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INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS
SUPERIORES DE MONTERREY
CAMPUS MONTERREY
DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA
PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA
“EVALUACIÓN DE UN PROCESO CROMATOGRÁFICO PARA LA
OBTENCIÓN DE EXTRACTOS FENÓLICOS DE TOMILLO (Thymus
vulgaris) LIBRES DE SUSTRATOS DE POLIFENOLOXIDASA”
TESIS
PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER
EL GRADO ACADÉMICO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS
CON ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA
POR:
OSCAR ALEJANDRO AGUILAR JIMÉNEZ
MONTERREY, N.L. DICIEMBRE DE 2003
INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS
SUPERIORES DE MONTERREY
CAMPUS MONTERREY
DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA
PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA
“EVALUACIÓN DE UN PROCESO CROMATOGRÁFICO PARA LA
OBTENCIÓN DE EXTRACTOS FENÓLICOS DE TOMILLO (Thymus
vulgaris) LIBRES DE SUSTRATOS DE POLIFENOLOXIDASA”
TESIS
PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA
OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS
CON ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA
POR:
OSCAR ALEJANDRO AGUILAR JIMÉNEZ
MONTERREY, N.L. DICIEMBRE DE 2003
INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE
MONTERREY
CAMPUS MONTERREY
DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA
PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA
Los miembros del comité de tesis recomendamos que el presente proyecto de tesis
presentado por el Lic. Oscar Alejandro Aguilar Jiménez sea aceptado como requisito
parcial para obtener el grado académico de Maestro en Ciencias con especialidad en:
BIOTECNOLOGÍA
Comité de Tesis:
Carmen Hernández Brenes, Ph.D
Asesor
Marco Antonio Rito Palomares, Ph.D
Sinodal
Mario Moisés Álvarez, Ph.D
Sinodal
Federico Viramontes Brown, Ph. D.
Director del Programa de Graduados en Ingeniería
Diciembre de 2003
Aprobado:
I
RESUMEN
 Las antocianinas han despertado interés debido a sus propiedades nutracéuticas
además de la amplia variedad de colores que despliegan en soluciones acuosas en función del
pH, en aplicaciones en alimentos, para el reemplazo de colorantes de origen sintético. Sin
embargo, una de las limitaciones para el uso de las antocianinas es su baja estabilidad, debido
a su estructura química, factores ambientales y a la presencia de otros fitoquímicos en
solución. El establecimiento de estrategias para la estabilización de estos pigmentos en
soluciones acuosas ha conducido al uso de sustancias llamadas copigmentos, los cuales
tienen la capacidad de incrementar el poder de tinción de estas moléculas de color, por
modificación de sus propiedades espectrales. El empleo de copigmentos como estabilizadores
de antocianinas tiene la desventaja de que la polifenoloxidasa es capaz de usar algunas
moléculas de copigmento como sustratos, conduciendo a la degradación de los mismos y de
las antocianinas, con la consecuente pérdida de las propiedades nutracéuticas del alimento. En
el presente trabajo se planteó como objetivo, obtener un extracto de tomillo (Thymus vulgaris)
libre de sustratos de polifenoloxidasa y con capacidad de copigmentación similar a la de los
copigmentos obtenidos a través del proceso comercial original para ser empleado en ensayos
copigmentación de jugo de fresa (Fragaria anannassa).
Se probaron dos resinas, una aniónicas una fuerte y una débil para modificar el
proceso comercial de obtención de extractos de tomillo, lo que condujo a la obtención de un
nuevo extracto con una reducida capacidad de ser usado como sustrato de polifenoloxidasa,
(extracto fuerte) en comparación con el extracto original en ensayos modelo. En el segundo
estudio, se concluyó que el extracto tratado con la resina fuerte, poseía una capacidad de
copigmentación mayor que el extracto tratado con la resina aniónica débil, incluso mayor que el
extracto original.
El efecto de las resinas aniónicas sobre el extracto de tomillo se evaluó en el tercer
estudio, donde se determinó la composición química de los extractos por cromatografía de
líquidos de alta resolución con detector de fotodiodos. Se determinó que el efecto de ambas
resinas aniónicas fue en la remoción de compuestos que participan del contenido de fenólicos
totales de los extractos, sin embargo en el caso de la resina aniónica fuerte se logra disminuir
selectivamente la concentración de compuestos específicos susceptibles a la oxidación por
acción de la polifenoloxidasa del sistema, mejorando a su vez las propiedades de dicho
extracto para ser usado como copigmento en jugos de fresa.
II
DEDICATORIA
A mis padres, a quien les debo todo lo que soy y lo que seré…….. son un
verdadero ejemplo de dedicación y esfuerzo constante, siempre viendo por el
bienestar de sus hijos.
Con todo mi cariño. Muchas Gracias
Mis evidencias convencen al ignorante, y las evidencias del
sabio me convencen a mí. Pero aquel cuyo razonamiento se
halla a la mitad del camino entre la sabiduría y la ignorancia, ni
puedo convencerle yo a él, ni puede convencerme él a mí.
Khalil Gibran
– Máximas Espirituales –
III
AGRADECIMIENTOS
A mi asesora, la Dra. Carmen Hernández, por dedicarme su tiempo en una etapa muy
especial de su vida. Felicidades.
A mis sinodales, sin duda un apoyo para la elaboración de este documento, y los
maestros, que de una u otra forma dejan su huella en mi formación durante este año y medio.
A mis amigos y compañeros de viaje……. Helena, Balta, Nidya, Ana, Oscar, Jorge y
Benito…….. mucha suerte.
A Isabel, Mayra, Gaby, Armando…… y a todo el mundo ya!! Mil gracias
IV
LISTA DE CONTENIDO
RESUMEN ....................................………………….............………………..…...........….…....…
DEDICATORIA .........................................................…………....…………………............…......
AGRADECIMIENTOS...……....…………………………….....................................…............…..
TABLA DE CONTENIDO .....……....…................................................................…...…...........
LISTA DE TABLAS…...….........................……………………………………………...….............
LISTA DE FIGURAS ……..……….....…………………….................……………......…..............
LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................................
CAPITULO 1 – REVISIÓN DE LITERATURA............................................................................
1.1 ANTOCIANINAS..................................................................................................................
1.1.1 Estructura Química.....................................................................................................
1.1.2 Importancia y Ocurrencia en la Naturaleza................................................................
1.1.3 Análisis de Antocianinas por Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución............
1.1.4 Factores que Afectan su Estabilidad..........................................................................
1.1.4.1 pH.....................................................................................................................
1.1.4.2 Temperatura ....................................................................................................
1.1.4.3 Oxígeno y Ácido Ascórbico ..............................................................................
1.1.4.4 Enzimas ............................................................................................................
1.1.4.5 Iones Metálicos..................................................................................................
1.1.4.6 Copigmentos......................................................................................................
1.2 FLAVONOIDES Y ÁCIDOS FENÓLICOS............................................................................
1.2.1 Clasificación y Estructura Química.............................................................................
1.2.2 Ocurrencia de Flavonoides y Ácidos Fenólicos en Tomillo.........................................
1.2.3 Características Espectrales........................................................................................
1.2.4 Fraccionamiento de ExtractosFenólicos....................................................................
1.2.5 Función como sustratos de polifenoloxidasa..............................................................
1.3 COPIGMENTACIÓN............................................................................................................
1.3.1 Tipos de copigmentación............................................................................................
1.3.1.1 Autoasociación..............................................................................................
1.3.1.2 Copigmentación Intramolecular.....................................................................
1.3.1.3 Copigmentación Intermolecular.....................................................................
1.3.1.4 Copigmentación con iones metálicos............................................................
I
II
III
IV
VII
VIII
IX
1
1
1
4
5
8
8
9
9
11
12
13
14
14
18
19
20
20
21
21
21
22
23
24
V
1.3.2 Uso de extractos fenólicos como estabilizadores de antocianinas.............................
CAPITULO 2. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE TOMILLO LIBRES DE SUSTRATOS DE
POLIFENOLOXIDASA Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA.......................................................
2.1 INTRODUCCIÓN.................................................................................................................
2.2 MATERIALES Y MÉTODOS...............................................................................................
2.2.1 Materiales..................................................................................................................
2.2.2 Estudio 1. Obtención del extracto acuoso de tomillo y modificación al proceso
comercial...................................................................................................................
2.2.2.1 Obtención del extracto acuoso de Tomillo....................................................
2.2.2.2 Modificación del proceso de extracción comercial........................................
2.2.2.3 Caracterización espectrofotométrica de extractos fenólicos.........................
2.2.2.3a Determinación de Fenólicos totales por el método de Folin-
Ciocalteau......................................................................................
2.2.2.3b Determinación del perfil de compuestos fenólicos por el método de
Glories............................................................................................
2.2.2.4 Evaluación de los extractos modificados como sustratos de PPO................
2.2.3 Estudio 2. Evaluación de la capacidad de copigmentación de los extractos
fenólicos de tomillo en jugo de fresa.....................................................................
2.2.3.1 Obtención del jugo de fresa...........................................................................
2.2.3.1a Clarificación enzimática...................................................................
2.2.3.1b Determinación de antocianinas monoméricas totales por el método
de pH diferencial............................................................................
2.2.3.1c Determinación de antocianinas por HPLC-PDA..............................
2.2.3.2 Sistemas de Copigmentación........................................................................
2.2.3.3 Caracterización de la copigmentación...........................................................
2.2.3.3a Propiedades espectrales.................................................................
2.2.3.3b Método de pH diferencial.................................................................
2.2.3.3c Color instrumental............................................................................
2.2.3.3d Índice de degradación, color polimérico y porcentaje de color
polimérico......................................................................................
2.2.3.4 Copigmentación con sales metálicas............................................................
2.2.4 Estudio 3. Caracterización química detallada de los extractos de tomillo por
cromatografía de líquidos de alta resolución con detector de arreglo de diodos.
