2teo MICROSCOPIA1

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MICROSCOPIO → su función es obtener una imagen magnificada para facilitar la 
observación de los detalles que escapan a la simple observación → nos permite observar 
objetos demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. 
 
 
 
El microscopio óptico está compuesto por un SISTEMA DE LENTES Y 
UTILIZA LUZ VISIBLE. 
El microscopio óptico → tiene un límite de resolución de 0,2 
micrómetros o 200 nanómetros → es un límite de resolución 
teórico → esto se conoce como LÍMITE DE DIFRACCIÓN DE ABBE 
(imagen). EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO TIENE MUCHA MAYOR 
CAPACIDAD DE RESOLUCIÓN QUE EL ÓPTICO (OBSERVAR ESCALA) → 
ya que con él pueden observarse proteínas globulares y 
pequeñas moléculas, virus, etc. 
Hay dos tipos de microscopio óptico: 
 
 
 
 
 
Microscopía 1 
2° T E O R I C O 
Microscopio óptico 
Utiliza lentes 
Microscopio electrónico 
Utiliza elementos electrónicos para 
direccionar haces de electrones 
Microscopía óptica 
Microscopio óptico 
directo 
La luz proviene de abajo → 
atraviesa la muestra, entra 
por el objetivo y llega al ojo 
magnificado. 
Microscopio invertido 
La luz ingresa por arriba y los 
objetivos están abajo; permite 
observar células que estén en 
un medio de cultivo. 
LENTES OCULARES → permiten la 
magnificación final y la 
proyección de la imagen. 
LENTES OBJETIVOS → son los que 
generan la magnificación de la 
muestra. Están montados sobre 
un REVOLVER → el cual puede 
girar para cambiar los objetivos. 
La muestra se coloca sobre un 
PORTA OBJETOS de vidrio al cual 
se le puede agregar por 
encima un CUBREOBJETOS → esa muestra está montada sobre la PLATINA. 
Por debajo está el CONDENSADOR → él cual tiene la función de concentrar o enfocar la luz 
proveniente de la fuente de luz. 
La fuente de luz está por debajo → tiene una fuente colectora → esa luz irá hacia el 
CONDENSADOR → el cual enfoca el haz de luz sobre la muestra → la luz ingresa al objetivo, 
continua su camino hasta las lentes oculares → los cuales proyectan la luz finalmente 
sobre los ojos del observador. 
TUBO OCULAR → en él se montan los 
oculares. 
ESTATIVO → es el cuerpo del microscopio. 
Tanto el TORNILLO MICROMÉTRICO COMO 
MACROMÉTRICO → mueven la platina 
sobre el eje Z subiendo y bajando 
permitiendo el enfoque. El tornillo 
micrométrico genera un movimiento de 
la platina mayor que el micrométrico → 
con el micrométrico se ajusta más finamente el foco. 
TORNILLOS DE DESPLAZAMINETO DE LA PLATINA X-Y → desplazan la platina para poder 
desplazar la muestra. 
CONDENSADOR → elemento óptico que concentra o enfoca el haz 
de luz sobre la muestra o espécimen. Este condensador tiene un 
DIAFRAGMA DE APERTURA → se abre y se cierra con el fin de 
modificar el haz de luz que llega a la muestra → cuando está 
abierto el haz de luz se expande y cuando se cierra, el haz de luz 
se reduce. 
 
