Tesis-2015-MarAa-Nancy-PA-rez--MejAa

Vista previa del material en texto

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
Centro de Desarrollo de Productos Bióticos 
Departamento de Biotecnología 
 
 
“PERFIL FITOQUÍMICO DE CULTIVOS EN 
SUSPENSIÓN DE Kalanchoe 
daigremontiana” 
 
 
 
T E S I S 
Que para obtener el Grado de 
Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos 
 
PRESENTA 
 
María Nancy Pérez Mejía 
 
Directores de Tesis 
Dra. Alma Angélica Del Villar Martínez 
Dr. Pablo Emilio Vanegas Espinoza 
 
Yautepec de Zaragoza, Morelos; Febrero de 2015. 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo se realizó se llevó a cabo en el Departamento de Biotecnología del Centro 
de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de 
la Dra. Alma Angélica Del Villar Martínez y del Dr. Pablo Emilio Vanegas Espinoza. En el 
laboratorio de Biología Molecular. Se realizó una estancia de investigación en el laboratorio 
de Farmacología y Fitoquímica de Plantas Medicinales del Centro de Investigación 
Biomédicas del Sur del Instituto Mexicano del Seguro Social bajo la supervisión del Dr. 
Alejandro Zamilpa Álvarez. 
Para la realización de los estudios se obtuvo el apoyo económico de la beca CONACYT 
(288473) y la Beca de Estímulo Institucional de Formación de Investigadores (BEIFI) y la 
Beca-Tesis terminal del IPN para la conclusión del trabajo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A mis directores de tesis, la Dra. Alma Angélica Del Villar Martínez y al Dr. Pablo Emilio 
Vanegas Espinoza por sus aportaciones en la escritura de la tesis. 
 
A mi comité turorial, Dra. Gabriela Trejo Tapia, Dr. Antonio Jiménez Aparicio, Dr. Luis 
Arturo Bello Pérez y Dr. José Luis Trejo Espino por ayudarme en la comprensión de 
conceptos, y sus aportaciones en la redacción de la tesis. 
 
Al Dr. Alejandro Zamilpa por aceptarme en su grupo de investigación y por sus valiosas 
aportaciones en el desarrollo y escritura de la tesis. 
 
 
 
i 
 
ÍNDICE 
 
Página 
ÍNDICE i 
ÍNDICE DE CUADROS iv 
ÍNDICE DE FIGURAS v 
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS viii 
RESUMEN x 
ABSTRACT xi 
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................... 1 
2. ANTECEDENTES ............................................................................................................................... 2 
2.1 Género Kalanchoe .......................................................................................................................... 2 
2.1.1 Constitución química del género Kalanchoe ........................................................................... 2 
2.1.2 Usos medicinales de género Kalanchoe .................................................................................. 4 
2.2 Kalanchoe daigremontiana y sus usos en la medicina tradicional ................................................. 4 
2.2.1 Descripción botánica ............................................................................................................... 5 
2.2.2 Constitución fitoquímica de Kalanchoe daigremontiana........................................................ 6 
2.3 Metabolismo secundario ................................................................................................................ 7 
2.3.1 Terpenos .................................................................................................................................. 9 
2.3.1.1 Ruta de biosíntesis de terpenos ...................................................................................... 10 
2.3.1.2 Triterpenos y esteroides ................................................................................................. 11 
2.3.2 Flavonoides ........................................................................................................................... 12 
2.3.2.1 Estructura básica y clasificación de los flavonoides ...................................................... 13 
2.3.2.2 Ruta de biosíntesis de los flavonoides ............................................................................ 14 
2.3.3 Lípidos ................................................................................................................................... 15 
 
 
ii 
 
2.4 Cultivo de células vegetales ......................................................................................................... 16 
2.4.1 Cultivos en suspensión .......................................................................................................... 17 
2.5 Morfología, viabilidad, y cuantificación de la viabilidad celular ................................................. 18 
2.6 Elicitación de cultivos celulares in vitro. ..................................................................................... 19 
2.6.1 Tipos de elicitores ................................................................................................................. 19 
2.6.2 Elicitación con ácido salicílico .............................................................................................. 20 
3. JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................................. 22 
3.1. Hipótesis ...................................................................................................................................... 22 
4. OBJETIVOS ...................................................................................................................................... 22 
4.1 Objetivo general ........................................................................................................................... 22 
4.2 Objetivos particulares ................................................................................................................... 23 
5. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................................... 24 
5.1 Diagrama general de trabajo ........................................................................................................ 24 
5.2 Material biológico ........................................................................................................................ 25 
5.3 Métodos ........................................................................................................................................ 26 
5.3.1 Obtención de células desdiferenciadas .................................................................................. 26 
5.3.2 Establecimiento de cultivos celulares en suspensión ............................................................ 27 
5.3.2.1 Análisis cualitativo de la morfología y viabilidad celular .............................................. 28 
5.3.2.2 Elicitación de cultivos en suspensión ............................................................................. 29 
5.3.3 Extracción de compuestos del material vegetal silvestre e in vitro ................................... 29 
5.3.3.1 Colecta y preparación del material vegetal .................................................................... 29 
5.3.3.2 Análisis químico por CCF .............................................................................................. 30 
5.3.3.3 Identificación de compuestos mediante HPLC .............................................................. 31 
5.3.3.4 Purificación de los compuestos mayoritarios presentes en cultivos en suspensión de K. 
daigremontiana .......................................................................................................................... 32 
 
 
iii 
 
5.3.3.5 Identificación de los compuestos mayoritarios presentes en los cultivos en suspensión 
mediante GC-MS........................................................................................................................ 35 
5.3.4 Análisis químico de los cultivos elicitados ...........................................................................36 
6.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................................... 37 
6.1 Establecimiento del cultivo in vitro de K. daigremontiana .......................................................... 37 
6.2 Inducción de callo a partir de explantes de tallo .......................................................................... 38 
6.3 Establecimiento de cultivos en suspensión .................................................................................. 40 
6.3.1 Cinética de crecimiento de los cultivos en suspensión .......................................................... 42 
6.3.2 Morfología descriptiva y viabilidad de los agregados celulares de K. daigremontiana ........ 44 
6.4 Análisis fitoquímico de extractos celulares de K. daigremontiana. ............................................. 47 
6.4.1 Identificación de flavonoides en hojas y tallos de K. daigremontiana mediante CCF.......... 47 
6.4.1.1 Contenido de flavonoides en el extracto metanólico de hojas silvestres de K. 
daigremontiana. ......................................................................................................................... 48 
6.4.2 Análisis de los compuestos presentes en cultivos en suspensión de K. daigremontiana 
mediante CCF ................................................................................................................................. 50 
6.5 Identificación estructural de los compuestos mayoritarios en cultivos en suspensión de K. 
daigremontiana .................................................................................................................................. 52 
6.5.1 Purificación de los compuestos mayoritarios presentes en los cultivos en suspensión ......... 52 
6.6 Perfil químico de los cultivos elicitados con ácido salicílico ....................................................... 59 
7. CONCLUSIONES ............................................................................................................................. 62 
8. PERPECTIVAS ................................................................................................................................. 63 
9. LITERATURA CITADA ................................................................................................................... 64 
 
 
 
 
 
 
 
 
iv 
 
ÍNDICE DE CUADROS 
 
Número Cuadro Página 
1 Bufadienólidos aislados del genero Kalanchoe 6 
2 Fase móvil utilizada en la separación de flavonoides por 
HPLC 
32 
3 Fase móvil del fraccionamiento cromatográfico del extracto 
metanólico de cultivos en suspensión de K. daigremontiana 
33 
4 Fraccionamiento cromatográfico de F33-F44 para la 
purificación de los compuestos mayoritarios en cultivos en 
suspensión de K. daigremontiana 
34 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
v 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
Número Figura 
 
Página 
1 Ejemplares de Kalanchoe daigremontiana 5 
2 Vista simplificada de las principales vías del metabolismo 
secundario y sus interrelaciones con el metabolismo 
primario 
9 
3 Ruta de biosíntesis de terpenos en plantas 11 
4 Estructuras químicas del ácido ursólico, campesterol, 
estigmasterol y sitosterol 
12 
5 Estructuras químicas de las principales subclases de 
flavonoides 
14 
6 Diagrama general de trabajo 24 
7 Ejemplares de Kalanchoe daigremontiana cultivados en el 
Centro de Desarrollo de Productos Bióticos 
28 
8 Obtención y aislamiento de los compuestos mayoritarios 
presentes en el extracto de cultivos en suspensión de K. 
daigremontiana 
33 
9 Aspecto de las plántulas de Kalanchoe daigremontiana in 
vitro obtenidas a partir de brotes vegetativos 
37 
10 Apariencia de las hojas y sistema radicular de K. 
daigremontiana desarrolladas in vitro 
38 
11 Inducción de callo a partir de explantes de tallo de 
Kalanchoe daigremontiana en medio MS adicionado con 
BAP y 2,4-D 
39 
 
 
vi 
 
12 Cultivo de callos de K. daigremontiana 40 
13 Apariencia de los cultivos en suspensión de Kalanchoe 
daigremontiana en medio MS adicionado con BAP y 2,4-D 
41 
14 Cinética de crecimiento de los cultivos en suspensión de 
Kalanchoe daigremontiana en base a peso seco 
43 
15 Apariencia de las células en cultivos en suspensión de 
Kalanchoe daigremontiana 
45 
16 Aspectos morfológicos y viabilidad celular de cultivos en 
suspensión de K. daigremontiana teñidas con DAF e IP 
46 
17 Análisis cualitativo de extractos metanólicos de diferentes 
fuentes vegetales mediante CCF 
48 
18 Perfil cromatográfico mediante HPLC de extractos 
metanólicos de hojas silvestres 
49 
19 Identificación de flavonoides en Kalanchoe 
daigremontiana mediante CCF 
50 
20 Perfil cromatográfico de terpenos y polisacáridos presentes 
en extractos metanólicos de cultivos en suspensión de K. 
daigremontiana 
51 
21 Comparación cromatográfica de los procesos de extracción 
con lavado continuo de cultivos en suspensión con los 
disolventes 
52 
22 Identificación de ácido ursólico y β-sitosterol mediante 
fraccionamiento en columna de cultivos en suspensión de 
K. daigremontiana 
53 
23 Estructuras químicas del ácido ursólico y β-sitosterol 54 
24 Purificación de R1 y R2 provenientes de cultivos en 
suspensión de K. daigremontiana mediante 
55 
 
 
vii 
 
fraccionamiento en columna abierta 
25 Perfil cromatografico y picos máximos de absorción de las 
fracciones R1 y R2 provenientes de la columna C2Kd 
56 
26 Espectrometría de masas correspondiente a las fracciones 
R1 y R2 
50 
27 Perfil cromatográfico de extractos de cultivos en 
suspensión de K. daigremontiana elicitados con ácido 
salicílico 
61 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
viii 
 
