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Brucelosis canina Pocas enfermedades en medicina veterinaria son tan desconcertantes como la brucelosis. “Lo único predecible en la brucelosis es su impredictibilidad”; este concepto es compartido por especialistas en brucelosis en todas las especies tanto animales como seres humanos. Los perros no son una excepción y hay cuatro causas coexistentes que llevan a esta situación: 1. Algunos animales no presentan síntomas a pesar de estar enfermos. 2. Si bien algunos perros se han curado mediante tratamientos antibióticos, ninguno de estos tratamientos ha probado ser eficaz en el 100% de los animales tratados. 3. No hay ningún método diagnóstico que asegure salud. 4. Las pérdidas económicas que causa la enfermedad en perros de cría hacen que los propietarios se resistan a reconocer su presencia y a seguir los pasos necesarios para eliminarla definitivamente del criadero lo que lleva a que se perpetúe en el ambiente. AGENTE ETIOLÓGICO La brucelosis es una zoonosis que afecta a la mayoría de las especies domésticas. El género Brucella está compuesto por varias especies genéticamente muy emparentadas, de modo que taxonómicamente se consideran todas como biovares de la Brucella mellitensis que fue la primera en identificarse. Sin embargo, se ha acordado seguir denominando a estos biovares como especies diferentes. Cada una de estas especies afecta preferentemente a una especie de mamíferos, aunque ocasionalmente pueda atacar a otras. Las especies de Brucella conocidas hasta el momento son B. mellitensis que afecta a las cabras, B. abortus, a los bovinos, B. suis a los cerdos, B. ovis a los ovinos, B. canis a los cánidos, B. neotomae a los roedores y más recientemente se han identificado dos especies más que afectan a mamíferos marinos: B. cetaceae y B. pinnipediae que afectan a cetáceos y pinnípedos respectivamente22,19. Si bien los perros pueden ser afectados por B. mellitensis, B. abortus, B. suis y B. canis, es esta última especie la más importante epidemiológicamente ya que se contagia de perro a perro y se difunde rápidamente en poblaciones caninas que conviven, mientras que las infecciones por las otras brucellas se adquieren por ingestión de leche, quesos o carne contaminados así como placentas y fetos abortados por el ganado y no se transmiten de un perro a otro. La Brucella canis fue aislada por primera vez en Estados Unidos en 1966 por Leland Carmichael5, cuando se produjo una explosión de abortos en criaderos de Beagles. Es un cocobacilo Gram negativo que se diferencia de las otras especies del género Brucella (salvo B. ovis) en que forma colonias rugosas6 debido a la falta de la cadena O en el LPS de su membrana externa ESPECIES SUSCEPTIBLES La Brucella canis afecta a los perros, cánidos salvajes y al ser humano, constituyendo de esta manera una zoonosis, aspecto a tener en cuenta cuando se está en presencia de un animal enfermo o de material posiblemente infectante, sea en el ambiente donde vive o en el laboratorio donde se procesan las muestras bacteriológicas. No se ha observado preferencia de sexo22. En cuanto a las razas, la enfermedad apareció por primera vez en beagles, y al ser de transmisión sexual se difundió rápidamente en la raza, pero no bien beagles enfermos fueron adquiridos por criaderos que tenían otras razas, la enfermedad comenzó a verse en ellas sin preferencia racial. Se menciona alguna mayor incidencia en labradores22, pero en mi experiencia, en cualquier criadero que tenga varias razas y donde no se han tenido recaudos de higiene e aislamiento ante la aparición del primer animal enfermo, la afección se ha extendido rápidamente, afectando a todos los animales expuestos sin distinción de raza. VÍAS DE TRANSMISIÓN La Brucella puede penetrar en el organismo por cualquier mucosa: oronasal, conjuntival o genital y además puede pasar a través de la placenta22,61,42, de modo que un cachorro nacido por cesárea de una madre brucelosa y separado inmediatamente, puede estar infectado sin haber tenido ningún otro contacto con la bacteria. Las dosis infectantes varían según la vía de entrada: por mucosa oral, nasal, se necesitan 106 bacterias para infectar a un animal11, mientras que por vía conjuntival la dosis infectante es de 104 bacterias16; sin embargo es muy difícil que el material infectante alcance la conjuntiva en forma natural, mientras que el lamido u olfateo de material infectante son frecuentes. En perras, se han logrado infecciones experimentales inoculando solamente 10-50 unidades formadoras de colonias en la vagina anterior (Carmichael, comunicación personal). Es importante recalcar entonces que no es necesario un servicio para infectar a un perro, y que animales vírgenes pueden estar infectados. Las vías de eliminación varían de acuerdo al sexo del animal: las hembras eliminan las bacterias con las secreciones vaginales, tanto durante el celo como en el pos- parto o pos-aborto. El material más peligroso por su concentración bacteriana son los loquios. Se han encontrado concentraciones de hasta 1010 bacterias/ml de secreción22, lo que constituye 10.000 dosis infectantes (vía oro