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INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY DIVISIÓN DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y MARÍTIMAS PROGRAMA DE GRADUADOS ESTUDIO DEL POTENCIAL INHIBIDOR Y ALELOPÁTICO DE Helietta parvifolia (Gray) Benth. ESPECIE DEL MATORRAL SUBMONTANO DE NUEVO LEÓN, MÉXICO. Tesis presentada como requisito parcial para optar por el grado académico de Maestría en Ciencias con Especialidad en Parasitología Agrícola. Cecilia Beatriz Graue Wiechers Monterrey, N.L. 1981 INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY PROGRAMA DE GRADUADOS Diciembre de 1981 Sr. Director de la División de Ciencias Agropecuarias y Marí timas. Sr. Director del Programa de Graduados. Nos es grato recomendar la tesis elaborada bajo nuestra super, visión por I a BIOL. CECILIA BEATRÍZ GKAUE WIECHERS Intitulada: ESTUDIO DEL POTENCIAL INHIBIDOR Y ALELOPATICO DE Helietta parvifolia (Gray) Benth. ESPECIE DEL MATORRAL 5UBMONTANO DE NUEVO LEÓN, MÉXICO Se acepta como requisito parcial para optar el G r a d o Académi co de Maestría en Ciencias, Especialidad en Parasitología - - Agrícola. Los datos de esta tesis sólo se podrán publicar con permiso del Programa de Graduados en Agricultura. AGRADECIMIENTOS A la Biól. Magdalena Royalo: Agradezco especialmente su dirección, orientación, y con tinua motivación que hicieron posible la realización de- esta tesis. Al Dr. Dieter Enkerlin S.: Por su ayuda desinteresada en la realización de mis estu dios de Maestría en Ciencias. Al Dr. Xorge Domínguez: Por su colaboración al proporcionarnos algunos extractos de H.parvifolia. Al Biól. Gerónimo Cano: Por su ayuda en la identificación del material biológico y sugerencias en la investigación. Al Biól. Manuel Rojas Garcidueñas: Por sus sugerencias al trabajo de investigación. Al Ing. Luis Garza Blanc: Por su asesoría en el análisis estadístico de los datos. A Juan, con todo mi cariño y amor, A nuestro hijo Pedro. A mis Padres; Or. Enrique Graue Dfaz-González Virginia Wiechers de Graue. A mis hermanos: Virginia, Enrique, Federico, Regina y José. Í N D I C E Pági na RESUMEN * INTRODUCCIÓN - Objetivo de la tésis 1 - Generalidades sobre el tema . . . . 1) Definición 2 2) Naturaleza química de los compuestos alelopáti eos 4 3) Liberación al Medio de sustancias alelopáticas y c Í c I o . . . . 5 4) Factores que afectan la producción de sustancias alelopáticas 10 5) Mecanismos de acción de los compuestos al elopá ticos 11 Ó) El suelo y los alelopáticos 12 7) Papel de la alelopatía en las común i dades vege tales 14 a) Alelopatfa en la Agricultura 14 b) Papel de la alelopatía en Ecosistemas Natu- rales 17 - La alelopatía en I a dominancia 17 - Prevención del decaimiento de semillas an tes de la germinación 19 - Patrones de vegetación 20 - Al elopatía en la sucesión vegetal y en co munidades climax 21 - Alelopatía en Zonas Áridas 23 8) Alelopatfa en Microorganismos y Patología Vege tal . 24 Pág i na - Efectos alelopáticos sobre mi corrí zas y - otros microorganiSmOS 24 - Papel de la alelopatía en la Fitopatología 26 9) Aplicaciones de la Alelopatía en la Agricultu ra 27 - Descripción de la Comunidad de Matorral Submonta- no estudiada General idades 29 Descripción del área de estudio 31 Descripción de Hel ietta parvifoli a 32 METODOLOGÍA I.- Extractos utilizados A.- Extractos crudos 34 B. - Extractos acuosos 35 C - Agua de lluvia y concentrado clorofórmico de ésta 35 0.- Aceite esencial 36 E.- Sustancias volátiles 38 F.- Extractos obtenidos con solventes orgánicos . 38 II.- Pruebas de germinación A.- Semi I las 40 B.- Bioensayos 40 III.- Pruebas con microorganismos del suelo A.- Aislamiento 41 B.- Bioensayos 43 Pági no IV.- Análisis de la vegetación 44 RESULTADOS 1.- Bioensayos sobre germinación de semillas . . . . 45 2.- Bioensayos sobre hongos y bacterias 69 3 . - Análisis de la Vegetación 72 CONCLUSIONES 77 BIBLIOGRAFÍA 79 CURRICULUM VITAE 87 ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS Tabla Página 1 Resultados de las pruebas de germinación con los diferentes fracciones obtenidas de H.parvifoli a. 48 2 Resultados obtenidos en las pruebas de germina - cíón con el extracto clorofórmico de H.parvif o - lia 50 3 Resultados de las pruebas de germinación con los extractos crudos de H.parvífolia 53 4 Resultados de las pruebas de germinación con los aceites esenciales de H.parv i foli a 58 5 Resultados de las pruebas de germinación con el concentrado clorofórmico de agua de lluvia de Hm parvifolia . 63 6 ResuItados de I as pruebas de germinación con I as sustancias volátiles de H.parvifoia 66 7 Resultados de las pruebas de germinación' con el extracto acuoso de H.parv i fo I i a 68 8 Cree i m i ento de hongos de I sueI o de f Matorra i Sub montano de Villa de Santiago, N . L . con dos ex tractos de H.parvifolia . 74 9 Crecimiento de bacterias del suelo del Matorral Submontano de Villa de Santiago, N . L . con dos e x tractos de H.parvi Fol ia . . 75 10 Va i ores de i mportanci a de las espec i es dom i non - tes en el Matorral Submontano de Villa de Santia go, N. L ., Méxi co 70 Figura Página 1 Clasificación de los principales compuestos ale lopáticos y sus probables vías de síntesis . . 7 2 Ciclo de sustancias alelopáticas 9 3 Obtención del concentrado clorofórmico de llu via de H.parvi f ol ia • 37 4 D i agrama que muestra I a secuenc i a de extrac - ción con diferentes solventes orgánicos de las hojas de H.parv ifol i a 39 5 Cromatografía realizada a las diferentes frac ciones obtenidas de las hojas de H.parvifolia. 47 Ó Resultados de las pruebas de germinación con - las diferentes fracciones obtenidas de las ho jas de H.parvifol i a 51 7 Resultados de las pruebas de germinación con - los extractos crudos de H.parvi foli a 55 S Resultados de las pruebas de germinación con - los aceites esenciales de H.parvi foli a . . . . 59 9 Resultados de las pruebas de germinación con - el concentrado clorofórmico de agua de Iluvia- de H.parvifol i a 65 10 Resultados de las pruebas de germinación con - las sustancias volátiles de H.parvi fo I i a . . . 67 11 Resultados de las pruebas de germinación con - las diferentes fracciones obtenidas de las ho jas de H.parvifol i a en frijol 70 12 Resultados obtenidos de las pruebas de germina ción del frijol en los diferentes bioensayos . 71 / Efecto de! licuado en fresco de las hojas de H.parvifol i a sobre la germinación de - semiII as de frijol (Phaseolus vulgari s) . Efecto del licuado en fresco de las hojas de H.parv¡foli a sobre la germinación de - semiI las de tomate (Lycopersicon escuI en- tum) Efecto del aceite esencial de H.parvifo - I ia sobre ta germinación de semillas de - tomate (Lycopersicon esculentum) . . . Efecto del aceite esencial de H.parv¡fo - I i a sobre la germinación de semillas de - calabaza (Cucurb i ta pepo) R E S U M E N ESTUDIO DEL POTENCIAL INHIBIDOR Y ALELOPATICO DE Helietta parvifolia (Gray) Benth., ESPECIE DEL MATORRAL SUBMONTANO DE NUEVO LEÓN, MÉXICO 1^ Cecilia Beatriz Graue Wiechers 2/ Biól. Magdalena Rovalo M.S. Introducc i ón Las zonas del Noreste han sido estudiadas ampliamente — desde el punto de vista botánico (Rojas Mendoza, 1965) y des- de el aspecto fitoqufmico (Domínguez, 1976). El desierto presenta características de distribución es- pacial que sugiere la presencia de al elopát¡eos. Sin embar - go, los estudios hechos por. Rovalo y Macías (1978) en Larrea divari cata comprueban la falta de fitotoxici dad de esta espe- cie a n i ve I de i nvernadero; en este caso es def i n i t i va una — competencia por agua o algún otro factor climático como el — factor determinante de la dominancia de L̂ . di vari cata. En este trabajo se presentan los estudios hechos en otra comunidad del Noreste, el Matorral Submontano (Rzedowski, - - 1 Trabajode tesis realizado por Cecilia B. Graue como requ_ sito para optar por el grado de Maestría en Ciencias, ITESM. 2 Profesor e investigador del Departamento de Biología, ITESM. 11 1966) y que corresponde al Matorral Alto Subperennífol¡o de - Rojas Mendoza (1965), al "Piedmont Scrub" de Muller (1939) y- al Matorral Subinerme Parvifol¡o de Miranda y Hernández X. — (1963). Se caracteriza por la predominancia de arbustos al - tos o árboles bajos de 3-5 metros de altura; sus hojas o f o - liólos son pequeños y es caducífolio por un breve período de- tiempo en la época de secas; se localiza en los cerros poco - elevados o porciones bajas de la altiplanicie y de las ver — tientes este y oeste de la parte norte de la Sierra Madre Oriental, en altitudes de 700 a 1700 mts, con suelo somero y- roca caliza o ri olí ta; como especies dominantes más f r e c u e n - tes se tienen; Helietta parvifolia, Neopri ngIea integrifo — lia, Pi thecelIobi um paIIens, Cord i a boi ssi eri, Acac i a r i g idu- l_a (Rojas Mendoza, 1965)- La aparente dominancia de una especie, HelIetta parvifo- Iia (Rutaceae), sobre lomeríos bajos que circundan la Presa - de la Boca que se encuentra a una altura entre los 500 y 600 mts, con un clima AC(x') (w)A(E), en Villa de Santiago, N.L-, presenta una situación favorable para la investigación sobre- el potencial al alopático de esta especie- Aunado al análisis de la dominancia química de vegetales superiores se efectúa - ron los estudios para identificar compuestos provenientes de- H.parvífoli a que sean responsables de otros efectos biocidas, particularmente sobre hongos y bacterias. M I Literatura revisada Los trabajos sobre alelopatfa empezaron a publicarse for malmente a principios de este siglo. Las publicaciones son - actualmente muy numerosas y hay una excelente recopilación — (R i ce,1979), lo que demuestra el creciente auge de esta rama- de la ecología química. Desde el punto de vista evolutivo, la alelopatfa puede - considerarse