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS 
 
µ Velocidad específica 
µL Microlitros 
µm Micras 
2,4-D Ácido 2,4-diclorofenoxiacético 
AS Ácido salicílico 
BAP Bencil amino purina 
CC Cromatografía en Columna 
 TLC Thin-layer chromatography (Cromatografía en 
capa fina) 
DAF Diacetato de fluoresceína 
DMAPP Dimetilalil pirofosfato 
DPBS Buffer de fosfatos salino de Dulbecco´s 
EM Espectrometría de masas 
FPP Farnesil pirofosfato 
GC-MS Cromatografía de gases acoplado a espetrometría 
de masas 
GGPP Geranil geranil pirofosfato 
CGL Cromatografía gas-líquido 
GPP Geranil pirofosfato 
HBSS Solución salina balanceada de Hank´s 
HPLC High-performance liquid chromatography (Cromatografía 
líquida de alta resolución) 
IP Yoduro de propidio 
 
 
ix 
 
IPP Isopentenil pirofosfato 
KOM Komarowsky 
MEP Metil eritritol fosfato 
mM Milimolar 
MS Medio de cultivo Murashige-Skoog 
AMV Ácido mevalónico 
 PEG Polietilenglicol 
Rf Factor de retención 
RMN Resonancia Magnética Nuclear 
Rt Tiempo de retención 
td Tiempo de duplicación celular 
UV Ultravioleta 
Vr Volumen de retención 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
x 
 
RESUMEN 
Kalanchoe daigremontiana es una planta utilizada en la medicina tradicional para el 
tratamiento de enfermedades respiratorias, inflamatorias y crónico degenerativas (cáncer). 
Los extractos de la planta han demostrado la prescencia de: triterpenos, bufadienólidos, 
esteroles, fenantrenos, flavonoides y ácidos grasos. La purificación de estos compuestos 
requiere grandes cantidades de biomasa vegetal, por lo tanto, es necesario desarrollar un 
sistema biotecnológico para su producción. Los cultivos en suspensión son sistemas que bajo 
condiciones específicas, favorecen la biosíntesis de compuestos con alto valor agregado. Por 
otra parte, la elicitación con diferentes compuestos como el ácido salicílico, permite el 
incremento en la biosíntesis de metabolitos de interés. El objetivo del presente trabajo fue 
estudiar el perfil fitoquímico de cultivos en suspensión de Kalanchoe daigremontiana. Se 
obtuvieron plántulas in vitro, que se utilizaron como fuente de explante para inducir la 
formación de célulasdesdiferenciadas, en medio MS adicionado con BAP y 2,4-D. 
Posteriormente, se establecieron los cultivos en suspensión, se obtuvo la cinética de 
crecimiento celular y se identificaron 4 fases (adaptación, exponencial, estacionaria y muerte). 
Se calcularon los parámetros cinéticos: µ= 0.36 d-1 y td= 2.81 días. Se analizó el aspecto de los 
cultivos en suspensión, identificándose principalmente células circulares y alargadas. Se 
realizaron extracciones metanólicas para el análisis e identificación de los compuestos 
presentes en planta, plántula y cultivos celulares mediante CCF y HPLC. Se realizó el 
fraccionamiento de los extractos, en columna abierta para identificar los compuestos 
mayoritarios en los cultivos en suspensión. El primer fraccionamiento en un sistema de fase 
normal se obtuvieron 93 fracciones, las fracciones 26 y 35 se analizaron por TLC y HPLC y 
correspondieron al ácido ursólico y al β-sitosterol, en las fracciones 36 a 44 se identificaron 
por HPLC y espectrometría de masas, ácidos grasos del grupo omega 3. En un segundo 
fraccionamiento en un sistema de fase reversa, se obtuvieron 14 fracciones, de las cuales 
permitió separar 2 compuestos e identificarlos por espectrometría de masas denominados EPA 
(M-1) correspondiente al metiléster del ácido 5, 8, 11, 14, 17 eicosapentaenoico y al DHA (M-
1) correspondiente al metiléster del ácido 4, 7, 10, 13, 16, 19 decosahexaenoico. Mediante la 
elicitación con ácido salicílico se logró estimular e incrementar la producción de compuestos 
de tipo iridoides presentes en los cultivos en suspensión, disminuyendo por otro lado el 
contenido de ácidos grasos. 
 
 
xi 
 
ABSTRACT 
 
Kalanchoe daigremontiana is a plant used in traditional medicine for the treatment of 
respiratory, inflammatory and chronic degenerative diseases (cancer). The plant extracts have 
demonstrated the prescence of: triterpenes, bufadienólidos, sterols, phenanthrene, flavonoids 
and fatty acids. Purification of these compounds requires large amounts of plant biomass, 
therefore, necessary to develop a biotechnological production system. Suspension cultures are 
systems under specific conditions favoring the biosynthesis of compounds with high added 
value. Moreover, different compounds elicitation as salicylic acid, allows the increase in the 
biosynthesis of metabolites of interest. The aim of this work was to study the phytochemical 
profile suspension cultures Kalanchoe daigremontiana. In vitro seedlings, which were used as 
explant source to induce the formation of undifferentiated cells were obtained on MS medium 
supplemented with BAP and 2,4-D. Subsequently, the suspension cultures were established, 
the kinetics of cell growth was obtained and 4 phases (adaptation, exponential, stationary and 
death) were identified. µ=0.36 d-1 and td=2.81 days: the kinetic parameters were calculated. 
The appearance of suspension cultures, identifying mainly circular and elongated cells was 
analyzed. Methanolic extraction for analysis and identification of compounds in plant, 
seedling and cell culture by TLC and HPLC were performed. Extracts fractionation was 
performed to identify open column compounds majority suspension cultures. The first 
fractionation system normal phase 93 fractions were collected, fractions 26 and 35 were 
analyzed by TLC and HPLC and corresponded to ursolic acid and β-sitosterol, in fractions 36-
44 mass spectrometry were identified by HPLC and fatty acids omega 3 group in a second 
fractionation on a reverse phase system, 14 fractions were obtained, which allowed to separate 
and identify them by mass spectrometry corresponding EPA called (M-1) to compounds 2 acid 
methyl ester 5 , 8, 11, 14, 17 eicosapentaenoic acid and DHA (M-1) corresponding to acid 
methyl ester 4, 7, 10, 13, 16, 19 docosahexaenoic. By elicitation with salicylic acid is achieved 
stimulate and increase the production of iridoid compounds present in type suspension 
cultures, on the other hand decreasing the content of fatty acids.
 
 
1 
 
1. INTRODUCCIÓN 
 
Las plantas superiores sintetizan una gran variedad de compuestos químicos, los cuales han 
sido utilizados en la medicina tradicional, debido a que se ha observado que son efectivas en el 
tratamiento de diversos padecimientos. El interés ha evolucionado hacia el estudio científico 
de sus constituyentes químicos, actividad biológica, extracción y purificación. Las plantas 
sintetizan dos categorías de metabolitos: primarios y secundarios. Los metabolitos primarios, 
intervienen en forma directa en los procesos de crecimiento y reproducción, entre ellos se 
encuentran aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos grasos y ácidos carboxílicos. 
Mientras que los metabolitos secundarios, intervienen en las interacciones ecológicas entre la 
planta y su ambiente, cada uno de ellos tiene una distribución restringida en el reino vegetal, a 
veces a sólo una especie o un grupo de ellas. 
El uso de cultivos celulares para la producción de metabolitos secundarios ha sido considerado 
para resolver los problemas de extracción y obtención de los compuestos bioactivo; los 
cultivos en suspensión ofrecen ventajas para producirlos a gran escala. Los elicitores bióticos 
son considerados factores químicos que inducen cambios fisiológicos en el organismo y que 
han sido empleados para estimular la biosíntesis de compuestos químicos en cultivos 
celulares. 
Se han utilizado diversos métodos de separación y purificación, así como métodos 
espectroscópicos para aislar y elucidar químicamente los constituyentes presentes en plantas, 
empleando sistemas de disolventes específicos para cada grupo de compuestos. La especie 
Kalanchoe daigremontiana se ha utilizado ampliamente en la medicina tradicional debido a la 
presencia de sustancias bioactivas como esteroles, fenantrenos, ácidos grasos, bufadienólidos, 
flavonoides, antocianinas y triterpenos. En este trabajo se planteó utilizar el cultivo de tejidos 
vegetales y la elicitación biótica como herramienta para estimular la producción de 
compuestos en Kalanchoe daigremontiana, realizar un estudio fitoquímico e identificar los 
compuestos mayoritarios que produce la planta. 
 
 
 
 
2 
 
2. ANTECEDENTES 
2.1 Género Kalanchoe 
 
El género Kalanchoe pertenece a la familia Crassulaceae, comprende cerca de 125 especies. 
En México, diversas especies del género se encuentran en Chiapas, Estado de México, 
Guerrero, Hidalgo, Michoacán, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Quintana Roo, Tabasco, Veracruz 
y Yucatán (REMIB, 2008) (Maurice, 1993). Muchas especies del género Kalanchoe son 
conocidas como “madre de miles” debido a que desarrollan plántulas en los márgenes de las 
hojas, utilizando reguladores de crecimiento que son clave en los procesos de organogénesis y 
embriogénesis (Garcés y col., 2007). Dentro del género se pueden encontrar especies como K. 
pinnata Lam; K. brasiliensis Laranaga; K. diagremontiana R. Hamet; K. spathulata D. C.; K. 
gracils Hance; K. streptantha Panadero; K. blosfeldiana Poeln; K. tubiflora Raym. Hamet; K. 
angolensis N. E. Br.; K. benti C. H. Wright; K. diversa N. E. Br.; K. dyeri N. E. Br.; K. elizae 
Berger; K. felthamensis Hort; K. kewensis Hort; K. latisepala N. E. Br.; K. luciae Hamet; K. 
magnidens N. E. Br.; K. prasina N. E. Br.; K. somaliensis Panadero; K. sexangularis N. E. Br.; 
K. flammea Stapf; K. kirki N. E. Br.; K. glaucescens Birt; K. rotundifolia Haw; K. carnea 
Mast; K. laciniata D.C.; K. laxiflora Baker, K marmorata Baker y K. verticilata Eliot (Milad y 
col., 2014). 
La mayoría de los estudios llevados a cabo en Kalanchoe se han realizado en el campo de la 
fisiología vegetal debido a que se ha utilizado como modelo para el estudio del metabolismo 
ácido crasuláceo (CAM), son plantas suculentas y xerófitas, adaptadas a la sequía (García, 
2009; Singab y col., 2011). 
2.1.1 Constitución química del género Kalanchoe 
 
Diversos autoreshan aislado e identificado los constituyentes químicos del género Kalanchoe, 
los cuales pueden ser clasificados principalmente en: glucósidos de flavonoides, antocianinas, 
cumarinas, bufadienólidos, triterpenos, esteroles, fenantrenos y ácidos grasos (Singab y col., 
2011; Milad y col., 2014). 
 
