Dra--Galdy-Hdez-Zarate-Ciclo-UV-2012

Vista previa del material en texto

DETERMINACIÓN DE 
MICROORGANISMOS 
CONTAMINANTES DEL AGUA
Dra. Galdy Hernández Zárate
Microbiología Molecular
Departamento de Ciencias del Mar
Instituto Tecnológico de Boca del Río
Boca del Río, Ver.
Correo-e: galdyhz@gmail.com
gahernanitboca@live.com
Temas
1. Importancia de los microorganismos.
2. Calidad microbiológica del agua, inocuidad y calidad
alimentaria, sanidad acuícola y vegetal.
3. Diagnóstico microbiano: métodos tradicionales vs métodos
biomoleculares.
4. Casos de estudio: granjas de producción acuícola/monitoreo 
ambiental: calidad del agua (Quintana Roo y Veracruz)
Médica
Salud publica y socioeconómica
Ecológico
Descomposición
Ciclos biogeoquímicos
Bioindicadores
Biorremediación
Industrial 
Alimenticia/Farmacéutica
Fermentaciones, probióticos
Ecología humana, animal, vegetal
Simbiosis, nutrientes, descomposición
Industria
Agrícola
Energética
Biocombustibles
(biogas, biodisel)
Salud Pública
Bacterias, microalgas virus, 
hongos, protozoos
Sanidad Animal
Acuícola/Pecuaria
Sanidad Vegetal 
(bacterias, hongos, viroides)
Inocuidad y calidad agroalimentaria
Agua de riego/fertirrigación
Salud de los Ecosistemas
Florecimientos algales nocivos (cianobacterias
dinoflagelados, microalgas)
Biorremediación
Prevención, tratamiento, cura
de 
enfermedades
Problemáticas: brotes de enfermedades en 
productos de importancia comercial
ACUÍOLAS
1980-Flavobacterium, 
Pseudomonas, 
Photobacterium, Aeromonas, 
Moxarella: P. monodon
1990-V. harveyi, V. 
parahaemolyticus, V. vulnificus: 
peces, camarones.
1994-TSV IHHNV, HPV, IMNV, 
MBV, YHV y WSSV: P. vannamei
P. stylirostris
AGRÍCOLAS
1990-Salmonella ponna: melon
cantaloupe
1995-E. coli O157:H7 (jugos, 
rabanos, alfalfa)
1997-Hepatitis A: fresas
1999-Shigella: perejil
2003-Salmonella: mango
E. coli O157:H7 : ensaladas
2008-Salmonella: chiles
NOM-EM-038-FITO-2002
Detergentes
Sustancias 
InorgánicasFertilizantes
Xenobióticos
orgánicos: COPs
(Herbicidas
Pesticidas)
Medicamentos
Y Productos de 
Uso Personal
Hidrocarburos
Metales 
Pesados
Grasas y 
Aceites
MICROBIOLÓGICA
Materia
Orgánica
Contaminación: 
vibrios, florecimientos 
algales tóxicos 
(fitoplacton)
PRINCIPALES CONTAMINANTES DEL AGUA
MARCADORES 
QUÍMICOS
Analgésicos, cafeína. 
- Bloqueadores 
solares, jabones, 
cremas, otros
(DDT y metabolitos)
Bioacumulación
Biomagnificación
¿Por qué Estudiar la 
Calidad
Microbiologica del 
Agua?
Restaurantes
Inocuidad
alimentaria
Hoteles
albercas, parques
ecológicos, TA
Agua de lastre
buques y cruceros
Alimentos
acuáticos y 
terrestres
Hidroagricola
Fertirrigación
(cianobacterias)
Aguas residuales
Ambiente
Playas, ríos, lagunas, 
lagos, manglares
cenotes, 
Prevenir la Contaminación Ambiental
Prevención y control de enfermedades, epidemias, plagas y brotes
infecciosos: humana, animal, vegetal y ambiental
Cultivos
Pecuaria, acuicola, 
agricola pesquera
Monitoreo de Calidad del Agua y del Producto
Canales de agua
fuente de abastecimiento
de agua y drenes colectores
Actividades de
manejo y procesamiento
Productos acuícolas, agrícolas y hortofrutícolas
verificación/prevención
Calidad
Inocuidad
A
N
A
LISIS H
A
C
C
P
Buenas practicas 
agrícolas, 
higiénicas y de 
manufactura
PRODUCTORES
Determinación Microbiana: 
Identificación y Cuantificación 
bacteriana
TTTTÉÉÉÉCNICAS TRADICIONALESCNICAS TRADICIONALESCNICAS TRADICIONALESCNICAS TRADICIONALES
Microscópicas y Bioquímicas
� Tinciones
� Histológicas
� Fenotípicas
� Tiempos prolongados
� Variaciones: plasticidad fenotípica y metabólica
� Células viables no cultivables
� METODOS NORMADOS (NOMs Y NMXs)
�NMX-AA-102-SCFI-2006 (MF)
�NMX-AA-042-SCFI-2005 (NMP)
� NMX-AA-120-SCFI-2006 (IDEXX)
� NOM-110-SSA1-1994
Métodos para Detección de Coliformes
Métodos de Norma (NMX)
Microorganismos Indicadores
� Presencia, entrada, crecimiento o sobrevivencia de 
patógenos.