nasal) por ml. Esto hace que la dispersión ambiental después de un aborto sea enorme, y que deban extremarse las precauciones a tomar en estos casos. Es muy fácil que se infecte un perro de un canil vecino, y pueden llevarse bacterias de un canil a otro en la ropa, calzado, bebederos, comederos, compartiendo material de limpieza, etc. La leche tiene una concentración elevada de bacterias; sin embargo como los cachorros ya se infectan a través de la placenta y además al pasar por el canal vaginal y compartiendo el ambiente de la madre durante la lactancia, la importancia epidemiológica de la eliminación de la bacteria por leche se reduce a los casos donde se administra leche de una perra brucelosa a cachorros huérfanos que no conviven con ella. Los machos eliminan bacterias por el semen, de modo que infectan a la hembra tanto por un servicio natural como por inseminación artificial, mientras que la contaminación ambiental por semen es poco frecuente. Tanto hembras como machos eliminan bacterias por orina, pero la concentración bacteriana en el macho es mayor (hasta 106 bacterias por ml de orina)11,53,54. Según la literatura, las hembras que no están en celo ni en posparto no son capaces de contagiar a otros perros, mientras que se han descripto contagios entre machos a través de la orina11,53. Sin embargo, estos estudios se realizaron poniendo en cohabitación estrecha machos infectados enteros con machos sanos. Estudios recientes donde se ha cultivado la orina de machos infectados antes y después de la castración han demostrado que el uro cultivo se torna negativo o la concentración bacteriana en la orina disminuye significativamente al castrar ya que se elimina el contacto con la orina con los testículos y epidídimos, y también se atrofia la próstata65. Se han encontrado cantidades no significativas de bacterias en saliva, heces y secreciones nasales y oculares en concentraciones bajas que les quitan importancia como fuente de infección66. B. canis puede diseminarse por medio de fomites. En condiciones de mucha humedad, bajas temperaturas y falta de sol, la Brucella puede permanecer viable durante varios meses en el agua, heces, fetos abortados, equipo y ropa. Puede resistir la desecación si hay presencia de materia orgánica y puede sobrevivir en el polvo y en el suelo. El tiempo de supervivencia es mayor si la temperatura es baja, sobre todo bajo cero24. PATOGENIA Las bacterias penetran por las mucosas, son fagocitadas por los macrófagos y neutrófilos y son llevadas a los ganglios regionales donde se replican. Son bacterias intracelulares que tienen mecanismos que evaden su destrucción una vez fagocitadas12,15,23 , por lo cual la inmunidad humoral no eseficaz en la curación del animal. Una a cuatro semanas después de la infección, se produce una bacteriemia que según la literatura es constante durante los primeros seis meses pos infección tornándose luego intermitente durante hasta 64 meses22. Sin embargo, en mi experiencia personal he tenido casos de infecciones recientes ya serológicamente positivos donde no logramos aislar la bacteria. A través de la sangre, las bacterias llegan a los órganos blanco donde se alojan, produciendo los síntomas característicos de la brucelosis: abortos, cuando llegan a un útero grávido, epididimitis, orquitis y prostatitis en el aparato genital masculino, discoespondilitis en los discos intervertebrales, uveítis recidivante en el ojo, glomerulonefritis en el riñón, y meningoencefalitis en el sistema nervioso central. Algunos animales se han recuperado espontáneamente luego de uno a 5 años de enfermedad, gracias al desarrollo de una inmunidad humoral y son resistentes a reinfecciones22. Patogénesis de la brucelosis canina SIGNOS CLÍNICOS Los perros infectados de brucelosis pueden presentar síntomas variados de acuerdo al órgano afectado, y además pueden no presentar ningún síntoma evidente y aun así estar infectados y diseminar la enfermedad. En un estudio realizado sobre 328 perros positivos, un 28% no había presentado ningún síntoma clínico63. SECRECIONES VAGINALES ORINA SEMEN MUCOSA CONJUNTIVAL MUCOSA ORONASAL MUCOSA GENITAL FAGOCITOSIS GANGLIOS BACTERIEMIA OJO APARATO GENITAL HEMBRA MACHO UTERO EPIDIDIMOS CACHORROS PROSTATA TESTICULOS DISCO INTERVERTEBRAL El aparato genital es el lugar preferido por las brucellas, de modo que los signos más comunes se presentan en él. El más evidente y que inmediatamente lleva a sospechar la presencia de brucelosis es el aborto de fetos muertos entre los 45 y los 60 días de gestación7. Los fetos suelen estar parcialmente autolisados y presentan edema subcutáneo y líquido peritoneal hemorrágico. Con frecuencia son ingeridos por la madre y lo único que se observa es una descarga amarronada que puede durar de 1 a 6 semanas. Luego de un primer aborto pos infección, la perra puede parir a término cachorros muertos o débiles que mueren en pocos días; algunos pueden sobrevivir y son portadores de la enfermedad que se manifiesta claramente después de la pubertad. Puede ocurrir infertilidad que está asociada a reabsorción temprana y también nacimiento de camadas aparentemente normales que en realidad