tanto una adaptación como un accidente que con - fiere supervivencia a las especies (Newman, 1979). La inves- tigación de alelopatfa se ha hecho en todos los ecosistemas,- sin embargo en zonas áridas y semiáridas los reportes son es- casos si se refiere a ecosistemas naturales. McPherson y Muller (1969) estudiaron ampliamente el po - tene¡al alelopático de especies de chaparral. Posteriormente, Hoffman y Hazlett (1977) estudiaron los efectos al elopáticos- de los extractos acuosos y sustancias volátiles de especies - de Artemisia sugiriendo la posibilidad de que ios al elopáti - eos producidos por ésta tengan un efecto en la distribución - espacial de este tipo de vegetación. Ashraf y Sen (1978) de - muestran que I os extractos acuosos de Ce1 os i a argéntea, una - maleza de zonas áridas, tiene un efecto altamente inhibidor - sobre cultivos de Pennisetum typhoídeum y Sesamum indicum; en el campo el mayor efecto se tuvo al quemar la maleza y sembrar los cultivos en el lugar. Se tienen reportes de H.parvifoli a desde el punto de — v i ata químico (Domínguez, et al. 1971) y Domínguez (1976), ya IV que es una planta que en algunas regiones se utiliza como planta medicinal y porque pertenece a la familia Rutaceae, co nocida por la presencia de sustancias como las cumarinas y fu_ ranoquinolinas, así como la presencia de sustancias aromáti - cas, pero hasta el momento no se ha estudiado como planta ale Iopát i ca• Metodología y Resultados La presente investigación se llevó a cabo en los labora- torios de Fisiología Vegetal y Ecología de la unidad de gra - duados de agricultura del Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey y en el lugar de estudio de la comun¿ dad de Matorral Submontano que se encuentra rodeando a la Pre sa de la Boca en Villa de Santiago, N.L. 1 / El objetivo general fue estudiar el potencial alelopáti- co de HL parvifolia. El trabajo se dividió en tres partes, - la primera que consistió en la realización de bioensayos que- demostraran la existencia de alelopatfa en Ĥ . parvifol i a e — identificar las probables vías de liberación de estos compues_ tos, realizando pruebas de germinación con semillas de plan - tas cultivadas, como: frijol (Phaseolus vulgaris), mafz (Zea mays), calabaza (Cucúrbita pepo), rábano (Raphanus sativus),- cebolla (Al Iium cepa) y jitomate (Lycopersicon esculentum) y- una maleza, el zacate bermuda (Cynodon dactilon). También se- utitizaron hongos y bacterias aislados del suelo de la común dad estudiada, entre los hongos: Fusarium, Botrytis sp, Rhi- V zopus stolonifer y cuatro especies de Aspergi I Ius: Ochrace - us. Flavus, parasítica y Niger. Entre las bacterias: Agrobac terturo, Baci IIus y Arthrobacter. Las pruebas realizadas fueron, en orden de importancia - en cuanto a inhibición: los extractos crudos de las hojas de ü- parvifol¡a, utilizando hojas jóvenes y maduras, éstos te - nfan una presión osmótica no mayor de 50 miliosmoles (10%) y- el de 5% una presión osmótica menor de 25 miliosmoles, lo — cual, basándose en las investigaciones de Bell (1974) no va a tener un efecto osmótico e interferir en los resultados ya -- que solamente una solución con una concentración mayor de 75 miliosmoles tiene un efecto osmótico sobre la germinación o - desarrollo de microorganismos. Estos extractos fueron proba- dos sobre la germinación de semillas utilizando la técnica de papel filtro impregnado; estos extractos tuvieron un efecto - altamente inhibidor sobre la germinación de semillas, esto — era de esperarse ya que el efectuar un licuado de hojas, - - arrastra una gran cantidad de sustancias, pero se obtuvieron- diferencias en inhibición en cuanto si se utilizaban hojas jó venes o maduras, siendo las primeras más inhibidoras, lo que- nos i nd i ca una diferene i a en la produce i ón de a IeIopát i eos — con respecto al estado de madurez de las partes de la planta. El aceite esencial de H.parvifoIÍa, obtenido por arras - tre de vapor de las hojas de esta planta, tiene una presión - osmótica que no excede de 50 niosni, fue probado en la germina- ción de semillas, mezclándolo con agar y en hongos y bacte — VI rías en discos de papel filtro, midiéndose en éstos el diáme- tro de inhibición alrededor del círculo. El aceite esencial - resultó ser inhibidor en todos los casos de semillas, excep - tuando al frijol, el cual fue estimulado significativamente - en su crecimiento; en hongos y bacterias también fue muy inhj_ b i dor. El concentrado clorofórmico de lluvia, el cual se obtuvo al concentrar el agua de lluvia con un solvente orgánico como es el cloroformo, fue probado en ta germinación de semillas - utilizando la técnica de papel filtro impregnado y en hongos- y bacterias midiendo el diámetro de inhibición alrededor de - los círculos de papel filtro que contenían dicha sustancia; - los resultados hicieron evidente la diferencia en la concen - tración de aletopáticos en diversas épocas del año, ya que el concentrado clorofórmico obtenido de la colecta de lluvia en- Noviembre de 1979/ fue muy inhibidor para todas las semillas- probadas, en cambio las otras dos colectas realizadas en Fe - brero y Abril de 1980 no fueron muy inhibidoras. En el caso- de hongos y bacterias no hubo inhibición significativa, ere - ciendo las colonias incluso por encima de los discos de papel filtro. También se le realizó una cromatografía al concentra^ do clorofórmico revelando un alcaloide no identificado aún. Para probar los efectos de las sustancias volátiles de - Ü" parvifoli a, se siguió la metodología de Hoffman y Hazlett- (1977) que consistió en poner 5 gramos de hojas frescas hume- decidas en una caja de petri abierta dentro de un recipiente- VII de plástico, alrededor de ésta se colocaron otras cajas petri abiertas con semillas de diversos cultivos sobre papel filtro humedecido. El recipiente se sellé con petrolato.Las sus - t a n d a s volátiles tuvieron un efecto más que inhibidor, retar_ dador del crecimiento para el frijol, cebolla y jitomate, re- tardo que repercutió en el crecimiento total y que fue sisni- f¡cativo estadísticamente, en cambio fueron estimulantes pare Pithecelobium pal lena, especie arbórea asociada con Hm parvi- fol ia. En base a esta primera parte de la investigación (ver — anexo figura l) se puede decir que las vías de liberación de- estas sustancias alelopáticas son: la lluvia que al lavar — Ias hojas arrastra un alcaloide aún no identificado totalmen- te, la volatilización de ciertas sustancias y los aceites - - esenciales. Faltando aún por estudiar otras probables vías - como el mantiI lo. Le segunda parte de la investigación consistió en la rea I izactón de una secuencia de extracción con diferentes sol ven tes orgánicos (etanol, cloroformo, éter de petróleo) de las - hojas de Ĥ . parvifol ia. Todos los extractos fueron probados- en bioensayos sobre germinación de semillas a 100 ppm mezcla- dos con agar. Estas pruebas tenían como base el rastrear la- frace ion más inhibidora, identificar mediante cromotografía - los componentes de estas fracciones, para aislar en un futuro las sustancias biológicamente activas. Se encontró que la — frace i ón más inhibidora era la clorofórmica (ver anexo figura Vil! 2) y la cromatografía de esta fracción reveló: cumarina, ca- simi-oina y furanoquinolina. La tercera parte de la investigación consistió en el sn«5 I ¡sis de la vegetación de la comunidad de J-L parvifol i a, rea- lizándose varios muéstreos y obteniendo los valores de impor- tancia de las especies más conspicuas. H_. parvifol i a es fuer temante dominante sobre otros componentes de la vegetación ar_ bórea y arbustiva entre tos que se tienen: Pithecelobium pa- 11ens. Sargentía greooi. Celtis pal I ida, Acacia rigiduI a. Neo orinalea integrifolia y Zanthoxylum fagara; en cuanto al e s - trato herbáceo se pudo observar que aunque éste es abundante- y diverso no alcanza más de 5 a 10 cms de altura y está repre_ sentado por plántulas de los estratos superiores como: P.pa - IIens, Hm parvifoli a, S.greggi y otros como: Eupatori um, Diospyros texana, Clematis drumondi i, entre otros. Conclusiones Se puede concluir que uno de los factores que intervie - nen en la dominancia de t̂ . parvifol ja en el Matorral Submonta_ no de Villa de Santiago, N.L., es la producción de sustancias alelopáticas que impiden el crecimiento de otras plantas y — que probablemente también tengan un efecto sobre posibles pa- rásitos de esta planta (hongos y bacterias) ya que los acei - tes esenciales tuvieron un efecto altamente inhibidor sobre - todos los microorganismos probados, siendo objeto de posterio res investigaciones el estudio de efectos del aceite esencial IX sobre microorganismos patógenos, con el fin de encontrar una- posible aplicación práctica de estas investigaciones. Bibliograffa - Ashraf,N. y D.N.Sen. 1978- Allelopathíc potential of Celo- s * a argéntea in arid land crop fields. Oecol.Plant.13 TU: 131-338. Bell,D.T. 1974. The influence of osmotic pressure in - - tests for allelopathy. Trans.lll. State Acad.Sci. 67 - (3): 312-317- Domínguez,X.A., J.Canales, A.Garza, E.Gómez y L.Garza. - - 1971. Constituents of Ieaves and branches of Helietta - parvifoI ir Phytochemistry 10:1966. Domínguez, X.A. 1976. Aspectos químicos de las plantas tó xicas y medicinales de Nuevo León y el Noreste de Méxi - co. En: Estado actual del conocimiento de plantas medi- cinales mexicanas. Editor; X.Losoya. IMEPLAN. México. - Págs: 131-149. - Hoffman,G.R. y D.L. Hazlett. 1977. Effeets of aqueous Ar- tero i s i a extraets and volatí le substances on germinal ion- of selected species. J.Range Management 30 (2):134-137. - McPherson,J.K. y C.H.Muller. 