� Buenas prácticas de manejo
� Integridad del proceso que se realiza
INDICADORES DE CALIDAD
¿Qué Indica un Microorganismo
Indicador?:
Métodos para Detección de Coliformes
(Filtracion en Membrana o FM)
Conexión de la bomba de 
vacío y trampa
Colocación de los filtros Colocación de los embudos
Filtrado de la muestra
Retirar el papel filtro
Colocar el papel en el medio
de cultivo correspondiente
Incubado de la muestra bajo
condiciones específicas de 
temperatura y tiempo
Ensayo Medio Temperatura de incubación
Tiempo de 
incubación
Aspecto de las 
colonias
Coliformes 
totales
m-Endo
Agar
35,0 ± 0,5 °C 24 h
colonias rojas 
con reflejos 
metálicos
Coliformes 
fecales
(Termotolerantes
Termofilicas)
m-FC Agar 44,5 ± 0,2 °C 24 h
colonias 
azules
Métodos de FM para CT y CF
Prueba Presuntiva
CT CF
• En tubos:En tubos:En tubos:En tubos:
• En charolas En charolas En charolas En charolas multipozosmultipozosmultipozosmultipozos
((((ColilertertColilertertColilertertColilertert////EnterolertEnterolertEnterolertEnterolert))))
Métodos para Detección de 
Coliformes (Método del NMP)
Ensayos enzimáticos o sustratos fluorogénicos
Tradicionales
Comerciales rápidos
Pruebas comerciales rápidas
Micro Tester Pro
Amarillo tenue Intenso
Coliform Test Kit
Coliscan
Water Monitoring Kits
Parámetro Tipos de Agua
E. coli Residuales tratadas
Contacto directo
240 NMP/100 mL
Descarga aguas 
Residuales tratadas
Contacto ocasional 
1,000 NMP/100 mL
Para consumo humano
0
Enterococos Áreas recreativas 
0-200 NMP/100 mL
100 NMP/100 mL CERTIFICACIÓN
Shigella/Salmonella Para consumo humano
0
Vibrio cholerae
Para consumo humano
0
Parámetros Microbiológicos de Calidad del Agua Normados para
diferentes Usos del Agua
Descargas vertidas a 
suelo (uso en riego 
agrícola
2,000 NMP/100 mL
NOM-001-ECOL-1996, NOM-001-SEMARNAT-1996, NOM-127-SSA1-1994, NOM-EM-034-FITO-2000 
Suelos:
<1,000 NMP/gr suelo seco
Manejo postcosecha
Ausencia
�E. coli (enteropatógena y otros) Staphylococcus
� Rickettsia Klebsiella
� Enterococcus sp. Listeria monocytogenes
� Salmonella
� Shigella
�Pseudomonas
�Clostridium
�Aeromonas
�Vibrio cholerae
�Vibrio vulnificus
�Vibrio parahaemolyticus
�Campylobacter
�Yersinia enterocolitica
Patógenos Microbianos Monitoreados en Agua
Bacterias
Asociación Mexicana de Bioseguridad
AMEXBIO
http://amexbio.org/
Monitoreo de Bacterias Patógenas en Agua
Monitoreo de Virus y Parásitos en Agua
� Enterovirus
� Virus Norwalk
� Hepatitis A. E
� Rotavirus
Monitoreo de Microalgas Nocivas en Agua
METODOS MOLECULARES 
DE IDENTIFICACIÓN 
BACTERIANA
Basados en la PCR/Secuenciación:
PCR, RFLPs, ARDRA
AFLPs, Rep-PCR, RAPDs
RIR-PCR, ERIC-PCR,
RT-PCR, DGGE, qPCR,
Metagenómica
Basados en sondas para ADN o ARN:
ISH, FISH, dot blot
Basados en anticuerpos:
ELISA, Inmunocitoquímica, anticuerpos
fluorescentes, recombinantes, despliegue en 