2.2.4.1 Método de separación cromatográfica por HPLC..........................................
2.2.4.2 Identificación y cuantificación de compuestos fenólicos individuales............
2.2.4.3 Procedimiento de interpretación espectros UV-Visible..................................
24
26
26
28
28
28
28
29
30
30
30
30
31
31
31
32
32
32
33
33
33
33
33
34
34
35
35
VI
2.2.5 Análisis Estadístico.................................................................................................
2.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................................
2.4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES......................................................................
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................................
ANEXOS....................................................................................................................................
VITA...........................................................................................................................................
36
37
63
65
70
79
VII
LISTA DE TABLAS
Tabla 1.1 Estructura de las antocianidinas................................................................................
Tabla 1.2. Características estructurales y espectrales de las antocianidinas en función de su
patrón de hidroxilación................................................................................................................
Tabla 1.3 Principales clases de flavonoides conocidos..............................................................
Tabla 1.4 Compuestos fenólicos en Thymus vulgaris................................................................
Tabla 1.5 Espectro de absorción de varias clases de compuestos polifenólicos......................
Tabla 2.1 Programa de elución por gradiente para separación cromatográfica de flavonoides.
Tabla 2.2 Perfil de compuestos fenólicos del extracto acuoso de tomillo (Thymus vulgaris) de
acuerdo con el método de Glories..............................................................................................
Tabla 2.3 Contenido de fenólicos totales en extractos de tomillo crudo y modificado por
cromatografía aniónica...............................................................................................................
Tabla 2.4 Velocidades de formación de producto por la acción enzimática de polifenoloxidasa
sobre extractos de tomillo y catequina.......................................................................................
Tabla 2.5 Efecto de la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre las propiedades
espectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa)....................................................................
Tabla 2.6 Coordenadas de color instrumental en escala CIEL*C*h* (D65/10º
iluminador/observador) para jugo de fresa (Fragaria ananassa) adicionado con tres tipos de
extracto de tomillo......................................................................................................................
Tabla 2.7 Efecto de la adición de los extractos fenólicos de tomillo (Thymus vulgaris) sobre las
determinaciones de antocianinas, densidad de color, color polimérico y porcentaje de color
polimérico del jugo de fresa (Fragaria anannassa)....................................................................
Tabla 2.8 Coordenadas de color instrumental en escala CIEL*C*h* (D65/10º
iluminador/observador) para jugo de fresa (Fragaria ananassa) adicionado con iones aluminio.
Tabla 2.9 Efecto de la adición de iones aluminio sobre las propiedades espectrales del jugo de
fresa (Fragaria ananassa)..........................................................................................................Tabla 2.10 Identificación de picos cromatográficos en extracto de tomillo crudo por HPLC-PDA
Tabla 2.11a Análisis comparativo de la composición fenólica de extractos de tomillo por HPLC-
PDA............................................................................................................................................
2
6
15
18
20
35
38
39
41
45
y
47
6
50 
50
t
51
51
55
58
VIII
Tabla 2.11b Análisis comparativo de la composición fenólica de extractos de tomillo por HPLC-
PDA. (continuación)...................................................................................................................
Tabla 2.12 Concentraciones molares necesarias de copigmento y pigmento para los 5 niveles
de copigmentación.....................................................................................................................
Tabla 2.13 Volúmenes de jugo, copigmento y solución reguladora de citratos necesarios para
cada nivel de copigmentación con los tres extractos.................................................................
Tabla 2.14 Volúmenes de jugo, solución de aluminio y solución reguladora de citratos
necesarios para cada nivel de copigmentación.........................................................................
59
72
73
73
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 Equilibrio de antocianinas.........................................................................................
Figura 1.2 Efecto generalizado del pH en el equilibrio de las antocianinas...............................
Figura 1.3 Estructuras químicas de las principales clases de polifenoles.................................
Figura 1.4 Subclases de flavonoides.........................................................................................
Figura 2.1 Esquema general de modificación de extractos de tomillo por cromatografía
aniónica. Flujo de 4 mL/min.......................................................................................................
Figura 2.2 Actividad enzimática de sistemas modelo formulados con extractos de tomillo con
polifenoloxidasa (300U/mL) y catequina 5mM @420 nm, 30ºC, pH 6.5....................................
Figura 2.3 Cambio en la apariencia del jugo de fresa después de la clarificación....................
Figura 2.4 Cromatograma HPLC-PDA de antocianinas presentes en jugo de fresa (Fragaria
anannassa) a 520 nm.................................................................................................................
Figura 2.5 Cambios visuales causados por la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre
jugo de fresa (Fragaria ananassa).............................................................................................
Figura 2.6 Cromatograma HPLC-PDA del extracto de tomillo crudo recolectado a tres
longitudes de onda.....................................................................................................................
Figura 2.7 Comparación entre cromatogramas HPLC-PDA de extracto de tomillo crudo con los
tratamientos con resinas aniónicas a 335 nm............................................................................
Figura 2.8 Efecto batocrómico por la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre las
propiedades espectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa)...............................................
Tabla 2.9 Efecto hipercrómico por la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre las
propiedades espectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa)...............................................
Figura 2.10 Espacio de color CIELAB.......................................................................................
Figura 2.11 Disco de tonalidades de acuerdo a su valor de ángulo de color (hue)..................
Figura 2.12 Modificación en la concentración de cuatro compuestos por efecto del tratamiento
con resinas aniónicas.................................................................................................................
3
8
16
17
29
41
43
43
46
54
 y
57
6 
74
t
75
76
77
78
X
LISTA DE ABREVIATURAS
ε Absortividad molar de la antocianina de interés
∆%Abs Cambio porcentual en absorbancia de las antocianinas copigmentadas
(-) Levógiro
(+) Dextrógiro
µm Micrómetros
λmax Longitud de onda de máxima absorbancia
λmax A Longitud de onda de máxima absorbancia de las antocianinas sin
copigmentar
λmax AC: Longitud de onda de máxima absorbancia de las antocianinas
copigmentadas
½O2 Medio mol de oxígeno
1H-RMN Resonancia magnética nuclear de ion hidrógeno
2R Posición de carbono quiral dextrógiro
3S Posición de carbono quiral levógiro
A Absorbancia
Aλ�max Absorbancia en la longitud de onda máxima de las antocianinas sin
copigmentar
Aλ�max Absorbancia a la longitud de onda máxima
A440 Absorbancia a 440 nanómetros
A700 Absorbancia a 700 nm a pH 1 y pH 4.5
AAλ�max Absorbancia en λmax de las muestras tratadas con agua
AA420nm Absorbancia a 420 nm de las muestras tratadas con agua
AA700 Absorbancia a 700 nm de las muestras tratadas con agua
ACλ�max Absorbancia en la longitud de onda máxima de las antocianinas
copigmentadas.
Al3+ Ion aluminio
AlCl3 Cloruro de aluminio
AMT Antocianinas monoméricas totales
ANOVA Análisis de Varianza
Ap Apigeninidina
arctan Arcotangente
Au Aurantinidina
Avis-max Absorbancia a 700 nanómetros
BHT Hidroxitolueno butilado
C Carbono
Cλ�max Absorbancia de los copigmentos en la longitud de onda máxima de las
antocianinas copigmentadas.
C* Saturación de color ó Chroma
C.V. Capital Variable
C18 Resina de 18 carbonos
CA California
CAT Catequina
CD3OD Metanol deuterado
CIE Commission Internationale de l’Eclairages
Co Company
Cp Capensinidina
Cy Cianidina
D65 Fuente de iluminación luz de día
Dp Delfinidina
E –Cu2+ Enzima-ion cobre(II)
E.C. Enzyme Commission
XI
E.U.A. Estados Unidos de América
Ea Energía de activación
EAG Equivalentes de ácido gálico
Ec. Ecuación
Et al. Y otros
Eu Europinidina
FD Factor de dilución
g Gramo
Ga3+ Ion galio
H Hidrógeno
h* Ángulo de color ó Hue
H2O Agua
HCl Ácido clorhídrico
HPLC Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución
Hs Hirsutidina
I Fuerza iónica
in Pulgada
Int International
KAl(SO4)2 Alumbre
kg Kilogramo
kJ/mol Kilojoules por mol
L Litro
L* Luminosidad
Lt Luteolinidina
M Molar
MA Massachusetts
MB Manitoba
mg Miligramo
Mg2+ Ion magnesio
meq miliequivalentes
MI Mississippi
min Minutos
mL Mililitro
Mv Malvidina
N Normal
NaCl Cloruro de sodio
NaOH Hidróxido de sodio
NC Carolina del Norte
NH4OH Hidróxido de amonio
NL Nuevo León
nm Nanómetros
O Oxígeno
ºC Grados centígrados
ºF Grados Fahrenheit
OH Grupo hidroxilo
OMe Grupo metoxilo
PA Pennsylvania
PA308 Resina aniónica fuerte
PDA Photodiode Array
Pg Pelargonidina
pH Potencial de hidrógeno
pKa Función p de la constante de disociación ácida
Pl Pulchelidina
PM Peso molecular
XII
Pn Peonidina
ppm Partes por millón
PPO Polifenoloxidasa
Pt Petunidina
PTFE Politetrafluoroetileno
R1 Sustituyente 1
R2 Sustituyente 2
RPLC Cromatografía liquida en fase reversa
rpm Revoluciones por minuto
Rs Rosinidina
Rx Radical
S.A. Sociedad Anónima
SAλ�max Absorbancia en λmax de las muestras tratadas con bisulfito
SA420nm Absorbancia a 420 nm de las muestras tratadas con bisulfito
SA700 Absorbancia a 700 nm de las muestras tratadas con bisulfito
seg Segundos
SO2 Dióxido de azufre
St Saint
Tr Tricetinidina
U/mL Unidades por mililitro
UV Ultravioleta
WA30 Resina aniónica débil
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
1
CAPITULO 1
REVISIÓN DE LITERATURA
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
1.1 ANTOCIANINAS
El color juega un papel muy importante en nuestra apreciación de la calidad en
alimentos y bebidas; es apreciado desde un punto de vista estético, así como para el
aseguramiento de calidad. A este respecto, el color nos proporciona claves visuales para la
identificación de sabor, influenciando el gusto por el alimento, su aceptabilidad y por último, la
elección por parte del consumidor (Bridle y Timberlake, 1996).