1969. Allelopathíc effeets - °^ Adenostoma fase iculatum "chamise" in the California - Chaparral. Ecol.Monogr.39:177-198. - Miranda,F. y E.Hernández X. 1963. Los tipos de vegetación- de México y su clasificación. Bol.Soc.Bot.Méx.28:29-179- - Muller,C.H. 1939- Relations of the vegetation and clima - tic types ¡n Nuevo León, México. Amer.Midi.Nat.21:687 - 729. Newman,E.I. 1978. Allelopathy, adaptation or accident. In Harborne, J.B. (ed). Phytochemical Society of Europe — X Symposia Series. No. 15 Biochemical aspects of plant - and animal coevolution. Proceedings of the Phytochemi - caI Soc i ety Symposi um. Read ing. EngI and. Apr i I 1977• - Acad. Press. London. 435 p. - Rice, L.E. 1979. Allelopathy, an Update. Bot.Rev. 45 (l): 1-109. - Rojas Mendoza, P. 1965. Generalidades sobre la vegetación del estado de Nuevo León y datos acerca de su flora. Te sis Doctoral sin publicar. Facultad de Ciencias, UNAM.- 124 P- - Rovalo,M. y M.R. Mac i as. 1979. Bioensayos con Larrea diva r i cata como posible planta alelopática y/o herbicida. — XVI Informe de Investigación 1977-1978. División de Ciencias Agropecuarias y Marítimas. Inst. Tec. Est. Sup. de Mty. pp. 69-70. Rzedowski, J. 1978. Vegetación de México. Edit. Limusa.- México. 432 p. Figura 1. Resultados obtenidos de las pruebas de germina - ción del frijol en los diferentes bioensayos. BIOENSAYO PORCIENTO DE CRECIMIENTO | 20 40 60 80 100 120 140 160 % EXTRACTO CRUDO < 1 0 » EXTRACTO CRUDO < 5 » EXT. HOJAS JO- VENES EXT. HOJAS MA DURAS EXT. ACUOSO CONCENTRADO CIO R0F0RMIC0. LLU- [ VIA NOV. 79 CONCENTRADO CLO f R0F0RMIC0. LLU~ l VIA FEB. 80 CONCENTRADO CLO ROFORMICO. LLU- [ VIA ABR. 80 ACEITE ESENCIAL [ SUSTANCIAS VOLA r TILES " l EXTRACTO CLORO- r FÓRMICO < * Significativo al 5% ** Significativo al \% NS No significativo TESTIGO Figura 2. Resultados de las pruebas de germinación con las diferentes fracciones obtenidas de las hojas de H.parvifolia+ en frijol. PORCIENTO DE CRECIMIENTO EN TALLO Y RAÍZ TRATAMIENTO I 0 TESTIGO EXTRACTO ETANOLICO EXTRACTO CLOROFOR MICO. EXTRACTO SO LUBLE EN AGUA DEL ETANOL ICO. EXTRACTO SO LUBLE EN ÉTER DE PE TRÓLEO- EXTRACTO IN SOLUBLE EN~ ÉTER DE PE TRÓLEO. I 20 40 60 80 100 120 % Tallo No se obtuvieron datos Raíz [ Tallo No se obtuvieron datos Raíz Tallo No se obtuvieron datos Raíz Tallo No se obtuvieron datos Raíz Tallo No se obtuvieron datos Raíz Tallo No se obtuvieron datos Raíz N.S •a- * Significativo al 5% ** Significativo al \% NS N O S i gn i f icat i vo + fuente: tabla 1 INTRODUCCIÓN OBJETIVO DE LA TESIS El objetivo de la presente tesis es estudiar el poten cial inhibidor y al elopático de Helietta parvifoli a (Gray) — Benth. (Rutaceae), una especie dominante en la comunidad de - Matorral Submontano en Villa de Santiago, Nuevo León. La dominancia de esta especie, la escasez de vegetación- herbácea, así como I a gran cant idad de compuestos aromati cos- que despide esta planta, llevó a pensar que ejerce una influen cia ale!opática en su comunidad y que contribuye a su dominan c ¡a. Con ésto en mente, se procedió a hacer las pruebas que - demostraran la existencia de alelopatfa a nivel de I aborato — río, tratando de asemejar las condiciones del campo y estu — diando también la composición de la vegetación del lugar. Se trata de cubrir dos aspectos: a) El conocimiento del comportamiento de una especie en su comunidad. b) Se discu - ten I as pos i bI es api i cae i ones práct i cas de este conoci mi ento- en la utilización de un recurso natural como fuente de com — puestos inhibidores naturales del crecimiento de otras plan - tas, hongos, bacterias e insectos. GENERALIDADES SOBRE EL TEMA l) Definición Et término alelopatfa fue dado por Molisch (1937) para - referirse a la interacción bioquímica benéfica o perjudicial- entre todos los tipos de plantas, incluyendo a los microorga- nismos. Pero en el uso corriente el término se refiere al efecto perjudicial que produce una planta superior (donador) enla - germinación, crecimiento y desarrollo de otras plantas (recep_ tor), a través de la liberación de sustancias tóxicas. En la presente tesis se utilizará el término como origi- nalmente fue concebido por Molísch y que ahora ha sido resca- tado por Rice (1979) , el cual dice que el efecto de cualquier compuesto puede ser estimulante o inhibidor dependiendo de la concentración del compuesto en el medio. Un punto muy importante de la alelopatfa es que su efec- to depende de un compuesto químico que se añade al medio, por lo que se separa de la competencia que implica la remoción o- reduce ion de un factor en el medio ambiente que es requerído- por otra planta que habita en el mismo medio, ejemplos de al- gunos factores que pueden ser reducidos son: el agua, los mi nerales, alimento, la luz (Rice, 1979). - 3 - La alelopatfa es diferente de la interacción con otros - organismos (herbívoros, patógenos) en que en estos el efecto- es directo e inmediato, en cambio la alelopatfa es por lo ge- neral indirecta, a largo plazo y depende para su expresión de factores como el clima, el suelo, tos microorganismos (Anaya- y Gómez-Pompa, 1971). Desde el punto de vista evolutivo la alelopatfa puede — considerarse tanto una adaptación como un accidente que con - fiere supervivencia a las especies (Newman,1978). Los primeros informes sobre alelopatfa fueron hallados - por Lee y Monsi en 1963, citados por Rice (1979)» tos cual es- encontraron un reporte por Banzan Kumazawa en un documento ja pones de 300 años atrás que dice que la lluvia o lavado de — las hojas del pino rojo (Pinus densifI ora) es dañino a I os — cultivos que crecen debajo de éste; esto fue corroborado en - experimentos realizados por Lee y Monsi. DeCandolle ( l832), sugiere que algunas plantas excretan- sustancias químicas a través de rafees y hojas y que una bue- na rotación de cultivos puede aliviar este problema en suelos agrícolas. A pesar de estas primeras sugerencias, no es sino hasta- este siglo, a partir de 1960 que ta investigación sobre alelo, patfa cobra importancia y en los últimos 5 años ha tenido un- cree i m i ento exponenc i a I. - 4 - En esta revisión se tratará de resaltar ios aspectos mes importantes de la investigación en la alelopatfa. 2) Naturaleza química de los compuestos a leíopáti eos. Se pueden distinguir en el metabolismo de las plantas - dos grandes aspectos: a) El metabolismo primario, que incluye la formación y - metabolismo de ácidos nucleicos, carbohidratos, aminoácidos y proteínas, que es similar en la mayoría de los organismos. b) El metabolismo secundario, que incluye la formación - de compuestos vítales como las vitaminas, esteróles, carote - no i des, etc., y un sinnúmero de compuestos secundarios como: ios ácidos fenol icos, cumarinas, terpenoides, flavonoides, aj_ caloides, que no se sabe si son productos finales del metabo lismo resultado de una evolución o productos de desecho (Sei- gler,1977). Independientemente de su origen, estos productos son po- tencialmente autotóxicos y por I o tanto deben ser liberados - de la planta en alguna forma (Putnam y Duke,1978). Una de las funciones que se les ha dado a estos compues tos secundarios, es el de la defensa de la planta contra her bívoros, patógenos y otras plantas. Es probable que estos — compuestos tengan más de un papel o función, ya que por ejem- - 5 - pío: varios ácidos orgánicos que se sabe que son exudados por las plantas tienen un efecto inhibidor para otras plantas y - también pueden inhibir ta germinación y posterior desarrollo- de zoosporas; algunos ácidos fenol icos simples están implica dos en interacciones alelopáticas en el bosque deciduo (Lodhi 1975), en la sucesión en un campo viejo (Guenzi y Norstadt, - 1967) y en el Chaparral de California (Muller y del Moral, — 1966). Estos mismos compuestos están asociados con la capa - de Ifpidos en la cutícula y tienen que ver con ta resistencia epidérmica al ataque de patógenos (Putnam y Duke,1978)- La juglona, es uno de los pocos casos que se conocen de- un compuesto específicamente a leí opát ico, producido por Ju_ — qlans niara (Putnam y Duke,1978). Rice (1974) da una clasificación de los principales com- puestos probados como al elopáticos y sus probables vías de — síntesis (Figura l ) . 3) Liberación al medio y ciclo • • La Iiberación al medio de compuestos secundarios, puede- seguir una de las siguientes vías: a) Exudación de sustancias volátiles de partes vivas de- Jas plantas, como en el caso de Salvia IeucophyIa y Artemisia cal¡fornica (Muí Ier,1964). b) Lavado de toxinas solubles en agua de tallos y hojas- en respuesta a la acción de la lluvia, neblina y rocío, como- - 6 - en el caso de Artemi si a absinthium y Juglans n igra (Borner, - 1960). c) Exudación de toxinas solubles en agua de rafees; Bor ner (1960) afirma que estos exudados de rafees se restringen- a la rizosfera y no tienen un efecto directo en otras plan — tas, sin embargo estudios recientes demuestran la existencia- de este tipo de liberación de sustancias tóxicas por la plan ta (Foy et al, 1977). d) Liberación de toxinas a partir de partes no vivas de- la planta, ya sea por medio del lavado de toxinas de la hoja rasca (Jameson,1977; Lodhi,1978) o como producto de la deseo» posición del mantillo por los microorganismos del suelo (Lin- derman,l970). 7 - Figura 1. Clasificación de los principales compuestos alelo- páticos y sus probables vías de síntesis (Rice - - 1974). Carbohidratos J.Tan i nos hidroliza | b.es f Acido deshidroshikfmico ácido digá- I j I i co F.Acido gal ico y Acido protocateuj. Acido Shikfmico P i ruvato 1' Acetato Acido Mevaló n ico E.-Terpenoi des y Esteroi des H.Cumariñas J.Tan i nos con densados Aminoácidos co K.Aminoácidos y po- Iipeptidos L .Alcaloides y Cian h idr i ñas M.Sulfuros y glucó- sidos del aceite- de mostaza N.Purinas y nucleó- sidos F.Fenol es simples y derivados del á c ¿ do benzoico - Ácidos orgánicos solubles en agua, aleono les de cadena corta, aldehidos alifáticos y cetonas. 