Microscopia resumen

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Microscopia 
El microscopio facilita la observación a partir de la magnificación de la imagen. 
 
Óptica 
Utiliza lentes y luz visible (o luz no visible) 
LR: 0,2 μm ó 200 nm 
Límite de difracción de Abbe 
 
 
 
 
Electrónica 
Utiliza haces de electrones. Veo 
ultraestructura. 
LR: 0,002 nm (teóricamente), 0,1 nm 
(realidad) 
 
 
 
 
 
 
 
Funciona en vacío: 
no se pueden ver 
células vivas 
Partes del microscopio óptico 
 
 
 
 
 
 
Pasos a seguir para utilizar el microscopio: 
1. Colocar la muestra. 
2. Poner el objetivo que queremos utilizar. 
3. Encender la luz y ajustar la cantidad con el voltímetro. 
4. Enfocar con tornillos macro (pasos grandes, se busca la muestra) y micro (pasos chicos, 
se ajusta el foco). 
5. Al cambiar el objetivo debo reajustar (mas cantidad de luz y ajustar el foco con el micro). 
6. Me desplazo con los tornillos en X e Y. 
La luz 
Longitud de onda (λ): Distancia entre dos puntos iguales, máximos o mínimos de una misma 
fase. La de la luz visible es de aproximadamente de 380 nm a 750 nm, así el ojo lo interpretara 
como color. 
Frecuencia (v): Mide el número de repeticiones por unidad de tiempo de cualquier fenómeno o 
suceso periódico. 
 
 
 
Condensador 
Diafragma de apertura 
Interacción luz-materia 
Luz reflectada: Se refleja la luz en la 
materia. 
Luz transmitida: Se transmite a través 
del material cambiando la luz (ej: una 
tinción). 
Luz absorbida: Se absorbe la luz. 
Luego se puede emitir 
Si se emite con otra λ se produce 
fluorescencia. 
 
El lente objetivo 
La magnificación 
Indica cuantas veces mas grande es la imagen generada en comparación con el objeto. 
𝑀𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 𝑀𝑜𝑏𝑗𝑒𝑡𝑖𝑣𝑜 ∙ 𝑀𝑜𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 
La resolución 
Capacidad de diferenciar 2 puntos como tales. 
Límite de resolución (𝐿𝑅 = 𝑑0): Distancia 
mínima que debe existir entre 2 puntos del 
objeto para que se visualicen separados. 
Mientras más chico, podremos distinguir 
puntos a menores distancias. Aunque los 
objetos se verán con un tamaño mínimo (como 
se observa en la imagen). 
Poder resolutivo (PR): 
1
𝐿𝑅
 . A menor PR, mayor 
LR, podremos distinguir puntos a mayor 
distancia. A mayor PR, menor LR, podremos 
distinguir puntos a menor distancia. 
 
 
La magnificación no tiene nada que ver con la resolución, un objetivo de menor magnificación no 
necesariamente tiene peor resolución que uno de magnificación mayor. Dos objetivos de igual 
magnificación pueden presentar incluso diferentes resoluciones de acuerdo con su apertura 
numérica o al uso de aceites de inmersión. 
La apertura numérica 
La apertura numérica mide la capacidad del objetivo de captar luz. Cuanto más pequeño el 
objetivo, más alta será la difracción de la luz (mas se dispersan los rayos). Cuantos mas rayos 
pueda capturar el objetivo, mejor resolución tendrá. 
𝑁𝐴 = 𝑛 ∙ sin(𝛼) 
 
 Índice de refracción 
𝑁𝐴 = 1 . sin(14,5°) = 0,25 𝑁𝐴 = 1 . sin(64°) = 0,9 
𝑑0 =
0,61 . 500 𝑛𝑚
0,25
= 1220 𝑛𝑚 𝑑0 =
0,61 . 500 𝑛𝑚
0,9
= 340 𝑛𝑚 
𝐿𝑅1 > 𝐿𝑅2 
En igualdad de condiciones, se prefiere una NA mayor, ya que así el límite de resolución será 
menor y por ende, tendrá mayor poder resolutivo. 
El índice de refracción 
Cuando un haz de luz pasa de un medio a otro, la luz se curva: 
 
 
 
 
 
 
Al no captar los haces de luz curvos, esto 
afecta a la resolución. 
 
El aceite tiene un n similar al vidrio, 
entonces los no se curvan tanto y son 
captados por el objetivo (mejor resolución) 
Distancia entre 
el objetivo y la 
platina 
El contraste 
El contrate es la diferencia de intensidad (brillo) entre un punto de una imagen y su fondo. El 
ojo humano necesita un contrate de 2-5% 
La visión no es absoluta si no comparativa, depende de la comparación local. NO ES POSIBLE 
DETERMINAR EL VALOR DEL BRILLO ABSOLUTO. 
¿Cómo se logra el contraste necesario? 
Iluminación Voltímetro: cambio de la intensidad de la luz 
 Diafragma del condensador: cuanto mas lo cierro, mas oscuro. 
 Se incrementa el contraste, pero se disminuye la AN del objetivo, así que 
 este pierde resolución. 
NO USAR EL DIAFRAGMA PARA DISMINUIR LA INTENSIDAD DE LA LUZ 
Para lograr un buen contraste con microscopia óptica, puedo efectuar diferentes estrategias: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Microscopio óptico de campo oscuro 
Se agrega a la fuente de iluminación un anillo de campo 
oscuro que produce que la luz se dirija de manera lateral, 
el espécimen la disperse (cambie de dirección) y entren al 
microscopio solo los haces que interaccionaron con la 
muestra. 
Microscopio óptico de contraste de fases 
Los rayos de luz tambien son marginales, pero los que no 
interaccionan con la muestra tambien ingresan al 
objetivo. Cuando la luz interacciona con muestras de 
diferente indice de refracción, cambia la velocidad de las 
ondas, entonces el microscopio las desfasa y las compara 
con otras. 
Estas técnicas 
nos permiten 
observar células 
vivas ya que no 
requieren 
fijación de la 
muestra. 
Absorben todas 
las longitudes de 
onda excepto la 
que llegará al ojo. 
Microscopio optico de contraste por interferencia diferencial (DIC ó Nomarski) 
Utiliza luz polarizada y aparenta cierto 
relieve. 
 
