Tese de Doutorado em Farmacologia sobre Fibrose Renal em Ratos Diabéticos

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La presente tesis es publicada a texto completo en virtud de que el autor 
ha dado su autorización por escrito para la incorporación del documento a la 
Biblioteca Digital y al Repositorio Institucional de la Universidad de Guadalajara, 
esto sin sufrir menoscabo sobre sus derechos como autor de la obra y los usos 
que posteriormente quiera darle a la misma. 
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA 
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS DE LA SALUD 
DOCTORADO EN FARMACOLOGÍA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TESIS DE GRADO 
 
EFECTO DE AMINOGUANIDINA SOBRE LA FORMACIÓN 
DE PRODUCTOS FINALES DE GLUCOSILACIÓN 
AVANZADA EN RELACIÓN A LA EXPRESIÓN DE GENES 
IMPLICADOS EN LA FIBROGÉNESIS DURANTE LA 
PROGRESIÓN DE FIBROSIS RENAL EN RATAS 
DIABÉTICAS 
 
 
ALAN OMAR VÁZQUEZ ALVAREZ 
 
Guadalajara, Jalisco. Agosto 2016 
 
2 
 
 
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA 
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS DE LA SALUD 
DOCTORADO EN FARMACOLOGÍA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TESIS DE GRADO 
 
EFECTO DE AMINOGUANIDINA SOBRE LA FORMACIÓN DE 
PRODUCTOS FINALES DE GLUCOSILACIÓN AVANZADA EN 
RELACIÓN A LA EXPRESIÓN DE GENES IMPLICADOS EN LA 
FIBROGÉNESIS DURANTE LA PROGRESIÓN DE FIBROSIS 
RENAL EN RATAS DIABÉTICAS 
 
PRESENTA 
M.C.P. ALAN OMAR VÁZQUEZ ALVAREZ 
 
Directora de tesis 
DRA. EN C. MARÍA CRISTINA ISLAS CARBAJAL. 
 
Co-Directora de tesis 
DRA. EN C. ANA ROSA RINCÓN SÁNCHEZ 
 
Guadalajara, Jalisco. Agosto 2016 
COLABORADORES 
 
3 
 
 
M. en C. Lourdes Yolotzin Rodríguez Herrera 
Dra. en C. Alma Ingrid Leal Anguiano 
Dra. en C. Alma Marlene Guadrón Llanos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
Instituciones participantes 
Instituto de terapéutica Experimental y Clínica (INTEC), Departamento de 
Fisiología, Centro Universitario de Ciencias de la Salud. Universidad de 
Guadalajara, Guadalajara, Jalisco. 
 
 
 
Agradecimientos 
Mi sincero agradecimiento: 
A mis papás y hermanos, por su comprensión y todo el apoyo incondicional en 
cada momento. 
A Edith Gómez, por estar siempre a mi lado durante toda esta gran experiencia, 
sin tu apoyo y comprensión en todo momento no hubiera sido este camino de la 
misma forma. Gracias Juri. 
 A mi tutora, María Cristina Islas Carbajal, por todo el apoyo, tiempo y dedicación 
que invirtió en mi para lograr alcanzar esta meta. 
Igualmente a mi co-tutora, Ana Rosa Rincón Sánchez, quien de igual forma estuvo 
siempre al tanto de que contará con la mejor asesoría en cada procedimiento así 
como su apoyo en todo momento. 
A la Dra. Claudia Charles, al Dr. Ramón Jiménez y al Patólogo José Cruz por todo 
su apoyo, sus enseñanzas, paciencia y tiempo. 
A mis compañeros del Doctorado en Farmacología, porque todo su apoyo y 
opiniones son fuentes de inspiración y motivación. Dando mayor énfasis a Simón 
Rodríguez, Homero Contreras, Adriana Muñoz y Marlín Corona, quienes me 
apoyaron en mayor medida con su conocimiento y enseñanzas en esta camino 
recorrido. ¡Gracias chicos! 
Alan Vázquez 
 
 
 
5 
ÍNDICE 
I. ABREVIATURAS 6 
II. ÍNDICE DE TABLAS 10 
III. ÍNDICE DE FIGURAS 10 
IV. ÍNDICE DE GRÁFICAS 11 
V. RESUMEN 12 
1. INTRODUCCIÓN 14 
2. MARCO TEORICO 17 
3. ANTECEDENTES 48 
4. JUSTIFICACIÓN 54 
5. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 56 
6. HIPÓTESIS 56 
7. OBJETIVOS 57 
 7.1 Objetivo General 57 
 7.2 Objetivos específicos 57 
8. METODOLOGÍA 58 
 8.1 Material y métodos 58 
 8.1.1 Diseño de estudio 58 
 8.1.2 Universo de estudio 58 
 8.1.3 Tamaño de muestra 59 
 8.1.4 Características de los grupos 60 
 8.2 Criterios de selección 61 
 8.2.1 Criterios de inclusión 61 
 8.2.2 Criterios de exclusión y eliminación 61 
 8.3 Operacionalización de variables 62 
 
6 
 8.4 Descripción de procesos 63 
 8.4.1 Flujograma 63 
 8.4.2 Preparación de dieta modificada 64 
 8.2.3 Inducción del modelo con estreptozotocina 64 
 8.2.4 Medición de glucemia 65 
 8.2.5 Administración de aminoguanidina 65 
 8.2.6 Sacrificio de animales 66 
 8.2.7 Descripción histológica 66 
 8.2.8 Pruebas bioquímicas 67 
 8.2.9 Expresión de genes 68 
 8.2.10 Determinación de AGEs en suero 70 
 8.2.11 Filtración glomerular 70 
9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 71 
10. CONSIDERACIONES ÉTICAS71 
11. RESULTADOS 73 
12. DISCUSIÓN 102 
13. CONCLUSIONES 116 
14. PERPECTIVAS 117 
15. BIBLIOGRAFÍA 118 
16. ANEXOS 136 
 
 
 
 
 
 
7 
I. ABREVIATURAS 
 
α-SMA Alfa-actina del músculo liso 
AG Aminoguanidina 
AGEs Productos finales de glucosilación avanzada (por sus 
 siglas en inglés: Advanced Glycation End Products) 
BMI Indice de masa corporal (por sus siglas en inglés: 
 Body Mass Index) 
BMP Proteína morfogénica de hueso (por sus siglas en 
 inglés: Bone Morphogenic Proteins) 
BUN Nitrógeno Ureico Sanguíneo 
CTGF Factor de Crecimiento del Tejido Conectivo 
DM2 Diabetes mellitus tipo 2 
EMT Transición epitelial a mesenquimal 
ERO Especies reactivas de oxígeno 
GLUT Transportador de Glucosa 
GMPc Guanosin monofosfato cíclico 
Gcs Guanilato ciclasa soluble 
GFR Tasa de filtración glomerular 
HDL Lipoproteína de alta densidad 
HF Insuficiencia cardíaca 
DM Dieta Rica en grasas y carbohidratos (modificada) 
 
8 
HMCs Células Mesangiales primarias Humanas 
HTECs Células epiteliales del Túbulo proximal Humanas 
iNOS Isoforma inducible de la sintasa del óxido nítrico 
IDF Federación Internacional de Diabetes (por sus siglas 
 en inglés: International Diabetes Federation) 
LDL Lipoproteína de baja densidad 
OxLDL LDL oxidada 
L-NAME Ester metil de L-arginina 
ME Matriz extracelular 
MBG Membrana basal glomerular 
MIP-1 Péptido quimioatrayente de los monocitos-1 
mRNA RNA mensajero 
NF-kB Factor nuclear-kapa B 
NFPD Nefropatía diabética 
NO Óxido nítrico (Nitric Oxide, por sus siglas en inglés) 
NADPH Dinucleótido de nicotinamida y adenina, forma 
 reducida 
NOS Sintasa del óxido nítrico 
PKC Cinasa de proteína C 
RAGE Receptor de AGEs 
 
9 
sAGE AGEs soluble 
SMAD Proteína similar a Mad (Mothers against 
 decapentaplegic de la Drosophila) y Sma de 
 Caenorhabditis elegans 
STZ Estreptozotocina 
TBR-I Receptor tipo I de TGF-β 
TBR-II Receptor tipo II de TGF-β 
TGF-β Factor de crecimiento transformante-beta 
TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa 
VLDL Lipoproteína de muy baja densidad 
VEGF Factor de crecimiento vascular endotelial 
 
 
 
 
 
 
 
 
10 
I. ÍNDICE DE TABLAS 
Tabla 1 Histopatología en la NFPD 20 
Tabla 2 Tabla de operacionalización de variables 62 
Tabla 3 Lista de genes evaluados así como su código de referencia 69 
Tabla 4 Promedio y desviación estándar de los parámetros fisiológicos de los 3 
grupos de estudio 
75 
Tabla 5 Expresión de genes en tejido renal de ratas Wistar por semanas de 
evaluación 
94 
 
 
II. ÍNDICE DE FIGURAS 
Figura 1 Mecanismos de la fisiopatología de la DM2 18 
Figura 2 Vías implicadas en la fisiopatología de la NFPD 23 
Figura 3 Proceso de formación de AGEs 25 
Figura 4 Conformación del complejo receptor AGE (AGE-R) 27 
Figura 5 Representación gráfica del receptor RAGE y su variante soluble (sRAGE) 29 
Figura 6 Mecanismos de acción de los receptores AGE-R y RAGE 31 
Figura 7 Vía de señalización de TGF-β/ SMAD 34 
Figura 8 Elementos estructurales de las proteínas Smad 36 
Figura 9 Factores moleculares implicados en la NFPD 42 
Figura 10 Estructura química de la Aminoguanidina 43 
Figura 11 Mecanismo de acción de Aminoguanidina 45 
 
11 
Figura 12 Diagrama general del modelo DM2 63 
Figura 13 Cortes histológicos de riñón con tinción tricrómico de Masson de ratas 
Wistar machos de los grupos a través de las 25 semanas de evaluación 
90 
 