Las antocianinas comprenden elgrupo mas grande de pigmentos solubles en agua en
el reino vegetal, y son especialmente características de las plantas angiospermas. Están
ampliamente distribuidas en al menos 27 familias, 73 géneros y multitud de especies (Bridle y
Timberlake, 1996). En el tejido vegetal, las antocianinas son pigmentos naturales, de la familia
de los polifenoles, responsables de los colores rojos, azules y púrpuras que se encuentran en
muchas flores y frutos. Al estar presentes en los hollejos de la uva, le dan color a los vinos
tintos (Escribano-Bailón y Brouillard, 1996).
1.1.1 Estructura Química
La estructura de una antocianina comparte el esqueleto de carbono C6C3C6 de otros
flavonoides naturales y el mismo origen biosintético (Jackman y Smith, 1996). Son glicósidos
con el esqueleto de una antocianidina. Las agliconas son raramente encontradas en productos
vegetales frescos (Clifford, 2000), y difieren de otros flavonoides naturales por su característica
de absorber fuertemente la luz visible. El rango de colores asociados con las antocianinas
resulta de su habilidad de formar estructuras resonantes a partir del núcleo principal C6C3C6 y
varios factores a su alrededor (Jackman y Smith, 1996). En la naturaleza se encuentran en la
forma de glicósidos dieciocho diferentes antocianidinas, siendo estas derivados
polihidroxilados y polimetoxilados de las sales del ion 2-fenilbenzopirilio (ion flavilio) (Tabla 1.1)
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
2
Tabla 1.1 Estructura de las antocianidinas.1
Grupos funcionales presentes
Antocianidina
3 5 6 7 3’ 5’
Color
Pelargonidina (Pg) OH OH OH OH H H Naranja
Cianidina (Cy) OH OH OH OH OH H Naranja-Rojo
Delfinidina (Dp) OH OH OH OH OH OH Azul-Rojo
Peonidina (Pn) OH OH OH OH OMe H Naranja-Rojo
Petunidina (Pt) OH OH OH OH OMe OH Azul-Rojo
Malvidina (Mv) OH OH OH OH OMe OMe Azul-Rojo
Apigeninidina (Ap) H OH OH OH H H Naranja
Luteolinidina (Lt) H OH OH OH OH H Naranja
Tricetinidina (Tr) H OH OH OH OH OH Rojo
Aurantinidina (Au) OH OH H OH H H Naranja
6-hidroxi-Cy (6OHCy) OH OH H OH OH H Rojo
6-hidroxi-Dp (6OHDp) OH OH H OH OH OH Azul-Rojo
Rosinidina (Rs) OH OH OH OMe OMe H Rojo
Hirsutidina (Hs) OH OH OH OMe OMe OMe Azul-Rojo
5-metil-Cy (5MCy) OH OMe OH OH OH H Naranja Rojo
Pulchelidina (Pl) OH OMe OH OH OH OH Azul-Rojo
Europinidina (Eu) OH OMe OH OH OMe OH Azul-Rojo
Capensinidina (Cp) OH OMe OH OH OMe OMe Azul-Rojo
1(Jackman y Smith, 1996)
Paradójicamente, la mayoría de las antocianinas, se tornan en compuestos incoloros
cuando se extraen de su medio natural y se disuelven en una solución acuosa de acidez
comparable. De hecho, el ion flavilio, que proporciona la principal forma coloreada de las
antocianinas, sufre un ataque nucleofílico en las posiciones 2 y 4 (Ver Tabla 1.1) por parte del
agua y se convierte de forma reversible en un hemiacetal incoloro, de acuerdo a una reacción
química conocida como hidratación del ion flavilio (Escribano-Bailón y Brouillard, 1996).
Las antocianinas se hallan en las vacuolas como un equilibrio de cuatro especies
moleculares (Figura 1.1). La estructura primaria de todas las antocianinas, la cual es pH
dependiente, es el catión flavilio, del cual derivan las estructuras secundarias, ya sea por
transferencia de protones para producir las azuladas bases quinoidales y sus correspondientes
bases quinoidales ionizadas, ó por hidratación para formar pseudobases carbinol incoloras, las
cuales se pueden tautomerizar a pseudobases chalconas incoloras (Bridle y Timberlake, 1996).
R5
 R7
R3
R5’
R3’
OH
6’
5’
4’
3’
2’
2
3
4
6
7
8
5
1
+ 1’
 R6
+
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
3
Las estructuras terciarias resultan de asociaciones moleculares de estructuras primaria
y secundaria, ya sea consigo mismas (auto-asociación) ó con otras moléculas en solución
(copigmentación intermolecular). La estructura cuaternaria resulta de lo efectos del medio
(disolvente) en el color de cualquiera de las estructuras previamente descritas, esto es de
particular importancia sobretodo en las propiedades de las bebidas alcohólicas (Bridle y
Timberlake, 1996).
Se conocen varios cientos de antocianinas, las cuales difieren principalmente en el
esqueleto básico de la antocianidina (el número y posición de los grupos hidroxilo y metoxilo);
la identidad, número y posición en que se encuentra unido el ó los azúcares al esqueleto
principal; y el grado de acilación del azúcar y la identidad del agente acilante (Clifford, 2000).
Las clases mas comunes de glicósidos son los 3-monósidos, 3-biósidos, y 3-triósidos, así
como 3,5-diglicósidos, y más raramente los 3,7-diglicósidos (Strack y Wray, 1989). El residuo
glicósido encontrado más comúnmente es la glucosa, aunque un gran número de diferentes
monosacáridos (ramnosa, galactosa, xilosa, arabinosa, o fructosa), disacáridos (principalmente
rutinosa, sambubiosa, o soforosa, lathyrosa, gentobiosa o laminariobiosa con menor
frecuencia), o trisacáridos (homo- ó heteroglicanos) pueden encontrarse entre los residuos de
azúcares (Jackman y Smith, 1996).
Los residuos de azúcares adheridos a las antocianinas, se hallan con frecuencia,
acilados con ácidos aromáticos, como el p-cumárico, caféico, ferúlico, sinápico, gálico ó p-
Figura 1.1 Equilibrio de antocianinas. (A) catión
flavilio; (B) base quinoidal; (C) pseudobase carbinol;
(D) chalcona (Iversen, 1996).
CA
B D
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
4
hidroxibenzoico, y/o ácidos alifáticos como malónico, acético, málico, succínico, ú oxálico
(Jackman y Smith, 1996).
1.1. 2 Importancia y Ocurrencia en la Naturaleza
Las antocianinas juegan un papel definitivo como factores de polinización, coloración
de flores y frutos para atraer insectos, aves y animales vectores, por lo cual asisten la
reproducción en plantas. Sin embargo la función de las antocianinas y otros compuestos, como
las betalaínas, en tejidos vegetales no está bien definida. Su acumulación en tejidos dañados y
heridas de la planta que las sintetizan sugiere que funcionan como fitoalexinas, esto significa
que ayudan en la defensa en contra de infecciones virales y microbianas. Cuando se
encuentran asociados a las proteínas, estos pigmentos funcionan como fotorreceptores de luz
verde. Además debido a que su mayor pico de absorción está entre 465-560 nm, cuando se
encuentran en grandes concentraciones, pueden actuar como filtros de luz verde y por lo tanto
contrarrestar la represión del crecimiento en las plantas, que se ha reportado es inducida por la
luz verde. Debido a que estos pigmentos también absorben intensamente la luz UV, se sugiere
que juegan un papel protector contra los efectos adversos de la luz UV (Jackman y Smith,
1996).
Las principales fuentes alimenticias de antocianinas pertenecen a las familias Vitaceae
(uva) y Rosaceae (cereza, ciruela, frambuesa, fresa, zarzamora, manzana y durazno). Otras
familias que contienen plantas comestibles pigmentadas con antocianinas incluyen las
Solanaceae (tamarillo, berenjena), Saxifragaceae (grosella roja y negra), Ericaceae
(arándanos, mora azul) y Cruciferae (col roja). Las antocianinas que se hallan con mayor
frecuencia tienen como núcleo principal, la cianidina, seguida de pelargonidina, peonidina y
delfinidina, luego por petunidina y malvidina. Los 3-glicósidos ocurren aproximadamente dos y
media veces con mas frecuencia que los 3,5-diglicósidos, siendo la mas frecuente la cianidina
3-glucósido (Jackman y Smith, 1996).
La pelargonidina-3-glucósido, la cual es la principal antocianina presente en las fresas
(Fragaria anannassa), es la responsable del atractivo color rojo brillante de esta fruta. En
algunos cultivares de origen español, comúnmente se halla presente en pequeñas cantidades
la cianidina-3-glucósido además de la pelargonidina-3-rutinósido (García-Viguera, et al., 1996).
Bakker (1992) reporta la presencia de antocianinas de fresa de las cuales el 79%
corresponden a pelargonidina 3-glucósido y 5% de cianidina 3-glucósido, además de otros
cinco compuestoscoloreados de los cuales cinco fueron identificados como derivados de
pelargonidina, en cantidades de 0.5 a 5 % (Bakker et al., 1992). Numerosos autores han
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
5
demostrado que la segunda antocianina presente en las fresas es la cianidina 3-glucósido.
