Tesis-Jeannette-Gunther

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1
DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DEL VIRUS DEL DENGUE EN EL 
VECTOR Aedes aegypti Y EN PACIENTES DE REGIONES 
ENDÉMICAS DEL ESTADO DE OAXACA 
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL 
ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATIA 
SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION 
DOCTORADO EN BIOMEDICINA MOLECULAR 
T E S I S
que para obtener el grado de 
DOCTOR EN CIENCIAS 
con especialidad en 
BIOMEDICINA MOLECULAR 
Presenta 
M. en C. JEANNETTE GÜNTHER 
 2
 3
 4
AGRADECIMIENTOS 
 
 
Estoy muy agradecida: 
 
En especial por el gran apoyo que me ha dado mi director el Dr. Juan Salas-Benito, 
que se involucró con tanto esfuerzo en este proyecto, y que me ha ayudado desde el 
desarrollo hasta el termino del mismo y que concluye con la presentación de mi tesis. 
 
A mi co-director, el Dr. Guillermo Pérez Ishiwara, por su gran ayuda durante todo el 
tiempo que duró el proyecto. 
 
A la Dra. Rosa Maria del Angel, la Dra. Laurance Marchat Marchau y la Dra. Paula 
Figueroa Arredondo por sus correcciones conspirativas. 
 
A la ENMyH de IPN por poner a mi disposición todo el equipo y material de trabajo 
para este proyecto. 
Este proyecto fue apoyado por la Secretaría de Investigación y Posgrado del Instituto 
Politécnico Nacional (proyecto CGPI 20060428). 
 
Agradezco al Programa Institucional de Formación de Investigadores del Instituto 
Politécnico Nacional (PIFI) por la beca otorgada de 2004-2005. 
 
A la Secretaría de Relaciones Exteriores por la disposición de la beca, lo cual hizo 
posible este trabajo. En especial agradezco a la Lic. Eva Luz Hernández y la Lic. 
Olivia Fernández por su gran ayuda en los trámites, por su esfuerzo y su paciencia. 
 
A la Bióloga Mariana Salas Benito y la QFB Matilde García Espitia, por su ayuda en 
muchas ocasiones y por el ambiente colegial en el laboratorio. 
 
Al LESPO por su buena voluntad, su colaboración, y por poner a mi disposición los 
sueros e informaciones. En especial agradezco mucho el gran apoyo que me han 
dado el entomólogo M. en C. Jorge Pascal Muñoz, y el epidemiólogo M. en C. Luis 
Ramón Ramírez-Palacios. 
 
A la Secretaría de Salud Pública de Oaxaca, los Departamentos de Epidemiología y 
Control de vectores de las Jurisdicciones Juchitán y Tuxtepec y al Laboratorio de la 
Biología Molecular de la Escuela de Veterinaria de la UABJO por su colaboración que 
de no ser por la gran ayuda y apoyo otorgado no se hubiera realizado este trabajo. 
 
A mi pareja Raúl, que tuvo la fuerza y la paciencia suficiente para apoyarme en todo 
este tiempo, y que me hizo más fácil muchos tiempos difíciles con su amor y cariño. 
 
A mis padres, que siempre están presentes y ayudando cuando los necesito. 
 
A Elvira Náder, que se preocupó como una madre por mi, y que siempre tuvo tiempo 
para una plática. 
Y a mis amigas Adriana Embríz Náder, Martha Embríz Náder, Stefanie Frommherz y 
Cynthia Sierra Ventura, que me ayudaron con sus consejos y distracción. 
 
 
 
 5
INDICE 
 
 
 
 
I. Glosario 9 
 
II. Resumen 10 
 
III. Abstract 11 
 
IV. Introducción 12 
 
1. Historia de las epidemias 12 
1.1 Mundial 12 
1.2 América 13 
1.3 México 14 
 
2. El virus 15 
 
3. Sintomatología 17 
 
4. Patogénesis 18 
 
5. Ciclo replicativo 20 
 
6. El vector 21 
 
V. Justificación 25 
 
VI. Objetivos 26 
 
VII. Estrategia experimental 27 
 
VIII. Materiales y Métodos 28 
 
1. Datos climatológicos y elección de las regiones de 
colecta 28 
 
2. Colecta de larvas de A. aegypti 28 
 
3. Extracción de RNA total 29 
3.1 Mosquitos y larvas 29 
3.2 Sueros de pacientes 29 
 
 
 
 
 
 
 6
 
 
4. Tratamiento de los extractos con DNAsa 
 
 
30 
 
5. Evaluación de la Integridad del RNA 30 
 
6. Detección del RNA viral por RT-PCR en muestras de 
larvas, mosquitos y sueros 
 
 
31 
 
7. Determinación de los serotipos virales por medio de 
PCR anidada 33 
7.1 En muestras de larvas y sueros 33 
7.2 En muestras de sueros 34 
 
IX. Resultados 35 
 
1. Estandarización de los métodos RT-PCR y PCR 
anidada 35 
 
2. Transmisión transovárica 38 
 
3. Muestras de pacientes con dengue del estado de 
Oaxaca 44 
 
4. Estadística de los casos documentados en el estado 
de Oaxaca en los años 2003-2006 46 
 
X. Discusión 52 
 
1. Transmisión transovárica 52 
 
2. Muestras de pacientes con dengue del estados de 
Oaxaca 56 
 
3. Estadística de los casos documentados en el estado 
de Oaxaca en los años 2003-2006 58 
 
XI. Conclusiones 62 
 
XII. Bibliografía 63 
 
Anexo I 70 
Anexo II 82 
Anexo III 97 
 
 7
INDICE DE FIGURAS 
 
 
Figura 1: Distribución de A. aegypti en el mundo y extensión 
(2002-2006) 
 
 
13 
Figura 2: Distribución de A. aegypti en América durante 
1930,1960 y 2001 
 
 
15 
Figura 3: Modelo del virus del dengue 
 
16 
Figura 4: Genoma del virus del dengue 
 
16 
Figura 5: Ciclo replicativo del virus del dengue 
 
21 
Figura 6: Productos de PCR anidada con una disminución 
del tiempo de hibridación de los oligonucleótidos de 1 minuto 
a 30 segundos 
 
 
 
36 
Figura 7: Productos de PCR anidada, tipificación de los 
serotipos 2 y 4 con diferentes concentraciones de Mg2+ 
 
 
37 
Figura 8: Productos de RT-PCR y PCR anidada para los 
serotipos 2 y 4 
 
 
37 
Figura 9: Mapa del estado de Oaxaca 
 
38 
Tabla 1: Datos del clima y de colecta de larvas en Tuxtepec 
 
39 
Figura 10: Documentación gráfica de los datos de la tabla 1 
 
40 
Tabla 2: Datos del clima y colecta de larvas en Juchitán 
 
40 
Figura 11: Documentación gráfica de los datos de la tabla 2 
 
41 
Figura 12: Productos de amplificación de los cuatro 
serotipos y productos de tipificación de serotipos en 
mosquitos 
 
 
42 
Tabla 3: Resultados de la tipificación de los serotipos en 
mosquitos resultados de los cálculos de MIR 
 
 
43 
Figura 13: Cadena de diluciones de los serotipos 1 y 3 
 
44 
Figura 14: Productos de PCR anidada de muestras de 
sueros de pacientes 
 
 
45 
Tabla 4: Casos del FD y FHD para pacientes masculinos y 
femeninos 
 
 
45 
 8
 
Figura 15: Casos de FD y FHD en el estado de Oaxaca 
durante el periodo 2003-2006 
 
 
46 
Figura 16: Casos de FD y FHD mensuales del año 2003 
en el estado de Oaxaca 
 
 
47 
Figura 17: Casos de FD y FHD mensuales del año 2005 
en el estado de Oaxaca 
 
 
47 
Figura 18: Casos de FD y FHD mensuales del año 2006 
en el estado de Oaxaca 
 
 
48 
Figura 19: Distribución de los casos de dengue en los años 
2003-2006 en las Jurisdicciones Sanitarias del estado de 
Oaxaca 
 
 
 
49 
Figura 20: Distribución por sexo de los casos de FD y FDH 
en las Jurisdicciones del estado de Oaxaca, 2003-2006 
 
 
49 
Figura 21: Distribución de los casos de FD y FHD de 
pacientes masculinos y femeninos en los años 2003-2006 en 
el estado de Oaxaca 
 
 
 
50 
Tabla 5: Resultados del análisis de muestras de pacientes 
con dengue por PCR del estado de Oaxaca en el año 2005 
 
51 
 
 
 9
I. Glosario 
 
 
 
Cápside estructuras helicoidales o icosaédricas del 
virus, formados de proteínas 
 
Células Kupffer células fagocíticas del hígado 
 
FD fiebre del dengue 
 
FHD fiebre hemorrágica del dengue 
 
Inoculación intratorácica inyección en el segmento torácico del 
mosquito 
 
LESPO Laboratorio Estatal de Salud Pública de 
Oaxaca 
 
MIR Minimum infection rate 
 
OMS Organización Mundial de Salud 
 
OPS Organización Panamericana de Salud 
 
Receptor Fc moléculas de contacto en la superficie de 
células (ejem. macrófagos, linfocitos) a donde 
los anticuerpos pueden unirse a través de sus 
porciones Fc (fragmento cristalizable) 
 
RNA ácido ribonucleico 
 
RT-PCR Reverse transcriptase - polimerase chain 
reaction 
 
SCD síndrome de choque del dengue 
 
Transmisión horizontal transmisión de un virus entre diferentes 
vectores (ejem. mosquito-humano-mosquito) 
 
Transmisión vertical transmisión de un virus entre diferentes 
individuos del mismo vector 
 
Transmisión transovárica transmisión de un virus entre un artrópodo 
hembra y sus descendientes 
 
Virulencia suma de todas características de unvirus que 
causan una enfermedad en el humano o un 
animal 
 
 10
II. Resumen 
 
 
 
El virus del dengue está distribuido en áreas tropicales y subtropicales en todo 
el mundo y es la causa de la fiebre del dengue y la fiebre hemorrágica del 
dengue. Este virus se transmite al humano por medio de mosquitos A. aegypti 
infectados. También se puede transmitir, en el mismo vector, por el mecanismo 
vertical o transovárico a sus descendientes. Durante este trabajo se realizó un 
análisis de la transmisión vertical del virus del dengue en mosquitos de A. 
aegypti, colectados como larvas, en dos regiones endémicas del estado de 
Oaxaca. Las larvas colectadas se criaron en el laboratorio bajo condiciones 
controladas. Las larvas, y los mosquitos provenientes de ellas, se analizaron 
por medio de RT-PCR en la busca del virus del dengue, para tipificar el serotipo 
se usó una PCR anidada. No pudimos detectar el virus en las larvas, pero sí en 
4 de 43 “pools” de mosquitos analizados. Dos “pools” pertenecieron a la región 
de Juchitán y dos a Tuxtepec. Se detectaron los serotipos DEN 2, 3 y 4. La 
tasa mínima de infección fue de 4.3/ 1000 para Tuxtepec y 5.0/ 1000 para 
Juchitán. Los resultados presentados sugieren que el virus del dengue se 
transmite verticalmente en los mosquitos de A. aegypti. 
También se realizó un estudio epidemiológico con los datos de pacientes 
diagnosticados con dengue en el estado de Oaxaca durante los años 2003-
2006. Se observó un aumento significativo en los últimos dos años, de 190 
casos documentados en el año 2004, a 3,400 casos en el año 2006. El grupo 
de edad de 11 a 15 años fue el más afectado y se documentaron 968 casos. 
Se reportaron más casos de FD en mujeres que en hombres, sin embargo, 
respecto a FHD predominaron los hombres, con el 14.9 %, en comparación con 
las mujeres, para cuales sólo se reportó el 11.7 %. En 109 sueros obtenidos del 
LESPO en el año 2005 de pacientes diagnosticados previamente como fiebre 
del dengue o fiebre hemorrágica del dengue se detectaron por medio de RT-
PCR 65 positivos y 44 negativos. Se encontraron los cuatro serotipos de este 
virus. El serotipo más frecuente fue el DEN 4, con 25 muestras detectadas. 
 11
III. Abstract 
 