fagos
MMMMÉÉÉÉTODOS MOLECULARESTODOS MOLECULARESTODOS MOLECULARESTODOS MOLECULARES
(ADN, ARN (ADN, ARN (ADN, ARN (ADN, ARN proteproteproteproteíííínasnasnasnas))))
Caracterización y diversidad genética de 
aislados ambientales (RADP)
Célula 
bacteriana
Cromosoma circular
ADN en forma de hélice
Huella genética 
Clave de identificación única
G C
C G
T A
T A
A T
T A
G C
C G
A T
A T
Marcadores Moleculares (RFLPs y RAPDs)
Detección molecular por PCR 
de genes de virulencia
ADN molde
Multiples copias
(1 millón)
SoluciSoluciSoluciSolucióóóón n n n 
de lavadode lavadode lavadode lavado
FormaldehidoFormaldehidoFormaldehidoFormaldehido al 6%al 6%al 6%al 6%
HIBRIDACIHIBRIDACIHIBRIDACIHIBRIDACIÓÓÓÓNNNN
LAVADOSLAVADOSLAVADOSLAVADOSVISUALIZACIVISUALIZACIVISUALIZACIVISUALIZACIÓÓÓÓNNNN
FISHFISHFISHFISH
Sonda fluorescenteSonda fluorescenteSonda fluorescenteSonda fluorescente
Microscopio de Microscopio de Microscopio de Microscopio de 
epifluorescenciaepifluorescenciaepifluorescenciaepifluorescencia
FIJACIFIJACIFIJACIFIJACIÓÓÓÓNNNN
Hibridación Fluorescente in situ
INMUNOLOGÍA 
Anticuerpos recombiantes por Despliegue en Fagos
FvCsInmunización
Z3
Síntesis VH y VL
PCRBazo y linfocitos B
Expresión, extracción y purificación de los 
FvCs contra V. harveyi
Búsqueda y selección de clonas
Contra V. harveyi por ELISA
RNAT
RT-PCR
Construcción
del vector fasmídico y 
transformación en E. coli
Despliegue en fagos
Caso de Estudio 1
Vibriosis y Coliformes en la 
Acuicultura
Identificación molecular de Vibrio haveyi
• AbundanciaAbundanciaAbundanciaAbundancia natural, 74 spp.natural, 74 spp.natural, 74 spp.natural, 74 spp.
• PlasticidadPlasticidadPlasticidadPlasticidad fenotfenotfenotfenotíííípicapicapicapica y y y y metabmetabmetabmetabóóóólicalicalicalica
• UbicuidadUbicuidadUbicuidadUbicuidad y y y y adaptaciadaptaciadaptaciadaptacióóóónnnn a a a a sistemassistemassistemassistemas acuiculturalesacuiculturalesacuiculturalesacuiculturales
• PatPatPatPatóóóógenosgenosgenosgenos oportunistasoportunistasoportunistasoportunistas de de de de organismosorganismosorganismosorganismos acuacuacuacuááááticosticosticosticos
PRINCIPAL PROBLEMA EN LA ACUICULTURAPRINCIPAL PROBLEMA EN LA ACUICULTURA
PorPorPorPor ququququéééé VibrioVibrioVibrioVibrio spp.?spp.?spp.?spp.?
HOSPEDEROHOSPEDEROHOSPEDEROHOSPEDERO
L. vannamei
PATPATPATPATÓÓÓÓGENOGENOGENOGENO
V. harveyi
AMBIENTEAMBIENTEAMBIENTEAMBIENTE
Sistemas
de cultivo
V. harveyi: un patógeno de 
organismos marinos cultivados
VHML
FACTORES DE VIRULENCIA DE FACTORES DE VIRULENCIA DE FACTORES DE VIRULENCIA DE FACTORES DE VIRULENCIA DE VibrioVibrioVibrioVibrio harveyiharveyiharveyiharveyi
Fosfolipasas
Cisteína-proteasa
alcalina
Endotoxinas:
Lipopolisacáridos
Hemolisinas
TLH
vhhA y vhhB
Metalo-
Proteasa
dependiente de 
Zn2+,
proteasas
termoestables o 
termolábiles.