Sondheimer y Kertesz (1956) reportaron la presencia dos pigmentos en una proporción de 1:1
en fresas salvajes, y de 20:1 en fresas cultivadas. Las cantidades relativas de estos pigmentos,
tienen diversos efectos en el color. La cianidina 3-glucósido en solución 0.01 % HCl en metanol
absorbe a 527 nm y tiene un color rojo, mientras que la pelargonidina 3-glucósido tiene una
absorción a 510 nm y es naranja-roja, las diferencias en la proporción de estos pigmentos
puede provocar diferencias en mediciones de color instrumental (Wrolstad et al., 1970).
1.1.3 Análisis de Antocianinas por Cromatografía de Líquidos de Alta
Resolución
En años recientes, la Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC), ha
surgido como herramienta extremadamente poderosa para la cuantificación de fenólicos y
antocianinas de diversas fuentes. Cuando se dispone de un detector de arreglo de fotodiodos
(PDA), es posible la identificación de los picos así como el establecimiento de la pureza de los
mismos por medio del análisis del espectro UV-Visible completo de cada pico (Parley, 2001). El
análisis de antocianinas por HPLC se realiza empleando columnas para cromatografía de fase
reversa, donde la fase estacionaria es usualmente un polímero de C18 enlazado a un soporte
de sílice, o recientemente soportes poliméricos que son estables sobre un amplio rango de pH
(Hong y Wrolstad, 1990). El pequeño tamaño de partícula de alrededor de 4-5 µm del
empacado asegura un alto número de platos teóricos, y por lo tanto una buena eficiencia y
resolución. La fase móvil es usualmente un gradiente de soluciones basadas, en agua, un
ácido y un modificador orgánico. El tipo más común de modificadores orgánicos es el metanol
o el acetonitrilo. La acidificación es necesaria para prevenir la ionización de los grupos ácidos
de los compuestos fenólicos, y en el caso de las antocianinas, el pH debe ser bajo para evitar
lo mas posible la interferencia de las antocianinas con estructuras diferentes a la forma del ion
flavilio. Los ácidos más comúnmente empleados son fosfórico, acético, perclórico y fórmico
(Parley, 2001).
La detección de las antocianinas ocurre a los 520 nm, debido a que todas las formas
del ion flavilio tienen un máximo en la vecindad de ese valor, y no hay interferencia de muchos
otros compuestos a esa longitud de onda. En la mayoría de los casos, la única preparación que
se necesita previa a la inyección y al análisis por HPLC, es una etapa de concentración de los
analitos de interés por medio de columnas de micro-extracción en fase sólida, además de la
filtración a través de filtros de 0.45µm. Se pueden obtener importantes propiedades
estructurales a partir del análisis de los datos espectrales de las antocianinas, obtenidos por
HPLC, incluyendo la naturaleza de la aglicona (antocianidina), la posición de enlace de la
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
6
molécula de azúcar, e información referente a la acilación por ácidos aromáticos. Típicamente
el espectro de las antocianinas, así como de otros flavonoides se obtienen en metanol con un
0.01% de HCl. Debido a que las características espectrales de las antocianinas son
dependientes tanto del pH como de la naturaleza del disolvente, la comparación directa de las
propiedades espectrales con aquellas publicadas en la literatura puede resultar inapropiada
cuando se trabaja con solventes distintos o en otros valores de pH (Hong y Wrolstad, 1990).
Tabla 1.2. Características estructurales y espectrales de las antocianidinas en función de su
patrón de hidroxilación.
Sustituyentes
Aglicona
R1 R2
Espectro visible
λmax. (nm)
Pelargonidina H H 494 (naranja)
Cianidina OH H 506 (naranja-rojo)
Delfinidina OH OH 508 (azulado-rojo)
Peonidina OMe H 506 (naranja-rojo)
Petunidina OMe OH 508 (azulado- rojo)
Malvidina OMe OMe 510 (azulado-rojo)
1(Jackman y Smith, 1996)
En soluciones metanólicas las soluciones de pelargonidina-3-glucósido exhiben una
longitud de onda de máxima absorbancia (λmax) alrededor de 505 nm, la cianidina y peonidina-
3-glucósidos tienen una λmax 520-526 nm, y los derivados de la delfinidina muestran una λmax a
532-537 nm. La longitud de onda de máxima absorbancia esta muy relacionada al patrón de
hidroxilación de la antocianidina, como se puede ver en la Tabla 1.2. Se ha reportado en
bibliografía, información contradictoria respecto al efecto que tiene la naturaleza de la
sustitución de azúcar. Según Guisti, et al., (1999), las características espectrales de las
antocianinas se ven modificadas por el efecto que surte el solvente en el que se encuentran y
la naturaleza de la glicosilación. Estos autores han reportado como una característica general
que un incremento en el número de sustituciones es acompañado por un incremento en la
absortividad molar del catión flavilio cuando se compara con sus similares mono y diglicósidos.
Harborne (1998) reporta que la naturaleza de las sustituciones en la estructura de las
antocianinas (glicosilaciones y acilaciones), impactan en los tiempos de retención y en la
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
7
hidrofobicidad de la molécula. De acuerdo con Hong y Wrolstad (1990), las moléculas análogas
eluirán en un sistema cromatográfico en el siguiente orden (en términos de retención
cromatográfica en HPLC de fase reversa), galactósido, más rápido que glucósido, éste a su
vez mas rápido que arabinósido.
El sistema de solventes empleado para el aislamiento de las antocianinas ejerce su
influencia sobre la estructura cuaternaria de la molécula, y se cree que tienen un gran impacto
en el color de las estructuras primaria, secundaria ó terciaria. (Dangles y Brouillard, 1993). Este
efecto del solvente es dependiente de la estructura química del pigmento. Los pigmentos no
acilados muestran los mayores efectos en sus características espectrales con un drástico
cambio no solo en la dimensión de su absortividad molar, sino también un marcado cambio en
la λmax. Un ejemplo es el metanol, el cual provoca cambios batocrómicos de alrededor de 10
nm en la λmax cuando se compara con el mismo pigmento en solución buffer (Guisti, et al.,
1999).
La presencia de grupos acilo unidos a los residuos azúcares, como los ácidos
cinámicos, provocan desplazamiento en la longitud de onda de máxima absorbancia de los
pigmentos, con un ligero corrimiento hacia el azul (Jackman y Smith, 1996; Dangles et al.,
1993; Harborne, 1967). Los fenoles simples y los ácidos fenólicos tienen una o dos bandas
fuertes entre 230 y 290 nm, mientras que los ácidos hidroxicinámicos muestran un máximo
distintivo a 310 y 332 nm (Strack y Wray, 1989).
Hay dos usos importantes de la espectroscopía en la identificación estructural de las
antocianinas, uno es para la determinación estructural de la posición de los azúcares, y otro es
la investigación de la posible presencia de acilos aromáticos. Para la estimación del primero de
estos factores, se emplea la relación de absorbancia a 440 nm entre la absorbancia de la
muestra a la λmax: %=(A440/Avis-max)*100. Los porcentajes obtenidos son específicos para cada
tipo de sustitución en cada antocianina, permitiendo identificar entre una sustitución en la
posición 3 y una disustitución 3,5 para una misma antocianidina. La presencia de una acilación
en las antocianinas se puede reconocer por la presencia de la banda de absorción
característica de los ácidos hidroxicinámicos entre 310 y 330 nm. Mediante la razón de
absorbancias entre esta banda de absorción y la banda máxima, se obtiene información de la
razón molar de antocianina:ácido hidroxicinámico, con valores de 50-60 % y 90-100 % para
razones 1:1 y 1:2 respectivamente (Strack y Wray, 1989).
NUTRACÉUTICOSY ALIMENTOS FUNCIONALES
8
1.1.4 Factores que Afectan su Estabilidad
La principal desventaja para el uso de antocianinas como colorantes para alimentos es
su baja estabilidad. De hecho la estabilidad del color de las antocianinas depende de la
combinación de varios factores, entre ellos la estructura y concentración de las antocianinas,
pH, temperatura, presencia de agentes acomplejantes (fenoles, iones metálicos), oxígeno, luz,
enzimas, interacción con componentes del alimento, etc. (Markakis, 1982; Malien-Aubert, et al.
2001; Jackman y Smith, 1996).
1.1.4.1 pH.
La presencia del ion oxonio adyacente al C2 de las antocianinas le da su característica
naturaleza anfotérica. Como se menciona anteriormente, las antocianinas existen como un
equilibrio de cuatro formas moleculares, las cuales se interconvierten por ganancia o pérdida
de un protón (Figura 1.1). Por lo cual las antocianinas se comportan como indicadores de
acidez, y existen como ácidos o como bases, en función del pH. El efecto global del pH en las
antocianinas se ilustra en la Figura 1.2 (Clifford, 2000).
En medios altamente ácidos (pH<2) el rojo catión flavilio es esencialmente la única
especie de antocianina presente. Con el incremento en el pH el ion flavilio se transforma en
base quinoidal por la rápida pérdida de un protón. En valores de pH de alrededor de 3 a 6, la
adición nucleofílica de agua a la posición C-2 del catión flavilio lentamente conduce a la
formación de un hemiacetal incoloro ó pseudobase. Con el incremento en el pH, los extractos
de antocianinas se transforman al punto en el que pueden parecer incoloros, antes de cambiar
por último a color azul o púrpura en pH>6 (Jackman y Smith, 1996).
Figura 1.2 Efecto generalizado del pH en el
equilibrio de las antocianinas (Clifford, 2000).