 
Dengue virus is spread in tropical areas of the world and is the causative agent 
of dengue fever and dengue hemorrhagic fever. It is horizontally transmitted to 
humans by infected Aedes mosquitoes, but it is also able to be vertically or 
transovarially transmitted to insect progeny. In this work, we analyzed the 
vertical transmission of dengue virus in A. aegypti mosquitoes collected in two 
endemic localities in the state of Oaxaca, Mexico. The collected larvae were 
grown in the laboratory and transovarial transmission of dengue virus was 
investigated, either in larvae or new emerged mosquitoes, using a semi-nested 
RT-PCR method developed by our group. 
Although the presence of dengue virus in larvae could not be demonstrated, the 
viral genome was amplified in 4 of 43 pools in cage-born mosquitoes: two pools 
from Tuxtepec and two from Juchitán. The DEN 2, 3 and 4 serotypes were 
detected in those pools with a minimum infection rate (MIR) of 4.3 MIR/1000 for 
Tuxtepec and 5.0 MIR/1000 for Juchitán. 
The results presented here, strongly suggest that dengue virus can be vertically 
transmitted to newborn mosquitoes. We performed an epidemiological analysis 
of dengue in the state of Oaxaca from 2003 to 2006. We observed a significant 
increase of dengue cases in the last two years from 190 cases in 2004 to 3,400 
cases in 2006. The most affected age group was 11 to 15 years old with 968 
cases in 2003-2006. Interestingly, we noticed that more porcent of DF cases 
appeared in women than in men, but the men population (14.9 %) was more 
affected by DHF than the women (11.7%). We demonstrate that in the state of 
Oaxaca all four dengue virus serotypes (DEN 1-4) were present. We detected 
them in sera from dengue fever patients from 2005 using the semi-nested RT-
PCR. 
From 109 examinated sera we detected 65 positive and 44 negative, the most 
frequently serotype was DEN 4 with 25 positive probes. 
 
 12
 IV. Introducción 
 
 
 
1. Historia de las epidemias 
 
 
1.1 Mundial 
 
Los primeros brotes epidémicos, probablemente causados por dengue, que 
fueron documentados datan de 1779 y 1790 en África, Asia y América del 
Norte. De 1780 hasta 1940 se documentaron epidemias asociadas con dengue 
pero con menor frecuencia. Hoy viven más de 2,500 millones de personas en 
áreas de riesgo, donde se encuentran vectores que son capaces de transmitir 
el virus del dengue. Cada año se infectan 50 millones de personas con este 
virus y 500,000 de ellos desarrollan la fiebre hemorrágica del dengue (FHD), 
una forma grave de la enfermedad que causa cada año más de 12,000 muertes 
en el mundo (Monath 1994, Gubler 1998, WHO 1999). 
En los últimos 50 años ha habido un incremento en el número de casos fatales 
por dengue en las regiones tropicales y subtropicales del mundo (Díaz 2002). 
Esto coincide con el aumento demográfico y con el incremento de las zonas en 
las que los vectores del dengue pueden vivir. Por ejemplo, en 1979 se encontró 
la especie Aedes albopictus en Albania y para 1990 se reportó su presencia en 
19 provincias de Italia (Knudsen 1996). Actualmente, existe el riesgo que A. 
albopictus se distribuya en Europa en regiones donde la precipitación pluvial 
anual llega a 50 cm3, las temperaturas en el invierno no son menores de 0°C y 
en verano alcanzan los 20°C, y que incluye países como España, Portugal, 
Grecia, Turquía, Francia y partes de la República de Yugoslavia en los que 
antes no se esperaba encontrarlo. En los últimos 6 años, el área con riesgo de 
infección por dengue se ha expandido a zonas como El Sudan, Nepal, Hong 
Kong, Madagascar, las islas Galápagos y Hawaii (Figura 1). Además de que se 
han reportado brotes de FHD en Indonesia con 40,337 casos y más de 500 
casos fatales en el año 2004. En Angola y Timor, en el año 2005, con un 
número aproximadamente de 100 muertos notificados (OMS, 2005) para 
mencionar algunos ejemplos. 
 
 13
 
Figura 1: Distribución geográfica del área con riesgo de infección por dengue y su extensión 
durante los años 2000-2006 (pagina web, www.who.com/dengue/maps) 
 
 
1.2 América 
 
 
Desde hace 200 años se han documentado enfermedades con la 
sintomatología causada por el virus del dengue en América. La primera 
epidemia de dengue clásico se documentó en Venezuela y la Cuenca del 
Caribe en los años 1963-1964, causada por el serotipo 3. La siguiente 
epidemia afectó las Islas del Caribe en el año 1968 donde se aislaron los 
serotipos 2 y 3. En el año 1977, Jamaica sufrió un brote causado por el serotipo 
1 que también afectó otras regiones como las Islas del Caribe, México, Centro 
y Sudamérica, reportándose un total de más de 700,000 casos (PAHO 1979). A 
principio de los ochentas, el área afectada por el virus del dengue se expandió 
hasta los EEUU ( Nelson 1986). El serotipo aislado fue el 1, el cual también fue 
responsable del gran brote en Cuba donde se documentaron más de 10 
millones de enfermos, es decir, un 42% del total de la población (Kourí 1989, 
Guzmán 1984, Guzmán 1990). Posteriormente, entre los años 1982 y 1989, se 
 14
registraron brotes en América Sur, en países como Brasil, Bolivia, Paraguay, 
Ecuador y Perú que fueron causados por los serotipos 1 y 4 (Pinheiro 1989). 
Los estudios inmunológicos revelaron que varios millones de personas se 
habían infectado y además se reportó un aumento drástico de los casos de 
FHD y SCD (síndrome del choque del dengue) durante estas epidemias. Este 
patrón se observó en el brote de Cuba en 1981, que fue causado por el virus 
serotipo 2 y donde se reportaron 344,203 casos de dengue, que incluyeron 
10,312 casos clasificados como FHD y 158 defunciones (Kourí 1989, Guzmán 
1990).Hoy en día Brasil obtiene el lugar número uno en la lista de los países 
en América (Anexo I) con el número más alto de casos de dengue y dengue 
hemorrágico. Setenta por ciento de los casos reportados en América 
corresponden a Brasil y México ocupa el tercer lugar (WHO, DengueNet, 
2007). 
 
 
1.3 México 
 
De 1947 hasta la década de los sesentas, la Secretaría de Salud en México 
realizó intensivas campañas contra el vector transmisor del virus de dengue A. 
aegypti, y aunque el mosquito fue oficialmente declarado erradicado del país en 
1963 (Figura 2), dos años después fue detectado de nuevo en territorio 
mexicano (Gómez 1992). La peor epidemia de la enfermedad producida por el 
serotipo 1 fue reportado en la costa oriental de México durante 1979-1980. 
Durante 1981, se registraron aproximadamente 17,000 casos (Díaz 2002) y 
para 1984 y 1985 se diagnosticó dengue en 25 de los 32 estados del país. 
Actualmente se considera que la enfermedad, producto de la diseminación del 
vector, sigue en expansión principalmente debido a la urbanización de 
territorios nuevos (Brison-García 1996). Quince estados han reportado la 
ocurrencia de casos de FHD y en siete de ellos se han presentado 
defunciones. Los estados con la mayor tasa de letalidad son Chiapas y 
Guerrero (SSA 1995). Para el año 2006 la Organización Mundial de la Salud 
(OMS) reportó en México 27,287 casos de dengue, de los cuales 4,477 de ellos 
fueron clasificados como FHD (WHO, DengueNet, 2007). 
 
 15
1930 1960 2001
 
Figura 2: Distribución de Aedes aegypti en América durante 1930, 1960 y 2001 (Gubler D.J., 1998, 
modificado por Martínez-Soriano U., 2002) 
 
 
 
2. El virus 
 
El virus del dengue pertenece a la familia Flaviviridae y al género Flavivirus. Es 
el virus más importante del mundo transmitido por un mosquito en lo que se 
refiere al número de casos y a la mortalidad. Existen cuatro tipos serológicos o 
serotipos (DEN 1, 2, 3 y 4). El virus del dengue contiene una cadena sencilla 
del RNA de polaridad positiva como genoma, que está protegido por una 
cápside formada por una proteína llamada C que a su vez está rodeada por 
una membrana o envoltura donde se encuentran las proteínas M (PrM) y E 
(Figura 3). La proteína E contiene determinantes antigénicos que son 
diferentes en cada serotipo y es la responsable de la producción de diferentes 
anticuerpos durante de la reacción inmunológica en el hombre. El genoma del 
virus del dengue contiene 10,723 nucleótidos aproximadamente y codifica para 
10 proteínas (Chambers 1990). Los marcos de lectura abiertos de los 
diferentes serotipos oscilan entre 10,158 bases (DEN 4) y 10,173 bases (DEN 
2,3) y codifican poliproteínas aproximadamente de 3,400 aminoácidos. Los 
genes C, E y PrM codifican las proteínas estructurales y los genes NS1, NS2A, 
NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5 las proteínas no estructurales (Figura 4). Las 
 16
no estructurales incluyen las grandes proteínas NS1, NS3 y NS5, las cuales 
son extremamente conservadas, y las cuatro proteínas pequeñas NS2A, NS2B, 
NS4A y NS4B que son hidrofóbicas (Rice 1985, Rice 1996, Westaway 1987). 
La NS2B y NS3 forman un complejo que funciona como proteasa; NS4A y 
NS4B son responsables de posicionar el complejo replicativo en la membrana 
del retículo endoplásmico y la proteína NS5 posee la función de RNA 
polimerasa dependiente de RNA. 
 