III. ÍNDICE DE GRÁFICAS 
Gráfica 1 Parámetros fisiológicos en ratas Wistar macho durante las 25 semanas 76 
Gráfica 2 Concentraciones séricas de AST y ALT de ratas Wistar macho 80 
Gráfica 3 Concentraciones séricas de TP y Albúmina de ratas Wistar macho 81 
Gráfica 4 Concentraciones séricas de Urea y Creatinina de ratas Wistar macho 82 
Gráfica 5 Concentración de AGEs en suero de ratas Wistar macho 85 
Gráfica 6 Tasa de Filtración Glomerular en ratas Wistar machos determinada por 
la fórmula de Krinkle 
91 
Gráfica 7 Expresión génica relativa de TGF-β1 en tejido renal de ratas Wistar 95 
Gráfica 8 Expresión génica relativa de SMAD7 en tejido renal de ratas Wistar 96 
Gráfica 9 Expresión génica relativa de CTGF en tejido renal de ratas Wistar 97 
Grafica 10 Expresión génica relativa de Colágena 1 en tejido renal de ratas Wistar 99 
Grafica 11 Expresión génica relativa de VEGF en tejido renal de ratas Wistar 100 
 
 
 
 
 
 
12 
RESUMEN 
Antecedentes. La nefropatía diabética (NFPD), una complicación microvascular 
de la diabetes mellitus, se presenta en más del 30% de los pacientes y del 70-80% 
desarrollarán enfermedad renal terminal. Se caracteriza por microalbuminuria, 
deterioro de la tasa de filtración glomerular (GFR, por sus siglas en ingles 
glomerular filtration rate) y alteraciones a nivel glomerular. La hiperglucemia 
circulante incrementa la formación de productos finales de glucosilación avanzada 
(AGEs por sus siglas en inglés, Advanced glycation end products), quienes al 
modificar proteínas estructurales o interacción con RAGE participan en el 
desarrollo de la NFPD. Los AGEs también son capaces de activar genes 
implicados en la producción de fibrosis glomerular e intersticial. La 
Aminoguanidina (AG), un inhibidor de AGEs, ha demostrado disminuir el desarrollo 
de las complicaciones microangiopaticas en modelos experimentales de diabetes. 
No se conoce completamente su participación en el perfil de expresión de genes 
relacionados con la NFPD en modelos experimentales de diabetes mellitus tipo 2 
(DM2). Objetivo. Evaluar el efecto de AG sobre la inhibición de AGEs y su 
relación sobre la progresión de fibrosis renal mediante la expresión de TGF-β1, 
CTGF, VEGF, Colágena 1 y SMAD-7 en ratas diabéticas. Métodos. Se indujo 
DM2 en ratas Wistar macho (200-250g), mediante 5 dosis consecutivas de STZ 
(20mg/kg) i.p. aunado a una dieta modificada alta en grasa y carbohidratos (DM) 
implementada 15 días previos a la inducción y durante todo el periodo de 
evaluación (25 semanas). Se consideraron diabéticos los animales con glucosa 
sérica ≥300mg/dL, evaluada previo a cada sacrificio, con muestras sanguíneas 
 
13 
obtenidas mediante punción de cola en ayuno y determinadas por glucómetro 
ACCu-CHEK Performa®. La dieta modificada (DM) se preparó adicionando los 
siguientes componentes a razón de 1kg: 0.1% de colesterol, 1% de sacarosay 
10% de aceite de coco. La administración de AG fue de 20mg/kg/d i.p. durante las 
25 semanas. Se realizaron sacrificios en el día basal, semana 4, 15, 20 y 25 
mediante exanguinación previa anestesia con Zoletil 50® y la colocación de ratas 
en cajas fisiológicas por 24 horas para los parámetros fisiológicos. Se extrajeron 
ambos riñones para evaluar la fibrosis mediante tinción Tricrómico de Masson y el 
perfil de expresión génica de los genes TGF-β1, CTGF, VEGF, Colgena-1 alfa 
(Col-1a) y Smad-7 mediante qRT-PCR usando un sistema de detección con 
sondas TaqMan® mediante el aparato StepOne™ Real-Time PCR System, 
expresando los valores con el método 2-ΔΔCt usando β-actina como gen endógeno. 
El suero se utilizó para evaluar la función hepática (AST, ALT, TP, Albúmina) y 
función renal (Urea, Creatinina sérica y urinaria), así como para evaluar la GFR, 
así como la medición de los AGEs séricos mediante ELISA (Elabscience®). 
Análisis estadístico. Las variables cuantitativas se expresaron con medias y 
desviación estándar como medida de dispersión. Se analizaron con la prueba de 
Kruskal Wallis usando U Mann Whitney como post hoc en SPSS v.20, 
considerando como significativo una p ≤0.05. Resultados. El modelo 
implementado presentó hiperglucemia persistente, mostrando las características 
clínicas y bioquímicas de la DM2. El desarrollo de las alteraciones estructurales 
histológicas de la NFPD con fibrosis progresiva hasta la semana 25 así como un 
incremento en el perfil de expresión génica de TGF-β1, CTGF y Col-1a y una 
reducción en la expresión de Smad-7 y VEGF promoviendo la fibrogénesis. El 
 
14 
grupo que recibió AG mostró una disminución significativa en los niveles de urea y 
creatinina, aminoró el desarrollo de las complicaciones histológicas de la NFPD a 
nivel glomerular, preservó la GFR así como modificó el perfil de expresión 
favoreciendo Smad-7 y VEGF y disminuyendo TGF-β1, CTGF y Col-1a de forma 
significativa. Conclusiones. El tratamiento con AG (20mg/kg/d) disminuyó de 
forma significativa los niveles séricos de AGEs sin presentar alteraciones 
hepáticas, estos beneficios se manifiestan con una reducción en las 
complicaciones bioquímicas e histológicas en el desarrollo de la NFPD aunado a 
una disminución de la expresión de genes implicados en la fibrogénesis con un 
incremento en los anti-fibrogénicos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
15 
1. INTRODUCCIÓN 
La diabetes mellitus es una enfermedad crónica considerada como un problema 
de salud pública, de incidencia y prevalencia elevada. Todas las formas de 
diabetes se caracterizan por hiperglucemia crónica secundaria a deficiencia de 
insulina o resistencia a la acción de insulina, la cual cursa con la presencia de 
complicaciones macrovasculares y microvasculares secundarias a la 
hiperglucemia y a la resistencia a la insulina que si no se tratan apropiadamente 
pueden causar alteraciones metabólicas agudas y trastornos crónicos que 
deterioran la función y la estructura de diversos órganos1. 
La enfermedad macrovascular aterosclerótica acelerada se asocia con un riesgo 
muy elevado de padecer infarto al miocardio, accidentes cerebrovasculares y 
amputaciones. El desarrollo de patología microvascular en el paciente diabético 
trae como consecuencia retinopatía, nefropatía y neuropatía diabética2. 
La nefropatía se presenta en más del 30% de los pacientes diabéticos y es una 
causa importante de morbilidad y mortalidad. La hiperfiltración y microalbuminuria 
son signos de la nefropatía temprana, con el subsecuente desarrollo de 
macroalbuminuria, hipertensión y disfunción renal progresiva. 
En humanos, la nefropatía diabética (NFPD) se manifiesta como un síndrome 
clínico caracterizado por: albuminuria, una declinación progresiva de la tasa de 
filtración glomerular (GFR) y un riesgo incrementado de enfermedad 
cardiovascular3. 
 
16 
El estrés oxidativo inducido por la hiperglicemia incrementa la formación de 
productos finales de glucosilación avanzada (AGEs), los cuales modifican de 
forma no enzimática a las proteínas y disparan una cascada de señalización que 
conducen a la fibrosis intersticial. El incremento en la formación de AGEs y la 
modificación de las proteínas estructurales renales, vasculares y cardiacas, se han 
implicado en el desarrollo de la cardiomiopatía y nefropatía diabética4. 
El tratamiento de ratas diabéticas con aminoguanidina (AG), un inhibidor de la 
formación de AGEs, ha demostrado reducir de manera importante la albuminuria y 
la expansión mesangial en ratas diabéticas tratadas con estreptozotocina (STZ)3. 
El propósito de este trabajo fue evaluar el efecto de la AG a nivel renal, sobre la 
expresión de los genes que participan en la fibrogénesis de este órgano: TGF-β1 
(Factor de crecimiento transformante beta 1), CTGF (Factor de crecimiento de 
tejido conectivo), VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), Colágena-1 y 
SMAD-7, en un modelo experimental en ratas Wistar diabéticas inducidas con 
STZ. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
2. MARCO TEÓRICO 
2.1 Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) 
La diabetes mellitus es una enfermedad crónica considerada un problema de 
salud pública, de incidencia y prevalencia elevada. De acuerdo a la Federación 
Internacional de Diabetes (IDF, International Diabetes Federation, por sus siglas 
en inglés) en el año 2015 existían 415 millones de personas con esta enfermedad 
y se prevé que para el año 2040 esta cifra se incremente hasta 642 millones 1. En 
México, de acuerdo al ENSANUT (Encuesta Nacional de Salud y Nutrición) en el 
2012 la prevalencia a nivel nacional era de 9.1, mostrando un incremento del 
59.6% con respecto a la encuesta realizada en el 2006 5. Para el 2015 en nuestro 
país existían 11 millones de mexicanos con DM2 y se estima que cada año se 
incrementen 300 mil nuevos casos. Aproximadamente 1 de cada 10 adultos 
presenta esta enfermedad. La DM2 se caracteriza por hiperglucemia crónica 
secundaria a deficiencia de insulina o resistencia a la acción de la misma así como 
a la alteración de diversos mecanismos metabólicos que producen la aparición de 
complicaciones macrovasculares y microvasculares secundarias al estado de 
hiperglucemia 1,6 (figura 1). 
 