nacen infectadas. Las perras pueden parir una camada aparentemente normal seguida de un nuevo aborto22. Los abortos se deben a una necrosis placentaria que produce la muerte de los fetos in útero Figura1. Figura 1 a. Aborto de una perra bull dog de 50 días de gestación. b. Placenta necrótica de uno de los cachorros anteriores. c. Placentas de estructura normal. En los machos el órgano más comúnmente afectado es el epidídimo. En ocasiones, la epididimitis se observa en forma aguda (Figura 2). y se acompaña de mucho dolor y a veces fiebre, mientras que en otros casos la inflamación del epidídimo es gradual. a b c Figura 2. Epididimitis aguda. El epidídimo está muy aumentado de tamaño y presenta alteraciones en su parénquima. (gentileza del Dr. L. Carmichael) El macho lame intensamente el escroto lo que produce dermatitis escrotales por lamido, generalmente contaminadas por piógenos (Figura3). Figura 3. Dermatitis escrotal aguda por lamido secundaria a una epididimitis por Brucella Algunas veces se presenta también orquitis, pero en la mayor parte de los casos solo el epidídimo se encuentra afectado. Las lesiones del epidídimo son graves y permiten el contacto del material espermático con el sistema inmune, que reacciona formando anticuerpos antiespermáticos que se pueden detectar tanto en el plasma seminal como en el suero sanguíneo a partir de las 14 semanas pos infección55. Esto se refleja en el semen, donde podemos encontrar presencia de macrófagos y aglutinación cabeza a cabeza de los espermatozoides. Otras alteraciones que se encuentran son colas enrolladas, acrosomas desprendidos, y finalmente azoospermia que acompaña a una atrofia testicular. (Figura 4). Figura 4. Semen canino. A. espermatozoides normales. B Eyaculado de un perro bruceloso a las 20 semanas posinfección: pueden verse colas enrolladas (a), espermatozoides sin acrosoma (b), cabezas desprendidas (c), macrófagos (d), y aglutinación espermática (gentileza del Dr. L. Carmichael) Algunas veces, después de unos meses el semen vuelve a la normalidad y el perro puede recuperar su fertilidad aunque continúa diseminando la bacteria. La próstata también puede verse afectada. Fuera del aparato genital, el signo que más frecuentemente se presenta es la discoespondilitis, que generalmente afecta a más de una vértebra. (Figura 5) A c b a B e d Figura 5. Discoespondilitis L1-2 y L2-3. Se observa esclerosis ósea e las placas terminales L1-2 y L2-3 con lesión osteolítica en el centro de cada una de ellas (gentileza Dr. Jorge Waldhorn). El animal se presenta con dolor que cede rápidamente al tratamiento antibiótico, pero las recaídas son frecuentes. Además, muchas veces, a pesar de la remisión de los síntomas las lesiones radiológicas permanecen activas34,36. Puede desarrollarse paresia y ataxia si hay compresión medular38. La uveítis anterior es Figura 6 Uveitis anterior. A. 1. Se observan hiperemia, hipopion, edema corneal, discoria, y cambios de coloración del iris. B. puede verse marcada inyección epiescleral, hiphema, edema corneal leve. Gentileza Dra. Nélida Gómez. La bacteria puede aislarse del humor acuoso de los perros que sufren esta lesión, y pueden encontrarse anticuerpos contra la bacteria. La reacción antígeno anticuerpo A B que se produce es responsable de la opacidad que se desarrolla en la cámara anterior del ojo. Es frecuente la linfadenitis de los ganglios retrofaríngeos e inguinales (de acuerdo a la vía de entrada, pudiendo presentarse en forma generalizada22.Otros signos descriptos son meningoencefalitis, glomerulonefritis y dermatitis poligranulomatosa. MÉTODOS DIAGNÓSTICOS El diagnóstico de la brucelosis canina constituye un serio problema, dado que ningún método ensayado hasta el presente permite alcanzar al mismo tiempo altos niveles de especificidad y sensibilidad, e invariablemente al mejorar una de ellas desmejora la otra. El diagnóstico se sospecha por la presencia de signos clínicos compatibles con brucelosis o por la convivencia con animales enfermos, se confirma parcialmente por serología y en un 100% por bacteriología. Todos los signos de brucelosis pueden deberse a otras enfermedades, sin embargo la presencia de abortos tardíos, epididimitis, prostatitis, infertilidad, discoespondilitis, uveítis anterior y linfadenopatías generalizadas, debe hacernos buscar la enfermedad y descartarla antes de buscar otras causas63. Los exámenes de rutina como hemograma, perfiles bioquímicos y análisis de orina, casi siempre son normales. Ocasionalmente pueden notarse signos no específicos que sugieren una enfermedad inflamatoria, como leucocitosis, neutrofilia, hiperglobulinemia e hipoalbunoimenia15. El aislamiento bacteriológico constituye el único método diagnóstico 100% específico. Si bien el aislamiento puede hacerse en diferentes muestras, el hemocultivo es la técnica más utilizada, pero su sensibilidad es baja debido, en parte, a que pasado el período agudo B. canis solo aparece en circulación en forma intermitente68. Aunque menos específicos, los métodos serológicos son más sensibles, rápidos y sencillos que los bacteriológicos, por lo cual constituyen el método diagnóstico más