 
Figura 3: Modelo del virus del dengue ( Modrow S., Falke D., Truyen U., Molekulare 
Virologie, Spektrum Verlag, 2003) 
 
 
 
Figura 4: Genoma del virus del dengue. El RNA genómico de dengue de 10723 nt, 
flanqueado por dos regiones no traducidas (NT) localizadas en os extremos 5´ y 3´ del genoma, 
codifica para tres proteínas estructurales (C, PrM y E) y siete no estructurales (NS1-NS5). En la 
parte inferior se indica el nucleódito correspondiential inicio y final de cada proteína. 
97
 
43
9 
93
7 
24
22
 
34
78
 
41
32
 
45
22
 
63
76
 
68
22
 
75
70
 
10
27
7 
10
72
3 
C PrM E NS1 NS2A NS2B NS3 NS4A NS4B NS5 
1 
3´ NT 5´ NT 
 17
3. Sintomatología 
 
La enfermedad causada por el virus del dengue se puede presentar en 
diferentes formas, como son el dengue clásico o fiebre del dengue (FD) y la 
fiebre hemorrágica por dengue (FHD), que puede desembocar en un síndrome 
del choque por dengue (SCD). El tiempo de incubación del virus desde su 
ingreso al organismo hasta el inicio de los síntomas es de 3 a 7 días. Los 
síntomas de FD característicos son fiebre, dolores retrorbitales y abdominales, 
náuseas, vómito, neutropenia, linfopenia y trombocitopenia moderada (Díaz 
1988). 
La infección con un serotipo del virus del dengue confiere inmunidad de por 
vida a la infección por virus homólogos pero no por serotipos heterólogos. La 
FHD ocurre con mayor frecuencia en pacientes que cursan con una segunda 
infección causada por un serotipo heterólogo, lo que sugiere la participación del 
sistema inmune (Gubler 1998, Rico-Hesse 1997) y del fenómeno de infección 
facilitada por anticuerpos (del inglés, "Antibody-dependent enhanced infection“). 
La fiebre hemorrágica del dengue es particularmente peligrosa en niños 
menores de 15 años (Martínez 1990) y representa un cuadro de alto riesgo 
caracterizado por fiebre alta, apatía, hematocrito elevado e hipotensión. Puede 
producirse choque por la salida del plasma a los espacios intersticiales y 
probablemente el 50 % de los pacientes con esta alteración mueren (Modrow 
2003). Se ha observado, en pacientes con fiebre hemorrágica, la inflamación 
del hígado y la extravasación de plasma hacia los espacios intersticiales, 
trombocitopenia acelerada, crecimiento y necrosis de las células Kupffer 
(Bhamarapravati 1967). 
La FHD ha sido definida por la Organización Mundial de Salud (OMS) como un 
cuadro clínico (Díaz 1988) caracterizado por fiebre, manifestaciones 
hemorrágicas (prueba del torniquete positiva y hemorragias en mucosas), 
trombocitopenia (100.000/ mm3 o menos) y hemoconcentración (manifestada 
por una elevación del hematocrito en un 20 % o más del valor normal) 
(Nimmannitya 1969). Así mismo ha establecido 4 diferentes grados: El primero 
está definido por fiebre acompañada de síntomas generales no específicos, la 
única manifestación hemorrágica es la prueba del torniquete positiva. El 
segundo grado está caracterizado por una hemorragia espontánea, 
 18
acompañada de las manifestaciones del primer grado. En el tercer grado existe 
insuficiencia circulatoria y el cuarto grado se manifiesta en el choque profundo 
con franca hipotensión arterial y pulso imperceptible (Nimmannitya 1969). 
 
 
4. Patogénesis 
 
El virus del dengue se transmite al hombre por la picadura del mosquito A. 
aegypti e infecta primero a las células dendríticas residentes de la piel, las 
cuales transportan el virus al sistema linfático, particularmente a los linfonodos 
regionales, donde pueden infectar a otras células, entre ellas los macrófagos. 
El paciente presenta una fase de viremia que tiene una duración de 4-5 días 
con una concentración de partículas virales de 108 hasta 109 por mililitro de 
sangre. Entre las células susceptibles al virus se encuentran, además a los 
macrófagos, las células epiteliales y las células de médula ósea, pero también 
el virus es detectable en órganos como hígado, pulmón, riñón y tracto 
gastrointestinal. El virus del dengue es además capaz de replicarse en cultivos 
de células de mamífero y de mosquito (CDC, Organización Panamericana de la 
Salud, 1981). 
Las células de mamífero que generalmente se emplean para detectar al virus 
por el método de placa lítica, son las células de riñón de mono LLC-MK2 
(rhesus monkey kidney cells) y GMK (green monkey kidney cells) (Halstead 
1984). Estudios similares probaron que los virus DEN 1 y DEN 4 se replican en 
cultivos de células de riñón de perro PDK (primary dog kidney cells), así como 
en células de hámster BHK (Syrian baby hamster kidney cells) (Halstead 1984, 
Puri1997). 
La FHD y el SCD son el resultado de un aumento de la permeabilidad vascular 
(Organización Mundial de la Salud, 1987) y se han sugerido dos hipótesis 
para explicar estas formas graves de la enfermedad. 
Primero, se ha propuesto la participación de mecanismos inmunopatológicos 
(Scott 1976) donde se involucra la participación del sistema inmune en un 
proceso denominado "Antibody-dependent enhancement“ por sus siglas en 
inglés, para explicar las observaciones paradójicas en las que (I) monos 
inmunizados con un virus del dengue heterólogo exhiben viremias mayores que 
monos normales, y (II) leucocitos de sangre periférica provenientes de 
 19
donadores inmunizados con dengue replican el virus con mayor eficiencia que 
leucocitos de donadores no inmunizados (Halstead 1979, Halstead 1988, 
Halstead 1981, Guzmán 1981). A este respecto, Halstead propuso que la 
existencia previa de anticuerpos (infección primaria) contra un serotipo y la 
siguiente reinfección con un serotipo diferente (infección secuencial heteróloga) 
dentro de un tiempo determinado, podían ser condiciones importantes para que 
se presentaran las manifestaciones graves. Esta aseveración se sustenta en el 
hecho de que en los pacientes desarrollan anticuerpos contra el virus durante 
la infección primaria que, aunque tienen capacidad neutralizante contra el 
serotipo causal, son capaces de unirse a la proteína E de cualquiera de los 
otros serotipos, pero no pueden impedir la infección, sino por el contrario, 
permiten el ingreso del virus al macrófago a través del receptor Fc. Como 
ejemplo, se han demostrado que las reinfecciones por los serotipos 2, 3 o 4 se 
asocian más frecuentemente con este fenómeno cuando los individuos han 
estado previamente en contacto con el serotipo 1. 
Halstead propuso también que la patogénesis de la FHD y el SCD radica 
principalmente en que los anticuerpos IgG preformados no neutralizantes y 
heterotípicos forman un complejo anticuerpo-virus que facilita la unión y la 
infección en los monocitos, lo que permite una amplificación progresiva de la 
progenie viral en estas células con su consecuente destrucción y liberación de 
diversos factores, entre ellos algunos vasoactivos o que tienen ingerencia en la 
coagulación sanguínea (Henchal 1987; Halstead 1979; Halstead 1981, 
Halstead 1988; Guzmán 1984, Guzmán 2002, Henchal 1990). 
La segunda hipótesis propone que los virus pueden presentar diferentes grados 
de virulencia (variación antigénica), lo que puede estar relacionado 
directamente con las manifestaciones graves de la enfermedad, por 
consiguiente la FHD puede presentarse también en pacientes que han sido 
infectados por primera vez con cualquiera de los serotipos del virus del dengue. 
Por ejemplo, la infección primaria con DEN 2, que estuvo asociada con casos 
fatales de FHD/ SCD durante un brote del dengue en la Isla Nieu en 1972, 
sugiere que algunas cepas de este virus pueden poseer un elevado potencial 
virulento capaz de causar manifestaciones graves (Scott 1976; Trent 
Vorndam 1981). 
 20
5. Ciclo replicativo 
 
El primer paso en el proceso de infección de un virus a su célula blanco es la 
interacción con la superficie celular. Para el caso del virus del dengue sólo 
algunas moléculas han podido ser identificadas entre las que se encuentran el 
heparán sulfato (Chen 1997), el receptor a la laminina (Skoonwatanyoo 2006), 
la proteína GRP78 (Jindadamrongwech 2004), las proteínas de choque 
térmico HSP70 y 90 (Reyes de Valle 2005), los receptores Fc, que permiten al 
virus del dengue infectar a los macrófagos (Littaua 1990) y la lectina DC-SIGN 
la cual media la infección a las células dendrícas (Klimastra 2003, 
Tassaneetrithep 2003, Navarro-Sanchez 2003 ). 
El virus ingresa a las células huéspedes por medio de endocitosis. Una vez 
dentro del endosoma, el aumento de la concentración de iones de hidrógeno 
provoca un cambio en el pH que induce una fusión entre las membranas viral y 
endosomal. De esta manera se libera el genoma viral al citoplasma y se 
encuentra accesible para interaccionar con los compartimentos celulares. El 
genoma viral interactúa con la maquinaria celular que lleva a cabo la traducción 
(Figura 5). De esta manera se sintetiza la poliproteína viral que se asocia a la 
membrana del retículo endoplásmico rugoso (RER). De manera co-traduccional 
ocurre el procesamiento proteolítico de esta poliproteína, principalmente por 
medio de la proteasa viral NS2B-NS3, dejando libre y activa a la proteína NS5, 
la RNA polimerasa dependiente de RNA. La porción de la poliproteína viral que 
posee las proteínas estructurales se asocia a la membrana del RER y forma la 
cápside (proteína C) y la envoltura (proteínas E y PrM). La RNA polimerasa 
viral replica el genoma y los genomas de polaridad positiva resultantes se 
asocian a la proteína C situada en la membrana RER. Este proceso está 
asistido por las proteínas NS4A y NS4B virales. La asociación del genoma viral 
a la cápside inicia un proceso de germinación hacia al lumen del RER con lo 
que se forman las nuevas partículas virales envueltas (Figura 5) que 
posteriormente son transportadas al aparato de Golgi y finalmente abandonan 
la célula por exocitosis ( Chambers 1990). 
 
 21
 
Figura 5: Ciclo replicativo del virus del dengue (Modrow S., Falke D., Truyen U., Molekulare 
Virologie, Spektrum Verlag, 2003) 
 
 
 
6. El vector 
 
 
 
El virus del dengue es transmitido al hombre por un vector. El vector más 
importante en las Américas es el mosquito A. aegypti. 
Un extenso estudio de la tribu Aedini por parte de Reinert, Harbach y Kitching 
causó un cambio de la taxonomía respeto a Aedes aegypti (Reinert 2004). Se 
han examinado 172 características de todos los estados de vida (que incluye 
los huevos, los cuatro estadios larvales, los adultos masculinos y femeninos y 
los genitales) de 12 géneros, 56 subgéneros y 119 especies de la tribu. Como 
resultado de estas observaciones Aedes aegypti fue trasladado al género 
Stegomyia aegypti. Sin embargo, todavía es común el uso del término Aedes 
aegypti, por lo que se continuará empleando esta dominación en el presente 
trabajo. 
 