18 
 
La hiperglucemia es el factor que determina el desarrollo de las complicaciones 
crónicas de la DM2. La hiperglucemia celular da como resultado niveles alterados 
de metabolitos y productos de síntesis que afectan de manera negativa la función 
celular. Estos son apreciables como: cambios cuantitativos y cualitativos en la 
composición de los proteoglicanos y glicoproteínas de la membrana basal 
glomerular (MBG) 7. 
Un ejemplo de este mecanismo es la vía de los polioles, la cual genera varios 
cambios metabólicos como disminución de los niveles de glutatión, mioinositol y 
de equivalentes reductores como la forma reducida del dinucleótido de 
nicotinamida y adenina (NADPH+H). 
 
19 
En un ambiente de hiperglucemia se incrementa el estrés oxidativo y este a su vez 
eleva la formación de productos finales de glucosilación avanzada (AGEs), 
quienes modifican de manera no enzimática a las proteínas y disparan una 
cascada de señalización que conduce a la fibrosis intersticial. El incremento en la 
formación de AGEs y la modificación de las proteínas estructurales renales y 
vasculares se ha implicado en el desarrollo de la NFPD 4. 
 
2.2 Nefropatía diabética (NFPD) 
La nefropatía diabética (NFPD) es una de las causas principales de enfermedad 
renal terminal en el occidente 8. 
 La nefropatía diabética (NFPD) se presenta en más del 30% de los pacientes 
diabéticos. La hiperfiltración y microalbuminuria son signos de la nefropatía 
temprana que en estadios avanzados genera macroalbuminuria, hipertensión y 
disfunción renal progresiva. En los seres humanos la ND se manifiesta con una 
declinación progresiva de la GFR y un aumento en el riego de enfermedadcardiovascular 3. Los hallazgos histopatológicos que se observan en esta 
enfermedad se muestran a continuación9 : 
 
 
 
 
 
20 
Tabla 1. Histopatología en la NFPD 
Lesiones estructurales glomerulares 
Hipertrofia glomerular 
Engrosamiento de la membrana basal glomerular 
Podocitopenia 
Expansión de la matriz mesangial 
Gloméruloesclerosis difusa 
Gloméruloesclerosis nodular (Kimmelstein-Wilson) 
Capsula en “gota” 
Tapones de fibrina 
Arterioesclerosis y hialinosis (aferente y eferente) 
Lesiones estructurales no glomerulares 
Hipertrofia tubuloepitelial 
Engrosamiento de la membrana basal tubular 
Atrofia tubular y fibrosis intersticial 
Tubulopatía de Armanni-Ebstein 
Necrosis papilar 
Tomada de Chen S, et al. Seldin and Giebisch´s The Kidney. 2013 
La microalbuminuria es considerada como un signo de la disfunción endotelial y 
por ello, una manifestación temprana de la ND se considera como un factor de 
riesgo independiente de la morbi-mortalidad cardiovascular, mostrando que la 
disfunción endotelial general puede ser la responsable en ambas complicaciones 
en la Diabetes Mellitus 8. 
 
La hiperglucemia, como factor desencadenante en el daño renal 
La hiperglucemia puede definir el estadio diabético, pero las concentraciones 
intracelulares de glucosa parece ser que es la alteración metabólica fundamental 
que promueve los cambios patológicos en la NFPD. Las células renales no 
requieren de la insulina para la captación de glucosa, en cambio dependen de 
una familia de proteínas transmembranales que permiten el trasporte de glucosa 
 
21 
de forma facilitada. La glucosa difunde por gradiente de concentración y, en 
diabetes, los niveles de glucosa intracelular renal se encuentran incrementados en 
proporción con el grado de hiperglucemia 9. El transportador de glucosa más 
expresado es la isoforma GLUT-1, un transportador de alta afinidad y baja 
capacidad que normalmente se satura en concentraciones fisiológicas de glucosa. 
Se encuentra en glomérulo y túbulos renales, pero en la diabetes mellitus modifica 
su distribución y expresión celular. Bajo este estado fisiopatológico de 
hiperglucemia, la mayoría de los tejidos disminuyen la expresión de este 
transportador como un mecanismo de protección celular, en cambio las células 
mesangiales renales generan una sobreexpresión del gen GLUT-1. Esta 
retroalimentación positiva es considerada una mala respuesta adaptativa debido al 
incremento reflejo de captación de glucosa del ambiente diabético ocasionando 
glucotoxicidad e iniciando la activación de cascadas de señalización que son 
claves en la fisiopatología de la NFPD 9,10. Esta entrada de glucosa a las células 
debido a la hiperglucemia y a un incremento en la expresión del transportador 
GLUT-1 posteriormente entra a la vía del sorbitol, incrementando el estrés 
oxidativo mediante la depleción de NADPH, necesario para la reducción del 
antioxidante glutatión. Además, el aumento en la conversión de la fructosa-6-
fosfato a glicerol-3-fosfato conduce a la generación de diagilglicerol, el cual activa 
a la cinasa de proteína C (PKC). En este ambiente de hiperglucemia la fructosa-6-
fosfato es desviada a la vía de la hexosamina generando uridina difosfato N-acetil 
glucosamina, un precursor de algunas moléculas de la ME 9,8. 
 
22 
La PKC juega un papel central en la patogénesis de la ND, ya que a través de una 
vía de señalización rio abajo incrementa la expresión del factor de crecimiento 
endotelial vascular (VEGF) afectando la permeabilidad vascular y la 
neovascularización. De igual forma, la PKC incrementa la expresión de 
angiotensina II (AII) y endotelina 1 quienes a su vez disminuyen la expresión de la 
sintasa de óxido nítrico endotelial (eNOS). También incrementa los niveles de 
ROS en el citoplasma mediante un incremento en la expresión de NADPH 
oxidasa. 
En el riñón, VEGF es producida por los podocitos y su expresión aumenta en la 
ND temprana, promoviendo la angiogénesis. En las fases avanzadas de la 
enfermedad esta expresión disminuye produciendo una rarefacción capilar y 
disminuye también la tasa de filtración glomerular. 
Un resumen de las vías implicadas en el desarrollo de NFPD se muestra a 
continuación en la figura 2: 
 
23 
 
 
2.3 Productos Finales de Glucosilación Avanzada (AGEs) 
Las primeras observaciones de los AGEs fueron en 1912 por el Louis-Camille 
Maillard como formaciones café-obscuras o amarillo-marrones al calentar una 
 
24 
mezcla de carbohidratos y aminoácidos u otras biomoléculas 7. En la actualidad 
los AGEs son utilizados ampliamente en la industria alimenticia, dado al agradable 
sabor que le confiere a los alimentos, para mejorar su inocuidad o la 
biodisponibilidad del mismo. Esta reacción observada en 1912 también se 
presenta en el sistema vivo. A diferencia del proceso ex-vivo que se presenta con 
altas temperaturas, de forma in vivo se realiza de forma más lenta dada la baja 
temperatura interna que presentan los organismos. Por tanto, esta reacción afecta 
principalmente proteínas de vida larga tales como la hemoglobina, fosfatasa 
alcalina, colágena, elastina, etc 11. 
Esta formación comienza con la reacción de los grupos amino de las proteínas, 
particularmente los grupo amino de la cadena lateral de lisina, arginina e histidina 
con carbohidratos reductores como la glucosa, fructosa, triosas y sus 
correspondientes derivados fosforilados. También llamada reacción de Maillard. 
En el caso de la glucosa, esta reacción en algunas horas produce la formación 
reversible de la base de Schiff (carbonilo de glucosa y grupo amino de la lisina). 
Esta base de Schiff posteriormente se convierte en un compuesto más estable, 
una cetoamina o fructosamina llamada producto de Amadori, esta reacción ocurre 
en cuestión de días. Después, a través de subsecuentes rearreglos moleculares 
en donde intervienen algunas reacciones de deshidratación, condensación, 
oxidación y ciclización; procesos que llevan semanas o meses, generan un grupo 
heterogéneo de productos fluorescentes y café obscuro llamados AGEs. Es 
importante resaltar, que de esta serie de reacciones, la formación de la base de 
 
25 
Schiff y el producto de Amadori son reacciones reversibles mientras que la 
formación de AGEs es un proceso irreversible 7,11,12 (figura 3). 
 
Los AGEs pueden formarse por reacciones oxidativas y no oxidativas. Las 
oxidativas se pueden ver aceleradas por metales de transición como el cobre y el 
fierro. En esta reacción se forman además compuestos dicarbonílicos y radicales 
libres de oxígeno. Los metales también pueden oxidar monosacáridos 
directamente en solución para formar compuestos dicarbonílicos que después 
forman enlaces entrecruzados con proteínas a través de “glucosilación auto-
oxidativa”. La glucosa es la menos reactiva de todos los carbohidratos 
relevantes7,12. 
 
26 
En las proteínas con vida media larga como la colágena, elastina, de la vaina de 
mielina o el cristalino, se acumulan los productos de glucosilación y participan en 
el entrecruzamiento proteína-proteína las cuales se acumulan en proporción con la 
vida media de la proteína 7. 
Receptores para AGEs 
De forma general podemos clasificar la gran familia de receptores que reconocen 
a los AGEs de forma específica en 2 grupos 12–14: 
Complejo de receptores para AGEs (AGE-R1 al AGE-R3) 
Consiste en 3 componentes diferentes que se ven involucrados en la señalización 
y endocitosis de AGEs. 
Fueron descubiertos años después de los RAGE debido a su gran afinidad por el 
ligando AGE principalmente en células macrófagas de ratón de la línea RAW 
264.7 13. 
Este complejo está conformado por AGE- R1 (oligosacaril-transferasa-48), AGE-
R2 (fosfoproteína 80K-H) y AGE-R3 (galectina-3) y se representa en la figura 4. En 
personas jóvenes principalmente aunque no exclusivamente, este complejo se 
encarga de la eliminación fisiológica de AGEs, esta funciónde eliminación de 
AGEs mediante el complejo AGER1-R3 se deteriora con la edad o por 
enfermedades crónico-degenerativas. Se ha demostrado que este complejo 
reconocen a su ligando mas no se genera alguna señal de transducción a nivel 
celular después del acoplamiento por AGEs, sino más bien, favorecen la 
disminución y evitan así la acumulación de AGEs 15. 
 