 
 
Estómago Humano 
pH de 2 a 5 
 Pseudobase Incolora 
PH de sangre humana approx 7 
Intestino delgado pH 7.5-8.0 Catión Flavilio 
Chalcona Incolora 
Base Quinoidal Azul 
P
o
rc
e
n
ta
je
 d
e
 A
n
to
c
ia
n
in
a
s
 T
o
ta
le
s
 
pH 
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
9
1.1.4.2 Temperatura
La relativamente rápida deterioración del atractivo color rojo en conservas de fresas
frescas, ha sido un problema persistente en la industria del procesado de este alimento a
través de los años. Kertesz y Sondheimer (1948) estudiaron las relaciones tiempo-temperatura
en la deterioración del color, y determinaron que 65ºF (19ºC) como la temperatura crítica, por
encima de la cual ocurría una acelerada pérdida del color rojo y un subsiguiente
obscurecimiento (Jackman y Smith, 1996).
En general, los factores que mejoran la estabilidad al pH (metoxilación, glicosilación y/o
sustituyentes acilo), también conducen a una mayor estabilidad térmica. La desprotonación del
catión flavilio por el solvente es de carácter exotérmica, mientras que la hidratación del catión y
la apertura del anillo de pirilio son ambos procesos endotérmicos. Por lo tanto, la formación de
chalconas esta favorecida por el incremento de la temperatura (durante el almacenamiento y el
procesado) a expensas de las formas quinoidal, hemiacetal y el ion flavilio (Jackman y Smith,
1996).
Con pocas excepciones, la degradación de las antocianinas sigue una cinética de
primer orden, el mecanismo de esta degradación es termo-dependiente. Se han reportado
energías de activación y valores z de alrededor de 70 kJ/mol y 25ºC, respectivamente, a
temperaturas de almacenamiento (<40ºC), y a temperaturas de proceso (<70ºC) valores de Ea
de 95 a 113 kJ/mol y valores z de alrededor de 28ºC. El valor z es el cambio de temperatura
requerido para producir un cambio en el tiempo de destrucción térmica por un factor de diez y
refleja la dependencia de la destrucción térmica con la temperatura. La concentración de
pigmentos poliméricos se ha demostrado que se incrementan con al temperatura y el tiempo
de almacenamiento, como en el caso de los jugos y vinos, y contribuyen a su coloración.
Algunos autores han sugerido tiempos de proceso cortos con alta temperatura para alcanzar
una máxima retención de pigmentos y evitar una degradación significativa de las antocianinas
y/o transformación a productos incoloros como las chalconas (Jackman y Smith, 1996).
1.1.4.3 Oxígeno y Ácido Ascórbico
Desde hace tiempo es conocido que las antocianinas y el ácido ascórbico (vitamina C)
son mutuamente destructivos en presencia del oxígeno. Las condiciones que favorecen la
oxidación del ácido ascórbico en un jugo de fresa, se ha encontrado que causan la máxima
pérdida de antocianinas (Sondheimer y Kertesz, 1953). Se ha reportado un efecto sinérgico
entre el oxígeno y el ácido ascórbico en la degradación de los pigmentos (Bakker et al., 1992).
Esta degradación mutua no es inesperada, ya que la vitamina C se ve considerablemente
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
10
afectada durante el procesado, debido a su tendencia a reaccionar con el oxígeno para formar
ácido dehidroascórbico y otros productos (Garzón y Wrolstad, 2002). Muchos de los estudios
son realizados a altas temperaturas (90, 88 y 38ºC) y los productos de la degradación del ácido
ascórbico como el peróxido de hidrógeno y el hidroximetilfurfural, parecen ser los principales
contribuyentes a este efecto degradador de antocianinas (Wrolstad, et al., 1970).
Bajo condiciones aeróbicas, la adición de metales de transición como el cobre,
aceleran la destrucción mutua del ácido ascórbico y las antocianinas; se cree que la causa de
ello es la formación de peróxido de hidrógeno producido por el rompimiento del ácido ascórbico
catalizado por los iones cobre (Timberlake, 1960a,b). La presencia de productos de ruptura en
sistemas decolorados muestra, según Iacubucci y Sweeny (1983), que el blanqueado de las
antocianinas por el ácido ascórbico ocurre por rompimiento oxidativo del anillo de pirilio. Estos
resultados divergen de aquellos publicados por Poei-Langston y Wrolstad (1981), estos autores
notaron que el color característico de las antocianinas se pierde más rápidamente en sistemas
libres de oxígeno (con nitrógeno) que bajo condiciones de oxigenación, favoreciendo un
mecanismo de condensación directa entre la antocianina con el ácido ascórbico para explicar
la pérdida de color observada.
El ion flavilio del núcleo de las antocianinas es deficiente de electrones, por lo tanto es
altamente reactivo, inestable y susceptible al ataque de agentes nucleofílicos. La distribución
de carga del ion flavilio indica que es más susceptible al ataque nucleofílico en la posiciones 2
y 4. Timberlake y Bridle (1968) estudiaron los posibles efectos estéricos en la estabilidad del
color en estudios sobre las sales del ion flavilio, demostrando que la sustitución en la posición 4
era un factor clave en la resistencia de las antocianinas al blanqueado por el dióxido de azufre.
Jurd (1972) postuló una reacción de condensación basado en el conocimiento de que las sales
de flavilio pueden condensarse con diversos compuestos conduciendo a la pérdida de la
pigmentación; entre ellos la dicetona dimedona, la cual es estructuralmente similar al ácido
ascórbico, por lo que sugirió un mecanismo similar. El autor concluyó que el ácido ascórbico se
podía condensar en la posición 4 del núcleo del ion flavilio, de manera análoga a la reacción
con el ion bisulfito.
Los resultados publicados por García-Viguera y Bridle (1999) sin embargo, dan
evidencias de que el mecanismo de condensación sugerido es poco probable de llevarse a
cabo por diversas razones, entre ellas que la pérdida de color es lenta, en lugar de ser una
reacción instantánea como ocurre con el SO2, adicionalmente y el color no regresa
inmediatamente con al acidificación, por otro lado No se observaron por HPLC nuevos
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
11
compuestos formados, debido a que no hubo cambios en λmax que indicaran lo contrario, y el
ácido ascórbico posee efecto degradador sobre el ion flavilio incluso cuando laposición 4 se
encuentra sustituida. Por lo tanto parece ser que ésta degradación es más probable que ocurra
por el mecanismo de radicales libres que por condensación directa en la posición 4. Se ha
comprobado que las antocianinas tienen capacidad de absorber radicales libres, lo cual les
confiere poder como antioxidantes (Wang, et al., 1997), esto nos conduce a soportar la teoría
de la reacción de oxidación, en la que el ácido ascórbico actúa como un activador del oxígeno
molecular, produciendo radicales libres, los cuales rompen el anillo de pirilio, como lo
postularon originalmente Iacobucci y Sweeny (1983).
1.1.4.4 Enzimas
Se han identificado diversas enzimas involucradas en la degradación de antocianinas y
en la correspondiente pérdida del color. La mayoría de estas enzimas son endógenas en
muchos tejidos vegetales. Estas enzimas se han llamado genéricamente ‘antocianasas’, pero
basados en sus distintas actividades, se han identificado dos grupos principales, las
glicosidasas, las cuales hidrolizan los enlaces glicosídicos de las antocianinas para producir
azúcares libres y agliconas, la inestabilidad de éstas últimas, resulta en su degradación
espontánea, vía la formación de chalconas incoloras; y las polifenoloxidasas (PPO), las cuales
actúan sobre las antocianinas en presencia de o-difenoles vía un mecanismo de oxidación
acoplado (Jackman y Smith, 1996).
El procesado de frutas frescas, viene acompañado siempre por un consecuente
rompimiento celular y estrés por daño a los tejidos. La actividad de muchas enzimas se
incrementa como una consecuencia del incremento en la permeabilidad que resulta de la
disrupción de tejidos y el mezclado de enzimas y sustratos, que en tejidos intactos, se
encontrarían secuestrados en vacuolas y otros compartimentos celulares (Lamikanra y
Watson, 2001). La enzima polifenoloxidasa, es dependiente de la presencia de iones cobre y
está ampliamente distribuida en plantas, y puede catalizar varias reacciones: entre ellas la
hidroxilación de monofenoles a o-difenoles (actividad cresolasa), la oxidación de o-difenoles a
o-quinonas (actividad catecolasa) y la oxidación de monofenoles a o-quinonas. Las quinonas
formadas pueden polimerizarse para formar pigmentos cafés, los cuales causan decoloración
en muchas frutas y vegetales durante las operaciones de poscosecha. Este oscurecimiento
enzimático afecta la aceptabilidad y es una de las principales causas de la disminución de la
calidad. En muchas frutas, incluida la fresa, la actividad de PPO es responsable de la pérdida
de color rojo, debido a la degradación de antocianinas (Serradell, et al., 2000).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
12
La degradación de antocianinas no o-difenólicas en presencia de sustratos o-
difenólicos y PPO ha sido estudiada con anterioridad por varios autores. La degradación de
antocianinas no o-difenólicas ha sido establecida como un mecanismo en dos etapas, que
involucran primero la oxidación enzimática de los sustratos o-difenólicos en sus
correspondientes o-quinonas, seguido de la reacción de estas quinonas con las antocianinas.
(Kader, et al., 1999). Wesche-Ebeling y Montgomery (1990) estudiaron la degradación de
pelargonidina 3-glucósido por PPO de fresas. En sistemas modelo con pelargonidina 3-
glucósido, la PPO muestra una ligera pérdida de pigmento (5%), pero en presencia de
catequina, la pérdida fue de un 50% después de 24 horas (Kader, et al., 1999). Ellos sugieren
que las quinonas y los productos intermediarios de reacción formados como resultado de la
acción de la actividad de polifenoloxidasa, son suficientes para iniciar las reacciones de
oxidación y polimerización que conducen a la pérdida de las antocianinas (Bakker, et al., 1992;
Wesche-Ebeling y Montgomery, 1990). Los autores propusieron un mecanismo de degradación
por incorporación de las antocianinas en productos de la reacción de condensación entre
catequina y fenoles. De acuerdo a estos autores, este mecanismo se lleva a cabo con
antocianinas o-difenólicas, tales como los derivados de la cianidina (Kader, et al., 1999).