A. aegypti tiene su origen en África y probablemente fue transportado a 
América en barriles de agua dentro de barcos en el tiempo de la colonización. 
 22
A. aegypti es una especie que se encuentra distribuida en las zonas tropicales 
y subtropicales del mundo. Debido a su estrecha asociación con el hombre, es 
esencialmente un mosquito urbano sin embargo, en Brasil, México y Colombia 
se han notificado considerables infestaciones rurales, a veces a muchos 
kilómetros de distancia de las poblaciones y de las carreteras. Por otro lado, la 
distribución de A. aegypti está limitada por la altitud. Aunque generalmente no 
se encuentra por encima de los 1,000 metros, se ha observado a 2,121 metros 
en la India y a 2,200 metros en Colombia (en Oaxaca a 1,600 metros), donde la 
temperatura anual media es de 17°C. 
A. aegypti prefiere depositar sus huevos en recipientes con agua limpia, de 
color oscuro y diámetro ancho, especialmente aquéllos que se localizan en 
áreas sombreadas. 
El desarrollo embrionario normal se completa en 48 horas cuando el ambiente 
es húmedo y cálido. Una vez completado, los huevos pueden resistir largos 
periodos de sequedad, hasta por más de un año, lo que hace difícil su 
erradicación. 
Las larvas pasan por 4 estadios de desarrollo cuya duración es dependiente de 
la temperatura, la disponibilidad de alimento y la densidad larvaria del 
receptáculo. En condiciones óptimas el desarrollo ocurre entre 5 a 10 días pero 
puede reducirse a 2 o 3 cuando la humedad es alta (Halstead 1984). 
Las hembras son hematófagas y se alimentan cada 4 días debido a que las 
proteínas de la sangre son necesarias para el desarrollo de los huevos (Salud 
Pública México, 1989). 
A. aegypti se alimenta preferencialmente del hombre. Se haprobado que el 
mosquito produce una mayor cantidad de huevos cuando se alimenta de 
sangre humana y esto se ha asociado con la alta concentración de isoleucina 
en ella (Scott 1997, Harrington 2001). 
El mosquito pica durante el día y puede transmitir el virus después de un 
periodo de 8-10 días, tiempo durante el cual se disemina en el cuerpo del 
insecto y se multiplica en las glándulas salivales. Después de 4 días de la 
inoculación intratorácica con DEN 2 se han observado una activa replicación 
viral en células de las glándulas salivales (Sriurairatna 1977), manifestada por 
la formación típica de estructuras vesiculares en el retículo endoplásmico (Ko 
1979). 
 23
El nivel más alto de partículas virales se alcanza después de 7-8 días de la 
infección, lo que correlaciona con los reportes que indican que los mosquitos 
infectados por dengue transmiten el virus después de 8-11 días de incubación 
en las glándulas salivales. También se han detectado partículas virales en 
órganos como el intestino, sistema nervioso y células epidérmicas 
(Sriurairatna 1978). 
Pocos receptores virales han sido caracterizados en células de mosquito, como 
la molécula relacionada con el receptor a la laminina (Chen 1997) del resto, 
sólo se conoce su peso molecular como son las proteínas de 40, 45, 67, y 80 
kDa (Salas-Benito 1997, Muñoz 1998, Mercado-Curiel 2006). Lo que 
aparentemente está claro es que, por estudios realizados con el serotipo 2 del 
virus del dengue, los receptores virales en las células del mosquito son 
diferentes a los reportados en células de mamífero (Hung 2004). 
 
Aparte de la transmisión bien conocida mosquito-humano-mosquito, llamada 
horizontal, existe otro mecanismo, la transmisión vertical, donde el virus es 
transmitido entre los mosquitos. Este mecanismo de transmisión ha sido 
implicado en la persistencia del virus del dengue en ciertas zonas geográficas y 
está documentando para un número creciente de flavivirus (Francy 1981, 
Turell 1988). 
La transmisión vertical del virus del dengue es dependiente del serotipo y de la 
cepa pero también de la especie del mosquito participante (Rosen 1983). Por 
ejemplo, en experimentos in vitro que en A. albopictus se ha demostrado que 
los cuatro serotipos se transmiten sexualmente de machos a hembras (Rosen 
1987) y a los descendientes (transmisión transovárica) (Rosen 1983, 
Gonçalves de Castro 2004). 
En A. aegypti sólo se pudo detectar el serotipo 1 en descendientes de 
mosquitos que fueron inyectados con el virus durante su estado larval (Rosen 
1983, Tesh 1980). 
Además de los trabajos realizados en el laboratorio, se ha probado que la 
transmisión vertical del virus del dengue ocurre en la naturaleza. Por ejemplo, 
se pudo aislar el serotipo 2 en larvas de A. aegypti de diferentes localidades en 
Rangoon (Khin 1983). 
 24
Por medio de inoculación intratorácica en la misma especie de mosquito con el 
serotipo DEN 3 se ha documentado la transmisión transovárica a la 
descendencia hasta la séptima generación, sin embargo, se ha observado un 
efecto negativo en la fecundidad y fertilidad de los mosquitos infectados así 
como un aumento en la duración del estado larval (Joshi 2002). El serotipo 4 
se ha detectado en huevos colectados en Trinidad y Tobago (Hall 1984, Hull 
1984) y en huevos y larvas de diferentes localidades de la Guinea Francesa 
(Fouque 2004). 
 
Generalmente la frecuencia de la transmisión transovárica es muy baja, mucho 
menos del 1%. Hall y Hull documentaron una infección de 5x10-4 en larvas y 
4x10-4 en huevos después de sus estudios en Trinidad y Tobago (Hall 1984, 
Hull 1984). En estudios matemáticos se ha calculado que el virus no se puede 
mantener en la naturaleza sin la transmisión horizontal (Fine 1975), sin 
embargo, la transmisión vertical podría tener importancia para la supervivencia 
del virus en periodos de tiempo donde las condiciones climatológicas no son 
óptimas para la reproducción del vector (Kuno 2005). 
 
 25
 
V. Justificación 
 
 
 
En México el dengue es un serio problema de salud pública ya que se estima 
que en aproximadamente 25 estados se han presentado casos de FD y de 
FHD. Por otro lado, se han detectado viremias generadas por los 4 serotipos 
del virus, por lo que existe el riesgo potencial de que se presenten brotes 
epidémicos de dengue hemorrágico. Esto, aunado a que no existe ni una 
vacuna ni un tratamiento antiviral específico, justifica plenamente todos los 
estudios encaminados al tratamiento y/o prevención de la enfermedad 
ocasionada por el virus del dengue. 
El estado de Oaxaca es una región endémica y uno de los estados con mayor 
riesgo de aparición de nuevos brotes con un amplio espectro de 
manifestaciones clínicos de la enfermedad. Recientemente se ha registrado 
una incidencia creciente de FD en las regiones de Tuxtepec y Juchitán con un 
aumento constante de casos de FHD. Por lo tanto, éste trabajo de investigación 
aporta información sobre el binomio vector-hombre en esta enfermedad. 
Siendo, los serotipos virales participantes y las infecciones previas, factores 
que pudieran relacionarse con la aparición de brotes epidémicos y la gravedad 
de los mismos en regiones específicas. 
La investigación experimental para buscar una relación entre la distribución de 
los serotipos y la existencia de la transmisión transovárica en el vector podría 
conducir a un sistema de prevención. Los experimentos para identificar los 
serotipos que están circulando en la población y en el vector podrían darnos 
información de si existe una correlación entre la aparición de FHD y la 
presencia de un serotipo determinado. 
La investigación de la existencia de la transmisión del virus desde las hembras 
en estado adulto hacia los óvulos desarrollados (transovárica) permitirá una 
mejor comprensión acerca del ciclo replicativo del virus del dengue y 
proporcionará información que sería útil en la evaluación de la importancia de 
este tipo de transmisión en la epidemiología del dengue. 
 
 
 26
VI. Objetivos 
 
 
 
General: 
• Determinación de la presencia, serotipificación y transmisión 
transovárica del virus del dengue en el vector A. aegypti procedente de 
dos regiones endémicas del estado de Oaxaca: Juchitán y Tuxtepec, así 
como en sueros humanos procedentes de varias localidades endémicas 
del estado de Oaxaca. 
 
 
Específicos: 
 
• Colecta de larvas de A. aegypti en las regiones de Juchitán y Tuxtepec y 
realizar la crianza de larvas hasta alcanzar el estado adulto. 
 
• Obtención de sueros de pacientes con dengue del Laboratorio Estatal de 
Salud Pública de Oaxaca (LESPO). 
 
• Extracción del RNA total de larvas y mosquitos y de los sueros de 
pacientes colectados. 
 
• Detección de la presencia del virus del dengue en muestras de larvas, 
mosquitos y sueros de pacientes por RT-PCR. 
 
• Identificación de los serotipos circulantes del virus del dengue en la 
población humana del estado de Oaxaca mediante RT-PCR anidada. 
 
 
 
 
 
 
 
 27
 
VII. Estrategia experimental 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Extracción del RNA 
total por medio del 
método con TRIZOL 
Detección del virus del dengue 
en muestras de mosquitos, 
larvas y sueros mediante la RT-
PCR 
Electroforésis de los 
amplificados 
Tipificación del virus del 
dengue en las muestras 
positivas por medio de PCR 
anidada 
Mosquitos Larvas Sueros 
Obtención de 
informaciones 
climatológicas 
Documentación de los 
resultados por medio 
de electroforesis 
Análisis de 
los resultados 
Obtención de los 
datos 
epidemiológicos del 
LESPO de los años 
2003-2006 
Realización de 
las estadisticas 
Obtención de 
sueros de 
pacientes con 
dengue del LESPO 
Captura de larvas de 
A. aegypti en Juchitán 
(Juris. II) y en 
Tuxtepec (Juris. III) 
Alimentación 
de larvas y 
críanza de 
mosquitos 
 28VIII. Materiales y Métodos 
 
1. Datos climatológicos y la elección de las regiones de captura 
Oaxaca es uno de los estados endémicos en México. Por los factores 
climatológicos siempre ha sido una región de riesgo para epidemias de dengue, 
específicamente en las regiones pertenecientes a las Jurisdicciones de 
Tuxtepec, Juchitán y la Costa, donde se han documentado frecuentemente 
brotes causado por el virus del dengue. Después de consultar a La Secretaría 
de Salud Pública en Oaxaca (LESPO), y debido ala alta incidencia de casos de 
FD se eligieron las regiones de Tuxtepec y de Juchitán (Mapa de Oaxaca, 
Página 31, Figura 9) para nuestros estudios. 
 
Los datos climatológicos, como temperatura y precipitación pluvial, se 
obtuvieron de la página de la red www.wonderground.com recomendada por la 
organización de Protección Civil de Oaxaca. Dado que los datos precisos de 
las localidades no se encuentran documentados, se utilizaron los datos de la 
estación climatológica más cercana a las localidades seleccionadas: para 
Juchitán se usaron los datos de la estación en Ixtepec, y para Tuxtepec se 
utilizaron los datos de Loma Bonita. Debido a que las distancias entre las 
estaciones y las localidades no exceden los 30 kilómetros y no existen barreras 
geográficas se consideró que los datos climatológicos de las estaciones eran 
válidos para las dos localidades estudiadas. 
 