utilizado. SEROLOGÍA Hay diferentes tests serológicospara detectar anticuerpos contra Brucella, y en casi todos ellos podemos utilizar diferentes antígenos. Estos pueden provenir de la membrana celular o de proteínas citoplasmáticas de la bacteria. La estructura de la membrana celular de las cepas lisas y rugosas de Brucella es diferente: las cepas lisas tienen la cadena O en su LPS(3) y los antígenos hechos con ellas no tienen reacción cruzada con B. canis. Figura 7. Figura 7. Estructura de la pared celular de cepas lisas y rugosas de Brucella. Las cepas rugosas carecen de la cadena “O” del LPS. OMP: proteínas de la membrana externa. Reproducido de “Brucelosis animal”, Blasco J.M. y Gamazo C. Investigación y Ciencia (1994), 218: 56-62 (3). El antígeno para detectar anticuerpos contra la membrana celular, puede obtenerse de la B. Ovis, de la cepa patógena de B. canis (RM 6/66) o de la cepa menos mucosa (M-) de B. Canis descripta por L. Carmichael en 19838 pero mientras que los antígenos obtenidos de B. ovis o de B. canis RM 6/66 pueden dar hasta un 62% de reacciones falsas positivas, en los realizados con cepa M- este porcentaje se reduce a un 10%, atribuido principalmente a reactividad cruzada con antígenos externos de P. aeruginosa y Staphylococcus spp.9,10,68, es decir son mucho más específicos sin perder sensibilidad. Los anticuerpos contra antígenos de membrana comienzan a ser detectables en algunos casos a las dos semanas pos-infección, pero a veces recién pueden detectarse a los tres meses de la exposición,17,68 de modo que para asegurarse de que un perro expuesto no se ha infectado, hay que seguir haciendo tests hasta tres meses después del contacto y es la razón por la que una cuarentena de un ejemplar recién adquirido debe tener esa duración, así como los controles en criaderos infectados donde se han retirado todos los perros positivos. Por otro lado, las proteínas citoplasmáticas no difieren entre las cepas de Brucella y se puede utilizar un extracto citoplasmástico de B. abortus como antígeno para brucelosis canina. Este tipo de antígenos es específico, pero la sensibilidad es menor, y la aparición de los anticuerpos contra proteínas citoplasmáticas es más tardía68. Los tests serológicos utilizados son: Aglutinación rápida en placa sin y con el agregado de 2ME (antígeno de pared) Aglutinación en tubo (antígeno de pared) Inmunodifusión en agar-gel (antígeno de pared o proteína citoplasmática) ELISA (antígeno de pared o proteína citoplasmática) Inmunocromatografía (antígeno de pared) Inmunofluorescencia indirecta (antígeno de pared) Aglutinación rápida en placa.(RSAT, 2ME-RSAT) Es la prueba utilizada con más frecuencia para detectar anticuerpos contra B. canis. Es muy sensible y los falsos negativos encontrados se deben habitualmente a infecciones tempranas, antes de que se desarrollen anticuerpos contra la enfermedad y en infecciones crónicas donde los títulos de anticuerpos circulantes son bajos22. Los falsos positivos se deben a reaciones cruzadas con Pseudomonas aeruginosa, Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus equuli, Streptococcus, Staphylococcus, y Morexella, con las que B. canis comparte antígenos de superficie.22,23,24 El antígeno que utiliza esta prueba es de membrana, de modo que debe utilizar obligatoriamente una cepa lisa, preferentemente B. canis M-.10 La técnica es sencilla y rápida. Consiste en poner una gota de suero en contacto con una de antígeno y mirarlas al microscopio a los dos minutos. El resultado puede calificarse según el grado de aglutinación con una a cuatro cruces (fig8). Figura 8. Prueba de aglutinación rápida en placa. (a) Resultado negativo: no se observan signos de aglutinación. (b) Resultado positivo: se observa una fuerte aglutinación del antígeno. Cuando el resultado de la aglutinación directa es positivo, hay que repetir la reacción tratando previamente el suero con 2-mercapto etanol (2ME). Este químico a b destruye las IgM, responsables de la mayor parte de las reacciones cruzadas con otras bacterias. Si el suero tratado no aglutina, el resultado se informa como “falso positivo”; sin embargo la presencia de IgM sin IgG puede deberse a que la enfermedad está en una etapa muy temprana. Para descartar esta posibilidad, la reacción debe repetirse a los 15 días, para dar tiempo a las IgM a hacer el switch a IgG, en cuyo caso al repetir la reacción dará positiva con y sin 2ME. Algoritmo de procedimiento frente a una prueba de RSAT positiva hasta confirmar resultado de aglutinación positiva. Aglutinación en tubo (TAT, 2ME-TAT) Tiene los mismos problemas de especificidad que el RSAT y el procedimiento es más complejo. Tiene la ventaja de ser semicuantitativo. Un perro se considera positivo con un título de 1/200 o superior 44,47,50. Inmunodifusión en agar-gel. Este test puede realizarse utilizando como antígeno pared celular o proteína citoplasmática. Con antígeno de pared, pueden presentarse los mismos problemas de especificidad que en las pruebas anteriormente mencionadas, pero si se la corre Resultado “Falso +” Es negativa Suero puro + Con 2ME - Resultado - Resultado - Resultado + Sigue + Resultado + Repetir