Esquema del camino de la 
luz en el microscopio óptico. 
El éxito de la observación en el 
microscopio depende de 3 parámetros 
fundamentales de la microscopia → 
MAGNIFICACIÓN, RESOLUCION Y CONTRASTE 
→ la magnificación y resolución están 
determinadas por la construcción propia 
del microscopio; el contraste, si bien 
depende también de la construcción del 
microscopio, depende de cómo el 
individuo ajuste el microscopio para la 
observación. EL PARÁMETRO DEL CONTRASTE 
RECAE EN EL INDIVIDUO. 
Hay dos fenómenos → INTERACCIÓN LUZ-
LUZ e INTERACCIÓN LUZ-MATERIA → mediante éstos, el microscopio produce el aumento a 
partir de un objeto y generación de una imagen. En éstos dos fenómenos → la luz sufre 
cambios → sin estas interacciones no podría ocurrir la formación de la imagen y la 
magnificación necesaria para cumplir las funciones del microscopio. 
LA LUZ ES UNA ONDA ELECTROMAGNÉTICA → LAS ONDAS ELECTROMAGNÉTICAS PUEDEN SER 
DESCRIPTAS A PARTIR DE DOS MODELOS: 
 MODELO DE PARTICULA 
 MODELO DE ONDA → describe a la luz o 
a la radiación electromagnética 
como un componente oscilante que 
se desplaza en el espacio → en este 
desplazamiento que tiene en el 
espacio oscila un componente 
eléctrico y perpendicularmente 
oscilará un componente magnético. 
LOS PARÁMETROS PARA DEFINIR UNA ONDA ELECTROMAGNÉTICA, ES DECIR, PARA DEFINIR LA LUZ, 
SERÁN 2: 
 LONGITUD DE ONDA → es la distancia sobre la cual se repite la 
forma de la onda, o la distancia entre dos puntos de una 
misma fase. Por ejemplo → en esta onda que se va 
desplazando en el espacio → se puede medir la distancia 
existente entre dos máximos o dos picos. Al ser una distancia 
→ se mide en el sistema métrico. 
 
 FRECUENCIA → es una magnitud que mide el número de 
veces que ocurre un fenómeno sobre un determinado 
espacio de tiempo. Entonces → se puede definir a la 
onda onda electromagnética como el tiempo que tarda en 
aparecer un máximo (por ejemplo). 
De todo el espectro de ondas electromagnéticas con diferente longitud de onda → EL 
OJO HUMANO PUEDE DISTINGUIR UNA LONGITUD DE ONDA QUE VA APROXIMADAMENTE DESDE 380 
NANÓMETROS A 750 NANÓMETROS → esas ondas electromagnéticas son las que llegan al ojo, 
y cuando llegan generan una respuesta en el cerebro, el cual la interpreta como un color 
determinado. 
Interacción luz-materia 
Las ONDAS ELECTROMAGNÉTICAS, en particular la luz 
→ pueden sufrir interacciones con la materia. 
Por ejemplo → la luz puede encontrarse con 
determinada materia y puede ser reflejada o 
reflectada. También puede transmitirse a través 
del material → el material cambia la luz y lo que 
uno percibe es la luz transmitida. 
TAMBIÉN → la luz puede absorberse por la materia y 
emitirse posteriormente, con una longitud de onda 
distinta → este es el fenómeno de FLUORESCENCIA. 
LAS INTERACCIONES LUZ-LUZ Y LUZ-MATERIA → son las que conforman la imagen que 
finalmente llega a la retina. 
 
