CyD - Histologia Introduccion

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Histología. Ross. Capítulo 1. Técnicas histológicas.
Generalidades
En la actualidad, en los trabajos prácticos de histología se utilizan microscopios ópticos y cada vez se valen más de la microscopia virtual, que consiste en un método para examinar especímenes microscópicos digitalizados en una pantalla.
Antes se fundamentaba en la microscopia electrónica, tanto MET, como MEB, y MFA.
Preparación del tejido
1. Fijación
Obtenida mediante el empleo de sustancias químicas individuales o mezcladas que conservan la estructura del tejido de forma permanente para permitir el tratamiento ulterior. Las muestran tiene que sumergirse en el fijador inmediatamente luego de ser extraídos. Este procedimiento se realiza para abolir el metabolismo celular, impedir la digestión enzimática de células y tejidos, destruir microorganismos patógenos y endurecer el tejido.
La formalina es el fijador de uso más común. Preserva la estructura general de la célula y los componentes extracelulares. No altera significativamente su estructura tridimensional y las proteínas mantienen su capacidad de reaccionar con anticuerpos, propiedad importante en métodos de tinción inmunocitoquimica. 
2. Inclusión en parafina
Para poder examinar la muestra hay que filtrarla en un medio de inclusión que permita realizarle cortes delgados de 5 a 15nm.
3. Deshidratación
Luego de la fijación, se lava y deshidrata en una serie de soluciones alcohólicas de concentración creciente hasta alcanzar el alcohol 100% antes de la parafina. 
4. Aclaración
Se utilizan solventes orgánicos como xileno o tolueno, miscibles en alcohol y parafina, para extraer el alcohol al 100% antes de la infiltración. Cuando la parafina se enfría y endurece, se empareja para formar un bloque llamado taco, que se coloca en el micrótomo que lo corta en rebanadas finas con una cuchilla de acero. Los cortes, se montan en un portaobjetos de vidrio, a la que previamente se les añadió albumina, que es un medio de montaje adhesivo.
5. Tinción
Los cortes en parafina son incoloros. Para colorearlos, la parafina debe disolverse y extraerse, de nuevo con xileno o tolueno, y rehidratarse, con a una serie de alcoholes de concentración decreciente.
El tejido se tiñe con Hematoxilina en agua, como el colorante de contraste, la eosina, es más soluble en alcohol que en agua, se vuelve a deshidratar en soluciones alcohólicas de concentración creciente y después se tiñe con eosina en alcohol.
Otros fijadores
Los cortes fijados con formalina y teñidos con H-E no dejan ver la composición química de los elementos celulares. Muchos componentes se pierden durante la preparación de la muestra, por lo que para retenerlos, hay que utilizar otros métodos de fijación. Por ejemplo los alcoholes y solventes orgánicos que diluyen los lípidos neutros. Para conservar lípidos neutro como células dianas, deben utilizarse cortes c congelación de tejido fijado en formalina y colorantes que se disuelvan en las grasas para conservar las estructuras de las membranas, y se deben utilizar fijadores especiales: metales pesados, como el permanganato o el osmio, que se unen a fosfolípidos. En rutina, tetroxido de osmio como fijador de ME.
Otras técnicas de tinción
H-E no permite ver adecuadamente ciertos componentes estructurales de los cortes como la elastina, fibras reticulares, membranas basales y lípidos. 
Se pueden utilizar otros métodos que incluyen la coloración con orceina y fucsinaresorcina para material elástico y la impregnación argentica para fibras reticulares y membranas basales. 
Es más importante saber lo que el método permite observar, que conocer su mecanismo de acción.
Histoquímica y citoquimica
Los procedimientos químicos específicos pueden proveer información detallada acerca de la función de la célula y de sus componentes extracelulares.
Estos métodos tienen su fundamento en las uniones específicas de un colorante, en el uso de anticuerpos marcados con un color fluorescente o en la actividad enzimática inherente de un elemento constante de la célula.
Muchas macromoléculas presentes en las células pueden detectarse x medio de la radioatografia, que utiliza una emulsión fotográfica la cual se colorea sobre un corte histológico para localizar material radiactivo en tejidos, en la cual precursores moleculares marcados radiactivamente se incorporan en la célula y el tejido antes de la fijación.
Composición química de muestras histológicas
Los componentes que perduran luego de la fijación son moléculas grandes, en particular son las que reaccionan con otras para formar complejos macromoleculares. Por ejemplo las nucleoproteínas, proteínas intracelulares del citoesqueleto, proteínas extracelulares y complejos de fosfolípidos y proteínas en membranas.
A pesar de que esos componentes perduren, se pierden las proteínas, ácidos nucleicos y generalmente otras partículas pequeñas durante la preparación del tejido.