a los 15 días Suero puro + Con 2ME + Suero puro - Con 2ME - Aglutinación rápida en placa (RSAT) positiva Repetir con 2ME (destruye las IgM) (2ME-RSAT) con suero control positivo, puede distinguirse una diferencia entre las bandas de precipitación del suero positivo y del falso positivo. El antígeno realizado con proteína citoplasmática es altamente específico, ya que solo presenta reacciones cruzadas con otras especies del género Brucella9. La prueba comienza a dar positiva recién a los 5-10 semanas pos-infección, y se mantiene positiva varios meses después de que la bacteriemia ha cesado. La desventaja de este método es que no es muy sensible y detecta anticuerpos tardíamente (Green). (Fig 9). Figura 9. Test de inmunodifusión en agar-gel. a. Antígeno. b. controles positivos. c. test positivo. d. test negativo. Nótese cómo la línea de algutinación del test positivo se curva y se une a la del control positivo ELISA Este test puede realizarse utilizando como antígeno extracto salino en caliente (HS) que tiene básicamente pared celular, o un extracto de proteína citoplasmática libre de LPS (CP)2,14,18,39,59,60. El ELISA HS, es altamente sensible, aunque puede dar a b c d b b b algunos falsos positivos, mientras que el CP es altamente específico, pudiendo dar algunos falsos negativos. Inmunocromatografía En diversos países se han desarrollado kits comerciales para detección de anticuerpos por inmunocromatografía. Son tests sencillos de realizar aunque su sensibilidad está entre el 80 y el 90%, lo que hace que muchos perros escapen al diagnóstico64,33,35. Inmunofluorescencia indirecta. Es un método ampliamente utilizado en muchos laboratorios de los Estados Unidos. Sin embargo no existen trabajos que avalen su sensibilidad y especificidad como las pruebas anteriormente descriptas, pero parece ser menor al RSAT y al ELISA22. Diagnóstico molecular (PCR) Recientemente se han publicado algunos trabajos sobre diagnóstico de brucelosis canina por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en sangre27,28,30,32,34, semen29,30,32,34 e hisopados vaginales31,32,34 y orina en los machos4. Se encontró 100% de especificidad, es decir que ningún perro serológicamente negativo y que no tuvo contacto con perros enfermos arrojó resultado positivo en la prueba. Todos los perros en los cuales se aisló la bacteria por hemocultivo tuvieron resultado positivo por PCR en sangre y también resultaron positivos algunos donde no se había logrado aislamiento pero que tenían serología positiva o contacto con perros brucelosos y manifestaciones clínicas de la enfermedad. La PCR en hisopados vaginales resultómucho más sensible que los cultivos de los mismos hisopados, lo cual fue atribuido por los autores a una baja carga de bacterias o a la detección por PCR de bacterias muertas (no detectables por cultivo). La mayor sensibilidad utilizando PCR como diagnóstico se obtuvo combinando el resultado en sangre y en hisopados vaginales, considerando positivas las perras que dieron una o ambas pruebas positivas. Aunque en los trabajos citados se concluyó que la PCR es más sensible que la aglutinación rápida en placa y que la inmunodifusión en agar-gel, cabe destacar que el porcentaje de falsos negativos por aglutinación (en casos confirmados por cultivo) fue muy superior al descrito en la literatura. Por otra parte, en ninguno de los estudios sobre PCR realizados hasta el presente se ha comparado la performance de esta técnica con pruebas serológicas más sensibles que la aglutinación, como es el caso del ELISA, por lo cual resta por definir la real magnitud de la ventaja diagnóstica aportada por la PCR. En mi experiencia personal, he utilizado la PCR en sangre y flujo vaginal en 4 criaderos infectados (n=325), y he encontrado muchos casos de falsos positivos sobre todo en flujos vaginales, donde el resultado fue positivo a PCR en perras donde ninguna otra reacción serológica dio positiva en ese momento ni durante un seguimiento mayor a 3 meses, bacteriología negativa y partos normales posteriores, así como también PCR negativas en muestras con aislamiento bacteriológico, (observaciones sin publicar) de modo que no recomiendo utilizarla como método diagnóstico confiable. Un trabajo reciente demostró una muy buena correlación de la PCR con el cultivo en muestras de orina de machos en los casos en los que el cultivo de orina era positivo4. Aislamiento bacteriológico Es la única prueba que nos asegura en un 100% que el perro está infectado; sin embargo, es poco sensible ya que solo en un 40% de los perros infectados es posible aislar la bacteria22. Debe tenerse en cuenta que la Brucella es un microorganismo de crecimiento lento, de modo que si la muestra que intentamos cultivar se encuentra contaminada, el germen contaminante enmascara la presencia de la Brucella. La sangre es la muestra de elección para el aislamiento ya que se obtiene fácilmente y es estéril, permitiendo obtener cultivos limpios. Si bien la bibliografía indica que la bacteriemia es constante entre los 15 días y los 6 meses posinfección, en muchos casos no nos ha sido posible aislar el microorganismo aun en perros recientemente