6.- Lactonas simples no saturadas. C - Ácidos grasos de cadena larga. D.- Naftoquinonas, antraqui nonas y qui nonas - complejas. - 8 - Una vez que estas sustancias han sido liberadas al medio ambiente cercano o inmediato deberán de acumularse en una can tidad suficiente como para afectar a otras plantas, persistir por un cierto período de tiempo o ser constantemente I ibera - das para tener un efecto inhibidor (Putnam y Duke,1978) . Su efecto puede perderse por: evaporación en el aire, - lavado a capas más profundas del suelo, adsorción por los co loides del suelo o destrucción por los microorganismos hetero tróficos (Grodzinsky,1977). La fase final del ciclo es la absorción por la planta -- aceptora con los subsecuentes resultados en el metabolismo — (una ilustración de este ciclo se puede observar en la Figura 2 ) . Con respecto a la absorción y transíocacion de las sus - tancias alelopáticas. Rice (1979) menciona algunas investiga ciones al respecto: un autor probó 20 alcaloides, todos fue - ron absorbidos por las raíces y se encontraban luego en I os - tallos, demostrando su transíocacion; otros autores midieron- las tasas de transíocacion de 13 fenoles y flavonoides en los tallos de Vicia faba L. Las tasas de movimiento en el tallo - hacia abajo partiendo de una hoja apical variaba de 12 cm/h a 108 cm/h, siendo los flavonoides los que presentaban un movi miento más lento. Pruebas realizadas con áfidos demostréron que esto» compuestos se movían por el floema en su forma quí mica original. Seigler (1977) menciona que la vida media de los compues tos al elopáti eos una vez que han sido liberados es muy varia- Planta donadora sustancias f ítogén¡cas _ fi tone i das m t asm m a s ra a¡ <o c « -O 3 "o .cion por , >v I os organ ¡ s_ mos hetero-sii tróf i eos excresiones act i vas excresiones pasivas de la hojarasca excresiones postmortaI es Perd i das *A en el sue lo Planta aceptora Fig. 2. Ciclo de Sustancias alelopáticas (Grodzinsky, 1977). - 10 - ble y va de unas cuantas horas como es el caso de monoterpe - nos dentro de plantas de menta; de la marrubina, un sesquiter, peno del marrubio (Marrubium vulgare) que tiene una vida me - día de 24 horas; hasta varios meses y años como es el caso de los aceites esenciales y resinas no volátiles de Ptñus sylves tris. 4) Factores que afectan la producción de sustancias alelopátj. cas Este es un punto muy importante en tas investigaciones - de alelopatfa, ya que se habla de ta posible relación entre - una condición ambiental desfavorable y la producción de sus - tancias alelopáticas, lo que haría que la alelopatfa tuviera- un papel ecológico muy importante. Koeppe, et al (1976) encontraron un alto incremento en - la concentración de isómeros del ácido clorogéníco en extrac- tos de plantas de girasol que habían sido sometidas a condi - ciones deficientes en fósforo. Los mismos autores encontraron un incremento en la concen trac ion de ácido cafeolfnico y escopoleti na bajo condiciones- ambientales desfavorables (falta de nitrógeno y frfo) en el - tabaco (Koeppe, et al 1977). Gil more (1977) encontró que la concentración de alfapine no se incrementaba en P i ñus taeda sometido a stress hídrico,- 11 - mientras que la concentración de beta-pineno y Iímoneno decre cían. La concentración de camfeno se incrementaba con un - - stress en la humedad del suelo en la primera prueba y decre - ció en la segunda prueba al siguiente año. 5) Mecanismos de acción de los compuestos a leíopáticos Se ha demostrado que las sustancias alelopáticas producj_ das por plantas superiores inhiben la germinación, el crecí - miento y desarrollo en otras plantas. Sin embargo en muy po- cos casos se ha estudiado los mecanismos específicos de inhi- bición. Muller (1977) estudió el efecto inhibitorio producido — por los terpenos emanados por Salvia leucophylla demostrando- que la elongación celular a nivel de las raíces era inhibida, asf como el desarrollo de raíces laterales; también encontró- una baja en la actividad respiratoria de estos tejidos produ- cida por una disminución en el número de mitocondri as. En otros casos hay evidencia de interacción entre las — sustancias alelopáticas y las hormonas del crecimiento. Rice (1979) cita un trabajo hecho por Stahl et al en 1974 quienes- encontraron que la toxina T producida por Fusarium tr ¡cinc— tum inhibía la elongación celular propiciada por auxínas en - Glycine max. Otro autor encontró que compuestos identificados como tan inos inhibían el crecimiento inducido por gtberelinas en el chícharo; la inhibición decrecía al aumentar la concen- - 12 trac ion da giberel¡ñas. Un efecto estudiado por varios autores, ha sido el de la interferencia de las sustancias alelopáticas con la absorción de sales minerales por la planta afectada. Bucholtz (1977) - encontró que los extractos de Aqropyron repens inhibían la ab_ sorción de sales minerales por el mafz. Batke, citado por R ¿ ce (1979) propone que el efecto inhibidor de las sustancias - alelopáticas en la absorción de sales minerales bien puede de berse a la inhibición de las ATPasas relacionadas con la mem- brana plasmática y que realizan el transporte activo de los - nutrientes. Otros efectos han sido encontrados en relación con la fo tosfntesis. El camferol (un flavonoide) inhibe el transporte de electrones y la fotofosforiI ación cíclica y no cíclica en- las reacciones lumínicas de la fotosíntesis. También se han- estudiado efectos sobre la síntesis de proteínas y la activi- dad de enzimas específicas (Rice,1979). 6) El suelo y los al elopáti eos El suelo, es en le gran mayoría de los casos el sitio — donde se depositan y actúan las sustancias alelopáticas. Una vez que las fitotoxinas han sido depositadas en el suelo co - míenzan a ser descompuestas tanto por los microorganismos co- mo por acción química; por lo que los efectos a leíopáticos po tenciales dependen básicamente del aporte de estos aleloquím^ eos (cantidad y constancia) y de su descomposición o inactiva^ - 13 - ciÓn. Un factor muy importante también es el tipo de suelo,- su textura y el poder de adsorción de las partículas coloida- les inorgánicas y orgánicas (Anaya,1976). Se han hecho varios trabajos acerca del papel que juegan ciertos microorganismos en la descomposición de sustancias ale Iopát Ícas en et suelo. Henderson et al. en 1956, citados por Rice (1979) estudiaron la descomposición de compuestos fenol eos por hongos del suelo, abarcando p-hidroxi-benzaldebido, - ácido ferúlico y vanilina; estos compuestos eran usados corno- única fuente de carbono por estos microorganismos. La van i lj_ na y el ácido ferúlico eran convertidos a ácido vanílico y el p-hidroxibenzaldehido era convertido a p-hidroxibenzoico, es- tos productos intermedios son tóxicos a muchos organismos, - por lo que el efecto ale!opático continúa por un período lar- go durante la descomposición. Los tan i nos, son compuestos muy tóxicos y muy difíciles- de degradar por lo que se pueden llegar a acumular en grandes cantidades en el suelo. Se ha encontrado una cepa de Pen i c i - 11um adametz i que útil iza estos tan i nos como única fuente de- carbono. Un factor muy importante en el estudio de las fitotoxi— ñas presentes en el suelo, es el método de extracción que se- utiliza, Kaminsky y Muller (1978) demuestran que no debe de - realizarse una extracción alcalina de los suelos, ya que Ios- compuestos que aparecen en la extracción provienen no sólo de la comunidad vegetal, sino que se forman en la misma extrac - - 14 - ción, por lo que esto puede dar resultados falsos acerca de - la concentración y persistencia de estos compuestos en el sue lo. 7) Papel de la alelopatfa en las comunidades vegetales a) Alelopatfa en la Agricultura La capacidad de la alelopatfa de influenciar la agricul- tura ha sido ampliamente reconocida. DeCandolle (1832) sugie re que el "soil sickness problem" en la agricultura puede de- berse a exudados de las plantas cultivadas y que la rotación- de cultivos puede aliviar este problema. Estas influencias alelopáticas contribuyeron en el pasa- do, a adoptar ciertas prácticas como la rotación de cultivos,- técnicas de germinación y fertilización. Los efectos primarios de la alelopatfa en tierras de cu|_ tivo son el resultado de ta liberación de toxinas de tos res¿ dúos vegetales (ya sea fitotoxinas lavadas por la acción de la lluvia o como producto de la descomposición orgánica); este - modo de liberación de las toxinas se cree que es el que más - influencia tiene en la baja en la productividad de los culti- vos. Una práctica común en el cultivo del arroz, es I a de — mezclar las partes no cosechadas de las plantas con el suelo; pero se ha observado que la producción en años subsecuentes - decrece. Chou y Lin (1976) encontraron que los extractos - - acuosos de los residuos de arroz en descomposición inhibían - - 15 - el crecimiento radicular del arroz y la lechuga. La máxima - toxicidad ocurría en el primer mes de la descomposición y lúe go declinaba; los extractos de suelo también eran altamente - inhibidores y su efecto duraba hasta 4 meses, se aislaron 5 - fitotoxinas y fue posible demostrar que la baja en la produc- tividad era debida a una influencia alelopática. El efecto inhibidor de los residuos de cultivos puede de_ berse a una combinación de las toxinas de los residuos y las- de microorganismos; por ejemplo Norstadt y McCalla (l°63) ais, laron al hongo Penici II ium urticae, que produce una toxina — muy tóxica a otros organismos, la patul¡na; este hongo es un- componente muy importante (9050 de los residuos en descompos^ ción.Otra forma de liberación de toxinas es la del layado de- las partes vivas de las