2. Colecta de larvas de A. aegypti 
Las larvas del vector A. aegypti se colectaron de fuentes naturales ubicadas en 
casas de diferentes colonias donde se habían documentado casos de dengue 
por la Secretaría de Salud de Oaxaca. Las larvas de una localidad fueron 
reunidas en grupos que se mantuvieron separados unos de otros. En el 
laboratorio, se lavaron y fueron transferidas a contenedores con 500 ml de 
agua purificada. Las larvas fueron alimentadas con alimento para peces (marca 
Aquarium) y diariamente se cambió el agua para prevenir contaminaciones. Las 
larvas de diferentes localidades se mantuvieron separadas en jaulas (30 cm x 
30 cm x 30 cm) desde el principio, para evitar la mezcla de los mosquitos 
http://www.wonderground.com/
 29
emergentes y para mantenerlos aislados del medio ambiente, evitando así su 
alimentación con sangre humana. Los mosquitos recién emergidos fueron 
alimentados con una solución de 5% de azúcar. Quince días después de su 
emergencia fueron colectados e incubados por 5 minutos a -20°C para 
paralizarlos. Se removieron las alas y las patas y los cuerpos se utilizaron para 
el proceso de extracción de los ácidos nucleicos. 
 
3. Extracción del RNA total 
3.1 Mosquitos y larvas 
“Pools” de 20 cuerpos de mosquitos, sin alas y patas, o larvas del estadio larval 
cuatro, se colocaron en un tubo Eppendorf de 1.5 ml y se adicionaron 400 µl de 
TRIZOL® (Invitrogene). Después de homogenizar por 3 minutos, se agregaron 
100 µl de cloroformo, se agitó brevemente en el vortex y se incubaron por 5 
minutos a temperatura ambiente. Luego se centrifugó a 8,870 x g por 5 minutos 
a 4°C en la microcentrífuga (Eppendorf modelo 5417R), se recuperó la fase 
acuosa (superior) y se transfirió a un nuevo tubo de Eppendorf 1.5 ml. Se 
adicionaron 250 µl de 2 propanol (J.T. Baker), la mezcla se incubó 5 minutos a 
temperatura ambiente y luego se guardó a -70 °C toda la noche. 
Posteriormente las muestras se sometieron a un tratamiento con 1 µl de DNAsa 
(Roche) por 15 minutos a temperatura ambiente. 
 
3.2 Sueros de pacientes 
Las muestras de pacientes con dengue se obtuvieron del LESPO del año 2005. 
Se trató de muestras de suero de pacientes con cuadro clínico de sospecha de 
dengue diagnosticado clínicamente. Las muestras fueron tomadas dentro de 
los 7 primeros días después del inicio de la enfermedad y no pasaron más de 
10 días entre ésta y la realización del procedimiento de extracción del RNA. 
Inmediatamente después de la toma de la muestra, ésta fue almacenada a 4oC. 
Por medio de centrifugación se separaron los glóbulos rojos del suero. 
 
Para la realización del procedimiento de detección del virus del dengue en 
estas muestras, 200 μl de suero fueron colocados en un tubo Eppendorf de 1.5 
ml al cual se le adicionó 1 ml de TRIZOL® (Invitrogene). Se homogenizó 15 
 30
segundos y se dejó incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. Luego se 
agregaron 200 µl de cloroformo, se agitó brevemente en el vortex y se incubó 
por 3 minutos a temperatura ambiente. Después se centrifugó a 12,000 rpm por 
15 minutos a 4°C en la microcentrífuga (Eppendorf modelo 5417R), se 
recuperó la fase acuosa y se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf 1.5 ml. Se 
adicionaron 500 µl de 2 propanol (J.T. Baker), la mezcla se incubó 5 minutos a 
temperatura ambiente y luego se guardó a -70°C toda la noche. Finalmente las 
muestras fueron sometidas a un tratamiento con 1 µl de DNAsa (Roche) por 15 
minutos a temperatura ambiente. 
 
4. Tratamiento de los extractos con DNAsa 
El RNA total obtenido y precipitado con 2 propanol proveniente de los 
mosquitos y larvas o sueros de pacientes, se centrifugó a 12,000 x g por 10 
minutos a 4°C. La pastilla resultante se lavó con 75% etanol (Merck) y 
posteriormente se resuspendió en 26 µl de agua libre de RNAsa. Se 
adicionaron 3 µl del amortiguador correspondiente a una concentración 10X y 
10 U de DNAsa libre de RNAsa (Roche 776785). Después de 15 minutos de 
incubación a temperatura ambiente, la enzima se inactivó mediante calor a 
80°C por 20 minutos. Las muestras se precipitaron con 2.5 volúmenes de 
etanol absoluto (Merck) y 1.0 volúmen de acetato de sodio 3 M. Se incubó por 
30 minutos a -70°C y luego se centrifugó a 12.000 rpm por 30 minutos a 4°C. 
Se eliminó el sobrenadante y se lavó la pastilla con 1 ml de etanol 75%. Se 
centrifugó nuevamente a 12,000 rpm por 5 minutos a 4°C, se dejó secar la 
pastilla a temperatura ambiente en condiciones estériles y finalmente se 
resuspendió en 25 µl (en el caso de los sueros, la pastilla se resuspendió en 50 
µl) de agua libre de RNAsa. Las muestras se guardaron a -70°C. 
 
5. Evaluación de la Integridad del RNA 
La integridad del RNA se evaluó por medio de una RT-PCR empleando 
oligonucleótidos para el mRNA del gen de actina : 5´- ACGTGAAATCGTTCGT 
GACATTAG (sentido) y 5´-TTAACTTAGAAGCACTTGCGGTGAA (antisentido). 
Para realizar la RT-PCR se utilizó el kit RT-PCR Access® (Promega) y el 
termociclador (Geneamp PCR System 2400 de Perkin Elmer). Las siguientes 
 31
condiciones fueron utilizadas: para la retrotranscripción un ciclo de 45 minutos 
a 48°C seguido de uno de 5 minutos a 94°C para inactivar la retrotranscriptasa. 
Para la PCR, 35 ciclos compuestos cada uno de paso de desnaturalización a 
94°C por 30 segundos, uno de hibridación a 55°C por 1 minuto y uno de 
alargamiento a 68°C por 1 minuto. Al final se realizó un paso de 68°C por 10 
minutos. Las muestras se analizaron por medio de electroforesis en un gel de 
agarosa al 1.8% en amortiguador TBE 1X (89 mM Tris base, 89 mM acido 
bórico y 2 mM EDTA pH 8.0) con 5 µl de bromuro de etidio por cada 100 ml de 
agarosa. Las bandas se visualizaron en el UV transiluminador (Cole-Palmer 
95500). 
 
6. Detección del RNA viral por RT-PCR en muestras de larvas, 
mosquitos y sueros 
Para la detección del virus del dengue en las muestras obtenidas de los 
mosquitos, larvas y sueros se usó el kit RT-PCR Access® (Promega) y 
oligonucleótidos para el gen NS3 reportados por Seah (Seah 1995). El volumen 
final de la reacción contuvo amortiguador para PCR 1X con 1 mM MgSO4, 1µl 
de cada oligonucleótido (DV1sentido, DV1 antisentido), 0.2 mM de cada dNTP, 
1U de retrotranscriptasa AMV, 1U de DNA polimerasa Tfl y 15 ng de RNA total 
proveniente de los mosquitos o larvas. La reacción se realizó en el 
termociclador (Geneamp PCR System 2400 Perkin Elmer) bajo las siguientes 
condiciones: 45 minutos a 48°C para la reacción de RT seguido de un paso de 
la inactivación de la retrotranscriptasa AMVa 94oC x 5 min. La PCR consistió 
en 30 ciclos, cada uno constituido por un paso de desnaturalización (a 94°C por 
30 segundos), uno de alineamiento de los oligonucleótidos (a 55°C por 1 
minuto) a uno de alargamiento (a 68°C por 1 minuto). Al final se incluyó un 
paso de extensión a 68°C por 10 minutos. Las muestras se analizaron por 
medio de electroforesis como se describió previamente (ver inciso 5). 
 
Secuencias de los oligonucleótidos: 
DV1 sentido 5´- GGRACKTCAGGWTCTCC -3´ 
DV1 antisentido 5´- AARTGYGCYTCRTCCAT- 3´ 
K=G/T, R=A/G, Y=C/T, W=A/T 
 32
Programa original (Promega): 
 
RT-PCR: 
 
48°C 45 minutos AMV/Tfl 5x amortiguador 10µl 
(1x) 
94°C 5 minutos dNTP Mix (10 mM cada NTP) 1µl 
 
94°C 30 segundos Oligonucleótidos 50 pmol 
(1 µM) 
60°C* 1 minuto 40 ciclos* 25 mM MgSO4 2 µl (1 
mM)** 
68 °C 2 minuto H2O (libre de Rnasa) add 50 
µl 
 AMV retrotranscriptasa 1 µl 
 Tfl polimerasa 1 µl 
 
68°C 10 minutos* 
 
4°C ∞ RNA aprox. 
15 µl 
 
 
* condiciones que se han cambiado en ambas reacciones, ** condiciones que se han cambiado en la 
PCR anidada 
 
Programas estandarizados: 
 
RT-PCR: PCR anidada: 
 
48°C 45 minutos 94°C 5 minutos 
94°C 5 minutos 
 
 
94°C 30 segundos 94°C 30 segundos 
55°C 1 minuto 30 ciclos 55°C 1 minuto 30 ciclos 
68 °C 1 minuto 68°C 1 minuto 
 
68°C 10 minutos 68°C 10 minutos 
4°C ∞ 4°C ∞ 
 
Reacciones estandarizadas: 
 
RT-PCR: PCR anidada: 
 
AMV/Tfl 5x amortiguador 10µl (1x) AMV/Tfl 5x amortiguador 10µl(1x) 
dNTP Mix (10 mM cada NTP) 1µl dNTP Mix (10 mM cada NTP) 1µl 
Oligonucleótido 1 µM Oligonucleótidos 1 µM 
25 mM MgSO4 1 mM 25 mM MgSO4 1.5 mM 
H2O (libre de Rnasa) add 50 µl H2O (libre de Rnasa) add50µl 
AMV retrotranscriptasa 1 µl 
Tfl polimerasa 1 µl Tfl polimerasa 1 µl 
RNA 15 ng RNA 15/30ng 
 
 
 
 33
7. Determinación de los serotipos virales por medio de PCR 
anidada 
 
7.1 En muestras de larvas y mosquitos adultos 
Para la identificación del serotipo del virus del dengue en los “pools” detectados 
como positivos, se utilizaron 1ng de los oligonucleótidos serotipo-específicos 
antisentido (DSP 1-4) reportados por Seah (Seah 1995). Estos oligonucleótidos 
amplifican un fragmento del gen NS3 con diferentes tamaños según el serotipo: 
169 pb (DEN 1), 362 pb (DEN 2), 265 pb (DEN 3) y 426 pb (DEN 4). Como 
oligonucleótido sentido se utilizó el DV1 sentido (ver inciso 6). Los 
componentes del kit RT-PCR Access® (Promega) se utilizaron para un 
volumen final de 50 µl, conteniendo 20 µl (depende de la concentración en el 
producto de la RT-PCR se utilizaron entre 8 y 15 ng del RNA) de de la reacción 
de la RT-PCR positiva para la detección del virus del dengue descrita en el 
inciso 6, 1.5 mM MgSO4, 1X de amortiguador para PCR, 0.2 mM de cada dNTP 
y 1 U de polimerasa Tfl. Por medio del termociclador se realizó la reacción con 
las siguientes condiciones: 1 ciclo de desnaturalización 5 minutos a 94°C 
seguidos por 30 ciclos, cada uno constituido por un paso de desnaturalización 
(94°C a 30 segundos), uno de alineamiento de los oligonucleótidos (55°C por 1 
minuto) y uno de alargamiento (a 68°C por 1 minuto). Se concluyó con un paso 
a 68°C por 10 minutos con la finalidad de terminar las reacciones de 
alargamiento. El producto se analizó por medio de electroforesis como ya se 
describió (ver inciso 5). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 34
Secuencias de los oligonucleótidos: 
 