Toxinas
T1 y T2
PREVENCIPREVENCIPREVENCIPREVENCIÓÓÓÓNNNN
DETECCIDETECCIDETECCIDETECCIÓÓÓÓNNNN
MONITOREO MONITOREO MONITOREO MONITOREO 
Ide
ntif
ica
ció
n
mo
lec
ula
r d
e la
s c
ep
as
Larvas
Juveniles
Adultos
Ge
ne
s y
 fa
cto
res
de
 
viru
len
cia
EstrategiaEstrategiaEstrategiaEstrategia paraparaparapara la la la la prevenciprevenciprevenciprevencióóóónnnn, control y , control y , control y , control y manejomanejomanejomanejo de de de de 
laslaslaslas enfermedadesenfermedadesenfermedadesenfermedades bacterianasbacterianasbacterianasbacterianas
Métodos
AisladosAisladosAisladosAislados dededede VibrioVibrioVibrioVibrio utilizadosutilizadosutilizadosutilizados en en en en esteesteesteeste estudioestudioestudioestudio....
CEPA FUENTE ORIGEN
Ea Sistema de eclosión Criadero Golfo Santa Clara, Son, Méx. (L.stylirostris)
1A-1 Agua de mar cercana a la costa Bahía Santa Bárbara, Son, Méx. (L. stylirostris)
M1 Agua de mar del fondo de estanques con 
reproductores
Criadero Golfo Santa Clara, Son, Méx (L. stylirostris)
M1-a Agua mar estanques reporductores “
PN-9801 Órgano linfoide de juveniles enfermos Filipinas (P. monodon)
ML Larvas Criadero La Paz, B. C. S., México (L. vannamei)
ML-1 Larvas “
10MZ1 Nauplios Criadero Mazatlán, Sin. México. (L. stylirostris)
10MZ2 Nauplios “
11MZ Nauplios “
Na-1 Nauplios Criadero Golfo Santa Clara, Son, Méx. (L. stylirostris)
Na-2 Nauplios “
Z1 Agua de mar del fondo de un estanque
con reproductores
Criadero Golfo Santa Clara, Son, Méx. (L. stylirostris)
Z2 Agua de mar de la superficie de un 
estanque con reprorductores
“
Z3 Agua del mar cercana a la pared de un 
tanque con reproductores
“
1
5
 a
is
la
d
o
s 
d
e
 s
is
te
m
as
 d
e
 p
ro
d
u
cc
ió
n
Análisis de Restricción
Experimental (Digestión
MspI)
Análisis de Restricción
Teórico
Determinación de Cepas
Vibrio sp.
ANÁLISIS MOLECULAR
Amplificación Gene 16S DNAr
RFLPs
Diseño de 
Oligonucleótidos
Identificación
de V. harveyi
PCR
RAPDs
Búsqueda de Patrones
Genéticos en V. harveyi
y Diferenciación entre 
Cepas
Generación de 
Anticuerpos
Ecoliclonales
Phage 
Display
ELISA
BBBBaseaseasease de de de de datosdatosdatosdatos deldeldeldel
NCBI NCBI NCBI NCBI ((((GeneBankGeneBankGeneBankGeneBank))))
SelecciSelecciSelecciSeleccióóóónnnn de genes de de genes de de genes de de genes de V. V. V. V. harveyiharveyiharveyiharveyi
txR, vhh-1, vhhB, luxL, luxM y 
luxN
AlineamientoAlineamientoAlineamientoAlineamiento y y y y disedisedisediseñññño de o de o de o de oligosoligosoligosoligos para para para para 
pcrpcrpcrpcr usandousandousandousando el el el el programaprogramaprogramaprograma DNAStarDNAStarDNAStarDNAStar y la y la y la y la 
base de base de base de base de datosdatosdatosdatos del del del del NCBINCBINCBINCBI
PCRPCRPCRPCR
IDENTIFICACIIDENTIFICACIIDENTIFICACIIDENTIFICACIÓÓÓÓN DE N DE N DE N DE V. V. V. V. harveyiharveyiharveyiharveyi
EstrategiaEstrategiaEstrategiaEstrategia utilizadautilizadautilizadautilizada paraparaparapara el el el el disedisedisediseññññoooo de primers.de primers.de primers.de primers.