Los solventes orgánicos disuelven lípidos neutros, por ej. glucógeno, proteoglucanos y proteosaminoglucanos, aunque pueden preservarse si se utilizan fijadores no acuosos si se le añaden agentes ligadores especiales.
Otras sustancias como metabolitos intermedios, glucosa, socio, cloro y otras se pierden durante la preparación. Estos participan en los procesos de síntesis o reacciones celulares. Cuando se conservan y pueden detectarse, aportan información valiosa acerca del metabolismo, transporte activo y procesos vitales de las células.
Colorantes ácidos y básicos
La H y la E, son los de uso más frecuente. Un colorante acido, como la eosina, tiene carga neta negativa en su parte coloreada (Na+anilina). Y un colorante básico, como la hematoxilina tiene carga neta positiva (AnilinaCl-)
Los colorantes ácidos reaccionan con componentes aniónicos de células y tejidos, donde se encuentran grupos fosfatos, sulfato y carboxilo. Esta capacidad de reaccionar es la basofilia. Los componentes teñidos con Hematoxilina también exhiben basofilia. Esto varía según el pH.
La hematoxilina se utiliza como mordiente, intermediario entre el tejido y la anilina, esto se presta para aquellos procedimientos tinturales a los que le siguen soluciones acuosas de colorantes ácidos. La H colocada en agua no se disocia del tejido.
Los colorantes básicos reaccionan con grupos catiónicos de células y tejidos, reacción llamada acidofilia, donde el enlace electrostático es el factor principal de la unión del colorante con el tejido. Además de la eosina: azul de anilina, fucsia acida, naranja G. Estas tinciones selectivas se deben a factores relativos, como el tamaño y el grado de acumulación de las moléculas del colorante, la permeabilidad y la densidad del tejido.
Basofilia: una cantidad limitada de sustancia dentro de la célula y en la matriz extracelular. Ej: heterocromatina y nucléolos, material extra celular, etc.
Acidofilia: filamentos citoplasmáticos, fibras extra celulares, etc.
Digestión enzimática
Es útil para confirmar la identidad del material que se tiñe. El material extra celular se tiñe con la técnica de PAS (localiza los Hidratos de Carbono), que puede identificarse como glucógeno mediante tratamiento pasivo de los cortes con distasa o amilasa 
Histoquímica enzimática
Se utiliza para identificar y localizar enzimas en las células y tejidos. En estos procedimientos se destaca el producto de reacción de actividad enzimática y no la enzima propiamente dicha.
Se utiliza un colorante de captura, colorante o un metal pesado para atrapar o fijar el producto de reacción.
En una reacción típica para destacar una enzima hidrolítica, se coloca una solución que contiene un sustrato y un agente de atrapamiento que precipitara uno de los productos.
El producto de reacción precipitado puede verse en MO y ME.
Inmunocitoquimica
El fundamento es la especificidad de la reacción entre el antígeno y el anticuerpo.
Los anticuerpos (inmunoglobinas) son glucoproteinas producidas por células del sistema inmune en respuesta a un antígeno. En los laboratorios, los anticuerpos pueden purificarse de la sangre y asociarse con un colorante fluorescente,que son sustancias químicas que absorben luz de distintas longitudes de onda.
La fluorescencia absorbe la luz ultravioleta y emite luz verde. Los anticuerpos conjugados con fluorescencia pueden aplicarse a cortes de tejido para localizar un antígeno en la célula o tejido.
Para su observación se utilizan microfotografías que se ven al M de fluorescencia o al focal.
Ross pág. 8 y 9…
Técnicas de hibridación
Sirven para localizar ARNm o ADN mediante la hidratación de la secuencia de interés con una sonda de nucleótidos de secuencia complementaria.
Hibridación: capacidad de las moléculas de ADN o ARN de interaccionar con secuencias complementarias.
En el laboratorio de la hibridación necesita el aislamiento del ADN o ARN, que luego se mezcla con una secuencia de nucleótidos complementaria, llamada sonda de nucleótidos.
La unión entre la sonda y la secuencia puede ocurrir en una solución o en una membrana. Puede verse mediante la radioautografia. Recientemente se han combinado colorantes fluorescentes con sondas de nucleótidos para visualizar muchas sondas al mismo tiempo, esta técnica se llama hibridación in situ con fluorescencia (FISH). Se utiliza para examinar simultáneamente cromosomas, expresiones genéticas y distribución de productos génicos. También se utiliza para encontrar cáncer de cuello uterino, células infectadas con HIV y cromosomas de los linfocitos de astronautas para calcular dosis de radiación.
Radioautografia
Utiliza una emulsión fotográfica la cual se coloca sobre un corte histológico para localizar material radioactivo en los tejidos.
Los aminoácidos que integran las proteínas y los nucleótidos que forman los ácidos nucleicos pueden marcarse mediante la incorporación de un átomo radiactivo o varios en su estructura molecular.