infectados. Pasados los 6 meses, la bacteriemia se torna intermitente y suele persistir durante 2 a 5 años si no se realiza tratamiento22,61. En las hembras, las secreciones vaginales tanto durante el celo como en el posparto/aborto, tienen gran concentración bacteriana, pero casi siempre están contaminadas, lo que dificulta el aislamiento. Las placentas tienen altas concentraciones de Brucella mientras que a veces los fetos abortados no contienen bacterias22. En los machos, puede aislarse del semen y de la orina. En las hembras la concentración en la orina es menor y es más difícil obtener una muestra sin contaminación52. Puede aislarse también de diferentes tejidos obtenidos por biopsia o en los exámenes post-mortem, siendo los órganos donde más frecuentemente se encuentra los ganglios linfáticos1, próstata, bazo y médula ósea, pudiendo encontrarse también en hígado, epidídimos y testículos. Las muestras de elección para aislamiento, momento óptimo para cultivo y resultados probables se resumen en la tabla 1.25 Órganos de elección para aislamiento de B. Canis Material Momento para el cultivo Resultados probables Secreción post-aborto Cuando está presente +++ Placenta Cuando está presente ++ Fetos abortados Cuando está presente Pueden ser negativos Semen 3-11 semanas +++ 12 a 60 semanas cifras bajas >60 semanas - Sangre 5-30 semanas 100% + después de 30 semanas intermitente 6-12 meses más del 80% 28-48 meses 50-80% 48-58 meses 25-50% > 58 meses >25% Epidídimo 35-60 semanas 50-100% >100 semanas - Orina 8-30 semanas + (el macho + microorganismos que la hembra) Próstata Hasta 64 semanas por lo gral. + Ganglio-bazo-médula ósea Cuando hay bacteriemia en gral. + Sin bacteriemia +/- Ojo Con uveitis +++ Disco intervertebral Con discoespondilitis +/- Tabla 1. Órganos de elección para aislamiento de B. Canis. Tomado de Johnson y col (1991): Diagnosis and control of Brucella Canis in kennel situations. Proceedings of the Society for Theriogenology. 1991, p 236.(25) `’Aun con esta variedad de pruebas serológicas, bacteriológicas y moleculares, muchas veces quedan dudas respecto del diagnóstico de algunos perros, porque además hay que tener en cuenta la sintomatología y la epidemiología que pueden inclinar la decisión diagnóstica hacia el positivo o negativo. Como sintomatología positiva tomamos la presencia de abortos, epididimitis, orquitis, discoespondilitis y uveítis y como epidemiología positiva si comparten hábitat (criadero o casa) o contacto sexual con animales positivos. El siguiente algoritmo puede facilitar las decisiones diagnósticas a partir de la prueba de 2ME RSAT. Negativo Sin síntomas ni epidemiología Negativo Con síntomas sin epidemiología Bacteriología ELISA Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Buscar otras causas de los síntomas Sin síntomas con epidemiología Negativo Seguimiento Sospechoso Seguimiento Con síntomas y epidemiología Bacteriología Positivo Positivo Negativo ELISA Positivo Positivo Negativo Positivo Con síntomas o epidemiología Positivo Sin síntomas ni epidemiología ELISA Positivo Positivo Negativo Negativo 2 ME-RSAT TRATAMIENTO Es fundamental entender que la prioridad en brucelosis es evitar la propagación de la enfermedad, por lo tanto el primer paso frente a un animal enfermo es la castración. Con ella eliminamos las principales fuentes de diseminación de bacterias y además algunos de los órganos donde la Brucella se aloja en el animal. En las hembras debe realizarse la ovariohisterectomía, ya que el órgano blanco de la bacteria es el útero, y además, si llegara a ocurrir un síndrome de remanente ovárico, al retirar el útero, la perra no elimina secreciones al exterior. En el macho, retiramos testículos y epidídimos, y si bien la próstata queda en el animal, al retirar el estímulo trófico de la testosterona testicular, el órgano se atrofia y la cantidad de organismos que aloja es menor. Una vez castrado el animal, debe realizarse un tratamiento antibiótico prolongado de mínimo un mes con por lo menos dos antibióticos de grupos diferentes. Hay que recordar que la Brucella es un microorganismo intracelular, así que es difícil atacarla con antibióticos46, y que además se acantona en diferentes órganos por períodos prolongados. Esto hace que además de no ser atacada por los antibióticos, no estimula el sistema inmune y los títulos de anticuerpos descienden, pudiendo negativizarse, dando la impresión de que el animal se ha curado; sin embargo ante situaciones de stress o un aumento de actividad hormonal como ser una gestación, entran nuevamente en circulación reactivando la enfermedad; inclusive se ha observado eliminación de bacterias por semen en individuos no castrados donde se han aplicado antibióticos lográndose una negativización de los títulos de anticuerpos59. Una vez realizada la castración del animal se realiza el tratamiento antibiótico aunque el animal no presente síntomas. No hay ningún tratamiento que haya demostrado ser un 100% eficaz en la erradicación de la enfermedad. Los tratamientos más utilizados son la combinación de tetraciclinas con aminoglucósidos. Dentro de las tetraciclinas, la doxiciclina y la