 
3 
 
Flavonoides: Milad y col. (2014) realizaron una recopilación de los compuestos reportados en 
diferentes tejidos vegetales de distintas especies del género Kalanchoe, entre los que destacan 
compuestos como patuletina, quercetina y kamferol, en hojas y flores de K. spathulata (Gaind 
y col., 1981). Eupafolin-4´-O-ramnósido, eupafolin-3-7-di-O-ramnósido, eupafolin-3-O-
ramnosil-7-O-(4-O-acetilramnósido), eupafolin-3-O-(3-O-acetilramnosil)-7-O-(3-O-
acetilramnósido), luteolina, quercetina, quercitrina, kamferol y eupafolina a partir de partes 
aéreas de K. gracilis (Lui y col., 1989). Diferentes tipos de patuletina como patuletina-3-O-
(4´´-acetil-α-Lramnopiranosil)-7O-(2´´´-O-acetil-α-ramnopiranósido), patuletina-3-O-α-L-
ramnopiranosil-7-O-(2´´´-O-acetil-α-L-ramnopiranósido y patuletina-3-O-(4´´´-O-acetipipil-α-
L-ramnopiranosil)-7O-ramnopiranósido, aislados de extractos de tallos y hojas de K. 
brasiliensis (Costa y col., 1994), y 4´´´´ -acetilsagitatina de hojas de K. streptantha (Costa y 
col., 1996). Quercetina, quercitrina y quercetina-3-O-β-D-glucósido fueron aislados de hojas 
de K. blossfelfiana (Nielsen y col., 2005). Quercetina, kapinnatósido, quercetina-3-O-α-L-
arabonosil-(1-2) α-L-ramnopiranósido de hojas frescas de K. pinnata (Muzitano y col., 2006). 
Compuestos similares a los descritos anteriormente han sido aislados en otras especies del 
género Kalanchoe (K. brasiliensis, K. pinnata, K. gastonisbornieri, K. marmorata y 
Briophylum pinnatum) a partir extractos de hojas (Trevisan y col., 2006; Singab y col., 2011; 
Tatsimo y col., 2012; Megawati y Fajriah, 2013). 
Antocianinas: Las variedades de Kalanchoe blossfeldiana con flores de color naranja, rosa, 
rojo y magenta contienen 3, 5-O-β-D-diglucósidos de pelargonidina, cianidina, peonidina, 
delfinidina y petunidina (Nielsen y col., 2005). 
Cumarinas: Se aisló 5-hidroxicumarina de las partes aéreas de K. gracilis (Lui y col., 1989). 
Bufadienólidos: Se ha reportado que el género Kalanchoe contiene bufadienólidos. Se ha 
reportado su aislamiento a partir de hojas y otras partes aéreas de diferentes especies. Entre los 
bufadienólidos aislados se encuentran a la Helibrigenina-3-acetato, aislado a partir de hojas de 
K. lanceolata (Anderson y col., 1983), Bersaldegenina-1,3,5-ortoacetato y Daigremontianina 
de K. daigremontiana y K. tubiflora (Wagner y col., 1985), Brofilina B de hojas de 
Bryophyllum pinnatum (Yamagishi y col., 1989), Briofilina A de hojas de K. pinnata 
(Supratman y col., 2000). 
 
 
4 
 
Ácidos fenólicos: p-metoxi benzoico, p-hidroxibenzaldehído, ácido vanílico, ácido p-
hidroxibenzoico, ácido cinámico y ácido nicotínico se identificaron en extractos metanólicos 
de K. hybrida (Kuo y col., 2008). Se aisló Protocatéquico-4'-O-β-D-glucopiranósido-4C1 de la 
fracción de acetato de etilo del extracto de la hoja de K. marmorata (Singab y col., 2011). 
Esteroles, triterpenos y fenantrenos: Se han aislado varios compuestos de hojas frescas de 
Kalanchoe pinnata, llamados briofilol, briofolona y briofolenono, briofinol y oleanano 18α-, 
ψ-taraxasterol, junto con una mezcla de α- y β-amirinas y sus acetatos (Siddiqui y col., 1989). 
De la partes aéreas enteras se han identificado: 5α- estigmast- 24-en-3β-ol; 25-metil-5α-
ergost-24 (28) - en-3β-ol; (24R) -stigmasta- 5, de 25 dien 3β-ol (24-epiclerosterol) y (24R) - 
5α- estigmasta- 7, 25-dien-3β-ol fueron aislados (Akishia y col., 1991). Por otro lado, se ha 
reportado que a partir de la fracción en diclorometano de las hojas de K. thrysiflora se aisló 3-
oxo-12 olean-eno y β-sitosterol (Singab y col., 2011). 
Ácidos grasos: El ácido palmítico (C16), ácido esteárico (C18) y trazas de ácidos araquídico 
(C20) y behénico (C22) se identificaron a partir del extracto etanólico de Kalanchoe pinnata 
(Almeida y col., 2000). 
2.1.2 Usos medicinales de género Kalanchoe 
 
En la medicina tradicional, las plantas de este género se han utilizado para el tratamiento de 
enfermedades periodontales, formación de grietas en los labios de niños, contusiones, heridas, 
artritis, úlceras gástricas, disentería, fiebre, tos, cólera, enfermedades urinarias, así como para 
aliviar dolores de cabeza (Singab y col., 2011). También se ha observado que poseen efectos 
antiulcerosos, antimicrobianos, analgésicos, hipoglucemiantes, cardiovasculares y anti-
inflamatorios (Garcés y col., 2007; Kuo y col., 2008; Singab y col., 2011). 
2.2 Kalanchoe daigremontiana y sus usos en la medicina tradicional 
 
Kalanchoe daigremontiana (Hamet y Perrier) también conocida como aranto o espinazo del 
diablo, se reproduce de manera asexual por la producción de brotes vegetativos en los 
márgenes de las hojas y es de fácil propagación; perenne y erecta de hasta 100 cm de altura. 
 
 
5 
 
Las hojas son carnosas, lanceoladas, opuestas, de color verde por el haz y manchadas de 
marrón por el envés (Garcés y col., 2007; Anisimov y col., 2009). 
Las hojas de la planta han sido utilizadas en la medicina tradicional como antihistamínico, 
antitumoral, antiinflamatorio, en el tratamiento contra hinchazones, abscesos, quemaduras, 
úlceras gástricas, reumatismo, tos, fiebre, antileishmaniasis y como anticancerígeno. Así 
mismo se ha evaluado su actividad hemolítica y antimicrobiana (Cruz y col., 2008; Anisimov 
y col., 2009). 
2.2.1 Descripción botánica 
 
La planta desarrolla un tallo erecto, puede alcanzar hasta 1 m de altura con hojas opuestas, 
carnosas, oblongo-lanceoladas que llegan a los 15–20 cm de largo y unos 3.2 cm de ancho. 
Las hojas son de color verde medio por el haz y con manchas púrpura en el envés (figura 1A). 
Los márgenes en forma de cuchara poseen unos pequeños espolones bulbíferos de donde 
surgen los brotes de las nuevas plantas (figura 1B) (Cruz y col., 2008; Anisimov y col., 2009). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Ejemplares de Kalanchoe daigremontiana. A) Planta B) Brotes vegetativos (Garcés 
y col., 2007). 
Las plantas adultas también pueden desarrollar raíces laterales en las estructuras de su tallo 
principal, alcanzando los 10–15 cm del suelo. Las hojas tienden a desarrollarse en estructuras 
desproporcionadamente grandes, provocando que el tallo principal se doble hacia abajo y las 
 
 
6 
 
raíces laterales enraicen en el suelo, produciendo finalmente, el desarrollo de nuevos tallos 
primarios que se establecerán como plantas independientes. En la época de floración de esta 
especie, el tallo principal se alarga verticalmente hasta 30 cm en un par de días, desarrollando 
una inflorescencia terminal (un racimo compuesto en forma de paraguas) con pequeñas flores 
campanuladas de color rosa (Cruz y col., 2008; Anisimov y col., 2009). 
2.2.2 Constitución fitoquímica de Kalanchoe daigremontiana 
 
En el estudio realizado por Anisimov y col. (2009) se caracterizó la composición, contenido de 
lípidos y pigmentos, a partir de extractos etanólicos y hexánicos de plantas de Kalanchoe 
daigremontiana. Se identificaron compuestos como: ácidos grasos, clorofila, carotenoides, 
esteroles, triacilgliceroles, fosfolípidos (fosfatidil glicerol y fosfatidil inositol) y carbohidratos, 
entre otros; los compuestos mas abundantes fueron las clorofilas (22.3%), ácidos grasos libres 
(16.7%) y triacilgliceroles (14%) (Cuadro 1). 
Cuadro 1. Compuestos identificados en K. daigremontiana (Modificado de Anisimov y col., 
2009). 
Metabolito mg/100 g de peso 
fresco 
Ácidos grasos libres 45.4 
β-caroteno 2.6 
Clorofilas 60.6 
Carotenoides 19.6 
Esteroles 16.4 
Carbohidratos 26.0 
Ésteres de esteroles 9.8 
Ésteres de ácidos grasos 21.0 
Triacilgliceroles 38.0 
Monogalactosil diglicérido 9.0 
Sulfoquinovosildiglicérido 9.8 
Fosfolípidos (forfatidil glicerol y 
fosfatidil inositol) 
13.4 
 