27 
 
 
Receptor multiligando para AGEs, características y señalización 
El receptor multiligando para AGEs (RAGE) pertenece a la superfamilia de 
inmunoglobulinas debido a su capacidad de reconocimiento de patrones 14. Se 
unen con la proteína modificada por el AGE y permite su internalización para su 
posterior degradación proteolítica. Estos son estímulos, dependiendo de la célula y 
señal concurrente se asocia con quimiotaxis, angiogénesis, estrés oxidativo, 
proliferación celular o apoptosis, estos mecanismos pueden estar relacionados 
con las complicaciones crónicas de la DM2. 
Se conocen 2 tipos de RAGES: 
*Uno de 80kD idéntica a la lactoferrina (LF-L). 
 
28 
*Uno de 35kD, que es un fragmento proteolítico de una proteína de 42kD que junto 
con una cadena de oligosacáridos tiene un peso de 45kD. Esta se le ha descrita 
como el RAGE. 
Estos receptores están expresados en una gran diversidad de tipos celulares, 
entre los más relevantes: 
*Monocitos/ macrófagos *Linfocitos T 
*Fibroblastos *Condrocitos 
*Queratinocitos *Cel. Endoteliales 
*Cel. Dendríticas *Cel. Musculo liso 
*Cel. Gliales 
El RAGE humano tiene un dominio extracelular en forma de “V” de 320 
aminoácidos con dos oligosacáridos unidos, una región transmembranal de 21 
aminoácidos y un dominio citoplasmático corto de 41 aminoácidos. Estas, se 
expresan en celular endoteliales, musculo liso vascular, miocitos cardiacos, 
monocitos, microglía y neuronas. En la mayoría de los tejidos se han encontrado 2 
RAGES, uno de 35kD y otro de 45kD, se creen son distintas isoformas por 
procesamientos postraduccionales 7,12,14. 
El dominio extracelular del fragmento proteolítico de 35kD se le denomina RAGE 
soluble (sRAGE) utilizado como un ligando para proteínas modificadas y como 
agente farmacológico para prevenir efectos vasculares 14. La estructura de RAGE 
se muestra en la figura 5: 
 
29 
 
 
Mecanismos fisiopatológicos relacionados a los AGEs 
Los AGEs alteran la estructura de la ME haciéndolos resistentes a la degradación. 
Al unirse con su receptor RAGE, incrementan la producción de especies reactivas 
de oxigeno (ERO) y mediante la activación de la fosfolipasa C induce la 
producción de DAG. Esta señalización termina en la activación de la PKC que a su 
vez activa a la cinasa de proteína activada de mitógeno (MAPK) y a algunos 
factores de transcripción como factor nuclear kB (NFkB) y a la proteína activadora-
1(AP-1, por sus siglas en inglés: Activator Protein-1) 8,14. 
 
30 
La activación de NFkB incrementará los niveles de la sintasa de óxido nítrico 
inducible, que también puede ser inducida por citosinas, este incremento en la 
sintasa ocasionará una elevación del estrés nitrosativo que aunado a los altos 
niveles de EROS promoverán la formación de peroxinitrito (ONOO-) el cual es 
capaz de inactivar proteínas funcionales. 
La señalización de Jak/Stat que se ha visto implicada por los AGE es la Jak1-2/ 
Stat1. Estos al ser fosforilados, a su vez fosforilan a Stat-1 en su residuo tirosin701 
el cual forma un homodimero con otro Stat-1 fosforilado. Este homodimero se une 
al factor regulador interferón 1 (IRF-1) para poder migrar al núcleo, este complejo 
se unirá a los elementos de respuesta estimulados por interferón (ISRE) los cuales 
participarán en la expresión de INF-γ, incremento en la expresión del proteosoma 
así como diversas citosinas 12,14. 
Las diversas acciones relacionadas con los diferentes receptores capaces de 
interactuar con los AGE se concentran en la figura 6. 
Los AGEs de manera directa o indirecta a través de ROS, activan al TGF-β1 así 
como un incremento en los niveles de AII el cual de igual manera activa TGF-β1. 
Una vez activo, TGF-β1 es capaz de incrementar su propia expresión resultando 
en una sobreexpresión de ME y fibrosis. 
La glucosilación de componentes básicos de la membrana basal, como el 
colágeno IV o laminina, disminuye la adhesión y propagación de las células 
endoteliales 8,14,16. 
 
 
31 
 
 
 
 
 
 
32 
2.4 Factores de crecimiento implicados en los eventos de fibrogénesis de la 
NFPD 
2.4.1 Factor de crecimiento transformante beta (TGF-β1) 
Las proteínas de la familia del factor de crecimiento transformante beta (TGF, por 
sus siglas en inglés, Transforming growth factors) fueron inicialmente descubiertas 
por sus actividades en células cancerosas, posteriormente se describió su 
participación en células normales, demostrando la capacidad de transformar 
fenotípicamente y de forma reversible a fibroblastos inmortalizados. Esta familia de 
TGF es una muestra del paradigma de versatilidad funcional entre polipéptidos 
hormonalmente activos. Son miembros de esta familia las activinas, BMP (por sus 
siglas en inglés: Bone Morphogenetic Proteins), miostatinas, hormona anti-
Mülleriana, quienes ejercen importantes efectos sobre la división, diferenciación, 
migración, adhesión, organización y muerte celular 17. 
El TGF-β se distingue de TGF- debido a que no se une al mismo receptor de 
TGF-, el factor de crecimiento epidermoide (EGF, por sus siglas en inglés 
Epidermal Growth Factor) y por lo tanto actúa a través de diferentes receptores de 
superficie celular y mediadores de señalización 18. 
El TGF-β es un factor con múltiples efectos en la diferenciación celular, 
crecimiento, modulación de la respuesta inmune, depósito de matriz extracelular y 
capacidad para activar diferentes poblaciones celulares. El TGF-β1 está implicado 
en la fibrogénesis de varios órganos, éste factor se une a su receptor serina-
treonina cinasa tipo II (TBR-II) y recluta al receptor tipo I (TBR-I), formando 
 
33 
complejos heteroméricos. Posteriormente, el receptor tipo I es fosforilado por el 
receptor tipo II en el dominio GS, ambos receptores tanto el tipo I como el tipo II 
son requeridos para la señalización intracelular 18,19. Es importante mencionar que 
existe un receptor tipo III en esta gran familia, dentro de este grupo encontramos a 
endoglobina y betaglicano, considerados receptores accesorios con roles de 
presentación de ligando pero sin actividad enzimática, son largos y se encuentran 
altamente glucosilados en los dominios extracelulares mientras que presentan una 
región corta en su porción citoplasmática; estos receptores no presentan alguna 
participación para los fines de este estudio. 
Estudios recientes han llevado a la identificación de una familia conservada de 
transductores de señal para miembros de la familia de TGF-β, las proteínas 
Smads, solo cinco de estas proteínas en mamíferos, actúan como sustrato para la 
familia de receptores de TGF-β (Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 y Smad8). Se 
conocen como Smad reguladoras o R-Smads. Las cuales son proteínas reguladas 
por receptor y son factores de transcripción que transmiten la señalización 
extracelular de los ligandos pertenecientes a la superfamilia de TGF-β, las cuales 
son fosforiladas por el receptor TGF-β, estas incluyen Smad 2 y Smad 3, mientras 
que Smad 1 y 5 son substrato para el receptor de la proteína morfogénica de 
hueso (BMP). Las proteínas Smad 6 y Smad 7 constituyen las Smads inhibitorias 
las cuales interfieren con la activación de otros Smads (figura 7) 20. Muchos 
estudios examinan la función de las proteínas Smads en la señalización de TGF- 
β1, al enfocarse a PAI-1, colágena I, colágena VII, al inhibidor de cinasa 
dependiente de ciclina, p15 y p21 21. 
 
342.4.2. La propagación de la señal: los SMADS 
El nombre Smad fue acuñado con la identificación del homólogo Smad1 humano, 
en referencia a su similitud con la secuencia de las proteínas Sma y Mad. El gen 
Mad (Mothers against decapentaplegic de la Drosophila) y los genes relacionados 
a Sma de Caenorhabditis elegans se han relacionado genéticamente en la 
señalización de miembros de la subfamilia BMP 22. La señalización por TGF-β1 
ocurre vía la formación del complejo heterotrimérico inducido por el ligando de los 
receptores serina treonina cinasas tipo I y II. Después de la activación del 
receptor, la señal se propaga al interior del citoplasma a través de la familia de 
 
35 
proteínas Smad. Algunos miembros de esta novedosa familia de reguladores 
transcripcionales, las proteinas Smad, son los sustratos fisiológicos de la cinasa 
del receptor tipo I 20,21. En los mamíferos existen tres variedades estructural y 
funcionalmente distintas de Smads. Las que son fosforiladas por la cinasa de un 
receptor tipo I se denominan R-Smad (receptor-regulated Smads: Smad 2 y Smad 
3), el mediador común Smad: Co-Smad (Smad 4), y los Smads inhibitorios o I-
Smad (Smad 6 y Smad 7). R-Smads y Co-Smads son homólogas en sus residuos 
de aminoácidos en la región amino y carboxilo terminal llamados dominios NH-1 y 
NH-2 respectivamente 21. 
Después de la activación del receptor de TGF-β1, los R-Smads son fosforilados y 
forman un dímero con Co-Smad. El complejo R-Smad-Co-Smad se dirige al 
núcleo, donde el dímero puede directa o indirectamente, a través de interacciones 
con otros factores transcripcionales, regular la transcripción de genes 
específicos21. 
Las características estructurales de los diferentes Smads se muestran en la figura 
8. El receptor tipo I del TGF-β fosforila a Smad2 y/o Smad3 en las serinas del 
motivo Ser-Xxx-Ser que se localiza en el extremo carboxilo de la proteína. Esta 
fosforilación induce la asociación de R-Smad a Smad 4 (con un Co-Smad), dando 
lugar al complejo Smad2/Smad4 (o Smad3/Smad4) el cual se dirige al núcleo 
celular en donde interactúa con otros reguladores transcripcionales para modular, 
positiva o negativamente la expresión de los genes regulados por TGF-β 20,21. 
 