RESULTADOS
Amplificación del gen 16S ADNr
1, 500 pb
PM C+ B C D E F G H I J K L M N Ñ O 
Confirmación de Vibrio sp.?
14126
Aislados ambientales
RFLPs del gen 16S ADNr con MspI. Carril R, V. harvyei (ATCC 14126), B, B. 
subtilis, E., E. coli, 1-15, aislados analizados, PM, peso molecular.
PM B 1 C+ B E 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
2000
1500
1000
750
500
300
150
50
RFLPs: “corte” con enzimas de restricción
Tabla VIII. Oligonucleótidos utilizados en el PCR.
OLIGOOLIGOOLIGOOLIGO GEN GEN GEN GEN BLANCOBLANCOBLANCOBLANCO PRODUCTOPRODUCTOPRODUCTOPRODUCTO FUNCIFUNCIFUNCIFUNCIÓÓÓÓNNNN
TAMATAMATAMATAMAÑO DEL O DEL O DEL O DEL 
PRODUCTOPRODUCTOPRODUCTOPRODUCTO
pbpbpbpb
txRtxRtxRtxR txRtxRtxRtxR TxRTxRTxRTxR ReguladorReguladorReguladorRegulador de la de la de la de la 
transcripcitranscripcitranscripcitranscripciónnnn
629629629629
vhhvhhvhhvhh----1111
vhhvhhvhhvhh----BBBB
vhhvhhvhhvhh----1111
vhhBvhhBvhhBvhhB
ββββ----lactamasalactamasalactamasalactamasa
hemolisinahemolisinahemolisinahemolisina
HidrHidrHidrHidrólisislisislisislisis del del del del anilloanilloanilloanillo ββββ----
lactlactlactlactámicomicomicomico de de de de antibiantibiantibiantibióticosticosticosticos
EnzimaEnzimaEnzimaEnzima lisalisalisalisa eritrocitoseritrocitoseritrocitoseritrocitos
818 818 818 818 
656656656656
luxLluxLluxLluxL luxLluxLluxLluxL autoinductorautoinductorautoinductorautoinductor MolMolMolMoléculaculaculacula seseseseñalalalal paraparaparapara la la la la 
expresiexpresiexpresiexpresiónnnn de la de la de la de la 
luminiscencialuminiscencialuminiscencialuminiscencia dependientedependientedependientedependiente
de de de de densidaddensidaddensidaddensidad celularcelularcelularcelular
292292292292
luxMluxMluxMluxM luxMluxMluxMluxM autoinductorautoinductorautoinductorautoinductor 393393393393
luxNluxNluxNluxN luxNluxNluxNluxN ProteProteProteProteínananana LuxNLuxNLuxNLuxN SensarSensarSensarSensar y responder al y responder al y responder al y responder al 
autoinductorautoinductorautoinductorautoinductor
2048204820482048
Selección de Genes para el Diseño de 
Oligonucleótidos
Amplificación de cepas ambientales de V. harveyi con luxN
2048
1500
1000
750
500
PM M1 C+ Z3 Z2
luxNluxNluxNluxN
PCR
Amplificación específica
� Hernández-Zárate G. and Olmos-Soto, J. 2000. Molecular 
identification of pathogenic and nonpathogenic strains of Vibrio harveyi
using PCR and RAPD. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63: 722-727 p. 
2000
1500
1000
750
500
300
Perfiles RAPDs para cepas V. harveyi
1281 1283 12901247 1254
R Z2 Z3 R Z2 Z3 R Z2 Z3R Z2 Z3 R Z2 Z3
RAPDs
Amplificación inespecífica (gel agarosa con bromuro)
Perfiles RAPDs de aislados de Vibrio spp., V. harveyi y 
la cepa control, utilizando el oligonucleótido OPS-11.
Ea PN 1A-1 PM M1 Z3 Z2 Z1 R
2072
1500
600
200
RAPDs
Amplificación inespecífica (gel poliacrilamida con plata)
R Vo Pd Vpa Vpe Vca Vpro Val PM
2000
1500
1000
750
500
300150
50
Perfiles RAPDs de diferentes especies del género Vibrio, 
incluyendo V. harveyi.