 
7 
 
Por otro lado Maarseveen y Jetter (2009), analizaron la composición de la cera cuticular 
(epicuticular e intracuticular), de hojas de K. daigremontiana, tanto de la superficie adaxial 
como abaxial, los compuestos se separaron por análisis de GC-MS. En todas las mezclas 
analizadas se identificaron triterpenos y derivados de ácidos grasos de cadenas muy largas. La 
fracción de triterpenos presentó compuestos como glutinol (8-19% del total de las ceras) y 
friedelina (4-9%) y cantidades pequeñas de glutanol, acetato de glutinol, epifriedelanol, 
germanicol y β-amirina. Con respecto a los derivados de ácidos grasos de cadenas largas, se 
encontraron compuestos como: alcanos de cadenas de C27-C35 (19-37% del total de las ceras), 
aldehídos de C32-C34 (3-7%), ácidos grasos de C32-C34 (0.2-3%), alcoholes primarios de C26-
C36 (4-8%) y ésteres de alquilo de C42-C52 (2-9%). 
Crumley y Nests (1990) describieron la composición de esteroles en raíces, hojas, tallos, flores 
y brotes vegetativos de plántulas de K. daigremontiana. Los compuestos fueron examinados 
mediante análisis de CCF, GLC, HPLC, masas y espectrometría de 1HRMN. Los 14 esteroles 
identificados fueron: colesterol, 24(28)-metilencolesterol, 24-metil-23-dehidrocolesterol, 24-
metil-24-dehidrocolesterol, 24-α-metilcolesterol, 24-β-metilcolesterol, 24-β-etil-22,25(27)-bis-
dehidrocolesterol, 24-dimetil-25(27)-dehidrocolesterol, 24-dimetil-25(27)-dehidrocolesterol, 
24-β-etil-25(27)-dehidrocolesterol (clerosterol), 24-etil-24-dehidrocolesterol (24-
etildesmosterol), trans-24-etilidenecolesterol (isofucosterol), 24-α-etilcolesterol (sitosterol) y 
24-α-etilcolesta-5,22-dienol (stigmasterol). 
2.3 Metabolismo secundario 
 
Todas las células vegetales realizan procesos metabólicos comunes que conducen a la 
formación de compuestos como azúcares, aminoácidos, nucleótidos, ácidos grasos y 
polímeros, esenciales para la planta. El conjunto de estos procesos constituyen el metabolismo 
primario, y los compuestos que se derivan de las reacciones químicas se denominan 
metabolitos primarios. Además de los procesos metabólicos primarios, en las plantas se 
desarrollan otros procesos que conducen a la formación de compuestos de distribución 
restringida en el reino vegetal que se encuentran a menudo en una especie o en ciertos grupos 
taxonómicos. Estas rutas constituyen el metabolismo secundario, y sus productos se 
denominan metabolitos secundarios (Buchanan y col., 2000; Azcón-Bieto y Talón, 2008). La 
 
 
8 
 
figura 1 muestra de forma simplificada las vías implicadas en la biosíntesis e interconexiones 
del metabolismo primario con el metabolismo secundario (Taiz y Zeiger 2006). 
La biosíntesis de los metabolitos secundarios suele encontrarse restringida a fases específicas 
de desarrollo y a periodos de estrés causados, por ejemplo, por deficiencia de nutrientes, 
factores ambientales o por el ataque de microorganismos. En general, los metabolitos 
secundarios son el producto de un amplio grupo de señales químicas a través del cual las 
plantas reaccionan con su entorno. 
El metabolismo primario, proporciona un número de pequeñas moléculas, entre las que cabe 
destacar el ácido shiquímico, el acetato o los aminoácidos, los que constituyen los materiales 
de partida para las rutas más importantes del metabolismo secundario. El ácido shiquímico, da 
origen a muchos compuestos aromáticos (aminoácidos aromáticos, ácidos cinámicos y 
polifenoles), el acetato es el precursor de los ácidos grasos y de los policétidos y de una parte 
de los terpenos o isoprenoides por la ruta del acetato-mevalonato (Azcón-Bieto y Talón, 
2008). 
Los metabolitos secundarios pueden ser divididos de acuerdo a su naturaleza química en 3 
grupos: terpenos, compuestos fenólicos y compuestos nitrogenados, (Buchanan y col., 2000; 
Taiz y Zeiger, 2006; Azcón-Bieto y Talón, 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Vista simplificada de las principales vías del metabolismo secundario y sus 
interrelaciones con el metabolismo primario (Taiz y Zeiger, 2006). 
2.3.1 Terpenos 
 
Los terpenos constituyen uno de los grandes grupos de compuestos ampliamente distribuídos 
en el reino vegetal, como los componentes de esencias, bálsamos y resinas, las fitohormonas 
giberelinas y el ácido abscísico, la cadena isoprenoíde de algunas citocininas, de la 
plastoquinona y de la ubiquinona, el fitol de la clorofila, los carotenoides y los fitoesteroles, 
esenciales para la integridad de las biomembranas (Azcón-Bieto y Talón, 2008). 
Este grupo está integrado por aproximadamente 22,000 estructuras diferentes y engloba 
sustancias que comparten un origen biosintético común (Marcano y Hasegawa, 2002). La 
unidad fundamental que define estos esqueletos contiene cinco átomos de carbono y se conoce 
 
 
10 
 
como isopreno. De acuerdo al número de unidades de isopreno, se pueden clasificar en 
monoterpenos (2 unidades), sesquiterpenos (3 unidades), diterpenos (4 unidades), triterpenos 
(6 unidades), tetraterpenos (8 unidades) y politerpenos (más de 8 unidades) (Gagner y Bladt, 
2001; Marcano y Hasegawa, 2002). 
Dentro de los monoterpenos (C10) se encuentran los compuestos denominados iridoides, 
derivados biosintéticamente del geraniol. Los iridoides pueden encontrarse como estructuras 
abiertas (secoiridoides), o cerradas (iridoides), que pueden aparecer como heterósidos o 
glucósidos (López Carreras y col., 2012). Se han aislado y caracterizado estructuralmente 
algunos iridoides en diversos extractos vegetales. Poseen diversas propiedades, debido a que 
tienen la capacidad para mejorar la función hepática y para estimular la excreción de ácidos 
biliares, así como actividades antimicrobiana, antitumoral, antiviral y antiinflamatoria 
(Miyagoshi y col., 1988; Recio y col., 1994; Chang, 1997; Konoshima y col., 2000; Li y col., 
2010; Brett y col., 2012). 
 
2.3.1.1 Ruta de biosíntesis de terpenos 
 
Los terpenos se forman a través de la condensación de unidades de isopreno. La ruta de 
biosíntesis inicia con la formación de isopentenil pirofosfato (IPP), las plantas sintetizan IPP y 
su isómero alílico dimetilalil pirofosfato (DMAPP), por una de dos rutas: la ruta del ácido 
mevalónico (MVA), o la del metil eritritol fosfato (MEP). En la segunda etapa, unidades 
básicas de C5 se condensan para generar tres grupos prenil difosfato: geranil pirofosfato (GPP, 
C10), farnesil pirofosfato (FPP, C15) y geranilgeranil pirofosfato (GGPP, C20). En la tercera 
etapa, las moléculas son sometidas a una amplia gama de ciclaciones y reordenamientos para 
producir los esqueletos de carbono de cada clase de terpenoides. Así, GPP, es el precursor de 
los monoterpenos (C10), FPP es el compuesto que da lugar a todos los sesquiterpenos (C15) y 
también a los triterpenos (C30), y GGPP es un compuesto precursor directo de los diterpenos 
(C20) y, por la dimerización de estos últimos, de los tetraterpenos (C40) (Azcón-Bieto y Talón, 
2008) (Figura 3). La cuarta y última etapa comprende una serie de reacciones de oxidación, 
isomerización, reducción, conjugación y transformación que cada uno de ellos sufre para dar 
origen a los distintos grupos de terpenoides (Marcano y Hasegawa, 2002; Devarenne, 2009; 
Ashour y col., 2010). 
 
 
11 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Ruta de biosíntesis de terpenos en plantas. CoA=Coenzima A, 
GAP=Glicelaldehído-3-fosfato (Ashour y col., 2010). CoA=Coenzima A, MEP=Metil eritritol 
fosfato, IPP=isopentenil pirofosfato. 
2.3.1.2 Triterpenos y esteroides 
 
Los triterpenos y los esteroides, son compuestos pentacíclicos, ampliamente distribuidos en el 
reino vegetal, desempeñan funciones fisiológicas en las plantas y algunos son de interés 
farmacológico (Azcón-Bieto y Talón, 2008). Los triterpenos se formanen el citoplasma 
celular a partir del escualeno. El ácido ursólico (figura 4A) es un compuesto triterpénico 
pentacíclico, se ha aislado de diferentes especies vegetales formando parte fundamental de la 
Gliceraldehído-
3-fosfato 
Piruvato 3 Acetil-CoA (C2) 
Ruta del 
ácido 
mevalónico 
Ruta del 
Piruvato/ 
MEP 
Isopentenil pirofosfato 
(IPP, C5) 
Dimetilalil pirofosfato 
(DMAPP, C5) 
Geranil difosfato 
(GPP, C10) 
Farnesil pirofosfato 
(FPP, C15) 
Geranilgeranil pirofosfato 
(GGPP, C20) 
Monoterpenos 
(C10) 
Sesquiterpenos 
(C15) 
Diterpenos 
(C10) 
Triterpenos 
(C30) 
Tetraterpenos 
(C40) 
Escualeno (C30) 
 
Fitoeno (C40) 
 
 
 
