Fraccionamiento celular

Vista previa del material en texto

Fraccionamiento celular 
Permite obtener fracciones enriquecidas o puras de los compartimientos celulares. La 
separación se lleva a cabo a través de distintos procesos que utilizan como método separativo 
la centrifugación. 
 
Paso 1: Homogeneización 
Disrupción o ruptura de las membranas celulares: la célula libera todo su contenido al medio de 
homogeneización. Cuando trabajo con células aisladas se llama lisado, y cuando trabajo con 
tejidos homogenado. Se usan métodos como: 
1. Shock hipotónico: Favorezco que el líquido de la solución fluya hacia el exterior y la 
célula lisa: rompe su membrana y se vierte su interior. 
2. Sonicación: Un sonicador emite ondas de sonido que perturban al liquido, forma 
burbujas y se forma la disrupción celular. 
3. Congelación-descongelación: cuando el agua se congela, se expande y altera la 
membrana plasmática. 
4. Homogeneizador mecánico: Debo utilizar una sc isotónica que contiene sacarosa 0,25 
M, en buffer con Tris-HCl 25 mM pH 7,4 a 4°C + hielo. 
Paso 2: Separación 
Separación de las fracciones celulares presentes en el lisado/homogenado 
A través de: 
El buffer de 
homogenizaci
ón debe ser 
isotónico 
1. Centrifugación 
• Sacarosa isotónica: centrifugo, me quedo con el sobrenadante y centrifugo a 
mayor velocidad, obtengo el Pellet y vuelvo a centrifugar el sobrenadante, 
sucesivamente, hasta que no haya compartimientos celulares en el 
sobrenadante. A este proceso se lo llama centrifugación diferencial y permite 
obtener fracciones impuras enriquecidas en algún compartimiento celular. 
 
 
• Gradiente: se realizan en un rotor vasculante y se obtienen fracciones puras 
a) Centrifugación en gradiente de velocidad de sedimentación o gradiente 
preformado (preformado continuo o discontinuo): Cuando se 
centrifuga, las partículas mas pesadas bajan mas que las mas livianas, 
entonces es de acuerdo con la velocidad de sedimentación que se 
separan bandas con cada orgánulo. 
b) Centrifugación en gradiente de equilibrio de sedimentación: No se 
utiliza generalmente para compartimientos celulares, si no para 
moléculas. Separa en función de la densidad. El tiempo de 
Células enteras y dendritos. 
Citoesqueleto asociado a 
membrana plasmática. 
Membrana plasmática en gran 
cantidad 
Restos nucleares 
Centrifuga de 
ángulo fijo. Debe 
estar refrigerada. 
Hasta 20000 G 
Ultracentrífuga: 
hace vacío 
centrifugación es suficientemente largo como para que se alcance el 
equilibrio. 
 
 
1. Afinidad 
• Imanes (dynabeats): Perlas magnéticas conjugadas con un anticuerpo dirigido hacia 
un antígeno de la vesícula o compartimiento. Se usa para separar vesículas muy 
livianas. 
 
Para asegurarme que obtuve el compartimiento que deseaba, busco: 
a) Moléculas características de la organela o compartimiento aislado. 
b) Actividad enzimática presente en la organela o compartimiento aislado. 
c) Microscopia electrónica 
MARCADORES 
BIOQUIMICOS 
Para asegurarme que es pura, descarto que haya moléculas del resto de los compartimientos, o 
también puedo utilizar la microscopia electrónica. 
 