OLIGO-
NUCLEÓTIDOS 
 
 
SECUENCIA 
POSICIÓN DE LOS 
NUCLEÓTDOS EN EL 
GENOMA DEL VIRUS 
DEL DENGUE 
DSP 1 5´ - AGTTTCTTTCCTAAACACCTCG - 3´ 5067 - 5045 
DSP 2 5´ - CCGGTGTCTRGCYCTGAT - 3´ 5279 - 5260 
DSP 3 5´ - TTAGAGTYCTTAAGCGTCTCTTG - 
3´ 
5174 - 5152 
DSP 4 5´ - CCTGGTTGACAAAAGTCTTG - 3´ 5342 - 5320 
 
 
7.2 En muestras de sueros 
Básicamente la reacción de tipificación de los serotipos en las muestras de 
sueros de pacientes se realizó de la misma manera y en las mismas 
condiciones que en los mosquitos y las larvas. La reacción se preparó con los 
mismos componentes utilizando las mismas concentraciones con excepción de 
la cantidad de RNA. Depende de la concentración en el producto de la RT-
PCR, se utilizaron aproximadamente 30 ng. 
 35
IX. Resultados 
 
1. Estandarización de los métodos RT-PCR y PCR anidada 
Antes de llevar a cabo la detección y tipificación del virus del dengue en las 
muestras provenientes tanto del vector como de los pacientes, fue necesario 
establecer las condiciones de uso del kit RT-PCR Access® de Promega y de los 
oligonucleótidos diseñados por Seah y colaboradores (Seah 1995). Se 
utilizaron como templado cuatro diferentes estándares del virus del dengue, 
que coinciden con los serotipos 1-4: DEN 1 (Hawaii), DEN 2 (cepa donada por 
el Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, México), 
DEN 3 (H-87) y DEN 4 (H-241). La primera prueba se realizó bajo las 
condiciones recomendadas por Promega para el kit empleado. La reacción dió 
como resultado la amplificación de muchos fragmentos no específicos 
(resultado no mostrado). 
 
 
Entonces se realizó una serie de experimentos para encontrar las condiciones 
óptimas para la amplificación de los fragmentos en la reacción de RT-PCR con 
los oligonucleótidos generales (DV1s y DV 1as), así como para la reacción de 
PCR anidada con los oligonucleótidos para tipificar los cuatro serotipos del 
virus del dengue (DV1s y DSP1-4). Para ellos se realizaron varias 
modificaciones con la finalidad de lograr una reducción en la amplificación de 
los fragmentos no específicos. Por ejemplo, se redujo el tiempo de 
alargamiento de 2 minutos a 1 minuto y se disminuyó el número de los ciclos 
de la amplificación tanto de la RT-PCR como de la PCR anidada. Los 
resultados no siempre fueron satisfactorios; la reducción del tiempo de reacción 
de la retrotranscripción de 45 a 30 minutos causó la falta de amplificación en 
ambas reacciones. Cuando se redujo el tiempo de hibridación de los 
oligonucleótidos de 1 minuto a 30 segundos en la PCR anidada, no se 
amplificaron los fragmentos correspondientes a los serotipos 1 (no mostrado) y 
2 (Figura 6). 
 
 
 
 36
 
 
 
 
Figura 6: Productos de PCR anidada con una disminución en el tiempo de hibridación de los 
oligonucleótidos de 1 minuto a 30 segundos Carriles: 1 no hubo una amplificación del 
fragmento específico del serotipo 2; 2: se muestra el fragmento específico (265 pb) del serotipo 
3, M: marcadador λ-ladder de 100 pb. 
 
 
 
También se disminuyó la temperatura de hibridación de los oligonucleótidos en 
ambas reacciones, lo que resultó en la amplificación de los fragmentos 
específicos para los cuatro serotipos pero también de varios fragmentos no 
específicos (resultado no mostrado). Durante la estandarización de la reacción 
PCR anidada se realizó una reacción en cual se utilizaron diferentes 
concentraciones de Mg2+ (Figura 7). La concentración de 1 mM de Mg2+ resultó 
ser muy baja para amplificar exitosamente los fragmentos específicos de los 
cuatro serotipos (datos no mostrados), siendo la de 1.5 mM de Mg2+ la 
concentración óptima (Figura 7, carriles 1-2). Una reducción del tiempo del 
paso de alargamiento final a 7 minutos en ambas reacciones dio el resultado 
deseado (Figura 8). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 2 M 
300 
1000 
500 
200 265 pb 
pb 
 37
 
 
 
 
Figura 7: Productos de PCR anidada, tipificación de los serotipos 2 y 4 con diferentes 
concentraciones de Mg2+. Carriles: 1-2: la reacción se realizó con 1.5 mM de Mg2+, se 
amplificaron los fragmentos que coinciden con los de DEN 2 (1) y DEN 4 (2), casi no hubo 
amplificados no específicos;3-4: PCR con una concentración de 2.0 mM de Mg2+, se 
amplificaron los fragmentos específicos de DEN 2 (3) y DEN 4 (4), pero hubo amplificaciones 
de varios fragmentos no específicos; M: marcador λ-ladder de 100pb. 
 
 
 
 
Figura 8: Productos de RT-PCR y PCR anidada para los serotipos 2 y 4. Carriles: 1-3: 
productos generados con los oligonucleótidos DV1s y DV1as. Se amplificaron los fragmentos 
típicos (470 pb) empleando RNA del virus DEN 2 (1) y DEN 4 (2); no hubo amplificación en el 
control negativo (3), 4-5: productos de PCR anidada para los serotipos DEN 2 (4) y DEN 4 (5) 
empleando los productos de RT-PCR y los oligonucleótidos DV1s, DSP 2 y 4; 4: se amplificó el 
fragmento específico del serotipo 2 (326 pb), 5: se amplificó el fragmento específico del 
serotipo 4 (426 pb), 6: control negativo, no hubo amplificación; M: marcador λ-ladder de 100 pb. 
 
 
 
362 pb 
426 pb 
400 
1000 
500 
300 
4M 1 2 3
426 pb 
362 pb 
470 
500 
300 
1 5 3 M 2 4 M 6 
pb 
pb 
 38
2. Transmisión transovárica 
Oaxaca es uno de los estados en México donde el virus del dengue es 
endémico. En nuestro estudio elegimos 2 regiones de las más endémicas del 
estado para evidenciar la presencia del virus del dengue en su vector A. 
aegypti: Juchitán, que está localizado en la Jurisdicción II (el Istmo) y 
Tuxtepec, en la Jurisdicción III (Tuxtepec) (Figura 9). Durante el tiempo que 
duraron nuestros estudios, se documentaron 479 casos de la enfermedad 
causada por el virus del dengue en Juchitán y 274 casos en el área localizada 
alrededor de Tuxtepec (información proporcionada por el LESPO). Las larvas 
de A. aegypti fueron recolectadas en el año 2005 durante dos periodos: abril-
junio y agosto-octubre, sobre todo en casas ubicadas en colonias con historial 
previo de casos de dengue (SSA de Oaxaca, Jurisdicciones II y III, Depto. 
Epidemiología). En total se colectaron 3,020 larvas de Tuxtepec y 2,680 larvas 
de Juchitán. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9: Mapa del estado de Oaxaca donde se muestran las localidades donde se 
colectaron las larvas de A. aegypti [indicadas con una estrella a) Tuxtepec; b) Juchitán]. Valle 
Centrales=Jurisdicción I, Istmo=Jurisdicción II, Tuxtepec=Jurisdicción III, Costa=Jurisdicción IV, 
Mixteca=Jurisdicción V, Sierra=Jurisdicción VI. 
 
 
a) 
 
Costa
Tuxtepec
Mixteca
Istmo 
a) 
b)
Valle 
central 
Sierra 
 39
Para evidenciar la existencia de una relación entre la población del vector y las 
condiciones climatológicas, se documentaron los números de larvas capturadas 
y la precipitación pluvial local, así como la temperatura de los meses en que 
fueron realizadas las colectas. Los datos climatológicos se obtuvieron de la 
pagina web www.wunderground.com (Tablas 1 y 2). La mayoría de las larvas 
que se encontraron en Tuxtepec fueron colectadas en los meses de junio y 
agosto, lo que coincidió con los picos máximos de precipitación pluvial (Figura 
10 y Tabla 1). Juchitán, por otra parte, dado que es una localidad más seca 
que Tuxtepec el número total de larvas colectadas en esta localidad fue menor 
que para Tuxtepec. En este caso el número más alto de las larvas fue obtenido 
durante el mes de agosto, lo que también coincidió con uno de los picos más 
altos de precipitación pluvial en esa localidad durante el año 2005 (Figura 11 y 
Tabla 2). En Tuxtepec, el promedio de la temperatura máxima osciló entre 
22°C y 29°C; en Juchitán entre 25°C y 30°C. En Tuxtepec la colecta máxima de 
larvas coincidió con una temperatura promedio de 27°C a 28°C y en Juchitán 
de 28°C (Tablas 1 y 2). 
 
 
 
 
 
 
Tabla 1: Datos de precipitación pluvial y temperatura, número de larvas colectadas y casos 
de dengue mensuales para la Jurisdicción III en el año 2005. 
 
 
Tuxtepec 
MES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC
Lluviaa 7.0 13.3 2.8 0.6 50.8 112.4 5.7 223.8 101.5 101.8 9.0 1.0 
Temperaturab 22 22 24 25 28 28 27 27 27 28 23 22 
Colección de 
Larvas 
--- --- --- 450 450 580 --- 650 480 410 --- --- 
Casos de 
dengue 
--- --- --- 9 5 13 15 74 55 58 43 2 
a precipitación de lluvia en cm3, b reportado en °C 
 
 
 
 
 
http://www.wunderground.com/
 40
 
Tuxtepec
0
100
200
300
400
500
600
700
en
e feb ma
r
ab
r
ma
y jun ju
l
ag
o
se
p oc
t
no
v dic
Año 2005 (meses)
N
úm
. d
e 
la
rv
as
 
co
le
ct
ad
as
0
50
100
150
200
250
Pr
ec
ip
ita
ci
ón
 p
lu
vi
al
 
(c
m
3)
Larvas colectadas
Casos de dengue
Precipitación pluvial
 
Figura 10: Documentación gráfica de los datos de la tabla 1, incluye promedios de 
precipitación pluvial mensual, el número de larvas colectadas y los casos de dengue 
documentados por el LESPO, para el año 2005 en Tuxtepec. 
 
 
 
 
Tabla 2: Datos de la precipitación pluvial y temperatura, número de larvas colectadas y casos 
de dengue mensuales para la Jurisdicción II en el año 2005. 
 