 
 
¿Puedo ver algo que es inferior a mi capacidad visual? Si, puedo ver por debajo del límite de 
resolución si las estructuras son capaces de emitir luz. Sin embargo, no lo voy a poder resolver. 
La fluorescencia 
Cuando irradio un átomo/molécula con una 
λ determinada, esta se excita y des-excita 
emitiendo luz a una λ distinta a la irradiada. 
Si se des-excita en nanosegundos, se 
denomina fluorescencia, si lo hace en mas 
tiempo, fosforescencia. 
 
Los fluorocromos son los encargados de excitar con una λ y emitir con otra, generalmente son 
moléculas orgánicas, también existen los puntos cuánticos, que tienen mayor vida media que 
las moléculas orgánicas. Se unen a las estructuras que quiero evidenciar mediante: 
 
Por ejemplo, el Hoechst se intercala en el DNA y marcará 
núcleos emitiendo luz azul. 
(unida a ARN ó ADN) el fluorocromo se localiza en la 
porcion de ADN que busco (por ej, el FISH permite ver los cariotipos) 
Inmunofluorescencia. Un anticuerpo 1° reconoce al antígeno y un anticuerpo 2° unido a un 
fluorocromo se une al primer anticuerpo. Este proceso amplifica la señal para revelar moléculas. 
El fluorocromo se une a una molécula que le confiere esfecificidad o selectividad. 
 
 
 
 
Selectividad ≠ Especificidad 
Selectividad: Se une a un 
grupo o familia. 
Especificidad: Se une a una 
estructura especifica 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para poder realizar inmunofluorescencia, debo fijar las células (se pierde la viabilidad) y 
permeabilizar la membrana para que ingrese el fluorocromo (también genera perdida de 
viabilidad) 
Para observar in-vivo, se desarrollaron distintas proteínas fluorescentes de diversos colores que 
permiten conservar las características de las células originales. 
 
Epifluorescencia 
Para ver un fluorocromo verde, debo excitarlo con luz 
azul (de menor λ y mayor energía) pero esta luz azul 
no llega al ojo, porque la epiiluminación produce que 
el camino de la luz de excitación sea igual al de la luz 
emitida. 
El filamento de mercurio excitado produce luz blanca 
que el filtro de excitación filtra dejando la λ de 
interés, esta luz en el espejo dicroico rebota la λ 
pasando por el objetivo y llegando a la muestra, con 
una λ capaz de atravesar el espejo y llegar al ocular 
por medio de un filtro de emisión. 
 
fármaco proteína 
 
Anticuerpo 1° 
Anticuerpo 2° 
El fondo negro es 
característico de la 
mic. de fluorescencia 
Fuera del núcleo 
Para cambiar el color emitido, se rota el “cubo”. 
Microscopiosconfocales 
Para evitar que la imagen refleje emisiones residuales, 
existen dos metodos: 
• Analógicamente: Microscopio confocal; recoje la 
emisión del punto de foco que yo quiero. Se utiliza 
un láser en lugar de luz y se recoje por un agujero 
solo la fluorescencia del punto de foco que deseo, 
permite sacar fotos en diferentes alturas de la célula y reconstruir una imagen 3D. 
• Desconvolución: Mediante un objeto conocido, analizo la convolución (componente que 
le aporta la obsevacion a la imagen) del microscopio y se aplica la inversa de una 
ecuación matemática que explique la convolución. 
Microscopio multifotónico 
Cuanta mas energía tenga una onda, menos 
profundidad logrará. Entonces se emiten dos 
haces de luz con ½ de su energia que coincidan 
en un punto. Solamente este punto de interes 
es excitado (mejor resolución). 
Este microscopio permite la microscopia 
INTRA-VITAL (dentro de un animal vivo). Ej; 
cerebro de ratón. 
Técnica de FRET 
Transferencia de energía entre 
dos fluorocromos: un donador y 
un aceptor. La energia de uno de 
los fluorocromos debe ser la de 
excitación del otro. 
 
Cuando están a 
menos de 5 nm, la 
proteína se excita y 
emite ella misma. 
Si están a menos 
de 5 nm, la prot. 
Cian se excita y la 
amarilla emite 
Técnica de FRAP 
Evalúa como se recupera la fluorescencia en una determinada porción de la célula en función 
del tiempo. 
Por ejemplo, con el fotoblanqueo se destruye 
la parte donde se ubica el fluorocromo y deja 
de emitir fluorescencia. Luego, veo cuanto 
tiempo tarda en recuperar la fluorescencia 
midiendo así velocidad de difusión, velocidad 
de transporte, compartimentalización.