1.1.4.5 Iones Metálicos
En los sistemas vivos, las antocianinas se encuentran asociadas con otros
compuestos, como iones metálicos, flavonoides (glicosilados y/o acilados) y quizá con
polisacáridos macromoleculares. Todas estas asociaciones afectan el espectro de absorción
de las antocianinas involucradas, lo queda pie a muchos mecanismos que explican la gran
variedad de colores en las plantas (Elhabiri, et al. 1997).
A diferencia de los copigmentos polifenólicos, los iones metálicos, que pueden estar
presentes en el medio natural de las antocianinas son raramente relacionados con la
estabilización del color. Sin embargo, se ha reportado que iones metálicos pequeños altamente
cargados, como el Mg2+ y Al3+, pueden actuar como reforzadores de la interacción entre
pigmento-copigmento. En particular, se ha propuesto que el color azul desplegado por algunas
flores, es el resultado de la interacción pigmento-copigmento-ion metálico (Elhabiri, et al.
1997). Dangles, Elhabiri y Brouillard, (1994) reportaron el acomplejamiento de sales de
aluminio con antocianinas, proveyendo información respecto al mecanismo de
acomplejamiento que se lleva a cabo. Los análisis de 1H-RMN en CD3OD, han confirmado la
conversión de la forma roja del ion flavilio de la antocianina a la forma quinoidal de color azul
intenso, mediante el acomplejamiento con el ion Al3+ (Elhabiri, et al. 1997).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
13
Desde hace tiempo se conoce la reacción de los iones metálicos como el aluminio(III) y
el hierro(III) con el sistema flavilio, y ha sido empleada como prueba cualitativa para demostrar
la presencia de un grupo catecol en las antocianinas derivadas de plantas. La prueba se basa
en la observación de un cambio de color, o cambio batocrómico, en la λmax, con la adición de
iones aluminio(III) en la forma de AlCl3. A partir de cálculos moleculares, parece ser que para la
sal de cloruro de 3-deoxiflavilio, la densidad de carga en la posición C-3 del complejo flavilio-
Al3+ o flavilio-Ga3+ se correlaciona con la longitud de onda máxima de estos compuestos en
solución metanólica. Se deduce que la sustitución en la posición 3 es de gran importancia para
las antocianinas copigmentadas con iones metálicos (Elhabiri, et al. 1997).
1.1.4.6 Copigmentos
La copigmentación fue descrita por primera vez por Robinson y Robinson en 1931 y
estudiada posteriormente en sistemas modelo. Cuando un copigmento se agrega a una
solución acuosa ácida, produce un incremento en la intensidad de color debido a la formación
de agregados coloridos (Baranac, 1996). Es bien sabido hoy en día, que los polifenoles
incoloros (flavonas, flavonoles, ésteres de ácidos cinámicos y benzóicos, taninos) son capaces
de formar complejos empalmes moleculares no covalentes con los núcleos de ion flavilio,
planos y ricos en electrones π (Elhabiri, et al. 1997).
Las interacciones hidrofóbicas eficientemente protegen los cromóforos contra el ataque
nucleofílico del agua, desplazando al mismo tiempo el equilibrio total entre las formas coloridas
e incoloras, (Figura 1.1) hacia las formas coloridas y acomplejadas. Este fenómeno es
conocido como copigmentación y además puede operar de manera intramolecular en
antocianinas más complejas que poseen ácidos cinámicos o benzoicos en sus grupos
glicosídicos produciendo soluciones estables coloreadas a valores de pH ligeramente ácidos
(Elhabiri, et al. 1997). El equilibrio de copigmentación puede ser escrito como sigue:
Antocianinas libres + Copigmentos Antocianinas copigmentadas
Un incremento en la concentración de copigmentos conduce a la intensificación del
color, debido a que desplaza las formas incoloras de las antocianinas a favor de las formas
coloridas. Los copigmentos incluyen una gran variedad de compuestos estructuralmente
relacionados y no relacionados, como los flavonoides, fenólicos no flavonoides,aminoácidos y
ácidos orgánicos (Darias-Martín, 2001). Este efecto estabilizador se discutirá en detalle en
secciones posteriores.
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
14
1.2 FLAVONOIDES Y ÁCIDOS FENÓLICOS
En términos muy generales, un compuesto fenólico o polifenol, puede ser
químicamente definido como una sustancia que posee un anillo aromático conteniendo un
grupo hidroxilo, incluyendo sus derivados funcionales (ésteres, metil éteres, glicósidos, etc.).
Los fenólicos derivados de plantas, provienen biogenéticamente de dos rutas principales, la
ruta del shikimato, la cual directamente provee de fenilpropanoides, como los ácidos
hidroxicinámicos y las cumarinas; y la ruta del acetato-malonato, la cual produce fenoles
simples y también muchas quinonas (Harborne, 1989).
El grupo más importante de fenólicos son los flavonoides, y estos a su vez se
subdividen en varios grupos, como se indica en la Tabla 1.3. Los ácidos hidroxicinámicos se
distribuyen en grupos amplios de combinaciones, más que ningún otro grupo de polifenoles. El
ácido caféico por ejemplo, se puede hallar en asociación con ácidos carboxílicos derivados del
ciclohexano, azúcares, ácidos orgánicos, aminas, lípidos, y también unido a otros fenoles. El
flavonoide más comúnmente encontrado , el flavonol quercetina, se ha encontrado en 135
asociaciones diferentes. La mayoría de éstas son O-glicósidos, pero hay O-sulfatos, con
azúcares acilados con ácidos alifáticos o aromáticos (Harborne, 1989).
Una de las funciones indiscutibles de los flavonoides y fenólicos relacionados es su
función como agentes protectores de las plantas en contra de la invasión microbiana. Debido a
su amplia habilidad para inhibir la germinación de esporas de patógenos de plantas, se ha
propuesto su uso contra patógenos fúngicos en el hombre (Harborne, 1989).
1.2.1 Clasificación y Estructura Química
Las principales clases de polifenoles se definen de acuerdo a la naturaleza de su
esqueleto carbonado: ácidos fenólicos, flavonoides, y en menor medida, estilbenos y lignanos
(Figura 1.3) (Scalbert y Williamson, 2000). La química de los compuestos fenólicos es
complicada por el hecho de que la mayor parte de los compuestos que están presentes en
plantas, están en su forma conjugada, principalmente con un residuo de azúcar enlazado a
través de uno o más de los residuos fenólicos. Los monosacáridos asociados con los fenólicos
incluyen glucosa, galactosa, arabinosa, rhamnosa, xilosa, manosa, apiosa, alosa, ácido
glucurónico y galacturónico, y con la complejidad de que algunos de estos azúcares pueden
estar en su forma de di-, tri- o tetrasacáridos (Harborne, 1989).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
15
Tabla 1.3 Principales clases de flavonoides conocidos.1
Clase Número de Estructuras
Conocidas Propiedades biológicas
Antocianinas 256 Pigmentos de rojo al azul
Chalconas 197
Auronas 29
Pigmentos amarillos
Flavonas, flavonoles, y
sus O-glicósidos 1660
Copigmentos en flores;
protectores UV en las hojas
C-glicosilflavonoides 303
Flavanonas 319
Dihidrochalconas 71
Algunas tienen sabor amargo
Dihidroflavonoles 110
Con frecuencia presentes en
maderas
Flavanos, leucoantocianinas y
proantocianidinas 309
Sustancias Astringentes con
propiedades de taninos
Biflavonoides 134
Isoflavonoides 630 Estrogénicos y fungitóxicos
Neoflavonoides 70
Estructuras misceláneas 100
1(Harborne, 1989)
Los flavonoles, flavonas y flavanoles o catequinas, constituyen tres de las principales
subclases de flavonoides (Figura 1.4). Los flavonoles y las flavonas tienen una estructura
anular similar, con un doble enlace entre los carbonos 2 y 3. Las flavonas, opuestos a los
flavonoles, carecen de un grupo hidroxilo en la posición 3. Los principales flavonoles son la
quercetina (3,5,7,3’,4’-pentahidroxiflavona), kaempferol (3,5,7,4’-tetrahidroxiflavona), miricetina
(3,5,7,3’,4’,5’-hexahidroxiflavona), isorhamnetina (3,5,7,4’-tetrahidroxi-3’-metoxiflavona). Las
flavonas mas abundantes en las plantas son la luteolina (5,7,3’,4’-tetrahidroxiflavona) y
apigenina (5,7,4’-trihidroxiflavona) (Hollman y Arts, 2000).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
16
O
O
O
OH
OH
H
H OH
OH
H
OH
OH
OH
OH
OH
CH3
OH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
OH
OOH
OH
OH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OOH
OH O
OH
H
OCH 3
O
+
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
CH3OC
CO
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CO
CO
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
OC
O
O
O
O
O
O
OOH
OH
OH
OH
OH
OOH
OH
OH
OH
OH
OOH
OH
OH
OH
OH
resveratrol
(estilbeno)
enterodiol
(lignano)
ácido clorogénico
(ácido fenólico)
quercetina
(flavonol)
(+)-catequina
(flavanol)
genisteína
(isoflavona)
hesperetina
(flavanona)
cianidina
(antocianidina)
casuarictina
(elagitanino)
trimero de procianidina
(flavanol)
Figura 1.3 Estructuras químicas de las principales clases de polifenoles (Scalbert,
2000).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
17
La característica estructural que tienen los flavanoles, que es una característica en
común con las antocianinas, es la ausencia del grupo ceto en la posición 4 del anillo C (Figura
1.4). La falta de un doble enlace entre la posición 2 y 3, y la presencia de un grupo hidroxilo en
la posición 3, crea dos centros de asimetría. Los flavanoles con una configuración 2R, son los
que se encuentran mayoritariamente en la naturaleza. Los flavanoles que predominan son (+)-
catequina (2R,3S-3,5,7,3’,4’-pentahidroxiflavano), (–)-epicatequina (2R,3R-3,5,7,3’,4’-
pentahidroxiflavano), (+)-galocatequina (2R,3S-3,5,7,3’,4’,5’-hexahidroxiflavano) y
epigalocatequina (2R, 3R-3,5,7,3’,4’,5’-hexahidroxiflavano) y los correspondientes ésteres de
ácido gálico: galato de (–)-epicatequina y galato de (–)-epigalocatequina. En el pasado a este
tipo de compuestos, flavanoles, se les hacia referencia como flavan-3-oles o catequinas
(Hollman y Arts, 2000).