 
La lente objetivo es una PARTE FUNDAMENTAL DEL MICROSCOPIO → es 
la que capta la luz que sufrió cambios cuando atravesó la 
muestra. 
El objetivo no es una sola lente → sino que suele ser un arreglo de 
distintas lentes. EN LA LENTE OBJETIVO ES DONDE OCURRIRÁ LA 
MAGNIFICACIÓN Y LA FORMACIÓN DE HACES QUE CONFORMARÁN LA 
IMAGEN. 
La lente objetivo tiene 
distintos parámetros. 
CORREPCIÓN ÓPTICA → 
indica que tanto 
corrige las 
aberraciones ópticas 
que pueden surgir 
durante la 
observación. 
Lente objetivo 
Magnificación 
La lente objetivo debe poseer, entre otras 
cosas, dos números → en este caso 60x/1.40 oil 
(indica el medio de inmersión → en este caso 
aceite) → el 60x indica la MAGNIFICACIÓN 
(cuantas veces se amplía la muestra) del 
objetivo; y el 1.40 indica la APERTURA NUMÉRICA 
(parámetro directamente relacionado con la 
resolución). 
La MAGNIFICACIÓN está codificada en el 
objetivo y es cuantas veces más grande es la imagen generada en comparación con el 
objeto ubicado en la platina. 
PARA CALCULAR LA MAGNIFICACIÓN TOTAL QUE ESTÁ TENIENDO EL SISTEMA ÓPTICO EN EL 
MICROSCOPIO V SE DEBE CONOCER LA MAGNIFICACIÓN DEL OBJETIVO (ESTÁ GRABADA EN ÉL) Y LA 
MAGNIFICACIÓN DEL OCULAR → MULTIPLICANDO AMBAS SE OBTIENE LA MAGNIFICACIÓN O LA 
AMPLIACIÓN TOTAL QUE SUFRIÓ EL OBJETO DE OBSRVACIÓN. 
Resolución 
LA RESOLUCIÓN ES LA DISTANCIA MÍNIMA A LA CUAL DEBEN ESTAR DOS PUNTOS PARA SER 
OBSERVADOS COMO TALES → esta distancia se conoce como “LÍMITE DE RESOLUCIÓN” → 
cuando los dos puntos están demasiado cerca y ya no puedo discriminarlos como tal → 
estoy por debajo del límite de resolución. 
PATRÓN DE AIRY → un punto se ve como un punto central bien brilloso; y se 
ven aros concéntricos de menor intensidad de luz. 
CRITERIO DE RAYLEIGH → establece que el ojo humano puede distinguir dos 
puntos cuando el máximo de un punto coincide con el primer mínimo del 
otro. 
Si se tiene dos puntos en un 
sistema óptico → se los observa 
como en la imagen de la 
izquierda → ambos puntos están 
perfectamente resueltos. 
Cuando los puntos se van 
acercando → se llega a unmomento en el cual se sigue 
viendo que hay dos puntos, pero 
comienzan a superponerse 
(imagen del medio) → SE CUMPLE EL CRITERIO DE RAYLEIGH → el máximo de un punto 
coincide con el primer mínimo del otro. A esta distancia todavía puedo discriminar a los 
dos puntos por separado. 
TERCERA IMAGEN → la distancia entre los puntos es menor → el máximo del primero 
coincide con parte del máximo del segundo → ya no distingo dos puntos → imagen no 
está resuelta. 
La distancia mínima a cual pueden estar dos puntos para poder resolverlos por separado 
como tales está dada por la distancia entre los máximos que se denomina → LÍMITE DE 
RESOLUCIÓN. 
Apertura numérica 
Ernst Abbe → definió el cálculo teórico del límite de resolución e introduce el término de 
apertura numérica (NA = n.sen σ). 
Cuando una muestra es iluminada → los rayos se dispersan, sufren difracción 
→ cuanto más chico es el objeto que se está viendo, más difracción produce 
→ MÁS SE DISPERSAN LOS RAYOS. La resolución de estructuras pequeñas 
depende de que se puedan captar los rayos a través del objetivo → cuantos 
más rayos se capten → mayor resolución habrá. 
LA APERTURA NUMÉRICA DE UN MICROSCOPIO ES LA MEDIDA DE LA CAPACIDAD DEL 
OBJETIVO DE CAPTAR LA LUZ. 
 
LA APERTURA NUMÉRICA ESTÁ CONSTITUIDA POR DOS PARÁMETROS → POR EL SENO DE UN ÁNGULO Y 
POR EL ÍNDICE DE REFRACCIÓN DEL MEDIO. 
A MAYOR APERTURA NUMÉRICA → SE CAPTURAN MAYOR CANTIDAD DE RAYOS PROVENIENTES DE LA 
MUESTRA → POR LO TANTO SE INCREMENTA LA RESOLUCIÓN. 
PODER RESOLUTIVO → es la inversa del límite de resolución → a menor límite de resolución 
mayor poder resolutivo; a mayor límite de resolución, menor poder resolutivo. 
 
OBJETIVO 1 → capta solo un cono 
de luz de toda la luz dispersada por 
la muestra; si se mide el ángulo de 
la mitad del cono de luz → esto es 
el σ. 
OBJETIVO 2 → objetivo más grande 
→ toma mayor cantidad de luz 
proveniente de la muestra → el 
ángulo de luz que capta es mayor 
→ tendrá mayor cantidad de AN 
ya que esta se define como la 
cantidad de luz que toma el 
objetivo. 
 