12 
 
cera que recubre frutos y hojas. Se encuentra generalmente junto a su isómero, el ácido 
oleanólico, y se puede encontrar en forma de aglicona o de ácido libre. El ácido ursólico ha 
mostrado actividad biológica, comprobando su potencial como anticancerígeno, 
antiinflamatorio, antimicrobiano y antiviral, entre otros. También ha sido empleado como 
agente emulsificante en preparados farmacéuticos, cosméticos y alimentos (Liu, 1995; Ferrer y 
col., 2007). 
Los esteroides constituyen una subclase de los triterpenos que se derivan del escualeno, a 
partir del cicloarnotenol se forman diversos esteroides vegetales o fitoesteroles. Entre los 
esteroides vegetales se encuentran el campesterol, el estigmasterol y el sitosterol (figura 4). 
Dentro de las funciones del β-sitosterol en la planta tenemos que son constituyentes de las 
membranas; sin embargo, su concentración varía en función al tipo de membrana así como su 
función en la célula (Azcón-Bieto y Talón, 2008; Sai y col., 2012). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Estructuras químicas del ácido ursólico (A), campesterol (B), estigmasterol (C) y 
sitosterol (D) (Ferrer y col., 2007; Azcón-Bieto y Talón, 2008; Sai y col., 2012). 
2.3.2 Flavonoides 
 
Los flavonoides son compuestos polifenólicos de origen natural producidos por las plantas, 
que son consumidos por sus propiedades terapéuticas, así como por su actividad 
antiinflamatoria y antioxidante, además presentan actividad anticancerígena, antitrombótica, 
antialérgica y hepatoprotectora (De Souza Dos Santos y col., 2011). En los vegetales, los 
flavonoides sirven como pigmentos y son importantes en procesos de defensa y en el 
C) 
A) 
B) 
D) 
 
 
13 
 
desarrollo en las plantas. Fueron descubiertos en 1939 por Szent-György, quien aisló de la 
cáscara del limón compuestos del tipo de los flavonoides como hesperidina y glucósido de 
eriodictiol que presentan múltiples actividades biológicas (Martínez-Flórez y col., 2002; Buer 
y col., 2010; De Souza Dos Santos y col., 2011). 
2.3.2.1 Estructura básica y clasificación de los flavonoides 
 
Los flavonoides son compuestos que comparten un esqueleto común de difenilpirano, 
compuesto por dos anillos de fenilo (A y B) ligados a través de un anillo C de pirano (Figura 
5) (Martínez-Flórez y col., 2002; De Souza Dos Santos y col., 2011). La actividad de los 
flavonoides como antioxidantes depende de las propiedades redox de sus grupos 
hidroxifenólicos y de la relación estructural entre las diferentes partes de la estructura química. 
Esta estructura básica permite una multitud de patrones de sustitución y variaciones en el 
anillo C (figura 5). En función de sus características estructurales (Mabry y col., 1970; 
Martínez-Flórez y col., 2002; De Souza Dos Santos y col., 2011) se pueden clasificar en: 
A) Antocianinas como pelargonidina, cianidina y malvidina, que tienen unido el grupo -OH en 
posición 3 pero además poseen un doble enlace entre los carbonos 3 y 4 del anillo C. 
B) Flavanoles como epigalocatequina, catequina y epicatequina, que tienen unido un grupo –
OH en la posición 3 del anillo y un doble enlace en la posición 2 y 3 del anillo C. 
C) Flavonas como luteolina, apigenina y crisina, que poseen un grupo carbonilo en posición 4, 
un doble enlace en la posición 2 y 3 del anillo C y carecen del grupo -OH en posición C3. 
D) Flavonoles representados por la quercetina, kampferol, miricetina y rutina, que poseen un 
grupo carbonilo en posición 4, un doble enlace en la posición 2 y 3, y un grupo -OH en 
posición 3 del anillo C. 
E) Flavononas como la naringenina, hesperidina y eridictiol, que solo poseen un grupo 
carboxilo en la posición 4 del anillo C. 
F) Isoflavonas como genisteina y daidzeina, que tiene el anillo B en la posición 3 del anillo C, 
un doble enlace en la posición 2 y 3 y un grupo carboxilo en la posición 4 del anillo C. 
 
 
14 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Estructuras químicas de las principales subclases de flavonoides (De Souza Dos 
Santos y col., 2011). 
2.3.2.2 Ruta de biosíntesis de los flavonoides 
 
La biosíntesis de los flavonoides inicia a partir de la ruta del shikimato que, por acción de la 
enzima fenilalanina amonio-liasa (PAL) la fenilalanina sufre una desaminación, formando al 
ácido cinámico o cinamato, el cual posteriormente es transformado a ácido p-cumárico o 
cumarato por acción de la enzima cinamato-4-hidroxilasa (C4H), la cual cataliza la 
hidroxilación del anillo aromático. La acción de la enzima 4-cumaril-CoA ligasa (4CL) 
convierte al ácido p-cumarínico en cumaril CoA. Un punto crítico en la ruta de biosíntesis de 
los flavonoides en general es catalizado por la enzima chalcona sintasa (CHS), que utiliza al 
malonil CoA y 4-cumaril CoA como sustratos, formando así a la naringenina, posteriormente 
la enzima flavonol sintasa (FLS) convierte el dihidroxi-camferol o dihidroxiflavonol en 
Estructura básica de los Flavonoides 
Antocianinas 
Pelargonidina, Cianidina, Malvidina 
 
Flavanoles 
EGCG, Epigalocatequina, Catequina, Epicatequina 
 
Flavonas 
Luteolina, Apigenina, Crisina 
 
Flavonoles 
Quercetina, Kampferol, Miricetina, Rutina 
Flavononas 
Naringenina, Hesperidina, Eridictiol 
Isoflavonas 
 Genisteina, Daidzeina 
 
 
15 
 
camferol (flavonol) y finalmente la enzima flavonol-3´-hidroxilasa convierte en camferol en 
quercetina y sus derivados como isoramnetina y miricetina (Winkel, 2006). 
2.3.3 Lípidos 
 
Además de terpenos y polifenoles, en los vegetales se encuentran diferentes tipos de lípidos, 
derivados del acetil-CoA, desempeñando funciones de tipo primario y secundario. Entre ellos 
destacan los ácidos grasos, los cuales desempeñan un papel biológico importante como 
almacén de energía. Las fuentes habituales de ácidos grasos en los vegetales son los 
cloroplastos o los protoplastidios, posteriormente estos compuestos experimentan diferentes 
modificaciones en el retículo endoplasmático. La biosíntesis de los ácidos grasos está 
catalizada por polipéptidos localizados en los plastos, en los que una molécula de acetil-CoA 
se une a unidades de malonil-CoA, con la consiguiente liberación de dióxido de carbono. Los 
ácidos policétidos que se van formando en esta vía son estabilizados mediante reducciones que 
originan las típicas cadenas de los ácidos grasos. Posteriormente, mediante acción de las 
desaturasas, se obtienen los ácidos grasos insaturados (Buchanan y col., 2000; Azcón-Bieto y 
Talón, 2008). Las plantas, además de los ácidos grasos característicos como palmítico, oleico, 
linoleico o araquidónico, entre otros, pueden formar compuestos menos frecuentes, a partir de 
moléculas de acetil-CoA, como el ácido ciclopentano carboxílico o pueden experimentar 
inusuales patrones de insaturación (formación de ácido petroselínico y hexadecanoico), 
además de hidroxilaciones, epoxidaciones, metilaciones, etc. De especial importancia son los 
aldehídos y los alcoholes derivados de la degradación oxidativa de los ácidos grasos, que 
causan el aroma de las hojas verdes (Azcón-Bieto y Talón, 2008). 
Dentro de los ácidos grasos de cadenas largas poliinsaturadas (≥20) demoninados omega 3 
(ω3), se encuentra el ácido eicosapentanoico (EPA, 20:5ω3) y el ácido decosahexaenoico(DHA, 22:6ω3), mismos que son sintetizados a partir del ácido oleico (Petrie y col., 2012). 
Ambos han sido reconocidos científicamente en la nutrición humana y para la prevención de 
enfermedades. Pueden evitar anomalías en el sistema inmune, cardiovascular, inflamatorio, 
endocrino y nervioso; por otro lado, un alto contenido de DHA en el cerebro y la retina es 
importante para el sistema nervioso y la función visual (Wu y col., 2005). 
 
 
 
16 
 
2.4 Cultivo de células vegetales 
 
El cultivo de células vegetales (CCV) comprende un grupo de técnicas biotecnológicas que 
permite el cultivo de explantes de una planta en medios nutritivos adecuados, en condiciones 
asépticas bajo condiciones controladas (Sathayanarayana y Varghese, 2007). Se basa en el 
principio de la totipotencia celular, el cual establece que una célula vegetal es capaz de formar 
un nuevo individuo completo e idéntico al de la planta progenitora mediante un proceso de 
regeneración (Santos y Torné, 1986; Garcês y col., 2007; Braybrook y Harada, 2008). 
Los procesos que se llevan a cabo en las células vegetales están regulados por factores físicos 
y químicos. Dentro de los factores físicos se encuentran la luz, temperatura, fotoperiodo y 
humedad; mientras que dentro de los químicos están los nutrimentos y los reguladores de 
crecimiento vegetal como auxinas, citocininas y giberelinas, entre otros, que en conjunto 
inducen la diferenciación y el crecimiento vegetal. 
El material vegetal puede ser cultivado en diferentes sistemas, tanto en medio líquido como en 
medio semisólido. El cultivo en medio semisólido es empleado con la finalidad de obtener 
células desdiferenciadas denominadas callos. Un callo celular es una masa amorfa de células 
que puede tener una variedad de colores, aspectos y grado de compactación entre otras 
características, sus células están en constante mitosis y no tienen diferenciación, que surgen 
de manera natural como un proceso de cicatrización cuando se presentan heridas en las 
plantas, esto se da como respuesta a la estimulación de la biosíntesis de reguladores de 
crecimiento generalmente auxinas y citocininas (Pérez-Molphe y col., 1999; Taiz y Zeiger, 
2006). 
Una vez obtenidas las células desdiferenciadas, se pueden emplear para producir cultivos en 
suspensión (Sathayanarayana y Varghese, 2007; Cai y col., 2012). Un cultivo de células en 
suspensión permite tener la producción controlada de biomasa o metabolitos secundarios, 
independientemente de las condiciones ambientales plagas y enfermedades; de manera que se 
tiene la posibilidad de modificar la cantidad y calidad de los metabolitos (Wagner y 
Vogelmann, 1997). 
 