 
¿Cómo puede evidenciarse la presencia de un marcador bioquímico? 
La presencia de un marcador bioquímico puede evidenciarse mediante: 
• Reacción enzimática: esta técnica basa su fundamento en la interacción de una enzima 
presente en la fracción subcelular (marcador bioquímico) con un sustrato, para llevar a cabo una 
reacción evidenciable. 
Ejemplo de este tipo de metodología es el estudio de la presencia de la enzima catalasa en la 
fracción mitocondrial, ya que se trata de un marcador bioquímico de peroxisoma. Para este 
estudio se adiciona a la fracción subcelular el sustrato de la enzima catalasa (peróxido de 
hidrogeno). Un resultado positivo se visualiza por la aparición de burbujeo en la muestra, 
producto del desprendimiento de oxígeno luego de la reacción. 
• Identificación de proteínas específicas por Inmunobloting (o Western 
blotting) esta técnica se basa en la corrida electroforética de las proteínas 
presentes en la muestra y su posterior identificación mediante el uso de 
anticuerpos específicamente dirigidos contra marcadores bioquímicos de la 
fracción a ensayar (metodología descripta en el teórico correspondiente a 
Proteínas). En la figura se puede observar un ejemplo de un Western blotting 
luego del revelado con un anticuerpo específico para detectar una proteína de 
interés, que se visualiza como una banda en la calle 2. Por otro lado, en la calle 
1 se suele sembrar una solución que contiene una mezcla de proteínas de 
diferentes pesos moleculares (Standard de PM), lo que permite estimar el PM de la proteína de 
interés. 
Controles + y – del inmunoblotting: 
Estos controles sirven para saber si la técnica que estoy utilizando sirve. 
C+: Utilizo un compuesto que se que va a dar positivo para la proteína buscada. 
C-: Utilizo algo que se que va a dar negativo para la proteína buscada. 
 
Antes de realizar un inmunoblotting, debo realizar una electroforesis en gel de poliacrilamida. 
Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 
Esta técnica separa proteínas según su peso molecular, tamaño o masa. Las proteínas deben 
tener pesos moleculares diferentes. 
Se divide en los siguientes pasos: 
1) Cuantificar la concentración de proteínas: generalmente con un 
método colorimétrico 
2) Preparación de la muestra: La muestra se prepara en un tubo 
con los siguientes reactivos: SDS (detergente cargado 
negativamente que disocia proteínas multimericas, 
desnaturaliza cadenas polipeptídicas y recubre de cargas 
negativas las cadenas polipeptídicas) – β-mercaptoetanol 
(rompe las uniones puente disulfuro) y Azul de bromofenol (un 
colorante que permite visualizar el frente de corrida). Luego de 
la adición de los reactivos, la muestra se calienta a 100 °C, lo 
que termina de desnaturalizar las proteínas. 
3) Siembra de la muestra: Se realiza en gel (en una lámina, 
preparado con poliacrilamida que forma un gel con 
determinado tamaño de poro) en una cuba vertical. Se siembra 
en unos pocillos o calles de corrida con una pipeta automática. 
4) Corrida electroforética: La cuba se conecta a corriente eléctrica. La muestra esta 
sembrada en el cátodo e irá migrando hacia el ánodo. Las de menor peso molecular, 
migraran mas rápido y llegaran mas lejos. Las proteínas se separan en bandas según su 
tamaño, para visualizarlo, debo teñir el gel y así obtendré el perfil proteico. 
Si las proteínas tienen pesos moleculares muy parecidos, se realiza previo a la electroforesis en 
gel de poliacrilamida una: 
Electroforesis bidimensional en gel 
Pasos: 
1) Desnaturalización de la muestra con urea (rompe interacciones no covalentes) 
2) Separación en primera dimensión según la carga: En un gel con gradiente de pH se 
siembra la muestra, se genera un campo eléctrico y las proteínas migran según su carga 
hasta el punto isoeléctrico. (Carga neta=0) 
3) Segunda separación en 2° dimensión por tamaño: Se aplica el primer gel de manera 
horizontal en un gel de poliacrilamida y se realiza la electroforesis en SDS. 
Una vez realizada la electroforesis, puedo realizar el Western blotting o inmunoblotting: 
 
Western blotting o inmunoblotting 
Esta tecnica permite evidenciar la presencia de un marcador bioquimico. 
Previamente a esta tecnica, se deben transferir las bandas obtenidas en la electroforesis a una 
membrana soporte de microcelulosa. 
1) Se incuba la membrana con anticuerpos especificos y se lava el exceso con un buffer. 
Luego se incuba con un segundo anticuerpo anti-el 1° anticuerpo unido a una enzima 
reportera y se lava el exceso con un buffer. 
2) Reaccion con el sustrato para la enzima unida al segundo anticuerpo (deteccion 
cromogenica).