36 
En un estudio realizado por Wang y cols., examinaron el rol de TGF-β1 y el 
inhibidor de la señalización Smad7 (I-Smad) en fibrosis cardiaca. El TGF-β1 
incrementó la expresión de Smad7 citosólico en fibroblastos primarios adultos de 
rata e indujeron una rápida exportación nuclear de Smad7 exógeno. Además, la 
sobre-expresión de Smad7 en los fibroblastos se asoció con la supresión de la 
expresión de colágena tipo I y III 23. 
 
 
 
2.4.3 Factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) 
La enfermedad renal crónica y aguda se asocia frecuentemente con el 
desequilibrio entre la angiogénesis y la perdida de capilares. 
 
37 
Uno de los más importantes factores angiogénicos es el VEGF, el cual se expresa 
de forma constitutiva en los podocitos glomerulares y en los túbulos distales y 
proximales 24. 
Aunque diversos estudios muestran que VEGF puede ser un factor indispensable 
para mejorar la función renal en la enfermedad renal, en contraste en modelos de 
nefropatía diabética experimental los niveles sistémicos y renales de VEGF están 
elevados y participan en la progresión de la enfermedad. Con base a este 
paradigma, se propone la teoría del “desacoplamiento del VEGF- NO endotelial”. 
El VEGF de igual forma participa en el desarrollo de ciertas patologías como la 
retinopatía, la nefropatía y la enfermedad vascular. A pesar de que en los modelos 
crónicos de enfermedad renal se observa una disminución en su expresión, los 
niveles de VEGF y VEGFR-2 se ven incrementados a nivel renal en los pacientes 
con DM2. Este incremento en sus niveles participa en la hipertrofia glomerular y 
tubular, e incremento en la excreción de albumina urinaria en modelos animales 
de diabetes mellitus (tipo 1 y 2). Se le ha catalogado como un mediador crítico de 
la retinopatía diabética 24,25. 
Normalmente la elevación en la expresión de VEGF se traduce en el incremento 
de la expresión de NO endotelial (eNOS) así como su liberación en las células 
endoteliales. Sin embargo, en la DM2 a pesar de los altos niveles de VEGF el NO 
endotelial esta disminuido 24. La hiperglicemia es un estímulo para la expresión de 
VEGF 26. 
 
38 
La angiogénesis anormal juega un papel fisiopatológico en el desarrollo de la 
retinopatía diabética. Se conoce muy poco de la contribución del incremento de la 
angiogénesis en la NFPD. Algunos estudios han reportado la formación de nuevos 
vasos en el glomérulo, en su polo vascular, así como, en la cápsula de Bowman 
27,28. En modelos animales esta angiogénesis anormal está asociada con la 
formación de nuevos capilares, presentando dilatación y no elongación capilar. 
Min y Yamanaka elucidaron la morfología renal de 94 pacientes con ND mediante 
el análisis de imagen por computadora con reconstrucción tridimensional 
encontrando que la mayor parte de los capilares se conectan en un punto, 
después de 2 o 3 ramificaciones de la arteriola aferente, la porción opuesta de 
este capilar fuera del glomérulo se anastomosa al capilar peritubular. Estos vasos 
anormales se correlacionan con la expresión de VEGF a nivel glomerular. El 
mecanismo fisiopatológico aun no es muy claro 27. 
 
2.4.4 Factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) 
El CTGF es una proteína secretada con un peso molecular de 36 a 38 kDa, rica en 
cisteínas. Es uno de los seis miembros distintos de la familia CCN y es codificado 
por un gen inducible inmediato temprano. Tiene un dominio de unión a heparina e 
interactúa con integrinas αVß3. El CTGF promueve la quimiotaxis, migración, 
diferenciación y formación de ME. El CTGF es inducido principalmente por el TGF-
β y las propiedades fibrogénicas del TGF-β pueden ser mediadas al menos en 
parte por el CTGF 29. 
 
39 
Es una proteína rica en cisteína inducida por TGF-β en células de tejido conectivo, 
la cual puede iniciar muchos de los procesos celulares que subyacen a la fibrosis, 
tales como proliferación celular, adhesión, migración y síntesis de ME 30. Es un 
mediador de la señalización inducida por TGF-β. El CTGF es una molécula crucial 
en el desarrollo de la fibrosis inducida por TGF- β. Varios estudios señalan que su 
expresión se incrementa en el desarrollo de la fibrosis vascular 31, cardiaca32 y 
renal 33,34. En presencia de altos niveles de glucosa varios genes implicados en los 
depósitos de matriz extracelular se activan, entre estos destaca el CTGF 
proveniente de células mesangiales dependiente de TGF- β1 y también 
dependiente de la cinasa de la proteína C 35. 
La transición epitelial a mesenquimal (EMT) de las células tubulares es uno de los 
factores que contribuye a la acumulación de proteínas de matriz, asociada con la 
NFPD. Tanto TGF-β1 como los AGEs son capaces de inducir la EMT. El rol del 
factor pro-esclerótico CTGF, como un mediador posterior de este proceso ha sido 
ampliamente estudiado por medio de la expresión de alfa-actina del músculo liso 
(α-SMA), vimentina, E-cadherina, proteínas de matriz y la inducción del fenotipo 
miofibroblástico. Burns y cols. demostraron que mediante la administración de 
CTGF recombinante humano, indujo un EMT parcial y dicho proceso no fue 
bloqueado por anticuerpos neutralizantes anti- TGF-β1, sugiriendo que esta acción 
era TGF-β1 independiente. Estos hallazgos sugieren que CTGF representa un 
mediador importante e independiente de la EMT tubular, en un ambiente con altas 
concentraciones de AGEs o TGF-β1 36. Esta interacción CTGF-AGES/TGF-β1 
 
40 
podría tener una función importante en la NFPD progresiva, lo que ha sugerido el 
considerar al CTGF como un blanco potencial para el tratamiento de la NFPD. 
 
2.4.4 Colágena tipo I (Col I) 
La colágena tipo I es la proteína más abundanteen el cuerpo humano y es 
producida por las células del tejido conjuntivo como los fibroblastos, 
miofibroblastos, condroblastos y osteoblastos siendo las dos primeras las células 
más importantes en el depósito de colágena tipo I (Col I) en todos los tejidos 37. Un 
depósito excesivo de colágena participa en la fisiopatología de todos los 
desórdenes fibroproliferativos 38. 
La fibrosis renal caracteriza prácticamente todas las enfermedades renales de tipo 
progresivas. El parénquima renal contiene en su intersticio fibroblastos y células 
dendríticas. Los fibroblastos se encuentran anclados a las membranas basales de 
túbulos, capilares y células dendríticas. Al igual que en otros tejidos, el proceso 
fibrogénico se ve determinado principalmente por la adquisición del fenotipo 
miofibloblasto, inducido a través de citosinas, estrés mecánico, etc. participando 
esta activación de fibroblastos en el incremento de la producción de colágena 39. 
La formación de colágena es a partir de tres aminoácidos que se ensamblan en 
tándem, creando cadenas polipeptídicas denominadas cadenas α, sub-
clasificándose a su vez en 2 tipos: α1 y α2 que difieren entre ellas en la 
composición de aminoácidos y su secuencia unidas a través de puentes de 
hidrogeno. Tres cadenas α se ensamblan para formar una molécula de pro-
 
41 
colágena con una conformación de triple espiral, la cual es secretada al espacio 
extracelular donde es transformada posteriormente a tropocolágena, quien se une 
entre sí por medio de enlaces entre algunos aminoácidos como la lisina, mediante 
entrecruzamientos, favoreciendo la consolidación de las fibras de colágena. Este 
monómero mide alrededor de 300nm de largo y 1.4nm de diámetro. Las tres 
cadenas se enrollan y fijan mediante enlaces transversales, formando una triple 
hélice dextrógira con una distancia entre las vueltas de 8.6nm. En el espacio 
extracelular varias moléculas de tropocolágena se asocian a través de enlaces 
entrecruzados formando fibrillas y fibras. Aquí, se produce el fenómeno de 
alineación y maduración de las moléculas en el proceso de fibrogénesis 37. 
La fibrosis es comúnmente conceptualizada como una respuesta para curar una 
lesión que se ha salido de control. Las lesiones a los tejidos son resultado de 
diversos estímulos agudos o crónicos, desde infecciones, reacciones autoinmunes 
o daño mecánico. El proceso de reparación tisular normalmente involucra 2 
estadios diferentes: una fase de regeneración, en la cual las células lesionadas 
son remplazadas por otras células del mismo tipo; y una fase de fibroplasia o 
fibrosis, en donde el tejido conectivo remplaza al parénquima dañado. Este 
proceso de remodelado de la ME en algunos casos puede conducir a la falla 
orgánica o la muerte 38,39. 
La patogenia de la fibrosis usualmente resulta de procesos inflamatorios crónicos, 
aunque para cada órgano este proceso puede ser muy específico, estas 
alteraciones tienen en común que dicha etiología se mantiene persistente y es 
capaz de estimular la producción de factores de crecimiento, enzimas 
proteolíticas, factores angiogénicos y citosinas fibrogénicas quienes de forma 
 
42 
conjunta estimulan el depósito de tejido conectivo que de forma progresiva van 
remodelando y destruyendo la arquitectura normal tisular 38. 
El incremento de la actividad de citosinas profibróticas como TGF-β1 e IL-13 se 
han implicado como mediadores importantes en la activación de fibroblastos, la 
diferenciación a miofibroblastos así como en la sobre-regulación del Col I a en 
esas células. La expresión aumentada de colágena se debe al incremento en la 
tasa de transcripción de los genes de Col I a y al incremento de la vida media de 
los mRNA de Col I a 37,40 siendo incrementada la tasa de transcripción hasta 3-10 
veces en los fibroblastos activados 37. 
La relación de estos diferentes factores de crecimientos en el desarrollo de la 
NFPD se muestra en la figura 9. 
 