 
17 
 
2.4.1 Cultivos en suspensión 
 
El cultivo de las células en suspensión que está constituido tanto por células individuales como 
por agregados celulares, heterogéneos en forma y tamaño, que crecen en condiciones asépticas 
bajo condiciones controladas. El cultivo de células en suspensión se inicia transfiriendo 
porciones de callos a medio líquido en agitación. Existe una amplia variedad de explantes, 
medios de cultivo y suplementos vitamínicos y hormonales para inducir callos disgregables. 
Una vez que se transfieren los callos para el cultivo en suspensión, se debe mantener un medio 
de cultivo adecuado que asegure un buen crecimiento. Además de lo anterior, se debe 
suministrar una agitación adecuada, que garantice la integridad y viabilidad celular, evitando 
la sedimentación de los agregados (Jiménez, 2005). 
Los cultivos celulares son asincrónicos, es decir, no todas las células están en la misma fase 
del ciclo celular en el mismo momento. Los cultivos en suspensión presentan un perfil de 
crecimiento iniciando con una fase lag o de adaptación, seguida por una fase de crecimiento 
rápido llamada exponencial, luego inicia la fase estacionaria y la fase de muerte (Kieran y col., 
1997; Rodríguez-Monroy y col., 2000). 
La producción de metabolitos secundarios en cultivos celulares, principalmente suspensiones 
celulares, ha impactado ampliamente en la producción de sustancias bioactivas (Vanisree y 
Tsay, 2007). Por el contrario, el cultivo de callos si bien es considerado un material vegetal 
adecuado para estudios biosintéticos, no lo es para la producción de metabolitos debido a su 
lento ritmo de crecimiento y a que no favorece el escalado en sistemas como los biorreactores 
(Kreis, 2007). Muchos metabolitos secundarios no se acumulan en cultivos de callos y en 
casos donde se han detectado, la concentración es usualmente mucho más baja que en plantas 
(Steven, 1998). La utilidad más grande de los cultivos en suspensión es en la producción de 
metabolitos secundarios importantes, por ejemplo: fármacos, colorantes, aromas, etc. (Cusidó 
y col., 2002 Ketchum y col. (1999) y Wang y col. (2001). 
 
 
 
 
18 
 
2.5 Morfología, viabilidad, y cuantificación de la viabilidad celular 
 
El tamaño característico de las células vegetales individuales es del orden de 101 a 102 µm. 
Pueden ser de forma esférica o cilíndrica, son significativamente más grandes y crecen más 
lento que los microorganismos. Además, las células vegetales tienden a crecer en forma de 
agregados, debido a que, después de la división celular, éstas quedan unidas por la presencia 
de la pared celular (Kieran y col., 1997). Asimismo, se ha reportado que la secreción de 
polisacáridos extracelulares, particularmente en los estados tardíos de crecimiento en lote 
puede contribuir a incrementar el problema de agregación (Taticek y col., 1991). Los 
agregados que contienen más de 102 células, pueden tener un diámetro de milímetros. Para la 
formación de un agregado, las células individuales se acomodan formando agregados esféricos 
y alargados en los cultivos en suspensión (Tanaka, 1982). 
El término de viabilidad celular en el cultivo de células vegetales se refiere al porcentaje de 
células que se mantienen metabólicamente activas, capaces de reproducirse y desarrollar todas 
las funciones fisiológicas necesarias para vivir o adaptarse a ciertas condiciones adversas 
(Duncan y Widholm, 1990). 
Un método para determinar la viabilidad celular consiste en utilizar moléculas conocidas como 
fluorocromos, que absorben luz a una determinada longitud de onda y emiten otra a diferente 
longitud de onda, se caracterizan por sus espectros de excitación y emisión. Se ha reportado 
que la mezcla de flourocromos como diacetato de fluoresceína (DAF) asi como ioduro de 
propidio (IP), es muy utilizada para determinar la viabilidad celular en cultivos en suspensión. 
DAF es un compuesto tipo éster polar que penetra a la célula, es hidrolizado por una esterasa y 
el producto de la hidrólisis es la flouresceína que se acumula en el interior celular, se excita 
por la luz azul a una longitud de onda de 490 nm y emite una radiación verde fluorescente, por 
lo que el fluorocromo permite visualizar las células vivas. Por otro lado; el IP permite 
identificar a las células muertas debido a que es impermeable a la membrana celular de 
manera que sólo penetra en las células que tienen dañada la membrana, y tiene afinidad por 
DNA y RNA y al ser excitado por la luz verde a 530 nm emite una florescencia de color rojo 
(Widholm, 1972; Jones y Senft, 1985; Fernandez-Da Silva y Menendez-Yuffa, 2006). 
 
 
19 
 
2.6 Elicitación de cultivos celulares in vitro. 
 
La adición de precursores representa una estrategia para potenciar la biosíntesis de las enzimas 
presentes en el cultivo de células, así como favorece la producción de diferentes grupos de 
productos naturales en las plantas superiores (Rao y Ravishankar, 2002). 
Por otro lado, el cultivo de células vegetales ha recibido mucha atención debido a que 
representa una tecnología eficaz para la producción de metabolitos secundarios con alto valor 
agregado, se han utilizado varias estrategias para aumentar la productividad de estos cultivos 
como laadición de precursores o la elicitación. El término elicitación se refiere a la activación 
o incremento del metabolismo secundario, provocada por factores determinados que conllevan 
a la producción de metabolitos. Los elicitores son definidos como sustancias de origen biótico 
o abiótico que desencadenan respuestas de defensa en las plantas (Zhao y col., 2005; 
Gadzovska y col., 2007; Yendo y col., 2010; Cai y col., 2012). 
La elicitación es un proceso mediante el cual la planta desarrolla un mecanismo de respuesta 
ante cualquier estímulo exógeno o endógeno. Después de la percepción de las señales por 
efecto del elicitor, se activan receptores y a continuación se activan efectores, tales como 
canales de iones, proteínas de unión a GTP (proteínas G), y las cinasas, la activación de la 
NADPH oxidasa y especies reactivas de oxígeno, la defensa provoca una respuesta tardía en la 
expresión genética y por consiguiente, la acumulación de metabolitos secundarios (Ebel y 
Mithoefer, 1998; Blume y col., 2000; Zhao y col., 2005). 
El proceso de transducción de señales por efecto de la elicitación nunca es el resultado de la 
activación de una única ruta, sino que es la consecuencia de una compleja red de interacciones 
entre distintas rutas de señalización. Los diferentes estímulos provocan una activación 
asimétrica de las rutas de biosíntesis y el balance final de interacciones entre ellas, es el que 
determina las respuestas específicas al estímulo inicial (Zhao y col., 2005). 
2.6.1 Tipos de elicitores 
 
Los elicitores se clasifican de acuerdo a su naturaleza en bióticos y abióticos: 
 
 
20 
 
Abióticos: La elicitación abiótica utiliza agentes físicos y químicos como la irradiación con 
rayos ultravioleta, temperatura, sustancias inorgánicas, pH, metales pesados, etc. (Muffler y 
col., 2011; Cai y col., 2012). 
Bióticos: Son compuestos sintetizados por organismos. Dentro de los elicitores bióticos, 
además de algunos microorganismos y los extractos de los mismos empleados comúnmente, 
es posible considerar moléculas que actúan como señales endógenas en los mecanismos de 
defensa de las plantas. Ejemplos de elicitores bióticos son: quitosano, ácido jasmónico (metil 
jasmonato), ácido salicílico, alginato, cloruro de clorocolina, entre otros (Tamogami y col., 
1997; Saniewski y col., 2003; Cai y col., 2012). 
El tratamiento y/o uso de elicitores provoca reacciones de defensa, que incluyen la 
acumulación de un amplio rango de metabolitos secundarios en las plantas tales como 
fitoalexinas tanto en plantas como en cultivos celulares (Zhao y col., 2005). 
2.6.2 Elicitación con ácido salicílico 
 
El ácido salicílico (AS) es una molécula señal que usualmente se puede encontrar en bajas 
concentraciones en las plantas (Raskin y col., 1990). Su producción y su mecanismo de 
biosíntesis para la producción de metabolitos secundarios, está asociado con el sistema de 
defensa en las plantas (Shulaev y col., 1995). Se sintetiza como respuesta a la infección 
producida por diferentes patógenos, como resultado se produce la boisíntesis de fitoalexinas 
que son metabolitos hidrofóbicos antimicrobianos. Dependiendo de la especie vegetal, las 
plantas sintetizan un grupo específico de fitoalexinas, las cuales provienen del metabolismo 
secundario y se derivan de la ruta metabólica de fenilpropanoides, terpenoides o poliacetilenos 
(Shulaev y col., 1995). 
El uso de ácido salicílico como elicitor en cultivos celulares, ha sido reportado en diversos 
estudios. Se ha observado que el AS incrementa la producción de taxol en cultivos celulares de 
Taxus chinensis cuando es utilizado con elicitores fúngicos (Yu y col., 2001). Por otro lado, la 
aplicación de 500 mM de AS en cultivos celulares de Cayratia trifolia, incrementó seis veces 
la producción de estilbeno en comparación con el control (Chetana y Ramawat, 2009). Se han 
reportado efectos similares para otros compuestos como azadiractina en Azadirachta indica 
 
 
21 
 
(Gunjan y Ashok, 2008) y antraquinonas en Rubia tinctorum (Orban y col., 2008). El uso de 
200 mM de AS induce la acumulación de triterpenos como ginsenósidos en cultivos en 
suspensión de Panax ginseng (Ali y col., 2006). Por otro lado, concentraciones de 0.05, 0.5 y 
1.5 mM, analizadas a las 24, 48 y 72 horas, en cultivos en suspensión de Andrographis 
paniculata se han empleado con la final de aumentar el contenido de flavonoides (Mendhulkar 
y Vakil, 2013). Shukor y col. (2013), adicionaron concentraciones de 5, 25, 50 y 100 mM de 
AS, ácido jasmónico y extracto de levadura, en los días 1, 2, 3 y 4, a cultivos en suspensión en 
fase estacionaria de la especie Polygonum minus, y se analizó el aumento en la producción de 
diferentes metabolitos secundarios. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
3. JUSTIFICACIÓN 
 
Kalanchoe daigremontiana es una planta utilizada en la medicina tradicional debido a que 
sintetiza diversos constituyentes químicos como flavonoides, antocianinas, bufadienólidos, 
triterpenos, esteroles y ácidos grasos; sin embargo su extraccion y purificación requiere de 
grandes candidades de biomasa vegetal, por lo tanto es necesario buscar alternativas para su 
obtención. Se ha reportado que la biotecnología por cultivo de células vegetales, así como la 
aplicación de elicitores de origen biótico permiten obtener y potenciar compuestos con alto 
valor agregado, representando una alternativa atractiva para su producción. Sin embargo no 
existen reportes en la literatura de la obtención de dichos compuestos en la especie antes 
mencionada mediante técnicas por cultivo en suspesión. Por lo tanto, se propuso establecer 
cultivos en suspensión de K. daigremontiana, analizar la composición química de los extractos 
de tallo, hoja y cultivos celulares, y estudiar la respuesta de los cultivos en suspensión frente a 
la adición de ácido salicílico para evaluar las modificaciones en el perfil de compuestos 
químicos. 
3.1. Hipótesis 
 
Las células en suspensión de Kalanchoe daigremontiana producen diferentes grupos de 
metabolitos secundarios en cultivos en suspesnión y en respuesta a la adición de ácido 
salicílico. 
4. OBJETIVOS 
4.1 Objetivo general 
 
Estudiar el perfil fitoquímico de cultivos en suspensión celulares de Kalanchoe 
daigremontiana. 
 