RAPDs
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Clona 8 Clona 18 CT C-
A
b
s
 (
4
0
5
 n
m
)
EnsayoEnsayoEnsayoEnsayo inmunoenziminmunoenziminmunoenziminmunoenzimááááticoticoticotico de de de de laslaslaslas clonasclonasclonasclonas seleccionadasseleccionadasseleccionadasseleccionadas especespecespecespecíííífiicasfiicasfiicasfiicas paraparaparapara V. V. V. V. harveyiharveyiharveyiharveyi. CT, . CT, . CT, . CT, 
control control control control E. coliE. coliE. coliE. coli Top10FTop10FTop10FTop10F’’’’virgen; Cvirgen; Cvirgen; Cvirgen; C----, control , control , control , control negativonegativonegativonegativo....
Anticuerpos Recombinantes
ELISA
14126141261412614126 Z2Z2Z2Z2
Z3Z3Z3Z3 EaEaEaEa
M1M1M1M1 PN9801PN9801PN9801PN9801
Propiedades hemolíticas de los aislados V. harveyi y Vibrio spp. 
Carga Bacteriana en Tilapia 
Granja BHT 
(UFC/mL)
Vibrio
(UFC/mL)
1
5.7 x 104 80
4.1 x 104 75
2
4.7 x 103 69
1.6 x 105 58
Coliformes (NMP)
408.3
437.1
258.9
Caso de Estudio 2
Calidad Sanitaria en Áreas 
Recreativas de Quintana Roo 
Evaluar de forma rápida y precisa
E. coli
enterococos
Presencia/ausencia por PCR:
V. cholerae,
V. parahaemolyticus
V. vulnificus
Corredor Turístico 
Isla Blanca-Cancún-Tulúm
Monitoreos:
2007-210
12 Cenotes 
4 Lagunas
8 Playas 
Indicadores de contaminación fecal
en ambientes costeros de Q. Roo
Concentración bacteriana
Coliformes 
totales 
E. coli
Enterococos Vibrio
patogénico
Laguna NMP /100 ml 
Nichupté 4, 083.0 20.2 186.9 +
Bojorquez (estación 1) 2, 167.0 10.0 225.5 +
Bojorquez (estación 2) 4, 674.3 62.6 823.0 +
Manatí 6, 910.3 157.9 179.1 ++
Chackmuchuck 1, 063.4 72.4 30.6 +
Especie C1 C2 C3 C4 C5 C6 %
V. p. total + + + + + + 100
V. p. patogénico -
+
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
50
83
V. c. total
V. c. toxigénico
- + - - + + 50
- - - - - - 0
V. v. total - + - - + + 50
V. v. patogénico - + - - + - 33
Profundidad (m) 20 4,5 2,0 0,5 1,5 2,0
Ocurrencia de Vibrio spp. en agua subterránea y cenotes del noreste 
de Quintana Roo, México.
Densidad promedio de indicadores microbiológicos en playas 
turísticas del noreste de Quintana Roo, México.
Certificación de playas: NMX-AA-120-SCFI-2006 (100 enterococos/100 mL)
SSA-COFEPRIS (200 enterococos/100 mL)
Concentración bacteriana
Coliformes 
totales 
E. coli Enterococos Vibrio patogénico
Playa NMP /100 ml 
Los Niños 435.2 2.0 13.5 -
Tortugas 193.5 13.1 2.0 -
Las Perlas 45.0 10.6 <1 -
Isla Contoy 2.0 <1 3.0 -
1000
600
500
300
200
100
PM Vp Vp Vp Vv Vv Vc Vc 
450 269 500 205 504 588 564 
pb
Total
Patogénico
Vp: V. parahaemolyticus
Vv: V. vulnificus
Vc: V. cholerae
C2
V. cholera
toxigénico
ausente
Rebolledo-Vieyra M. y Hernández-Zárate, G. Unidad de Ciencias del Agua: El Agua y la 
Investigación Científica. En: Luis del Castillo et al. CICY: treinta años de labor científica y 
educativa. Centro de Investigación Científica de Yucatán, A. C. Mérida, Yuc. México. 2010. 383-
388 pp. ISBN 978-607-7823-04-9 (Incluye Fe de erratas).
http://www.cicy.mx/documentos/cicy/ultimas_noticias/fe%20de%20erratas.pdf
http://www.cicy.mx/documentos/cicy/ultimas_noticias/cicy_30_anos_de_labor_cientifica_y_educativa.pdf
G R A C I A S …