minociclina son las más liposolubles y permitenalcanzar mayor concentración intracelular, por lo cual son más eficaces que otras drogas del grupo. Por otro lado, dentro de los aminoglucósidos, las que mejores resultados han demostrado son la estreptomicina y la dihidroestreptomicina.22 Tabla 2 Droga Dosis mg/kg Vía de administración Frecuencia (hs) Duración (semanas) Tetraciclinas Minociclina 25 Oral 24 4 Doxiciclina 12,5 Oral 12 4 Tetraciclina 30 Oral 12 4 Aminoglucósidos Estreptomicina 20 IM 24 2 (sem 1 y 4) Dihidroestreptomicina 10 20 IM,SC IM,SC 12 24 2 (sem 1 y 4) 2 (sem 1 y 4) Gentamicina 2,5 5 IM,SC IM,SC 12 24 2 (sem 1 y 4) 2 (sem 1 y 4) Quinolonas Enrofloxacina 5 oral 12,24 4 Otras Rifampicina 7,5 oral 24 4 Tabla 2. Drogas recomendadas en el tratamiento de la brucelosis canina. Tomado de Green y Carmichael 2012 (22) Habitualmente se realizan ciclos de 4 semanas de tratamiento con administración continua de tetraciclina o enrofloxacina con el agregado de estreptomicina la primera y la cuarta semana20,44,48,69,62. Se recomienda hacer dos ciclos de tratamiento con un mes de intervalo, ya que son muy comunes las recaídas. No se han obtenido buenos resultados con ampicilinas38. En perros con discoespondilitis, el tratamiento antibiótico suele traer un alivio muy rápido del dolor, pero si se discontinúa reaparece rápidamente; aún aplicando las 4 semanas de tratamiento suele recurrir de 1 a 4 semanas de interrumpido y es necesario repetirlo una o más veces hasta lograr una mejoría permanente. Es conveniente hacer un control serológico cada tres meses hasta que los perros se tornen negativos por lo menos a la aglutinación. Las lesiones oculares suelen ser más resistentes al tratamiento antibiótico y suelen empeorar en cuanto se suspende el tratamiento. En un trabajo se logró una recuperación total con un tratamiento extremadamente agresivo y prolongado: se administró doxiciclina a 15 mg/kg cada 12 hs durante 8 semanas junto con 10 mg/kg c/24 hs y 20 mg/kg semana por medio. Luego, sin interrupción se continuó con las mismas dosis de doxiciclina y enrofloxacina y se reemplazó la estreptomicina con 7,5 mg/kg de rifampicina en forma continua, hasta que todas las pruebas (2ME-RSAT, hemocultivo, inmunodifusión, Test de aglutinación en tubo e inmunofluorescencia indirecta) dieron negativas durante 8 semanas seguidas. Este resultado se alcanzó luego de 96 semanas de tratamiento37. Una vez castrado y tratado el animal se controla periódicamente cada seis meses para detectar reactivación de la enfermedad. Si bien en algunos países se recomienda la eutanasia de los animales brucelosos, consideramos que esta medida no es necesaria, ya que la castración de los animales enfermos elimina el riesgo de infección a otros animales y humanos en contacto. PRONÓSTICO La enfermedad no trae riesgos que comprometan la vida del animal. Como se dijo anteriormente, muchos perros cursan sin síntomas, y si bien no es curable, los animales sintomáticos pueden tratarse y mantenerse controlados, aunque reproductivamente significa el fin de la carrera del animal. CONTROL DE CRIADEROS INFECTADOS Y PROFILAXIS Cuando aparece un animal infectado en un criadero, hay que testear a todos los perros del criadero, aún si no están en contacto directo. Se realiza una prueba de 2ME-RSAT y frente a un positivo se reconfirma con aislamiento bacteriológico. Si es posible, es conveniente realizar en el primer control, tests de ELISA y hemocultivo a todos los perros. Esto permite a veces detectar perros con infecciones recientes que aún no son positivos a RSAT. Todos los perros positivos, deben castrarse, tratarse y retirarse del criadero. La separación física de perros infectados y sanos aun manteniendo estrictas medidas de higiene, no es suficiente para evitar la propagación de la enfermedad11, por lo que se aconseja sacar del criadero a los animales infectados. Los perros negativos deben ser testeados una vez por mes hasta que durante tres meses consecutivos no haya ningún positivo nuevo. Las Brucellas son lábiles y se eliminan fácilmente del ambiente con desinfectantes comunes como hipoclorito de sodio al 2,5%, amonios cuaternarios, soda cáustica al 2-3%, formaldehido al 2%. El etanol, isopropanol, iodóforos o diluciones de hipoclorito pueden utilizarse para desinfectar la piel contaminada, mientras que los amonios cuaternarios no se recomiendan para este propósito. Para desinfectar el equipo se puede autoclavar a 121ºC por al menos 15 minutos o utilizar calor seco a 160-170ºC durante 1 h. Para desinfectar líquidos, estos se pueden hervir durante 10 min. La Brucella también puede inactivarse con radiación gamma24. El material orgánico y las temperaturas bajas disminuyen la eficacia de los desinfectantes por lo que es crucial una limpieza rigurosa del lugar. Los elementos de limpieza no deben compartirse entre zonas donde hubo animales enfermos, sobre todo abortos y otros lugares para evitar la contaminación. Para prevenir nuevos contagios, deben realizarse en forma rutinaria tests de aglutinación de todas las hembras y machos antes de servirlas y periódicamente a todos los perros que salen a competencias, exposiciones