 
Juchitán 
MES ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC 
Lluviaa --- --- --- 0.06 --- 0.08 30.6 61.5 30.7 66.9 --- 20.4
Temperaturab 25 25 26 28 30 29 28 28 29 27 26 25 
Colección de 
Larvas 
--- --- --- 260 410 380 --- 720 430 480 --- --- 
Casos de 
Dengue 
3 1 0 0 0 6 67 87 144 150 66 3 
a precipitación de lluvia en cm3, b reportado en °C 
 41
Juchitán
0
100
200
300
400
500
600
700
800
en
e
fe
b
m
ar ab
r
m
ay ju
n ju
l
ag
o
se
p
oc
t
no
v
di
c
Año 2005 (meses)
N
úm
. d
e 
la
rv
as
 
co
le
ct
ad
as
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Pr
ec
ip
ita
ci
ón
 p
lu
vi
al
Larvas colectadas
Casos de dengue
Precipitación pluvial
 
 
Figura 11: Documentación gráfica de los datos de la tabla 2, incluye promedios de 
precipitación pluvial mensual, el número de larvas colectadas y los casos de dengue 
documentados por el LESPO, para el año 2005 en Juchitán. 
 
 
La detección del virus del dengue en las larvas capturadas se realizó por medio 
de la técnica reportada por Seah y colaboradores (Seah 1995), la cual fue 
inicialmente estandarizada mediante el empleo de cuatro diferentes estándares 
del virus del dengue, que coinciden con los serotipos 1-4, propagados en el 
laboratorio por inoculación intracerebral en ratones recién nacidos (lactantes) y 
por infección de células C6/36 del mosquito: DEN 1 (Hawaii), DEN 2 (cepa 
donada por el Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, 
México), DEN 3 (H-87) y DEN 4 (H-241). La Figura 12A muestra los diferentes 
productos de RT-PCR obtenidos con las cepas de los cuatro serotipos del virus 
del dengue empleados como controles: 169 pb para DEN 1, 362 pb para DEN 
2, 265 pb para DEN 3 y 426 pb para el serotipo DEN 4. 
 
En total se analizaron 31 “pools” de 20 individuos cada uno, de larvas 
capturadas en las dos regiones elegidas, Juchitán y Tuxtepec. No se pudo 
detectar el virus del dengue en ninguno de los 31 “pools” de larvas con el 
método descrito (Figura 12B y Tabla 3), sin embargo fue posible amplificar la 
banda que corresponde al fragmento de mRNA del gen de actina de A. aegypti, 
lo cual prueba la integridad del RNA extraído (Figura 12B). 
 
b)o 
 42
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12A) Electroforésis de los productos de RT-PCR. Se amplificó un fragmento de la 
secuencia de la proteína NS3 de los cuatro serotipos (1-4) del virus de dengue con los 
oligonucleótidos DV1s (sentido) y DSP1-4 (antisentido) como cebadores específicos 
empleando RNA total extraído de la línea celular C6/36 infectada por separado con cada uno 
de los diferentes serotipos del virus del dengue. Carriles DV1-4: productos generados de 169, 
326, 265 y 426 pb específicos para los distintos serotipos. 
12B) Electroforesis de los productos de la RT-PCR de un “pool” detectado positivo para el 
serotipo DEN 4, de mosquitos (las lavas se colectaron en Juchitán, en octubre 2005). Lar: 
“pool” de larvas de la misma colecta; Mos: se amplificó un producto de 426 pb que coincide con 
el fragmento de DEN 4 (Fig. 10A); DV4: como control positivo, se utilizóel producto de RT-PCR 
de la línea celular C6/36 infectada con DEN 4; Actina: producto de RT-PCR con 
oligonucleótidos de actina A. aegypti, se amplificó el fragmento de 518 pb en todas las 
reacciones. 
 
El resto de las larvas de A. aegypti capturadas en el campo se criaron en el 
laboratorio (UABJO, Escuela de Veterinaria, Lab. Biología molecular) bajo 
condiciones controladas hasta que alcanzaron el estado adulto. Los mosquitos 
se dejaron madurar 14 días para asegurar la replicación del virus del dengue 
en los tejidos de los ovarios y las glándulas salivales (Rosen 1987). Para los 
exámenes subsecuentes se utilizaron exclusivamente hembras. 
Se analizaron 43 “pools” de mosquitos adultos, 20 individuos por “pool”, 
provenientes de diferentes localidades, ubicadas en las regiones de Tuxtepec y 
Juchitán, por medio de RT-PCR semi-anidada. En total se analizaron 860 
mosquitos. 
En cuatro “pools” fue detectado el virus del dengue (Tabla 3 y Figura 12B). 
Dos de ellos tuvieron su origen en Tuxtepec y los otros en Juchitán. Se calculó 
la tasa mínima de infección (Minimum infection rate, MIR) como: (el número de 
los “pools” positivos/ el número total de individuos examinados) x 1000 (Nasci 
500 
400 
300 
200 
100 
1000 
500 
400 
300 
D
V
4 
M
os. 
L
arpb 
426 
Actin 
D
V
1 
D
V
2 
D
V
3 
D
V
4 
B 
pb 
A 
1000 
 43
1996, Katholi 2006). Basado en esta fórmula, se calculó una MIR/1000 de 4.3 
para Tuxtepec y de 5.0 para Juchitán, lo que resulta en una MIR promedio de 
4.7 (Tabla 3). En relación al porcentaje de positividad, se detectó un 8.7 % en 
Tuxtepec y un 10 % en Juchitán del total de “pools” examinados, lo que da un 
promedio general del 9.3 % de “pools” positivos. 
 
Se realizó la reacción PCR para tipificar el serotipo de los cuatro “pools” 
positivos para el virus del dengue. En los dos “pools” de Juchitán se detectó el 
serotipo DEN 4 y en los de Tuxtepec uno fue positivo para el serotipo DEN 2 y 
el otro del serotipo DEN 3 (Tabla 3 y Figura 12B). 
 
 
 
Tabla 3: Detección y tipificación del virus del dengue en muestras de mosquitos *todos 
mosquitos examinados fueron hembras ** todos los mosquitos se colectaron en el estadio 
larval y se criaron en el laboratorio para la detección del virus del dengue 
 
 
ESTADIO 
DE VIDA 
NO. “POOLS” 
POSITIVOS/ NO. 
“POOLS” 
EXAMINADOS 
 NO. TOTAL 
DE 
INDIVIDUOS 
EXAMINAD
OS 
„POOLS“ 
EXAMINADOS 
TASA 
MÍNIMA DE 
INFECCIÓN/ 
1000 
SEROTIPO
S 
DETECTA
DOS 
Larvas/ 
Juchitán 
 
0/14 
 
280 
 
14 
 
- 
 
- 
Larvas/ 
Tuxtepec 
 
0/17 
 
340 
 
 
17 
 
- 
 
- 
Mosquitos 
adultos**/ 
Juchitán 
 
2/20 
 
400 
 
20 
 
5 
 
DEN 4 
Mosquitos 
adultos**/ 
Tuxtepec 
 
2/23 
 
460 
 
23 
 
4.3 DEN 2, 3 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 44
 
 
3. Muestras de pacientes con dengue del estado de Oaxaca 
En total se examinaron 109 muestras mediante RT-PCR y PCR anidada como 
se describió anteriormente, excepto para el procedimiento en la detección del 
serotipo 1, donde hubo la necesidad de cambiar las condiciones. En las series 
de diluciones se notó que los oligonucleótidos para la detección de este 
serotipo son 100 veces menos sensibles que para los serotipos 2-4 (Figura 
13). Por esta razón se repitió la reacción de tipificación para las muestras que 
resultaron negativas bajo el uso de las condiciones descritas. Se utilizaron 30 µl 
de RNA y 2 µl de los oligonucleótidos DV1s y DSP 1. 
 
 
 
 
 
 
Figura 13: Serie de diluciones del RNA de los serotipos 1 y 3 del virus del dengue. 
Amplificación de diferentes concentraciones del RNA de los serotipos 1 y 3. Para el serotipo 1 
sólo hubo una amplificación con una concentración del RNA viral de 10 ng. Para el serotipo 3 
se amplificaron los fragmentos específicos desde una concentración de 10 ng hasta 0.08 ng. 
 
De los sueros examinados, 8 pacientes procedieron de la Jurisdicción I, 14 de 
la Jurisdicción II, 76 eran de la Jurisdicción III, 4 de la Jurisdicción IV y 7 de la 
Jurisdicción V. De las 109 muestras analizadas, 44 fueron negativas y 65 
positivas. Se detectaron los cuatro serotipos en pacientes de la Jurisdicción III. 
En las muestras provenientes de las Jurisdicciones II y V se encontraron 3 
serotipos que fueron DEN 1, 3 y 4 para la Jurisdicción II y DEN 1, 2 y 4 para la 
Jurisdicción V. Los serotipos más frecuentemente detectados fueron DEN 4 en 
25 muestras y DEN 1 en 22 muestras. A razón de los resultados obtenidos, se 
169 pb 
DEN 1
10
 n
g 
2 
ng
 
0,
4 
ng
 
0,
08
 n
g 
DEN 3 
10
 n
g 
2 
ng
 
0,
4 
ng
 
0,
08
 n
g 
265 pb 
C- 
100 
300 
500 
pb 
 45
puede sugerir que en las Jurisdicciones I-V circulan los cuatro serotipos (Tabla 
4, Figura 14 y Anexo III), sin embargo, estos resultados deben considerarse 
con cautela ya que la cantidad de las muestras obtenidas de las diferentes 
Jurisdicciones es muy variable y no se puede afirmar con seguridad si la 
distribución de los serotipos que se ha obtenido es representativa. 
 
 
 
 
Figura 14: Resultados obtenidos de la PCR anidada realizada con los productos de RT-PCR 
de muestras de sueros de pacientes utilizando los oligonucleótidos DV1s y DSP1-4 para 
tipificar el serotipo del virus del dengue. Carriles 1 y 4: se amplificó el fragmento del serotipo 1 
(169 pb); 2, 5 y 6: se ha detectado el serotipo 3 se muestra el fragmento específico (265 pb); 3: 
se ha amplificado el fragmento específico del serotipo 4 (426 pb); M marcador λ-ladder de 100 
pb. 
 
Tabla 4: Resultados del análisis de muestras de pacientes del dengue por PCR del estado de 
Oaxaca en el año 2005, * una muestra fue positiva para DEN 2 y 3. ** una muestra fue positiva 
para DEN 3 y 4 
 
Jurisdicción Muestras 
examinadas 
Muestras 
negativas 
Muestras 
positivas 
DEN 1 DEN 2 DEN 3 DEN 4 
I 8 5 3 - 2* 1 - 
II 14 6 8 3 - 2 3 
III 76 30 46 15 9 3 19** 
IV 4 1 3 1 - - 2 
V 7 2 5 3 1 - 1 
total 109 44 65 22 12 6 25 
169 pb 
265 pb 
426 pb 400 
200 
300 
500 
1000 
2 1 M 3 4 5 6 pb 
 46
 
Un resultado interesante fue que en dos muestras se detectaron dos serotipos. 
Una de ellas tuvo su origen en la Jurisdicción I y se detectaron los serotipos 2 y 
3. La otra precedió de la Jurisdicción III y se encontraron los serotipos 3 y 4. 
Probablemente los pacientes fueron infectados con cada uno de los serotipos 
por diferentes mosquitos en un lapso de tiempo corto. La otra opción es que 
fueron infectados por un mosquito que transmitió los dos serotipos. 
 