 
 
 
 
23 
 
4.2 Objetivos particulares 
 
1. Establecer cultivos en suspensión de células desdiferenciadas de K. daigremontiana. 
2. Analizar cualitativamente la producción de los metabolitos secundarios en hoja, tallo y 
en células en suspensión de K. daigremontiana. 
3. Elucidar la estructura química de los compuestos mayoritarios en cultivos en 
suspensión de K. daigremontiana. 
4. Analizar el efecto del ácido salicílico sobre la producción de compuestos presentes en 
las células de K. daigremontiana mediante CCF y HPLC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
5. MATERIALES Y MÉTODOS 
5.1 Diagrama general de trabajo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Diagrama general de trabajo para la detección de compuestos presentes en 
diferentes fuentes vegetales así como en células en suspensión anterior y posterior a la 
elicitación con ácido salicílico. 
 
 
Hojas y tallos 
silvestres e in vitro 
Extracción 
metanólica 
Elucidación 
química 
Fraccionamiento en 
Columna abierta 
Cinética de crecimiento 
celular (td y µ) 
Morfología 
Celular 
Extracción 
metanólica 
Cultivos en 
suspensión 
Análisis de 
resultados 
Elicitación con 
ácido salicílico 
CCF 
HPLC 
GC-MS 
 
 
25 
 
5.2 Material biológico 
 
Se colectaron brotes vegetativos de aproximadamente 0.3-0.5 cm de diámetro, de los 
márgenes de las hojas de Kalanchoe daigremontiana en etapa vegetativa, desarrolladas en 
invernadero en el Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi-IPN) en Yautepec, 
Morelos, a una altitud de 1,067 msnm. Su localización geográficaes de 18º 49´ 43.71´´ de 
latitud norte y 99º 37.40´ 37.40´´ de longitud este. 
En la figura 7A se muestra la planta completa en etapa vegetativa, en la figura 7B se observa 
la apariencia de las flores características de la etapa de floración que abarca los meses de 
octubre-abril, y los brotes vegetativos localizados en los márgenes de las hojas (Fig. 7C). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Ejemplares de Kalanchoe daigremontiana cultivados en el Centro de Desarrollo de 
Productos Bióticos A) planta completa en etapa vegetativa, B) etapa de floración, y C) brotes 
vegetativos. 
 
B 
A 
C 
 
 
26 
 
5.3 Métodos 
5.3.1 Obtención de células desdiferenciadas 
 
Para el establecimiento del cultivo in vitro, los brotes vegetativos se desinfestaron de acuerdo 
al método establecido por Pedroso y col. (2000), el cual consistió en enjuagar los brotes con 
agua corriente, posteriormente se enjuagaron con agua estéril, seguido de 3 lavados: el 
primero con una solución Tween 20 al 1% durante 1 min, el segundo con etanol al 70% 
durante 2 min y el tercero con una solución de hipoclorito de sodio comercial (Cloralex ®) al 
0.5% durante 17 min; entre cada lavado se realizaron enjuagues con agua estéril para remover 
el exceso de cada solución; todo este proceso se llevó a cabo en campana de flujo laminar. 
Posterior a la desinfestación se sembraron los brotes en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) 
adicionado con 30 g/L de sacarosa y 3 g/L de fitagel (Sigma ®) (modificado de López- Díaz, 
2011) a pH de 5.7, sin reguladores de crecimiento vegetal y se incubaron bajo un fotoperiodo 
de 16/8 horas (luz/oscuridad) y a una temperatura de 25 ±2º C. Se evaluó el porcentaje de 
brotación y contaminación, se monitoreó el crecimiento de las plántulas a través del tiempo y 
el registro se realizó en centímetros (Pedroso y col. 2000; López-Díaz, 2011). Una vez que las 
plántulas in vitro alcanzaron una altura aproximadamente de 8 cm, se obtuvieron explantes de 
tallo de aproximadamente 1 cm y se seccionaron longitudinalmente, mismos que se colocaron 
en cajas Petri con medio MS adicionado con bencil amino purina (BAP) a 1 mg/L y ácido 2, 
4-diclorofenoxiacético (2, 4-D) a 0.5 mg/L, sacarosa (30 g/L) y fitagel (Sigma®) (3 g/L), los 
cultivos se incubaron a una temperatura de 25±2° C (López-Díaz, 2011). Se analizó el proceso 
de desdiferenciación del tejido utilizando un microscopio estereoscópico (Nikon, SMZ-1500, 
tomando muestras cada 4 días, y empleando objetivos de diferentes aumentos (4 y 10X). Una 
vez obtenidos los callos provenientes de la desdiferenciación de los explantes de tallo, se 
subcultivaron periódicamente (con el medio descrito anteriormente) cuando los cultivos se 
encontraron en la fase exponencial. Con el cultivo de callo, se procedió al establecimiento de 
los cultivos en suspensión. 
 
 
 
 
27 
 
5.3.2 Establecimiento de cultivos celulares en suspensión 
 
Los cultivos celulares de K. daigremontiana en medio líquido se establecieron a partir de 
fragmentos de callo friable procedente de los cultivos obtenidos en medio semisólido, se 
seleccionaron partes de callos frescos sin señales de oxidación, se pesaron inóculos de 3 a 5 g 
y se sembraron en matraces Erlenmeyer de 125 ml, con 30 ml del medio MS, sin agente 
gelificante. Los cultivos se incubaron a 25±2° C, con agitación constante de 110 rpm en 
agitador orbital (Adolf Kühner AG Schweiz), se subcultivaron cada 15 días para obtener 
nuevos cultivos de células, donde se decantó el medio, se filtró con una membrana de nylon 
(0.5 µm), eliminando los agregados celulares de mayor tamaño. 
Una vez obtenido un cultivo en suspensión disgregado, se procedió a realizar una cinética de 
crecimiento. Se inocularon 2 g de biomasa fresca en matraces de 125 ml con 30 ml de medio 
MS bajo las condiciones de pH (5.7), temperatura (25±2° C), agitación (110 rpm) y 
reguladores de crecimiento (BAP a 1 mg/L y 2,5-D a 0.5 mg/L). Se tomaron muestras por 
triplicado cada 2-3 días y se registró el peso fresco (PF). Para esto, se filtraron las células con 
una membrana de nylon (0.5 µm), la biomasa se colocó en papel filtro a peso constante y por 
diferencia de peso entre el papel filtro y el papel con la biomasa, se registró el PF, 
posteriormente para conocer el peso seco (PS) se secaron las muestras en un horno a 50º C 
durante 24 h; y por diferencia de peso se registró el PS (Kieran y col., 1997; Rodríguez-
Monroy y col., 2000). Finalmente se determinaron los parámetros cinéticos: velocidad 
específica de crecimiento (µ) y tiempo de duplicación celular (td), y se obtuvo el perfil de 
crecimiento celular identificando las fases: adaptación, exponencial, estacionaria y muerte que 
sirvieron para estudios posteriores como la elicitación y análisis del perfil fitoquímico. 
El crecimiento exponencial de las células vegetales en suspensión puede ser descrito por la 
siguiente ecuación: 
Ln X = µ (t-t0)…………………………………………………..……………………… (1) 
 X0 
Donde: 
 
 
28 
 
X0 es la concentración celular (g/L) en el tiempo t0, cuando inicia el crecimiento exponencial, 
X la concentración celular (g/L) en el tiempo t. Una gráfica semilogarítmica de X vs t es lineal 
cuando el crecimiento es exponencial. La pendiente de esta línea recta corresponde a la 
velocidad específica de crecimiento, µ (tiempo -1). Este parámetro indica la rapidez con la que 
ocurre el crecimiento. El tiempo de duplicación (td) es el tiempo que el cultivo tarda en 
duplicar la cantidad de biomasa correspondiente al inóculo y se obtiene mediante la siguiente 
fórmula (Kieran y col., 1997; Rodríguez-Monroy y col., 2000). 
td= Ln2 ……………………...……………………………………………………… (2) 
 µ 
Donde Ln2 es el logaritmo natural de 2 y µ es la pendiente de la recta. 
5.3.2.1 Análisis cualitativo de la morfología y viabilidad celular 
 
Se realizaron observaciones al microscopio para describir de forma cualitativa la morfología y 
viabilidad celular de los cultivos en suspensión (Jones y Senft, 1985). Para el estudio de la 
morfología celular se tomaron alícuotas de 50 µl de cultivo y se colocaron en tubos eppendorf 
de 1.5 ml, las muestras se lavaron dos veces añadiendo 1 ml de la solución salina de Hank`s 
(HBSS), se agitaron por inversion por 5 min, se centrifugaron por 5 min a 12,500 rpm a 4º C, 
se decantó el sobrenadante y la pastilla se resuspendió en 1 ml del buffer de fosfatos (DPBS), 
el buffer actua como una solución tensoactiva que ayuda a disgregar las células: Las muestras 
se agitaron por inversión durante 5 min, se colocaron en un portaobjetos, se observaron en un 
microscopio óptico (Nikon Eclipse 80i) y se analizaron empleando diferentes objetivos (100, 
40 y 10X). Posteriormente para los análisis de viabilidad celular se realizó el mismo 
procedimiento de lavado de células y se adicionaron 0.1 ml de diacetato de fluoresceína 
(DAF) y 0.03 ml de ioduro de propidio (IP). Las muestras se observaron en un microscopio 
óptico de fluorescencia (Leica MZFLII). Las observaciones se realizaron utilizando 2 cubos de 
excitación: el primero se excita por la luz azul de 450-490 nm emitiendo una radiación verde, 
empleado para identificar a las células vivas; mientras que el segundo filtro se excita por la luz 
verde a 530 nm y emite una radiación roja que permite visualizar las células muertas. Se 
emplearon objetivos de diferentes aumentos (100, 40 y 10x). 
 
