Resumen metodos de estudio 1

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METODOS DE ESTUDIO DE LAS CELULAS Y SUS 
COMPONENTES MOLECULARES 
MICROSCOPIO 
MICROSCOPIOS OPTICOS 
• DE CAMPO CLARO 
 
• CONTRASTE DE FASE Y 
INTERFERENCIA DIFERENCIAL DE 
NOMARSKY (lo mismo, pero de una 
forma más compleja): permiten observar 
células vivas (en cultivo) y tejidos no 
teñidos. Usan el fenómeno de diferencia 
de fase que se produce cuando la luz 
monocromática un color con una longitud 
de una en específico atraviesa partes de 
la célula de diferente grosor y por lo tanto 
de diferente índice de refracción 
 
• DE CAMPO OSCURO: La muestra es 
iluminada lateralmente y solo penetran en el objetivo los rayos de luz refractados 
por la célula, por eso esta última aparece como un cuerpo brillante contra un fondo o 
campo oscuro. 
 
• FLUORESCENCIA: Cuando molécula fluorescente absorbe 
la luz a una longitud de onda (color) y la emite a una longitud 
de onda mayor que deja ver este microscopio 
 
Un filtro → deja pasar la luz monocromática (de un solo color) 
que excita a cada colorante fluorescente en particular 
 
Espejo dicroico → refleja dicha luz pero deja pasarla luz de 
longitud de onda diferente emitida por la molécula 
fluorescente (y de un color diferente). 
 
Las moléculas marcadoras fluorescentes se utilizan ligadas a 
anticuerpos que reconocen proteínas y estructuras celulares 
específicas. 
 
• LASER CONFOCAL: usa una óptica fluorescente como el 
microscopio de fluorescencia ilumina fuertemente la muestra 
en un solo punto (foco) de la misma. 
Utiliza un rayo láser y luego detecta solo la luz emitida por ese 
único punto, de allí el nombre de con focal. 
 
 
• DE SUPER RESOLUCION 
 
 
 
 
 
Microscopia estructurada de la iluminación Microscopia de agotamiento de la emisión 
 estimulada 
 
 
 
 
 
Microscopia de localización foto activada 
 
MICROSOPIOS ELECTRONICOS 
Utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz. La longitud de onda del electrón es 
mucho menor que la longitud de la luz y como el límite de resolución es proporcional a la 
longitud de onda, el límite de resolución es aproximadamente 200 veces menor que el de la 
microscopia óptica. 
• DE TRANSFERENCIA 
hace pasar un rayo de electrones a través de 
la muestra dando lugar a una imagen en dos 
dimensiones. 
Se utilizan electroimanes que guían al haz 
de electrones, ya que los electrones 
colisionan con las moléculas de aire la 
muestra debe ser colocada en el vacío. 
 
 
• DE BARRIDO 
Proyecta un rayo de electrones sobre la muestra y produce 
una imagen en 3 dimensiones 
 
 
 
 
INSTRUMENTO MECANICO OPTICO 
• FUERZA ATOMICA 
Una púa muy pequeña y extremadamente fina en su punta, 
sostenida por una palanca móvil, recorre una superficie sumamente 
lisa donde se ha colocado la muestra. 
Cuando la púa encuentra una molécula se levanta cambiando la 
reflexión del rayo láser esto se detecta y es enviado a una 
computadora que forma una imagen. 
 TECNICA HISTOLOGICA 
Pasos para preparar un tejido para observar en MO : 
• Tengo el tejido 
• Lo fragmento 
Los cortes tienen que ser aptos para fijación 
• Fijación (Formaldehido) 
• Deshidratación en serie de alcoholes 
C 70% → 80% → 90% 
(Para que la parafina penetre) 
• Inclusion (Parafina) 
Resulta el bloque de parafina 
- Corte en Microtomo 
- Colocación y secado sobre portaobjeto 
- Eliminación de parafina (Xileno) 
- Serie alcohólica D 90% → 80% → 70%} 
- Coloración 
- Serie alcohólica C 70% → 80% → 90% 
- Montaje del corte en portaobjeto con 
 Cubreobjeto 
 
 
 
Coloraciones más comunes de esta técnica: 
 
Hematoxilina → azul/violeta (nucleo) 
Eosina → rojo (proteínas citoplasmaticas) 
 
