a las reacciones que generan productos extracelulares o consumen sustratos 
únicamente. En la matriz T2 se agrupan estos mismos compuestos medidos respecto a las 
reacciones intracelulares de los compuestos C, por lo que es una forma de apreciar el efecto 
macroscópico sobre el microscópico. De forma similar, en T3 y T4 pueden apreciarse las 
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interacciones pero respecto a los compuestos que deben ser estimados. En el caso de T5 se 
muestran las interacciones de los compuestos intracelulares con las reacciones que permiten el 
análisis macroscópico. En T6 se encuentran distribuidos los compuestos intracelulares respecto a 
las reacciones en que participan. Aparecen en la tabla 5.1 los compuestos C y en la tabla 5.2 los 
compuestos extracelulares considerados en el modelos final. 
Tabla 5.1 Compuestos en estado Pseudoestable 
HCO3 ACCOA LYS CYS 
G6P ISOCIT ASP PHE 
F6P A-KETO ASN TYR 
G3P SUCC THR TRP 
3PGLY MAL MET HIS 
PEP OAA ALA GABA 
PIR GLIOX VAL AGMATINE 
RIB5P GLU ILE ATP 
R5P GLN LEU NADH 
X5P PRO SER NADPH 
E4P ARG GLY FADH 
 
 
El acomodo final de la matriz TT se muestra en la figura 5.2 
Los vectores qm y qc quedaron estructurados de la siguiente forma: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Ecuación 24 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ecuación 25 
Tabla 5.2 Compuestos en estado no estacionario 
GLUCOSE O2 ACETATE 
GFP NH3 
BIOMASS CO2 
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Figura 5.2 Estructura de la Matriz estequiométrica T
T
. Se resaltan en color rojos los compuestos C en estado pseudoestable, en verde los compuestos medidos y en amarillo 
los compuestos calculados. En color gris se indican los coeficientes estequiométricos de los compuestos de cada reacción diferentes de cero. 
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14 R15 R16 R17 R18 R19 R20 R21 R22 R23 R24 R25 R26 R27 R28 R29 R30 R31 R32 R33 R34 R35 R36 R37 R38 R39 R40 R41 R42 R43 R44 R45 R46 R47 R48 R49 R50 R51
GLUCOSA -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
BIOMASA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
GFP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
ACET 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CO2 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 -1 0
O2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 0 0 0
NH3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
HCO3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
G6P 1 -1 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -0.005 0 0 0 0 0 0 0
F6P 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -0.002 0 0 0 0 0 0 0
G3P 0 0 2 -1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -0.004 0 0 0 0 0 0 0
3PGLY 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 -0.0389 0 0 0 0 0 0 0
PEP 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -2 -2 -2 0 0 -0.013 0 0 0 0 0 0 0
PIR 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 -1 -2 -1 -2 0 0 0 0 0 1 0 0 -0.074 0 0 0 0 0 0 0
RIB5P 0 0 0 0 0 0 1 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
R5P 0 0 0 0 0 0 0 1 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 0 -0.023 0 0 0 0 0 0 0
X5P 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
E4P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 -1 0 0 -0.009 0 0 0 0 0 0 0
ACCOA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 -1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 -1 0 0 0 0 0 -0.097 0 0 0 0 0 0 0
ISOCIT 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
A-KETO 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 3 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 -0.028 0 0 0 0 -1 0 0
SUCC 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
MAL 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
OAA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -0.046 0 0 0 0 0 0 0
GLU 0 0 0