 
29 
 
5.3.2.2 Elicitación de cultivos en suspensión 
 
Se utilizaron matraces de 150 ml con 30 ml de medio MS líquido adicionado con BAP y 2,4-D 
(1.0 y 0.5 mg/L, respectivamente) a los cuales se les inocularon 2 g de células, se incubaron 
bajo las condiciones de cultivo descritas anteriormente. Una vez que los cultivos alcanzaron la 
fase estacionaria del crecimiento celular, se adicionaron tres concentraciones de ácido 
salicílico (AS) (0.05, 0.5 y 1.5 mM), y se tomaron muestras a las 0, 24 y 72 horas. Cada una 
de las muestrasde biomasa fueron congeladas con nitrógeno líquido y almacenadas a -70 ºC 
(Bonfill y col., 2003; Dong y col., 2010; Mendhulkar y col., 2013; Shukor y col., 2013). Tanto 
a los cultivos elicitados como a los no elicitados se les realizó un análisis de producción de 
compuestos (flavonoides, terpenos, ácidos grasos) mediante CCF y HPLC. 
5.3.3 Extracción de compuestos del material vegetal silvestre e in vitro 
5.3.3.1 Colecta y preparación del material vegetal 
 
Colecta y secado: 
Se tomaron muestras de hojas y tallos bajo condiciones silvestres (localizados en el 
invernadero de CeProBi-IPN) e in vitro. El material se lavó y se seleccionaron las partes sanas 
para someterlas a un proceso de secado. En una estufa (ECF.102) con flujo de aire caliente 
(55-60º C) durante 48 h. Por otro lado, se colectó la biomasa fresca de las células en 
suspensión proveniente de diferentes etapas de desarrollo celular (1, 8, 12, 13, 14, 20, 25 y 26 
días), las células se congelaron con nitrógeno líquido y almacenaron a -70º C, para su posterior 
liofilización en una liofilizadora (LABCONCO, freeze dryer 18). 
Molido: 
Una vez seco el material vegetal fue molido hasta obtener un tamaño de partícula entre 0.1-0.3 
mm de diámetro, en un molino industrial (Pulvex Plastic). 
Extracción y concentración: 
Se pesaron entre 1 y 10 g de de tallos, hojas (silvestres e in vitro) y células en suspensión 
previamente molidas, se colocaron las muestras en matraces Erlenmeyer y se adicionaron 50 
 
 
30 
 
ml de metanol, por un periodo de 24 h. Posteriormente el disolvente fue separado del material 
vegetal por filtración, los extractos fueron concentrados por destilación a presión reducida 
utilizando un Rotavapor®-buchi-490 (Buchi, Siuza), los extractos semisólidos se secaron con 
vacío para calcular los rendimientos. Cada uno de los extractos secos se almacenaron en viales 
de vidrio a temperatura ambiente hasta su análisis. 
5.3.3.2 Análisis químico por CCF 
 
Una vez obtenidos los extractos metanólicos se realizaron pruebas cualitativas de 
identificación de compuestos mediante CCF (Strobel y col., 2005; Swaroop y col 2005; Dutta 
y col., 2007; Dmitrienko y col., 2012): 
1. Fases móvil y estacionaria: Como fase estacionaria se utilizaron cromatofolios de 
aluminio recubiertos de sílica gel 60 F254 (fase normal) y sílica gel 60-18 F254 (fase 
reversa) (Merck
® Millipore). Como fase móvil se emplearon una serie de mezclas de 
diferentes sistemas: CH2Cl2/CH3OH (95:5 y/o 85:15 y 80:20 v/v) y H2O/CH3CN 
(70:30 v/v). 
2. Preparación de las muestras: Se disolvieron las muestras (extractos de tallos, hojas y 
células en suspensión) a una concentración final de 3-8 mg/ml con CH3OH. Se 
emplearon como estándares de referencia: flavonoides (rutina y glucósido de 
quercetina), un triterpeno (ácido ursólico) y un esterol (β-sitosterol). 
3. Reveladores: Reactivo de KOM y reactivo de productos naturales-polietilenglicol 
(NP/PEG) (Gagner y Bladt, 2001). El reactivo de KOM se preparó con 0.5 mg de 4-
hidroxibenzaldehido (Merck), 90 ml de etanol y 10 ml de ácido sulfúrico; mientras que 
el reactivo NP/PEG se preparó con 5 ml de polietilenglicol, 200 mg de 
difenilboriloxietilamina y 35 ml de etanol. 
4. Procedimiento: Se cortaron placas de sílica gel de 4 cm de altura, se marcó en la parte 
inferior una línea a 0.5 cm donde se aplicaron cada una de las muestras. Posteriormente 
se colocaron en una cámara de vidrio previamente saturada con la fase móvil, se 
eluyeron hasta que el disolvente recorriera el 90% de la longitud de la placa, se secaron 
a 25 ± 2º C, se rociaron con los diferentes reveladores y finalmente se calentaron en 
una parrilla a 90º C hasta la aparición de color. 
 
 
31 
 
5. Interpretación: Las cromatoplacas se analizaron cualitativamente visualizándolas con 
una cámara de luz ultravioleta (UV) a una longitud de onda corta de 254 nm y una 
onda larga de 365 nm (antes y posterior del revelado). 
Para la detección de ácidos grasos (omega) y terpenos se utilizó como agente 
cromogénico el reactivo de KOM, la coloración azul indicó la presencia de ácidos 
grasos, el color rosa correspondió a β-sitosterol, y el morado a terpenos. Por otro lado 
el reactivo de NP/PEG tiene la particularidad de unirse al grupo fenol de los 
flavonoides. Los colores característicos van del naranja intenso (rutina y glucósido de 
quercetina) al amarillo (quercetina y apigenina) (Mabry y col., 1970; Gagner y Bladt, 
2001). 
Finalmente para cada compuesto se calculó el factor de retención (Rf) el cual se determinó 
como el cociente entre la distancia recorrida por el compuesto o soluto presente en el extracto 
desde el origen (d) y la distancia recorrida por el disolvente (h). 
Rf = Distancia recorrida por el soluto (d) ……………………………………... (3) 
 Distancia recorrida por el disolvente (h) 
 
5.3.3.3 Identificación de compuestos mediante HPLC 
 
Se realizaron análisis de cromatografía líquida de alta resolución, para la identificación de 
compuestos utilizando una columna de fase reversa Licrosphere® 100 RP-18 (5µm) Sorbent 
Lot. No. HX128137 LichroCART® 250-4, con un módulo de separación (Waters 2696) y un 
detector de arreglo de diodos (Waters 2996). La detección se realizó a diferentes longitudes de 
onda (205 nm para terpenos y ácidos grasos, 240 nm para iridoides, 280-300 nm para 
compuestos fenólicos, y 360 nm para flavonoides) utilizando como sistema eluyente un 
gradiente de agua-acetonitrilo, con una tasa se flujo de 1 ml/min y un volumen de inyección de 
20 µl. El tiempo de retención de los diferentes extractos se comparó con diferentes estándares 
de referencia. Se realizó una búsqueda de los posibles flavonoides presentes en el extracto de 
hoja silvestre mediante inyecciones en el equipo de HPLC (fase reversa, sistema CH3CN:H2O 
(cuadro 2), la detección se realizó a 295 nm). 
 
 
 
32 
 
Cuadro 2. Fase móvil utilizada en la separación de flavonoides por HPLC. A: agua, B: 
acetonitrilo (columna Licrosphere® 100 RP-18). 
 
Tiempo 
(min) 
Flujo 
(min/ml) 
%A %B 
 1.00 100 0 
1.00 1.00 100 0 
2.00 1.00 90 10 
4.00 1.00 90 10 
5.00 1.00 80 20 
7.00 1.00 80 20 
8.00 1.00 75 25 
11.00 1.00 75 25 
12.00 1.00 60 40 
14.00 1.00 60 40 
15.00 1.00 20 80 
16.00 1.00 20 80 
17.00 1.00 0 100 
18.00 1.00 0 100 
19.00 1.00 100 0 
20.00 1.00 100 0 
22.00 1.00 100 0 
 
5.3.3.4 Purificación de los compuestos mayoritarios presentes en cultivos en suspensión 
de K. daigremontiana 
 
Para realizar el aislamiento e identificación de los compuestos mayoritarios presentes en los 
cultivos en suspensión, se pesaron 12.4 g de biomasa seca y molida provenientes de diferentes 
días de crecimiento celular. Se realizó una extracción añadiendo 400 ml de CH3OH por un 
periodo de 24 h. Posteriormente se tomaron 3.2 g y se realizaron varios lavados utilizando 
diferentes disolventes de menor a mayor polaridad: 1. diclorometano CH2Cl2, 2. acetona 
C3H6O, 3. diclorometano-metanol CH2Cl2-CH3OH (80:20 v/v), 4. Mezcla de metanol-
diclorometano CH3OH-CH2Cl2 (80:20 v/v) y 5. Metanol CH3OH. Se seleccionó el disolvente 
que permitiera separar mejor los diferentes compuestos presentes en el extracto mediante 
 
 
33 
 
análisis cromatográfico de CCF. Se separaron los compuestos presentes en los cultivos en 
suspensión en una columna abierta fase normal (20 cm de altura x 2 cm de diámetro interno), 
la cual se empacó con 1 g de sílica gel 60 (Merck®) y 318 mg de extracto resultante, la fase 
móvil consistió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y metanol en el orden y 
proporciones como describe el cuadro 3 (clave de la columna C1Kd). 
 
Cuadro 3. Fase móvil del fraccionamiento cromatográfico del extracto metanólico de cultivos 
en suspensión de K. daigremontiana. 
Sistema de elución Sistema de 
elución (%) 
Fracciones 
colectadas 
Hexano 100 F1-F5 
Hexano-acetato de etilo 95-5 F6-F10 
90-10 F11-F15 
85-15