CULTIVO DE CELULAS 
Las células son separadas de los tejidos por enzimas que degradan las proteínas que 
las mantienen unidas para ser cultivadas. 
En los cultivos pueden crecer y dividirse en cajas de Petri con el medio 
de cultivo adecuado que provee todos los nutrientes necesarios y 
factores de crecimiento que las estimulan a dividirse. 
Cultivos primarios → los cultivos obtenidos directamente de los tejidos. 
Sus células dejan de dividirse luego de un número de mitosis y entran en un 
estado denominado senescencia. 
Otros cultivos acortan sus telómeros mientras se van dividiendo hasta 
finalmente morir por apotosis. 
Por distintos medios las células pueden ser inmortalizadas y entonces se 
dividen indefinidamente → Líneas celulares. 
Las cajas de Petri con las células se cultivan en estufas de cultivo o 
incubadoras que mantienen constantes la temperatura y la concentración de 
CO2. 
METODOS INMUNOHISTOQUIMICOS 
Reconocimiento específico de determinados componentes celulares y tisulares (antígenos) 
utilizando un anticuerpo. 
Anticuerpos utilizados pueden ser: 
• POLICLONALES → se obtienen inyectando el antígeno a un animal, Distintos clones 
de linfocitos B producen entonces anticuerpos contra distintas partes de la molécula 
del antígeno 
• MONOCLONALES → son más específicos, producidos por células híbridas producto 
de la fusión de un clon único de linfocitos B y una célula plasmática tumoral. El clon 
de linfocitos B produce un único tipo de anticuerpo dirigido contra un solo epitope. 
 
ANTICUERPO PRIMARIO → Es el que reconoce al antígeno 
ANTICUERPO SECUNDARIO → Es el que reconoce al anticuerpo primario con un anticuerpo 
secundario específico para las moléculas de anticuerpo de la especie animal en la que se 
obtuve el anticuerpo primario 
MARCADOR → Para poder ver al anticuerpo. Unido a un anticuerpo primario DIRECTO. Unido a 
un anticuerpo secundario INDIRECTO (más usado) 
INMUNOFLUORESCENCIA → Si se utiliza como marcador un colorante fluorescente, se ve 
por MO de fluorescencia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PASOS PARA HOMOGENIZAR UNA PROTEINA 
Para entender cómo funciona una proteína hay que tener muchas cantidades puras de la 
misma y así saber su estructura primaria 
PRIMERA ETAPA: obtener un homogenado o extracto celular lisando células de un 
tejido o cultivo celular. 
SEGUNDA ETAPA: El homogenado es sometido a fraccionamiento celular por 
centrifugación usando ultracentrífugas 
 
Centrifugación diferencial: realizar repetidas centrifugaciones a velocidades cada vez más 
altas. 
 
Centrifugación en gradientes de densidad: El homogenado es distribuido a través de un 
gradiente de densidad de sacarosa después de centrifugar y llegar al equilibrio los 
componentes migraron a una región que coincide con su propia densidad. 
 
 
Componentes pequeños y 
menos densos 
Componentes grandes y 
mas densos 
TERCERA ETAPA: Purificación por cromatografía, se pasa la fracción celular pot 
columnas cromatográficas que separan proteínas individuales según sus propiedades. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tipos de cromatografía: 
 
INTERCAMBIO IONICO FILTRACION EN GEL AFINIDAD 
 
 
ELECTROFORESIS 
Técnica para separar moléculas de una mezcla por medio de su migración en un gel 
dentro de un campo eléctrico. 
Es una de las técnicas más usadas para estudiar proteínas y ácidos nucleicos. 
La velocidad de migración de las moléculas en el gel dependerá de la relación entre su 
carga y su masa, 
 
Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-
PAGE) 
• Las proteínas se desnaturalizan con dodecilsufato 
de Na (SDS) que se une a las mismas otorgándoles 
carga negativa. 
• Los puentes disulfuro se rompen con 
mercaptoetanol. 
• La mezcla es sembrada en los “wells”. 
• Las proteínas más pequeñas migran más rápido en 
el gel. 
• El gel debe ser coloreado para ver las proteínas. 
KDa → estándares de proteínas de peso molecular 
Luego de separadas las proteínas pueden ser extraídas del 
gel para realizar estudios posteriores. 
La estructura primaria de la proteína puedeser obtenida 
por métodos bioquímicos o por espectroscopía de masas 
 
TÉCNICA DE INMUNOBLOT O WESTERN BLOT 
Para identificar una proteína en particular y observar cómo varia su expresión en 
distintas condiciones usando SDS-PAGE. 
Las proteínas del gel son transferidas a una membrana de nitrocelulosa por medio de un 
campo eléctrico y luego expuestas a un anticuerpo primario (Ab1). 
Luego un anticuerpo secundario (Ab2), con a una enzima que cataliza una reacción 
quimioluminiscente y produce luz con un sustrato, se une al primario. 
Se busca ver si h activa a HO-1, la actina es un control para 
saber si la cantidad que puse de extracto es la misma. 
Cantidad de anticuerpos → 3 (2 primarios y 1 secundario) 
Las proteínas que identifican los anticuerpos → Actina y HO-1 
 
 
Se pone en buffer 
con exceso de 
anticuerpos Ab1 (Y) 
y luego se lavan los 
excedentes