El objetivo 1, que tiene menor apertura numérica → está más alejado de la muestra 
respecto del objetivo 2 → esto se denomina DISTANCIA DE TRABAJO (WD) → distancia entre el 
cubre objetos y el borde de la lente del objetivo. PARA TENER MAYOR APERTURA NUMÉRICA Y 
POR ENDE, MAYOR RESOLUCIÓN → SE DEBE APROXIMAR MÁS A LA MUESTRA → MENOR DISTANCIA DE 
TRABAJO. 
Índice de refracción (n) 
El índice de refracción es uno de los PARÁMETROS QUE CONFORMA A LA APERTURA NUMÉRICA. 
La refracción es el cambio de dirección y velocidad que experimenta una onda al pasar 
de un medio a otro con distinto índice refractivo. 
Cuando hay dos medios en los cuales se desplaza un haz de luz → cuando el haz de luz 
atraviesa o pasa de un determinado medio que posee un medio de refracción, a otro 
medio con otro índice de refracción → SE CURVA. 
OBJETIVO LENTE SECA → la luz atraviesa 
la muestra; cuando la luz pasa del 
vidrio al aire → que tienen diferente 
índice de refracción (aire n=1; vidrio 
n=1,5) → en este pasaje, la luz se 
curva → los haces de luz que venían 
transitando por el vidrio pasan al aire 
y se curvan de tal manera que ya no 
logran ingresar al objetivo. SI EL 
OBJETIVO NO CAPTURA ESOS HACES DE 
LUZ → DISMINUIRÁ LA RESOLUCIÓN. 
n es el índice de refracción; 
es n = 1 porque es el índice 
de refracción del aire. 
Este microscopio permite la 
resolución solo de aquellas 
estructuras separadas 
mínimamente por 1220 nm. 
Este microscopio permite la 
resolución solo de aquellas 
estructuras separadas 
mínimamente por 340 nm. 
OBJETIVO LENTE DE INMERSIÓN → ya no hay aire entre la muestra y el objetivo, sino que hay 
aceite (el cual tiene un índice de refracción muy similar al vidrio) → dado que la diferencia 
entre los índices de refracción del aceite y del vidrio es muy pequeña → los haces de luz 
no van a sufrir una difracción tan grande y podrán influir todos sobre la muestra, sin 
perderse ninguno. Por lo tanto → MAYOR CANTIDAD DE LUZ CAPTA → MAYOR RESOLUCIÓN. 
AL COLOCAR EL ACEITE DE INMERSIÓN → AUMENTO EL ÍNDICE DE REFRACCIÓN DEL MEDIO, 
MEJORANDO LA RESOLUCIÓN DEL SISTEMA ÓPTICO. 
Resolución vs magnificación 
MAGNIFICACIÓN → cuantas veces amplía la muestra un determinado objetivo. La 
magnificación no tiene ninguna relación con la resolución. 
Foto con magnificación x y otra foto con 
magnificación 9x → que una esté más 
magnificada que la otra no quiere decir que 
tenga la misma o mayor resolución. Si se hace 
un aumento de la foto → se observa que la 
foto más chica (x) tiene una mayor resolución 
que la foto más grande (9x) → MAGNIFICACIÓN 
O AUMENTO NO ES SINÓNIMO DE RESOLUCIÓN → LA 
RESOLUCIÓN DEPENDE DE LA APERTURA NUMÉRICA 
QUE TENGA EL OBJETIVO. 
Contraste 
El contraste es LA DIFERENCIA DE INTENSIDAD O BRILLO ENTRE UN PUNTO DE UNA IMAGEN Y SU 
FONDO. Debe haber una diferencia de intesidad ENTRE EL 2 Y EL 5% (y la diferencia debe ser 
abrupta) para que el ojo humano pueda captarlo. 
IMAGEN IZQUIERDA → diferencia del brillo 
gradual del 2%. 
IMAGEN DERECHA → la diferencia de brillo 
gradual ahora es brusca → el salto de brillo 
es escalonado. 
La visión humana no es absoluta → no 
puede ver una intensidad de brillo sino que 
el brillo lo determina en función de su fondo. 
Cuando en microscopia se quiere lograr un contraste importante, para poder ver una 
estructura → se deben ajustar las condiciones para lograr la condición justa en donde 
pueda ver el contraste perfectamente y así resolver las estructuras. 
TABLERO DE ADELSON → dos 
cuadrados A y B → el cuadrado A es 
más oscuro que el B → pero si retiro a 
ambos cuadros del contexto del 
tablero → resulta que ambos 
cuadrados son exactamente iguales. 
 