 
 
 
4. Estadística de los casos documentados en el estado de 
Oaxaca en los años 2003-2006 
 
En los últimos cuatro años se ha documentado un aumento significativo 
(Figura 15) en el número de casos de esta enfermedad en el estado de 
Oaxaca. El número de los casos de FD creció de 147, en el año 2004, a 2,954 
en el año 2006. También hubo un crecimiento en el número de casos de FHD, 
de 49 en el año 2004, a 420 en el año 2006. 
 
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
c
a
s
o
s
2003 2004 2005 2006
ano
Casos de FD y FHD en el estado de 
Oaxaca 2003-2006 
FD
FHD
 
Figura 15: Casos de FD y FHD en el estado de Oaxaca durante el periodo 2003-2006. 
 
 
 
 
 
 
 47
Durante el año 2003, la mayoría de los casos de FD se presentaron durante los 
meses de septiembre-noviembre cuando hubo más de 30 casos al mes y lo 
que coincidió con la distribución de los casos de FHD (Figura 16). En 
septiembre se confirmó un máximo en el número de los casos de FD con un 
total de 52. 
En el año 2005 los meses más endémicos fueron julio-noviembre, con más de 
100 casos de FD confirmados (Figura 17). En octubre se documentaron 215 
casos de FD, que fue el máximo para este año. De julio- agosto se presentó la 
mayoría de casos de FD en el año 2006 (Figura 18) obteniéndose el pico 
máximo durante el mes de septiembre con 683. 
 
0
10
20
30
40
50
60
c
a
s
o
s
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
mes
Casos de FD y FHD en 2003
FD
FHD
 
Figura 16:Casos de FD y FHD mensuales del año 2003 en el estado de Oaxaca. 
 
 
 
0
50
100
150
200
250
c
a
s
o
s
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
mes
Casos de FD y FHD en 2005
FD
FHD
 
Figura 17: Casos de FD y FHD mensuales del año 2005 en el estado de Oaxaca. 
 48
 
En los tres años documentados (no se ha documentado el año 2004 por falta 
de datos) se encontró una coincidencia entre el intervalo de tiempo donde se 
reportó el mayor número de casos con el de mayor precipitación pluvial. En 
general, en estos mismos meses se presentaron también más casos de FHD 
(Figura 16-18). 
 
0
100
200
300
400
500
600
700
c
a
s
o
s
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
mes
Casos de FD y FHD en 2006
FD
FHD
 
Figura 18: Casos de FD y FHD mensuales del año 2006 en el estado de Oaxaca 
 
 
 
Los resultados referentes a la distribución de los casos de dengue en las 
Jurisdicciones Sanitarias se presentan en la figura 19: (I) Valle Centrales, (II) 
Istmo, (III) Tuxtepec, (IV) Costa, (V) Mixteca y (VI) Sierra (ver también Página 
31, Figura 9). Como se puede observar en el gráfico 7, hay un notable pico 
para la Jurisdicción IV en el año 2006, cuando más del 50% del número total de 
casos de dengue se presentaron en esta Jurisdicción. Solamente las 
Jurisdicciones III y V no reportaron el número más alto en el año 2006. En los 
años 2003 y 2006, la Jurisdicción IV obtuvo el primer lugar con el número más 
alto de casos de dengue (Figura 19). En el año 2004 este lugar fue ocupado 
por la Jurisdicción III y en el año 2005 por la Jurisdicción II. En las 
Jurisdicciones V y VI se han presentado pocos casos de dengue (Figura 19), lo 
que se puede explicar por las condiciones geográficas, ya que la mayor parte 
del área incluida en estas Jurisdicciones se encuentra en las montañas, a una 
 49
altura de más de 1,600 metros sobre el nivel del mar, una altitud no 
acostumbrada por el vector. 
 
1 2 3 4 5 6
0
500
1000
1500
2000
2500
n
o
.
 
c
a
s
o
s
Jurisdicción
Distribución de los casos del dengue por 
Jurisdicciones en los anos 2003-2006
2003
2004
2005
2006
 
Figura 19: Distribución de los casos de dengue en los años 2003-2006 en las Jurisdicciones 
Sanitarias del estado de Oaxaca 
 
 
0
100
200
300
400
500
600
c
a
s
o
s
1 2 3 4 5 6
Jurisdicción
Distribución por Jurisdicciones
FD, masculino
FD, femenino
FHD, masculino
FHD, femenino
 
Figura 20: Distribución por sexo de los casos de FD y FHD en las Jurisdicciones del estado 
de Oaxaca, 2003-2006. 
 
 
 
 
 50
La distribución por sexo de los casos de FD y FHD en las diferentes 
Jurisdicciones Sanitarias fue analizada y se presenta en la figura 20. En los 
últimos cuatro años el número más alto de casos de FD y FHD para hombres y 
mujeres se ha presentado en la Jurisdicción IV. Aparte de la Jurisdicción III, se 
documentaron en todas las Jurisdicciones más casos de FHD para hombres 
que mujeres, aunque en las Jurisdicciones I, III y IV hubo más mujeres 
enfermas de FD. 
 
 
0
100
200
300
400
500
600
N
O
.
 
C
A
S
O
S
0 
a 
1 
1 
a 
5
6 
a 
10
11
 a
 1
5
16
 a
 2
0
21
 a
 2
5
26
 a
 3
0
31
 a
 3
5
36
 a
 4
0
41
 a
 4
5
45
 a
 5
0
ma
s 
de
 5
0
EDAD
Distribución de los casos de FD y FHD por sexo y 
edad
FD, masculino
FD, femenino
FHD, masculino
FHD, femenino
Figura 21: Distribución de los casos de FD y FHD de pacientes masculinos y femeninos por 
grupos de edad en los años 2003-2006 en el estado de Oaxaca. 
 
El número más alto de pacientes de ambos sexos con FD y FHD cae dentro del 
grupo de edad de 11 a 15 años, seguido de los grupos de 6 a 10 y de 16 a 20 
años. En todos los grupos de edad de más de 16 años, las mujeres ocuparon el 
primer lugar en FD con respecto a los hombres, y a excepción de los grupos de 
1 a 5 años, de 31 a 35 años y más de 50 años, el número de casos de FHD es 
mayor para los hombres que para las mujeres (Figura 21 y Tabla 5). 
 
Por los resultados presentados, se puede notar una tendencia en cuanto al 
número de casos por sexo: los hombres en general padecen con menos 
frecuencia FD pero con mayor frecuencia FHD que las mujeres. La tabla 5 
muestra datos de FD y FHD para cada grupo de edad en ambos sexos. Se ha 
 51
calculado el porcentaje de los casos de FHD en base al número total de casos 
por cada uno de los sexos. Se obtuvo como resultado que el 14.9 % de los 
casos de dengue en hombres se presentaron como FHD y solamente el 11.6 % 
de los casos en pacientes femeninos, en base al número total de casos de 
dengue en este grupo. Esta diferencia fue analizada mediante la prueba χ2 
(Chi-cuadrada), la que dio un valor de 0.0013, el cual es importante si se toma 
en cuenta que un valor menor a 0.05 en esta prueba indica una diferencia 
significativa. 
 
 
 
 
 
 
Tabla 5: Casos de FD y FHD en pacientes masculinos y femeninos, en los diferentes 
grupos de edad. Se realizó la suma FD+FHD para hombres y mujeres. 
 
 
Edad FD ♂ FD♀ FHD♂ FHD♀ ∑ FD+ FHD ♂ 
∑ FD+ 
FHD ♀ 
0-1 12 11 3 1 15 12 
1-5 149 133 16 25 165 158 
6-10 383 366 60 53 443 419 
11-15 519 449 76 64 595 513 
16-20 244 299 59 34 303 333 
21-25 109 162 29 23 138 185 
26-30 66 123 17 16 83 139 
31-35 71 128 13 19 84 147 
36-40 70 111 15 13 85 124 
41-45 44 75 16 6 60 81 
45-50 37 78 7 7 44 85 
Más de 
50 143 171 12 17 155 188 
∑ 1847 2106 323 278 2170 2384 
% de 
los 
casos 
en total 
 
40.6 
 
46.2 
 
7.1 
 
6.1 
 
47.7 
 
52.3 
 
 
 
 
 
 
 
 52
 X. Discusión 
 
1. Transmisión transovárica 
El dengue es la enfermedad viral más importante en el mundo transmitida por 
un mosquito y hasta hoy no se ha desarrollado un tratamiento antiviral o una 
vacuna específica contra el virus del dengue. Hasta hoy, la única manera de 
luchar contra esta enfermedad es el control del vector (Kourí 2006). El 
mosquito no sólo es un transmisor sino que también es un elemento 
determinante que selecciona algunos genotipos virales sobre otros (Chevillon 
2003) y A. aegypti es un mosquito especialmente susceptible a la infección por 
el virus del dengue (Sumanochitrapon 1998). 
 
Durante el año 2005 se documentó la presencia de los cuatro serotipos en el 
estado de Oaxaca. Los más frecuentes fueron DEN 1, 2 y 4 (SSA, Oaxaca 
2006). En nuestros estudios pudimos detectar los serotipos 2, 3 y 4 en 
mosquitos y los cuatro serotipos en sueros de pacientes (ver inciso VII 2 y 4), lo 
cual coincide con los datos reportados por la Secretaría de Salud. Es 
interesante que se han reportado más casos de dengue en la región de 
Juchitán (Jurisdicción II) que en Tuxtepec (Jurisdicción III), pero fue posible 
colectar más larvas de A. aegypti en Tuxtepec. Esto podría deberse a la 
diferencia en las condiciones climatológicas, Tuxtepec es una región menos 
calida y más húmeda que Juchitán. 
Fue notoria la correlación directa entre la precipitación pluvial y la colecta de 
larvas. Pudimos colectar en las dos localidades, más larvas durante el tiempo 
de lluvias, cuando la humedad fue más alta, que en otros meses del año, 
mucho más secos. Esta observación es totalmente congruente con las 
condiciones propicias para el desarrollo de los huevos y las larvas del vector 
(Gibbons 2002). Esta correlación se observó en un nivel menor para la 
temperatura. Por ejemplo, en Juchitán la temperatura más alta se reportó en 
mayo, con 30°C, pero solamente se colectaron 410 larvas, mientras que en 
agosto, cuando la temperatura sólo alcanzó los 28°C, se pudo obtener la 
cantidad más alta de individuos (Tabla 2 y Figura 12). Por otro lado, en mayo 
no se registró lluvia en Juchitán pero aún así se pudieron recolectar hasta 410 
 53
larvas. Estos resultados respaldan la teoría de que la concurrencia de los 
factores lluvia y temperatura es importante para el desarrollo de A. aegypti 
(Gibbons 2002). 
 
El mecanismo de la transmisión mejor documentado para el virus del dengue 
es el horizontal (humano-mosquito-humano). En efecto, se ha observado que 
descendientes de mosquitos