plantas, este es el caso del Chrysan- temum morjfolium que libera fitotoxinas que afectan el creci- miento de otras plantas de la misma especia; Asparagus off ici nal i» es un cultivo que permanece en el campo de 25-30 años,- se ha demostrado que la producción en años subsecuentes decre ce debido a sustancias alelopáticas liberadas por él mismo — (autotoxicidad) , (Putnam y Duke,1978). También se ha demostrado una baja en la productividad en cultivos asociados con la cebada y el centeno los cuales libe ran toxinas a partir de las rafees. - 16 - Les malezas son por lo general plantas muy agresivas que compiten fuertemente con el cultivo, un posible efecto de las malezas sobre los cultivos puede ser el de una influencio ale lopática que les permiten eliminar a otras malezas asoci adas as T como al cultivo; el conocimiento de ésto es importante pa ra la rápida erradicación de estas malezas. Einhellig y Ras- mussen (1973) encontraron que los extractos acuosos de Rumex- crispus inhibían el crecimiento del maíz, de Amaranthus retro fIexus y del sorgo; asimismo, se observó que en los campos — donde existe esta maleza no hay otras. Otros estudios citados por Rice (1979) han demostrado la influencia alelopática de Cyperus escuIentus var. aureus en - cultivos de maíz, trébol, lechuga, jitomate. Se ha observado que en presencia de Agropyron repens la producción de trigo - decae fuertemente; fue posible demostrar que esta maleza redu ce la absorción de fósforo por el trigo. BendelI (1975) demostró el efecto alelopótico del abrojo (Cirsium arvense). Le Roy (1978) demostró la influencia alelo pática de Artem i s i a absinthium, esta es una maleza que domina varios tipos de vegetación. Gliessman (1976) hizo un estudio acerca de Pteridium - - aguí Iunum que es una maleza que domina varios tipos de vegeta, ción en el mundo. El mecanismo primario de interferencia que permite a este helécho ser tan dominante es la alelopatfa. Es te helécho he desarrollado además un mecanismo de liberación- - 1 7 de (ae toxinas según el ambiente en que vive; por ejemplo en- el sur de California, la liberación de toxinas comienza con - la estación de lluvias y por lo tanto con la iniciación de la germinación de especies asociadas; en el Pacífico noroeste en los Estados Unidos la liberación de toxinas comienza con el - rompimiento de la latencia impuesta por el crudo invierno, en la primavera; en estos dos casos las toxinas provienen princj_ pálmente de la hojarasca, raíces y rizomas; en cambio en Cos- ta Rica la liberación es a lo largo de todo el año y las toxj_ ñas provienen de las frondas, dado el clima tropical de esta- reg ion. b) Pepel de la Alelopatfa en Ecosistemas Naturales - La alelopatfa en la dominancia En un sentido funcional, la dominancia puede ser defini- da como la influencia que tienen ciertas plantas sobre el me- dio ambiente, siendo esta suficientemente fuerte como para de terminar que otras plantas crecerán allí (Muí Ier,1974)- Ya sea que la interferencia implicada sea competencia o- alelopátfa, la exclusión resultante depende de la intensidad- de I a reacc i ón y deI grado de suscept i b i I i dad de I as demás es peeies• Por lo tanto un árbol de un bosque puede dominar por producir una gran sombra en el ambiente y entonces sólo espe- cies de sombra se desarrollarán o bien una especie fitotóxica dominante como Quercus faIcata var. paqodaefolia o J U Qlans ni Q » * * pueden excluir todas, excepto unas cuantas especies tole- rantes (Muller, 1974). - 18 - Debido a que la exclusión es una expresión común de la - dominancia frecuentemente se tienen ejemplos oscuros. Esto - es*particularmente cierto en la exclusión alelopática la cual frecuentemente es completa; sólo se observa el resultado final la ausencia de la especie excluida, el cual es un concepto dj_ ffcil de interpretar. Se puede decir, que mientras más efi - cíente sea el mecanismo de exclusión mayor es la dificultad - para observar el proceso en acción (Muller, 1974). Según Becking (1968) un componente importante de la dom¿ nene¡a es el tiempo en el cual ocurre la reacción y respues - ta, la duración, periodicidad y condiciones ambientales para- la expresión de la alelopatfa; por ejemplo, la acción toxica- do SaIvía IeucophyIIa depende de las condiciones de sequía, - un perfodo largo de condiciones favorables (lluvia o precipi- tación abundante), produce una reducción significativa en la- dominancia de estos arbustos (Muí Ier,1970). Otra relación pe riódica muy interesante se tiene en las regiones de fuegos pe riódicos, como en el Chaparral de California, los cuales inte rrumpen la producción de toxinas y desnaturalizan las existen tes. Como consecuencia de esto aparecen una gran cantidad de hierbas que en perfodos de la dominancia de los arbustos Ade- noatome faaciculatum y ArctostaphyI os glandulosa var. zacaen- sis son completamente suprimidas (Muller et al. 1968). Otro ejemplo en comunidades en duas, en éstas la de toxicidad periódica se puede encontrar - las cuales las especies dominantes son deci, máxima toxicidad se encuentra en las hojas- - 19 que caen. Las condiciones climáticas favorecen la rápida des_ composición de la hojarasca y renuevan ta toxicidad de la co- munidad (Muller, 1974). - Prevención del decaimiento de semillas antes de la germina- ción Este es probablemente uno de los aspectos más importan - tes y universales de la alelopatfa en los ecosistemas natura- les pero ha sido muy poco estudiado (Rice,1977). Rice (1979) postula que la persistencia de semillas en - el suelo por-años e inclusive décadas sin ser descompuestas,- se debe a la presencia de compuestos al elopáti eos en frutos y semiI las. Horton y Kraebel, citados por Rice (1979) reportan que - las semillas de muchas hierbas anuales en el chaparral de Ca- lifornia permanecen latentes por períodos hasta de 40-50 años e inclusive algunas la hacen en regiones húmedas y superhúme- das. Ferenzy en 1958, también citado por Rice (1979) realizÓ- bioensayos con semillas y frutos de 512 especies pertenecien- tes a 88 familias y encontró que muchas eran inhibidoras del- creci miento de hongos y bacterias. Posteriormente Lañe cita- do por Rice (1979) encontró que los frutos y semillas de He - IJanthua annuus (nativa) eran rápidamente invadidas por bacte ría» y hongos cuando se lavaban con agua destilada, no ocu — 20 - priendo ésto sin el tratamiento. - Patrones de Vegetación ta distribución o arreglo de los organismos en una comu- nidad (al azar, uniforme, en manchones) ha sido explicada co- mo una expresión de la competencia entre los organismos, sin- embargo hay casos concretos del papel de la alelopatfa en es- ta distribución. Groner (1974) observó que las plántulas de Ka I anchoe da i oremont i ana que crecían en et mismo sustrato que plantas adu]_ tas establecidas se desarrollaban lentamente; la aplicación - de fertilizantes no incrementaba el crecimiento de las plántu las, pero el de las adultas sf (efecto a 1 elopático). En el sur de California, los arbustos de comunidades de- Chaparral como Sal vía Ieucophy11 a y Artemi sia cal¡fornica, es tan frecuentemente separadas de pastizales adyacentes por una zona desnuda de uno a dos metros de ancho. Aparentemente, — Ios terpenos volátiles, que son liberados de las hojas de es- tos arbustos inhiben el crecimiento'de pastos cercanos (Mu — Iter y del Moral, 1966). Halligan (1973), propone que la zo- na desnuda de vegetación se debe a la actividad de pequeños - mamíferos principalmente aunque también toma en cuenta la pro ducción de al elopáticos. En posteriores estudios Hoffman y - Hazlett (1977) apoyan la hipótesis de los compuestos alelopá- ticos. - 21 - La comunidad formada por Pinus edul is y Jun iperua sp., - es muy abiertay presenta un estrato herbáceo muy pobre. Ios- estudios demostraron que la hojarasca de estos árboles tiene- efectos alelopáticos (Jameson, 1977)* Lodhi (1978) estudió el efecto de la hojarasca de los ár boles dominantes de la vegetación de bosque de tierras bojas- Platanus occidentalis, Celti s occidentalis, Quercus borealis- y G. alba en la vegetación herbácea, encontrando que a launas- de las sustancias alelopáticas de la hojarasca necesitaban — ser hidrolizadas y otras no para presentar su efecto alelopá- tico. - Al elopatTa en la sucesión vegetal y en comunidades climax Cowles, citado por Rice (1977) enfatiza que la produc — ción de toxinas por las pl-antas es un factor importante en la sucesión. Un ejemplo bien documentado es el de la sucesión - en un campo abandonado en la región de los pastos altos en — Oklahorna (estudiados por Rice en varios años consecutivos). - Se tienen en este 4 estados sucesionafes, una vez que el cam- po ha sido abandonado: a) Estado dé malezas pioneras (2-3 - - años), b) Pastos anuales (9-13 años) dominado por Ar i at i da — ol i'gantha. c) Pastos perennes (hasta 30 años) dominado por — Andropooon scoparium. d) Pradera climax. El primer estado dominado por plantas muy robustas como- Ambrosia psi1ostachya. Coreóos i s ti nctori a y Helianthus - - annuus es reemplazado muy rápidamente por A.oligantha. Estu - - 22 - dios hechos por Rice (1977) demostraron que el primer estadio se elimina a sf mismo por una guerra química (alelopatía)y — que es sustituido por A.oliqantha ya que ésta no se ve afecta da por le presencia de estos compuestos. Algunas especies pioneras y A.oligantha producen fitoto- xinas que inhiben el crecimiento de Rh izobium, de organismos- fijadores de nitrógeno libres y la nodulación y formación de- leghemoglobina. Conforme prosigue la sucesión las especies - que aparecen después son más fuertemente alelopáticas contra- las bacterias nitrif¡cantes del suelo, por lo que reducen la- tasa de nitrif¡cae¡ón y conservan el nitrógeno del suelo en - forma de amonio, ya que el fon amonio está cargado positiva - mente y por lo tanto es adsorbido por los coloides del suelo; además de que el amonio no es transformado a nitrógeno gaseo- so y por lo tanto perdido del suelo por falta de las bacte — rías desnitrificantes. Rice (1974) y Muller (1974) discuten- la importancia ecológica de la inhibición de la n¡tr¡f¡caeiÓn en las comunidades climax y proponen que probablemente todes- estas comunidades inhiben la nitrifi cae¡ón y por lo tanto per mi ten la conservación del nitrógeno. Se ha estudiado en otros lugares la sucesión vegetal, y- el papel de la alelopatfa en ésta como es el caso de Ambros i a cumanensi a que es una maleza que se encuentra ampliamente d¡£ tribuida en las regiones semiáridas y ca l¡do-humedas de Méxi- co y es también una especie pionera importante en la sucesión secundaria de los Tuxtlas, Veracruz (Anaya y del Amo, 1978) , - 23 - existe en poblaciones puras y densas, sugiriendo asf que fue ra alelopática. Se hicieron numerosas pruebas para determinar el potencial alelopático de esta especie, resultando autotóxj_ ca en la mayor parte de las pruebas e inhibidora a las otras- especies, sugiriéndose que la producción de sustancias tóxi - cas, le permiten dominar y que la autotoxicidad puede ser un- mecanismo de control de población de la misma. - Alelopatfa en Zonas áridas Se realiza la revisión bibliográfica de este tema ya que la especie estudiada, Helietta parvifoli a, se presenta en las zonas áridas y semiáridas de la República Mexicana. Los reportes sobre alelopatfa en zonas áridas y semiári- das son escasos. El desierto presenta características de dis tribución espacial que sugieren (a presencia de al elopáti eos. Sin embargo, los estudios hechos por Rovalo y Macfas (1979) - en Larree di varicata comprueban la falta de fitotoxicidad de- esta especie e nivel de invernadero. En este caso es defini tiva una competencia por agua o algún otro factor climático - como el factor determinante de la dominancia de L.divari cata. McPherson y Muller (1969) estudiaron ampliamente el po - tencisl alelopático de especies de chaparral. Groner (1974)- descubrió alelopatfa intraespecffica en KaIanchoe dajgremon - ti ana, una erasu lacea originaria de Madagascar, concluyendo - que el efecto alelopático se incrementa en la época de se - - qufa. Posteriormente, Hoffman y Hazlett (1977) estudian los- - 24 - efectos a leí©páticos de ios extractos acuosos y sustancias vo látiles de especies de Artemisia, sugiriendo la posibilidad - de que los al elopáticos producidos por ésta tengan un efecto- en la distribución espacial de este tipo de vegetación. Ash- raf y Sen (1978) demuestran que los extractos acuosos de Ce - |os i a argéntea, una maleza de zonas áridas tiene un efecto aj_ tamente inhibidor sobre cultivos como Penn¡setum typhoideum y Seaamum indicum en los cuales crece abundantemente; en el cam po el mayor efecto se obtuvo el quemar dicha maleza y sembrar en el lugar a P.typhoideum y S.indicum. Montenegro, et al — (1978) encontraron que la dominancia de ciertos arbustos so - bre la vegetación herbácea en el Matorral Chileno no se debfa a una influencia al elopática, sino a algún otro factor, las - especies dominantes eran; Cryptocarya alba, Qui I1 aja sapona - ria. Col I¡guaja odorífera. Satureja gi11 i es i i, Trevoa triner- vis y L i thraea caust i ca. 8) Alelopatfa en Microorganismos y Patología Vegetal a) Efectos al elopátieos sobre mi corrizas y otros microorga — nismos Este es un tema muy interesante e importante en sus aplj_ cae¡ones prácticas en la agricultura y silvicultura, por ejém pío, algunas especies arbóreas tales como BetuI a pendu1 osa y- Picea abies no se desarrollan bien en presencia de CaI1 una — vulgaris. esta última inhibe el crecimiento de mi corrí zas en- el pino y por lo tanto éste no se desarrolla. En otros casos se ha observado que algunos árboles no crecen bien en suelos- de pradera a menos que tas plántulas de éstos sean 'Inoculadas 25 - con hongos micorrfzicos, se demostré que los pastos y los sue los de pradera inhiben el crecimiento de hongos mi corrízIcos- de vida libre (Rice,1979). Brown y Mikola citados por Rice (1979) hicieron un estu dio muy interesante acerca del efecto inhibidor que ejercen - algunas especies de liqúenes sobre el crecimiento de hongos - micorrízicos en el laboratorio y el campo; los liqúenes proba dos fueron: Cladonia. Cetrari a i siandica, Stereocaulon pas - cha le. Se demostró que estos liqúenes afectaban la supervi - vencía de las especies arbóreas, a través de la producción de fitotoxinas que inhibían el crecimiento de micorrizas en Ios- árboles. Otro tipo de investigaciones son acerca del efecto de fj_ totoxinas sobre el crecimiento de hongos no micorrfzicos y — bacterias en el suelo;, en algunos casos se tiene una estimula ción del crecimiento producido por las sustancias volátiles - emanadas por la alfalfa la cual aumenta la tasa respiratoria- de la microffora del suelo y por lo tanto un aumento en el nú mero de esta (Owens, et al 1969). Averett, et al (1978) probaron el efecto de les susten - cias flavonoides: rutina y cuercetina (las cuales son sustan cias fitotóxicas excretadas por varios grupos de plantas) en- el crecimiento de Agrobacterium y Escher i ch i a col i, encontrar», do que su actividad no se veía afectada. Línderman (1970) menciona varíes estudios acerca del - - - 26 - efecto inhibidor o en algunos casos estimutatorio que tléñen- los residuos vegetales en el crecimiento de los hongos patóge nos del suelo; resalta la importancia de estos estudios para- un mejor manejo agrícola (control biológico). b) Papel de la alelopatfa en la Fitopatología El término alelopatfa raramente se usa en la literatura- sobre fitopatología. Pero el desarrollo y morfogénesis de — Ios patógenos, antagonismode patógenos, el desarrollo de los síntomas de enfermedad y la resistencia de la planta hospedera a los patógenos, implican de una u otra manera agentes alelo- péticos. No se incluye en la literatura debido a que la mayo rfa de los autores suponen que los compuestos químicos impli- cados en éstos no son liberados al ambiente; sin embargo las- fi toaI ex inae y otros compuestos producidos por el huésped en- tran al ambiente del patógeno. En cuanto al desarrollo y morfogénesis de los patógenos, éstos generalmente se propagan en forma de esporas u otro ti- po de propágulos que permanecen latentes hasta que invaden a- la planta huésped; estudios hechos por Bell (1977) dan eviden cía de la existencia de compuestos al elopátieos ya sea produ- cidos por el mismo propágulo o por el medio (planta) que pro- mueven o inhiben la germinación de los propágulos. Tal es el caso de sustancias volátiles producidas por la cebolla que — promueven la germinación de los esclerocios de Sclerotium ce- pivorum . En otro caso se demostró que eI etenoI supri me la - respuesta quimiotáctica de las zoosporas de Phytophtora cinaa 27 - tnomi # el etanol se encontró en la rizosfera de las red f cu las- de L U P Í ñ u s angustifolius. Otro tema muy interesante y de gran aplicación es el del antagonismo de patógenos por organismos no patógenos y plan - tas; hay evidencia de que muchas plantas secretan sustancias- ai medio que son fungistótices a organismos patógenos impi — diendo la germinación de los propágulos. Otro caso es el de- la actividad antagónica entre microorganismos, la cual puede- ser utilizada como un control biológico de las enfermedades - de las plantas; por ejemplo, el frijol puede ser protegido — contra la antracnosis producida por Coiletotrichum Iindemu — thianum, inoculando el suelo con otras especies de Col Ieto — trichum no patógenas al frijol (Rice, 1979). 9) Aplicaciones de la Alelopatfa en la Agricultura Varios autores han propuesto y de hecho ya se están uti- lizando compuestos naturales inhibidores al crecimiento de Ín_ sectos (como es el caso de las piretrinas del Crisantemo), de nematodos, hongos, bacterias y malezas (como puede ser el ma- nejo de los residuos vegetales, utilizando cultivos acompañan^ tes o variedades resistentes); este tipo de prácticas son muy beneficiosas ya que la toxicidad no es alta como la de algu - nos compuestos utilizados en el control qufmico y además de - que permiten la utilización de recursos naturales no aprove - chados hesta el momento. Ya se mencioneron algunos aspectos en el tema anterior.