 
Que hayamos visto al cuadrado B 
más claro que el A → está dado por 
el contexto en el cual está cada uno 
de los cuadrados. 
NO ES POSIBLE DETERMINAR UN BRILLO ABSOLUTO → SINO QUE SE LO DETERMINA EN FORMA 
COMPARATIVA. 
Hay dos maneras de modificar el contraste: 
 A TRAVÉS DEL VOLTÍMETRO → perilla que se mueve para modificar la intensidad de la 
luz → al hacer esto, se cambia la cantidad de luz que ilumina la muestra y así → si es 
muy brilloso, el contraste será malo; y si es muy poca la luz, habrá muy poco contraste. 
EL PRIMER PARÁMETRO QUE UNO MUEVE PARA LOGRAR UNA ILUMINACIÓN CORRECTA Y UN 
CONTRASTE IDEAL ES A TRAVES DE LA ILUMINACIÓN O LA POTENCIA DE LA LUZ. 
 
 A TRAVÉS DEL DIAFRAGMA DEL CONDENSADOR → al mover el diafragma del condensador 
se modifica el cono de iluminación → si el diafragme está completamente abierto, el 
cono de iluminación es máximo, la estructura se observaría muy iluminada y lavada; si 
se va cerrando el diafragma, se achica el cono de iluminación y se va ganando 
contraste de la imagen observada → para que ya no se vea lavada. CUANDO SE 
MODIFICA EL DIAFRAGMA DEL CONDENSADOR CAMBIA EL ANCHO DEL CONO DE ILUMINACIÓN 
PARA INCREMENTAR EL CONTRASTE. Sin embargo → cuando disminuyo el cono de 
iluminación → el cono de luz que llega al objetivo es menor → y si el cono de luz que 
está entrando al objetivo es menor, se estará disminuyendo la apertura numérica del 
objetivo → esto generaría una pérdida de la resolución. 
 
 
 
 
 
 
Diafragma 
totalmente abierto 
→ hay máxima 
resolución del 
objetivo, sin 
embargo, el 
contraste es muy 
bajo → con lo cual 
la imagen obtenida 
no sirve. 
Diafragma muy 
cerrado → tengo 
muy buen contraste, 
pero muy baja 
resolución → la 
imagen tampoco 
sirve. 
Hay una relación directa entre contraste y resolución → se debe encontrar una relación 
de compromiso en la cual trabaje al mejor contraste y a la mejor resolución posible. 
NUNCA USAR EL DIAFRAGMA PARA DISMINUIR LA INTENSIDAD DE LA LUZ → DISMINUIR LA INTENSIDAD 
DE LA LUZ CON EL VOLTÍMETRO Y AJUSTAR EL CONTRASTE CON EL DIAFRAGMA. 
En la microscopía óptica se pueden observarcélulas y tejidos → UNA 
FORMA DE CONTRASTAR ES CON MARCACIÓN A TRAVÉS DE COLORANTES → la 
luz que sale de la fuente de luz y pasa por el condensador es luz blanca 
→ los colorantes absorben todas las longitudes de onda exceptuando 
una longitud de onda determinada que es la que atravesará la muestra 
y llegará a nuestro ojo → LA LONGITUD DE ONDA QUE SE OBSERVA ES LA NO 
ABSORBIDA. ENTONCES UNA MANERA DE LOGRAR EL CONTRASTE ES MEDIANTE EL 
USO DE COLORANTES (MARCACIÓN). 
SIN EMBARGO, EXISTEN CASOS EN DONDE NO SE 
PUEDE UTILIZAR COLORANTES → por ejemplo si 
quisiera observar células en cultivo → ya 
que el uso de colorantes generalmente 
está sujeto a la necesidad de fijar el tejido 
para permitir que el colorante ingrese → 
para esto la célula debería dejar de ser 
viable → en estos casos el contraste no 
puede lograrse mediante un método 
químico como el uso de colorantes. 
Existe generación de contraste dado por las propiedad ópticas de los microscopios → son 
CONTRASTES LOGRADOS SIN MARCACIÓN → llamados CONTRASTES ÓPTICOS. 
Si bien se puede hacer una observación directa en un microscopio de luz transmitida; 
también pueden utilizarse estrategias como el contraste de fases, el campo oscuro y el 
contraste de fase interferencial diferencial → esta generación de contraste SE BASA EN LAS 
DIFERENTES PROPIEDADES QUE SE VAN A GENERAR POR LAS INTERACCIONES LUZ-LUZ Y LUZ-MATERIA 
→ se utilizan estos fenómenos para generar contraste. 
 