y lugares donde estén en contacto con otros perros ajenos al criadero. Los ejemplares nuevos que entren al criadero deben mantenerse en cuarentena durante 3 meses antes de incorporarlos al plantel26. Si bien se están estudiando proteínas de Brucella que podrían conferir algún grado de protección13,49, no hay hasta el momento ninguna vacuna disponible para prevenir la brucelosis en el perro. CONSIDERACIONES SOBRE SALUD PÚBLICA La brucelosis canina es una zoonosis. Se sabe a ciencia cierta que la B. canis afecta al ser humano, si bien no se conoce la incidencia exacta de la enfermedad en esta especie. Si bien B canis afecta al hombre, es mucho menos virulenta que las especies lisas del mismo género; hay pocos reportes de casos humanos y la enfermedad suele ser leve56, en general por un contacto muy estrecho con material de aborto o secreciones durante el celo. Ha habido comunicaciones de infecciones en el laboratorio al trabajar directamente con la bacteria. La enfermedad cursa con fiebre prolongada, ganglios linfáticos agrandados56, faringitis57, dolores articulares21, escalofríos, fatiga y pérdida de peso45, aunque se han reportado casos más graves con presencia de endocarditis. Las personas infectadas responden rápidamente al tratamiento con antibiótico (tetraciclinas solas o junto con estreptomicina o ampicilina)51,56. Sin embargo se han presentado trabajos recientes de algunos brotes en humanos, uno de una familia de seis personas en contacto con una perra y 4 cachorros brucelosos40 y otro brote en tierra del fuego en una zona marginal con un alto porcentaje de perros brucelosos43 y en pacientes inmunosuprimidos41 Los propietarios de los perros deben ser advertidos del peligro de zoonosis, sobre todo en el manejo de perras y cachorros infectados en las proximidades del parto- aborto. Los veterinarios que manejan perras que han abortado deben extremar las precauciones y los técnicos de laboratorio que manipulan la bacteria, aún la cepa M- que es de patogenicidad reducida deben manipular la bacteria en laboratorios con la adecuada bioseguridad, ya que se ha publicado un caso de infección en humanos por manipulación de esta cepa en laboratorio58. GUÍA DE RECOMENDACIÓN PARA LOS PROPIETARIOS DE LAS MASCOTAS INFECTADAS Para el propietario de una mascota infectada El propietario debe saber que a pesar de que la brucelosis canina es una zoonosis, el principal riesgo de contagio son las secreciones vaginales de las perras y la orina y el semen de los machos, por lo pronto los animales deben castrarse, sin importar que no tengan síntomas clínicos. Una vez castrados, los perros norepresentan un riesgo importante para los humanos en contacto y no es necesaria la eutanasia. Puede ocurrir que diferentes métodos diagnósticos den diferentes resultados, y es muy importante que terminen de confirmar si el perro está infectado o no realizando más de una prueba diagnóstica en lugar de aceptar la primer prueba que arroje un resultado negativo. Luego de castrar, es importante realizar un tratamiento antibiótico prolongado para tratar de eliminar la bacteria o lograr que la misma se acantone. A pesar de esto, puede ocurrir que los perros sigan portando la enfermedad y presenten síntomas periódicamente, por lo cual hay que controlarlos y volver a tratarlos si es necesario. Los perros a pesar de no presentar síntomas clínicos pueden contagiar; hasta tanto se practique la castración se deben extremar las precauciones de contacto, sobre todo con las perras en celo o después de un parto o aborto. Las hembras deben aislarse hasta su ovariohisterectomía. También los cachorros recién nacidos y los que están en contacto con los loquios de las perras positivas pueden tener una carga bacteriana importante en el pelaje y su contacto estrecho que pueda llevar a la ingestión accidental de bacterias puede desencadenar el contagio al ser humano. En estas circunstancias, deben usarse guantes cuando se manipula la perra hasta tanto se la castre y deje de presentar descargas vaginales. Propietarios de criaderos: No utilizar perros positivos para la reproducción. Castrar, tratar y retirar del criadero a todos los animales positivos. No tratar a los perros negativos ya que el tratamiento puede enmascarar el diagnóstico. Controlar a todos los perros que viven en el criadero hasta que durante tres meses consecutivos todos los perros sean negativos. Mantener una correcta higiene de los caniles y lugares donde habitan los perros. No compartir elementos de lmpieza ni comederos entre perros sanos e infectados. Preferentemente, hasta que sean removidos del criadero deberían ser atendidos por personal diferente a los sanos y estar en otro lugar físico. Realizar controles pre servicio tanto de machos como de hembras y establecer una cuarentena de los animales nuevos antes de incorporarlos al plantel. Veteriranios y personal encargado de los perros Utilización rutinaria de guantes durante la atención de partos y exámenes ginecológicos y realización de inseminación artificial. Desinfección de camillas, consultorios y material con amonios cuaternarios. 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