- 28 Para el control de malezas, se pueden tener varias alternati- vas, mencionadas por Putnam y Duke (1978): a) Utilizando cultivos que sean capaces de inhibir el — crecimiento de malezas (búsqueda en tipos silvestres). Pocas investigaciones se han hecho acerca del poten - cíal alelopático del germoplasma de plantas cultiva - das. Fay y Duke (1977) probaron el potencial al el opa tico de muchas variedades de Avena sativa, encontran- do varias Ifnees que inhibfan el crecimiento de male- zas, el compuesto fitotóxico aislado fue la escopola- tina. Putnam y Duke (1974), probaron una colección - del germoplasma de Cucumis sativus, encontrendo va — rias I¡neas inhibidoras. b) Utilización de cultivos acompañantes que sean al el opa ticamente selectivos y que no interfieran con el cre- cimiento del cultivo. c) Rotación de cultivos que provean de toxicidad a male- zas por algunos de los medios conocidos de liberación de toxinas, así como a organismos patógenos. d) Aislamiento e identificación de los compuestos alelo- páticos para su posible uso como herbicidas natura — I es, nemat i c i dea, fung i c i das e i nsect i c i das. e) Otra aplicación importante es le de conocer qué male- zas son alelopáticas, para hacer más efectiva su erra d i cae¡ón. DESCRIPCIÓN DE LA COMUNIDAD DE MATORRAL SUBMONTANO ESTU DIADA. Genera I¡dades El térníno Matorral Submontano es establecido por Rze — dowski (1966) y corresponde al Matorral Alto Subperennifolio- do Rojas Mendoza (1965), al "Piedmont Scrub" de Muller (1939) y al Matorral Subinerme Parvifoli o de Miranda y Hernández X (1963). Esta comunidad prospera en climas relativamente menos — áridos (450 a 900 mm anuales de precipitación) y raro vez so- brepasa los 2,000 m de altitud. Está distribuido a lo largo- de la Sierra Madre Oriental, desde Nuevo León hasta Hidalgo,- extendiéndose un poco hacia la Planicie Costera Noriental y - también hacia el Altiplano. Reaparece asimismo en forma algo modificada en Puebla y Oaxaca. Es un matorral generalmente inerme, alto (3 a 5 m de al- tura) y denso, más o menos perennifol io (perdiendo sus hojas- por un breve período de tiempo en le época de secas), se des¿ rrolle sobre suelos someros de laderas de cerros, en le mayo- ría de los casos formado por roca sedimentaria. El tamaño de le hoja o foliolo es en general mayor que en el caso de los - matorrales xerófilos y califica en promedio en la categoría - de nanófila de la clasificación de Raunkier de 1934 (citado - por Odum, 1972). Las dominantes varían de una región a otra, pero las más frecuentes son: Helietta parvifolia, Neopringlea i nteori foI i a. Gochnat i a hypoIeuca, P i theceIIobi um brevifoltum - 30 y Cordi a boi sai er i, González-Medrano (1972) lo encontró en pequeñas elevecio nes ubicadas en medio de la Planicie Costera de Tameul¡pas y- en la base de la Sierra Madre Oriental, siendo dominantes en- esa zona: Helietta. Neopr i ngIea y Acac i a y entre los géneros- acompañantes se citan: Amyr i a, Cercidium, Cordia, Gochnatia,- Karwinskia y Pithecellobium. En Coahuila, según Muller - - (1947) citado por Rzedowski (1978) Quercus fusiformis. Dios - pyros texana. BumeI i a lanuginosa y Sophora secundiflora son - las especies más importantes. En San Luis Potosí, el mato — rral de HeI i etta parvifoli a es el más frecuente de todas las- variantes sobre todo en la región del Altiplano (Rzedowski, - 1978). Rojas Mendoza (1965) dice que el Matorral Submontano en- Nuevo León cubre el 8% de la vegetación total y sus límites - altitudinales se encuentran entre los 600 y 800 m de altitud» Las plantas dominantes son de 4 a 6 m de altura, de hoja pe - quena y algunas deciduas breves, la cobertura total entre el- 45 y 65#. Hacia las partes más bajas se tienen especies del- matorral circundante aunque con una parte exuberante dominada por: Acac i a r i g i duI a (Chaparro prieto), Cord i a bo i ss j er i (Ana cahuita), Acacia farnesiana (Huízache); conforme se asciende- es más frecuente: Pithecellobium pal Iens (tenaza), Helietta - parvifoli a (Barreta), Leucanea puIvurenta (tepehuaje). Cae — sal pin ia mexicana (hierba del potro) y Leucaena IeucocephaI a (guajillo). En las partes más altas y protegidas aparecen — - 31 - los encinos Quercus fusi formi a y Q.canbyi, Descripción del área de estudio La zona escogida para el estudio del potencial alelopátj_ co de H.parvifoli a en el Matorral Submontano se encuentra lo cal izada en los lomeríos bajos que circundan la Presa de la - Boca a los lados de la carretera que conduce a la cortina de- la presa, en Villa de Santiago, N.L. El suelo es poco profundo aunque contiene una buena can- tidad de hojarasca. El clima es (A)C(x')(w)a(e) o sea semicá I¡do, con lluvias en invierno y lluvias intermedias (verano). Los meses más calurosos son Junio, Julio y Agosto con una tem peratura promedio de 28°C, mientras que los meses más fríos - son Diciembre y Enero con una temperatura promedio de 13°C. - Los vientos predominantes son de Oriente. La comunidad climax de este matorral submontano corres - ponde a un matorral bastante alto que sobrepasa los 6 m de aj_ tura, las ramas de estos se entremezclan dando el aspecto de- un matorral mucho más cerrado de lo que en realidad es. El estrato arbóreo es el que predomina, loselementos do minantes de gran altura son: Neopr inalea integrifol¡a (Sapindaceae) Acac i a r i g i duI a (Leguminosae) Helietta parvifoli a (Rutaceae) - 32 Pithecellobium pal Iens (Leguminosae) ¿anthoxyIum fagara (Rutaceae) En menor número pero alcanzando gran altura: Rendía Iaetevi rens (Rubiaceae) Cord i a bo i ss i er i (Boraginaceae) Sargenti a prega i (Rutaceae) Ehret i a anacua (Boragineceae) De menor número y porte: Celtis spinosa var.pal I ida (Ulma ceae) e Indigofera sufrutescens (Leguminosas). El estrato herbáceo está constituido por: heléchos como Chei - I antes sp.. Pe11ea ovata, PoI ypod i um poIypod i o i. Otras herbáceas son: D i condra carolinensis. Par i etar i a penn - svlvanica. Plantago virginica. Trepadoras como: AristoJochía sp., Ipomoea sp. Centrosorna virgin ianum, OpercuI i na dissecata. Gramíneas: Lasiacis divaricatus, Oplismenus Iintelus. Paspa - Ium sp. Compuestas: Calyptocarpus vial i s, Eupatorium odora - tum, Pérez i a runcinata. Labiadas: Scutellar i a sp., Salv ia — sp», Teucrium cúbense. Otros componentes son: Caps i cum fru - •fceacens. Karwinskia humboIdt i ana. Lantana careara (MeI goza, — 1977). Descripción de Heli etta parvifoli a (Gray) Bsnth. Barreta (n. común). Arbustos sin espinas, de 2 a 4 m. - de alto; hojas opuestas, trifoliadas, de 35-50 mm de largo, - en su mayoría glabras. Hojas sésiles o casi sésiles, generaj_ mente obtongadas u ovadas, redondeadas en el ápice; flores en - 33 - panículas terminales, perfectas y pequeñas; el cáliz secciona do en 3 6 4 partes, de 2 mm de ancho con 3 6 4 pétalos, imbrj_ cados en botón, elípticos de 2.5 a 3 mm de largo. Tres o cua_ tro estambres, ovarios de 3 a 4 lóbulos, frutos con 3 a 4 car pelos indehiscentes de tipo samara, que se separan en la roadu rez; alados en la parte dorsal, de 10-15 mm de largo, con 2 - óvulos en cada cavidad, pero las semillas solitarias al libe- rarse. Confinada a colinas de grava y roca, se distribuye a- unos cuantos kilómetros ai este del Río Grande, en el extremo sur de Texas, en donde originalmente era muy abundante. Tam- bién se encuentra en Hidalgo, San Luis Potosí, Tamaulipas y - Nuevo León, México (CorreII y Johnston, 1970). METODOLOGÍA La presente investigación se llevó a cabo en los labora- torios de Fisiología Vegetal y Ecología de la Unidad de Gra - duados de Agricultura del Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey y en el lugar de estudio de la común¿ dad de Matorral Submontano que se encuentra rodeando a la Pre sa de la Boca en Villa de Santiago, N.L.; durante el período- comprendido entre el 1 de Junio de 1979 y el 15 de Mayo de — 1980. El objetivo general Fue estudiar el potencial alelopáti- co de HeI i etta parvifoli a. El trabajo consistió en la real iza ción de veri os bioensayos sobre germinación de semillas de — pIantas cultivadas y crecimiento de hongos y bacterias utili- zando diversos extractos de la planta a nivel del laborato — rio. En el campo se hizo un análisis de la vegetación del Iu_ gar. Se discuten las posibles aplicaciones prácticas de Ios- resultados obtenidos. A continuación se detalla la metodología. I.- Extractos ut i 1 izados A.- Extractos crudos Se obtienen el moler 100 gramos de hojas frescas de I I . parvifolia en 1000 mi de agua destilada (10%), también se pre pararon al Se hicieron además extractos crudos de hojas- jóvenes y maduras de esta especie, para observar si existía - una diferencia entre éstos, en cuanto a la producción de ale- Iopáticos. A todos los extractos se.les midió la presión os- 35 - «ótica Mediante el método de Shardakov, que se basa, en que se puede conocer la presión osmótica de una solución x, si se po ne una gota de éste dentro de soluciones de molar¡dad conoci- da y se observa el comportamiento de la gota, si ésta es más- densa que la solución mayor es su presión osmótica, si es me- nos dense es menor su presión osmótica, si difunde es igual la concentración de solutos en las dos. También se midió el pH en un potenciómetro, obteniendo que: un extracto crudo de ho- jas de H.parvifoli a tiene una presión osmótica entre 50 y 25 miliosmoles y un pH=6.8 y un extracto al 5% tiene una presión osmótica menor de 25 miliosmoles, lo cual basándose en las in vestigaciones de Bell (1974) significa que no presentarán un- efecto osmótico e interfirán con los resultados, soluciones - que tengan concentraciones mayores a 75 miliosmoles si tienen ya un efecto osmótico sobre la germinación o el desarrollo de mi croorgan i smos• B.- Extractos acuosos Se obtienen al remojar 30 gramos de hojas frescas en un- I i tro de agua por dos horas. C.- Agua de lluvia y concentrado clorofórmico de ésta Para obtener el agua de lluvia, se hizo una lluvia arti- ficial sobre plantas de H.parvifolia en el campo, ésta se pro bó en bioensayos sobre germinación de semillas de plantas cuj_ tivedas y los resultados fueron negativos; por lo que se pro- cedió a concentrar esta agua de lluvia con algún solvente or- - 36 - gánico, como el cloroformo. Para esto se mezclaron por par - tes ¡guales el cloroformo con el agua de lluvia en un embudo- de separación, se agitó por 10 minutos y se separaron las fa- ses, se obtuvo el solvente con las posibles sustancias arras- tradas por éste, se evaporó el solvente en un rotavapor, se - pesó el sobrante y se reconstituyó con agua destilada para — probarlo en los bioensayos a 100 ppm (la obtención del concen trado clorofórmico puede observarse en la figura 3 ) - Por - - otro lado se realizó una cromatografía al concentrado cloro - fórmico utilizando el sistema bencenoacetona (9:1) y se reve- ló con Dragendorff, que es positivo a alcaloides. 0.