 
El microscopio óptico de campo oscuro → se 
basa en que → un haz de luz, cuando es 
dispersado, puede llegar al detector. 
Debajo de todo está el condensador → se pone 
un anillo de campo oscuro → que deja pasar 
únicamente la luz de los bordes → cuando esos 
haces de luz interaccionen con las diferentes 
estructuras de la muestra → los haces de luz 
sufrirán un cambio de dirección (imagen B) y 
esos haces que cambien su dirección → 
algunos entrarán al objetivo → solamente 
entraran al objetivo aquellos haces de luz que 
hayan sufrido un cambio de dirección por 
interacción con la muestra. 
Imagen C → se observa un campo totalmente 
oscuro → solamente se ve brillante aquellos 
lugares donde había una estructura que permitió cambiar la dirección de la luz. 
ES UN CASO DE CONTRASTE SIN COLORANTES → SE VALE DE UN CAMBIO DE DIRECCIÓN QUE OCURRE 
EN LA LUZ CUANDO ESTA INTERACCIONA CON UNA MUESTRA (INTERACCIÓN LUZ-MATERIA). 
 
 
Cuando una determinado haz de luz que 
viene con una determinada longitud de onda 
→ interacciona con la muestra → la cual tiene 
diferente índice de refracción → cambia la 
velocidad de la onda y se desfasa. 
El microscopio de contraste de fases → 
compara las ondas desfasadas con respecto 
de las ondas que no interaccionaron con la 
muestra. 
La luz, cuando atraviesa estructuras más 
gruesas, con más índice de refracción → 
cambia su velocidad ya a su vez cambian de 
fase → INTERACCIÓN LUZ-MATERIA. 
Se logra un contraste a partir de los cambios 
que sufrió la luz (no se utilizan colorantes). 
Campo oscuro 
Contraste de fases 
 
Sirve para la observación de células vivas → se 
basa en la interferencia de haces de luz 
polarizada muy próximos. 
Otorga imágenes que aparentan tener relieve → 
generación de contraste a través de la 
utilización de la luz polarizada y el índice de 
refracción. SE GENERA UN INCREMENTO DE 
CONTRASTE QUE PUEDE PERMITIRME OBSERVAR UNA 
CÉLULA VIVA → VER PROCESOS SIN NECESIDAD DE 
FIJACIÓN. 
 
 
 
 
 
 
 
IMPORTANTE → la resolución no me habla de límite el en tamaño de la estructura que 
puede observarse al microscopio; sino que → la resolución habla de la distancia mínima o 
tamaño mínimo que tendrán que tener determinadas estructuras para reconocerlas como 
tales. LIMITE DE RESOLUCIÓN DE ABBE → 200 nm → con un MO, puedo llegar observar 
estructuras menores a esto → sin embargo, SI BIEN PUEDEN VERSE, NO PUEDEN RESOLVERSE. 
SI LA ESTRUCTURA EMITE LUZ → ENTONCES SI PUEDO VERLA POR DEBAJO DEL LÍMITE DE RESOLUCIÓN → 
LO QUE ES IMPOSIBLE ES RESOLVERLA. 
La fluorescencia es una técnica de marcación → es un MÉTODO DE CONTRASTE IDEAL que 
PERMITE OBSERVAR ESTRUCTURAS MUY POR DEBAJO DEL LÍMITE DE RESOLUCIÓN → debido a que 
estas estructuras emiten luz. SE OBSERVARÁ UN FONDO OSCURO, EN EL CUAL, LA MOLÉCULA 
FLUORESCENTE ESTARÁ EMITIENDO LUZ. 
CONTRASTE → es la diferencia de intensidad (brillo) entre un punto de una imagen y su 
fondo. 
FLUORESCENCIA → es un fenómeno por el cual cuando se irradia un átomo o una molécula 
con una determinada longitud de onda → los electrones que constituyen los átomos de la 
molécula cambiarán de orbital (se excitan) → luego de un determinado tiempo, los 
electrones volverán a su orbital (desexcitan) → y emitirán luz. 
Contraste de espécimen 
Fluorescencia 
IRRADIO CON LUZ → MOLÉCULA SE EXCITA → SE DESEXCITA EMITIENDO LUZ NUEVAMENTE. Se excita 
con una determinada longitud de onda → y la emisión que se observa es una emisión a 
una longitud de onda distinta → a una longitud de onda mayor, con menor energía que la 
primera (la que excitó). 
El tiempo que la molécula tarde en emitir desde el momento en que es excitada → define 
dos fenómenos distintos: 
 Si la emisión sucede en nanosegundos → la excitación y la emisión son 
prácticamente instantáneas → FENÓMENO DE FLUORESCENCIA. 
 Si la molécula excita y tarda segundos, minutos u horas en desexcitarse → FENÓMENO 
DE FOSFORESCENCIA. 
MOLÉCULAS FLUORESCENTES → generalmente son moléculas orgánicas → se las llama 
FLUOROCROMOS → moléculas que excitan con una longitud de onda y emiten con otra. 
DAPI → caso particular → cuando se la excita en el UV (luz no visible para el ojo humano) 
→ va a emitir luz azul. 
RODAMINA → se la irradia con luz amarilla y emite luz rojo. 
Cy5 → se la excita con luz roja y emite en el infrarrojo → emite luz no visible para el ojo 
humano → se necesita una cámara especial que detecte emisión infrarroja. 
 