Los flavonoles y flavonas se encuentran usualmente en plantas unidos a azúcares
como O-glicósidos. Las flavonas pueden encontrarse como C-glicósidos. La forma glicosídica
Figura 1.4 Subclases de flavonoides. La clasificación está
basada en las diferencias en el anillo heterocíclico C
(Hollman y Arts, 2000).
O
OOH
OH
CH3
OH
CH3
O
OOH
OH
CH3
OH
CH3
OH
O
OH
OH
CH3
OH
CH3
OH
O
OOH
OH
CH3
OH
CH3
O
+
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
CH3
OH
CH3
O
Flavona Flavonol
Flavanona
Antocianidina
Flavanol
Isoflavona
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
18
es una característica general de los flavonoides, con excepción de los flavanoles, en donde
esta presentación es rara. La forma de aglicona de los flavonoles y flavonas no se halla
presente en plantas frescas, pero pueden encontrarse como resultado del procesado de los
alimentos. Los residuos de azúcar se pueden enlazar en varias posiciones de la estructura de
un flavonoide, sin embargo hay preferencia por la posición 3 (Hollman y Arts, 2000).
1.2.2 Ocurrencia de Flavonoides y Ácidos Fenólicos en el Tomillo
En muchas plantas, los principales flavonoides constituyentes, son las agliconas, como
la quercetina, miricetina, kaempferol y sus glicósidos (Zheng y Wang, 2001). Algunas especies
como el tomillo (Thymus vulgaris) y el romero (Rosmarinus officinalis) son conocidas por tener
alta capacidad antioxidante, y algunas flavonas metiladas fueron aisladas del tomillo como
antioxidantes. En el aceite esencial de tomillo, el timol y el cravacol fueron reconocidos como
los principales componentes que mostraron una alta actividad antioxidante y antimicrobiana
(Zheng y Wang, 2001). Zheng y Wang, (2001), reportan compuestos bifenilos, dímeros del
timol, y flavonoides aislados de tomillo, que mostraron actividad antioxidante tan fuerte como el
BHT. Además los autores reportan altos contenidos de ácido rosmarínico (91.8 mg/100g peso
fresco) y luteolina (39.5 mg/100g peso fresco) hallados en extractos de tomillo.
Varios autores han reportado el contenido de los flavonoides más abundantes en
tomillo, por su importancia como potentes antioxidantes.Entre los compuestos comúnmente
reportados se encuentran aquellos extraídos con soluciones acuosas reguladoras (Tabla 1.4).
Tabla 1.4 Compuestos fenólicos en Thymus vulgaris1
Compuesto Fenólico Concentración2
Ácido caféico 11.7 ± 1.04
Luteolina 39.5 ± 1.53
Ácido rosmarínico 91.8 ± 2.75
Hispidulina 20.8 ± 0.96
1(Zheng y Wang, 2001), 2 Expresado en mg/100g de peso fresco.
Existen reportes de tres flavonas alquiladas, las cuales tienen un residuo de ácido p-
hidroxibenzoico enlazado al C-8 de la apigenina, luteolina y diosmentina, estos fueron aislados
con los correspondientes derivados de quercetina y kaempferol de partes aéreas de Thymus
hirtus. Este es uno de los primeros reportes de sustitución a través de enlaces C-C (Harborne y
Williams, 1998).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
19
Los principales compuestos fenólicos reportados en extractos de Tomillo, aparecen en
la Tabla 1.4, sin embargo, se ha reportado también la presencia de algunos otros ácidos
fenólicos como el ácido clorogénico, ácido cinámico, ferúlico, gálico, vainíllico y p-
hidroxibenzoico. La presencia de estos compuestos es altamente dependiente de las
condiciones de crecimiento de la planta, así como la especie y variedad de Thymus sp. de la
que se trate (Duke, 2003).
1.2.3 Características Espectrales
La cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) en fase reversa (RPLC), es la
técnica más popular y confiable para el análisis de fenólicos. El perfil de elución es típico para
RPLC, esto es, los compuestos polares, (como los ácidos fenólicos) eluyen primero, seguidos
por aquellos de polaridad decreciente. Por lo anterior, se puede establecer un orden de elución
como sigue: ácidos fenólicos < ácidos cinámicos < flavonoides. Aunque pueden presentarse
empalmes entre miembros individuales de diferentes clases debido a la diversidad de
compuestos. El orden de elución de los flavonoides con similar patrón de sustitución se puede
establecer como flavanona-glicósido, seguido de flavonol y flavona glicósidos, seguidos por la
aglicona libre en el mismo orden. En ácidos cinámicos y fenólicos, la polaridad se incrementa
principalmente por los grupos hidroxilos en al posición 4, seguidos por aquellos en la posición 3
y en la posición 2. Los grupos metoxi y acrílicos reducen la polaridad y por lo tanto incrementan
los tiempos de retención (Robards, et al., 1999).
La detección es usualmente basada en la absorción en el rango ultravioleta, o en
menor medida a varias longitudes de onda del rango visible que son características de ciertas
clases de compuestos fenólicos. (Ver Tabla 1.5). La mayoría de los compuestos fenólicos
exhiben dos principales bandas de absorción; la Banda I en la región de 320±385 nm que
representa la absorción del anillo B y la Banda II en la región de 250±285 que representa la
absorción el anillo A (Robards, et al., 1999). Los cambios hacia la longitud de onda del rojo son
debidos a un incremento en el número de grupos hidroxilo, por ejemplo, 367 nm en kaempferol,
a 371 nm, en quercetina, y 374 nm en miricetina. Por esta razón la banda I en las flavonas es
usualmente a una longitud de onda mas corta, por 20 a 30 nm que en los flavonoles
equivalentes (Robards, et al., 1999).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
20
Tabla 1.5 Espectro de absorción de varias clases de compuestos polifenólicos (Robards, et al.,
1999).
Tipo de compuesto Banda UV II a Banda UV I a Visible a
Ácidos benzóicos 270-280
Ácidos cinámicos (290-300)b 305-330
Antocianinas 240-280 (315-325)c 450-560
Flavonoles 250-270 (300)b 350-380
Flavanoles 270-280
Coumarinas 220-230 310-350
Flavonas 250-270 330-350
Flavanonas, Flavanoles 270-295 (300-330)b
Chalconas 220-270 (300-320)b 340-370
Auronas 240-270 340-370
Isoflavonas 245-270 300-340
aEl solvente usual es metanol, excepto para antocianinas que es metanol-HCl. bHombro; cEn el caso de
acilación por ácidos cinámicos
1.2.4 Fraccionamiento de Extractos Fenólicos
En estudios recientes, Guillén, et al. (1997) reportaron un procedimiento de
fraccionamiento de fenólicos de interés enológico empleando dos cartuchos de extracción en
fase sólida, el primero de C18, seguido de una resina de intercambio aniónico. Esta estrategia
de separación les permitió la separación de compuestos cargados negativamente como ácidos
fenólicos, de aquellos compuestos neutros como aldehídos fenólicos y catequinas.
Seleccionando el pH del medio en el cual la muestra fue inyectada en la resina aniónica, en
función el pKa promedio de los ácidos fenólicos, los autores efectuaron la separación de los
compuestos fenólicos en las dos familias, neutros y cargados negativamente. Empleando un
pH de 6.5 se aseguraron que las especies ácidas se encontraran en la forma ionizada para
poder ser retenidas en la resina aniónica.
El fraccionamiento de compuestos fenólicos también se puede llevar a cabo mediante
el uso de solventes orgánicos, para la elución de polifenoles adsorbidos en cartuchos de C18.
Sin embargo la selectividad de dichos solventes no es suficiente para lograr una separación en
función de sus características químicas (Covarrubias, 2001).
1.2.5 Función como Sustratos de Polifenoloxidasa
Varias sustancias, como el ácido clorogénico, quercetina-5’sulfonato, morina, rutina,
quercetina, etc, han sido identificados como buenos copigmentos (B�kowska, et al., 2003). Sin
embargo se han identificado compuestos que actúan como sustratos de polifenoloxidasa,
principalmente ácidos fenólicos como ácido caféico, protocatecoico y clorogénico (Stauffer,
1999).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
21
La enzima polifenoloxidasa, es dependiente de la presencia de iones cobre como
cofactor además de oxígeno disuelto en el sistema; la reacción de oxidación puede ser
representada por la ecuación (1) de manera general.
 
OH
OH
 
O
O
 Catecol o-benzoquinona
Algunos compuestos fenólicos no intervienen directamente en el obscurecimiento
enzimático, pero pueden actuar como sinergistas o inhibidores de polifenoloxidasas. Se sabe
que el ácido p-coumárico es un inhibidor no competitivo de la PPO de manzana, y que cataliza
la degradación de ácido clorogénico (Shahidi y Naczk, 2003). Dincer y otros (2002) por otro
lado reportan el uso de 4-metilcatecol como el sustrato ideal para la PPO extraída de plantas.