Este material radiactivo se monta en portaobjetos. Luego de la exposición adecuada en una cámara oscura, la emulsión expuesta se revela con las técnicas fotográficas comunes y el portaobjeto en la muestra se preserva, siempre sellándolo con un cubreobjetos.
Los gránulos de plata aparecen como puntos negros. Pueden usarse como indicadores de la localización de unas sustancias o pueden contarse para proporcionar información.
La radioautografia también puede practicarse sobre cortes finos.
Metacromasia
Ciertos colorantes básicos reaccionan con componentes hísticos que hacen cambiar su color normal de azul al rojo o al purpura. Por ejemplo, si se tiñe con azul de toluidina, cambia a purpura.
Grupo aldehído y reactivo de Schiff (técnica de PAS)
La capacidad de la fucsina básica decolorada para reaccionar con los grupos aldehídos, trae como conseciencia la aparición de un color rojo distintivo, que es la base de las areaccion de PAS (acido peryódico-reactivo de Schiff) y de Feulgen.
· PAS: tiñe hidratos de carbono y macromoléculas con abundancia de hidratos de carbono. Se utiliza para detectar glucógeno en células, moco en varios tipos de células y tejidos, membrana basal subyacente y fibras reticulares.
· Reaccion de Feulgen: comprende la hidrolisis acido débil con acido clorhídrico, se utiliza para teñir ADN.
Microscopía
Un microscopio es un instrumento oque aumenta el tamaño de una imagien y permite ver mas detalle de lo que seria posible a simple vista. El poder de resolución del ojo humano es de 2mm.
El poder de resolución es la capacidad de una lenta o sistema óptico del microscopio de producir imágenes separadas de objetos que están muy cerca uno de otro. La resolución también depetende de la longitud de onda de la luz, el espesor de la muestra, la calidad de la fijación y la intensidad con que esta teñido.
Microscopio óptico
Los componentes son: fuente luminosa para la iluminación de la muestra, lente condensador, platina, lente objetivo y lente ocular.
Los órganos son tridimensionales, mientras que los cortes histológicos son solo bidimensionales, por lo que es un desafío tratar de reconstruir mentalmente la tercera dimensión.
En todas las etapas de preparación del tejido pueden generarse artefactos en los preparados histológicos, que son imperfecciones en la ejecución de la metodología o contar con un equipo inadecuado.
Microscopio de contraste de fase
Permite el examen de células y tejidos no teñidos y es de especial utilidad para estudiar células vivas.
Aprovecha las pequeñas diferencias en el índice de refracción que hay en diferentes partes de células y tejidos. Además, añade otras longitudes de onda cuya salida de fase se ha inducio mediante una serie de anillos ópticos en las lentes condernsador y objetivo, cancela la ampliación de la porción de haz refractada inicialmente y se produce contraste en la imagen.
Sirve para examinar células y tejidos vivos, como los de cultivo.
Microscopio de campo oscuro
Esta provisto de un condensador especial que ilumina el preparado con mucha intensidad y de forma oblicua. La resolución no es mejor la del de campo claro dado que ambos poseen luz de la misma longitud de onda. Pero pueden detectarse particular mas pequeñas.
Se utiliza para examinar preparación radioautográficas. En la clínica se aplica para la detección de cristales en la orina e identificar bacterias.
Microscopio de fluorescencia 
Aprovecha la capacidad de ciertas moléculas de fluorescer bajo la luz UV, y estudiar la fluorescencia secundaria para detectar antígenos o anticuerpos de técnicas inmunocitoquímicas.
Microscopio confocal de barrido 
Permite la visualización de una muestra biológica en 3 dimensiones. Sus lentes están alineadas. Su resolución es de 2 a 5 micrometros. 
Microscopio de polarización o de luz polarizada
Microscopio de luz ultravioleta
200nm. Registra los resultados en una placa fotográfica. La muestrta no puede ser inspeccionada directamente a través de un ocular xq la luz UV no es visible a través del ojo y lo lesiona.
Detecta acidos nucleicos, proteínas contenedoras de ciertos aminoácidos, determinar cuantitativamente el ADN y ARN en células individuales.
Microscopio Electronico de Transferencia
Microscopio Electronico de Barrido
Microscopio de Fuerza Atómica
Es el mas poderoso para el estudio de la topografía superficial con resolución molecular y atómica.
Es un microscopio no óptico, y funciona igual que el pulpejo de los dedos, que tocan y sienten cuando no podemos ver. Puede funcionar con la pua de soporte tocando la muestra (método de contacto) o con la pua puede dar golpecitos a través de la superficie (método de percusión) como el baston de un ciego.
La ventaja de este microscopio es que la muestra no necesita estar en el vacio, sino que puede estar en agua. Esto favorece a la obtención de imágenes de células vivas y en su medio circundante.