PUNTOS CUÁNTICOS → son pequeños núcleos de semiconductores → dependiendo de 
cómo estén constituidos pueden presentar diferentes colores de emisión. Estos 
semiconductores no se degradan → como si lo hacen las moléculas orgánicas. 
 
¿Cómo hacer que las moléculas con fluorescencia se unan 
 específicamente o selectivamente a una estructura que quiero evidenciar?
Hay varías estrategías para darle específicidad o selectividad a las moléculas: 
 
Fluorocromo con selectividad 
PUEDE SUCEDER QUE EL FLUOROCROMO, LA PROPIA MOLÉCULA EN SÍ, 
TENGA SELECTIVIDAD → interactúa con una molécula o un sector 
particular de la célula. Por ejemplo → caso de Hoechst → es 
una molécula que se intercala en el ADN → debido a esto, 
cuando se lo agrega a las células → rápidamente interactúa 
con mucha afinidad con el ADN → permite marcar núcleos en 
azul. 
Fluorocromo unido a moléculas 
TAMBIÉN HAY CASOS EN LOS CUALES LOS FLUOROCROMOS SE PUEDEN UNIR A DIFERENTES 
MOLÉCULAS QUE DAN SELECTIVIDAD Y ESPECIFIDAD → molécula que posee una determinada 
afinidad. 
Ejemplo → falodina-(FITC) → al fluorocromo verde (FITC) se le 
conjuga y se lo une con una toxina llamada faloidina → es una 
toxina que produce el hongo amanita phalloides. Esta toxina se 
unirá al citoesqueleto de actina que se encuentra polimerizado. 
Si uno la toxina que se une a la actina polimerizada con el 
fluorocromo → se observa el citoesqueleto de actina 
polimerizado de color verde. 
Fluorocromo unido a sonda 
PUEDE UNIRSE LA MOLÉCULA FLUORESCENTE A UNA 
SONDA DE HIBRIDACIÓN DE ARN O ADN. Haciendo 
diferentes combinaciones de fluorocromo con 
diferentes sondas → que tendrán una secuencia 
de nucleótidos determinada → por lo tanto, se 
van a pegar específicamente a lugares donde 
tenga complementariedad de bases. Puedo ver 
cariotipos → se tiñen los cromosomas de 
diferentes colores; algunos pares se tiñen de 
varios colores → esto quiere decir que ocurrió una 
translocación de los cromosomas → es común que un fragmentode un cromosoma se 
una a otro cromosoma (traslocación). 
 
Fluorocromo unido a anticuerpo 
ANTICUERPOS → son proteínas que se unen específica y selectivamente a otras 
macromoléculas. Se pueden generar anticuerpos, y a éstos, que son proteínas → unirles la 
molécula fluorescente → cuando observe la célula al microscopio se sabrá que donde 
está la fluorescencia es donde está el anticuerpo; y está el anticuerpo porque está la 
proteína a la cual tiene afinidad el anticuerpo. 
Generalmente se pone un anticuerpo primario → el cual reconoce a la estructura, al 
antígeno que se quiere revelar. Luego se pone un segundo anticuerpo unido al 
fluorocromo → anticuerpo secundario → se une al anticuerpo primario → de esta manera, 
en la figura, para una única molécula se une un anticuerpo primario → y a este primario se 
unen 4 secundarios → se “amplifica la señal”.