 
43 
2.5 Aminoguanidina (AG), un inhibidor de la formación de AGEs 
 
Aminoguanidina (Pimagedine) es un prototipo de agente barredor α, β-dicarbonilo 
que previene la formación de AGEs a partir de precursores α, β-dicarbonilo. Se 
presenta como una sal (Clorhidrato de aminoguanidina) 41, su estructura química 
se muestra en la figura 10. 
 
Entre algunas de sus propiedades farmacocinéticas: 
*Presenta una unión a proteínas plasmáticas del 5% 
*Tiene una vida media de 4.4 horas, en el adulto sano, después de una 
administración de 300mg en 24 horas y se ve afectada por la insuficiencia renal, 
incrementando su concentración 42. 
*Tras su administración en modelos murinos a razón de 1g/L de AG, presenta un 
pico de concentración plasmática de 47μM. La concentración observada en 
 
44 
diferentes tejidos fue: aorta 26nmol/g, retina 30nmol/g, nervio ciático 38nmol/g, 
cristalino 140nmol/g, riñón 740nmol/g y piel 315nmol/g 43. 
*Su eliminación es principalmente renal, en donde se puede recuperar hasta el 
80% sin cambios en orina tras una administración oral 41. 
La Ag es un agente nucleofílico con 2 centros claves de reacción: 
*Grupo hidracina nucleofílico (-NHNH2) 
*Grupo guanidino dicarbonilo-directo [-NH-C(=NH) NH2 ] 
Los grupos guanidino de los residuos de arginina en las proteínas son sitios 
claves para el proceso de glucosilación por los compuestos α,β-dicarbonilo 44. 
Esta conformación es muy reactiva a los agentes de glucosilación α,β-dicarbonilo, 
particularmente los α-oxoaldehídos como: metilglioxal, glioxal y el 3-
desoxiglucosona (3-DG), quienes de otra manera podrían formar AGEs 
reaccionando con los residuos de arginina y lisina de las proteínas 41 y esto se 
debe a que la AG ha demostrado ser químicamente más reactivo que el grupo 
épsilon-amino de la lisina de las proteínas y de esta forma impide la formación de 
AGEs. Bloquea los grupos carbonilo reactivos de los compuestos Amadori y sus 
derivados (3-desoxiglucosona y glucoaldehido), evitando de esta forma la 
formación de puentes intercatenarios entre las proteínas solubles del plasma y la 
colágena, de la colágena sobre ella misma y de puentes entre los proteoglicanos y 
colágena, fibronectina y membrana basal (figura 11)7. 
Los productos de esta reacción de sustitución son 3-amino-1, 2, 4-triazinas43. La 
actividad farmacológica de este producto no se ha investigado a fondo, sin 
 
45 
embargo se ha demostrado que es un inhibidor de la sintasa de óxido nítrico 
inducible (iNOS)41. 
 
El primer reporte de intervención en la formación de AGEs mediante el uso de AG 
fue para la prevención de la formación de puentes entre proteínas (reticulación) en 
las paredes arteriales inducidas por DM2 45. La AG mediante diversos estudios ha 
demostrado que retarda el desarrollo de diversas complicaciones microvasculares 
como neuropatía y retinopatía en animales experimentales 3,46–48 y se han 
realizados diversos ensayos clínicos para evaluar su eficacia y seguridad en el ser 
humano. 
 
46 
En el estudio ACTION II (Aminoguanidine Clinical Trial in Overt Type 2 Diabetic 
Nephropathy), un ensayo clínico aleatorizado, doble ciego, controlado con 
placebo, se comparó dos dosis de AG sobre la progresión de la NFPD en 599 
pacientes diabéticos con enfermedad renal en 84 centros en los E.U.A. y Canadá. 
El punto final primario es la duplicación de las concentraciones séricas de 
creatinina por medición del aclaramiento de creatinina o creatinina calculada por 
Cockcroft and Gault [C&G]. Los puntos finales secundarios incluyeron los efectos 
de AG en el tiempo sobre todas las causas de mortalidad, tasas de cambio en los 
índices de función renal, proteinuria, retinopatía, niveles circulantes y urinarios de 
AGEs y la estimación sobre la relación entre las concentraciones plasmáticas de 
AG y los puntos finales primarios y secundarios de eficacia así como los eventos 
adversos. La progresión de la enfermedadmacrovascular fue monitoreada por 
fotografías del fondo de ojo. Los pacientes con DM2 de edades entre 30-70 años, 
fueron elegibles para el estudio si su presión arterial sistólica era a 180 mm Hg y la 
diastólica a 120 mm Hg; las concentraciones séricas de creatinina de 1.0 mg/dL 
(en mujeres) o 1.2 mg/dL (en hombres), aclaramiento C&G 40 mL/min y 
proteinuria 500 mg/dL, con retinopatía diabética o NFPD por biopsia renal 49. 
En otro estudio aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en 690 
pacientes con DM1, nefropatía y retinopatía (ACTION I) Pimagedine (AG) aminoró 
la NFPD en pacientes con DM1 (insulino-dependiente). Los pacientes recibieron 
dos dosis diarias: placebo, pimagidine 150 mg o 300 mg por 2 a 4 años. El punto 
final primario fue el tiempo para la duplicación de la creatinina sérica; los puntos 
finales secundarios incluyeron evaluaciones de proteinuria, función renal y 
 
47 
retinopatía (54). La creatinina sérica se duplicó en 26% (61/236) de los pacientes 
tratados con placebo y 20% (91/454) de los tratados con pimagedine (p = 0.099). 
La GFR estimada disminuyó más lentamente en los pacientes tratados con AG, 
con disminución al mes 36 del valor basal de 6.26 mL/min/1.73 m2, comparado 
con 9.80 mL/min/1.73 m2 en el grupo de pacientes tratados con placebo (p = 0.05), 
y AG redujo la proteinuria en la orina de 24 horas 50. Aunque este estudio no 
demostró efecto benéfico estadísticamente significativo de la AG sobre la 
progresión de la NFPD en DM1, constituyen las primeras pruebas de hallazgos 
clínicos de los beneficios observados en la inhibición de la formación de AGEs y 
estos pueden resultar en una atenuación clínicamente importante de las serias 
complicaciones de la DM2. 
Sin embargo, debido a la presencia de efectos adversos reportados en el ACTION 
II aunados a cuestiones comerciales y financieras de Laboratorio Alteon Inc. 
ocasionaron el cese de la investigación de ésta molécula, comercializada con el 
nombre Pimagenide®. Actualmente se continúan realizando investigaciones 
encaminadas en su efecto sobre las complicaciones de la DM2. 
En años recientes se han realizado estudios encaminados a evaluar el posible 
efecto hepatotóxico de AG, uno de los eventos adversos más importantes 
observados en los ensayos clínicos. Meira y cols. administraron AG en el hígado 
de ratas diabéticas inducidas con STZ, observaron que las muestras de tejido 
hepático no presentaron hipertrofia, alteración en depósitos de polisacáridos ni 
congestión de los vasos hepáticos por lo que concluyeron que AG no es un 
compuesto hepatotóxico 51. 
 
48 
3. ANTECEDENTES 
3.1 La participación de TGF-β y de CTGF en modelos experimentales de 
diabetes 
 
Aunque TGF-β tiene un importante efecto anti-proliferativo y anti-inflamatorio. Es el 
principal factor pro-fibrótico en la NFPD, la inhibición del TGF-β puede tener como 
resultado un efecto benéfico o perjudicial por el efecto pleiotrópico de esta 
molécula y su participación en los mecanismos fisiopatoloficos de la nefropatía 
diabética. Por lo que blancos alternativos para la intervención terapéutica para 
tratar las complicaciones de la Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) son necesarios. De 
igual forma se ha implicado al CTGF en la patogénesis de la NFPD52. 
Para clarificar las diversas funciones de estos factores de crecimiento en las 
células responsables del depósito patológico de matriz extracelular (ME), se ha 
descrito su expresión en células mesangiales primarias humanas (HMCs) y células 
epiteliales del túbulo proximal humanas (HTECs). Ambos factores indujeron de 
forma significativa la expresión de la proteína de colágena con similar potencia en 
HMCs. De forma adicional la actividad del promotor así como los niveles de RNA 
mensajero (mRNA) de la colágena tipo II (I) fueron inducidos de forma similar por 
ambos factores de crecimiento en HMCs. Sin embargo, sólo TGF-β estimuló la 
síntesis de proteínas colagenosas en HTECs. La expresión de tenascina-C por las 
HTEC fue incrementada tanto por TGF-β y CTGF, aunque TGF-β fue el inductor 
más potente. De esta forma vemos que ambos factores de crecimiento inducen 
 
49 
similares efectos pro-fibrogénicos sobre la producción de ME en HMCs, aunque 
promoviendo efectos divergentes en HTECs53. 
Zhou y cols. demostraron una sobre-expresión significativa del mRNA de TGF-β y 
CTGF en los riñones de ratas tratadas con AGEs y en células mesangiales en 
cultivo. Sin embargo el silenciamiento del mRNA o el bloqueo de la proteína de 
TGF-β en las células en cultivo, por un anticuerpo neutralizante de TGF-β, no 
afectó de forma significativa la expresión del mRNA de CTGF, sugiriendo que aun 
observando una inducción de ambos mensajeros, la expresión de CTGF es 
independiente de TGF-β54. 
 
3.2 La participación de AGEs en las complicaciones de la DM2. 
 
Los AGEs son compuestos producidos por glucosilación y oxidación de proteínas, 
lípidos o ácidos nucleicos. La glucosilación es la adición (o inserción) no 
enzimática de derivados de disacáridos a estas moléculas. Esto produce la 
formación de bases Schiff intermediarias y productos de Amadori que finalmente 
se transforman en un AGE irreversible. Esta clásica visión se ha modificado en 
años recientes con el reconocimiento de la importancia del estrés carbonilo y 
oxidativo en la formación endógena de AGEs. Estos también pueden ser 
obtenidos de fuentes exógenas en ciertas comidas y el humo del tabaco. Se ha 
descrito una clase completa de receptores de unión a AGEs específicos y no 
específicos. Aparte del enlace cruzado de proteínas por AGEs, los efectos de la 
 
50 
estimulación del receptor, contribuyen al desarrollo de las complicaciones crónicas 
de condiciones como la diabetes, insuficiencia renal y aterosclerosis7 debido a que 
los AGEs se acumulan en el cuerpo humano con la edad y dicha acumulación se 
ve acelerada con la presencia de diabetes mellitus55. 
La participación de los AGEs en el desarrollo de las complicaciones renales 
observadas en la DM2 fue demostrado por Zhou y cols. quienes mediante un 
tratamiento con AGEs, produjeron a nivel renal una acumulación significativa de 
ME, un incremento en la expresión de mRNA de TGF-β y CTGF así como la 
expresión de sus respectivas proteínas54. 
 