Al parecer, este tipo de PPO tiene un sitio de unión con una alta afinidad por pequeños o-
difenoles como el catecol o el 4-metilcatecol y menor afinidad por o-difenoles voluminosos
como la epicatequina.
1.3 COPIGMENTACIÓN
1.3.1 Tipos de copigmentación
1.3.1.1 Autoasociación
Cuando la concentración de pigmentos es relativamente alta, las antocianinas mismas,
pueden actuar como copigmentos y participar en reacciones de auto-asociación. En estudios
sobre el equilibrio de las antocianinas en solución acuosa, se ha observado que no se sigue la
Ley de Lambert-Beer, excepto para soluciones muy diluídas. Asen et al. (1972) encontraron
que un incremento en la concentración de cianidina-3,5-diglucósido a pH 3.16 provocaba
incrementos no proporcionales en la absorbancia de la solución. Este efecto fue atribuido a la
auto-asociación de moléculas de antocianinas. Estudios subsecuentes de la auto-asociación
de malvidina-3-glucósido por RMN, mostraron que tanto la forma de ion flavilio como la forma
quinoidal, pueden formar apilamientos verticales con un giro en el sentido de las manecillas del
reloj, y se mantienen juntos gracias a interacciones electrostáticas e hidrofóbicas (Hoshino,
1992).
+ E –Cu2+ + ½O2 + E–2Cu
2+ + H2O Ec. (1)
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
22
1.3.1.2 Copigmentación Intramolecular
Estudios recientes sugieren que el acomplejamiento molecular de las antocianinas con
otros fenoles, denominados copigmentos es el responsable de la estabilización del color en las
plantas (Davies et al., 1993; Brouillard et al., 1989; Mazza y Brouillard, 1990).
La copigmentación consiste en el apilamientode moléculas de copigmento sobre el
núcleo plano de las formas coloridas de las antocianinas. De esta forma, el ataque nucleofílico
del agua en la posición 2 del núcleo de pirilio, que conduce a las formas incoloras de
hemiacetal y chalconas, es prevenido parcialmente (Figura 1.1) (Dangles y Amiot, 2001). La
copigmentación en un fenómeno ampliamente distribuido en la naturaleza y puede ocurrir en
productos derivados de frutas y verduras, como jugos y vinos. Este fenómeno se vuelve más
eficiente cuando el pigmento y el copigmento se encuentran unidos a través de un espaciador.
Tal es el caso de las antocianinas, en las que las glicosilaciones se encuentran aciladas
(frecuentemente en la posición 6-OH) por ácidos fenólicos. Dentro de estas moléculas
aciladas, la copigmentación consiste en un arreglo conformacional de los grupos acilo sobre el
núcleo del ion flavilio (copigmentación intramolecular) (Dangles et al., 1993).
Los residuos de azúcares unidos a las antocianinas pueden encontrarse acilados con
ácidos aromáticos como p-cumárico, caféico, ferúlico, gálico o por ácidos p-hidroxibenzoicos,
y/o por ácidos alifáticos como malónico, acético, málico, succínico, etc. También se han
reportado antocianinas que tienen dos o más grupos acilos, como la cianodelfinidina,
rubrocinearina, ternatinas y lobelinas, etc. (Jackman y Smith, 1996). Esta acilación posee un
efecto estabilizante en las antocianinas, a través de la copigmentación intramolecular, esto es
a través del apilamiento tipo sándwich de los grupos acilo, con el anillo de pirilio de la molécula
de antocianina y este efecto es más aparente para el caso de las moléculas con acilos
aromáticos. Hay que mencionar que las antocianinas monoaciladas, por lo general no
presentan el efecto estabilizador de las antocianinas di, tri o poliaciladas, indicando que al
menos dos grupos acilo son necesarios para una buena estabilidad y retención de color en
medios ligeramente ácidos ó neutros (Jackman y Smith, 1996). Las antocianinas aciladas, son
particularmente prometedoras como colorantes de alimentos, debido a su gran estabilidad de
color en el rango de pH de 4-5, donde las antocianinas no aciladas son casi incoloras. En la
industria de alimentos, algunas fuentes comunes de estas antocianinas son Tradescantia
pallida, Zebrina pendula, zanahoria morada y col roja (Dangles y Amiot, 2001).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
23
1.3.1.3 Copigmentación Intermolecular
La adición de compuestos no coloreados (copigmentos), en soluciones de antocianinas
ligeramente ácidas, produce un incremento en la longitud de onda de máxima absorbancia
(λmax), conocido como cambio batocrómico, y un incremento en la absorbancia en el espectro
visible, llamado cambio hipercrómico, por un mecanismo análogo a la autoasociación. La
magnitud del efecto del copigmento en tales soluciones es dependiente de la estructura así
como de la cantidad de antocianina y molécula de copigmento presente, del pH, la
temperatura, y la composición de la solución empleada como solvente (Mazza & Brouillard,
1990).
Estas modificaciones en las propiedades espectrales probablemente apuntan al hecho
de que la molécula de copigmento interactúa con al antocianina en su primer estado excitado
(transiciones electrónicas en el rango visible) mas fuertemente que con su estado basal (Alluis
et al., 2000).
Robinson y Robinson (1931) describieron por primera vez la copigmentación
intermolecular con diferentes compuestos, y su capacidad de copigmentar soluciones de
malvidina 3-glucósido. Los tipos de moléculas que pueden actuar como copigmentos exógenos
para antocianinas incluyen flavonoles, flavan-3-oles, ácidos fenólicos, alcaloides, aminoácidos,
y en el caso de la auto-asociación, las antocianinas (Asen, 1972). Los mejores copigmentos
encontrados son por mucho, los flavonoles, sin embargo el principal prerrequisito de un
copigmento es que contenga un anillo plano rico en electrones π, lo cual permite un
solapamiento π-π con el anillo de pirilio del ion flavilio (Brouillard y Dangles 1994).
La concentración de ambos, las antocianinas, y las moléculas de copigmento,
influencian la magnitud del efecto de la copigmentación (Mazza y Brouillard, 1990). Al
incrementar al concentración de antocianinas, se incrementa la absorbancia así como el
cambio batocrómico. Sin embargo, la magnitud del incremento en la absorbancia es
dependiente de la proporción copigmento:pigmento para una determinada antocianina. El
incremento en esta proporción, también incrementa la magnitud de los cambios hipercrómicos
y batocrómicos (Covarrubias 2001, Del Follo, 2003).
En estudios sobre antocianinas de uva muscadina Talcott, y otros (2003) demuestran
la dependencia de los cambios hipercrómicos y batocrómicos con la concentración de
compuestos fenólicos provenientes de extractos acuosos de romero (Rosmarinus officinalis).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
24
En su estudio, el color de los jugos de uva muscadina se incrementa en un 120% con la
adición de dichos extractos.
1.3.1.4 Copigmentación con iones metálicos
La cianidina, la cual posee dos grupos hidroxilo adyacentes, tiene la propiedad de
acomplejar metales como el aluminio en solución metanólica acidificada, lo que provoca una
modificación en el máximo de absorción a 567 nm mientras que la pelargonidina 3-glucósido
no es afectada, debido a la ausencia de hidroxilos en posición orto (Wrolstad et al., 1970).
Se ha estudiado con anterioridad el papel que juega el ácido cítrico, que es el principal
ácido orgánico presente en las fresas, y se sabe que preferentemente reacciona con iones
metálicos, dejándolos no disponibles para el acomplejamiento previamente descrito. Jurd y
Asen (1966) estudiaron la copigmentación de cianidina 3-glucósido con quercetina, ácido
clorogénico y metil-galato, y hallaron que la presencia de sales metálicas era esencial para al
formación del copigmento en soluciones acuosas. El ácido cítrico, al estar acomplejado con el
metal, impide la formación del complejo copigmento-metal-antocianina, responsable de un
indeseable corrimiento hacia el azul de algunas variedades de fresas congeladas. Aunque el
ácido cítrico es el principal ácido presente en la fresas, también se encuentran el málico,
shikímico, succínico, glicérico, glicólico y aspártico. La magnitud de dicho efecto depende del
tipo de ácido orgánico presente (Wrolstad et al., 1970).
1.3.2 Uso de extractos fenólicos como estabilizadores de antocianinas
En ausencia de mecanismos estabilizadores de color, las formas coloridas de las
antocianinas, se hallan en menor proporción en soluciones acuosas ligeramente ácidas. Como
una consecuencia de esto, se deduce que la gran variedad de colores naturalmente
expresados por las antocianinas, debe ser estrictamente controlado por la copigmentación y el
acomplejamiento metálico (para el caso de las antocianinas con un grupo 1,2-dihidroxibenceno
en el anillo B) (Dangles y Amiot, 2001). Es sabido desde hace tiempo que los flavonoides están
comúnmente asociados con las antocianinas en las plantas, por lo que se ha sugerido el uso
de algunos de estos compuestos para mejorar la estabilidad de pigmentos como las
antocianinas en alimentos (Lenoble, 1999). Por ejemplo, se ha demostrado la eficacia de
extractos acuosos de romero (Rosmarinus officinalis), el cual es rico en flavonoides en la
estabilización del color proveniente de antocianinas (Covarrubias 2001; Del Follo, 2003;
Talcott, et al., 2003).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
25
La formación de complejos entre las antocianinas y los copigmentos en condiciones
ácidas, mejora las cualidades visuales y la estabilidad del color en los alimentos que los
contienen. La estabilidad de las antocianinas copigmentadas en presencia de ácido ascórbico
fue conocida recientemente, y actúa proporcionando un efecto quimoprotector durante el
procesado de los alimentos (Talcott, et al., 2003).
Del Follo (2003) reporta la copigmentación