- Aceite esencial El aceite esencial de H.parvifoli a fue facilitado por el Laboratorio de Fitoquímica del ITESM, obteniéndose por arras- tre de vapor de las hojas de H.parvifoli a. Este método consis te en volatilizar una sustancia que es insoluble o práctica - mente insoluble en agua pasando vapor por una mezcla del com- puesto más agua. Esta sustancia puede ser fácilmente separa- da del líquido destilado puesto que.no es miscible en agua. - La presión osmótica del aceite esencial no excede de 50 mi- - I iosmoles a 25°C. http://que.no - 37 - Figura 3. Obtención del concentrado clorofórmico de lluvia de H.parvifoli a Helietta parvifolia Aerea r 11uv i a art i f i c i a I r Agua de lluvia — - — Bioensayo Extracción con cloroformo (embudo de separación) Extracto soluble en cIoroformo Extracto soluble en agua Concentrado en rotavapor Cromatografía sistema benceno-acetona (9 : 1 ) revelada con Dragendorff Bioensayo - 38 - E.- Sustancias volátiles Para probar los efectos de las sustancias volátiles de - H.parvifolia. se siguió la metodología de Hoffman y Hazlett - ( 1 9 7 7 ) , que consistió en poner 5 gramos de hojas frescas hume decides de esta planta en una caja de petrí abierta dentro de un recipiente de plástico, alrededor de asta se colocaron - - otras cajas de petri abiertas con semillas de diversas plan - tea cultivadas sobre papel filtro humedecido. Para mantener- la humedad en el recipiente se puso agua en el fondo del recj_ píente de plástico y las cajas se mantenían sobre el agua con pequeños botes de plástico. El recipiente se cubrió con un - vidrio y se selló con petrolato. El testigo se construyó de- igual manera. Las cámaras se colocaron en el laboratorio a - temperatura y luz ambiente y se tomaron datos a los 4 y 8 - - días. F.- Extractos obtenidos con solventes orgánicos Se realizó una secuencia de extracción con diferentes — solventes orgánicos (etanol, cloroformo, éter de petróleo) de las hojas de H.parvifolia. Estos extractos fueron facilita - dos por el laboratorio de Fitoqufmica del ITESM. Todos los - extractos fueron probados en bioensayos sobre germinación de- semillas. El diagrama que muestrala secuencia de extracción con solventes orgánicos puede ser observado en la figura 4 . - También se realizó una cromatografía utilizando el sisteme — benceno-acetona ( 7 : 3 ) y revelada con Oragendorff y cloruro de - 39 - Figura 4. Diagrama que muestra la secuencia de extracción — con diferentes solventes orgánicos de las hojas de H.parvifolia Heli etta parvifoli a Hojas — — E x t r a c c i ó n con etanol Extracto etanólico —--B¡oensayo •Extracción eloroformo/agua (3:1) Soluble en cloroformo B¡oensayo Soluble en agua Bioensayo -—Extracción éter de petróleo Soluble en éter de petreleo — — B i o e n s a y o Insoluble en éter de petróleo -—Bioensayo - 40 - cobalto; los resultados de ésta pueden ser observados en la - figura 5 en resultados. II.- Pruebas de Germinación A.- SemiI las Se trató en un principio de utilizar semillas de la comu nidad de H.pervifoli a para los bioensayos, pero éstas tenían- una viabilidad muy baja y necesitaban de varios tratamientos- para poder germinar; por lo que se decidió utilizar semillas- de plantas cultivadas como: frijol (Phaseolus vulgari a ) , maíz (Zea mays), cebolI a (Al Iium cepa), rábano (Raphanus sat ivus), jitomate (Lycopersicon esculentum) y calabaza (Cucurbita pe - p o ) , que tuvieran alta viabilidad, rápida germinación y que - fueren certificadas. Además se usó semilla certificada del - Zacate Bermuda (Cvnodon dactylon). Todas las semillas se ponían a remojar por dos horas an tes del bioensayo, con el fin de remojar la testa y se desin fectaban con hipoclorito de sodio al 5% por 5 minutos y se ta vaban con agua destilada estéril. B«- Bioensayos Todo el material de vidrio era esterilizado en el auto - clave (15 Iba x 15 min). Para los bioensayos con los extractos crudos, acuosos y- - 41 - el concentrado clorofórmico de lluvia se utilizó la técnica - del papel filtro (Whatman # l) impregnado con el extracto. p£ ra los bioensayos con los aceites esenciales y los extractos- obtenidos con solventes orgánicos (etanol, cloroformo y éter- de petróleo) se probaba a 100 ppm mezclado con agar al 2%. Pa ra las sustancias volátiles ya se explicó anteriormente. So- pón fan 10 semillas por caja cuando éstas eran de un tamaño — considerable (frijol, maíz, calabaza, rábano y cebolla) y 100 semillas por caja en el caso del jitomate y el zacate bermu - da. Se tenían 3 repeticiones por tratamiento. Las cajas de- petri se sellaban con durex y se ponían en una cámara de cre- cimiento a 25°C por 72 horas, pasadas las cuales se tomaban - los datos de: porciento de germinación, longitud del tallo y- longitud de la radícula y se hacían observaciones acerca del- aspecto de la plántula. III.- Pruebas con microorganismos del suelo A.- Aislamiento Se tomó una muestra de suelo de la comunidad de H.parvi- fol¡a y se siguió el método de dilución en placa para obtener los microorganismos del suelo, que consiste en pesar una can- tidad conocida de suelo (l gramo) y diluirlo en agua destila- da estéril (10 m i ) , de esta dilución inicial se toma un mi y- se pasa a otro tubo y así sucesivamente, con esto se obtienen diluciones: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:1000,000 (Pramer 1974). Una vez obtenidas las diluciones se toma una muestra- - 42 - de 1 mi de cada uno de los tubos y se siembra en las cajas de petri que contienen el medio apropiado para el aislamiento de hongos o de bacterias, el medio debe estar líquido pero frfo- al realizar la siembra. Pera el aislamiento de hongos ee utilizó el medio rosa - de bengala que se prepara de la siguiente manera: .5 gramos .5 gramos .5 gramos 10 gramos .5 gramos .05 gramos .03 gramos 17 gramos 1000 mi Se esteriliza el medio sin la estreptomicina y ésta se - añade justo antes de que solidifique el medio. Es un medio excelente para aislar hongos del suelo y par tes de plantea, la estreptomicina retarda el crecimiento de - bacterias y el rosa de bengala disminuye el crecimiento de los hongos de rápido crecimiento (Al Ien,1959). Pera el aislamiento de bacterias se usó agar nutritivo - K H 2 P 0 4 M g S 0 4 . 7 H 2 0 _ Peptona _ _ _ _ _ Oextrosa _ Extracto de Ievadura Rosa Bengala Estreptomicina Agar Agua desti Iada 43 - (Richards,1974). Las cajas ya sembradas y selladas se metieron en una cá- mara de crecimiento a 25°C, 24 horas las bacterias y 72 horas los hongos. Una vez crecidas tas colonias, se aislaron las - •tés evidentes y se volvieron a sembrar, los hongos en medio - PDA y las bacterias en agar nutritivo, hasta obtener cultivos puros de éstas. Se procedió a su identificación al microscopio, obteniejn do los siguientes géneros de hongos: Botrytis sp., Fusarium - sp., Rh i Z O P U S stolonifer y 4 especies de Aspergi M u s : paras i - tica, fIavus. ochraceus y una de la serie niger. En cuanto a las bacterias fue posible identificar 3 gene, r o * ! Bac i 11uso Arthrobacter y Agrobacteri um, todas estas aon- muy abundantes en las muestras de suelo y son mesÓftlas. B.- Bioensayos Sobre los hongos y bacterias a i alados del suelo se proba ron el aceite esencial y el concentrado clorofórmico de l l u - via de H.parvifol¡a. Para probar estos extractos, se hicieron discos de papel filtro Whatman # 1 , de 6 mm de diámetro y se impregnaron con- la sustancia a probar, se pusieron dos discos por caja. Se - sembraron los hongos en cajas de petri conteniendo PDA y para las bacterias agar nutritivo. - 44 La actividad fungicida y anti bacteriana fue medida en términos de zonas de inhibición alrededor de los discos de pa peí filtro, pasadas de 24 a 48 horas para las bacterias y 96 horas para los hongos. Se siguió la metodología de Jain y — Kar (1971) y de Averett et al (1978) . IV.- Análisis de la Vegetación Se realizó un muestreo de la vegetación arbórea y arbus tiva del lugar, mediante el uso de un transecto de 25 metros- (se realizaron 4 de éstos) y para la vegetación herbácea se - utilizó un cuadro de un metro (se realizaron 2 de éstos). Se colectó el material muestreado y se identificó con la ayuda - de ejemplares de herbario y con la ayuda prestada por el Biól. Gernónimo Cano y el Biól. Raúl Garza Cuevas del Oepto. de Bio logfa del ITESM. Se analizaron los datos obtenidos en el - - muestreo para obtener los valores de importancia de las espe cies arbóreas y arbustivas de la comunidad, según le métodolo gfa de Cox ( 1 9 7 6 ) . Nota: Los resultados obtenidos en las pruebas sobre germina — ciÓn de semillas fueron analizados estadísticamente, utilizan do la prueba f o de Fisher, con un nivel de significación del 5% y del 12. RESULTADOS 1 . - Bioensayos sobre germinación de semi l las Los resul tados obtenidos en los bioensayos sobre germina^ ción de semi l las fueron los s igu ien tes : En general todos los tratamientos fueron inh ib idores s i g n i f ¡ca t ivamente, al menos para alguna de las especies u t i l i z a das. Esta inh ib ic ión está dada por una reducción general en- el porcentaje de germinación, inh ib ic ión del crecimiento radj_ cular ( r a f z pr inc ipa l y la tera les) e inh ib ic ión del cree i mi en to del ta l Io . Es de hacerse notar que entre las especies usadas, unas- fueron siempre más to le rantes , como el maíz, otras muy poco - to le ran tes , como el j i tomate y otras como el f r i j o l que en gunos casos era inh ib ida , en otras estimulada y en otros no - presentaba efecto alguno, por lo que se considera que esta es_ pecíe es representat iva de los resul tados. La primera prueba rea l izada fue la de los bioensayos so- bre germinación de semil las (maíz, f r i j o l y j i tomate) ú t i l i - zando las f racciones obtenidas con los d i fe rentes solventes - orgánicos (e tanot , cloroformo y éter de pe t ró leo ) . Esta p r i - mera prueba tenía por objeto el ras t rear o encontrar la f r a c - ción más inh ib idora para hacer
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