3.3 La DM2 genera una progresiva disfunción glomerular 
 
Los dos principales mecanismos que describen cómo la diabetes puede conducir a 
una progresiva disfunción glomerular son: 
 
 Factores hemodinámicos locales 
 Acumulación progresiva de matriz mesangial que conduce a la disminución 
del área de superficie de filtración en el glomérulo. 
 
Factores hemodinámicos locales 
 
 
51 
La hipertensión intraglomerular y la hiperfiltración, son mecanismos anormales 
relacionados a una respuesta de mala adaptación renal, ya que pueden inducir 
glomerulosclerosis y destrucción de la nefrona. Una alta presión hidrostática 
intraglomerular genera presión sobre la célula mesangial y estimulación de la 
producción de TGF-β. La producción de TGF-β también se ve estimulada por 
diferentes factores de crecimiento y citosinas glomerulares presentes en el estado 
diabético. Estas incluyen algunos agentes vasoactivos como la angiotensina II, 
tromboxanos, óxido nítrico (NO) y endotelina-I 
9,56
. 
 
Acumulación Progresiva de matriz mesangial 
 
Es evidente que los factores físicos y metabólicos tales como la hiperglucemia y la 
presión arterial, también activan vías de señalización, generando cambios 
fenotípicos en el tejido blanco. La elevación de los niveles plasmáticos de glucosa 
es un factor patogénico primario en las complicaciones microvasculares en ambos 
tipos de diabetes mellitus (tipo 1 y 2). Las altas concentraciones de glucosa y los 
AGEs han mostrado inducir la sobre-expresión del mRNA y proteínas de TGF-β, 
CTGF, SMAD-7, fibronectina, laminina y colágena IV en diferentes tipos de 
células, incluyendo lascélulas mesangiales murinas57–65. 
 
3.4 Proteinuria 
 
 
52 
La proteinuria per se es un factor independiente en la progresión de todas las 
formas de enfermedad renal crónica, incluyendo la nefropatía diabética 66. El 
exceso de filtración de las proteínas dentro del túbulo proximal y su subsecuente 
endocitosis, puede representar un mecanismo patológico subyacente del proceso 
de cicatrización renal. Un escenario que explica la correlación entre el grado de 
proteinuria y la insuficiencia renal progresiva se puede relacionar con la captación 
tubular de proteínas y la sobre-regulación del péptido quimioatrayente de los 
monocitos-1 (MIP-1), con la consecuente infiltración de los macrófagos. Los 
macrófagos son una rica fuente de TGF-β y promueven el cambio de fibroblastos a 
miofibroblastos activados. La síntesis y depósito de colágenas fibrilares tipo I y III 
por éstas células contribuyen al desarrollo de la fibrosis túbulo-intersticial y su 
severidad está correlacionada con la disminución de la tasa de filtración 
glomerular. La pérdida de nefronas conduce a una tensión hemodinámica 
glomerular subsecuente en las nefronas sobrevivientes, un incremento en la 
proteinuria y un daño túbulo-intersticial acelerado creando un círculo vicioso 58,67. 
La activación del TGF-β a nivel renal parece ser un mediador común de 
virtualmente todos los factores que se involucran en el desarrollo y progresión de 
la NFPD. Se ha reportado que el tratamiento de ratones diabéticos con 
anticuerpos anti-TGF-β previno la hipertrofia glomerular, redujo el incremento en el 
peso renal aproximadamente un 50% y atenuó de manera significativa el 
incremento en los niveles de mRNA de TGF-β, sin tener ningún efecto sobre la 
glucosa sanguínea. En la presencia de concentraciones normales de glucosa, la 
administración exógena de TGF-β reproduce el daño renal causado por la 
 
53 
hiperglucemia 67. La manipulación genética para sobre-expresar TGF- β en el 
glomérulo de ratas normales produce gloméruloesclerosis y los ratones 
transgénicos que producen en exceso TGF-β desarrollaron proteinuria, 
gloméruloesclerosis, y fibrosis túbulo-intersticial 68. 
La albuminuria diabética en humanos y murinos se asocia con el desarrollo de 
características histopatológicas típicas, incluyendo el engrosamiento de la 
membrana basal glomerular y la expansión mesangial 3,53,67. 
La microalbuminuria es considerada un predictor para el desarrollo de la NFPD y 
es de hecho un indicador de daño glomerular establecido, el cual puede conducir a 
insuficiencia renal progresiva en la diabetes mellitus 69,70. La prevención primaria 
de la NFPD, es factible si los factores que inician el cambio de la excreción normal 
de albúmina urinaria a microalbuminuria y de esta a NFPD, puede ser identificada 
y tratada. Se han identificado factores de riesgo asociados con la microalbuminuria 
y la progresión a NFPD, éstos incluyen: un bajo índice de masa corporal (BMI), 
una mayor duración de la diabetes, hiperglicemia, hipertensión, dislipidemia, 
tabaquismo e historia familiar de diabetes e hipertensión69. Riser y cols han 
demostrado que la expresión glomerular de CTGF se encuentra mayormente 
sobre-regulada de forma temprana en diabetes humana y experimental y la 
exposición de células mesangiales a CTGF incrementa su producción de 
moléculas de ME, responsables de la gloméruloesclerosis y por tanto ellos 
proponen utilizar al CTGF como un predictor temprano tanto de la NFPD así como 
de gloméruloesclerosis progresiva y enfermedad renal en estadio final 70. 
 
54 
4. JUSTIFICACIÓN 
La diabetes mellitus es una enfermedad multifactorial resultado de una deficiencia 
relativa o absoluta de insulina y un grado variable de resistencia a la acción de la 
insulina, que finalmente culmina en la presentación de hiperglucemia. La DM2 
representa el 95%de los casos de diabetes mellitus, lo que la constituye en la 
principal categoría de la enfermedad a nivel mundial. En el 2015 existían 415 
millones de personas con DM2 y se prevé que esta cifra alcance los 642 millones 
en el 2040, en México para el 2015 habían 11 millones de diabéticos lo que la 
convierte en una enfermedad endémica en nuestra población de gran prevalencia 
y relevancia. Este escenario nacional y mundial exige la búsqueda de mecanismos 
de prevención más eficientes, regímenes de tratamiento más efectivos o la 
búsqueda de nuevos tratamientos que estén enfocados principalmente en las 
complicaciones macro y microvasculares de la DM2 para las cuales actualmente 
no existen tratamientos, incrementando la mortalidad y disminuyendo la calidad de 
vida en quienes las presentan. 
Una de las complicaciones microvasculares más relevantes de esta enfermedad 
es la NFPD, la cual se presenta en el 30% de los pacientes con DM2, quienes de 
un 70 al 80% de los casos desarrollan enfermedad renal terminal debido al 
reemplazo progresivo del parénquima funcional por acúmulo de tejido fibroso. El 
proceso hiperglucémico que subyace en la DM2 genera un incremento en la 
formación de AGEs los cuales se ha implicado en el desarrollo y progresión de la 
NFPD, quienes ya sea por su alta concentración o interacción con su receptor son 
capaces de activar diversos genes implicados en el proceso pro-fibrogénico, y de 
 
55 
generar un ambiente pro-inflamatorio y pro-oxidante. Los mecanismos moleculares 
responsables en el desarrollo de fibrosis no se conocen en su totalidad. Se ha 
demostrado que la activación de mecanismos relacionados con TGF-β1, CTGF, 
VEGF y SMAD-7 participan en el desarrollo y la progresión de la NFPD. 
Aminoguanidina, una hidracina nucleofílica, es capaz de inhibir la formación de 
AGEs y ha demostrado que retarda el desarrollo de algunas complicaciones 
microvasculares. Sin embargo, no existe evidencia científica que explique el efecto 
de AG sobre perfiles de expresión génica a nivel renal en DM2. 
El presente trabajo pretende analizar la expresión génica asociada a la 
fibrogénesis, implicados en el desarrollo de la NFPD en un modelo experimental 
de DM2, así como el efecto de AG, al inhibir la formación de AGEs, sobre dichos 
mecanismos de expresión en el desarrollo de la NFPD. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
56 
5. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 
¿Cuál es el efecto de aminoguanidina sobre la inhibición de la formación de 
productos finales de glucosilación avanzada en relación a la expresión de TGF-β1, 
CTGF, SMAD-7, Colágena 1 y VEGF durante la progresión de fibrosis renal en un 
modelo experimental de DM2? 
 
 
 
6. HIPÓTESIS 
El tratamiento con aminoguanidina disminuirá la expresión de TGF-β1, CTGF, 
VEGF, Colágena 1 e incrementará la expresión de SMAD-7 mediante la inhibición 
de AGEs en ratas diabéticas durante la progresión de fibrosis renal. 
 
 
 
 
 
 
 
57 
7. OBJETIVOS 
7.1 OBJETIVO GENERAL 
Evaluar el efecto de aminoguanidina sobre la inhibición de AGES y su relación con 
la expresión de TGF-β1, CTGF, VEGF, Co1 a y SMAD-7 en ratas diabéticas sobre 
la progresión de fibrosis renal. 
 
 
 
7.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
1] Analizar los parámetros fisiológicos (poliuria, polidipsia y polifagia) en los 
diferentes grupos. 
2] Cuantificar parámetros bioquímicos (pruebas de función hepática y renal]. 
3] Cuantificar los niveles séricos de AGEs. 
4] Analizar la expresión de TGF-β1, CTGF, VEGF, Colágena 1 y SMAD-7 en tejido 
renal mediante qRT-PCR en ratas tratadas con AG vs control. 
5] Cuantificar la progresión de la fibrosis renal mediante histopatología. 
 
 
 
58 
8. METODOLOGIA 
8.1 MATERIAL Y METODOS 
 
8.1.1 Diseño de estudio 
Experimental 
 
 
8.1.2 Universo de estudio 
Ratas Wistar (Rattus norvegicus albinus), machos, recién destetadas y de la 
misma camada, con un peso entre 100-150g obtenidas del bioterio de la 
Universidad de Guadalajara, Centro Universitario de Ciencias de la Salud (CUCS). 
Los animales se mantuvieron dentro del bioteriodel CUCS, con ciclos de 12h de 
luz y 12 h de oscuridad, agua ad libitum y alimentación ad libitum (excepto cuando 
el ayuno fuera requerido) 
 
 
 
 
 
59 
8.1.3 Tamaño de muestra 
Se determinó el número de animales por grupo mediante la fórmula de medias 
para estudios comparativos entre 2 o más grupos, de acuerdo a la diferencia en el 
cambio de concentración de AGEs a nivel sérico entre los grupos; suponiendo una 
diferencia de 2 entre medias considerando una distribución normal, con un α=0.05, 
una confiabilidad del 95%, un poder del 80% y una β=0.20 se calculó: 
 
n= . s21 + s
2
2 . (Z1-α/2 + Z1-β)
2 
 (x1 - x2)
2 
 
n= . 121 + 1
2
2 . (1.96 + 0.846)
2
 
 (0 - 2)
2 
 
n= . 2 . (1.96 + 0.846)
2
 
 (-2)
2 
 
n= 3.94 ~ 4.0 animales para cada determinación 
4 x 5 (No. De sacrificios) = 20 ratas por grupo (sin considerar pérdidas) 
20 x 3 (grupos)  n= 60 (sin considerar posibles pérdidas) 
 
El presente estudio se realizó siguiendo las recomendaciones de tamaño de 
muestra para mejorar el diseño y análisis estadístico de experimentos usando 
animales de laboratorio71,72 fundamentadas por la regla de las tres “R” formuladas 
por Russell y Burch73 ajustándose a un número final de 52 ratas totales para el 
estudio. 
 
 
60 
8.1.4 Características de los grupos 
El número total de ratas fue aleatorizado y asignado a uno de los siguientes 
grupos del estudio: 
A. Grupo experimental n=16 ratas 
Ratas Wistar macho con diabetes inducida mediante STZ i.p., alimentación con 
dieta modificada (DM) y agua libre a demanda. 
 
B. Grupo de tratamiento n=16 ratas 
Ratas Wistar macho con diabetes inducida mediante STZ i.p., alimentación con 
dieta modificada (DM), agua libre a demanda y administración de AG. 
 
C. Grupo control n=20 ratas 
Ratas Wistar macho con dieta modificada (DM) y agua libre a demanda durante el 
seguimiento. 
 
 
 
 
 
61 
8.2 CRITERIOS DE SELECCIÓN 
8.2.1 Criterios de inclusión 
* Ratas Wistar (Rattus Norvegicus albinus) 
* Macho 
* Activas y reactivas 
* Destetadas 
* Peso corporal entre 100-150g 
 
8.2.2 Criterios de exclusión y eliminación 
* Falta de apetito 
* Infecciones concomitantes 
* Fuera del rango de peso al momento de la inducción 
* Desarrollo de infecciones concomitantes 
*Muerte 
 
 
 
 
62 
8.3 OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES 
Variables dependientes 
* Parámetros fisiológicos * Expresión génica 
* Química sanguínea * AGEs séricos 
* Fibrosis renal 
Variables independientes 
* Aminoguanidina 
 
Variable 
Tipo de 
variable 
Unidad de 
medición 
Prueba 
estadística 
Aminoguanidina Cuantitativa 
(continua) 
mg/kg 
Parámetros fisiológicos: 
*Peso 
*Consumo de agua 
*Consumo de alimento 
*Diuresis 
*Glucemia 
 
 
Cuantitativa 
(continua) 
 
kg 
mL/24hr 
mg/24hr 
mL/24hr 
mg/dL 
 
 
 
 
 
 
 
Kruskal-Wallis 
 
 
Post hoc: 
 
U Mann 
Whitney 
Expresión relativa de: 
*VEGF 
*Smad-7 *Colagena-1 
*TGF-β1 *CTGF 
 
Cuantitativa 
(continua) 
 
UT/ 2-ΔΔCt 
Niveles séricos de AGEs Cuantitativa 
(continua) 
ng/mL 
PFH: ALT, AST 
 Albúmina 
Cuantitativa 
(continua) 
U/L 
g/L 
Pruebas de función renal: 
*TP 
*Urea 
*Creatinina 
*Tasa de filtración glomerular 
 
Cuantitativa 
(continua) 
 
g/dL 
mg/dL 
mg/dL 
mL/min/100g 
Fibrosis renal Cualitativa 
(nominal) 
 
 
 
63 
8.4 DESCRIPCIÓN DE PROCESOS 
8.4.1 Flujograma 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Diagrama general del modelo DM2. 
2 semanas previas a la inducción, se inició con la dieta modificada. Transcurridos ese 
tiempo, se comenzó con la inducción mediante STZ (20mg/kg) durante 5 días 
consecutivos. La DM se continuó hasta finalizado el estudio. La administración de AG 
(20mg/kg) se efectuó 1 vez al día. Se realizaron sacrificios en la semana 4, 15, 20 y 25. 
 
 
 
 
 
Sem. 
Sem. 
Sem. 
Sem. 
Sem. 
Sem. 
 
64 
8.4.2 Preparación de la dieta rica en grasas y carbohidratos (DM) 
La dieta rica en grasas y carbohidratos se realizó mediante el recubrimiento de los 
cubos de alimento para roedor Prolab 2500 Rodent 5P14® (Reg. SAGARPA: A-
8003-036) con una mezcla de 0.1% de colesterol (sigma grado USP), 1% de 
sacarosa (azúcar refinada) y 10% de aceite de coco en relación a 1kg de alimento. 
La preparación se realiza calentando a baño maría (40°C) el aceite de coco e ir 
incorporando el colesterol al aceite con una agitación constante para evitar grumos 
y hasta que quede completamente disuelto. Mientras, el azúcar se disuelve en 
30mL de agua potable a baño maría (40°C) en agitación hasta que quedara 
completamente disuelta. Esta mezcla de agua azucarada se adiciona a los cubos 
de alimentos para que absorban el azúcar y evitar que se escarchen y pierdan el 
azúcar al secarse. Una vez secos, los cubos con la azúcar absorbida se 
impregnan del aceite de coco con colesterol asegurándose de impregnar 
completamente los cubos y de forma homogénea. La preparación del alimento se 
realizó de acuerdo a los requerimientos. 
 
8.4.3 Inducción del modelo con estreptozotocina 
Una vez que las ratas alcanzaron un peso entre 200 a 300g se administró STZ 
(Cat. No. S0130 Beilstein Registry: 2060675 EC Number: 242-646-8) i.p. a una 
dosis de 20mg/kg por 5 días consecutivos. Se utilizó como vehículo buffer de 
citrato de sodio al 0.1M pH 4.5. La estreptozotocina se diluyó en 0.3mL del buffer 
inmediatamente antes de ser inyectada. 
 
65 
 Una semana posterior al periodo de inducción, se dejaron en ayuno de 6 horas y 
se procedió a medir la glucosa sanguínea. Se consideraron ratas diabéticas a 
todas aquellas que presentaron niveles de glucosa ≥ 200mg/dL. 
 
8.4.4 Medición de glucemia 
La medición de glucemia se realizó en cada animal con un periodo de ayuno 
mínimo de 6 horas. La muestra de sangre se obtuvo mediante punción de cola 
utilizando una aguja estéril. La evaluación de la glucemia sanguínea se realizó 
como prueba de tamizaje posterior al periodo de inducción así como previo a cada 
sacrificio utilizando el aparato ACCu-CHEK Performa® (Ref. No. 0997R97 SSa, 
Cat. No. 5070775001). 
 
8.4.5 Administración de AG 
Los animales diabéticos fueron aleatorizados para recibir o no Aminoguanidina 
(Sigma-Aldrich). 
La AG se administró a una dosis de 20mg/kg/día i.p cada 24 horas durante las 25 
semanas a partir del último día de inducción con STZ y hasta su sacrificio. Se 
utilizó como vehículo solución fisiológica, en donde se diluyo la AG en 0.5ml de 
sol. fisiológica. La dosis se determinó mediante ajuste por peso una vez por 
semana. 
Los grupos control para el tratamiento recibieron 0.5 ml de sol. fisiológica. 
 
66 
 
8.4.6 Sacrificio de animales 
Previo a cada sacrificio los animales fueron pesados y colocados en cajas 
metabólicas por un periodo de 24 horas precedentes a la eutanasia para la 
determinación de los parámetros fisiológicos: ingesta de agua, excreción de orina y 
consumo de alimento. Se llevó a cabo el sacrificio de animales acorde al diagrama 
general: en el día basal, semana 4, 15, 20 y 25 posterior a la administración de 
STZ. El sacrificio se llevó a cabo mediante exanguinación previa anestesia con 
Zoletil 50® (Virbac, S.A.). Los riñones se pesaron y mediante un corte sagital se 
dividieron, una fragmento se fijó en formaldehido en buffer de fosfato 0.1M al 10% 
para histología, la otra parte se almacenó a -80°C para los estudios moleculares. 
Además se obtuvo muestra de sangre mediante punción cardiaca previa anestesia 
del animal, se recolecto en un tubo sin anticoagulante, se realizó la separación del 
suero y dividido en varias alícuotas almacenándose a -80°C para las pruebas 
correspondientes. 
 
8.4.7 Descripción histológica 
Los tejidos obtenidos se conservaron en paraformaldehido al 10%. Posteriormente 
se embebieron en parafina y se obtuvieron cortes de 5 µm de la parte más